WO2008032796A1

WO2008032796A1 - Nouveau vaccin canin

Info

Publication number: WO2008032796A1
Application number: PCT/JP2007/067873
Authority: WO
Inventors: Masayuki Okazaki; Takahiro Yoshimura; Toshihiro Tsukui; Shigehiro Iwabuchi
Original assignee: Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
Priority date: 2006-09-13
Filing date: 2007-09-13
Publication date: 2008-03-20
Also published as: US20110091490A1; EP2062972A4; JPWO2008032796A1; EP2062972A1

Description

明細書

新規ィヌ用ワクチン

技術分野

[0001] 本発明はィヌジステンパーウィルス感染症、ィヌアデノウイルス 2型感染症及びィヌパルボウイルス感染症に対するィヌ感染症用ワクチンに関する。

背景技術

[0002] ィヌジステンパーウィルス（Canine Distemper Virus; CDV)は、発熱、中枢神経症状、呼吸器症状、下痢症を呈するィヌの急性の全身性疾病の原因ウィルスである。子ィヌで感染する確率が高ぐ致死率も高い。感染をして一旦は回復しても、中枢神経症状のような後遺症がでたり、ウィルスが体内に潜伏し、数ケ月〜数年後に再発することがある。代表的な症状は、くしゃみ、鼻水、咳などの呼吸器症状であり、その他に、消化器症状、神経症状などが認められる。消化器症状は、嘔吐、水様性の下痢、血便などであり、神経症状は、興奮、てんかん様発作、チック、後躯マヒ、運動失調などである。

[0003] ィヌアデノウイルス 2型（Canine adeno virus type2; CAV2)は、ィヌ伝染性咽頭気管炎の原因として知られている。ィヌジステンパーを除ぐ咳、くしゃみ等の呼吸器症状を示す伝染性の急性 ·慢性の疾病を総称してケンネルコフと呼ぶ力ィヌアデノウィルス 2型は、ケンネルコフの原因ウィルスの 1つである。また、 CAV2力なるワクチンは、ィヌ伝染性肝炎を引き起こすィヌアデノウイルス 1型 (CAV1)と共通の抗原性を有すること力 S失口られている。

[0004] ィヌパルボウイルス（Canine parvovirus; CPV)は、強烈な下痢を主徴とする消化器症状を引き起こし、さらに仔ィヌでは心筋炎を生じ、死に至らしめる。パルボウイルスは、消毒液、野外環境要因等に対して強い抵抗性を持ち、感染ィヌの排泄した便に大量に含まれ、体外に排泄されたあともすぐには死滅せずに自然環境下で数年間生存する。

[0005] このように上記 3種類のウィルス感染症は重症度が高ぐ特に仔ィヌが感染した場合、その死亡率の高さが問題になっていた。 [0006] これらのウィルス感染症に対しては、すでにワクチンが開発されている (特許文献 1 及び 2を参照）。これらの感染症に対しては、それぞれのウィルスに対する単味ヮクチンの他、 2種混合ワクチン及び 3種混合ワクチンなどが用いられている。

[0007] 使用されているワクチンは注射投与用のものであり、アナフィラキシーや過敏症等の副作用が生じ得ることが報告されている (非特許文献 1参照)。また、注射投与のためィヌに痛みやストレスを与えるという問題もあった。さらに、混合ワクチンとして用いる場合、ウィルス同士の干渉により、ウィルスの増殖が抑制され該ウィルスに対する抗体価が上昇しないという問題もあった。特にジステンパーウィルスワクチンとパルボウィルスの混合ワクチンで干渉が生じやすかつた（非特許文献 2参照）。

特許文献 1：特許 3040157号公報

特許文献 2：特表 2004-501979号公報

非特許文献 l : Gaskell. R.M. et al.， Vet，Rec. l50， 126-34 (2002)

非特許文献 2 : GEMMA Τ·， et al.， J.Vet.Med，Sci.57(3):535- 537, 1995

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 本発明は、経口接種可能なィヌジステンパーウィルス感染症、ィヌアデノウイルス 2 型感染症及びィヌパルボウイルス感染症に対するワクチンの提供を目的とする。課題を解決するための手段

[0009] 従来、用いられていたィヌジステンパーウィルス感染症、ィヌアデノウイルス 2型感染症及びィヌパルボウイルス感染症に対するワクチンの多くは注射投与用であった。注射で投与した場合、アレルギー症状等の副作用が起こりやすいという問題があつた。

[0010] また、生まれたば力、りの仔ィヌは、母ィヌから移行抗体を付与されており、該移行抗体が仔ィヌ個体に残存している時期にワクチンを接種しても、母ィヌから受け継がれた移行抗体によってワクチンは中和されてしま!/、、免疫を獲得することができな!/、とレヽう問題があった。初乳摂取により、生後 2日以内に受動的に獲得されたこの移行抗体は、生後まもなく徐々に減少し始め、個体差がある力一般に生まれてから 12〜14週間目位でほぼ無くなる。仔ィヌのワクチン接種は母ィヌからの移行抗体の切れた直後の時期に行なうのが理想的と言われている。し力もながら、現実的には母ィヌからの移行抗体が減少する時期に、ィヌジステンパーウィルス感染症、ィヌアデノウイルス 2 型感染症及びィヌパルボウイルス感染症に罹患する場合が多ぐこれらの感染症から確実に仔ィヌを防御することができないという問題があった。

[0011] 本発明者は、ィヌジステンパーウィルス、ィヌアデノウイルス 2型及びィヌパルボウイノレスの強毒株である野外分離株を弱毒化して新規な株を確立した。従来のワクチンが注射投与用であり、従来のワクチンを経口投与しても、ィヌに免疫を成立させることはできなかった。一方、本発明者らが新たに確立した株は経口投与または経鼻投与等の経粘膜投与又は経消化器投与によりィヌに投与してもィヌに免疫を成立させることができ、注射投与による副作用の問題を回避することができることを見出した。また、本発明者等が確立した株は、混合ワクチンとして投与した場合でもウィルス同士が干渉を起こさず混合したすべての株に対して抗体価が上昇した。さらに、これらのワクチンを仔ィヌに経口投与した場合、母ィヌからの移行抗体により中和されることなぐ仔ィヌに免疫を成立させ得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。

[0012] すなわち、本発明は以下の通りである。

[0013] [1] 配列番号 1で表される塩基配列又は配列番号 1で表される塩基配列において、

1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる VP2遺伝子を有するィヌパルボウイルス F3株。

[0014] [2] 以下の（1 )〜（7)のいずれかのウィルスである [1]のィヌパルボウイルス F3株：

( 1 )配列番号 26に表される塩基配列を含む DNAからなるゲノムを有するウィルス；

(2)配列番号 26に表される塩基配列の連続する 500、 750、 1000、 1250、 1500、 1750 、 2000、 2250、 2500、 2750、 3000、 3250、 3500、 3750又は 4000塩基からなる塩基配列を含む DNAからなるゲノムを有するウィルス；

(3)配列番号 26に表される塩基配列の 188、 200若しくは 630番目の塩基〜 4000若しくは 4017番目の塩基配列を含む DNAからなるゲノムを有するウィルス；

(4)配列番号 26に表される塩基配列の 188、 200若しくは 630番目の塩基〜 480番目の塩基配列を含む DNAからなるゲノムを有するウィルス；

(5)配列番号 26に表される塩基配列の 500番目の塩基〜 4000若しくは 4017番目の塩基配列を含む DNAからなるゲノムを有するウィルス；

(6)上記（1)〜（5)のゲノムの塩基配列からなる DNAに相補的な配列からなる DNAとストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件でハイブリダィズする DNAからなるゲノムを有するウィルス；並びに

(7)上記（1)〜（5)のゲノムの塩基配列からなる DNAと 95%以上の相同性を有して!/、る DNAからなるゲノムを有するゥイノレス。

[0015] [3] 配列番号 5で表される塩基配列又は配列番号 5で表される塩基配列において、

1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる LITR E1A2 遺伝子を有し、かつ配列番号 7で表される塩基配列又は配列番号 7で表される塩基配列において、 1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる RITR遺伝子を有するィヌアデノウイルス 2型 F 朱。

[0016] [4] ECACC(European Collection of Cell Cultures)に受託番号 07071601で寄託されたィヌアデノウイルス 2型 F 朱。

[0017] [5] 配列番号 9で表される塩基配列又は配列番号 9で表される塩基配列において、

1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる H遺伝子を有し、かつ配列番号 12で表される塩基配列又は配列番号 12で表される塩基配列において、 1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる F遺伝子を有するィヌジステンパーウィルス 95-54株。

[0018] [6] ECACC(European Collection of Cell Cultures)に受託番号 07071602で寄託されたィヌジステンパーウィルス 95-54株。

[0019] [7] [1]又は [2]のィヌパルボウイルス F3株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化ィヌパルボウイルス株。

[0020] [8] [7]の弱毒化ィヌパルボウイルス株であって、配列番号 1で表される VP2遺伝子の塩基配列において、第 885、 886、 892、 894及び 895番目の 1つ又は複数、好ましくはすべての塩基が変異した塩基配列を有する弱毒化ィヌパルボウイルス株。

[0021] [9] 第 891番目と 892番目の塩基の間に 2塩基が揷入され、及び/又は第 901番目と

902番目の塩基の間に 100塩基が揷入された塩基配列を有する、 [7]又は [8]の弱毒化ィヌパルボウイルス株。 [0022] [10] [3]又は [4]のィヌアデノウイルス 2型 F 朱を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化ィヌアデノウイルス 2型株。

[0023] [11] [10]の弱毒化ィヌアデノウイルス 2型株であって、配列番号 5で表される LITR 遺伝子において、 1つ又は複数の塩基が変異した塩基配列を有する弱毒化ィヌアデノウィルス 2型株。

[0024] [12] [5]又は [6]のィヌジステンパーウィルス 95-54株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化ィヌジステンパーウィルス株。

[0025] [13] [12]の弱毒化ィヌジステンパーウィルス株であって、以下の（1)〜（3)の変異の少なくとも 1つの変異を有する弱毒化ィヌジステンパーウィルス株：

(1)配列番号 12で表される F遺伝子にける第 394及び/又は 523番目の塩基の変異

(2)配列番号 10で表される H遺伝子における第 56、 74、 78、 94、 100、 110、 116、 128 、 135、 142、 156、 159、 174、 176、 182、 204、 218、 278、 306、 311、 320、 350、 374、 389 、 398、 407、 416、 437、 446、 452、 456、 482、 485、 489、 495、 499、 531、 542、 548、 551 、 553、 557、 558、 572、 598、 610、 614、 626、 629、 632、 647、 650、 659、 664、 680、 689 、 698、 707、 716、 732、 737、 741、 753、 755、 776、 785、 788、 792、 812、 821、 850、 872 、 884、 888、 914、 923、 929、 932、 935、 946、 947、 955、 957、 968、 977、 978、 983、 999

、 1010、 1011、 1016、 1019、 1044、 1051、 1067、 1076、 1079、 1094、 1096、 1115、 1116

、 1120、 1136、 1139、 1146、 1147、 1160、 1176、 1184、 1214、 1232、 1255、 1263、 1268

、 1269、 1292、 1295、 1301、 1319、 1325、 1351、 1356、 1374、 1382、 1385、 1395、 1406

、 1442、 1444、 1445、 1454、 1457、 1466、 1479、 1499、 1511、 1514、 1520、 1525、 1535

、 1537、 1538、 1559、 1570、 1585、 1592、 1604、 1607、 1608、 1609、 1610、 1615、 1619

、 1644、 1657、 1658、 1676、 1720、 1733、 1734、 1758、 1762、 1776、 1778、 1838、 1840

、 1845、 1851、 1871、 1877、 1879、 1889、 1894、 1896、 1908及び 1911番目の塩基の 1 つ又は複数、好ましくはすべての変異、

(3)配列番号 10で表される H遺伝子における第 628、 634、 644、 648、 657、 681、 683、 718、 744、 748、 823及び 1406番目の塩基の 1つ又は複数、好ましくはすべての変異。

[14] [7]〜[9]のいずれかの弱毒化ィヌパルボウイルス株、 [10]若しくは [11]の弱毒化ィヌアデノウイルス 2型株並びに [12]若しくは [13]の弱毒化ィヌジステンパーウィルス株からなる群力、ら選択されるウィルス株の 1種、 2種又は 3種を含むィヌウィルス感染症ワクチン。

[0027] [15] [7]〜[9]のいずれかの弱毒化ィヌパルボウイルス株、 [10]若しくは [11]の弱毒化ィヌアデノウイルス 2型株並びに [12]若しくは [13]の弱毒化ィヌジステンパーウィルス株からなる群から選択されるウィルス株の 3種類を含むィヌウィルス感染症混合ワクチン。

[0028] [16] 異なるウィルス株同士の間で干渉が生じない、 [14]又は [15]のィヌウィルス感染症混合ワクチン。

[0029] [17] ィヌジステンパーウィルスとィヌパルボウイルスの間で干渉が生じない、 [16]のィヌウィルス感染症混合ワクチン。

[0030] [18] 経口接種用である、 [14]〜[； 17]のいずれかのィヌウィルス感染症ワクチン。

[0031] [19] 生後 4〜18週までの仔ィヌに接種した場合に、免疫が成立し得る仔ィヌ用の [1

4]〜[； 18]のいずれかのィヌウィルス感染症ワクチン。

[0032] [20] [7]〜[9]のいずれかの弱毒化ィヌパルボウイルス株、 [10]若しくは [11]の弱毒化ィヌアデノウイルス 2型株並びに [12]若しくは [13]の弱毒化ィヌジステンパーウィルス株からなる群から選択されるウィルス株の 1種、 2種又は 3種をィヌに経口接種することを含む、ィヌのウィルス感染症を防御する方法。

[0033] [21] 異なるウィルス株同士の間で干渉が生じない、 [20]のィヌのウィルス感染症を防御する方法。

[0034] [22] ィヌジステンパーウィルスとィヌパルボウイルスの間で干渉が生じない、 [20]又は [21]のィヌのウィルス感染症を防御する方法。

[0035] [23] 生後 4〜18週の仔ィヌに接種する、 [20]〜[22]のいずれかのィヌのウィルス感染症を防御する方法。

発明の効果

[0036] 本発明の新規な弱毒化ィヌジステンパーウィルス株、ィヌアデノウイルス株及びィヌパルボウイルス株は、経口投与によりィヌに免疫を成立させることができる。経口投与が可能になることにより、ワクチン接種に力、かる時間やコストが低減される。また、一度に多数のィヌに集団投与することも可能である。さらに、母ィヌからの移行抗体を保持している仔ィヌに対して投与した場合も、移行抗体により中和排除されることなぐ仔ィヌに対して免疫を成立させることが可能である。従って、ィヌジステンパーウィルス感染症、ィヌアデノウイルス 1型及び 2型感染症及びィヌパルボウイルス感染症に罹患するリスクにさらされている、移行抗体が減少している力従来のワクチンを中和してしまう仔ィヌにも投与することができ、仔ィヌをこれらのウィルス感染症から防御すること力 Sでさる。

[0037] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2006-248522号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。

図面の簡単な説明

[0038] [図 1A]ィヌパルボウイルスの VP2遺伝子の 10代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である。

[図 1B]ィヌパルボウイルスの VP2遺伝子の 10代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図 1Aの続き）。

[図 1C]ィヌパルボウイルスの VP2遺伝子の 10代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図 1Bの続き）。

[図 2A]ィヌパルボウイルスの N遺伝子の 10代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である。

[図 2B]ィヌパルボウイルスの N遺伝子の 10代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図 2Aの続き）。

[図 2C]ィヌパルボウイルスの N遺伝子の 10代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図 2Bの続き）。

[図 3A]ィヌアデノウイルス 2型の LITR E1A遺伝子の 1代継代した株の塩基配列及び

50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である。

[図 3B]ィヌアデノウイルス 2型の LITR E1A遺伝子の 1代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図 3Aの続き）。

[図 3C]ィヌアデノウイルス 2型の LITR E1A遺伝子の 1代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図 3Bの続き）。 [図 3D]ィヌアデノウイルス 2型の LITR E1A遺伝子の 1代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図 3Cの続き）。

[図 4]ィヌアデノウイルス 2型の RITR遺伝子の 1代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である。

[図 5A]ィヌジステンパーウィルスの H遺伝子の親株の塩基配歹 IJ、 14代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である。

[図 5B]ィヌジステンパーウィルスの H遺伝子の親株の塩基配歹 IJ、 14代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図 5Aの続き）。

[図 5C]ィヌジステンパーウィルスの H遺伝子の親株の塩基配歹 IJ、 14代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図 5Bの続き）。

[図 5D]ィヌジステンパーウィルスの H遺伝子の親株の塩基配歹 IJ、 14代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図 5Cの続き）。

[図 5E]ィヌジステンパーウィルスの H遺伝子の親株の塩基配歹 IJ、 14代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図 5Dの続き）。

園 6A]ィヌジステンパーウィルスの F遺伝子の親株の塩基配列及び 14代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である。

園 6B]ィヌジステンパーウィルスの F遺伝子の親株の塩基配列及び 14代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図 6Aの続き）。

園 6C]ィヌジステンパーウィルスの F遺伝子の親株の塩基配列及び 14代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図 6Bの続き）。

園 6D]ィヌジステンパーウィルスの F遺伝子の親株の塩基配列及び 14代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図 6Cの続き）。

園 6E]ィヌジステンパーウィルスの F遺伝子の親株の塩基配列及び 14代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図 6Dの続き）。 [図 7A]ィヌジステンパーウィルスの H遺伝子の 14代継代した株の塩基配列及び 50 代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である。

[図 7B]ィヌジステンパーウィルスの H遺伝子の 14代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図 7Aの続き）。

[図 7C]ィヌジステンパーウィルスの H遺伝子の 14代継代した株の塩基配列及び 50 代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図 7Bの続き）。

[図 8]ィヌパルボウイルス接種後の抗体価の推移を示す図である。

[図 9]ィヌパルボウイルスの感染防御試験の結果を示す図である。

[図 10]ィヌパルボウイルスの安全性試験の結果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0039] 本発明は、弱毒化されたィヌジステンパーウィルス、ィヌアデノウイルス 2型及びィヌパルボウイルスであり、これらの弱毒化ウィルスを含むィヌジステンパー用ワクチン、ィヌアデノウイルス 2型感染症ワクチン及びィヌパルボウイルス感染症ワクチンである。

[0040] 弱毒化は元来病原性を有する親株の毒性を低下させることを!/、い、弱毒化されたゥィルス株は感染性はある力病原性を有さなレ、。

[0041] 弱毒化させる親株としては、病原性のある野外からのウィルス分離株（ビルレント株 )を用いる。病原性のあるウィルス株は、ィヌから単離することができる。本発明で親株として用いる病原性のあるウィルス分離株は、ィヌジステンパーウィルスとしては 95 -54株、ィヌアデノウイルス 2型としては F 朱、ィヌパルボウイルスとしては F3株を用いればよい。弱毒化は親株を弱毒化する突然変異が蓄積するような時間、これらのウイルスを適当な培養細胞中で連続継代することにより、培養細胞へ馴化させて行う。連続継代は、ウィルス株による細胞系への感染、該宿主細胞からの該ウィルス子孫の回収、および該ウィルス子孫による宿主細胞への後続感染により次の継代を得ることを意味する。弱毒化のための継代のための培養細胞としては、 VERO細胞（アフリカミドリザル正常腎）、 MDCK細胞 (ィヌ正常腎）、 CRFK細胞（ネコ腎由来株化細胞）、 B9 5a (マーモセット由来の Bリンパ芽球細胞）、 A72 (ィヌ細胞）等を用いることができる。このうち、ィヌジステンパーウィルスの継代には、 VERO細胞又は B95a細胞、好ましくは VERO細胞が好適に用いられ、ィヌアデノウイルス 2型の継代には、 MDCK細胞又は CRFK細胞、好ましくは MDCK細胞が好適に用いられ、ィヌパルボウイルスの継代には、 A72細胞又は CRFK細胞が好適に用いられる。本発明の弱毒化されたウィルス株は、培養細胞を用いて少なくとも 10継代、好ましくは 50継代、さらに好ましくは 75継代、さらに好ましくは 100継代することにより得られる。ウィルスの継代培養は以下の方法で行なう。

1.細胞を継代する。

[0043] 2.単層を形成したら、培地を除去する。

[0044] 3.ウィルス液を接種する。

[0045] 4. 37°Cで 1時間吸着させる。

[0046] 5.細胞維持培地を加える。

[0047] 6. 37°Cの COインキュベーターで培養する。

[0048] 7. CPEが観察されたら、 80°Cで凍結するとともに更に継代する。

[0049] ィヌパルボウイルスの場合

1.細胞を継代する。

[0050] 2.ウィルス液を接種する。

[0051] 3. 37°Cの COインキュベーターで培養する。

[0052] 4. CPE力 S観察されたら、 80°Cで凍結するとともに更に継代する。

[0053] 親株からの目的ウィルスを連続継代することにより、変異株を取得する。ィヌに継代分離株を投与し、該ィヌの臨床プロフィールを確認することにより、これらの変異株が弱毒化された力、どうか決定することができる。あるウィルス株力 Sィヌに感染するが病気を発生させる能力を有さな!/、と確認されたら、それは弱毒化されたと判断することができる。

[0054] 弱毒化ウィルスを分離した後、そのゲノムの配列分析を行ってもよい。

[0055] 本発明の弱毒化ウィルスは、ウィルスの病原性に関与する遺伝子に変異が生じ、弱毒化されている。ウィルスの病原性に関与する遺伝子として、ィヌパルボウイルスで (ま、 VPHvirion capsid) proteini c VP2(virion capsid protein2)をコード" 5 O退子、等力、あり、メシスアンノヽーゥイノレスで (ま、 F(fusion protein) H(hemagglutinin protein八等がある。

[0056] 3種類のウィルスの以下に掲げる遺伝子の親株（Challenge株）の塩基配列又は継代した株の塩基配列の配列を以下の配列番号として配列表に示す。

[0057] ィヌノノレボウイノレス

VP2 10代継代配列番号 1

VP2 50代継代配列番号 2

N 10代継代配列番号 3

N 50代継代配列番号 4

ィヌアデノウイルス 2型

LITR E1A 1代継代配列番号 5

LITR E1A 50代継代配列番号 6

RITR 1代継代配列番号 7

RITR 50代継代配列番号 8

ィヌジステンノーウイノレス

H 親株（Challenge株）配列番号 9

H 14代継代配列番号 10

H 50代継代配列番号 11

F 親株（Challenge株）配列番号 12

F 14代継代配列番号 13

NP 14代継代配列番号 14

NP 50代継代配列番号 15

ィヌパルボウイルスの VP2遺伝子の 10代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列の比較を図 1A〜1Cに示す。

[0058] ィヌパルボウイルスの N遺伝子の 10代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列の比較を図 2A〜2Cに示す。

[0059] ィヌアデノウイルス 2型の LITR E1A遺伝子の 1代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列の比較を図 3A〜3Dに示す。

[0060] ィヌアデノウイルス 2型の RITR遺伝子の 1代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列の比較を図 4に示す。

[0061] ィヌジステンパーウィルスの H遺伝子の親株の塩基配歹 1]、 14代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列の比較を図 5A〜5Eに示す。

[0062] ィヌジステンパーウィルスの F遺伝子の親株の塩基配列及び 14代継代した株の塩基配列の比較を図 6A〜6Eに示す。

[0063] ィヌジステンパーウィルスの NP遺伝子の 14代継代した株の塩基配列及び 50代継代した株の塩基配列の比較を図 7A〜7Cに示す。

[0064] 図 1〜7の塩基配列のアラインメントにより、継代により変異する遺伝子が存在することがわかる。これらの遺伝子の変異は、ウィルスの弱毒化に関与しているものと考えられる。

[0065] ィヌパルボウイルスにおいては、 VP2遺伝子において、 50代継代したもので 10代継代したものに対して、第 885、 886、 892、 894及び 895番目の塩基が置換され、 50代継代したものにおいて、第 892及び 893番目の 2塩基（10代継代したものの第 891番目と 892番目の塩基の間）並びに第 902から 1003番目の塩基（10代継代したものの第 901 番目と 902番目の塩基の間）が揷入されて!/、る。

[0066] ィヌジステンパーウィルスにおいては、 F遺伝子において、 14代継代したもので親株に対して、第 394及び 523番目の塩基が置換されている。また、 H遺伝子において、

50代継代したもので、親株に対して、第 56、 74、 78、 94、 100、 110、 116、 128、 135、 1

42、 156、 159、 174、 176、 182、 204、 218、 278、 306、 311、 320、 350、 374、 389、 398、 4

07、 416、 437、 446、 452、 456、 482、 485、 489、 495、 499、 531、 542、 548、 551、 553、 5

57、 558、 572、 598、 610、 614、 626、 629、 632、 647、 650、 659、 664、 680、 689、 698、 7

07、 716、 732、 737、 741、 753、 755、 776、 785、 788、 792、 812、 821、 850、 872、 884、 8

88、 914、 923、 929、 932、 935、 946、 947、 955、 957、 968、 977、 978、 983、 999、 1010、

1011、 1016、 1019、 1044、 1051、 1067、 1076、 1079、 1094、 1096、 1115、 1116、 1120 1136、 1139、 1146、 1147、 1160、 1176、 1184、 1214、 1232、 1255、 1263、 1268、 1269 1292、 1295、 1301、 1319、 1325、 1351、 1356、 1374、 1382、 1385、 1395、 1406、 1442 1444、 1445、 1454、 1457、 1466、 1479、 1499、 1511、 1514、 1520、 1525、 1535、 1537 1538、 1559、 1570、 1585、 1592、 1604、 1607、 1608、 1609、 1610、 1615、 1619、 1644 1657、 1658、 1676、 1720、 1733、 1734、 1758、 1762、 1776、 1778、 1838、 1840、 1845、 1851、 1871、 1877、 1879、 1889、 1894、 1896、 1908及び 1911番目の塩基が置換されている。さらに、 50代継代したもので、 14代継代したものに対して、第 628、 634、 644 、 648、 657、 681、 683、 718、 744、 748、 823及び 1406番目の塩基が置換されている。

[0067] 本発明は、ィヌより分離されたそれぞれのウィルスの親株である、ィヌパルボウイノレス F3株、ィヌアデノウイルス 2型 F 朱及びィヌジステンパーウィルス 95-54株を包含す

[0068] ィヌアデノウイルス 2型 F 朱及びィヌジステンパーウィルス 95-54株は、 2007年 7月 1 6日付で Eし Aしし (European collection of Cell (cultures, Centre ror emergency Pr eparedness and Response, The Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, SP4 0JG， UK)に、ブタペスト条約に基づきそれぞれ受託番号 07071601及び受託番号 07071602として寄託されて!/、る。

[0069] ィヌパルボウイルス F3株は、配列番号 1で表される塩基配列又は配列番号 1で表される塩基配列において、 1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる VP2遺伝子を有し、及び/又は配列番号 3で表される塩基配列又は配列番号 3で表される塩基配列において、 1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる N遺伝子を有する。「1個又は数個」の「数個」とは 9個以内、好ましくは 5個以内、さらに好ましくは 2個をいう。

[0070] ィヌアデノウイルス 2型 F 朱は、配列番号 5で表される塩基配列又は配列番号 5で表される塩基配列において、 1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる LITR E1A2遺伝子を有し、及び/又は配列番号 7で表される塩基配列又は配列番号 7で表される塩基配列において、 1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる RITR遺伝子を有する。「1個又は数個」の「数個」とは 9個以内、好ましくは 5個以内、さらに好ましくは 2個をいう。

[0071] ィヌジステンパーウィルス 95-54株は、配列番号 9で表される塩基配列又は配列番号 9で表される塩基配列において、 1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる H遺伝子を有し、及び/又は配列番号 12で表される塩基配列又は配列番号 12で表される塩基配列において、 1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる F遺伝子を有する。また、さらに配列番号 14 で表される塩基配列又は配列番号 14で表される塩基配列において、 1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる NP遺伝子を有して!/、てもよい。「1個又は数個」の「数個」とは 9個以内、好ましくは 5個以内、さらに好ましくは 2 個をいう。

[0072] 配列番号 26にィヌパルボウイルス F3株の全長配列に近!/、部分配列を示す。該配列は全長配列の約 75〜80 %に相当する。該配列はショットガン ·シークェンシング法で解析した配列であり、一部クォリティーの低い塩基も存在する。本発明のィヌパルボウイルス F3株は以下のいずれかのウィルスであると特定される。

[0073] (1)配列番号 26に表される塩基配列を含む DNAからなるゲノムを有するウィルス、

(3)配列番号 26に表される塩基配列の 188、 200若しくは 630番目の塩基〜 4000若しくは 4017番目の塩基配列を含む DNAからなるゲノムを有するウィルス、

(4)配列番号 26に表される塩基配列の 188、 200若しくは 630番目の塩基〜 480番目の塩基配列を含む DNAからなるゲノムを有するウィルス、

(5)配列番号 26に表される塩基配列の 500番目の塩基〜 4000若しくは 4017番目の塩基配列を含む DNAからなるゲノムを有するウィルス、

(6)上記（1 )〜（5)のゲノムの塩基配列からなる DNAに相補的な配列からなる DNAとストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件でハイブリダィズする DNAからなるゲノムを有するウィルスであり、ここで、ストリンジェントな条件とは、すなわち、 DNAを固定したフィルターを用いて、 0·7〜1·0Μの NaCl存在下、 68°Cでハイブリダィゼーシヨンを行つた後、 0.1〜2倍濃度の SSC溶液（1倍濃度の SSCとは 150mM NaCl、 15mMクェン酸ナトリウムからなる）を用い、 68°Cで洗浄することにより同定することができる条件、あるいは、サザンブロッテイング法によりニトロセルロース膜上に DNAを転写、固定後、ノヽイブリダィゼーシヨン緩衝液〔50%フオルムアミド、 4 X SSC、 50mM HEPES(pH7.0)、 1 O X デンハルツ（Denhardt' s)溶液、 100 g/mlサケ精子 DNA〕中で 42°Cでー晚反応させることによりハイブリッドを形成することができる条件をいう、並びに (7)上記（；！）〜（5)のゲノムの塩基配列からなる DNAと BLAST (Basic Local Alignmen t Search Tool at tne National Center for Biological Informatioru米国国 AL生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール） )等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも 85%以上、好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、さらに好ましくは 97%以上、さらに好ましくは 98%以上、特に好ましくは 99%以上の相同性を有している DNAからなるゲノムを有するウィルス。

[0074] 本発明のウィルスの弱毒株は、各ウィルスの親株から上記の変異部位に変異を有する塩基配列を有するウィルス株である。

[0075] すなわち、ィヌパルボウイルス F3株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化ィヌパルボウイルス株であって、配列番号 1で表される VP2遺伝子の塩基配列において、第 885、 886、 892、 894及び 895番目の塩基の 1つ又は複数、好ましくはすベてが変異した塩基配列を有する株であり、又はさらに第 891番目と 892番目の塩基の間に 2塩基が揷入され、及び/又は第 901番目と 902番目の塩基の間に 100塩基が揷入されていてもよい。

[0076] ィヌジステンパーウィルス 95-54株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化ィヌジステンパーウィルス株は、以下の（1)〜（3)の変異の少なくとも 1つ、好ましくは 2つ、さらに好ましくは 3つを有する株である。

[0077] (1)配列番号 12で表される F遺伝子にける第 394及び/又は 523番目の塩基の変異

〇

[0078] (2)配列番号 10で表される H遺伝子における第 56、 74、 78、 94、 100、 110、 116、 128

、 135、 142、 156、 159、 174、 176、 182、 204、 218、 278、 306、 311、 320、 350、 374、 389

、 398、 407、 416、 437、 446、 452、 456、 482、 485、 489、 495、 499、 531、 542、 548、 551

、 553、 557、 558、 572、 598、 610、 614、 626、 629、 632、 647、 650、 659、 664、 680、 689

、 698、 707、 716、 732、 737、 741、 753、 755、 776、 785、 788、 792、 812、 821、 850、 872

、 884、 888、 914、 923、 929、 932、 935、 946、 947、 955、 957、 968、 977、 978、 983、 999

1010、 1011、 1016、 1019、 1044、 1051、 1067、 1076、 1079、 1094、 1096、 1115、 1116 、 1120、 1136、 1139、 1146、 1147、 1160、 1176、 1184、 1214、 1232、 1255、 1263、 1268

、 1845、 1851、 1871、 1877、 1879、 1889、 1894、 1896、 1908及び 1911番目の塩基の 1 つ又は複数、好ましくはすべての変異。

[0079] (3)配列番号 10で表される H遺伝子における第 628、 634、 644、 648、 657、 681、 683、

718、 744、 748、 823及び 1406番目の塩基の 1つ又は複数、好ましくはすべての変異。

[0080] 本発明のワクチンは、ィヌジステンパー用ワクチン、ィヌアデノウイルス 1型及び 2型感染症ワクチン及びィヌパルボウイルス感染症ワクチンのそれぞれを単味ワクチンとして使用することもできるし、ィヌジステンパー用ワクチンとィヌアデノウイルス 1型及び 2型感染症ワクチン、ィヌジステンパー用ワクチンとィヌパルボウイルス感染症ヮクチン、又はィヌアデノウイルス 1型及び 2型感染症ワクチンとィヌパルボウイルス感染症ワクチンの 2種類の混合ワクチン又はィヌジステンパー用ワクチン、ィヌアデノウイルス 2型感染症ワクチン及びィヌパルボウイルス感染症ワクチンの 3種類の混合ワクチンとしてあ使用すること力でさる。

[0081] 本発明のワクチンは、混合して投与した場合であっても、ウィルス同士で干渉を起こすことなく、混合した弱毒ウィルス株のすべてについて抗体価が上昇し得る。特に、ィヌジステンパーウィルスワクチンとィヌパルボウイルスワクチンを含む混合ワクチンを用いた場合でも干渉は生じなレ、。

[0082] 本発明のワクチンの投与量は、公知のワクチンと同様である。ワクチン中のウィルスの含有量は、ィヌジステンパーウィルスは約 1 X 10²〜約 1 X 10¹²の 50%組織培養感染量 (TCID )、ィヌアデノウイルス 2型は約 1 X 10²〜約 1 X 10¹²の 50%組織培養感染量（

TCID )、ィヌパルボウイルスは約 1 X 10²〜約 1 X 10¹²の 50%組織培養感染量 (TCID

)である。ワクチンの TCID は細胞変性効果（cytopathic effect; CPE)の有無により測定する。 CPEは、培養細胞が顆粒状や円形化、膨化などいろいろな形態を示し、最後には培養容器から脱落して細胞維持液中を浮遊することを!/、い、顕微鏡で確認すること力 Sでさる。

[0083] 本発明のワクチンは、獣医学的に有効量の本発明のウィルスワクチンを有効成分として含んでおり、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルシヨンの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤、アジュバント等の医薬的に許容できる希釈剤、助剤、担体等を含んでいてもよい。ワクチンは、経口、経鼻、経粘膜、筋肉内または皮下、鼻腔内、気管内、皮膚、経皮または皮内の各経路によって接種できる。この中でも経口接種、経鼻接種及び経粘膜接種が好ましい。また、本発明のワクチンは飲料水や餌に含ませた状態でィヌに摂取させてもよい。本発明は、ワクチンを含む飲料水及び餌も包含する。

[0084] 本発明のワクチンは、母ィヌからの移行抗体を有しており、通常の注射による接種では移行抗体によりワクチンウィルスが排除され、免疫が成立しなレ、仔ィヌに対しても免疫を成立させることができる。仔ィヌとしては、移行免疫を有している生後 4〜 18週、好ましくは 4〜8週の仔ィヌが対象となる。

実施例

[0085] 本発明を以下の実施例によって具体的に説明する力本発明はこれらの実施例によって限定されるものではなレ、。

[0086] 実施例 1 ウィルスの弱毒化

ウィルス親株は以下のようにして分離した。

[0087] ィヌパルボウイルス F3株は、福島県郡山巿保健所より入手した雑種犬粪便より常法により分離した。

[0088] ィヌアデノウイルス 2型 F 朱は日本全薬工業株式会社内にして飼育して!/、た自家繁殖ビーグル犬咽喉等拭い液より常法により分離した。

[0089] ィヌジステンパーウィルス 95-54株は、日本全薬工業株式会社に検査依頼のあった犬鼻汁検体より日本全薬工業株式会社が分離した。

[0090] ウィルスの継代培養は以下の方法で行なった。

1.細胞を継代する。

[0092] 2.単層を形成したら、培地を除去する。 [0093] 3.ウィルス液を接種する。

[0094] 4. 37°Cで 1時間吸着させる。

[0095] 5.細胞維持培地を加える。

[0096] 6. 37°Cの COインキュベーターで培養する。

[0097] 7. CPE力 S観察されたら、 80°Cで凍結するとともに更に継代する。

[0098] ィヌパルボウイルスの場合

1.細胞を継代する。

[0099] 2. ウィルス液を接種する。

[0100] 3. 37°Cの COインキュベーターで培養する。

[0101] 4. CPE力 S観察されたら、 80°Cで凍結するとともに更に継代する。

[0102] 実施例 2 ウィルス遺伝子の特定領域の配列決定

ィヌジステンパーウィルス（CDV) H及び F遺伝子配列の決定

10cm径の細胞培養用シャーレ（ファルコン製）にフルシート状に発育した Vero細胞に 2〜3mLのウィルス液を接種し、 37°Cで 1時間吸着後、増殖用培地 15mlを加え、 37 °Cで 3〜4日間培養した。細胞変性効果が全体の 50%程度となった時点で、市販の R NA抽出キット（TRIZOL試薬、ライフテックオリエンタル製）を用いて、ウィルス感染細胞内から全 RNAを抽出した。操作は添付の使用説明書に従った。すなわち、シヤーレから培地を除き、細胞に lmlの TRIZOL試薬を加え、ピペッティングによりホモジナイズし、得られた細胞溶解液を 1.5ml遠心チューブに移して室温で 5分間静置した。これに 0.2mlのクロ口ホルムを加え、混和後、室温で 3分間静置した。遠心（12000 X g、 15分間、 4°C)後、水層を別の遠心チューブに移してイソプロパノール沈殿操作を行つた。得られた沈殿を 75%エタノールで遠心洗浄（7500 X g、 5分間、 4°C)し、風乾後、ジェチルピロカーボネート処理水（DEPC水）で 0.5〜1.0 g / 1の濃度に溶解したものをウィルス RNA溶液とした。

[0103] 逆転写反応には 0.5mlチューブを用い、ウィルス RNA溶液 1 μ 1、 CDV H又は Fリバースプライマー 0.25 1、 5 X 1st Strand Buffer (逆転写酵素添付品） 2 1及び DEP C水 4.55 1を加えて全量を 7.8 1とし、さらにミネラルオイル (Sigma製、 DNase、 RNas e、 and Proteaseフリー）を 1滴重層した。 70°Cで 10分間加熱後、直ちに氷冷した。次いで、 M-MLV逆転写酵素（200 units/ 1ライフテックオリエンタル製） 0.5 1、デォキシヌクレオチド混合溶液（Pharmacia製） 0.5 1、 0.1Mジチオスレィトール 1 μ 1及び RN ase阻害剤（RNasin ; 40 units / μ ΐ ΤΟΥΟΒΟ製） 0.2 1を加えて総量 10〃 1の RT反応液とし、 37°Cで 1時間反応させ CDV H及び F遺伝子 mRNAの cDNAを合成した。反応終了後、 70°Cで 10分間加熱した。

[0104] この RT反応液全量に 10 X PCR Buffer (Taq DNAポリメラーゼ添付品） 10 μ 1、各プライマー（CDV Ηフォワードプライマー及びリバースプライマー又は CDV Fフォワードプライマー及びリバースプライマー） 0.5 μ 1ずつ、 dNTPs Mixture (各 2.5mM、 Taq DN Aポリメラーゼ添付品） 8 1、滅菌蒸留水 70.5 1及び Taq DNAポリメラーゼ（TaKaRa EX Taq ; 5 units /〃 1、宝？酉造製） 0·5 μ 1をカロえて全量 100 μ 1の PCR反応 ί夜とした。 Ρ CR用の DNA増幅装置はサーマルサイクリックリアクター（TC_100、東洋紡エンジニアリング製）を用い、これに PCR反応液をセットし、 94°C 1分間、 58°C 1分間、 72°C 2分間のサイクルを 30回繰り返した。反応終了後、反応液の一部をとり、 0.7%ァガロースゲルで電気泳動を行い、ェチジゥムブロマイド染色後、紫外線照射下で CDV H及び F遺伝子 DNAの増幅を確認した。

[0105] その後、宝酒造 (株)遺伝子解析センターにシークェンス及び遺伝子解析を委託した。

[0106] ィヌアデノウイルス 2型（CAV2)遺伝子配列の決定

75cm²角型培養フラスコにフルシート状に発育した MDCK細胞を、 10mlのリン酸緩衝液で洗浄した後、ウィルス液を lml接種した。 37°Cで 30分間静置してウィルスを吸着させた後、これに 20mlの細胞増殖用培地を加えて、 37°Cで 40時間静置培養した。

[0107] ウィルス感染細胞からのウィルス DNAの抽出は、品川らの方法 (Shinagawa et.al. Mi crobiol.Immunol. 27 817-822 1983)に従って実施した。

[0108] 培地を除去し、 2mlの細胞溶解液を加え室温に 10分間静置した後、 37°Cで 5分間保温した。これに 0.5mlの 5M塩化ナトリウムを加え穏やかに反転攪拌し、 37°Cに 5分間保温後、 3〜4時間氷冷した。 10000 X gで 5分間遠心し、上清に 10mMトリス-塩酸緩衝液で飽和させたフエノールを等量加え、室温で 10分間振盪後、 16000 X gで 10分間遠心した。水層を除去し、フエノール層に等量の 10mMトリス -塩酸緩衝液を加え同様に振盪、遠心した。水層を完全に除去後、フエノール層に 1.5倍容のエタノールを加えて、 10分間氷冷し、 4000 X gで 10分間遠心した。

[0109] 得られた沈殿を 0.5mlの 80%エタノールで洗浄後、 0.5mlの TENS溶液に溶解し、これに 250〜500 gの Proteinase 粉末を加え、不溶性物質が確認できなくなるまで約 1時間 37°Cで保温した。この酵素分解溶液に等量のフエノール：クロ口ホルム（1： 1) を加えて同様の操作を行い、さらにこの水層に等量のクロ口ホルムを加えて同様に処理した。得られた水層に 1/10容の 3M酢酸ナトリウム溶液と lmlのエタノールを加え、 70°Cにて 1時間静置後、 10000 X gで 10分間遠心した。得られた沈殿を 80%ェタノールで洗浄後、 20 1の TE緩衝液に溶解しウィルス DNA溶液とした。

[0110] その後、宝酒造 (株)遺伝子解析センターにシークェンス及び遺伝子解析を委託した。

[0111] ィヌパルボウイルス（CPV) VP-2遺伝子の配列決定

CPVにおける VP-2遺伝子解析は、以下の方法にて実施した。増殖用培地で調整した A72細胞浮遊液（7 X 10⁵/ml) 5mlに 2〜3mlのウィルス液を加え、 25cm²の角型培養フラスコ（ファルコン製）に播種した。 37°Cで 3〜4日間培養し、細胞変性効果が全面に拡がった時点で培養液を回収した。遠心（3000rpm、 10分間）後、得られた上清を滅菌蒸留水で 100倍希釈したものをウィルス希釈液とした。

[0112] 0.5mlチューブにウィルス希釈液 5 1、 10 X PCR Buffer (Taq DNAポリメラーゼ添付品） 10 1、各プライマー（VP-2フォワードプライマー及びリバースプライマー） 0.5 a 1ずつ、 dNTPs Mixture (Taq DNAポリメラーゼ添付品） 8 1および滅菌蒸留水を加えて 95 μ 1とし、さらにミネラルオイル（Sigma製、 DNase、 RNase and Proteaseフリー）を一滴重層し、 DNA増幅装置（サーマルサイクリックリアクター · ΤΟ100、東洋紡ェンジニアリング製）にセットして、 94°Cで 5分間加熱した。次いで Taq DNAポリメラーゼ（Ta KaRa Ex Taq； 5 units/ μ 1、宝酒造製） 0.5 μ 1及び滅菌蒸留水を加えて全量 100 μ 1の PCR反応液とし、 94°C 30秒間、 55°C 2分間、 72°C 2分間のサイクルを 30回繰り返した。反応終了後、反応液の一部をとり、 0.7%ァガロースゲルで電気泳動を行い、ェチジゥムブロマイド染色後、紫外線照射下で遺伝子 DNAの増幅を確認した。

[0113] その後、宝酒造 (株)遺伝子解析センターにシークェンス及び遺伝子解析を委託した。

[0114] 配列決定において、 RT-PCRは以下のプライマーを用いて行った。

[0115] CDV H フォワードプライマー 5，- AATGCTAGAGATGGTTTAATT- 3，（配列番号 16)

リバースプライマー 5，- AGGGCTCAGGTAGTCCAGC-3' (配列番号 17) CDV F フォワードプライマー 5， - CATAGCAAGCCAACAGGTCAACCAGG-3' ( 配列番号 18)

リバースプライマー 5， -CCTGGCAATCAAGCGAGATATATG-3 (配列番号

19)

CPV VP- 2 フォワードプライマー 5，- ATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCA- 3，（配列番号 20)

リバースプライマー 5，- ATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGAG- 3，（配列番号 21)

実施例 3 ィヌジステンパーウィルスワクチンにつ!/、ての免疫原性試験及び感染防御試験からなる有効性評価試験、並びに病原性復帰試験からなる安全性評価試験 (1)有効性評価試験

ィヌジステンパーウィルス（CDV) 95-54株が経口接種で高!/、免疫原性を有する株であるかを調べるため、 Vero細胞で 24代継代し弱毒化した株をィヌに接種し CDVに対する中和抗体の産生について比較した。

[0116] 約 3か月齢のビーグル犬 12頭を性別および月齢から経口投与群 5頭、皮下注射群

2頭、非接種群 5頭の 3群に分けた。経口投与群の供試犬には 10^{5 5}/mLの濃度の CD V95-54株培養上清 2mL/頭を 3週間間隔で 2回経口および経鼻 (各 lmL)投与した。経鼻.経口による強毒株の攻撃は、約 10cmの長さに切断したファイバースコープ用噴霧カテーテル (PW-6C_1、ォリンパス光学工業製）の先端ノズル部分を 19Gの注射針に取り付け、 CDV抗体陰性犬の右側鼻腔内に挿入し、鼻咽頭部に噴霧して行った。皮下注射群の供試犬には 10^{5 5}/mLの濃度の CDV 95-54株培養上清 2mL/頭を 3 週間間隔で 2回皮下注射した。 1回目接種 2日前から 2回目接種後 3週間目まで毎日、供試犬の一般臨床観察を行った。両群ともに 1回目接種日力試験終了まで一週ごとに採血し、 CDV抗体価測定を実施した。

[0117] また、免疫を付与した犬が経鼻 ·経口攻撃して感染を防御することができるかどうかを、感染防御用の攻撃用ウィルスとして弱毒して!/、な!/、CDV95_54強毒株を用い確認した。経鼻 ·経口による強毒株の攻撃は、 10^{5 5}/mLの濃度の CDV95-54強毒株培養上清 lmlを、免疫原生を確認した方法と同様に 1回投与した。ウィルス接種前から接種後 21日目まで毎週血清を採取し、 CDV中和抗体価の測定を常法に従って実施した。

[0118] 表 1に示すように、皮下、経鼻 '経口群ともに、ワクチンとして良好な免疫原性を有し、感染防御効果が確認された。

[表 1]

S 帰

Q

病疫用ゥレスとして、 9 上清 (Vero細胞で 24代継代、 10⁵'⁸⁹ TCID /mL)を用いた。

[0120] 供試動物は生後約 3〜3.5か月の健康で CDV抗体陰性のビーグル犬を使用した。

[表 2]

[0121] 病原性復帰試験の 1代目及び継代 5代目には病原性試験を実施した。すなわち、供試犬 5頭に対し、 Vero細胞で 24代継代した 95- 54株培養上清を鼻腔及び口腔内へそれぞれ 1 mLずつ、シリンジを用いて滴下することで接種を行った。試験期間はワクチン接種前 4日目（一 4d)から接種後 21日目までとし、下記の検査を実施した。

[0122] 病原性復帰試験のウィルス継代用として、血液と粪便からウィルス検出を毎日行レ、、常法に従って継代した。

[0123] 病原性試験検査項目は以下の通りであった。

[表 3]

検査項目期間備考

一般臨床観察 - 2d〜14d：毎 B 元気、食欲

消化管症状（下痢、嘔吐）

体温測定

0d、 7d, 14d：毎通体 a測定

血液学的検査 - 2！〜 14d：毎日赤血球数

へモグロビン値

へマトクリツト値

白血球数

血小板数

血漿総蛋白

ウィルス検出 0d~14d：毎日血液、糞便からの CPV遗伝子検出（PCR法）

14d 採材臓器からの CPV遺伝子検出（PCR法）

採材鷗器：胸腺、扁桃、心臓、肝臓、脾

臓

腎臓、霄、十二指腸、空腸、回腸

盲腸、結腸、直腸、腸間膜リンパ節

骨髄、副腎、膀胱

抗体価測定 0d、 7d、 14d：毎週中和抗体価

病理学的検査 14d 病理解剖学的検査、病理組織学的検査

採材櫞器：胸腺、扁桃、心臓、肝臓、脾

臓

腎臓、胃、十二指腸、空腸、回腸

盲腸、結腸、直腸、腸問膜リンパ節

骨髄、副腎、膀咣

[0124] 病原性試験の結果、弱毒化ウィルス株は、 1頭にのみ、一過性の軽度の発熱が認められたが、ワクチンとして問題となるような病原性を有しないことが判明した。また、病原性の復帰も認められなかった。

[0125] 実施例 4 ィヌパルボウイルスワクチンについての免疫原性試験及び感染防御試験力なる有効性評価試験、並びに病原性復帰試験からなる安全性評価試験

( 1 )有効性評価試験

CPV免疫原性試験

供試ウィルスとして CPV F3株培養上清（l( ³°/mL) (Vero細胞 68代継代）を用いた

[0126] 供試動物として約 3か月齢のビーグル犬 5頭を用いた。約 3か月齢のビーグル犬 5 頭を CPV F3株培養上清 2mL/頭を 3週間間隔で 2回経口および経鼻 (各 ImL)投与した。 1回目接種 2日前から 2回目接種後 3週間目まで毎日、供試犬の一般臨床観察を行った。 1回目接種日から試験終了まで一週ごとに採血し、 CPV-HI価を測定することにより、 CPV抗体価測定を実施した。 [0127] CPV感染防御試験

供試ウィルスとして F3株 Vero細胞 68代継代培養上清（10⁵ °°TCID /mL)を用いた

[0128] 攻撃用ウィルスとして F3野外強毒株を用いた。

[0129] 供試動物として 4 5か月齢の健康で CPV抗体陰性のビーグル犬を用い、ワクチン候補株接種群として 5頭、対照群として 3頭、計 8頭用いた。

[0130] 免疫期間を終了した 6Wに、供試犬全頭に F3強毒株 lmLを経口投与し、攻撃した

。試験期間は攻撃前 2日目 (-2d)から攻撃後 14日目（14d)までとし、毎日採血を行い

、血中の CPVの有無を PCRによる CPV DNAの検出により行なうとともに、表 3に示した試験検査を行なった (但し、抗体価測定は HI抗体価)。

[0131] 結果を図 8及び 9に示す。用いた弱毒化パルボウイルスは、ワクチンとして十分な免疫原性を有し、また感染を防御することもできた。

[0132] (2) 安全性評価試験

CPV病原性復帰試験

[0133] 供試動物として約 3ヶ月齢の健康で CPV抗体陰性のビーグル犬 17頭を用いた。

[0134] 病原性復帰試験の 1代目及び継代 5代目には病原性試験を実施した。まず、供試犬 5頭に対し、 F3株培養上清を鼻腔及び口腔内へそれぞれ 1 mLずつ、シリンジを用いて滴下することで接種を行った。病原性復帰試験のウィルス継代用として、血液と粪便からウィルス検出を毎日行い、常法に従って継代した。病原性試験検査項目は以下の通りであった。

[0135] 検査項目は表 3に示すとおりであり、抗体価のみ HI価を測定した。

[0136] 結果を図 10に示す。病原性試験の結果、弱毒化ウィルス株は病原性を有しないことが判明した。また、病原性の復帰も認められなかった。

[0137] 実施例 5 CAV2免疫原性試験

供試ウィルスとして CAV F 朱培養上清（10⁴ 10^{5 5} 10ソ mL、対照区）（MDCK細胞 105代継代）を用いた。 [0138] 供試動物として約 3か月齢のビーグル犬 16頭を用いた。

[0139] 約 3か月齢のビーグル犬 4頭/群を CAV F 朱培養上清 lmL/頭を経口 (各 lmL)投与した。 1回目接種日力試験終了まで一週ごとに採血し、 CAV抗体価測定を実施した。弱毒化ィヌアデノウイルス 2型ワクチンは免疫原性を有して!/、た。

[0140] 実施例 6 混合ワクチンの有効性試験

上述したそれぞれのワクチン株を混合し経口投与した際に、免疫を賦与する能力を有しているかどうかを確認した。比較用の供試ワクチンには、次の日本国内で市販されてレ、る代表的なワクチンを用いた。

[0141] 本発明のワクチンとしては Vero細胞で 24代継代し弱毒したィヌジステンパーウィルス（CDV)、 MDCK細胞で 105代継代し弱毒したィヌアデノウイルス 2型（CAV2)及び A 72細胞で 68代継代し弱毒したィヌパルボウイルス（CPV)の 3種類のワクチン株のウイノレス液を混合したものを用いた。

[0142] 1.バンガード 5 :ジステンパー'ィヌアデノウイルス（2型）感染症'ィヌパラインフルェンザ'ィヌパルボウイルス感染症混合生ワクチン (フアイザ一株式会社、製造番号: 4781 01)

2. デユラミューン 5：ジステンパー'ィヌアデノウイルス（2型)感染症 .大パラインフルェンザ.ィヌパルボウイルス感染症混合生ワクチン (共立製薬株式会社、製造番号： 101 152A)

3. "京都微研"キヤナイン 6：ジステンパー'ィヌアデノウイルス（2型)感染症'ィヌパラインフルエンザ.ィヌパルボウイルス感染症.ィヌコロナウィルス感染症混合生ワクチン

(株式会社微生物化学研究所、製造番号: 7-2)

4.本発明のワクチン:ジステンパー'ィヌアデノウイルス（2型)感染症'ィヌパルポウィルス感染症混合ウィルス液

生後約 3か月の CDV抗体陰性のビーグル犬を、各社のワクチンにっき 3頭ずつ無作為に割り当て、ワクチン 1ドース分（ウィルス液 lmL (10^{5 89}TCID /ml) )を 3週間間隔で 2回、経口接種した。ワクチン接種前力も接種後 6週目まで毎週血清を採取し、 CD V中和抗体価の測定を常法に従って実施した。なお、ワクチン株によって抗原交差性の異なることが考えられるため、中和用ウィルスはそれぞれのワクチンから分離したヮクチン株を用いた。

[0143] 各ワクチンを経口接種したィヌにおける CDV中和抗体価を表 1に示した。バンガード接種ィヌでは 3頭中 1頭にワクチン接種後 2週目より抗体産生がみられた力残る 2 頭は抗体陰性のままであった。デユラミューン接種ィヌでは 1頭に 5週目より抗体産生がみられたが低力価で、残る 2頭は抗体陰性のままであった。キヤナイン接種ィヌでは 1頭が 3週目に、もう 1頭では 6週目に抗体産生がみられたが、残る 1頭は抗体陰性のままであった。これらの結果から、巿販ワクチンの経口接種により CDVに対する免疫を確実に賦与させることはできないことが明ら力、となった。

[0144] CPV及び CAV2に対する抗体価の推移については、各群間において明確な差は認められなかった。

[表 4]

CDV中和抗体価の推移

ワクチン接種後

0W (1st) 1W 2W 3W (2nd) 4W 5W 6W

04-18 <4 <4 128 512 2,048 2,048 1 ,618 バンガ一ド 04-23 <4 <4 <4 <4 <4 ぐ 4 <4

(フアイザ一） 04-32 <4 ぐ 4 <4 ぐ 4 ぐ 4 <4 <4 幾何平均 <4 ぐ 4 5 8 13 13 12

04-21 <4 <4 ぐ 4 <4 <4 8 32 デュラミューン 04-31 <4 <4 ぐ 4 ぐ 4 ぐ 4 <4 <4

(共立） 04-33 ぐ 4 <4 ぐ 4 ぐ 4 <4 ぐ 4 ぐ 4 幾何平均ぐ 4 <4 <4 ぐ 4 <4 2 3

04-20 <4 <4 ぐ 4 128 162 405 512 キヤナイン 04-22 <4 <4 <4 <4 <4 <4 ぐ 4

(京都微研） ■ 04-34 <4 <4 ぐ 4 <4 <4 <4 6 幾何平均 <4 <4 <4 5 5 7 15

05-51 <4 4 256 4,096 2,048 1 ,024 648 ネ土ヮチ、 05-53 <4 3 32 256 1 ,616 2,024 1 ,024

05-55 <4 <4 64 405 1 ,618 1.024 512 幾何平均ぐ 4 2 81 751 1.750 1 ,290 698

[0145] 実施例 7 移行抗体保有犬に対する経口生ワクチンの免疫原性確認

母親からの移行抗体のレベルが高い子犬にワクチン接種をしても、ワクチンウイノレスが中和されてしまレ、、免疫が成立しない。最近ではワクチン中のウィルス含量を高めることにより、高レベルの移行抗体を乗り越えるワクチンも市販されている。

[0146] 本発明者は、作製したワクチンウィルスを注射ではなく、自然感染ルートである経口力、ら投与した場合、低レベルの移行抗体であれば乗り越えられて抗体応答がみられるのではな!/、かとレ、う仮説を立てた。 [0147] そこで本実施例では、移行抗体を保有する子犬にワクチンウィルスを経口投与して抗体価を測定し、その免疫原性を確認した。

[0148] 材料と方法

(1)供試動物

ワクチンウィルス投与時に約 7〜8週齢で、移行抗体を保有する健康なビーグル種の子犬 10頭を日本農産工業株式会社 (Nosar Beagle)から導入した（表 5)。供試犬はアイソレータ内で個別飼育した。

[表 5] 供試犬リスト

出生日（試験開始時週齢）性別

IA35G 2007年 5月 12ョ (8週齢）早

JA55G 2007年 5月 13ョ (8週齢）早

QA45G 2007年 5月 16日 (7週齢）

QA65G 2007年 5月 16日 (7週齢）早

QA75G 2007年 5月 16日 (7週齢）

RA45G 2007年 5月 16日 (7週齢）早

SA45G 2007年 5月 Γ7ョ (7週齢）早

SA55G 2007年 5月 17日 (7週齢）早

LA45G 2007年 5月 13ョ (8週齢）

MA55G 2007年 5月 13日 (8週齢）早

[0149] (2)供試ワクチン

日本全薬工業株式会社中央研究所にお!、て弱毒化したジステンパーウィルス (CD V)、犬アデノウイルス 2型（CAV2)及び犬パルボウイルス（CPV)を用い、各ウィルス液を混合しての供試ワクチンを作製した。各ウィルスの含有量は下記のとおりである（表 6)。

[0150] ジステンパーウィルス 95-54/666株は、ジステンパーウィルス 95-54株を Vero細胞を用いて 24代継代した株であり、アデノウイルス 2型 F1-HP株は、アデノウイルス 2型 F 朱を MDCK細胞を用いて 105代継代した株であり、パルボウイルス F3/666株は、パルポウィルス F3株を Vero細胞を用いて 68代継代した株である。

[表 6] 供試ワクチンに含まれるウィルス量

ウィルス株名 1頭分あたりの含有量

CDV 95-54/666株 04.50 TCIDso mL

CAV2 F1-HP株 ₁₀3.33 _TciD₅o mL

CPV F3/666株 10 67 TCIDeo mL

(3)試験方法

試験日程を表 7に示した。導入から 3日間の馴致後、 0Wに第一回目のワクチンウイノレスの投与を行った。経口投与はウィルス液 1 mLをシリンジに採り、これを飲ませることで行った。さらにその 3週後にも同ウィルス液を経口投与した。第一回目投与前から第二回目投与後 2週目まで 1週間ごとに血清を採取し（計 6時点）、 CDV及び CAV2は中和抗体価、 CPVは HI価を測定した。抗体応答の判定基準は、各抗体価がワクチン投与前と同等以上に上昇した場合、抗体応答ありと判定した。

[表 7]

試験日程

試験項目導入 0W 1W 2W 3W 4W 5W 導入 7/3

ウィルス投与 7/6 (1*) 7/27 (2">d)

採血 7/6 7/13 7/20 7/27 8/3 8/10 (終了）臨床観察毎 S

[0152] 結果及び考察

1) CDV中和抗体価

ワクチンウィルス投与後の供試犬における CDV中和抗体価の推移を表 8に、ヮクチン接種前に保有する移行抗体レベルごとの抗体応答率を表 9に示した。第一回投与前にはすべての個体が移行抗体を保有（1 :4から 1 :22)していた。第一回ワクチン投与後 1週目には 10頭中 9頭が抗体陰性となったが、 2週目には 1頭を除き抗体陽転化し、第二回ワクチン投与後 2週目（試験終了時）には 1 :512から 1 :2,048となった（表 8)

[0153] 移行抗体価が 1 :8以下ではワクチン 1回投与で抗体応答率力 ^100% (7頭中 7頭）となつた。一方、 1 : 10以上では 3頭中 1頭力回投与では応答がみられなかったものの、 2 回投与後には全頭陽転化した（表 9)。

[表 8]

CDV中和抗体価の推移

ワクチン接種後週数

犬番号 OW 1W 2W 3W 4W 5W

1st Vac. 2nd Vac.

IA35G 8 <4 3 162 648 2,048

JA55G 10 <4 <4 ぐ 4 <4 1,024

QA45G S <4 41 162 1,024 1,024

QA65G 4 <4 16 162 648 1,024

QA75G 8 ぐ 4 p 8 41 256 512 ω

RA45G 6 ぐ 4 32 1 8 648 1,024

SA45G 10 <4 32 128 1,618 2,048

O

SA55G 22 6 16 128 512 512

LA45G 4 <4 64 256 2,048 2,048 A55G 4 <4 8 32 405 2,048

[表 9コ各ウィルスにおける前抗体価別の抗体答率

接種前のワクチン接種回数

ウィルス

ΪΛ体価 1回 2回

4 3/3 (100) * 3/3 (100)

~8 4/4 (100) 4/4 (100)

CDV

~16 1 /2 ( 50) 2/2 ( 00)

-32 1/1 (100) 1/1 ( 00)

9/10 ( 90) 10/10 ( 100)

4 1/1 (100) 1/1 (100)

~S 1/1 (100) 1/1 (100)

〜16 0/1 C 0) 1/1 (100)

CAV2

~32 2/3 ( 67) 3/3 (100)

~64 1 /2 ( 50) 2/2 (100)

〜128 1 /2 ( 50) 2/2 (100)

6/10 ( 60) 10/10 100)

<8 2/2 (100) 2/2 (100)

~16 2/2 (100) 2/2 C 00)

CPV -32 2/3 ( 67)

-64 0/1 ( 0) 1/1 (100)

〜128 0/2 ( 0) 1 /2 C 50)

□十 2/8 C 25) 6/8 C 75)

*頭数（％) 2)CAV2中和抗体価ワクチンウィルス投与後の供試犬における CAV2中和抗体価の推移を表 10に、ワクチン接種前に保有する移行抗体レベルごとの抗体応答率を表 9に示した。第一回投与前にはすべての個体が移行抗体を保有（1:4から 1:128)していた。試験終了時には全頭陽転化しており、抗体価は 1:64から 1:6,472までの範囲となった。

[0155] 移行抗体価が 1:8以下ではワクチン 1回投与で抗体応答率力 ^100% (2頭中 2頭）となつた。一方、 1:10以上では応答率の低下がみられたものの、 2回投与後には全頭陽転化した（表 10)。

[表 10]

CAV2中和抗体価の推移

ワクチン接種後週数

犬ョ OW 1W 2W 3W 4W 5W

1 st Vac. 2nd Vac.

IA35G 10 8 <4 <4 <4 6,472

JA55G 32 32 64 256 162 512

QA45G 41 41 25 32 10 2,048

QA65G 41 32 128 101 162 256

QA75G 128 128 01 162 256 405

RA45G 8 8 64 101 101 128

SA45G 32 25 162 101 128 64

SA55G 128 64 32 10 10 405

LA45G 4 6 512 2,048 405 648

MA55G 25 16 8 6 ぐ 4 2,048

[0156] 3)CPV中和抗体価

ワクチンウィルス投与後の供試犬における CPV-HI抗体価の推移を表 11に、ヮクチン接種前に保有する移行抗体レベルごとの抗体応答率を表 9に示した。供試犬 10頭中 2頭はワクチン投与時に抗体陰性であったため、移行抗体保有犬のデータには含めなかった。参考までに、この 2頭は第一回ワクチン投与後 1週目に陽転化した。残る 8頭は 1:16から 1:128の移行抗体を保有していた。試験終了時の抗体応答率は 75% ( 8頭中 6頭）で、抗体価は 1:128から 1:2,048の範囲であった。

[0157] 移行抗体価が 1:16以下ではワクチン 1回投与で抗体応答率力 100% (2頭中 2頭）となった。一方、 1:32以上になると 1回投与では全頭応答がみられな力た力 2回投与後で 75% (6頭中 4頭）の応答率となった。

[0158] 一般に高いレベルの移行抗体を乗り越えるためには、ワクチン株の免疫原性とともに接種ウィルス量が重要であることが知られている。本実施例において作製したワクチンの CPV含有量は巿販ワクチンのものと比べると低ぐそのため移行抗体が高レべルの個体では応答が得られにくかったと考えられる。したがってワクチン中のウィルス含有量を高めることにより、高いレベルの移行抗体を保有する子犬に対しても免疫を付与できる可能性がある。

[表 11]

CPV HI抗体価の推移

ワクチン接種後週数

犬番号 OW 1 W 2W 3W 4W 5W

1st Vac. 2nd Vac.

IA35G 16 1 28 1 ,024 5 2 51 2 512

JA55G 32 16 16 <8 <8 <8

QA45G 1 28 64 64 32 64 32

QA65G 64 32 32 32 32 1 ,024

QA75G 1 28 128 64 32 128 32

RA45G 32 32 32 8 64 512

SA45G 16 16 256 512 1 ,024 512

SA55G 32 32 16 <8 128 2,048

LA45G <8 256 2,048 2,048 51 2 1 ,024

MA55G <8 1 28 1 ,024 1 ,024 1 ,024 2,048

[0159] 本実施例の成績から、 1回または 2回のワクチン投与により各ウィルスに対する抗体応答が得られたことから、ワクチンの経口接種は移行抗体保有犬に対しても有効であることが証明された。

産業上の利用可能性

[0160] 経口接種可能なィヌジステンパーウィルス感染症、ィヌアデノウイルス 2型感染症及びィヌパルボウイルス感染症に対する本発明のワクチンは、これらの感染症に対するィヌの予防又は治療のために有用である。

配列表フリーテキスト

[0161] 配列番号 16〜25 人工配列の説明：プライマー

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。 PCT

紙面による写し（注意電子データが原本となります）にの用紙は、国際出願の一部を構成せず、国際出願の用紙の枚数に算入しない]

受理官庁記入檷

0-4 この用紙は国際出願とともに受理しだ

(はい/いいえ）

0-4-1 権限のある嗨員

銶ぇ招鈸 m^ PCT

紙面による写し（注意電子データが原本となります）

[この用紙は、国降出願の一部を稱成せず、国際出願の用紙の枚数に算入しない] 国際事務局記入:

0-5 この用紙が国際事務局に受理された日

0-5-1 権限のある職員

絷替え瑢紙 (ΜΜ^^

Claims

請求の範囲

[1] 配列番号 1で表される塩基配列又は配列番号 1で表される塩基配列において、 1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる VP2遺伝子を有するィヌパルボウイルス F3株。

[2] 以下の（1)〜（7)のいずれかのウィルスである請求項 1記載のィヌパルボウイルス F3 株：

(1)配列番号 26に表される塩基配列を含む DNAからなるゲノムを有するウィルス；

(6)上記（1)〜（5)のゲノムの塩基配列力なる DNAに相補的な配列力なる DNAとストリンジヱントなハイプリダイゼーシヨン条件でハイプリダイズする DNAからなるゲノムを有するウィルス；並びに

(7)上記（1)〜（5)のゲノムの塩基配列力なる DNAと 95%以上の相同性を有している DNAからなるゲノムを有するウィルス。

[3] 配列番号 5で表される塩基配列又は配列番号 5で表される塩基配列において、 1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる LITR E1A2遺伝子を有し、かつ配列番号 7で表される塩基配列又は配列番号 7で表される塩基配列において、 1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列力もなる RI TR遺伝子を有するィヌアデノウイルス 2型 F1株。

[4] ECACC(European Collection of Cell Cultures)に受託番号 07071601で寄託されたィヌアデノウイルス 2型 F1株。镲替え招紙 [5] 配列番号 9で表される塩基配列又は配列番号 9で表される塩基配列において、 1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列力なる H遺伝子を有し

、かつ配列番号 12で表される塩基配列又は配列番号 12で表される塩基配列において、 1個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列力なる F遺伝子を有するィヌジステンパーウィルス 95-54株。

[6] ECACC(European Collection of Cell 01 ^^)に受託番号07071602で寄託されたィヌジステンパーウィルス 95- 54株。 . '

[7] 請求項 1又は 2に記載のィヌパルポウィルス F3株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化ィヌルボウイルス株。

[8] 請求項 7に記載の弱毒化ィヌパノレボウイルス株であって、配列番号 1で表される VP

2遺伝子の塩基配列において、第 885、 886、 892、 8¾4及ぴ 895番目の 1つ又は複数、好ましくはすべての塩基が変異した塩基配列を有する弱毒化ィヌパルボウイルス株。

[9] 第 891番目と 892番目の塩基の間に 2塩基が揷入され、及び/又は第 901番目と 902 番目の塩基の間に 100塩基が挿入された塩基配列を有する、請求項 7又は 8に記載の弱毒化ィヌパルポゥイノレス株。

[10] 請求項 3又は 4に記載のィヌアデノウイルス 2型 F1株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化ィヌアデノウイルス 2型株。 .

[11] 請求項 10に記載の弱毒化ィヌアデノウイルス 2型株であって、配列番号 5で表される LITR E1A2遺伝子において、 1つ又は複数の塩基が変異した塩基配列を有する弱毒化ィヌアデノウイルス 2型株。

[12] 請求項 5又は 6に記載のィヌジステンパーウィルス 95- 54株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化ィヌジステンパーウィルス株。

[13] 請求項 12に記載の弱毒化ィヌジステンパーウィルス株であって、以下の（1)〜（3) の変異の少なくとも 1つの変異を有する弱毒化ィヌジステンパーウィルス株：

(2)配列番号 10で表される H遺伝子における第 56、 74、 78、 94、 100、 110、 116、 128 、 135、 142、 156、 159、 174、 176、 182、 204、 218、 278、 306、 311、 320、 350、 374、 389 齄替え用紙濯猶 26》、 398、 407、 416、 437、 446、 452、 456、 482、 485、 489、 495、 499、 531、 542、 548、 551 、 553、 557、 558、 572、 598、 610、 614、 626、 629、 632、 647、 650、 659、 664、 680、 689 、 698、 707、 716、.732、 737、 741、 753、 755、 776、 785、 788、 792、 812、 821、 850、 872 、 884、 888、 914、 923、 929、 932、 935、 946、 947、 955、 957、 968、 977、 978、 983、 999

、 1845、 1851、 1871、 1877、 1879、 1889、 1894、 1896、 1908及び 1911番目の塩基の 1 つ又は複数、 \好ましくはすベての変異、

(3)配列番号 10で表される H遺伝子における第 628、 634、 644、 648、 657、 681、 683、 718、 744、 748、 823及び 1406番目の塩基の 1つ又は複数、好ましくはすべての変異。請求項 7~9のいずれか 1項に記載の弱毒化ィヌパルポウィルス株、請求項 10若しくは 11に記載の弱毒化ィヌアデノウイルス 2型株並びに請求項 12若しくは 13に記载の弱毒化ィヌジステンパーウィルス株力らなる群力選択されるクイルス株の 1種、 2 種又は 3種を含むィヌウィルス感染症ワクチン。

請求項 7〜9のいずれか 1項に記載の弱毒化ィヌパルボウイルス株、請求項 10若しくは 11に記載の弱毒化ィヌアデノウイルス 2型株並びに請求項 12若しくは 13に記载の弱毒化ィヌジステンパーウィルス株力なる群力も選択されるウィルス株の 3種類を含むィヌウィルス感染症混合ワクチン。

異なるウィルス株同士の間で干渉が生じなレヽ、請求項 14又は 15に記載のィヌウイノレス感染症混合ワクチン。

ィヌジステンパーィルスとィヌパルボウイルスの間で干渉が生じなレ、、請求項 16 記載のィヌウィルス感染症混合ワクチン。

経口接種用である、請求項 14〜： 17のいずれ力項に記載のィヌウィルス感染症ヮクチン。螯替え招紙 cm 26》 [19] 生後 4〜18週までの仔ィヌに接種した場合に、免疫が成立し得る仔ィヌ用の請求項 14〜： 18のいずれ力 1項に記載のィヌウィルス感染症ワクチン。

[20] 請求項？〜 9の!/.、ずれか 1項に記載の弱毒化ィヌパルボウイルス株、請求項 10若しくは 11に記載の弱毒化ィヌアデノウイルス 2型株並びに請求項 12若しくは 13に記载の弱毒化ィヌジステンパーウィルス株力なる群力選択されるウィルス株の 1種、 2 種又は 3種をィヌに経口接種することを含む、ィヌのウィルス感染症を防御する方法。

[21] 異なるウィルス株同士の間で干渉が生じない、請籴項 20記載のィヌのウィルス感染症を防御する方法。

[22] ィヌジステンパーウィルスとィヌパルポウィルスの間で干渉が生じなレ、、請求項 20 又は 21に記載のィヌのウィルス感染症を防御する方法。

[23] 生後 4〜 18週の仔ィヌに接種する、請求項 20〜22のいずれか 1項に記載のィヌのウィルス感染症を防御する方法。

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