JP2003284583A - アミノ酸デヒドロゲナーゼによるｌ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
アミノ酸デヒドロゲナーゼによるｌ−アミノ酸の製造方法Info
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- JP2003284583A JP2003284583A JP2002094837A JP2002094837A JP2003284583A JP 2003284583 A JP2003284583 A JP 2003284583A JP 2002094837 A JP2002094837 A JP 2002094837A JP 2002094837 A JP2002094837 A JP 2002094837A JP 2003284583 A JP2003284583 A JP 2003284583A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】遺伝子組換え技術を用いることなく、天然の微
生物由来の酵素を用いて、α−ケト酸よりアミノ酸を生
産する。 【解決手段】選択された微生物由来のアミノ酸デヒドロ
ゲナーゼ活性を用いて、アンモニウムイオン、および還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、またはそ
れらの塩などの還元力を有する補酵素の存在下にα−ケ
ト酸と反応させる。この反応により様々なα−ケト酸よ
り対応するアミノ酸を製造することができる。
生物由来の酵素を用いて、α−ケト酸よりアミノ酸を生
産する。 【解決手段】選択された微生物由来のアミノ酸デヒドロ
ゲナーゼ活性を用いて、アンモニウムイオン、および還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、またはそ
れらの塩などの還元力を有する補酵素の存在下にα−ケ
ト酸と反応させる。この反応により様々なα−ケト酸よ
り対応するアミノ酸を製造することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物由来のアミ
ノ酸デヒドロゲナーゼ活性を用いてα−ケト酸よりアミ
ノ酸を生成蓄積せしめ採取する方法に関する。
ノ酸デヒドロゲナーゼ活性を用いてα−ケト酸よりアミ
ノ酸を生成蓄積せしめ採取する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】光学活性な天然・非天然アミノ酸はその
生物学的活性のみならず、各種化学物質や医薬の合成前
駆物質としても大変重要である。これらアミノ酸は化学
合成により製造されうるが、その場合立体選択的に操作
できず、最終生成物がラセミ体となってしまうという欠
点がある。これに対し酵素による方法は簡単に調整でき
る中間体から酵素行程を用いることによりキラル化合物
が選択的に合成されるという利点を有する。このことは
２つの立体異性化合物のうちの一方のみが生物学的に活
性である場合に特に好都合である。
生物学的活性のみならず、各種化学物質や医薬の合成前
駆物質としても大変重要である。これらアミノ酸は化学
合成により製造されうるが、その場合立体選択的に操作
できず、最終生成物がラセミ体となってしまうという欠
点がある。これに対し酵素による方法は簡単に調整でき
る中間体から酵素行程を用いることによりキラル化合物
が選択的に合成されるという利点を有する。このことは
２つの立体異性化合物のうちの一方のみが生物学的に活
性である場合に特に好都合である。
【０００３】アミノ酸デヒドロゲナーゼを用いたアミノ
酸の生物学的変換の例としては、サーモアクチノマイセ
ス・インターメディウス由来のＬ−フェニルアラニンデ
ヒドロゲナーゼを用いてフェニルピルビン酸よりＬ−フ
ェニルアラニンへと変換する酵素を単離した例（特公平
０８−０２９０７９号）が知られている。
酸の生物学的変換の例としては、サーモアクチノマイセ
ス・インターメディウス由来のＬ−フェニルアラニンデ
ヒドロゲナーゼを用いてフェニルピルビン酸よりＬ−フ
ェニルアラニンへと変換する酵素を単離した例（特公平
０８−０２９０７９号）が知られている。
【０００４】また非天然アミノ酸を生産した例として
は、バシラス・セレウスの菌体由来もしくはバシラス・
セレウス由来のロイシンデヒドロゲナーゼを遺伝子組換
え技術により大量発現した大腸菌を用いて３，３−ジメ
チル−２−オキソブタン酸（トリメチルピルビン酸）よ
りＬ−ｔ−ロイシンを製造した例（特開平９−２２４６
８８号）があるが、バシラス・セレウスは毒素形成が懸
念される細菌である。
は、バシラス・セレウスの菌体由来もしくはバシラス・
セレウス由来のロイシンデヒドロゲナーゼを遺伝子組換
え技術により大量発現した大腸菌を用いて３，３−ジメ
チル−２−オキソブタン酸（トリメチルピルビン酸）よ
りＬ−ｔ−ロイシンを製造した例（特開平９−２２４６
８８号）があるが、バシラス・セレウスは毒素形成が懸
念される細菌である。
【０００５】このように遺伝子組換え技術を用いずに、
自然界から単離でき毒性の低い微生物由来のアミノ酸デ
ヒドロゲナーゼを用いたアミノ酸の生産方法については
知られていない。
自然界から単離でき毒性の低い微生物由来のアミノ酸デ
ヒドロゲナーゼを用いたアミノ酸の生産方法については
知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】一般に生物由来の酵素
を用いたアミノ酸の生産において遺伝子組み換え技術を
用いて発現した酵素を利用する場合、組み換えた遺伝子
が宿主以外の生物由来であるときには、産業として利用
する際に著しい制約がある。そのため、自然界より単離
でき、危険性が低く、アミノ酸生産能の高い微生物の選
定が望まれる。
を用いたアミノ酸の生産において遺伝子組み換え技術を
用いて発現した酵素を利用する場合、組み換えた遺伝子
が宿主以外の生物由来であるときには、産業として利用
する際に著しい制約がある。そのため、自然界より単離
でき、危険性が低く、アミノ酸生産能の高い微生物の選
定が望まれる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、アミノ酸
産生能の高い微生物を、所有する微生物の乾燥菌体ライ
ブラリーからスクリーニングした結果、以下の本発明に
到達した。
産生能の高い微生物を、所有する微生物の乾燥菌体ライ
ブラリーからスクリーニングした結果、以下の本発明に
到達した。
【０００８】すなわち、本発明は、 α−ケト酸または
その塩を、 i）アンモニウム塩 ii）還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ま
たはそれらの塩から選ばれる１種 iii）フラボバクテリウム(Flavobacterium）属、アース
ロバクター（Arthrobacter）属、ブレビバクテリウム(B
revibacterium）属、あるいはブレバンディモナス（Bre
vundimonas）属に属する微生物由来、またはバシラス・
ロゼウス（Bacillus roseus）、またはバシラス・スリ
ンジェンシス（Bacillus thuringiensis）に属する微生
物由来のアミノ酸デヒドロゲナーゼの存在下に還元的ア
ミノ化反応し、Ｌ−アミノ酸を採取することからなるＬ
−アミノ酸の製造方法である。
その塩を、 i）アンモニウム塩 ii）還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ま
たはそれらの塩から選ばれる１種 iii）フラボバクテリウム(Flavobacterium）属、アース
ロバクター（Arthrobacter）属、ブレビバクテリウム(B
revibacterium）属、あるいはブレバンディモナス（Bre
vundimonas）属に属する微生物由来、またはバシラス・
ロゼウス（Bacillus roseus）、またはバシラス・スリ
ンジェンシス（Bacillus thuringiensis）に属する微生
物由来のアミノ酸デヒドロゲナーゼの存在下に還元的ア
ミノ化反応し、Ｌ−アミノ酸を採取することからなるＬ
−アミノ酸の製造方法である。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明において使用されうるアミ
ノ酸デヒドロゲナーゼとしては、フラボバクテリウム(F
lavobacterium）属、アースロバクター（Arthrobacte
r）属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium）属、また
はブレバンディモナス（Brevundimonas）属のバクテリ
アおよびバシラス・ロゼウス（Bacillus roseus）、バ
シラス・スリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）
のバクテリアに由来するものである。
ノ酸デヒドロゲナーゼとしては、フラボバクテリウム(F
lavobacterium）属、アースロバクター（Arthrobacte
r）属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium）属、また
はブレバンディモナス（Brevundimonas）属のバクテリ
アおよびバシラス・ロゼウス（Bacillus roseus）、バ
シラス・スリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）
のバクテリアに由来するものである。
【００１０】さらに好ましくは、フラボバクテリウム・
ヘパリウム(Flavobacterium heparium）、バシラス・ロ
ゼウス（Bacillus roseus）、バシラス・スリンジェン
シス（Bacillus thuringiensis）、アースロバクター・
シンプレックス（Arthrobacter simplex）、ブレビバク
テリウム・アンモニアジェネス(Brevibacterium ammoni
agenes）、またはブレバンディモナス・ディミヌタ（Br
evundimonas diminuta）などのバクテリアに由来するア
ミノ酸デヒドロゲナーゼである。
ヘパリウム(Flavobacterium heparium）、バシラス・ロ
ゼウス（Bacillus roseus）、バシラス・スリンジェン
シス（Bacillus thuringiensis）、アースロバクター・
シンプレックス（Arthrobacter simplex）、ブレビバク
テリウム・アンモニアジェネス(Brevibacterium ammoni
agenes）、またはブレバンディモナス・ディミヌタ（Br
evundimonas diminuta）などのバクテリアに由来するア
ミノ酸デヒドロゲナーゼである。
【００１１】本発明におけるアミノ酸デヒドロゲナーゼ
とは、α−ケト酸のα位に結合した酸素原子をアミノ基
および水素原子に還元的に変換しアミノ酸を生成する反
応（還元的アミノ化反応）を触媒する酵素であり、生成
されたアミノ酸は光学的にＬ体である。その反応にはα
−ケト酸以外にアンモニウム塩および還元化する活性を
有する補酵素を必用とする。アミノ酸デヒドロゲナーゼ
にはロイシンデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、アラニ
ンデヒドロゲナーゼなどが知られている。どの酵素も使
用できるが、好ましくは、比較的脂溶性の高いアミノ酸
に活性の高いロイシンデヒドロゲナーゼである。
とは、α−ケト酸のα位に結合した酸素原子をアミノ基
および水素原子に還元的に変換しアミノ酸を生成する反
応（還元的アミノ化反応）を触媒する酵素であり、生成
されたアミノ酸は光学的にＬ体である。その反応にはα
−ケト酸以外にアンモニウム塩および還元化する活性を
有する補酵素を必用とする。アミノ酸デヒドロゲナーゼ
にはロイシンデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、アラニ
ンデヒドロゲナーゼなどが知られている。どの酵素も使
用できるが、好ましくは、比較的脂溶性の高いアミノ酸
に活性の高いロイシンデヒドロゲナーゼである。
【００１２】本発明に用いられるα−ケト酸は微生物由
来のトランスアミナーゼによりアミノ酸に変換されるも
のであれば、いかなるα−ケト酸でもよいが、好ましく
は、α−ケトイソカプロン酸、α−ケトバレレン酸、α
−ケトカプロン酸、α−ケト酪酸、トリメチルピルビン
酸（３，３−ジメチル−２−オキソブタン酸）などの下
記一般式（II）
来のトランスアミナーゼによりアミノ酸に変換されるも
のであれば、いかなるα−ケト酸でもよいが、好ましく
は、α−ケトイソカプロン酸、α−ケトバレレン酸、α
−ケトカプロン酸、α−ケト酪酸、トリメチルピルビン
酸（３，３−ジメチル−２−オキソブタン酸）などの下
記一般式（II）
【００１３】
【化２】
【００１４】（ここでＲは炭素数２個から４個のアルキ
ル基である）で表されるα−ケト酸である。
ル基である）で表されるα−ケト酸である。
【００１５】またそれらの塩も使用でき、その場合当然
アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を著名に阻害しないイオ
ンが選択される。ナトリウム、カリウム、およびアンモ
ニウム塩が好ましい。
アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を著名に阻害しないイオ
ンが選択される。ナトリウム、カリウム、およびアンモ
ニウム塩が好ましい。
【００１６】本発明により得られるＬ−アミノ酸は、上
記のα−ケト酸から得られるものであればいかなるもの
でもよいが、下記一般式（Ｉ）
記のα−ケト酸から得られるものであればいかなるもの
でもよいが、下記一般式（Ｉ）
【００１７】
【化３】
【００１８】（ここでＲは炭素数２個から４個のアルキ
ル基である）で表されるものが好ましく、具体的には、
ロイシン、バリン、ノルバリン、α−アミノ酪酸、Ｌ−
ｔ−ロイシンである。さらに好ましくは、自然界では通
常、生物学的に生成されない非天然アミノ酸が望まし
い。
ル基である）で表されるものが好ましく、具体的には、
ロイシン、バリン、ノルバリン、α−アミノ酪酸、Ｌ−
ｔ−ロイシンである。さらに好ましくは、自然界では通
常、生物学的に生成されない非天然アミノ酸が望まし
い。
【００１９】アンモニウム塩としてはアミノ酸デヒドロ
ゲナーゼ活性を著名に阻害しないいかなるアンモニウム
塩でもよく、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニ
ウム、酒石酸アンモニウム、または酢酸アンモニウムな
どがあげられる。これらはアンモニウムイオンとして、
α−ケト酸に対し等モル量または過剰に添加される。ア
ンモニウムイオンモル濃度：α−ケト酸モル濃度比が
１：１〜５：１、好ましくは１：１〜２：１なる割合が
好ましく添加される。
ゲナーゼ活性を著名に阻害しないいかなるアンモニウム
塩でもよく、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニ
ウム、酒石酸アンモニウム、または酢酸アンモニウムな
どがあげられる。これらはアンモニウムイオンとして、
α−ケト酸に対し等モル量または過剰に添加される。ア
ンモニウムイオンモル濃度：α−ケト酸モル濃度比が
１：１〜５：１、好ましくは１：１〜２：１なる割合が
好ましく添加される。
【００２０】また本発明では、反応において他の基質を
還元するとともに自らは酸化されるような補酵素である
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸（ＮＡＤＰＨ）、およびそれらの塩のいずれかの存
在下に実施する必要がある。これら補酵素はα−ケト酸
に対し等モル量または過剰に添加されるべきであるが、
コストが高いこと、および後述するようにエネルギー依
存的な再生系が添加できることから、等モル量以下で用
いることができる。好ましくは補酵素モル濃度：α−ケ
ト酸モル濃度比が、１：１００〜１：１、さらに好まし
くは、１：１００〜１：１０である。
還元するとともに自らは酸化されるような補酵素である
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸（ＮＡＤＰＨ）、およびそれらの塩のいずれかの存
在下に実施する必要がある。これら補酵素はα−ケト酸
に対し等モル量または過剰に添加されるべきであるが、
コストが高いこと、および後述するようにエネルギー依
存的な再生系が添加できることから、等モル量以下で用
いることができる。好ましくは補酵素モル濃度：α−ケ
ト酸モル濃度比が、１：１００〜１：１、さらに好まし
くは、１：１００〜１：１０である。
【００２１】また補酵素を還元型へとエネルギー依存的
に共益的にリサイクルするような酵素およびエネルギー
源を添加してもよい。その例としては、グルコースデヒ
ドロゲナーゼとグルコース、蟻酸デヒドロゲナーゼと蟻
酸またはその塩、乳酸デヒドロゲナーゼと乳酸またはそ
の塩などが挙げられる。
に共益的にリサイクルするような酵素およびエネルギー
源を添加してもよい。その例としては、グルコースデヒ
ドロゲナーゼとグルコース、蟻酸デヒドロゲナーゼと蟻
酸またはその塩、乳酸デヒドロゲナーゼと乳酸またはそ
の塩などが挙げられる。
【００２２】アミノ酸デヒドロゲナーゼを有する微生物
は以下のように調製される。微生物はその生育に最適の
培養液中で適当な温度条件および通気条件のもとで、培
養液１リットル当たり乾燥重量約30〜100ｇとなるまで
培養するのが好ましい。それぞれの微生物に最も適当な
条件は公知の条件（例えば、Lawrence C. Parks編(199
7)、HANDBOOK OF Microbiological Media SECOND EDITI
ON、CRC Press）により判定されうる。次に微生物を培
養液中に、もしくは培養液から分離してα−ケト酸の還
元的アミノ化に供する。還元的アミノ化反応は細胞全
体、細胞の乾燥体、凍結乾燥体、あるいは破砕した細胞
を用いても実施でき、それぞれ慣用の乾燥法、破砕法が
用いられる。またこれらからの抽出物、総タンパク質、
または精製したアミノ酸デヒドロゲナーゼを用いても同
様に実施できる。さらにこれら微生物、その由来物、単
離された酵素を固定した形態で使用することも可能であ
る。
は以下のように調製される。微生物はその生育に最適の
培養液中で適当な温度条件および通気条件のもとで、培
養液１リットル当たり乾燥重量約30〜100ｇとなるまで
培養するのが好ましい。それぞれの微生物に最も適当な
条件は公知の条件（例えば、Lawrence C. Parks編(199
7)、HANDBOOK OF Microbiological Media SECOND EDITI
ON、CRC Press）により判定されうる。次に微生物を培
養液中に、もしくは培養液から分離してα−ケト酸の還
元的アミノ化に供する。還元的アミノ化反応は細胞全
体、細胞の乾燥体、凍結乾燥体、あるいは破砕した細胞
を用いても実施でき、それぞれ慣用の乾燥法、破砕法が
用いられる。またこれらからの抽出物、総タンパク質、
または精製したアミノ酸デヒドロゲナーゼを用いても同
様に実施できる。さらにこれら微生物、その由来物、単
離された酵素を固定した形態で使用することも可能であ
る。
【００２３】反応混合物への反応体の添加は、溶液とし
て、または固形または液状の原体を添加することにより
行われる。また反応時間中に段階的にまたは継続的に添
加してもよい。
て、または固形または液状の原体を添加することにより
行われる。また反応時間中に段階的にまたは継続的に添
加してもよい。
【００２４】反応液のｐＨは５〜９、特にｐＨ６〜８で
操作するのが好ましい、また反応温度は１０℃〜６５
℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲で実施するのが好
ましい。反応温度をこの範囲とすることで、酵素反応の
低下や、酵素の不活化を防ぐことができる。
操作するのが好ましい、また反応温度は１０℃〜６５
℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲で実施するのが好
ましい。反応温度をこの範囲とすることで、酵素反応の
低下や、酵素の不活化を防ぐことができる。
【００２５】また本発明により用いられた微生物よりア
ミノ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を単離し、遺伝子組み換
え技術により、大量に発現させた菌体、菌体由来物、ま
たは単離精製した酵素を用いて還元的アミノ化反応を実
施することも可能であり、この場合の宿主には酵素源と
なった微生物以外のものも使用できる。さらには微生物
以外の動物、植物、培養細胞において大量発現させても
よく、その場合、その由来物、分泌物、単離した酵素を
用いることができる。
ミノ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を単離し、遺伝子組み換
え技術により、大量に発現させた菌体、菌体由来物、ま
たは単離精製した酵素を用いて還元的アミノ化反応を実
施することも可能であり、この場合の宿主には酵素源と
なった微生物以外のものも使用できる。さらには微生物
以外の動物、植物、培養細胞において大量発現させても
よく、その場合、その由来物、分泌物、単離した酵素を
用いることができる。
【００２６】
【実施例】以下、実施例をもって本発明を具体的に説明
する。
する。
【００２７】参考例
＜乾燥菌体の作製＞菌株を冷蔵ストックより以下の組成
の培地に接種し、600nmにおける吸光度が0.7となるまで
30℃において振とう培養した。その後、菌体を集め、0.
85％NaClで洗浄した後、ガラスシャーレに薄く一様の塗
布し、送風下一晩乾燥させた。乾燥した菌体を乳鉢によ
りすりつぶし、乾燥菌体とした。
の培地に接種し、600nmにおける吸光度が0.7となるまで
30℃において振とう培養した。その後、菌体を集め、0.
85％NaClで洗浄した後、ガラスシャーレに薄く一様の塗
布し、送風下一晩乾燥させた。乾燥した菌体を乳鉢によ
りすりつぶし、乾燥菌体とした。
【００２８】培地組成
グルコース １ w/v％
K2HPO4 0.3 w/v％
MgSO4 0.02w/v％
ペプトン 1.5 w/v％
NaCl 0.2 w/v％イーストエキストラクト
0.1 w/v％
＜ニンヒドリン発色＞薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）上のアミノ酸の検出は、アミノ基の呈色反応である
ニンヒドリン発色により行った。すなわち、ニンヒドリ
ンを0.2％(w/v)の濃度でアセトンに溶解した溶液を展開
後のＴＬＣプレートに一様にスプレーした後、アセトン
を乾燥させ、105℃で10〜20秒ベイクしたとき、アミノ
酸のスポットが赤紫〜青紫色に呈色することにより同定
した。
Ｃ）上のアミノ酸の検出は、アミノ基の呈色反応である
ニンヒドリン発色により行った。すなわち、ニンヒドリ
ンを0.2％(w/v)の濃度でアセトンに溶解した溶液を展開
後のＴＬＣプレートに一様にスプレーした後、アセトン
を乾燥させ、105℃で10〜20秒ベイクしたとき、アミノ
酸のスポットが赤紫〜青紫色に呈色することにより同定
した。
【００２９】実施例１
表１に示す菌株について、参考例の方法を用いて乾燥菌
体を作製し、α−ケト酸としてトリメチルビン酸を用い
て、アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を探索した。バシラ
ス・ロゼウス（IAM 1257）は「東京大学分子細胞生物学
研究所（IAM）」に寄託された菌株であり、該研究所よ
り分与可能である。
体を作製し、α−ケト酸としてトリメチルビン酸を用い
て、アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を探索した。バシラ
ス・ロゼウス（IAM 1257）は「東京大学分子細胞生物学
研究所（IAM）」に寄託された菌株であり、該研究所よ
り分与可能である。
【００３０】0.2Ｍリン酸カリウム緩衝（pH7.0）中で、
10g/Lトリメチルピルビン酸（ＴＭＰ）、20g/L塩化アン
モニウム、100g/Lグルコース、1.2g/L NADH、1.2g/L NA
DPH、0.41g/Lグルコースデヒドロゲナーゼを調製した水
溶液（ＴＭＰ＋塩化アンモニウム＋補酵素）を反応液と
し、反応液100μｌ中に約１ｍｇの乾燥菌体を加え、３
０℃で終夜振とうし、反応させた後、反応液を等量のブ
タノールで抽出し、その一部をＴＬＣ（メルク社、Sili
ca gel 60 F254) にスポットし、１−プロパノール、25
％アンモニア水（２：１）で展開した後、ニンヒドリン
発色した。比較例として0.2Ｍリン酸カリウム緩衝（pH
7.0）中で、10g/Lトリメチルピルビン酸（ＴＭＰ）のみ
を調製した反応液での反応を行い、比較することによ
り、還元的アミノ化反応によるアミノ酸の生成であるこ
とを確認した。またコントロールとして0.5 ,1 ,2g/Lの
Ｌ−ｔ−ロイシンをＴＬＣにスポットしておき、コント
ロールと同じ位置にスポットが得られた株を陽性とし、
目視により定量した。その結果を表１に示す。
10g/Lトリメチルピルビン酸（ＴＭＰ）、20g/L塩化アン
モニウム、100g/Lグルコース、1.2g/L NADH、1.2g/L NA
DPH、0.41g/Lグルコースデヒドロゲナーゼを調製した水
溶液（ＴＭＰ＋塩化アンモニウム＋補酵素）を反応液と
し、反応液100μｌ中に約１ｍｇの乾燥菌体を加え、３
０℃で終夜振とうし、反応させた後、反応液を等量のブ
タノールで抽出し、その一部をＴＬＣ（メルク社、Sili
ca gel 60 F254) にスポットし、１−プロパノール、25
％アンモニア水（２：１）で展開した後、ニンヒドリン
発色した。比較例として0.2Ｍリン酸カリウム緩衝（pH
7.0）中で、10g/Lトリメチルピルビン酸（ＴＭＰ）のみ
を調製した反応液での反応を行い、比較することによ
り、還元的アミノ化反応によるアミノ酸の生成であるこ
とを確認した。またコントロールとして0.5 ,1 ,2g/Lの
Ｌ−ｔ−ロイシンをＴＬＣにスポットしておき、コント
ロールと同じ位置にスポットが得られた株を陽性とし、
目視により定量した。その結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】その結果、フラボバクテリウム属、アース
ロバクター属、ブレビバクテリウム属、ブレバンディモ
ナス属に属する微生物およびバシラス・ロゼウス、バシ
ラス・スリンジェンシス由来のアミノ酸デヒドロゲナー
ゼ存在下ではＬ−アミノ酸が生成しており、マイクロコ
ッカス属の微生物由来のアミノ酸デヒドロゲナーゼ反応
ではアミノ酸が生成しなかった。
ロバクター属、ブレビバクテリウム属、ブレバンディモ
ナス属に属する微生物およびバシラス・ロゼウス、バシ
ラス・スリンジェンシス由来のアミノ酸デヒドロゲナー
ゼ存在下ではＬ−アミノ酸が生成しており、マイクロコ
ッカス属の微生物由来のアミノ酸デヒドロゲナーゼ反応
ではアミノ酸が生成しなかった。
【００３３】実施例２
フラボバクテリウム・ヘパリウム(ATCC13125）、アース
ロバクター・シンプレックス（ATCC 6946）、およびブ
レビバクテリウム・アンモニアジェネス(ATCC 6872）に
ついてトリメチルピルビン酸を基質としてＬ−ｔ−ロイ
シンの蓄積濃度を調べた。0.2Ｍリン酸カリウム緩衝液
(pH7.0)中で40g/Lのトリメチルピルビン酸、40g/Lの塩
化アンモニウム、100g/Lのグルコース、1.2g/LのＮＡＤ
Ｈ、1.2g/LのＮＡＤＰＨおよび0.41g/Lのグルコースデ
ヒドロゲナーゼの存在下、これら菌株より調製した乾燥
菌体を反応液１mlあたり10mg加え、30℃で６日間振とう
しながら反応させた。１，２，４，６日後に反応液を分
取し、2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノ
シルイソチオシアネート（ＧＩＴＣ、和光純薬）標識後
ＨＰＬＣにより分析、定量を行った。反応液100μlに対
し、100μlの10mMγ−アミノ酪酸を加え200μlの１−ブ
タノールで抽出した。１−ブタノール層20μlに対し、1
0μlの１％トリメチルアミン水溶液、20μlのアセトニ
トリル、50μlの0.2％、ＧＩＴＣ−アセトニトリル溶液
を加え、15分間室温で反応させた。そのうち５μｌをＨ
ＰＬＣにインジェクトした。ＨＰＬＣでは、カラムにSh
im-pack CLC-ODS(M)4.6x250mm（島津製作所）,溶離液は
60％メタノール水溶液（pH2.5）で流速1ml/min、検出は
214nmで行った。既知の濃度のＬ−ｔ−ロイシンを用い
て抽出、反応、分析を行い、その標準曲線をもとに試料
中のＬ−ｔ−ロイシンの濃度を求めた。
ロバクター・シンプレックス（ATCC 6946）、およびブ
レビバクテリウム・アンモニアジェネス(ATCC 6872）に
ついてトリメチルピルビン酸を基質としてＬ−ｔ−ロイ
シンの蓄積濃度を調べた。0.2Ｍリン酸カリウム緩衝液
(pH7.0)中で40g/Lのトリメチルピルビン酸、40g/Lの塩
化アンモニウム、100g/Lのグルコース、1.2g/LのＮＡＤ
Ｈ、1.2g/LのＮＡＤＰＨおよび0.41g/Lのグルコースデ
ヒドロゲナーゼの存在下、これら菌株より調製した乾燥
菌体を反応液１mlあたり10mg加え、30℃で６日間振とう
しながら反応させた。１，２，４，６日後に反応液を分
取し、2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノ
シルイソチオシアネート（ＧＩＴＣ、和光純薬）標識後
ＨＰＬＣにより分析、定量を行った。反応液100μlに対
し、100μlの10mMγ−アミノ酪酸を加え200μlの１−ブ
タノールで抽出した。１−ブタノール層20μlに対し、1
0μlの１％トリメチルアミン水溶液、20μlのアセトニ
トリル、50μlの0.2％、ＧＩＴＣ−アセトニトリル溶液
を加え、15分間室温で反応させた。そのうち５μｌをＨ
ＰＬＣにインジェクトした。ＨＰＬＣでは、カラムにSh
im-pack CLC-ODS(M)4.6x250mm（島津製作所）,溶離液は
60％メタノール水溶液（pH2.5）で流速1ml/min、検出は
214nmで行った。既知の濃度のＬ−ｔ−ロイシンを用い
て抽出、反応、分析を行い、その標準曲線をもとに試料
中のＬ−ｔ−ロイシンの濃度を求めた。
【００３４】
【表２】
【００３５】その結果、フラボバクテリウム属、アース
ロバクター属、ブレビバクテリウム属に属する微生物の
乾燥菌体を用いた反応において、反応液中にＬ−ｔ−ロ
イシンが大量に蓄積した。
ロバクター属、ブレビバクテリウム属に属する微生物の
乾燥菌体を用いた反応において、反応液中にＬ−ｔ−ロ
イシンが大量に蓄積した。
【００３６】実施例３
アースロバクター・シンプレックス（ATCC 6946）、ブ
レビバクテリウム・アンモニアジェネス(ATCC 6872）由
来のアミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を用いて様々なαケ
ト酸を基質としたときのアミノ酸の生成を調べた。その
結果を表３に示す。α−ケト酸10g/Lの濃度で用い、そ
れ以外の反応条件および実験条件は実施例１と同様に行
った。
レビバクテリウム・アンモニアジェネス(ATCC 6872）由
来のアミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を用いて様々なαケ
ト酸を基質としたときのアミノ酸の生成を調べた。その
結果を表３に示す。α−ケト酸10g/Lの濃度で用い、そ
れ以外の反応条件および実験条件は実施例１と同様に行
った。
【００３７】
【表３】
【００３８】その結果、これら微生物由来のアミノ酸デ
ヒドロゲナーゼにより、Ｌ−ｔ−ロイシン、α−アミノ
酪酸、ノルバリン、バリン、ロイシン、チロシン、フェ
ニルアラニンなどの天然、非天然アミノ酸が対応するα
−ケト酸より生成することが明らかとなった。
ヒドロゲナーゼにより、Ｌ−ｔ−ロイシン、α−アミノ
酪酸、ノルバリン、バリン、ロイシン、チロシン、フェ
ニルアラニンなどの天然、非天然アミノ酸が対応するα
−ケト酸より生成することが明らかとなった。
【００３９】
【発明の効果】天然の微生物由来のアミノ酸デヒドロゲ
ナーゼ活性を用いて、様々なα−ケト酸より対応するア
ミノ酸を生産することができる。
ナーゼ活性を用いて、様々なα−ケト酸より対応するア
ミノ酸を生産することができる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
(Ｃ１２Ｐ 13/04
Ｃ１２Ｒ 1:01）
(Ｃ１２Ｐ 13/04
Ｃ１２Ｒ 1:07）
(72)発明者 小川 順
京都府京都市北区上賀茂榊田28メルベーエ
346 301号室
Ｆターム(参考） 4B064 AE03 CA21 CB30 CD05 CD12
Claims (5)
- 【請求項１】 α−ケト酸またはその塩を、 i）アンモニウム塩、 ii）還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、お
よびそれらの塩から選ばれる少なくとも１種、および iii）フラボバクテリウム(Flavobacterium）属、アース
ロバクター（Arthrobacter）属、ブレビバクテリウム(B
revibacterium）属、あるいはブレバンディモナス（Bre
vundimonas）属に属する微生物由来、またはバシラス・
ロゼウス（Bacillus roseus）、またはバシラス・スリ
ンジェンシス（Bacillus thuringiensis）に属する微生
物由来のアミノ酸デヒドロゲナーゼ、の存在下に還元的
アミノ化反応し、Ｌ−アミノ酸を採取することからなる
Ｌ−アミノ酸の製造方法。 - 【請求項２】アミノ酸デヒドロゲナーゼがフラボバクテ
リウム・ヘパリウム(Flavobacterium heparium）、アー
スロバクター・シンプレックス（Arthrobacter simple
x）、ブレビバクテリウム・アンモニアジェネス(Brevib
acterium ammoniagenes）、ブレバンディモナス・ディ
ミヌタ（Brevundimonas diminuta）、バシラス・ロゼウ
ス（Bacillus roseus）、またはバシラス・スリンジェ
ンシス（Bacillus thuringiensis）由来であることを特
徴とする請求項１記載のＬ−アミノ酸の製造方法。 - 【請求項３】得られるＬ−アミノ酸が、下記一般式
（Ｉ） 【化１】 （ここでＲは炭素数２個から４個のアルキル基である）
であることを特徴とする請求項１または２記載のＬ−ア
ミノ酸の製造方法。 - 【請求項４】得られるＬ−アミノ酸が非天然アミノ酸で
あることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記
載のＬ−アミノ酸の製造方法。 - 【請求項５】アミノ酸デヒドロゲナーゼがロイシンデヒ
ドロゲナーゼであることを特徴とする請求項１から４の
いずれか１項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002094837A JP2003284583A (ja) | 2002-03-29 | 2002-03-29 | アミノ酸デヒドロゲナーゼによるｌ−アミノ酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002094837A JP2003284583A (ja) | 2002-03-29 | 2002-03-29 | アミノ酸デヒドロゲナーゼによるｌ−アミノ酸の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003284583A true JP2003284583A (ja) | 2003-10-07 |
Family
ID=29238626
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002094837A Pending JP2003284583A (ja) | 2002-03-29 | 2002-03-29 | アミノ酸デヒドロゲナーゼによるｌ−アミノ酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003284583A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102978249A (zh) * | 2012-11-19 | 2013-03-20 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 6-氰基-（3r,5r）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法 |
| US9273332B2 (en) | 2006-10-12 | 2016-03-01 | Kaneka Corporation | Method for production of L-amino acid |
-
2002
- 2002-03-29 JP JP2002094837A patent/JP2003284583A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9273332B2 (en) | 2006-10-12 | 2016-03-01 | Kaneka Corporation | Method for production of L-amino acid |
| CN102978249A (zh) * | 2012-11-19 | 2013-03-20 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 6-氰基-（3r,5r）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法 |
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