WO2008032712A1 - Monoclonal antibody and use thereof - Google Patents

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WO2008032712A1
WO2008032712A1 PCT/JP2007/067666 JP2007067666W WO2008032712A1 WO 2008032712 A1 WO2008032712 A1 WO 2008032712A1 JP 2007067666 W JP2007067666 W JP 2007067666W WO 2008032712 A1 WO2008032712 A1 WO 2008032712A1
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antibody
opn
thrombin
polypeptide
cleaved
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PCT/JP2007/067666
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Hiroko Kobayashi
Masahiro Hasegawa
Tsutomu Seito
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Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.
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    • G01N2333/52—Assays involving cytokines

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody that specifically recognizes a protein or polypeptide having a specific amino acid sequence at the C-terminus, and a use thereof.
  • Osteopontin (hereinafter referred to as “OPN”) is an acidic calcium-binding glycoprotein that is abundant in bones, and mature OPN is cleaved by thrombin in vivo to produce an N-terminal fragment of OP N (Hereinafter referred to as “OPN N—half”) and C-terminal fragment (hereinafter referred to as “OPN C—half”).
  • OPN N—half N-terminal fragment of OP N
  • OPN C—half C-terminal fragment
  • human osteopontin (hereinafter referred to as “h OPN”) is cleaved at the C-terminal side of the 168th arginine residue in the amino acid sequence of hOPN, and hOPN N—half and hOPN C—half Become two.
  • the OPN is responsible for a variety of physiological pathologically important functions such as cell adhesion, cell migration, tumor formation, immune response and complement-mediated cell lysis inhibition. have. This diverse function is mediated by a variety of cell surface receptors.
  • OPN N-half cleaved by thrombin exposes the SVVYGLR sequence on the C-terminal side and has been shown to bind to ⁇ 9 and ⁇ 4 integrins via this sequence.
  • Patent Document 1 an international patent application by the present applicant reports that the ratio of OPN N-half to the total OPN increases in rheumatic patients!
  • OPN N-half exposes the SWYGLR sequence by cleavage of OPN with thrombin and binds to ⁇ 9 and ⁇ 4 integrins via this sequence!
  • an antibody that specifically binds to at least part of the sequence was required.
  • Patent Document 1 WO02 / 081522 International Publication Pamphlet
  • the present invention provides an antibody that recognizes only OPN N-half without recognizing full-length OPN, and a method for accurately measuring OPN N-half using this antibody. It is to be an issue.
  • the present inventors have obtained a protein having a specific amino acid sequence at the C-terminus, obtained using a polypeptide comprising a specific amino acid sequence IJ as an antigen, or The inventors have found that the above-mentioned problems can be solved by the ability of a monoclonal antibody specifically recognizing a polypeptide, and the present invention has been completed.
  • the present inventors have found that OPN N-half can be accurately measured by using this monoclonal antibody. Furthermore, the present inventors have found that the antibody can be used for diagnosis, severity determination, treatment and the like of diseases associated with OPN N-half. Furthermore, since the antibody recognizes a protein or polypeptide whose C-terminus is the amino acid sequence, it has been found that the protein or polypeptide can be used for detection-purification of a target protein if the protein or polypeptide is used as a tag. Completed the invention.
  • the present invention recognizes a protein or polypeptide whose amino acid sequence at the C-terminal is YGLR (SEQ ID NO: 1), and substantially comprises a protein or polypeptide having the amino acid sequence IJYGLR other than at the C-terminal. It is a monoclonal antibody characterized by not being recognized.
  • the present invention also provides a first reagent containing the monoclonal antibody, and an N-terminal fragment of osteopontin which is different in recognition site from the monoclonal antibody contained in the first reagent and cleaved with thrombin. Containing a second reagent containing an antibody that recognizes This is a measurement kit for osteobontin N-terminal fragment cleaved with the characteristic thrombin.
  • the present invention is a method for measuring an N-terminal fragment of osteobontin cleaved with thrombin, characterized in that an N-terminal fragment of osteobontin cleaved with thrombin in a specimen is measured with the monoclonal antibody. .
  • the present invention provides a method for diagnosing rheumatoid arthritis by using the monoclonal antibody to measure the amount of N-terminal fragment of osteobontin cleaved by thrombin in a specimen, and using the amount as an index. It is a method for distinguishing from osteoarthritis or a method for judging the severity of osteoarthritis.
  • the present invention is a therapeutic agent for inflammatory diseases comprising the monoclonal antibody as an active ingredient, and a method for treating inflammatory diseases, comprising administering the therapeutic agent for inflammatory diseases to an inflammatory disease patient. .
  • the present invention also provides a therapeutic agent for autoimmune diseases comprising the monoclonal antibody as an active ingredient, and a method for treating autoimmune diseases, comprising administering the therapeutic agent for autoimmune diseases to a patient with autoimmune diseases. It is.
  • the present invention uses an antibody that recognizes a target protein expressed together with the tag.
  • the present invention is a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding a target protein and a polynucleotide encoding a protein or polypeptide whose C-terminal amino acid sequence is YGLR.
  • the monoclonal antibody of the present invention specifically recognizes a protein or polypeptide having a specific amino acid sequence at the C-terminus, an OPN having the above-mentioned amino acid sequence at the C-terminus
  • the monoclonal antibody can be used to accurately measure OPN N-half recognized by the monoclonal antibody, to diagnose and treat a disease associated with OPN N-half, to treat it, to specifically treat the antibody. It can be used for detection and purification of target proteins using the binding amino acid sequence as a tag.
  • the monoclonal antibody of the present invention recognizes a protein or polypeptide in which the C-terminal amino acid sequence IJ is YGLR (SEQ ID NO: 1) and converts the amino acid sequence YGLR into the C-terminal. It is characterized in that it does not substantially recognize any other protein or polypeptide. It should be noted that the fact that the antibody of the present invention does not substantially recognize a protein or polypeptide having an amino acid sequence IJYGLR other than at the C terminus means that the ratio of the antibody of the present invention binding to the protein or polypeptide is 1.0% by mass (hereinafter simply referred to as Hereinafter, it is preferably 0 to 0.5%.
  • the production method of the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it has the above characteristics.
  • the antibody of the present invention uses a protein or polypeptide whose C-terminal amino acid sequence is YGLR as an antigen, immunizes the animal, collects the antibody from the animal, and then the C-terminal amino acid sequence is YGLR. It is obtained by screening using a certain protein or polypeptide, a protein or polypeptide having the amino acid sequence YGLR other than at the C-terminus.
  • the method for producing the antibody of the present invention is described in detail below.
  • the protein or polypeptide in which the C-terminal amino acid sequence used as the antigen is YGLR is not particularly limited.
  • the C-terminal amino acid sequence is YGLR.
  • a polypeptide comprising a continuous amino acid sequence is mentioned.
  • Specific examples of the polypeptide include hOPN N-half C-terminal force, a polypeptide that also has an IJSVVYG LR (SEQ ID NO: 2) sequence that has seven consecutive amino acids to the N-terminal side (hereinafter “hOPN-7 peptide”) And! / ⁇ ⁇ ).
  • This hOPN-7 peptide matches positions 162 to 168 of the amino acid sequence of hOPN (SEQ ID NO: 3).
  • Force S in the present invention BAA03554 was used as the amino acid sequence of hOPN.
  • a biopolymer compound is bound to the polypeptide to form a conjugate, which is used as an antigen.
  • the protein or polypeptide whose amino acid sequence at the C-terminal used for the antigen is YGLR can be obtained by various methods without any particular limitation.
  • the polypeptide may be synthesized by a method known in the art, or a synthetic product may be purchased from, for example, Synpep Corporation (Ty Laboratories, USA). You can also.
  • biopolymer compounds to be conjugated to the above-mentioned polypeptides include scab shell hemocyanin (hereinafter referred to as "KLH”), egg white albumin (hereinafter referred to as “OVA”), ushi serum albumin (hereinafter referred to as “KLH”). “BSA”), rabbit serum albumin (hereinafter referred to as "RSA”), thyroglobulin, etc., among which KLH and thyroglobulin are preferred.
  • the binding between the polypeptide and the biopolymer compound is, for example, a mixed acid anhydride method (B.
  • the mixed acid anhydride used in the mixed acid anhydride method is obtained by subjecting the above-described polypeptide to a normal Schotten-Baumann reaction, and reacting it with a biopolymer compound to target polypeptide A conjugate of the biopolymer compound and the biopolymer compound is created.
  • the haloformate used in the mixed acid anhydride method include methyl chloroformate, methyl bromoformate, ethyl chloroformate, ethyl bromoformate, and isobutyl chloroformate.
  • the ratio of the peptide, the haloformate and the polymer compound used in the method can be appropriately selected from a wide range.
  • the Schotten-Baumann reaction is performed in the presence of a basic compound.
  • the basic compound used in the reaction includes compounds commonly used in the Schotten-Baumann reaction, such as triethinoreamine and trimethinoreamine.
  • Pyridine dimethylaniline, N-methylmonoleolin, diazabicyclononene (DBN), diazabicycloundecene (DBU), diazabi Organic bases such as cyclooctane (DABCO), inorganic bases such as potassium carbonate, sodium carbonate, lithium hydrogen carbonate and sodium hydrogen carbonate can be used.
  • the above reaction is usually performed at 20 ° C to 100 ° C, preferably 0 ° C to 50 ° C, and the reaction time is about 5 minutes to 10 hours, preferably 5 minutes to 2 hours.
  • the reaction between the obtained mixed acid anhydride and the biopolymer compound is usually performed at 20 ° C to 150 ° C, preferably 0 ° C to 100 ° C, and the reaction time is about 5 minutes to 10 hours. It is preferably 5 minutes to 5 hours.
  • the mixed acid anhydride method is generally carried out in a solvent, but any solvent conventionally used in the mixed acid anhydride method can be used, and specifically, dichloromethane, black form, dichloroethane, etc.
  • Halogenated hydrocarbons aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene, ethers such as jetyl ether, dioxane, tetrahydrofuran and dimethoxyethane, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, N, N aprotic polar solvents such as dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, hexamethylphosphoric acid triamide and the like.
  • aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene
  • ethers such as jetyl ether, dioxane, tetrahydrofuran and dimethoxyethane
  • esters such as methyl acetate and ethyl acetate
  • N, N aprotic polar solvents such as dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, hexamethylphosphoric acid triamide and the like.
  • the activated ester method can be generally performed as follows. First, the above polypeptide is dissolved in an organic solvent and reacted with N-hydroxysuccinimide in the presence of a coupling agent to produce an N-hydroxysuccinimide activated ester.
  • the coupling agent used in the reaction a common coupling agent commonly used in condensation reactions can be used, and examples thereof include dicyclohexyl carpositimide, carbodiimidazole, and water-soluble carposimide.
  • the organic solvent for example, N, N dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide, dioxane and the like can be used.
  • the molar ratio of the polypeptide used in the reaction to the coupling agent such as N-hydroxysuccinimide is preferably 1:10 to 10: 1, most preferably 1: 1.
  • the reaction temperature is 0 to 50 ° C, preferably 22 to 27 ° C, and the reaction time is 5 minutes to 24 hours, preferably 1 to 2 hours.
  • the reaction temperature can be at a temperature not lower than the melting point and not higher than the boiling point.
  • reaction temperature is 0 to 60 ° C, preferably 5 to 40 ° C, more preferably 22 to 27 ° C, and the reaction time is preferably 5 minutes to 24 hours. 1 to 16 hours, more preferably 1 to 2 hours.
  • conjugate of the peptide and the biopolymer compound (hereinafter simply referred to as “conjugate” and V , Sometimes).
  • conjugate As a specific immunization method using the above conjugate as an antigen, first, the conjugate is dissolved in a sodium phosphate buffer (hereinafter referred to as "PBS"), and this is combined with Freund's complete adjuvant or incomplete adjuvant. Or, it is mixed with an adjuvant such as Myoban, and this is used as an antigen to immunize animals.
  • PBS sodium phosphate buffer
  • the animal to be immunized for example, mammals such as mice, rats, rabbits, goats, horses, etc. can be mentioned, for example, those commonly used in the art.
  • the immunogen can be administered by subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intradermal injection, or intramuscular injection, but subcutaneous injection or intraperitoneal injection is preferred. Immunization can be performed once or multiple times at appropriate intervals, preferably multiple times at intervals of 1 to 5 weeks.
  • the antibody of the present invention can be obtained by screening the antibody using a protein or polypeptide whose C-terminal amino acid sequence is YGLR.
  • a specific screening method first, an antibody that binds to a protein or polypeptide whose amino acid sequence at the C-terminal is YGLR is collected, and then the antibody or polypeptide that has the amino acid sequence YGLR other than at the C-terminal is used.
  • a method of collecting an antibody that does not bind to the target is used.
  • proteins or polypeptides whose amino acid sequence at the C-terminal is YGLR include proteins such as OPN N-half such as human, mouse and rat, and polypeptides such as YGL R (SEQ ID NO: 1) and VYGLR (SEQ ID NO: 17). It is done.
  • Amino Proteins or polypeptides having an acid-ligated IJYGLR other than the C-terminus include proteins such as human, mouse, rat, etc. OPN or VYGL (SEQ ID NO: 18), SVVYGL (SEQ ID NO: 19), SVVYG (SEQ ID NO: 20). And the like.
  • the antibody of the present invention recognizes a protein or polypeptide having an amino acid sequence ability of SYGLR at the C-terminus, and substantially comprises a protein or polypeptide having an amino acid sequence IJYGLR other than at the C-terminus. Don't recognize! Since this antibody recognizes only the polypeptide or protein whose C-terminus is YGLR, it can recognize hOPN N-half and the like having this amino acid sequence at the C-terminus. On the other hand, this antibody is cleaved by thrombin having the amino acid sequence other than the C-terminus, and cannot recognize! /, NA! /, HOPN.
  • amino acid sequence IJYGLR is included in the amino acid sequence SWYGLR recognized by ⁇ 9 integrin or ⁇ 4 integrin, such as ⁇ 9 / 31, «4/31, « 4/37, etc.
  • the antibody of the present invention can inhibit the binding of OPN N-half to ⁇ 9 integrin or ⁇ 4 integrin.
  • this amino acid sequence has a C-terminal porcine (accession number: P14287), monkey ( ⁇ — 001093307), nomstar (CAI65407), ( ⁇ 40758) Can recognize OPN N-half of mice ( ⁇ 5726 5 etc.) and rats (BAA19247 etc.).
  • the antibody of the present invention can inhibit the binding of OPN N-half to ⁇ 9 integrin or ⁇ 4 integrin. Since these integrins are involved in inflammatory reactions, it is considered that drugs that inhibit integrin activity potentially have anti-inflammatory effects. Therefore, the antibody of the present invention is effective for the treatment of inflammatory diseases such as rheumatism, hepatitis, arthritis and the like.
  • the antibody of the present invention suppresses hepatocyte necrosis in concanapalin ⁇ (hereinafter referred to as "ConA”)-induced hepatitis, and has an ALT (alanine aminotransferase) value. Can be suppressed. Therefore, the antibody of the present invention is particularly preferably used as a therapeutic agent for hepatitis.
  • ConA concanapalin ⁇
  • ALT alanine aminotransferase
  • the antibody of the present invention that widely blocks the binding between these integrins and OPN N-half is suitable for rheumatism and other self Can suppress the disappointment of symptoms of immune diseases. Therefore, the present invention Rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis and chronic rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis Membranitis ⁇ Behcet's disease ⁇ Polymyositis ⁇ Filament Proliferative nephritis ⁇ It can be used as a therapeutic agent for autoimmune diseases such as sarcoidosis.
  • the antibody of the present invention may be further purified as necessary, and then formulated according to a conventional method.
  • dosage forms of this therapeutic agent include parenteral agents such as injections and infusions, and these are preferably administered by intravenous administration, subcutaneous administration or the like.
  • parenteral agents such as injections and infusions
  • these are preferably administered by intravenous administration, subcutaneous administration or the like.
  • carriers and additives corresponding to these dosage forms can be used within a pharmaceutically acceptable range.
  • the addition amount of the present invention antibody of when the formulation, the degree of the patient's symptoms, different force the binding titer like age and use to formulate dosage forms the present invention or antibody s for example, O. lmg / kg to no About 100mg / kg
  • the antibody of the present invention can be used for immunological assay by labeling or immobilizing as necessary.
  • the antibody is horseradish Peruokishidaze (HRP), an enzyme such as alkaline phosphatase Fatah one peptidase, full O receptacle in iso Xia sulfonates, fluorescent substance rhodamine, 32 [rho, 125 radioactive substances such as iota, This is performed by binding a labeling substance such as a chemiluminescent substance and the antibody of the present invention by a conventional method.
  • HRP horseradish Peruokishidaze
  • an enzyme such as alkaline phosphatase Fatah one peptidase, full O receptacle in iso Xia sulfonates, fluorescent substance rhodamine, 32 [rho, 125 radioactive substances such as iota
  • the antibody of the present invention is immobilized by binding the antibody of the present invention to an appropriate solid phase.
  • the solid phase any solid phase commonly used in immunochemical measurement methods can be used.
  • a plate such as a 96-well microtiter plate made of polystyrene or a microtiter plate with an amino group is used.
  • various kinds of beads are used.
  • a buffer containing the antibody of the present invention may be added to the solid phase and incubated.
  • the antibody of the present invention has a recognition site different from that of the antibody of the present invention and is combined with an antibody that recognizes OPN N-half cleaved with thrombin (hereinafter referred to as "OPN-1 antibody"). OPN N-half can be measured accurately.
  • OPN N which is different from the antibody of the present invention in recognition site and cleaved with thrombin —
  • an antibody recognizing half for example, polyclonal antibody or monoclonal antibody that can be obtained by conventional methods using all or part of OPN N-half as an antigen can be used.
  • the whole or part of OPN N-half used as the antigen is not particularly limited.
  • examples of the polypeptide include a polypeptide comprising an amino acid sequence which is about 5 to 30, preferably about 10 to 20, in the sequence. This polypeptide may be selected as appropriate according to the animal from which OPN or OPN N-half is derived.
  • the amino acid sequence of hOPN (SEQ ID NO: 3) 17
  • the mOPN-1 peptide corresponding to the 17th to 32nd amino acid sequence of the mOPN (SEQ ID NO: 4) in the case of the mouse OPN (hereinafter referred to as “mOPN”)
  • the rat OPN (Hereinafter referred to as “rOPN”! /, U) includes rOPN-1 peptide corresponding to the 17th to 33rd positions of the amino acid sequence of rOPN (SEQ ID NO: 5).
  • AAA57265 was used.
  • the strength of AAH78874 and BAA19247 can be referred to from SPubmed. In the present invention, the strength of BAA19 247 was used.
  • hOPN— 1 peptide IPVKQADSGSSEEKQ (SEQ ID NO: 6)
  • mOPN— 1 peptide LPVKVTDSGSSEEKLY (SEQ ID NO: 7)
  • rOPN— 1 peptide LPVKVAEFGSSEEKAHY (SEQ ID NO: 8)
  • a conjugate of the above peptide and a biopolymer compound may be used as the antigen, as in the method for producing the antibody of the present invention.
  • the conjugate of the peptide and the biopolymer compound is preferably bound to the C-terminal amino acid of the peptide with, for example, lysine 'cysteine (KC).
  • OPN-1 antibody As the OPN-1 antibody as described above, the following antibodies commercially available from Immunobiological Research Institute, Inc. may be used. Anti-Mouse Osteopontin (0-17) Rabbit IgG Affinity Purify
  • Specific methods for measuring OPN N-half using the antibody of the present invention and OPN-1 antibody include radioisotope immunoassay (RIA method), ELISA method (E. Engvall et al., ( 1980): Methods in Enzymol., 70, 419-439), fluorescent immunoassay, plaque method, spot method, aggregation method, Ouchterlony, immunochromatography, etc. And various other methods ("Neudribroma Method and Monoclonal Antibody", published by R & D Planning, Inc., pages 30-53, March 5, 1982).
  • step (A) the antibody of the present invention is immobilized on a carrier, and then in step (B), the surface of the carrier on which the antibody is not immobilized is unrelated to OPN N-half, for example, Block with protein. Furthermore, in step (C), a sample containing OPN N-half at various concentrations is added to this to form a complex of OPN N-half and the antibody of the present invention, and then labeled OPN as step (D). —1 Add antibody, bind OPN N-half-antibody complex to this, and finally measure the amount of labeling as step (E). From the calibration curve prepared in advance, OPN N— The amount of half can be determined.
  • the antibody used in step (A) and step (D) can be measured in the opposite case, but it is preferable to immobilize the antibody of the present invention from the viewpoint of detection sensitivity.
  • a carrier used for immobilizing the antibody of the present invention any carrier commonly used in immunochemical measurement methods without any particular limitation is used. I can use it.
  • a 96-well microtiter plate made of polystyrene or an amino group-bonded microtiter plate can be used.
  • a buffer solution containing the antibody may be added to the carrier and incubated.
  • a known buffer can be used, for example, 10 mM PBS.
  • the concentration of the antibody in the buffer is a force that can be selected from a wide range. Usually 0.01 to about 100 H g / ml, preferably 0 ⁇ ! To 20 g / ml is suitable.
  • 300 1 / wenore or less is 20 to about 150 to 1 / well.
  • Incubation conditions are not particularly limited, but overnight incubation at about 4 ° C is usually suitable.
  • the blocking in the step (B) is carried out on the carrier on which the antibody of the present invention is solid-phased in the step (A), and OPN N-half in the sample added later is adsorbed irrespective of the antigen-antibody reaction.
  • the blocking agent for example, a commercially available blocking agent such as BSA, skim milk solution, or Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. (code No. UK-25B)) can be used.
  • Specific blocking is not limited, but for example, an appropriate amount of block ace is added to the antigen-immobilized part, and the mixture is incubated overnight at about 4 ° C, and then washed with a buffer solution. Is done.
  • the specimen containing OPN N-half is brought into contact with the immobilized antibody of the present invention, and OPN N-half is captured with the immobilized antibody of the present invention, and immobilized.
  • the complex of the present invention antibody and OPN N-half is formed.
  • the conditions for producing this complex are not limited, but it is sufficient that the reaction can be carried out at about 4 ° C to 37 ° C for about 1 hour to 1 hour. After completion of the reaction, it is preferable to wash the carrier with a buffer solution to remove unreacted proteins and the like.
  • the buffer used in this reaction is preferably 10 mM PBS (pH 7.2) and 0.05% (v / v) Tween20 thread! / ,.
  • OPN N-hal f captured by the immobilized antibody of the present invention is added to an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase, or the like by a conventional method.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the OPN-1 antibody labeled with a fluorescent substance such as inisocyanate or rhodamine, a radioactive substance such as 32 ⁇ or 125 ⁇ , or a labeling substance such as a chemiluminescent substance is added to the solid phase.
  • Light antibody OPN N-half A complex of labeled OPN-l antibody is formed. After completion of this reaction, it is preferable to wash the carrier with a buffer solution to remove unreacted proteins and the like.
  • the amount of labeled OPN-1 antibody used in this step (D) is about 5,000 to 10,000 times that of the immobilized antibody of the present invention, preferably so that the final absorbance is 1.5 to 2.0.
  • a buffer solution can be used for dilution, and the reaction conditions are not particularly limited. It is preferable that the reaction is performed at a force of about 4 ° C. to 37 ° C. for about 1 hour, and then washed with the buffer solution after the reaction.
  • a complex of the immobilized antibody of the present invention OPN N-half labeled OPN-1 antibody can be formed.
  • step (E) the amount of OPN N-half is calculated from the calibration curve by adding a coloring substrate solution that reacts with the labeling substance used for labeling the OPN 1 antibody and measuring the absorbance. I can help.
  • TMB 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • alkaline phosphatase when used as the labeling substance, a method of measuring the absorbance at 415 nm by coloring with p-nitrophenyl phosphate as the substrate, adding 2N sodium hydroxide to stop the enzyme reaction, is suitable. Yes.
  • the concentration of OPN N-half in the sample can also be calculated using a calibration curve prepared in advance based on the absorbance of the reaction solution to which OPN N-half with a known concentration is added.
  • the method for measuring OPN N-half described above includes a first reagent containing the antibody of the present invention and a second reagent containing the OPN-1 antibody. It is preferable to use the OPN N—half measurement kit (hereinafter referred to as “the present invention kit”! /).
  • the kit of the present invention can be prepared by a conventional method. Specifically, either the antibody of the present invention or the OPN-1 antibody is used as a labeled antibody, and in addition, a dilution buffer, a standard substance, a substrate buffer, a stop solution, a washing solution, etc. may be combined. . [0063] By using the above-described measurement method and measurement kit, OPN N-half in a sample such as plasma, serum, urine, and joint fluid can be accurately measured.
  • rheumatoid arthritis can be diagnosed by measuring OPN N half in the sample, particularly in urine, using the measurement method and measurement kit, and using the amount as an index. Specifically, first, urine samples from multiple healthy subjects or rheumatoid arthritis patients are collected, and the OPN N-half concentration is measured using the measurement method and measurement kit described above, and the average value is calculated. . Next, the OPN N-half concentration in the subject's urine is measured, and if that value is significantly higher than the average value for healthy subjects (eg, 1500 pM or higher) or significantly lower than the average value for patients with rheumatoid arthritis ( For example, the subject can be diagnosed with rheumatoid arthritis.
  • the average value for healthy subjects eg, 1500 pM or higher
  • the subject can be diagnosed with rheumatoid arthritis.
  • the ratio of OPN N-half to N-half may be calculated and combined with this result. Specifically, in this example, if the ratio of OPN N-ha If to the total OPN in synovial fluid is 8.52% or more, the subject can be diagnosed as having rheumatoid arthritis.
  • the OPN concentration in synovial fluid is measured using a commercially available OPN measurement kit (for example, Human 0 steopontin Assay Kit (L)-IBL (manufactured by Immunobiological Laboratories, Inc. (product number: 27158))).
  • the power to do S for example, Human 0 steopontin Assay Kit (L)-IBL (manufactured by Immunobiological Laboratories, Inc. (product number: 27158)
  • the amount of OPN N-half in the synovial fluid is correlated with the grade of osteoarthritis. If this is used as an index, the severity of osteoarthritis in addition to the above-mentioned discrimination Can also be determined. Specifically, the amount of OPN N-half in the synovial fluid is moderate rather than mild Degree and severity are high (slight is average 55. OpM, moderate is 163.9 pM and severe is 144.2 pM average). The ratio of OPN N-half to total OPN (OPN and OPN N-half) in the synovial fluid is also correlated with the grade of osteoarthritis, and this result is used to determine the severity of osteoarthritis. You may do it.
  • the subject is mild with osteoarthritis, and if it is 1.81% or more.
  • the subject can be determined to be moderate or severe osteoarthritis.
  • the antibody of the present invention specifically recognizes a protein or polypeptide having an amino acid sequence IJYGLR at the C-terminal
  • the protein or polypeptide recognized by the antibody is labeled with a well-known tag such as a His tag or a Flag tag.
  • a well-known tag such as a His tag or a Flag tag.
  • a polynucleotide encoding a protein or polypeptide whose C-terminal amino acid sequence is YGLR, and a polynucleotide encoding a target protein to be detected are prepared by a conventional method, and these are incorporated into a vector to prepare a recombinant vector.
  • a recombinant protein containing the target protein and a protein or polypeptide whose amino acid sequence is IJYGLR is expressed in a well-known protein expression system.
  • this recombinant protein is detected with the antibody of the present invention labeled by a conventional method.
  • Examples of the vector used for the detection of the target protein include pEU vector if the protein expression system is a cell-free synthesis system using barley germ extract.
  • the vector is preferably one in which a polynucleotide encoding a protein or polypeptide encoding the protein or polypeptide whose C-terminal amino acid sequence is YGLR is inserted into the 3 ′ end of the polynucleotide encoding the target protein.
  • a promoter such as SP6 at the 5 ′ end of the polynucleotide encoding the target protein.
  • vectors used for the detection of the target protein include pGEX vectors, pQE vectors, and the like in the case of a cell synthesis system using protein expression system S. coli.
  • the target protein is purified, a well-known protein expression system is used in the same manner as described above. Then, a recombinant protein containing the target protein and a protein or polypeptide having the amino acid sequence YGLR at the C-terminus is expressed and bound to the antibody of the present invention immobilized on a carrier. Next, this is dissociated with 0.1 M glycine-hydrochloric acid buffer ( ⁇ 2 ⁇ 5) or the like, and the recombinant protein is purified.
  • a carrier for immobilizing the antibody of the present invention includes formyl cellulofine (manufactured by Seikagaku Corporation), and an immobilization method includes an amino group. The method of using is mentioned.
  • polypeptides (a) to (c) having the following amino acid sequences which have been purified by HPLC chromatography, were prepared by Sypping Corporation and TANA Laboratories. , USA) and Auspep (Ausp sign).
  • Polypeptide (a) is an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence of hOPN N-half C-terminal amino acid sequence that is also continuous on the N-terminal side (amino acids corresponding to amino acids 162 to 168 of hOPN N-half amino acid sequence).
  • a sequence hereinafter, a polypeptide having this sequence is referred to as “hOPN-7 peptide”! /, U))
  • cysteine (C) cysteine
  • Polypeptide (b) is the amino acid sequence corresponding to positions 17 to 31 of the amino acid sequence of hOPN N—half with a cysteine (C) added. Furthermore, polypeptide (c) is obtained by adding a cysteine (C) to the amino acid sequence corresponding to the 15th to 169th amino acid sequence of full-length hOPN.
  • a conjugate of each of the above polypeptides and thyroglobulin was prepared by the EMCS (N- (6-Maleimid ocaproyloxy) -succinimide) method as follows.
  • the molar ratio of thyroglobulin, polypeptide and EMCS was 1: 300: 400, respectively.
  • conjugate solution was dialyzed with PBS to adjust the concentration to 10 mg / ml as conjugate.
  • the thus obtained conjugate of each polypeptide and thyroglobulin was used as an immunizing antigen in the following Examples and Reference Examples.
  • a conjugate of the polypeptide (a) obtained in Example 2 and thyroglobulin was used, and this was used to immunize BALB / c mice.
  • spleen monocyte cells of immunized mice and a fusion partner, X63—Ag8-653 were subjected to polyethylene glycol-mediated cell fusion, and literature (J. Immunol. 146: 3721-3728 ) Hypridoma was selected by the method described. Selection was performed by selecting cells that responded to the immobilized polypeptide (a). As a result, hybridomas 39E1 and 34E3 were obtained.
  • Each of the hyperidomas selected as described above was produced in 80% of the cells in GIT medium (Wako Pure Chemical), which is a serum-free medium, until the cells were killed. Next, after removing cells from this medium by centrifugation (1,000 rpm, 15 min), saturated with ammonium sulfate at 50%, left at 4 ° C., and left the precipitate by centrifugation (1,000 rpm, 30 min). It was collected. This precipitate is further diluted with a 2-fold diluted binding buffer (Protei). n AM APS Ilkit) and then passed through a protein A column (Pharmacia-Amersham) to adsorb IgG.
  • a mouse polyclonal antibody (hereinafter referred to as this antibody) was used in the same manner as in Reference Example 3 except that the conjugate of the polypeptide (c) obtained in Example 2 and thyroglobulin was used as the immunizing antigen, and mice were used as the animals to be immunized.
  • the antibody was "hOPN-5 antibody”! /, U).
  • hOPN integrates the hOPN gene (accession number: 04765) into the vector pcD NA3.1 according to conventional methods (eg, “Molecular Biology Basic Experiments”, Nankodo), and further integrates the vector into Chinese Chinese Star Ovary. (CHO) cells were transfected. Next, anti-OPN-1 antibody column (Immuno Corporation) was used from the culture supernatant when this cell was cultured. It was obtained by purification at Biological Research Laboratory. This hOPN was treated with thrombin at 37 ° C for 90 minutes to obtain OPN N-half. Further, mOPN and rOPN, and further, they were treated with thrombin in the same manner as described above to obtain N-half of mOPN and rOPN, respectively.
  • FIG. 1 shows the result that the antibody does not react with the 39E1 antibody and 34E3 antibody strength, but reacts only with hOPN N-half.
  • hOPN-1 antibody and hOPN-5 antibody reacted to both hOPN and hOPN N-half.
  • FIG. 2 shows the results of Western blotting for mOPN and rOPN using the 39E1 antibody and 34E3 antibody.
  • polypeptide (d) described in the applicant's international patent application W 002/081522 international publication pamphlet
  • cysteine (C) added to the amino acid sequence corresponding to positions 138 to 153 of mOPN
  • Western blotting was performed in the same manner as described above using an antibody obtained using as an antigen (hereinafter, this antibody is referred to as “mOPN-5 antibody”). This result is also shown in FIG.
  • FIG. 2 shows that 39E1 antibody and 34E3 antibody strength 3 ⁇ 4 react with mOPN N-half and rOPN N-half in addition to OPN N-half alone. This means that 39E1 antibody and 34E3 antibody strength 3 ⁇ 4 OPN N-half, mOPN N—half and rOPN N—half are cross-linked and the recognition site of the antibody is hOPN N-half, mOPN N—half and rOPN N — It was shown that the amino acid sequence is common to the C-terminal of half.
  • a conjugate of hOPN-1 antibody obtained in Reference Example 3 and horseradish peroxidase (HRP) was prepared as follows. The required amount of HRP is dissolved in distilled water and oxidized with NalO.
  • hOP N-1 labeled antibody a conjugate of hOPN-1 antibody and HRP (hereinafter referred to as “hOP N-1 labeled antibody”).
  • a sandwich ELISA plate on which E1 antibody or 34E3 antibody was immobilized was used. Further, a conjugate of hOPN-1 antibody and HRP prepared in (1) above was used as a labeled antibody.
  • mOPN— 1 peptide LPVKVTDSGSSEEKLY (SEQ ID NO: 7)
  • GRGD S peptide GRGD S (SEQ ID NO: 16)
  • Each of the above polypeptides or proteins is 0.1 M carbonate buffer ( ⁇ 9 ⁇ 5).
  • FIG. 4 shows that mouse melanoma cell lines having ⁇ 9 and ⁇ 4 integrin amino acid sequence GRGDS-free polypeptides, mOPN-1 peptide and mOPN-3 peptide, hardly adhere to each other. It was.
  • 39E1 antibody, 34E3 antibody or mOPN-5 antibody strength Whether to inhibit cell adhesion to polypeptides (mOPN-5 peptide, mOPN-7 peptide and GRGDS peptide) contained in mOPN was examined by the following method. . First, 96-well plates were pre-coated with various concentrations of mOPN-5, mOPN-7 and GRGDS peptide at 4 ° C, then non-specific with 0.5% BSA PBS at 37 ° C for 10 minutes. A treatment to block mechanical adhesion was performed.
  • mouse melanoma cells B16-F10 are suspended in D-MEM containing 0.25% BSA, and the cell suspension (cell concentration is 5 ⁇ 10 4 cells / well) 200 1 is mixed with the above-mentioned various concentrations.
  • Adherent cells were fixed and stained with 0.5% crystal violet in 20% methanol for 30 minutes. All wells were rinsed 3 times with water, and adherent cells were lysed with 20% acetic acid. To determine the relative number of cells with each well supernatant attached to the well, absorbance at 590 nm was measured and analyzed with an immuno reader. These results are shown in FIG.
  • FIG. 5 shows that 39E1 antibody and 34E3 antibody strength inhibit the adhesion of mouse melanoma cell line to mOPN-5 and mOPN-7.
  • the 39E1 and 34E3 antibodies do not affect the adhesion between the mouse melanoma cell line and the GRGDS peptide.
  • the 39E1 antibody and the 34E3 antibody force inhibit the adhesion between mOPN and ⁇ 4 and ⁇ 9 integrin.
  • mOPN-5 antibody obtained by using polypeptide (d) containing GRGDS peptide as an antigen inhibits adhesion between GRGDS peptide and mouse melanoma cell line. This is because the antibody is short! / And does not recognize the GRGDS peptide.
  • the recognition site strength of the 39E1 antibody and 34E3 antibody was an amino acid sequence continuous from the C-terminal amino acid of the S, OPN N-half to the N-terminal side.
  • the polynucleotides encoding the following polypeptides (I) to (V) having five different portions in the hOPN-7 peptide used for the production of 39E1 antibody and 34E3 antibody are provided on the 3 ′ side, On the 5 'side, 5 patterns of primer (antisense primer) designed to have a polynucleotide encoding the C-terminal part of any polypeptide sequence to which these polypeptides (I) to (V) are to be bound. ) was produced.
  • a primer for the SP6 promoter was prepared. Then, the PCR method using these antisense primers and sense primers was used to synthesize from the promoter required for mRNA synthesis to the 3 'end of the cDNA. Furthermore, mRNA was synthesized using this PCR product as a saddle type, and proteins corresponding to the respective nucleotide sequences were further synthesized from the mRNA in a cell-free synthesis system using wheat germ extract (manufactured by Cell Free Science). Western blotting was performed using each protein synthesized with 39E1 antibody and 34E3 antibody and hOPN N-half as a control.
  • FIG. 6 shows that the 39E1 antibody and the 34E3 antibody comprise a polypeptide comprising an amino acid sequence at the C-terminus of the hOPN N-half used for the antigen and then contiguous to the N-terminus (
  • Urine was collected from 23 healthy subjects and 25 RA patients with informed consent.
  • Human Osteopontin Assay Kit (L)-IBL manufactured by Immunobiology Laboratories, Inc. (product number: 27158)
  • Example 4 Using the prepared ELISA system, full-length OPN concentration and OPN N-half concentration were measured, full-length OPN and OPN N-ha If concentrations in urine samples were expressed in pM, and numerical values were expressed as mean soil standard error. The results of measuring these concentrations are shown in Table 1.
  • OA is mild 45 joints equivalent to Kellgren & Lawrence grades 1 and 2, moderate 33 joints equivalent to grade 3, 29 joints equivalent to grade 4, and RA is a severe case of Larsen classification grade III, IV, V It is.
  • OPN N-half concentration was determined using the ELISA kit prepared in Example 4.
  • full-length OPN concentration was also measured using Human Osteopontin Assay Kit (L)-IBL (manufactured by Immunobiological Laboratories, Inc. (Product No. 27158).
  • OPN N-half in the patient's knee joint fluid by Western blotting Of the patient knee joint fluid collected in Example 8, the OPN N-half amount was high in the measurement results by ELISA in Example 8. The detected knee joint fluid and the strength of the knee joint fluid with almost no measured value were detected by Western blotting using the OPN N-half antibody of the present application. Specifically, 0.15 ml of these knee joint fluids were diluted 2-fold with D-PBS, and DEA E 3 ⁇ 4 epharose Fast Flow (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) 20 1 was added thereto, and mixed at room temperature for 30 minutes.
  • Hepatitis was developed by intravenous administration of 200 ug / cona of C57BL / 6 mice. Three hours before Con A administration, 400 ug / mouse of 34E3 antibody or control antibody was intravenously administered. Serum was collected 24 hours after ConA administration, and ALU was measured. [0108] The ALT level was significantly decreased in the 34E3 antibody administration group compared to the control antibody administration group. This indicates that 34E3 antibody can suppress hepatocyte necrosis caused by ConA administration.
  • the antibody that recognizes the C-terminal peptide of thrombin-cleaved OPN (OPN N-half) of the present invention recognizes thrombin-cleavage OPN and does not recognize full-length OPN. And OPN N-half measurement kits that use this can measure OPN N-half accurately, unlike OPN measurement kits that have been marketed so far.
  • the measurement kit of the present invention can be used for diagnosing inflammatory diseases related to OPN, and for research on mechanisms related to onset.
  • the antibody itself can be used as an antibody drug as a therapeutic agent for inflammatory diseases.
  • OPN N-half and other thrombin cleavage OPN can be used as a tag for purifying peptides with C-terminal end of OPN. The power S to do.
  • FIG. 1 shows Western blotting using 34E3 antibody, 39E1 antibody, hOPN-1 antibody and hOPN-5 antibody (in the figure, lane 1 is hOPN, 2 is hOPN T hrombin) (—), 3 represents hOPN Thrombin (+), 4 represents hOPN N—half, 5 represents hOPN N -half Thrombin (—), and 6 represents hOPN N—half Thrombin (+)).
  • FIG. 2 is a drawing showing Western blotting using 34E3 antibody, 39E1 antibody and mOPN-5 antibody.
  • FIG. 3 shows the results of measuring hOPN N-half (Thrombin (+)), hOPN (Thrombin (1)) and control (hOPN) using the ELIS A plate prepared in Example 4.
  • A is the result measured with hOPN-5 antibody and hOPN-1 labeled antibody
  • B is the result measured with 34E1 antibody and hOPN-1 labeled antibody
  • C is 39E3 antibody and hOPN-1 labeled antibody. Shows the result of measurement.
  • FIG. 4 is a drawing showing the results of adhesion tests of various polypeptides derived from mouse OPN to mouse melanoma cell line B16-F10.
  • FIG. 5 shows 34E3 antibodies (34E3) and 39E1 against various polypeptides derived from mouse OPN. It is a figure which shows the result of having measured the adhesion inhibitory activity of an antibody (39E1) and mOPN-5 antibody (M-5) (in the figure, A is the result of the adhesion inhibition test using mOPN-5 peptide, B is m Results of adhesion inhibition test using OPN-7 peptide and C shows results of adhesion inhibition test using GRGDS peptide V).
  • FIG. 6 shows Western blotting using 34E3 antibody, 39E1 antibody and hOPN-5 antibody and various polypeptides or proteins (lane 1 is mRNA, 2 is cDNA, 3 is cDNA—YGLR, 4 is cDNA—VYGLR, 5 is cDNA—VY GL, 6 is cDNA—SVVYGL, 7 is cDNA—SWYG, 8 is purified hOPN N—half).

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Description

明 細 書
モノクローナル抗体およびその用途
技術分野
[0001] 本発明は、 C末端に特定のアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを特 異的に認識するモノクローナル抗体およびその用途に関する。
背景技術
[0002] ォステオポンチン（以下、「OPN」という）は、骨に多く含まれる酸性のカルシウム結 合性の糖タンパク質であり、成熟体 OPNは生体内のトロンビンにより切断されて、 OP Nの N末端フラグメント（以下、「OPN N— half」という）および C末端フラグメント（以 下、「OPN C— half」という）の 2つになる。例えば、ヒトォステオポンチン（以下、「h OPN」という）であれば、 hOPNのアミノ酸配列の 168番目のアルギニン残基の C末 端側で切断されて、 hOPN N— halfと hOPN C— halfの 2つになる。
[0003] 上記 OPNは、多種の生理学的病理学的に重要な機能を担っており、例えば、細胞 接着、細胞遊走、腫瘍形成、免疫応答および補体が媒介する細胞溶解の阻害等の 機能を持っている。この多様な機能は、多種の細胞表面受容体により媒介されてい る。トロンビンにより切断された OPN N— halfは、 C末端側に SVVYGLR配列を露 出し、この配列を介して α 9および α 4インテグリンと結合することが明らかにされてい
[0004] 本出願人らはこれまで ΟΡΝの生体内における機能を研究し、その結果、上記 ΟΡ Ν Ν— halfと各種疾患の関連を徐々に明らかにしてきている。例えば、本出願人に よる国際特許出願（特許文献 1)ではリウマチ患者にお!、て全 OPNに占める OPN N— halfの割合が増大することを報告して!/、る。
[0005] このように OPN N— halfと疾患との関連は徐々に明らかになってきている力 その 他疾患との関連を更に明らかにするためにも、 OPN N— halfを正確に測定すること は重要であった。しかし、上記国際特許出願で本出願人らが報告している 2K1抗体 は、 OPN N— halfの C末側に認識領域をもつものの、トロンビンにより切断されてい ない OPNも認識するため、条件によっては OPN N— halfを正確に測定していると は言い難かった。
[0006] また、上記 OPN N— halfは OPNのトロンビンによる切断により SWYGLR配列を 露出し、この配列を介して α 9および α 4インテグリンと結合すると!/、う事実から、この 結合を効果的に阻害するためには前記配列の少なくとも一部と特異的に結合する抗 体が必要であった。
特許文献 1 :WO02/081522国際公開パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 従って、本発明は全長 OPNを認識せずに、 OPN N— halfのみを認識する抗体 の提供およびこの抗体を利用して OPN N— halfを正確に測定する方法等を提供 することを課題とするものである。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究をした結果、特定のアミノ酸配 歹 IJからなるポリペプチドを抗原として得られた、 C末端に特定のアミノ酸配列を有する タンパク質またはポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体力 s、上記課題 を解決しうることを見出し、本発明を完成させた。
[0009] また、本発明者らは、このモノクローナル抗体を利用すれば、 OPN N— halfを正 確に測定できることを見出した。更に、前記抗体は、 OPN N— halfと関連する疾患 の診断や重篤度の判定、治療等に利用可能なことを見出した。更にまた、前記抗体 は、 C末端が前記アミノ酸配列であるタンパク質またはポリペプチドを認識するので、 前記タンパク質またはポリペプチドをタグとすれば目的タンパク質の検出-精製等に 利用可能なことを見出し、本発明を完成させた。
[0010] すなわち、本発明は C末端のアミノ酸配列が YGLR (配列番号 1)であるタンパク質 またはポリペプチドを認識し、アミノ酸配歹 IJYGLRを C末端以外に有するタンパク質ま たはポリペプチドを実質的に認識しないことを特徴とするモノクローナル抗体である。
[0011] また、本発明は前記モノクローナル抗体を含む第 1の試薬と、前記第 1の試薬に含 まれるモノクローナル抗体と認識部位が異なり、かつ、トロンビンで切断されたォステ ォポンチンの N末端フラグメントを認識する抗体を含む第 2の試薬とを含有することを 特徴とするトロンビンで切断されたォステオボンチンの N末端フラグメントの測定キット である。
[0012] 更に、本発明は検体中のトロンビンで切断されたォステオボンチンの N末端フラグメ ントを、前記モノクローナル抗体で測定することを特徴とするトロンビンで切断された ォステオボンチンの N末端フラグメントの測定方法である。
[0013] また更に、本発明は前記モノクローナル抗体を用いて、検体中のトロンビンで切断 されたォステオボンチンの N末端フラグメント量を測定し、その量を指標として関節リ ゥマチを診断する方法、関節リウマチと変形性関節炎とを鑑別する方法または変形 性関節炎の重篤度を判定する方法である。
[0014] 更にまた、本発明は前記モノクローナル抗体を有効成分とする炎症性疾患治療剤 および炎症性疾患患者に前記炎症性疾患治療剤を投与することを特徴とする炎症 性疾患の治療方法である。
[0015] また、本発明は前記モノクローナル抗体を有効成分とする自己免疫疾患の治療剤 および自己免疫疾患患者に前記自己免疫疾患の治療剤を投与することを特徴とす る自己免疫疾患の治療方法である。
[0016] 更に、本発明はタグと共に発現させた目的タンパク質を、タグを認識する抗体を用
V、て検出'精製する目的タンパク質の検出 ·精製方法にお!/、て、タグとして C末端の アミノ酸配列が YGLRであるタンパク質またはポリペプチドを用い、タグを認識する抗 体として前記モノクローナル抗体を用いることを特徴とする目的タンパク質の検出 '精 製方法である。
[0017] また更に、本発明は目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび C末端のァ ミノ酸配列が YGLRであるタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド を有する組換えベクターである。
発明の効果
[0018] 本発明のモノクローナル抗体は、 C末端に特定のアミノ酸配列を有するタンパク質 またはポリペプチドを特異的に認識するので、 C末端が前記アミノ酸配列である OPN
N— halfを認識し、前記アミノ酸配列を C末端以外に有する OPNを実質的に認識 しない抗体である。 [0019] 従って、このモノクローナル抗体は、このモノクローナル抗体が認識する OPN N— halfの正確な測定、 OPN N— halfと関連する疾患の診断や重篤度の判定、治療、 前記抗体と特異的に結合するアミノ酸配列をタグとした目的タンパク質の検出 ·精製 等に利用可能である。
発明を実施するための最良の形態
[0020] 本発明のモノクローナル抗体（以下、「本発明抗体」という）は、 C末端のアミノ酸配 歹 IJが YGLR (配列番号 1)であるタンパク質またはポリペプチドを認識し、アミノ酸配列 YGLRを C末端以外に有するタンパク質またはポリペプチドを実質的に認識しないこ とを特徴とするものである。なお、本発明抗体がアミノ酸配歹 IJYGLRを C末端以外に 有するタンパク質またはポリペプチドを実質的に認識しないとは、本発明抗体が前記 タンパク質またはポリペプチドに結合する割合が 1.0質量％ (以下、単に「％」という） 以下、好ましくは 0〜0.5%であることをいう。
[0021] 本発明抗体は、上記特徴を有するものであれば、その作製法は特に限定されない 。具体的に本発明抗体は、 C末端のアミノ酸配列が YGLRであるタンパク質またはポ リペプチドを抗原とし、これを動物に免疫を行い、当該動物から抗体を採取した後、 C 末端のアミノ酸配列が YGLRであるタンパク質またはポリペプチド、アミノ酸配列 YG LRを C末端以外に有するタンパク質またはポリペプチド等を利用してスクリーニング することにより得られる。以下に本発明抗体の作製法を詳細に説明する。
[0022] 上記抗原として用いる C末端のアミノ酸配列が YGLRであるタンパク質またはポリぺ プチドとしては、特に制限されないが、例えば、 C末端のアミノ酸配列が YGLRである OPN N— halfの C末端から N末端側へ 4〜； 10個程度、好ましくは、 5〜7個程度 連続したアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。具体的なポリペプチドとし ては、 hOPN N— halfの C末端力、ら N末端側へ 7つ連続したアミノ酸配歹 IJSVVYG LR (配列番号 2)力もなるポリペプチド（以下、「hOPN— 7ペプチド」と!/ヽぅ）が挙げら れる。この hOPN— 7ペプチドは hOPNのアミノ酸配列（配列番号 3)の 162番目から 168番目に一致する。なお、 hOPNのアミノ酸配列としては、ァクセッションナンバー BAA03554, AAC28619等のものが Pubmed (http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/entr ez/query.fcgi?DB=pubmed)等から参照できる力 S、本発明においては BAA03554の ものを hOPNのアミノ酸配列として使用した。また、前記ポリペプチドには抗原性を高 めるために生体高分子化合物を結合させ結合物とし、これを抗原とすることが好まし い。更に、この場合には前記ポリペプチドの N末端のアミノ酸にシスティン（C)を付け て結合させることが好ましレ、。
[0023] 抗原に用いられる C末端のアミノ酸配列が YGLRであるタンパク質またはポリぺプ チドは、特に限定されることなく種々の方法で得ることができる。このうちポリペプチド は、例えば、当業界で公知の方法により合成してもよいし、シンぺップ社（Sy叩印 Co rporation)およびタナ社（TANA Laboratories, USA)等から合成品を購入することも できる。
[0024] 上記ポリペプチドに結合させる生体高分子化合物の例としては、スカシ貝のへモシ ァニン（以下「KLH」という）、卵白アルブミン（以下、「OVA」という）、ゥシ血清アルブ ミン（以下「BSA」という）、ゥサギ血清アルブミン（以下「RSA」という）、サイログロブリ ン等が挙げられ、このうち KLHおよびサイログロブリンが好ましい。
[0025] 上記ポリペプチドと生体高分子化合物との結合は、例えば、混合酸無水物法 (B.
F. Er langer, et al. ： J. Biol. Chem. 234 1090-1094(1954))または活性化エス テル法（A. E. ARU, et al. ： J. Agric. Food Chem. 42 301- 309(1994))等の 公知の方法によって行うことができる。
[0026] 混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、上記ポリペプチドを通常の ショッテン バウマン反応に付すことにより得られ、これを生体高分子化合物と反応さ せることにより目的とするポリペプチドと生体高分子化合物との結合物が作成される。 この混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロ口蟻 酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロ口蟻酸ェチル、ブロモ蟻酸ェチル、クロ口蟻酸イソ ブチル等が挙げられる。当該方法におけるペプチドとハロ蟻酸エステルと高分子化 合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。
[0027] なお、ショッテン バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われる力 当該反 応に用いられる塩基性化合物としては、ショッテン バウマン反応に慣用の化合物、 例えば、トリエチノレアミン、トリメチノレアミン、ピリジン、ジメチルァニリン、 N メチルモ ノレホリン、ジァザビシクロノネン（DBN)、ジァザビシクロウンデセン（DBU)、ジァザビ シクロオクタン (DABCO)等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素力 リウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等を使用することができる。
[0028] また、上記反応は通常 20°Cから 100°C、好ましくは 0°Cから 50°Cにおいて行わ れ、反応時間は 5分から 10時間程度、好ましくは 5分から 2時間である。
[0029] 得られた混合酸無水物と生体高分子化合物との反応は、通常 20°Cから 150°C、 好ましくは 0°Cから 100°Cにおいて行われ、反応時間は 5分から 10時間程度、好まし くは 5分から 5時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われるが、溶媒とし ては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的に はジクロロメタン、クロ口ホルム、ジクロロェタン等のハロゲン化炭化水素、ベンゼン、ト ノレェン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジェチルエーテル、ジォキサン、テトラヒド 口フラン、ジメトキシェタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸ェチル等のエステル類 、 N, N ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、へキサメチルリン酸トリアミド等 の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。
[0030] 一方、活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、上記ポリ ペプチドを有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にて N ヒドロキシコハク酸ィ ミドと反応させ、 N ヒドロキシコハク酸イミド活性化エステルを生成する。
[0031] 当該反応に用いられるカップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常の カップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロへキシルカルポジイミド、カルボエルジイ ミダゾール、水溶性カルポジイミド等が挙げられる。また、有機溶媒としては、例えば N, N ジメチルホルムアミド（DMF)、ジメチルスルホキシド、ジォキサン等が使用で きる。反応に使用するポリペプチドと N ヒドロキシコハク酸イミド等のカップリング剤 のモル比は好ましくは1 : 10〜10 : 1、最も好ましくは1 : 1でぁる。反応温度は、 0〜50 °C、好ましくは 22〜27°Cで、反応時間は 5分〜 24時間、好ましくは 1〜2時間である 。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。
[0032] カップリング反応後、反応液を生体高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させ ると、例えば生体高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基と上記 ペプチドのカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、 0〜60°C 、好ましくは 5〜40°C、より好ましくは 22〜27°Cで、反応時間は 5分〜 24時間、好ま しくは 1〜； 16時間、より好ましくは 1〜 2時間である。
[0033] 上記いずれかの方法により得られた反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製す ることにより、上記ペプチドと生体高分子化合物との結合物（以下、単に「結合物」と V、うことがある）を得ることができる。
[0034] 次に、上記のようにして得られた結合物を抗原として用いた本発明抗体 (モノクロ一 ナル抗体）の製造方法について説明する。なお、抗体の調製にあたっては、抗原とし て結合物を用いる以外は、公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研 究法（日本生化学会編）等に記載の方法を適宜利用することができる。
[0035] 上記結合物を抗原とした具体的な免疫方法としては、まず、結合物をリン酸ナトリウ ム緩衝液（以下、「PBS」という）に溶解し、これとフロイント完全アジュバントまたは不 完全アジュバント、あるいはミヨウバン等の補助剤と混合し、これを抗原として動物を 免疫する。
[0036] 免疫される動物としては当該分野で常用されたものをいずれも使用できる力 例え ば、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ゥマ等の哺乳動物を挙げることができる。また、免疫 の際の免疫原の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉 内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は、 1回ま たは適当な間隔で複数回、好ましくは 1週間ないし 5週間の間隔で複数回行うことが できる。
[0037] 最後に、常法に従い、上記の免疫を行った動物から得た免疫細胞と、ミエローマ細 胞とを融合させてハイプリドーマを得、当該ハイプリドーマの培養物から抗体を採取 する。そして、その抗体を C末端のアミノ酸配列が YGLRであるタンパク質またはポリ ペプチド等を利用してスクリーニングすることによって本発明抗体を得ることができる。 具体的なスクリーニング法としては、まず、 C末端のアミノ酸配列が YGLRであるタン パク質またはポリペプチドと結合する抗体を採取し、次いで、アミノ酸配列 YGLRを C 末端以外に有するタンパク質またはポリペプチドと実質的に結合しない抗体を採取 する方法等が挙げられる。 C末端のアミノ酸配列が YGLRであるタンパク質またはポ リペプチドとしてはヒト、マウス、ラット等の OPN N— half等のタンパク質または YGL R (配列番号 1)、 VYGLR (配列番号 17)等のポリペプチドが挙げられる。また、ァミノ 酸配歹 IJYGLRを C末端以外に有するタンパク質またはポリペプチドとしては、ヒト、マ ウス、ラット等の OPN等のタンパク質または VYGL (配列番号 18)、 SVVYGL (配列 番号 19)、 SVVYG (配列番号 20)等のポリペプチドが挙げられる。
[0038] 斯くして得られる本発明抗体は C末端のアミノ酸配列力 SYGLRであるタンパク質ま たはポリペプチドを認識し、アミノ酸配歹 IJYGLRを C末端以外に有するタンパク質また はポリペプチドを実質的に認識しな!/、ものである。そしてこの抗体はポリペプチドまた はタンパク質の C末端が YGLRのもののみを認識するので、このアミノ酸配列を C末 端に有する hOPN N— half等を認識することができる。一方、この抗体は前記アミノ 酸配列を C末端以外に有するトロンビンで切断されて!/、な!/、hOPNは認識することが できない。また、アミノ酸酉己歹 IJYGLRは α 9 /3 1、 « 4 /3 1 , « 4 /3 7等の α 9インテグリ ンまたは α 4インテグリンが認識するアミノ酸配列 SWYGLRに含まれているため、こ の本発明抗体は OPN N— halfと α 9インテグリンまたは α 4インテグリンとの結合を 阻害すること力 Sできる。更に、本発明抗体は、その認識部位力 SYGLRであることから、 このアミノ酸配列が C末端にあるブタ（ァクセッションナンバー： P14287)、サル（ΧΡ —001093307)、ノヽムスター (CAI65407)、ィヌ (ΑΒΑ40758)マウス (ΑΑΑ5726 5等）、ラット（BAA19247等）の OPN N— halfも認識することができる。
[0039] 本発明抗体は上記したように OPN N— halfと α 9インテグリンまたは α 4インテグリ ンとの結合を阻害することができる。これらのインテグリンは、炎症反応に関与してい ることから、インテグリン活性を阻害する薬剤は、潜在的には抗炎症作用を有してい ると考えられている。従って、本発明抗体は、リウマチ、肝炎、関節炎等の炎症性疾 患の治療に有効である。
[0040] なお、本発明抗体は以下の実施例で示すように、コンカナパリン Α (以下、「ConA」 という）誘導性肝炎において、肝細胞の壊死を抑制し、 ALT (ァラニンアミノトランスフ エラーゼ)値の上昇を抑制することができる。従って、本発明抗体は特に肝炎の治療 剤とすることが好ましい。
[0041] また、リウマチの炎症にはインテグリンが協同的に関与していると考えられるので、こ れらのインテグリンと OPN N— halfの結合を幅広く遮断する本発明抗体はリウマチ やそれ以外の自己免疫疾患の症状の憎悪を抑えることができる。従って、本発明抗 体を有効成分とすることでリウマチ性関節炎 ·若年性関節リウマチや慢性リウマチ等 のリウマチ、乾癬性関節炎 ·乾癬等の治療、臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、全身 性自己免疫疾患 ·エリテマトーデス ·ぶどう膜炎 ·ベーチェト病 ·多発性筋炎 ·糸状体 増殖性腎炎 ·サルコイドーシス等の自己免疫疾患の治療剤とすることができる。
[0042] 本発明抗体を上記治療剤とするには、本発明抗体を必要によりさらに精製し、その 後、常法に従って製剤化すればよい。この治療剤の剤型の例としては、注射剤、点 滴用剤等の非経口剤が挙げられ、これらは静脈内投与、皮下投与等により投与する ことが好ましい。また、製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型 に応じた担体や添加剤を使用することができる。上記製剤化に当たっての本発明抗 体の添加量は、患者の症状の程度、年齢や使用する製剤の剤型あるいは本発明抗 体の結合力価等により異なる力 s、例えば O. lmg/kgないし 100mg/kg程度である
〇
[0043] 更に、本発明抗体は必要により標識または固相化することにより免疫学的測定法に 禾 IJ用することカでさる。
[0044] 本発明抗体の標識は、西洋わさびペルォキシダーゼ（HRP)、アルカリホスファタ一 ゼ等の酵素、フルォレセインイソシァネート、ローダミン等の蛍光物質、 32ρ、 125ι等の 放射性物質、化学発光物質等の標識物質と本発明抗体とを常法で結合させることに より行われる。
[0045] また、本発明抗体の固相化は適切な固相に本発明抗体を結合させることにより行 われる。固相としては、免疫化学的測定法において慣用される固相の何れをも使用 すること力 Sでき、例えば、ポリスチレン製の 96穴マイクロタイタープレート、アミノ基結 合型のマイクロタイタープレート等のプレートや、各種のビーズ類が挙げられる。本発 明抗体を固相に結合させるには、例えば、本発明抗体を含む緩衝液を固相上に加 え、インキュベーションすればよい。
[0046] 更に、本発明抗体は、本発明抗体と認識部位が異なり、かつ、トロンビンで切断さ れた OPN N— halfを認識する抗体（以下、「OPN— 1抗体」という）と組み合わせる ことにより、 OPN N— halfを正確に測定することができる。
[0047] このような本発明抗体と認識部位が異なり、かつ、トロンビンで切断された OPN N — halfを認識する抗体としては、例えば、 OPN N— halfの全部または 1部を抗原と し、常法により得ることができるポリクローナル抗体やモノクローナル抗体が利用でき
[0048] 上記抗原として用いる OPN N— halfの全部または 1部としては、特に制限されな いが、例えば、 OPN N— halfの N末端側のアミノ酸配列を有するポリペプチド、好 ましくは前記アミノ酸配列中、 5〜30個程度、好ましくは 10〜20個程度連続したアミ ノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。このポリペプチドは、測定対象となる OP Nまたは OPN N— halfの由来となる動物に併せて適宜選択すればよぐ例えば、 測定対象が hOPNであれば hOPNのアミノ酸配列（配列番号 3)の 17〜31番目に該 当する hOPN—lペプチド、マウス OPN (以下、「mOPN」という）であれば mOPNの アミノ酸配列（配列番号 4)の 17〜32番目に該当する mOPN— 1ペプチド、ラット OP N (以下、「rOPN」と!/、う）であれば rOPNのアミノ酸配列（配列番号 5)の 17〜33番 目に該当する rOPN—1ペプチド等が挙げられる。なお、 mOPNのァミノ配列として は、ァクセッションナンノ ー AAA57265、 AAH02113, AAH57858、 AAH8072 0、 CAA36132および NP033289のものが Pubmedから参照できる力 本発明に おいては AAA57265を使用した。また、 rOPNのアミノ酸配列としても AAH78874 および BAA19247のもの力 SPubmedから参照できる力 本発明においては BAA19 247のものを使用した。
[0049] hOPN— 1ペプチド： IPVKQADSGSSEEKQ (配列番号 6)
mOPN— 1ペプチド： LPVKVTDSGSSEEKLY (配列番号 7)
rOPN— 1ペプチド： LPVKVAEFGSSEEKAHY (配列番号 8)
[0050] また、上記ペプチドを用いて OPN— 1抗体を作製する場合、抗原として前記本発明 抗体の作製方法と同様に、上記ペプチドと生体高分子化合物との結合物を利用して も良い。この上記ペプチドと生体高分子化合物との結合物は、上記ペプチドの C末 端側のアミノ酸に、例えばリジン'システィン (KC)を付けて結合させることが好ましい
[0051] 上記のような OPN— 1抗体としては株式会社免疫生物研究所から市販されている下 記のものを禾 lj用することもできる。 Anti-Mouse Osteopontin (0-17) Rabbit IgG Affinity Purify
(製品番号： 18621)
Anti-Human Osteopontin (0-17) Rabbit IgG Affinity Purify
(製品番号： 18625)
Anti-Rat Osteopontin (0-17) Rabbit IgG Affinity Purify
(製品番号： 18628)
[0052] 本発明抗体と OPN— 1抗体とを用いた OPN N— halfの具体的な測定方法として は、放射性同位元素免疫測定法 (RIA法）、 ELISA法（E. Engvall et al.， (1980): Methods in Enzymol., 70， 419-439)、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝 集法、ォクタロニー（Ouchterlony)、ィムノクロマト法等の、一般の免疫化学的測定 法にぉレ、て使用されて!/、る種々の方法（「ノヽイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、 株式会社 R&Dプランニング発行、第 30頁—第 53頁、昭和 57年 3月 5日 )が挙げら れる。
[0053] これらの測定方法は種々の観点から適宜選択することができる力 感度、簡便性等 の点からは ELISA法が好ましい。より具体的な、 OPN N— halfの測定について、 E LISA法の一つであるサンドイッチ法を例にとってその手順を説明すれば次の通りで ある。
[0054] まず、工程 (A)として、本発明抗体を担体に固相化し、次いで、工程 (B)として、抗 体が固相化されていない担体表面を OPN N— halfと無関係な、例えばタンパク質 等によりブロッキングする。更に、工程（C)として、これに各種濃度の OPN N-half を含む検体を加え、 OPN N— halfと本発明抗体との複合体を生成させた後、工程 (D)として、標識した OPN—1抗体を加え、これに OPN N— halfと抗体との複合体 を結合させ、最後に工程 (E)として、標識量を測定することにより、予め作成した検量 線から検体中の OPN N— halfの量を決定することができる。なお、工程 (A)と工程 (D)に用いる抗体は逆の場合でも測定が可能であるが、本発明抗体を固相化した方 が検出感度の点から好ましレ、。
[0055] 具体的に工程 (A)において、本発明抗体を固相化するために用いられる担体とし ては、特別な制限はなぐ免疫化学的測定法において常用されるものをいずれも使 用すること力できる。例えば、ポリスチレン製の 96穴マイクロタイタープレートあるいは 、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートが挙げられる。また、上記抗体を固相化さ せるには、例えば、上記抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすれ ばよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば 10mMの PBSを挙げることが できる。緩衝液中の上記抗体の濃度は広い範囲から選択できる力 通常 0.01〜； 100 H g/ml程度、好ましくは 0·；!〜 20 g/mlが適している。また、担体として 96ゥエル のマイクロタイタープレートを使用する場合には、 300 1/ウエノレ以下で 20〜； 150〃 1/ゥエル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、 通常 4°C程度で一晩のインキュベーションが適している。
[0056] また、工程 (B)のブロッキングは、工程 (A)で本発明抗体を固相化した担体におい て、後に添加する検体中の OPN N— halfが抗原抗体反応とは無関係に吸着され る部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤としては、 例えば、 BSAやスキムミルク溶液や、ブロックエース（Block— Ace：大日本製薬製（ コード No.UK— 25B) )等の市販のブロッキング剤を使用することができる。具体的 なブロッキングは、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブ ロックエースを適量加え、約 4°Cで、一晩のインキュベーションをした後、緩衝液で洗 浄することにより行われる。
[0057] 更に、工程（C)において、 OPN N— halfを含む検体を固相化した本発明抗体と 接触させ、この固相化した本発明抗体で OPN N— halfを捕捉し、固相化した本発 明抗体と OPN N— halfとの複合体を生成させる。この複合体を生成させるための 条件は限定されるわけではないが、 4°C〜37°C程度で約 1時間〜 1晚の反応を行え ばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させるこ とが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、 10mMの PBS (pH7.2)および 0.0 5% (v/v)の Tween20の糸且成のものが好まし!/、。
[0058] また更に、工程 (D)において、固相化した本発明抗体に捕捉された OPN N-hal fに、常法により西洋わさびペルォキシダーゼ（HRP)、アルカリホスファターゼ等の酵 素、フルォレセインイソシァネート、ローダミン等の蛍光物質、 32ρ、 125ι等の放射性物 質、化学発光物質等の標識物質で標識した OPN— 1抗体を加え、固相化した本発 明抗体 OPN N— half 標識した OPN—l抗体の複合体を形成させる。この反 応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好まし い。この反応に用いる緩衝液としては、前記したものが使用される。この工程 (D)に おいて使用される標識した OPN— 1抗体の量は、固相化した本発明抗体に対して約 5,000〜； 10,000倍、好ましくは最終吸光度が 1.5〜2.0となるように希釈された量で ある。希釈には緩衝液を用いることができ、反応条件は特に限定されるわけではない 力 4°C〜37°C程度で約 1時間行い、反応後、緩衝液で洗浄することが好ましい。以 上の反応により、固相化した本発明抗体 OPN N— half 標識した OPN— 1抗 体の複合体を形成させることができる。
[0059] 最後に工程 (E)において、 OPN 1抗体の標識に用いた標識物質と反応する発 色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線から OPN N— halfの量 を算出すること力できる。
[0060] 標識抗体の標識物質として、西洋わさびペルォキシダーゼを使用する場合には、 例えば、過酸化水素と 3，3'，5，5'—テトラメチルベンジジン（以下「TMB」という）を含 む発色基質溶液を使用することができる。発色反応の条件は、限定されるわけでは ないが、発色基質溶液を加え約 25°Cで約 30分間反応させた後、；!〜 2Nの硫酸を加 えて酵素反応を停止させることにより行うことができる。 TMBを使用する場合、発色は 450nmの吸光度により測定する。一方、標識物質として、アルカリホスファターゼを 使用する場合には、 p 二トロフエニルリン酸を基質として発色させ、 2Nの水酸化ナト リウムを加えて酵素反応を止め、 415nmでの吸光度を測定する方法が適している。 なお、既知の濃度の OPN N— halfを添加した反応液の吸光度により予め作成して おいた検量線を用いて、検体中の OPN N— halfの濃度を算出することもできる。
[0061] 上記で説明した OPN N— halfの測定方法を実施するには、本発明抗体を含む 第 1の試薬と、 OPN— 1抗体を含む第 2の試薬とを含有することを特徴とする OPN N— halfの測定キット（以下、「本発明キット」と!/、う）を利用することが好まし!/、。
[0062] なお、本発明キットは常法により作製することができる。具体的には、本発明抗体ま たは OPN— 1抗体のいずれかを標識抗体とし、他に、希釈用緩衝液、標準物質、基 質用緩衝液、停止液、洗浄液等を組み合わせればよい。 [0063] 上記の測定方法や測定キットを利用することにより、血漿、血清、尿、関節液等の検 体中の OPN N— halfを正確に測定することができる。
[0064] また、上記の測定方法や測定キットを利用して上記検体中、特に尿中の OPN N halfを測定し、その量を指標とすれば、関節リウマチを診断することができる。具体 的には、まず、複数名の健常者または関節リウマチ患者の尿を採取し、上記の測定 方法や測定キットを利用して OPN N— half濃度を測定し、その平均値を算出して おく。次に、被験者の尿中の OPN N— half濃度を測定し、その値が健常者の平均 値よりも有意に高い（例えば、 1500pM以上)場合または関節リウマチ患者の平均値 より有意に低い値 (例えば、 1500pM未満）でない場合には、その被験者が関節リウ マチであると診断することができる。
[0065] 更に、上記の測定方法や測定キットを利用して上記検体中、特に関節液中の OPN
N— halfを測定し、その量を指標とすれば、関節リウマチと変形性関節炎とを鑑別 すること力 Sできる。具体的には、まず、複数名の変形性関節炎患者または関節リウマ チ患者の膝関節液を採取し、上記の測定方法や測定キットを利用して OPN N-ha If濃度を測定し、その平均値を算出しておく。次に、被験者の OPN N— half濃度を 測定し、その値が変形性関節炎患者の平均値よりも有意に高い（例えば、 200pM以 上)場合または関節リウマチ患者の平均値より有意に低い値 (例えば、 200pM未満） でない場合には、その被験者が関節リウマチであると診断することができる。また、こ の鑑別においては、関節液中の OPN濃度を測定し、これから全 OPN (OPNと OPN
N— half)に対する OPN N— halfの比率を算出し、この結果と併せて鑑別しても 良い。具体的に、本実施例においては、関節液中の全 OPNに対する OPN N-ha Ifの比率力 8.52%以上であればその被験者が関節リウマチであると診断することが できる。なお、関節液中の OPN濃度は、市販の OPN測定キット（例えば、 Human 0 steopontin Assay Kit (L) - IBL (株式会社免疫生物研究所製（製品番号： 27158 ) ) )等を利用して測定すること力 Sできる。
[0066] また更に、関節液中の OPN N— halfの量は、変形性関節炎のグレードと相関が 認められるので、これを指標とすれば、上記鑑別の他に、変形性関節炎の重篤度を 判定することもできる。具体的に関節液中の OPN N— halfの量は、軽度よりも中等 度、重度で高値 (軽度は平均値 55. OpMに対し、中等度では 163. 9pMおよび重 度では 142· 2pMの平均値）を示す。また、関節液中の全 OPN (OPNと OPN N— half)に対する OPN N— halfの比率も変形性関節炎のグレードと相関が認められる ので、この結果と併せて変形性関節炎の重篤度を判定しても良い。具体的に、本実 施例においては、関節液中の全 OPNに対する OPN N— halfの比率が、 0.93%以 下であればその被験者が変形性関節炎の軽度であり、 1.81 %以上であればその被 験者が変形性関節炎の中等度あるいは重度であると判定することができる。
[0067] 本発明抗体は C末端がアミノ酸配歹 IJYGLRであるタンパク質またはポリペプチドを 特異的に認識するので、前記抗体が認識するタンパク質またはポリペプチドを、 His タグ、 Flagタグ等の周知のタグと同様にして目的タンパク質の検出 ·精製等に用いる こと力 Sでさる。
[0068] 具体的に、 目的タンパク質の検出であれば、まず、 C末端のアミノ酸配列が YGLR であるタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、検出の対象とな る目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを常法により作製し、これらをベクター に組み込んで組換えベクターを作製する。次に、この組換えベクターを用いて周知 のタンパク質発現系で目的タンパク質と C末端がアミノ酸配歹 IJYGLRであるタンパク 質またはポリペプチドとを含む組換えタンパク質を発現させる。最後に、この組換えタ ンパク質を常法により標識した本発明抗体で検出する。
[0069] 上記目的タンパク質の検出に用いられるベクターとしては、タンパク質発現系が小 麦胚芽抽出液を用いた無細胞合成系であれば pEUベクター等が挙げられる。この 場合、ベクターは目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの 3'末端に、 C末端の アミノ酸配列が YGLRであるタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチ ドを結合させたものを揷入したものが好ましぐまた、 目的タンパク質をコードするポリ ヌクレオチドの 5'末端に SP6等のプロモーターを揷入したものが好ましい。
[0070] また、上記目的タンパク質の検出に用いられるベクターとしては、タンパク質発現系 力 S 大腸菌等を用いた細胞合成系であれば pGEXベクター、 pQEベクター等が挙 げられる。
[0071] 一方、 目的タンパク質の精製であれば、上記と同様にして周知のタンパク質発現系 で目的タンパク質と C末端がアミノ酸配列 YGLRであるタンパク質またはポリペプチド とを含む組換えタンパク質を発現させ、これを担体に固定化した本発明抗体に結合 させる。次に、これを 0.1Mグリシン—塩酸バッファー（ρΗ2·5)等により結合を解離さ せ、組換えタンパク質を精製する。
[0072] 上記目的タンパク質の精製にお!/、て本発明抗体を固定化する担体としてはホルミ ルセルロファイン (生化学工業株式会社製）が挙げられ、また、固定化方法としてはァ ミノ基を利用する方法が挙げられる。
実施例
[0073] 以下、実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何 ら制約されるものではない。また当業者は、本明細書の記載に基づいて容易に本発 明に修飾、変更を加えることができるが、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。
[0074] 参 考 例 1
抗原用ポリペプチドの入手：
抗原用ポリペプチドとして、下記のアミノ酸配列からなるポリペプチド（a)〜（c)の H PLCクロマトグラフィー精製した状態の品をシンぺップ社（Sy叩印 Corporation)、タ ナ社（TANA Laboratories, USA)およびオースぺップ社 (Ausp印)より購入した。なお 、ポリペプチド（a)は hOPN N— halfの C末端のアミノ酸力も N末端側に連続したァ ミノ酸配列からなるアミノ酸配列（hOPN N— halfのアミノ酸配列の 162〜； 168番目 に該当するアミノ酸配列（以下、この配列を有するポリペプチドを「hOPN— 7ぺプチ ド」と!/、う） )にシスティン（C)を付けたものである。また、ポリペプチド（b)は hOPN N — halfのアミノ酸配列の 17〜31番目に該当するアミノ酸配列にシスティン（C)を付 けたものである。更に、ポリペプチド（c)は全長 hOPNのアミノ酸配列の 153〜； 169番 目に該当するアミノ酸配列にシスティン（C)を付けたものである。
ポリペプチド（a)： CSWYGLR (配列番号 9)
ポリペプチド（b)： IPVKQADSGSSEEKQC (配列番号 10)
ポリペプチド（c)： CVDTYDGRGDSVVYGLRS (配列番号 11)
[0075] 参 考 例 2
免疫用抗原の作製： 上記の各ポリペプチドとサイログロブリンとの結合物を EMCS (N—（6— Maleimid ocaproyloxy)—succinimide)法により、以下のようにして作製した。なお、結合物 を作るにあたり、サイログロブリンとポリペプチドと EMCSのモル比はそれぞれ 1 : 300 : 400とした。
[0076] まず、実施例 1の各ポリペプチド 4mgを、それぞれ約 lmlの蒸留水に溶解した。一 方、 lmlの 0.01Mリン酸バッファー（ρΗ7·0)に 5mgのサイログロブリンを溶解したも のと、ジメチルホルムアミドで溶解した EMCS80mg/mlとをそれぞれ上述モル相当 量になるように混合し、サイログロブリン— EMCS複合体溶液を作成した。この複合 体溶液を 3つに分け、その各々にそれぞれのポリペプチド溶液を上述モル相当量カロ えることにより、 EMCSで架橋されたポリペプチドとサイクログロブリンとの結合物溶液 を作製した。
[0077] この結合物溶液を、 PBSを用いて透析し、結合物として 10mg/mlになるように濃 度を調製した。このようにして得られた上記の各ポリペプチドとサイログロブリンとの結 合物を免疫用抗原として以下の実施例および参考例に用いた。
[0078] 実 施 例 1
モノクローナル抗体の作製：
免疫用抗原として、実施例 2において得られたポリペプチド（a)とサイログロブリンと の結合物を用い、これを用いて BALB/cマウスを免疫化した。マウスに 4回免疫を 行った後、免疫化されたマウスの脾単球細胞と融合パートナー、 X63— Ag8— 653 をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、文献 (J. Immunol. 146 : 3721 - 3728)記載の方法によりハイプリドーマを選択した。選択は、固定化したポリペプチド (a)に反応する細胞を選択することにより行い、その結果、 39E1と 34E3というハイブ リドーマを得た。
[0079] 上記のようにして選択したハイプリドーマのそれぞれを無血清培地である GIT培地（ 和光純薬）中で細胞の 80%が死滅するまで抗体を産生させた。次いでこの培地から 遠心（l，000rpm、 15min)により細胞を取り除いた後、硫酸アンモニゥムの 50%飽 和状態にして 4°Cでー晚静置し、沈殿を遠心（l，000rpm、 30min)により回収した。 更にこの沈殿を、 2倍に希釈したバインディングバッファー（binding buffer : Protei n AM APS Ilkit製）に溶解させた後、プロテイン Aカラム（Pharmacia—Amersh am製）に通して IgGを吸着させた。その後、このカラムに PBS透析をー晚行って抗体 を精製し、ヒト OPN N— halfの C末端を含むポリペプチドを認識する抗体をそれぞれ のハイブリドーマから得た。そしてこれらの抗体を 39E1抗体および 34E3抗体と名付 けた。なお、モノクローナル抗体 34E3抗体を産生するハイブリドーマ（Human Ost eopontin Hybridoma. 34E3) ίこつレヽて (ま、平成 18年 7月 11曰付で、独立 ί亍政 法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター ( Τ 305-8566 日本国茨城県つく ば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に FERM BP— 10897として国際寄託した（平成 1 8年 7月 11日付で上記センターに国内寄託した FERM P— 20957より移管）。
[0080] 参 考 例 3
ポリクローナル抗体の作製（1)：
免疫用抗原として、実施例 2において得られたポリペプチド (b)とサイログロブリンと の結合物を用い、 1週間、または 2週間おきに結合物溶液の SO ^ UlOOmg/ml)を 投与し、ゥサギを免疫化した。抗原は初回免疫のみにフロイント完全アジュバントと混 和し、二回目力、らはフロイント不完全アジュバントと混和した。その後、全採血を行い 1 , 500rpmで 15分間の遠心により抗血清を分離し、ゥサギポリクローナル抗体（以 下、この抗体を「hOPN—l抗体」という）を得た。
[0081] 参 考 例 4
ポリクローナル抗体の作製（2)：
免疫用抗原として、実施例 2において得られたポリペプチド (c)とサイログロブリンと の結合物を用い、免疫化する動物としてマウスを用いる以外は参考例 3と同様にして マウスポリクローナル抗体（以下、この抗体を「hOPN— 5抗体」と!/、う）を得た。
[0082] 参 考 例 5
OPNの作製：
hOPNは hOPNの遺伝子（ァクセッションナンバー :】04765)をベクターである pcD NA3.1へ常法 (例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従い組み込み、更に そのベクターをチャイニーズノヽムスター卵巣（CHO)細胞にトランスフエクシヨンした。 次に、この細胞を培養した際の培養上清から抗 OPN— 1抗体カラム (株式会社免疫 生物研究所製）にて精製することにより得た。この hOPNをトロンビンを用いて 37°C、 90分処理することにより OPN N— halfを得た。更に、 mOPNおよび rOPN、更には それらを上記と同様にトロンビンで処理して mOPNおよび rOPNのそれぞれの N— h alfを得た。
[0083] 実 施 例 2
ウェスタンブロッテイングによる抗体の特異性の確認：
実施例 1で得られた 39E1抗体および 34E3抗体の特異性を確認するために、常法 (例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従いウェスタンプロッティングを行つ た。なお、ウェスタンブロッテイングには、参考例 5で作製した hOPNまたは hOPN N-half, hOPNまたは hOPN N— halfにトロンビンを加えて 37°C、 90分で処理し たもの（Thrombin ( + ) )、 hOPNまたは hOPN N— halfにトロンビンを加えず処理 したもの（Thrombin (—））を用いた。また、対照として免疫に用いたポリペプチドが 異なる参考例 3で得た hOPN— 1抗体および参考例 4で得た hOPN— 5抗体を用い て、同様にウェスタンブロッテイングを行った。これらの結果を図 1に示した。
[0084] 図 1は、 39E1抗体および 34E3抗体力 ¾ ΟΡΝには反応せず、 hOPN N— halfに のみ反応するという結果を示した。一方、 hOPN—l抗体ぉょびhOPN— 5抗体はh OPNおよび hOPN N— halfの両方に反応していた。この結果により 39E1抗体およ び 34E3抗体が OPN N— halfにのみ反応する特異的な抗体であることが示された
〇
[0085] 実 施 例 3
ウェスタンブロッテイングによる抗体の交差性の確認：
上記 39E1抗体および 34E3抗体を用いて、 mOPNおよび rOPNに対してゥエスタ ンブロットを行った結果を図 2に示す。また、対照として本出願人の国際特許出願 (W 002/081522国際公開パンフレット）に記載の以下のポリペプチド（d) (mOPNの 138番目〜 153番目に該当するアミノ酸配列にシスティン（C)を付けたものである）を 抗原として得られた抗体（以下、この抗体を「mOPN— 5抗体」という）を用い、上記と 同様にウェスタンブロットを行った。この結果も図 2に示した。
ポリペプチド（d)： CVDVPNGRGDSLAYGLR (配列番号 12) [0086] 図 2は、 39E1抗体および 34E3抗体力 ¾ OPN N— halfだけでなぐ mOPN N— halfおよび rOPN N— halfに対しても反応することを示した。このことは 39E1抗体 および 34E3抗体力 ¾ OPN N-half, mOPN N— halfおよび rOPN N— halfに 交差性を有することおよび前記抗体の認識部位が、 hOPN N-half, mOPN N — halfおよび rOPN N— halfの C末端に共通のアミノ酸配列であることを示した。
[0087] 実 施 例 4
サンドイッチ ELISA法の構築：
(l) hOPN— 1抗体と HRPとの結合物の作製
参考例 3で得られた hOPN— 1抗体と西洋わさびペルォキシダーゼ（HRP)との結 合物を以下のように作製した。必要量の HRPを蒸留水に溶解し、 NalOで酸化させ
4
た後、 pH4.4の ImM酢酸緩衝液にー晚透析した。また、 hOPN— 1抗体の 2mgも p H9.5の 0.1M炭酸緩衝液にー晚透析した。これらの透析した hOPN— 1抗体と HRP を、抗体 lmgに対して HRPが 0.4mgになるように混合し、室温で 2時間反応させた。 次いで、これに NaBHを加え氷中で 2時間反応させた後 PBSにー晚透析した。更に
4
、この反応物をゲル濾過し、 hOPN— 1抗体と HRPとの結合物（以下、これを「hOP N— 1標識抗体」とレ、う）を作製した。
[0088] (2)サンドイッチ ELISA用プレートの作製
10 g/mlの 39E1抗体あるいは 34E3抗体を 100 1ずつ 96wellの ELISA用プ レートに加え、また比較の目的で同様に hOPN— 5抗体を加えた。次いで、これを 4 °Cでー晚反応させた後、 l %BSA/PBS/NaN溶液にてブロッキングを行い、 39
3
E1抗体あるいは 34E3抗体を固相化したサンドイッチ ELISA用プレートとした。また 、上記（1)で作製した hOPN— 1抗体と HRPとの結合物を標識抗体とした。
[0089] (3)標準曲線の作製
上記（2)で作製した 96wellの ELISA用プレートと、上記（1)で作製した hOPN— 1 標識抗体を用いて、 hOPN (Thrombin (—））および hOPN N -half (Thrombin ( + ) )の測定を行った。また、コントロールとして hOPNの測定を行った。これらの結果 を図 3に示した。 39E1抗体または 34E3抗体と hOPN— 1標識抗体を用いて hOPN N— halfの測定をした場合には、それぞれ濃度依存的に良好な直線性を示した。 また、 hOPNとの交差性はそれぞれ約 0.39%であった。一方、 hOPN—5抗体と hO PN - 1標識抗体を用レ、て hOPN N - halfの測定をした場合には!/、ずれも濃度依 存的に良好な直線性を示したものの、 hOPNとの交差性が約 25%もあった。
[0090] 実 施 例 5
細胞接着阻害活性試験：
(1)マウスメラノーマ細胞接着試験
α 9および α 4インテグリンを有するマウスメラノーマ細胞株 B16— F10 (北海道大 学より供与）を用いて、以下の方法によりこの細胞に対して接着活性を持つポリぺプ チドを以下のポリペプチドを用いて検定した。まず、検定に用いたポリペプチドのうち 、 mOPNのアミノ酸配列（配列番号 4)中、 17〜32番目のアミノ酸配列に該当するポ リペプチド（mOPN— 1ペプチド）、 155〜172番目のアミノ酸配列に該当するポリぺ プチド（mOPN— 3ペプチド）、 147〜153番目のアミノ酸配列に該当するポリぺプチ ド（mOPN— 7ペプチド）、 138〜； 153番目のアミノ酸配列に該当するポリペプチド（ mOPN— 5ペプチド）、 143〜147番目のアミノ酸配列に該当するポリペプチド（GR GDSペプチド)はシンぺップ社 (Synpep Corporation)、タナ社 (TANA Laboratories ， USA)およびオースぺップ社 (Ausp印)より購入した。また、全長 OPN (Full mOP N)およびマウス OPN N— half (mOPN— N)の各タンパク質は参考例 5と同様にし て調製した。
mOPN— 1ペプチド： LPVKVTDSGSSEEKLY (配列番号 7)
mOPN— 3ペプチド： KSRSFQVSDEQYPDATDE (配列番号 13)
mOPN - 5ペプチド： VDVPNGRGDSLAYGLR (配列番号 14)
mOPN— 7ペプチド： SLAYGLR (配列番号 15)
GRGD Sペプチド： GRGD S (配列番号 16 )
[0091] 上記ポリペプチドまたはタンパク質はそれぞれ 0.1Mの炭酸緩衝液（ρΗ9·5)で 20
a g/mlの濃度に調整した後、 96wellの ELISA用プレートに 50 1/wellづっ加 えた。次いでこれを 4°Cでー晚反応させた後、 0.5%BSA/PBS/NaN溶液にて
3 ブロッキングを行い、その後 PBSで洗浄して上記ポリペプチドまたはタンパク質を固 相化した ELISA用プレートを作製した。次に、このプレートに B16— F10細胞を 0.2 5%BSA/D— MEMで 1 X 105cells/mlに調整した後、各ゥエルに 200 1ずつカロ え、これを 1時間、 37°Cでインキュベート後 0.25%BSA/D— MEMで洗浄し、プレ ートから接着していない細胞を取り除いた。そして、各ゥエルに 0.5%クリスタルバイオ レットを含む 20%メタノールを加え、 30分間染色した。全てのゥエルは、水で 3回す すぎ、接着した細胞は 20%酢酸により転溶させた。各ゥエルの上清をゥエルに接着 した細胞の相対的数を求めるために 590nmの吸収を測定し、ィムノリーダーで分析 した。これらの結果を図 4に示した。
[0092] 図 4は、 α 9および α 4インテグリンを有するマウスメラノーマ細胞株力 アミノ酸配列 GRGDSを含まないポリペプチドである mOPN— 1ペプチド、 mOPN— 3ペプチドと は殆ど接着しなレ、ことを示した。
[0093] (2)接着阻害試験
39E1抗体、 34E3抗体あるいは mOPN— 5抗体力 mOPNに含まれるポリぺプチ ド（mOPN— 5ペプチド、 mOPN— 7ペプチドおよび GRGDSペプチド）に対する細 胞の接着を阻害するかどうかを以下の方法で調べた。まず、 96穴プレートを、 4°Cで ー晚、種々の濃度の mOPN— 5、 mOPN— 7および GRGDSペプチドでプレコート し、次いで 10分間、 37°Cの条件で 0.5%BSAの PBSにより非特異的接着をブロック するための処理を行った。次に、マウスメラノーマ細胞 B16— F10を、 0.25%BSAを 含む D— MEMに懸濁させ、細胞懸濁液（細胞濃度は、 5 X 104細胞/ゥエル） 200 1を、種々の濃度の前記抗体の何れかの存在下または非存在下で、 96穴プレート に注入し、 1時間、 37°Cでインキュベートした。インキュベート後、培地をプレートから 除去し、全てのゥエルを 0.25%BSAを含む D— MEMで 2回洗浄した。接着した細 胞は固定し、 20%メタノール中の 0.5%クリスタルバイオレットで 30分間染色した。全 てのゥエルは、水で 3回すすぎ、接着した細胞は 20%酢酸により転溶させた。各ゥェ ルの上清をゥエルに接着した細胞の相対的数を求めるために 590nmの吸収を測定 し、ィムノリーダーで分析した。これらの結果を図 5に示した。
[0094] 図 5は、 39E1抗体および 34E3抗体力 マウスメラノーマ細胞株と mOPN— 5およ び mOPN— 7との接着を阻害することを示した。また、 39E1抗体および 34E3抗体 は、マウスメラノーマ細胞株と GRGDSペプチドとの接着に影響を及ぼさないことから 、 39E1抗体および 34E3抗体力 mOPNと α 4および α 9インテグリンとの接着を阻 害することが確認された。なお、図 5において GRGDSペプチドを含むポリペプチド（ d)を抗原として得られた mOPN— 5抗体が GRGDSペプチドとマウスメラノーマ細胞 株との接着を阻害してレ、なレ、のは、 mOPN— 5抗体が短!/、GRGDSペプチドを認識 しないためである。
実 施 例 6
39E1抗体および 34E3抗体を用いた精製系の構築：
39E1抗体および 34E3抗体の認識部位力 S、 OPN N— halfの C末端のアミノ酸か ら N末端側に連続したアミノ酸配列であることを示すために以下の実験を行った。 ま ず、 39E1抗体および 34E3抗体の作製に用いた hOPN— 7ペプチド内の異なる 5つ の部分を有する以下のポリペプチド（I)〜（V)をコードするポリヌクレオチドを 3 '側に 有し、 5 '側には、これらのポリペプチド（I)〜（V)を結合させたい任意のポリペプチド 配列の C末部分をコードするポリヌクレオチドを持つように設計した 5パターンのプライ マー（アンチセンスプライマー）を作製した。センスプライマーには SP6プロモーター に対するプライマーを作製した。そしてこれらのアンチセンスプライマーとセンスプライ マーを用いた PCR法で、 mRNA合成に必要なプロモーターから cDNAの 3 '端まで を合成した。更にこの PCR産物を铸型として mRNAを合成し、その mRNAから更に それぞれの塩基配列に対応したタンパク質を小麦胚芽抽出液 (セルフリーサイエンス 製）を用いた無細胞合成系で合成した。 39E1抗体および 34E3抗体と合成した各タ ンパク質およびコントロールとして hOPN N— halfを用いてウェスタンブロッテイング を行った。また、対照として本出願人らが報告している WO02/081522国際公開パ ンフレットに記載の上記ポリペプチド（c)を抗原としたモノクローナル抗体である 2K1 抗体を用いて、同様にウェスタンブロッテイングを行った。これらの結果を図 6に示し た。
ボリぺプチド （I) ： Y G L R (配列番号 1 )
ボリぺブチド （I I) ： V Y G L R (配列番号 1 7 )
ポリぺプチド （Π Ι) ： V Y G L (配列番号 1 8 )
ポリぺプチド （IV) ： S V V Y G L (配列番号 1 9 )
ポリベプチド （V) ： S V V Y G (配列番号 2 0 ) [0096] 図 6は、 39E1抗体および 34E3抗体は、抗原に用いた hOPN N— halfの C末端 のアミノ酸 Rを含み、それから N末端側に連続したアミノ酸配列からなるポリペプチド（
1)、 （II)および hOPN N— halfを認識し、 hOPN N— halfの C末端のアミノ酸 Rを 含まないポリペプチド（III)〜(V)は認識しないという結果を示した。一方、 2K1抗体 はポリペプチド（I)〜（V)の何れをも認識できず、 hOPN N— halfもほとんど認識し ないという結果を示した。これらの結果より、 39E1抗体および 34E3抗体がトロンビン 開裂された hOPN N— halfの C末端のアミノ酸 Rを認識していることを示すとともに、 ポリペプチドやタンパク質の検出 ·精製タグとして有用であることが示された。
[0097] 実 施 例 7
ELISA法による慢性関節リウマチ（RA)患者尿中の OPN N— half量 の測定：
インフォームドコンセントを得た健常者 23例および RA患者 25例について尿を採取 し、 Human Osteopontin Assay Kit (L) - IBL (株式会社免疫生物研究所製（製 品番号: 27158)および実施例 4で作製した ELISA系を用いて、全長 OPN濃度およ び OPN N— half濃度を測定した。尿サンプル中の全長 OPNおよび OPN N-ha If濃度は pM、また数値は平均土標準誤差で表した。これらの濃度を測定した結果を 表 1に示した。
[0098] [表 1]
Figure imgf000026_0001
[0099] 測定の結果、尿中全長 OPN濃度については、健常人と RA患者の間に統計的有 意差は認められなかったカ、尿中 OPN N— half濃度は、健常者が 801.5 ± 178.
4PMであったのに対し、 RA患、者力 2128·4 ±429·4ΡΜという結果となり、健常者尿 の濃度よりも有意に高値を認めた。
[0100] この結果より、本キットで測定される尿中 OPN Ν— halfの測定が慢性関節リウマ チ疾患の新しい診断マーカーとして用いられることが明ら力、となり、これにより本発明 のキットによる尿検体を利用した非侵襲的検査が可能となる。
[0101] 実 施 例 8
ELISA法による変形性関節炎（OA)および慢性関節リウマチ（RA)患者膝 関節液中の OPN N— half量の測定：
変形性関節炎（OA) 107関節の膝関節液と関節リウマチ (RA) 18関節の膝関節液 を採取し、— 80°Cで凍結保存した。 OAは Kellgren&Lawrenceの grade 1、 2に 相当する軽度 45関節、 grade 3に相当する中等度 33関節、 grade 4に相当する重 度 29関節であり、 RAは Larsen分類 grade III、 IV、 Vの重度例である。関節液を 1 0倍希釈後、実施例 4で作製した ELISAキットを用いて、 OPN N— half濃度を求め た。また、比較として Human Osteopontin Assay Kit (L) - IBL (株式会社免疫生 物研究所製 (製品番号: 27158)を用いて全長 OPN濃度も測定した。更に、 OPN N -half/OPN N— half +全長 OPN (OPN N— half量/ OPN 全量）の値も求め た。これらの結果を表 2に示した。
[0102] [表 2]
Figure imgf000027_0001
OAと RAの比較：
•全長 OPNは、有意差無し
•OPN N— halfは、 RAで高値（Ρ = 0·0001)
•OPN N— half+全長 OPNは、有意差無し
•OPN N— half/OPN
N— half +全長 OPNは、 RAで高値（ρ< 0·0001)
OAのグレード間での比較：
•全長 OPNは相関無し •OPN N— halfはグレードと正の相関有り（ρ = 0·0037、 r = 0.282)、軽度より中 等度、重度で高値 (p = 0.0363)
•OPN N-half/OPN N— half+全長 OPNは、グレードと正の相関有り（ρ = 0· 0048、r = 0.274)、軽度より中等度、重度で高値（p = 0.0189)
[0104] この結果により、関節液中の OPN N— half濃度を測定することによりあるいは OP N全量に対する OPN N— half量の比率を求めることにより、 OAと RAの鑑別および OAの重篤度の判定が可能となる。
[0105] 実 施 例 9
ウェスタンブロット法による患者膝関節液中の OPN N— half量の検出： 実施例 8で採取した患者膝関節液のうち、実施例 8の ELISA法による測定結果で OPN N— half量が高値を示した膝関節液と測定値がほとんど認められな力 た膝 関節液を用いてウェスタンブロット法により本願の OPN N— half抗体を用いて検出 した。詳しくは、これら膝関節液の 0.15mlを D— PBSにて 2倍に希釈し、これに DEA E ¾epharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech製) 20 1添ノ J口 し、室温で 30分混和した。次にこれを 1.0mlの PBSで 5回洗浄し、 0.7Mの塩化ナトリ ゥム/ PBS溶液の 0.1mlで溶出させ、更に、これに等量の 2倍のドデシル硫酸ナトリ ゥム（SDS)緩衝液と混和し、煮沸処理を行い、ウェスタンブロットのサンプルとした。 このサンプルに対し、実施例 1で得られた 34E3抗体を用いて常法 (例えば、「分子生 物学基礎実験法」、南江堂）に従いウェスタンプロッティングを行った。
[0106] 実施例 8の ELISA法で OPN N— half量が高値を示した患者膝関節液では、ゥェ スタンプロット法においてもその濃度に従って OPN N— Halfのバンドが認められた 。一方、 ELISA法では測定値がほとんど認められな力 た膝関節液では、ウェスタン ブロット法においても OPN N— Halfのバンドは認、められなかった。
[0107] 実 施 例 10
肝炎モデルマウスへの 34E3抗体投与：
C57BL/6マウスに ConAを 200ug/匹、静脈内投与し肝炎を発症させた。 Con A投与の前 3時間に、 34E3抗体またはコントロール抗体を 400ug/匹、静脈内投与 した。 ConA投与 24時間後に、血清を回収し、 ALU直を測定した。 [0108] 34E3抗体投与群は、コントロール抗体投与群と比べて有意に ALTレベルの低下 が見られた。このことから 34E3抗体は ConA投与による肝細胞の壊死を抑制できる ことが分力、つた。
産業上の利用可能性
[0109] 本発明のトロンビン開裂 OPN (OPN N— half)の C断端ペプチドを認識する抗体 は、トロンビン開裂 OPNを認識し、かつ全長 OPNを認識しないものである。そして、 これを利用した OPN N— half測定キットは、これまで市販されている OPN測定キッ トと異なり、 OPN N— halfを正確に測定することができる。
従って、本発明の測定キットは、 OPNが関連する炎症系の疾患の診断や、発症に 関するメカニズム等の研究に利用することができる。また、本抗体そのものを抗体医 薬として炎症系疾患の治療剤としても用いることができ、更には OPN N— halfその 他トロンビン開裂 OPNの C末断端を有するペプチドを精製するためのタグとして利用 すること力 Sでさる。
図面の簡単な説明
[0110] [図 1]図 1は 34E3抗体、 39E1抗体、 hOPN— 1抗体および hOPN— 5抗体を用いた ウェスタンブロッテイングを示す図面である（図中、レーン 1は hOPN、 2は hOPN T hrombin (— )、 3は hOPN Thrombin ( + )、 4は hOPN N— half、 5は hOPN N -half Thrombin (—）、 6は hOPN N— half Thrombin ( + )を示す）。
[図 2]図 2は 34E3抗体、 39E1抗体および mOPN— 5抗体を用いたウェスタンブロッ ティングを示す図面である。
[図 3]図 3は実施例 4で作製した ELIS A用プレートを用いて hOPN N- half (Thro mbin ( + ) )、 hOPN (Thrombin (一））およびコントロール（hOPN)を測定した結果 を示す図面である（図中、 Aは hOPN— 5抗体と hOPN— 1標識抗体により測定した 結果、 Bは 34E1抗体と hOPN— 1標識抗体により測定した結果および Cは 39E3抗 体と hOPN— 1標識抗体により測定した結果を示す)。
[図 4]図 4はマウス OPN由来の各種ポリペプチドの、マウスメラノーマ細胞株 B16— F 10に対する接着試験の結果を示す図面である。
[図 5]図 5はマウス OPN由来の各種ポリペプチドに対する 34E3抗体（34E3)、 39E1 抗体（39E1)および mOPN— 5抗体（M— 5)の接着阻害活性を測定した結果を示 す図面である（図中、 Aは mOPN— 5ペプチドを用いた接着阻害試験の結果、 Bは m OPN— 7ペプチドを用いた接着阻害試験の結果および Cは GRGDSペプチドを用 V、た接着阻害試験の結果を示す)。
[図 6]図 6は 34E3抗体、 39E1抗体および hOPN— 5抗体と各種ポリペプチドまたは タンパク質を用いたウェスタンブロッテイングを示す図面である（図中、レーン 1は m RNA、 2は cDNA、 3は cDNA— YGLR、 4は cDNA— VYGLR、 5は cDNA— VY GL、 6は cDNA— SVVYGL、 7は cDNA— SWYG、 8は精製 hOPN N— half)。

Claims

請求の範囲
[1] C末端のアミノ酸配列力 SYGLR (配列番号 1 )であるタンパク質またはポリペプチドを 認識し、アミノ酸配歹 IJYGLRを C末端以外に有するタンパク質またはポリペプチドを 実質的に認識しないことを特徴とするモノクローナル抗体。
[2] C末端のアミノ酸配列力 SYGLR (配列番号 1 )であるタンパク質またはポリペプチドが
、トロンビンで切断されたォステオボンチンの N末端フラグメントであり、アミノ酸配列 Y GLRを C末端以外に有するタンパク質またはポリペプチド力 S、ォステオボンチンであ る請求項 1に記載のモノクローナル抗体。
[3] トロンビンで切断されたォステオボンチンの N末端フラグメントと、 a 9インテグリンま たは α 4インテグリンとの結合を阻害するものである請求項 1または 2に記載のモノク ローナル抗体。
[4] ヒト、ブタ、サル、ノ、ムスター、ィヌ、マウスまたはラットのトロンビンで切断されたォス テオポンチンの Ν末端フラグメントを認識するものである請求項 1ないし 3の何れかに 記載のモノクローナル抗体。
[5] 請求項 1ないし 4の何れかに記載のモノクローナル抗体を含む第 1の試薬と、前記 第 1の試薬に含まれるモノクローナル抗体と認識部位が異なり、かつ、トロンビンで切 断されたォステオボンチンの Ν末端フラグメントを認識する抗体を含む第 2の試薬とを 含有することを特徴とするトロンビンで切断されたォステオボンチンの Ν末端フラグメ ントの測定キット。
[6] 関節リウマチと変形性関節炎とを鑑別するものである請求項 5に記載の測定キット。
[7] 変形性関節炎の重篤度を判定するものである請求項 5に記載の測定キット。
[8] 検体中のトロンビンで切断されたォステオボンチンの Ν末端フラグメントを、請求項 1 ないし 4の何れかに記載のモノクローナル抗体で測定することを特徴とするトロンビン で切断されたォステオボンチンの Ν末端フラグメントの測定方法。
[9] 請求項 1ないし 4の何れかに記載のモノクローナル抗体を用いて、検体中のトロンビ ンで切断されたォステオボンチンの Ν末端フラグメント量を測定し、その量を指標とし て関節リウマチを診断する方法。
[10] 検体が尿である請求項 9に記載の関節リウマチを診断する方法。
[11] 請求項 1ないし 4の何れかに記載のモノクローナル抗体を用いて、検体中のトロンビ ンで切断されたォステオボンチンの N末端フラグメント量を測定し、その量を指標とし て関節リウマチと変形性関節炎とを鑑別する方法。
[12] 更に、検体中のォステオポンチン量を測定し、トロンビンで切断されたォステオポン チンの N末端フラグメント量とォステオボンチン量に対するトロンビンで切断されたォ ステオボンチンの N末端フラグメント量の比率を指標とするものである請求項 11に記 載の関節リウマチと変形性関節炎とを鑑別する方法。
[13] 検体が関節液である請求項 11または 12に記載の関節リウマチと変形性関節炎とを 鑑別する方法。
[14] 請求項 1ないし 4の何れかに記載のモノクローナル抗体を用いて、検体中のトロンビ ンで切断されたォステオボンチンの N末端フラグメント量を測定し、その量を指標とし て変形性関節炎の重篤度を判定する方法。
[15] 更に、検体中のォステオポンチン量を測定し、トロンビンで切断されたォステオポン チンの N末端フラグメント量とォステオボンチン量に対するトロンビンで切断されたォ ステオボンチンの N末端フラグメント量の比率を指標とするものである請求項 14に記 載の変形性関節炎の重篤度を判定する方法。
[16] 検体が関節液である請求項 14または 15に記載の変形性関節炎の重篤度を判定す る方法。
[17] 請求項 1ないし 4の何れかに記載のモノクローナル抗体を有効成分とする炎症性疾 患治療剤。
[18] 炎症性疾患が、肝炎である請求項 17に記載の炎症性疾患治療剤。
[19] 肝細胞の壊死を抑制するものである請求項 18に記載の炎症性疾患治療剤。
[20] 炎症性疾患患者に、請求項 17ないし 19の何れかに記載の炎症性疾患治療剤を 投与することを特徴とする炎症性疾患の治療方法。
[21] 請求項 1ないし 4の何れかに記載のモノクローナル抗体を有効成分とする自己免疫 疾患治療剤。
[22] 自己免疫疾患が、リウマチである請求項 21に記載の自己免疫疾患治療剤。
[23] 自己免疫疾患患者に、請求項 21または 22に記載の自己免疫疾患治療剤を投与 することを特徴とする自己免疫疾患の治療方法。
[24] タグと共に発現させた目的タンパク質を、タグを認識する抗体を用いて検出 ·精製 する目的タンパク質の検出 ·精製方法において、タグとして C末端のアミノ酸配列が Y
GLR (配列番号 1)であるタンパク質またはポリペプチドを用い、タグを認識する抗体 として請求項 1ないし 4の何れかに記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とす る目的タンパク質の検出'精製方法。
[25] 目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび C末端のアミノ酸配列が YGLR ( 配列番号 1)であるタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有す る糸且換えベクター。
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