JPWO2008032712A1 - モノクローナル抗体およびその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
mOPN−1ペプチド:LPVKVTDSGSSEEKLY(配列番号7)
rOPN−1ペプチド:LPVKVAEFGSSEEKAHY(配列番号8)
Anti-Mouse Osteopontin (O-17) Rabbit IgG Affinity Purify
(製品番号:18621)
Anti-Human Osteopontin (O-17) Rabbit IgG Affinity Purify
(製品番号:18625)
Anti-Rat Osteopontin (O-17) Rabbit IgG Affinity Purify
(製品番号:18628)
抗原用ポリペプチドの入手:
抗原用ポリペプチドとして、下記のアミノ酸配列からなるポリペプチド(a)〜(c)のHPLCクロマトグラフィー精製した状態の品をシンペップ社(Synpep Corporation)、タナ社(TANA Laboratories, USA)およびオースペップ社(Auspep)より購入した。なお、ポリペプチド(a)はhOPN N−halfのC末端のアミノ酸からN末端側に連続したアミノ酸配列からなるアミノ酸配列(hOPN N−halfのアミノ酸配列の162〜168番目に該当するアミノ酸配列(以下、この配列を有するポリペプチドを「hOPN−7ペプチド」という))にシスティン(C)を付けたものである。また、ポリペプチド(b)はhOPN N−halfのアミノ酸配列の17〜31番目に該当するアミノ酸配列にシスティン(C)を付けたものである。更に、ポリペプチド(c)は全長hOPNのアミノ酸配列の153〜169番目に該当するアミノ酸配列にシスティン(C)を付けたものである。
ポリペプチド(a):CSVVYGLR(配列番号9)
ポリペプチド(b):IPVKQADSGSSEEKQC(配列番号10)
ポリペプチド(c):CVDTYDGRGDSVVYGLRS(配列番号11)
免疫用抗原の作製:
上記の各ポリペプチドとサイログロブリンとの結合物をEMCS(N−(6−Maleimidocaproyloxy)−succinimide)法により、以下のようにして作製した。なお、結合物を作るにあたり、サイログロブリンとポリペプチドとEMCSのモル比はそれぞれ1:300:400とした。
モノクローナル抗体の作製:
免疫用抗原として、実施例2において得られたポリペプチド(a)とサイログロブリンとの結合物を用い、これを用いてBALB/cマウスを免疫化した。マウスに4回免疫を行った後、免疫化されたマウスの脾単球細胞と融合パートナー、X63−Ag8−653をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、文献(J. Immunol. 146:3721−3728)記載の方法によりハイブリドーマを選択した。選択は、固定化したポリペプチド(a)に反応する細胞を選択することにより行い、その結果、39E1と34E3というハイブリドーマを得た。
ポリクローナル抗体の作製(1):
免疫用抗原として、実施例2において得られたポリペプチド(b)とサイログロブリンとの結合物を用い、1週間、または2週間おきに結合物溶液の50μl(100mg/ml)を投与し、ウサギを免疫化した。抗原は初回免疫のみにフロイント完全アジュバントと混和し、二回目からはフロイント不完全アジュバントと混和した。その後、全採血を行い1,500rpmで15分間の遠心により抗血清を分離し、ウサギポリクローナル抗体(以下、この抗体を「hOPN−1抗体」という)を得た。
ポリクローナル抗体の作製(2):
免疫用抗原として、実施例2において得られたポリペプチド(c)とサイログロブリンとの結合物を用い、免疫化する動物としてマウスを用いる以外は参考例3と同様にしてマウスポリクローナル抗体(以下、この抗体を「hOPN−5抗体」という)を得た。
OPNの作製:
hOPNはhOPNの遺伝子(アクセッションナンバー:J04765)をベクターであるpcDNA3.1へ常法(例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂)に従い組み込み、更にそのベクターをチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞にトランスフェクションした。次に、この細胞を培養した際の培養上清から抗OPN−1抗体カラム(株式会社免疫生物研究所製)にて精製することにより得た。このhOPNをトロンビンを用いて37℃、90分処理することによりOPN N−halfを得た。更に、mOPNおよびrOPN、更にはそれらを上記と同様にトロンビンで処理してmOPNおよびrOPNのそれぞれのN−halfを得た。
ウエスタンブロッティングによる抗体の特異性の確認:
実施例1で得られた39E1抗体および34E3抗体の特異性を確認するために、常法(例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂)に従いウエスタンブロッティングを行った。なお、ウエスタンブロッティングには、参考例5で作製したhOPNまたはhOPN N−half、hOPNまたはhOPN N−halfにトロンビンを加えて37℃、90分で処理したもの(Thrombin(+))、hOPNまたはhOPN N−halfにトロンビンを加えず処理したもの(Thrombin(−))を用いた。また、対照として免疫に用いたポリペプチドが異なる参考例3で得たhOPN−1抗体および参考例4で得たhOPN−5抗体を用いて、同様にウエスタンブロッティングを行った。これらの結果を図1に示した。
ウエスタンブロッティングによる抗体の交差性の確認:
上記39E1抗体および34E3抗体を用いて、mOPNおよびrOPNに対してウエスタンブロットを行った結果を図2に示す。また、対照として本出願人の国際特許出願(WO02/081522国際公開パンフレット)に記載の以下のポリペプチド(d)(mOPNの138番目〜153番目に該当するアミノ酸配列にシスティン(C)を付けたものである)を抗原として得られた抗体(以下、この抗体を「mOPN−5抗体」という)を用い、上記と同様にウエスタンブロットを行った。この結果も図2に示した。
ポリペプチド(d):CVDVPNGRGDSLAYGLR(配列番号12)
サンドイッチELISA法の構築:
(1)hOPN−1抗体とHRPとの結合物の作製
参考例3で得られたhOPN−1抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)との結合物を以下のように作製した。必要量のHRPを蒸留水に溶解し、NaIO4で酸化させた後、pH4.4の1mM酢酸緩衝液に一晩透析した。また、hOPN−1抗体の2mgもpH9.5の0.1M炭酸緩衝液に一晩透析した。これらの透析したhOPN−1抗体とHRPを、抗体1mgに対してHRPが0.4mgになるように混合し、室温で2時間反応させた。次いで、これにNaBH4を加え氷中で2時間反応させた後PBSに一晩透析した。更に、この反応物をゲル濾過し、hOPN−1抗体とHRPとの結合物(以下、これを「hOPN−1標識抗体」という)を作製した。
10μg/mlの39E1抗体あるいは34E3抗体を100μlずつ96wellのELISA用プレートに加え、また比較の目的で同様にhOPN−5抗体を加えた。次いで、これを4℃で一晩反応させた後、1%BSA/PBS/NaN3溶液にてブロッキングを行い、39E1抗体あるいは34E3抗体を固相化したサンドイッチELISA用プレートとした。また、上記(1)で作製したhOPN−1抗体とHRPとの結合物を標識抗体とした。
上記(2)で作製した96wellのELISA用プレートと、上記(1)で作製したhOPN−1標識抗体を用いて、hOPN(Thrombin(−))およびhOPN N−half(Thrombin(+))の測定を行った。また、コントロールとしてhOPNの測定を行った。これらの結果を図3に示した。39E1抗体または34E3抗体とhOPN−1標識抗体を用いてhOPN N−halfの測定をした場合には、それぞれ濃度依存的に良好な直線性を示した。また、hOPNとの交差性はそれぞれ約0.39%であった。一方、hOPN−5抗体とhOPN−1標識抗体を用いてhOPN N−halfの測定をした場合にはいずれも濃度依存的に良好な直線性を示したものの、hOPNとの交差性が約25%もあった。
細胞接着阻害活性試験:
(1)マウスメラノーマ細胞接着試験
α9およびα4インテグリンを有するマウスメラノーマ細胞株B16−F10(北海道大学より供与)を用いて、以下の方法によりこの細胞に対して接着活性を持つポリペプチドを以下のポリペプチドを用いて検定した。まず、検定に用いたポリペプチドのうち、mOPNのアミノ酸配列(配列番号4)中、17〜32番目のアミノ酸配列に該当するポリペプチド(mOPN−1ペプチド)、155〜172番目のアミノ酸配列に該当するポリペプチド(mOPN−3ペプチド)、147〜153番目のアミノ酸配列に該当するポリペプチド(mOPN−7ペプチド)、138〜153番目のアミノ酸配列に該当するポリペプチド(mOPN−5ペプチド)、143〜147番目のアミノ酸配列に該当するポリペプチド(GRGDSペプチド)はシンペップ社(Synpep Corporation)、タナ社(TANA Laboratories, USA)およびオースペップ社(Auspep)より購入した。また、全長OPN(Full mOPN)およびマウスOPN N−half(mOPN−N)の各タンパク質は参考例5と同様にして調製した。
mOPN−1ペプチド:LPVKVTDSGSSEEKLY(配列番号7)
mOPN−3ペプチド:KSRSFQVSDEQYPDATDE(配列番号13)
mOPN−5ペプチド:VDVPNGRGDSLAYGLR(配列番号14)
mOPN−7ペプチド:SLAYGLR(配列番号15)
GRGDSペプチド:GRGDS(配列番号16)
39E1抗体、34E3抗体あるいはmOPN−5抗体が、mOPNに含まれるポリペプチド(mOPN−5ペプチド、mOPN−7ペプチドおよびGRGDSペプチド)に対する細胞の接着を阻害するかどうかを以下の方法で調べた。まず、96穴プレートを、4℃で一晩、種々の濃度のmOPN−5、mOPN−7およびGRGDSペプチドでプレコートし、次いで10分間、37℃の条件で0.5%BSAのPBSにより非特異的接着をブロックするための処理を行った。次に、マウスメラノーマ細胞B16−F10を、0.25%BSAを含むD−MEMに懸濁させ、細胞懸濁液(細胞濃度は、5×104細胞/ウエル)200μlを、種々の濃度の前記抗体の何れかの存在下または非存在下で、96穴プレートに注入し、1時間、37℃でインキュベートした。インキュベート後、培地をプレートから除去し、全てのウエルを0.25%BSAを含むD−MEMで2回洗浄した。接着した細胞は固定し、20%メタノール中の0.5%クリスタルバイオレットで30分間染色した。全てのウエルは、水で3回すすぎ、接着した細胞は20%酢酸により転溶させた。各ウエルの上清をウエルに接着した細胞の相対的数を求めるために590nmの吸収を測定し、イムノリーダーで分析した。これらの結果を図5に示した。
39E1抗体および34E3抗体を用いた精製系の構築:
39E1抗体および34E3抗体の認識部位が、OPN N−halfのC末端のアミノ酸からN末端側に連続したアミノ酸配列であることを示すために以下の実験を行った。 まず、39E1抗体および34E3抗体の作製に用いたhOPN−7ペプチド内の異なる5つの部分を有する以下のポリペプチド(I)〜(V)をコードするポリヌクレオチドを3’側に有し、5‘側には、これらのポリペプチド(I)〜(V)を結合させたい任意のポリペプチド配列のC末部分をコードするポリヌクレオチドを持つように設計した5パターンのプライマー(アンチセンスプライマ―)を作製した。センスプライマ―にはSP6プロモーターに対するプライマ―を作製した。そしてこれらのアンチセンスプライマ―とセンスプライマ―を用いたPCR法で、mRNA合成に必要なプロモーターからcDNAの3’端までを合成した。更にこのPCR産物を鋳型としてmRNAを合成し、そのmRNAから更にそれぞれの塩基配列に対応したタンパク質を小麦胚芽抽出液(セルフリーサイエンス製)を用いた無細胞合成系で合成した。39E1抗体および34E3抗体と合成した各タンパク質およびコントロールとしてhOPN N−halfを用いてウエスタンブロッティングを行った。また、対照として本出願人らが報告しているWO02/081522国際公開パンフレットに記載の上記ポリペプチド(c)を抗原としたモノクローナル抗体である2K1抗体を用いて、同様にウエスタンブロッティングを行った。これらの結果を図6に示した。
ELISA法による慢性関節リウマチ(RA)患者尿中のOPN N−half量
の測定:
インフォームドコンセントを得た健常者23例およびRA患者25例について尿を採取し、Human Osteopontin Assay Kit (L) - IBL(株式会社免疫生物研究所製(製品番号:27158)および実施例4で作製したELISA系を用いて、全長OPN濃度およびOPN N−half濃度を測定した。尿サンプル中の全長OPNおよびOPN N−half濃度はpM、また数値は平均±標準誤差で表した。これらの濃度を測定した結果を表1に示した。
ELISA法による変形性関節炎(OA)および慢性関節リウマチ(RA)患者膝
関節液中のOPN N−half量の測定:
変形性関節炎(OA)107関節の膝関節液と関節リウマチ(RA)18関節の膝関節液を採取し、−80℃で凍結保存した。OAはKellgren&Lawrenceのgrade 1、2に相当する軽度45関節、grade 3に相当する中等度33関節、grade 4に相当する重度29関節であり、RAはLarsen分類grade III、IV、Vの重度例である。関節液を10倍希釈後、実施例4で作製したELISAキットを用いて、OPN N−half濃度を求めた。また、比較としてHuman Osteopontin Assay Kit (L) - IBL(株式会社免疫生物研究所製(製品番号:27158)を用いて全長OPN濃度も測定した。更に、OPN N−half/OPN N−half+全長OPN(OPN N−half量/OPN 全量)の値も求めた。これらの結果を表2に示した。
・全長OPNは、有意差無し
・OPN N−halfは、RAで高値(P=0.0001)
・OPN N−half+全長OPNは、有意差無し
・OPN N−half/OPN
N−half+全長OPNは、RAで高値(p<0.0001)
OAのグレード間での比較:
・全長OPNは相関無し
・OPN N−halfはグレードと正の相関有り(p=0.0037、r=0.282)、軽度より中等度、重度で高値(p=0.0363)
・OPN N−half/OPN N−half+全長OPNは、グレードと正の相関有り(p=0.0048、r=0.274)、軽度より中等度、重度で高値(p=0.0189)
ウエスタンブロット法による患者膝関節液中のOPN N−half量の検出:
実施例8で採取した患者膝関節液のうち、実施例8のELISA法による測定結果でOPN N−half量が高値を示した膝関節液と測定値がほとんど認められなかった膝関節液を用いてウエスタンブロット法により本願のOPN N−half抗体を用いて検出した。詳しくは、これら膝関節液の0.15mlをD−PBSにて2倍に希釈し、これにDEAE Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech製)を20μl添加し、室温で30分混和した。次にこれを1.0mlのPBSで5回洗浄し、0.7Mの塩化ナトリウム/PBS溶液の0.1mlで溶出させ、更に、これに等量の2倍のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)緩衝液と混和し、煮沸処理を行い、ウエスタンブロットのサンプルとした。このサンプルに対し、実施例1で得られた34E3抗体を用いて常法(例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂)に従いウエスタンブロッティングを行った。
肝炎モデルマウスへの34E3抗体投与:
C57BL/6マウスにConAを200ug/匹、静脈内投与し肝炎を発症させた。ConA投与の前3時間に、34E3抗体またはコントロール抗体を400ug/匹、静脈内投与した。ConA投与24時間後に、血清を回収し、ALT値を測定した。
従って、本発明の測定キットは、OPNが関連する炎症系の疾患の診断や、発症に関するメカニズム等の研究に利用することができる。また、本抗体そのものを抗体医薬として炎症系疾患の治療剤としても用いることができ、更にはOPN N−halfその他トロンビン開裂OPNのC末断端を有するペプチドを精製するためのタグとして利用することができる。
Claims (25)
- C末端のアミノ酸配列がYGLR(配列番号1)であるタンパク質またはポリペプチドを認識し、アミノ酸配列YGLRをC末端以外に有するタンパク質またはポリペプチドを実質的に認識しないことを特徴とするモノクローナル抗体。
- C末端のアミノ酸配列がYGLR(配列番号1)であるタンパク質またはポリペプチドが、トロンビンで切断されたオステオポンチンのN末端フラグメントであり、アミノ酸配列YGLRをC末端以外に有するタンパク質またはポリペプチドが、オステオポンチンである請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- トロンビンで切断されたオステオポンチンのN末端フラグメントと、α9インテグリンまたはα4インテグリンとの結合を阻害するものである請求項1または2に記載のモノクローナル抗体。
- ヒト、ブタ、サル、ハムスター、イヌ、マウスまたはラットのトロンビンで切断されたオステオポンチンのN末端フラグメントを認識するものである請求項1ないし3の何れかに記載のモノクローナル抗体。
- 請求項1ないし4の何れかに記載のモノクローナル抗体を含む第1の試薬と、前記第1の試薬に含まれるモノクローナル抗体と認識部位が異なり、かつ、トロンビンで切断されたオステオポンチンのN末端フラグメントを認識する抗体を含む第2の試薬とを含有することを特徴とするトロンビンで切断されたオステオポンチンのN末端フラグメントの測定キット。
- 関節リウマチと変形性関節炎とを鑑別するものである請求項5に記載の測定キット。
- 変形性関節炎の重篤度を判定するものである請求項5に記載の測定キット。
- 検体中のトロンビンで切断されたオステオポンチンのN末端フラグメントを、請求項1ないし4の何れかに記載のモノクローナル抗体で測定することを特徴とするトロンビンで切断されたオステオポンチンのN末端フラグメントの測定方法。
- 請求項1ないし4の何れかに記載のモノクローナル抗体を用いて、検体中のトロンビンで切断されたオステオポンチンのN末端フラグメント量を測定し、その量を指標として関節リウマチを診断する方法。
- 検体が尿である請求項9に記載の関節リウマチを診断する方法。
- 請求項1ないし4の何れかに記載のモノクローナル抗体を用いて、検体中のトロンビンで切断されたオステオポンチンのN末端フラグメント量を測定し、その量を指標として関節リウマチと変形性関節炎とを鑑別する方法。
- 更に、検体中のオステオポンチン量を測定し、トロンビンで切断されたオステオポンチンのN末端フラグメント量とオステオポンチン量に対するトロンビンで切断されたオステオポンチンのN末端フラグメント量の比率を指標とするものである請求項11に記載の関節リウマチと変形性関節炎とを鑑別する方法。
- 検体が関節液である請求項11または12に記載の関節リウマチと変形性関節炎とを鑑別する方法。
- 請求項1ないし4の何れかに記載のモノクローナル抗体を用いて、検体中のトロンビンで切断されたオステオポンチンのN末端フラグメント量を測定し、その量を指標として変形性関節炎の重篤度を判定する方法。
- 更に、検体中のオステオポンチン量を測定し、トロンビンで切断されたオステオポンチンのN末端フラグメント量とオステオポンチン量に対するトロンビンで切断されたオステオポンチンのN末端フラグメント量の比率を指標とするものである請求項14に記載の変形性関節炎の重篤度を判定する方法。
- 検体が関節液である請求項14または15に記載の変形性関節炎の重篤度を判定する方法。
- 請求項1ないし4の何れかに記載のモノクローナル抗体を有効成分とする炎症性疾患治療剤。
- 炎症性疾患が、肝炎である請求項17に記載の炎症性疾患治療剤。
- 肝細胞の壊死を抑制するものである請求項18に記載の炎症性疾患治療剤。
- 炎症性疾患患者に、請求項17ないし19の何れかに記載の炎症性疾患治療剤を投与することを特徴とする炎症性疾患の治療方法。
- 請求項1ないし4の何れかに記載のモノクローナル抗体を有効成分とする自己免疫疾患治療剤。
- 自己免疫疾患が、リウマチである請求項21に記載の自己免疫疾患治療剤。
- 自己免疫疾患患者に、請求項21または22に記載の自己免疫疾患治療剤を投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療方法。
- タグと共に発現させた目的タンパク質を、タグを認識する抗体を用いて検出・精製する目的タンパク質の検出・精製方法において、タグとしてC末端のアミノ酸配列がYGLR(配列番号1)であるタンパク質またはポリペプチドを用い、タグを認識する抗体として請求項1ないし4の何れかに記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする目的タンパク質の検出・精製方法。
- 目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびC末端のアミノ酸配列がYGLR(配列番号1)であるタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する組換えベクター。
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