WO2008029790A1

WO2008029790A1 - Nouvel acide nucléique

Info

Publication number: WO2008029790A1
Application number: PCT/JP2007/067187
Authority: WO
Inventors: Yoji Yamada; Tatsuya Miyazawa; Tetsuo Yoshida; Haruo Nakano; Kyoko Kosaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.
Priority date: 2006-09-04
Filing date: 2007-09-04
Publication date: 2008-03-13
Also published as: EP2077326A4; US20110021600A1; JPWO2008029790A1; EP2077326A1; EP2374884A3; EP2374884A2

Description

明細書

新規核酸

技術分野

[0001] 本発明は、新規核酸、ならびに、該核酸を発現または抑制させる方法、該核酸を有する分子を含有する診断薬または治療薬に関する。

背景技術

[0002] マイクロ RNA(miRNA)は、蛋白質に翻訳されない約 22ヌクレオチドの小さな非コード一本鎖 RNAであり、ヒトを含む生物に多数存在することが確認されている（非特許文献 1、 2)。

マイクロ RNAは、単一又はクラスター化されたマイクロ RNA前駆体に転写される遺伝子から生成される。すなわち、まず、遺伝子から一次転写産物である primary-microR NA (pri-miRNA)が転写され、次いで、 pri-miRNAから成熟型マイクロ RNAへの段階的プロセシングにお!/、て、 pri-miRNAから特徴的なヘアピン構造を有する約 70塩基の pr ecursor-microRNA (pre-miRNA)が生成される。さらに、 Dicer介在によるプロセシングにより pre-miRNAから成熟型マイクロ RNAが生成される（非特許文献 3)。

[0003] 成熟型マイクロ RNAは、標的となる mRNAに相補的に結合して mRNAの翻訳を抑制する、あるいは mRNAを分解することにより、遺伝子発現の転写後制御に関与していると考えられている。 2006年 5月現在、マイクロ RNAのデータベース miRBase (http：〃 microrna.sanger.ac.uk/)には、ヒトで 455種、全生物種で 3685種のマイクロ RNAが登録されている。ヒトを含む哺乳類で発現するマイクロ RNAの中で、その生理的機能に関してわかっているものは、血球系分化に関与する miR-181 (非特許文献 4)やインシュリン分泌に関与する miR-375 (非特許文献 5)など一部のみであり、多くはその生理的活性が未解明である。ただし、線虫やショウジヨウバエを用いた研究からマイクロ R NAが生物の発生、分化に様々な重要な役割を果たしていることが明らかとなってきており、ヒト疾患との関係においても特に癌との深い関係を示唆する報告が出てきている (非特許文献 6)。

[0004] マイクロ RNAの同定には、細胞から低分子 RNAクローニングする方法や、ゲノム配列情報からバイオインフォマティクスを用いる方法などがある。 miRBaseにマイクロ RN Aとして登録されるためには、発現に関する情報と生合成及び構造に関する情報の両方が必要であり、ゲノム配列情報から構造の予測だけではマイクロ RNAとして認められていない (非特許文献 7)。

[0005] 間葉系幹細胞は、哺乳類の骨髄、脂肪組織、臍帯血等に存在し、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞等に分化する多能性の幹細胞として知られている。間葉系幹細胞は、その分化多能性の故に、骨、軟骨、腱、筋肉、脂肪、歯周組織など、多くの組織の再生医療のための移植材料として注目されて!/、る（非特許文献 8)。

間葉系幹細胞は、薬剤やサイト力イン等の添加により iiudtmで特定の細胞へ分化させること力 sでき、例えば、脂肪細胞へは 1-メチル -3-イソブチルキサンチン、デキサメタゾン、インスリンおよびインドメタシンを作用させることにより、骨芽細胞へはデキサメタゾン、 β—グリセロールフォスフェイト、およびァスコルビン酸を作用させることにより誘導できる（非特許文献 9)。しかし、これらの分化の過程における分子的なメカニズムに関しての詳細は不明である。遺伝子ノックアウトマウスや分化段階での遺伝子発現解析の結果から、脂肪細胞へは PPAR yおよび C/EBPファミリ一力 S、骨芽細胞分化時には Cbfal/Runx2および Osterkなどの遺伝子発現が関与していることが知られている（非特許文献 10)が、これらの遺伝子群のみで間葉系幹細胞からの分化メカ二ズムを説明することはできず、人為的に分化及び増殖を制御するには至っていない。また、間葉系幹細胞の分化及び増殖に作用するマイクロ RNAは知られていない。

[0006] 肥満細胞は各種刺激により活性化され、脱顆粒を起こし、数多くの炎症性メデイエ一ターを遊離、産生することが知られている（非特許文献 11〜； 13)。例えば肥満細胞に抗原が認識されると、脱顆粒によりヒスタミンやトリプターゼが速やかに放出されると共に、プロスタグランジン D2 (PGD2)、ロイコトリェン (LT)、血小板活性化因子（PAF) などのケミカルメディエーター、およびマクロファージ炎症性蛋白質（ΜΙΡ) -Ι α等の各種のケモカインや顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF)等の各種サイト力インが新たに合成され、放出されることが知られている。また、これまで好酸球が作ると考えられていた細胞障害性蛋白質である主要塩基性蛋白質（major basic prot ein)に関しても、ヒトの場合は肥満細胞が多量につくることが最近明らかになつている (非特許文献 14)。

[0007] このように、肥満細胞は種々のアレルギー疾患の病態形成において主要な役割を演じていると考えられること力、ら、肥満細胞の機能を制御することにより、アレルギー疾患の治療が可能であると考えられる。

しかしな力、げっ歯類肥満細胞とヒト肥満細胞では、薬剤への反応性が異なることが知られている（非特許文献 12)。具体的には、炎症性メディエーター遊離抑制薬として使用されているクロモグリク酸ナトリウムは、ラット腹腔肥満細胞においては IgE依存性の炎症性メディエーター遊離を顕著に抑制するが、ヒト肥満細胞に対する作用は強いものではない（非特許文献 15)。塩酸ァゼラスチンは、高濃度においてはヒト培養肥満細胞からのヒスタミン、 PGD2、 LTの遊離、 GM- CSFおよび MIP-1 aの産生を抑制する力いずれの活性も強いものではない。また、抗サイト力イン薬として使用されているトシル酸スブラタストは、ラット月巴満細胞に対して炎症性メディエーター遊離抑制作用を示した力、ヒト月巴満細胞に対する作用はない（非特許文献 15)。

[0008] また、ヒト肥満細胞とマウス肥満細胞で発現する遺伝子について比較された結果、各種刺激により発現する遺伝子が必ずしも一致しないことが知られている（非特許文献 16)。

マイクロ RNAについては、マウス骨髄由来肥満細胞で発現するマイクロ RNAは報告されているが（非特許文献 17)、マイクロ RNAと肥満細胞の機能との関係は知られていない。ヒト肥満細胞で発現するマイクロ RNAについては報告されておらず、上記のようなヒトとマウス間の種差を考慮すると、マウス肥満細胞のマイクロ RNAの発現情報をもとに、ヒト肥満細胞のマイクロ RNAの発現情報を予測することは困難である。

[0009] マイクロ RNAは様々な遺伝子の発現制御に関与することから、マイクロ RNAの異常はヒトの種々の疾患に関与していることが予想される。特に癌においては研究が進展しており、多くの癌においてマイクロ RNAの発現が正常組織と異なっていること、マイクロ RNAの発現プロファイル解析により癌の分類が可能であることなどが報告されている（非特許文献 18)。また、これまでに見出されたヒトのマイクロ RNAの約半数が、ヒト癌で知られている染色体異常あるいは染色体の脆弱部位に存在することも知られている（非特許文献 19)。今までに報告されている癌とマイクロ RNAの関係の例としては、 B細胞慢性リンパ性白血病（B-CLL)で欠失が見られる染色体 13ql4に miR_15a/ miR-16クラスターが含まれ、その欠失が B-CLLの原因の一つになっていると予測されること（非特許文献 20)、肺癌ではマイクロ RNAの一つである Let-7の発現が低下しており、その標的の一つが癌原遺伝子として知られる Rasであること（非特許文献 21、 22)などがある。多くのマイクロ RNAは癌細胞で発現が低下している力逆に癌で遺伝子増幅や過剰発現が見られるマイクロ RNAもある。例えば、悪性リンパ腫で遺伝子増幅が見られる領域には 6種のマイクロ RNAからなるクラスター（miR-17-92)が存在し、この miRNAクラスター遺伝子をヒト B細胞リンパ腫のモデルマウスに強制発現させるとリンパ腫の発生が促進されることが報告されている（非特許文献 23)。また、以前からホジキンリンパ腫で過剰発現する蛋白質をコードしない癌遺伝子候補とされていた BICと呼ばれる遺伝子は、 miR-155をコードしていることも明らかとなっている（非特許文献 24)。

このように癌とマイクロ RNAの関係は近年多数報告されている力その殆どは癌細胞での発現異常を示すものであり、マイクロ RNAの機能を示した研究は、 Let-7を肺癌細胞株に強制発現させることで癌細胞株の増殖を阻害したという報告 (非特許文献 25)など、わずかしかない。体外からマイクロ RNAあるいはその前駆体、あるいはそのアンチセンスオリゴを投与してマイクロ RNAの発現を増大あるいは減少させることで、動物モデルで癌の増殖を抑制させたと!/、う報告は現在のところ存在しな!/、。

非特許文献 1 : Science, 294， 853-858 (2001)

非特許文献 2 : Cell, 113， 673-676 (2003)

非特許文献 3： Nature Reviews Genetics, 5， 522-531 (2004)

非特許文献 4 : Science, 303， 83-86 (2004)

非特許文献 5 : Nature, 432， 226-230 (2004)

非特許文献 6： Nature Reviews Cancer, 6， 259-269 (2006)

非特許文献 7 : RNA, 9， 277-279 (2003)

非特許文献 8 :「遺伝子医学」、 2000年、 4巻、 p. 58 - 61

非特許文献 9 : Science, 284， 143-147 (1999)

非特許文献 10 :「実験医学」、 2002年、 20巻、 p. 2459 - 2464 非特許文献 11 :黒沢元博編，「肥満細胞の臨床」，先端医学社， pl42 (2001) 非特許文献 12 :黒沢元博編，「肥満細胞の臨床」，先端医学社， p559 (2001) 非特許文献 13 : Crit. Rev. Immunol. , 22， 115-140 (2002)

非特許文献 14 : Blood, 98， 1127-1134 (2001)

非特許文献 15 : Clin. Exp. Allergy, 28， 1228-1236 (1998)

非特許文献 16 : Blood, 100， 3861-3868 (2002)

非特許文献 17 : Genome Biology, 6， R71 (2005)

非特許文献 18 : Nature, 435, 839-843 (2005)

非特許文献 19 : Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 101， 2999-3004 (2004)

非特許文献 20 : Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 99， 15524-15529 (2002)

非特許文献 21 : Cancer Research, 64, 3753-3756，（2004)

非特許文献 22 : Cell, 120， 635-647， (2005)

非特許文献 23 : Nature, 435， 823-833 (2005)

非特許文献 24 : Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 102， 3627-3632 (2005)

非特許文献 25 : Cancer Research, 64, 3753-3756，（2004)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0011] ヒトの種々の臓器で発現しているマイクロ RNAを同定し、その機能を解析して疾患との関係を解明することにより、新しい治療薬及び診断薬が開発されることが期待され間葉系幹細胞で作用しているマイクロ RNAを見出すことは、間葉系幹細胞における分化及び増殖の機能解明につながり、間葉系幹細胞から特定の細胞への分化制御法の開発および分化制御を利用した新しい治療法につながると期待できる。

[0012] また、肥満細胞で作用しているマイクロ RNAを見出すことは、肥満細胞における分化や脱顆粒、炎症性メディエーター産生、サイト力イン産生、ケモカイン産生等の機能解明につながり、これらの制御法の開発および新しいアレルギー疾患等の治療に貢献することが期待される。

さらに、癌細胞の増殖または抑制を引き起こすマイクロ RNAを見出すことは、発癌のメカニズムの理解に役立つのみならず、ヒトの癌の診断薬や治療薬の開発、さらにはそれらを利用した癌の新しい診断法や治療法につながることが期待される。さらに癌以外の疾患に関しても、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎、自己免疫疾患など細胞の異常増殖、組織の過形成等が原因となっている疾患の診断薬 ·治療薬やそれらを利用した診断法 ·治療法の開発に貢献することが期待される。

本発明の目的は、マイクロ RNA群を取得し、間葉系幹細胞の分化及び増殖の制御、肥満細胞の分化 ·脱顆粒 ·炎症性メディエーター産生 ·サイト力イン産生 ·ケモカイン産生等の制御及びアレルギー疾患の治療、癌細胞の分化や増殖の制御、癌等の疾患の診断'治療に有用な核酸及び、それらの利用法を提供することにある。

課題を解決するための手段

本発明は以下の（1)〜（40)に関する。

(1)配列番号 1〜29および 78〜80のいずれかで表される塩基配列と 90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸。

(2)配列番号 1〜29および 78〜80のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダィズする核酸。

(3)配列番号 1〜29および 78〜80のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロ RNA。

(4) (1)〜（3)の!/、ずれか 1項に記載の核酸を含むマイクロ RNA前駆体。

(5)配列番号 30〜73および 8；!〜 83のいずれかで表される塩基配列と 80%以上の同一性を有する塩基配列からなる（4)記載のマイクロ RNA前駆体。

(6)配列番号 30〜73および 8；!〜 83のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダィズする（4)または（5)記載のマイクロ RNA前駆体。

(7)配列番号 30〜73および 8；!〜 83のいずれかで表される塩基配列からなるマイク口 RNA前駆体。

(8) (1)〜（7)のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体に対して相補的な塩基配列からなる核酸。 (9) (1)〜（7)のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体と、該核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸。

(10) (1)〜（9)のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いることを特徴とするマイクロ RNAの発現を検出する方法。

(11) (1)〜（9)のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いることを特徴とするマイクロ RNAの変異を検出する方法。

(12) (1)〜（9)のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いることを特徴とする細胞を分離する方法。

(13) (1)〜（9)のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を発現するベクター。

(14) (1)〜（9)のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いることを特徴とする該核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の標的塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制する方法。

(15) (1)〜（9)のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いることを特徴とするマイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の発現または機能を促進或いは抑制させる物質をスクリーニングする方法。

(16) (1)〜（9)のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖および/または分化の異常に起因する疾患の診断薬。

(17) (1)〜（9)のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖および/または分化の異常に起因する疾患の治療薬。

(18) (1)〜（9)のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を導入した細胞。

(19) (13)に記載のベクターを導入した細胞。

(20)配列番号が 1、 17、 18、 19、 22のいずれかである、（1)〜（4)のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。

(21)配列番号が 1、 17、 18、 19、 22のいずれかである、（1)〜（4)のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒促進剤。

(22)酉己歹 IJ番号力 30、 58、 59、 60、 61、 65のいずれ力、である、（5)〜（7)のいずれ力、 1項に記載のマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。

(23)酉己歹 IJ番号力 30、 58、 59、 60、 61、 65のいずれ力、である、（5)〜（7)のいずれ力、 1項に記載のマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒促進剤。

(24)配列番号が 1、 17、 18、 19、 22のいずれかである、（1)〜（4)のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは配列番号が 30、 58 、 59、 60、 61、 65のいずれかである、（5)〜（7)のいずれか 1項に記載のマイクロ R NA前駆体に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、月巴満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。

(25)配列番号が 1、 17、 18、 19、 22のいずれかである、（1)〜（4)のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは配列番号が 30、 58 、 59、 60、 61、 65のいずれかである、（5)〜（7)のいずれか 1項に記載のマイクロ R NA前駆体に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、月巴満細胞の脱顆粒抑制剤。

(26)配列番号が 1、 17、 18、 19、 22のいずれかである、（1)〜（4)のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは配列番号が 30、 58 、 59、 60、 61、 65のいずれかである、（5)〜（7)のいずれか 1項に記載のマイクロ R NA前駆体と、該核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。

(27)配列番号が 1、 17、 18、 19、 22のいずれかである、（1)〜（4)のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは配列番号が 30、 58 、 59、 60、 61、 65のいずれかである、（5)〜（7)のいずれか 1項に記載のマイクロ R NA前駆体と、該核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒促進剤または脱顆粒抑制剤。

(28)酉己歹 IJ番号力、 4、 6、 8、 9、 10、 17、 18、 19、 20、 22のいずれ力、である、 (1) 〜（4)のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。

(29)酉己歹 IJ番号力 30、 34、 42、 43、 44、 46、 47、 48、 58、 59、 60、 61、 62、 65の V、ずれかである、（5)〜（7)の!/、ずれ力、 1項に記載のマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。

(30)酉己歹 IJ番号力、 4、 6、 8、 9、 10、 17、 18、 19、 20、 22のいずれ力、である、 (1) 〜（4)のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは酉己歹 IJ番号カ 30、 34、 42、 43、 44、 46、 47、 48、 58、 59、 60、 61、 62、 65のいずれかである、（5)〜（7)の!/、ずれ力、 1項に記載のマイクロ RNA前駆体に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。

(31)酉己歹番号カ 1、 4、 6、 8、 9、 10、 17、 18、 19、 20、 22のいずれ力、である、 (1) 〜（4)のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは酉己歹 IJ番号カ 30、 34、 42、 43、 44、 46、 47、 48、 58、 59、 60、 61、 62、 65のいずれかである、（5)〜（7)のいずれか 1項に記載のマイクロ RNA前駆体と、該核酸、マイク口 RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。

(32)疾患が癌、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎および自己免疫疾患からなる群から選ばれる疾患である（28)〜（31)の!/、ずれか 1項に記載の診断薬または治療

(33)酉己歹 IJ番号力、 4、 6、 8、 9、 10、 17、 19、 20、 22のいずれ力、である、 (1) ~ (4) のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤。

(34)酉己歹 IJ番号力 30、 34、 42、 43、 44、 46、 47、 48、 58、 59、 61、 62、 65のいずれかである、（5)〜（7)の!/、ずれ力、 1項に記載のマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤。

(35)酉己歹 IJ番号力、 4、 6、 8、 9、 10、 17、 19、 20、 22のいずれ力、である、 (1) ~ (4) のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは配歹 IJ番号カ 30、 34、 42、 43、 44、 46、 47、 48、 58、 59、 61、 62、 65のいずれ力、である、（5)〜（7)のいずれか 1項に記載のマイクロ RNA前駆体に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖促進剤。

(36)酉己歹 IJ番号力、 4、 6、 8、 9、 10、 17、 19、 20、 22のいずれ力、である、 (1) ~ (4) のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは配歹 IJ番号カ 30、 34、 42、 43、 44、 46、 47、 48、 58、 59、 61、 62、 65のいずれ力、である、（5)〜（7)のいずれ力、 1項に記載のマイクロ RNA前駆体と、該核酸、マイクロ RN Aまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と力なる二本鎖核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。

(37)配列番号が 18である、（1)〜（4)のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNA またはマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、細胞の増殖促進剤。

(38)配列番号が 60である、（5)〜（7)のいずれ力、 1項に記載のマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、細胞の増殖促進剤。

(39)配列番号が 18である、（1)〜（4)のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNA またはマイクロ RNA前駆体もしくは配列番号が 60である、（5)〜（7)の!/、ずれか 1項に記載のマイクロ RNA前駆体に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤。

(40)配列番号が 18である、（1)〜（4)のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNA またはマイクロ RNA前駆体もしくは配列番号が 60である、（5)〜（7)の!/、ずれか 1項に記載のマイクロ RNA前駆体と、該核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤。

発明の効果

[0014] 本発明により、新規核酸、該核酸を発現するベクター、該核酸を制御する物質のスクリーニング方法、該核酸の発現及び変異を検出する方法、並びに、間葉系幹細胞または肥満細胞等の異常に起因する疾患、細胞の増殖異常に起因する癌等の疾患の診断法または治療法を提供することができる。

図面の簡単な説明

[0015] [図 l]KHK_miR_001の配列番号 30で表される塩基配列の 2次構造を示す。

[図 2]hMSCおよび HeLa細胞における KHK_miR_007の相対発現量を表すグラフである。縦軸は、 hMSCの KHK_miR_007の発現量を 1とした時の相対発現量を示す。横軸の 1は hMSC、 2は Hela細胞を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0016] 本発明においてマイクロ RNAとは、細胞内に存在する 15〜26塩基長からなる一本鎖 RNAであり、かつ、該配列を含む周辺ゲノム配列がヘアピン構造を形成し得る配列を有しており、ヘアピンのいずれか片鎖から切り出され得る RNAである。マイク口 RNAは、その標的となる mRNAに相補的に結合して mRNAの分解あるいは翻訳を抑制し、遺伝子発現の転写後制御を行う。

[0017] 本発明はまた、マイクロ RNA前駆体に関する。本発明のマイクロ RNA前駆体とは、上記本発明の核酸を含む約 50〜約 200塩基長、より好ましくは約 70〜約 100塩基長の核酸であり、且つ、ヘアピン構造を形成し得る核酸である。マイクロ RNA前駆体は、 Dicerと呼ばれる蛋白質によるプロセシングを経て、マイクロ RNAが生成される。本発明の核酸としては、配列番号;!〜 29、 78〜80のいずれかで表される塩基配列と 90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸、好ましくは 95%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸をあげることができる。また、配列番号;!〜 29、 78 〜80のいずれかで表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件でハイプリダイズする核酸をあげること力できる。具体的には、配列番号;!〜 29、 78〜80のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロ RNAをあげることができる。 [0018] また本発明の核酸として以下の核酸、マイクロ RNA、マイクロ RNA前駆体と相補的な塩基配列からなる核酸があげられる。すなわち、配列番号;!〜 29、 78〜80のいずれかで表される塩基配列からなる核酸、配列番号;!〜 29、 78〜80のいずれかで表される塩基配列と 90%以上、好ましくは 95%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸、配列番号;!〜 29、 78〜80のいずれかで表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件でハイブリダィズする核酸、これらの核酸を含むマイクロ RNA、配列番号 30〜73、 8；!〜 83のいずれかで表される塩基配列と 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上の同一性を有する塩基配列からなるマイクロ RN A前駆体、配列番号 30〜73、 8；!〜 83のいずれかで表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件でハイブリダィズするマイクロ RNA前駆体、配列番号 30〜7 3、 8；!〜 83のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロ RNA前駆体と相補的な塩基配列からなる核酸があげられる。

[0019] また本発明の核酸として以下の核酸、マイクロ RNA、マイクロ RNA前駆体と、該核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列に対して相補的な塩基配歹 IJからなる核酸とからなる二本鎖核酸があげられる。すなわち、配列番号;!〜 29、 78 〜80のいずれかで表される塩基配列からなる核酸、該塩基配列と 90%以上、好ましくは 95%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸、配列番号;!〜 29、 78-80 のいずれかで表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件でハイブリダィズする核酸、これらの核酸を含むマイクロ RNA、配列番号 30〜73、 8；!〜 83のいずれかで表される塩基配列と 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上の同一性を有する塩基配列からなるマイクロ RNA前駆体、配列番号 30〜73、 81 〜83のいずれかで表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件でハイプリダイズするマイクロ RNA前駆体、配列番号 30〜73、 8；!〜 83のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロ RNA前駆体と、該核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA 前駆体の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸があげられる。

[0020] 本発明のマイクロ RNAの前駆体としては、配列番号 30〜73、 8；!〜 83のいずれ力、で表される塩基配列と 80%以上の同一性を有する塩基配列からなるマイクロ RNA 前駆体、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上の同一性を有する塩基配列力、らなるマイクロ RNA前駆体をあげることができる。また、配列番号 30〜73、 8；!〜 8 3のいずれかで表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件でハイブリダィズするマイクロ RNA前駆体をあげることができる。具体的には、配列番号 30〜73、 8 ；!〜 83のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロ RNA前駆体をあげることができる。

[0021] また本発明のマイクロ RNA前駆体として、配列番号;!〜 29、 78〜80のいずれかで表される塩基配列と 90%以上、好ましくは 95%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸を含むマイクロ RNA前駆体、配列番号;!〜 29、 78〜80のいずれかで表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件でハイブリダィズする核酸を含むマイクロ RNA前駆体、配列番号;!〜 29、 78〜80のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロ RNAを含むマイクロ RNA前駆体があげられる。

[0022] 本発明にお!/、て、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸、マイクロ RN Aまたはマイクロ RNA前駆体とは、例えば配列番号 1〜73、 78〜83のいずれかで表される塩基配列を有する核酸またはその一部の断片をプローブとして、 20xSSC 7. 5 mL、 1M Na HPO (pH7.2) 0.6 mL、 10% SDS 21 mL、 50xDenhardt's solution 0.6 mL

2 4

、 10 mg/mL sonicated salmon sperm DNA 0.3 mL力、らなる Hybridization bufferに、 y -³²P-ATPで標識したプローブ RNAを加え、 50 °Cでー晚反応させた後、 50 °Cで 10分間、 5xSSC/5%SDS液で洗浄し、更に 50°Cで 10分間、 lxSSC/l%SDS液で洗浄し、その後メンブレンを取り出し、 X線フィルムに感光させることにより同定できる核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体をあげることができる。

[0023] 本発明において、核酸とはヌクレオチドおよび該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなるものでもよぐ例えば、リボヌクレオチドの重合体である RNA、デォキシリボヌクレオチドの重合体である DNA、 RNAおよび DNAが混合した重合体、および、ヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド重合体をあげることができ、さらに、核酸誘導体を含むヌクレオチド重合体であってもよぐ一本鎖核酸または二本鎖核酸であってもよレ、。

[0024] 本発明にお!/、て、ヌクレオチド類似体とは、 RNAまたは DNAに比べ、ヌクレアーゼ耐性を向上または、安定化させるため、相補鎖核酸とのァフィ二ティーをあげるため、あるいは細胞透過性をあげるため、あるいは可視化させるために、リボヌクレオチド、デォキシリボヌクレオチド、 RNAまたは DNAに修飾を施した分子であれば!/、かなる分子でもよく、天然に存在する分子でも非天然の分子でもよぐ例えば、糖部修飾ヌクレオチド類似体やリン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体等があげられる。

[0025] 糖部修飾ヌクレオチド類似体とは、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学構造物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、 2 ' 0—メチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、 2 '— 0 プロピルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、 2，ーメトキシエトキシリボースで置換されたヌクレオチド類似体、 2 '— 0—メトキシェチルリボースで置換されたヌクレォチド類似体、 2 '— 0— [2—（グァニジゥム）ェチル]リボースで置換されたヌクレオチド類似体、 2 ' 0—フルォロリボースで置換されたヌクレオチド類似体、糖部に架橋構造を導入することにより 2つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸 (Bridged Nu oleic Acid) (BNA)、より具体的には、 2 '位の酸素原子と 4 '位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸 (Locked Nucleic Acid) (LNA)、およびエチレン架橋構造型人工核酸（Ethylene bridged nucleic acid) (ENA) [Nucleic Acid Researc h， 32， el75 (2004)]があげられ、さらにペプチド核酸（PNA) [Acc. Chem. Res., 32， 62 4 (1999)]、ォキシペプチド核酸（OPNA) . Am. Chem. Soc, 123， 4653 (2001)]、およびペプチドリボ核酸（PRNA) [J. Am. Chem. Soc , 122， 6900 (2000)]等をあげることができる。

[0026] リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体とは、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学物質を付加ある!/ヽは置換したものであればいかなるものでもよぐ例えば、ホスフォロチォエート結合に置換されたヌクレオチド類似体、 Ν3'_Ρ5'ホスフォアミデート結合に置換されたヌクレオチド類似体等をあげることができる。

[0027] 本発明において、核酸誘導体とは、核酸に比べ、ヌクレアーゼ耐性を向上させるため、安定化させるため、相補鎖核酸とのァフィ二ティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、あるいは可視化させるために、該核酸に別の化学物質を付加した分子であればいかなる分子でもよぐ例えば、 5 ' ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、 Cy5 付加誘導体、 Cy3付加誘導体、 6— FAM付加誘導体、およびビォチン付加誘導体等をあげることができる。

[0028] 核酸の誘導体としては、例えば、糖の修飾体としては、 2'-0_プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 2'—メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 2 ' -0-メチルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 2 ，-0-メトキシェチルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 2，-0- [2- (グァニジゥム）ェチル]リボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 2，-0_フルォロリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができ、リン酸基の修飾体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチォエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が Ν3'_Ρ5'ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる [細胞工学， 16， 1463-1473 (1997)] [RNAi法とアンチセンス法、講談社 (2005)]。

[0029] 本発明において間葉系幹細胞とは、骨髄、脂肪組織、臍帯血、子宮内膜、真皮、骨格筋、骨膜、歯小嚢、歯根膜、歯髄、および歯胚等の間葉系組織に存在し、少なくとも骨芽細胞、脂肪細胞、および筋肉細胞等の間葉系細胞への分化能を有する細胞をいう。

本発明において肥満細胞とは、各種刺激により活性化され、脱顆粒を起こし、数多くの炎症性メディエーターを遊離、産生する細胞をいう。

[0030] 本発明の核酸、マイクロ RNAおよびマイクロ RNA前駆体を製造する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等にて製造すること力 Sできる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスフォロチォエート法、ホスホトリエステノレ法、 CEM法 [Nucleic Acid Research, 35， 3287 (2007)]等をあげることができ、例えば、 ABI3900ハイスループット核酸合成機（ァプライドバイオシステムズ社製）により合成すること力 Sできる。酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたは DNAを铸型として典型的なファージ RNAポリメラーゼ、例えば、 T7、 Τ3、または SP6RNAポリメラーゼを用いた転写をあげることができ

[0031] 本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いてマイクロ RNAの発現を検出する方法としては、検体中のマイクロ RNAあるいはマイクロ RNA前駆体の存在が検出できる方法であればいかなる方法でもよぐ例えば、（1)ノーザンハイブリダィゼーシヨン、（2)ドットブロットハイブリダィゼーシヨン、（3) in situハイブリダィゼーシヨン、（4)定量的 PCR、（5)デフアレンシャル 'ノヽイブリダィゼーシヨン、（6)マイクロアレイ、（7)リボヌクレアーゼ保護アツセィ等が挙げられる。

[0032] 本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いてマイクロ RNAの変異を検出する方法としては、検体中のマイクロ RNAあるいはまたはマイクロ RNA 前駆体の塩基配列の変異が検出できる方法であれば、いかなる方法でもよぐ例えば、非変異型塩基配列を有する核酸と変異型塩基配列を有する核酸とのハイブリダィズにより形成されるへテロ二本鎖を検出する方法や、あるいは、検体由来の塩基配歹 IJを直接、配列決定して変異の有無を検出する方法等をあげることができる。

[0033] 本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いて細胞を分離する方法としては、種々の細胞の混合物より、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイク口 RNA前駆体を発現する細胞を分離できる方法であれば!/、かなる方法でもよく、例えば、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列と相補的な配列を有する核酸に蛍光標識したプローブを細胞に導入し、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体と該プローブとハイブリダィゼーシヨンさせ、標識プローブとハイブリダィゼーシヨンした細胞のみを、ソーティング機能を有したフロ一サイトメーターで分離する方法等をあげることができる。

[0034] 本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を発現するベクターとは、細胞内に導入して転写されることにより本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ R NA前駆体が生合成されるように設計されたベクターをいい、細胞内で本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を転写することができるプロモーターを有して!/、れば!/、かなるベクターでもよ!/、。具体的には、 cDNA6.2-GW/miR (Invitrogen 社製）、 pSilencer 4.1- CMV(Ambion社製）、 pSINsi-hHl DNA (タカラバイオ社製）、 pS INsi-hU6 DNA (タカラバイオ社製）、 pENTR/U6 (Invitrogen社製）等をあげることができる。

[0035] 本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の標的塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制する方法とは、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RN A前駆体を用いて、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の標的塩基配列を有する mRNAの発現を抑制する活性を利用して、該標的塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制する方法であれば、いかなる方法でもよい。なお、ここで、発現を抑制するとは、 mRNAの翻訳を抑制する場合、および mRNAを切断あるいは分解することによって、結果として mRNAから翻訳される蛋白質の量を減少させる場合も含む。

[0036] 標的塩基配列とは、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体によつて認識される数塩基からなる核酸の塩基配列を!/、う。該塩基配列を有する mRNAの翻訳は本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体により抑制される。マイクロ RNAの 5'末端側 2〜8番目の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する mRNAは、該マイクロ RNAによって翻訳が抑制される [Current Biology, 15， R458-R4 60 (2005)]ので、本発明の核酸、マイクロ RNAの 5'末端側 2〜8番目と相補的な塩基配列を該核酸、マイクロ RNAの標的塩基配列としてあげることができる。例えば、マイク口 RNAの 5'末端側 2〜8番目の塩基配列に対して相補的な標的配列を用意し、ヒト mRNAの 3'UTR塩基配列群に対して、完全一致配列を含有する mRNAを、文字列探索などの方法で選抜することで決定することができる。ヒト mRNAの 3'UTR塩基配列 ¾ ίュ、「UCSし Human Genome Browser ateway (http://genome.ucsc.edu/ cgi_bm/ hgGateway)」より取得できるゲノム配列および遺伝子位置情報を用いて作製することができる。本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の標的塩基配列を有した遺伝子の具体的な例としては、米国国立バイオテクノロジー情報センター Na tional Center for Biotechnology Informat請 (NCi3I)の treGeneァータペース (http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)で使われて!/、る名前（Official Symbol)で表記された表 1— 14に記載の遺伝子をあげることができる。なお、表 2— 14は表 1の続きを示している。 [0037] [表 1]

[0038] [表 2]

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[0052] 本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分とする医薬は、間葉系幹細胞の増殖および/または分化の異常に起因する疾患の診断または治療に用いることができる。

間葉系幹細胞の増殖および/または分化の異常に起因する疾患としては、具体的には、癌及び、骨形成不全症、軟骨形成不全症、糖尿病等をあげることができる。

[0053] また本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分とする医薬は、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断または治療に用いることができる。肥満細胞の異常としては、脱顆粒の異常があげられるため、本発明の核酸、マイクロ R NAまたはマイクロ RNA前駆体は、肥満細胞の脱顆粒促進剤または脱顆粒抑制剤として用いることあでさる。

肥満細胞の異常に起因する疾患としては、具体的には、アトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、及びアレルギー疾患等をあげることができる。

[0054] さらに本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分とする医薬は、細胞の増殖などの異常や、組織の過形成等が原因となっている疾患の診断または治療に用いることができる。また本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ R NA前駆体は、細胞の増殖抑制剤もしくは増殖促進剤として用いることもできる。ここで細胞の増殖の異常とは、生体内における通常の増殖速度ではない速度で細胞が増殖している状態をいう。

[0055] 細胞の増殖異常や組織の過形成等が原因となっている疾患としては、具体的には、癌、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎、自己免疫疾患等をあげることができる。以下、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体が RNAである場合を例として、本発明を詳細に説明する。

1.聞幹細胞由のマイクロ RNAおよびマイクロ RNA前駆体の同定

(1 1)間葉系幹細胞の取得、培養

骨髄から間葉系幹細胞を取得する方法としては、安全かつ効率的に取得される方法であれば特に限定されないが、例えば S. E. Haynesworth et al. Bone, 13， 81 (199 2)に記載の方法があげられる。

[0056] 胸骨または腸骨において、骨髄穿刺を行う場所の皮膚を消毒し、特に骨膜下を十分に局所麻酔する。骨髄穿刺針の内筒を抜き、 5,000 unitsのへノリンを入れた 10 ml 注射器を装着して必要量、平均的には 10 ml〜20 mlの骨髄液を吸引する。骨髄穿刺針を取り外し、 10分間程度圧迫止血する。取得した骨髄液を 1 ,000 X gで遠心分離して骨髄細胞を回収した後、該骨髄細胞をリン酸緩衝液（phosphate-buffered saline) (P BS)で洗浄する。遠心分離'洗浄を 2回繰り返した後、骨髄細胞を 10%のゥシ胎仔血清 (FBS)を含む a -MEM ( a -modified MEM), DMEM (Dulbecco's modified MEM), IM DM (Isocove's modified Dulbecco's medium)等の細胞培養用培地に浮遊させることにより骨髄細胞液を得る。骨髄細胞液から間葉系幹細胞を単離する方法としては、骨髄細胞液中に混在する他の細胞、例えば血球系細胞、造血幹細胞、血管幹細胞、泉維芽細胞等を除去することができれば特に限定されないが、例えば M. F. Pitten ger et al. Science, 284， 143-147 (1999)に記載の方法があげられる。骨髄細胞液を密度 1.073 g/mlの Percollに重層した後、 1， 100 X gで 30分間遠心分離し、界面の細胞を間葉系幹細胞として単離することができる。また、骨髄細胞液に 10 X PBSを加えて 9 /10に希釈した Percollを同容量加えて混合した後に、 20,000 X gで 30分間遠心分離し、密度 1 ·075〜1 ·060の画分の細胞を間葉系幹細胞として単離することもできる。

[0057] また、ヒトの骨髄に由来する間葉系幹細胞は、 Cambrex社、タカラバイオ社より購入することあでさる。

臍帯から間葉系幹細胞を取得する方法としては、効率的に取得される方法であれば特に限定されないが、例えば Stem Cells, 21， 105-110 (2003)に記載の方法があげられる。臍帯静脈の両端に力ニューレを揷入し、適当な緩衝液、例えば、 EBSS(Earle' s balanced salt solution)で洗浄する。蛋白質分解酵素、例えば、 0.1%コラゲナーゼを含む 199培地に抗生物質を添加して血管に注入し、 4〜40 °C、好ましくは 37 °Cで、 1 〜60分間インキュベートする。血管を EBSSで洗浄し、臍帯を軽くマッサージした後、内皮細胞および内皮下層細胞の懸濁液を回収する。該懸濁液を 600 X gで 10分間遠心分離し、得られた細胞を、例えば、低濃度のグルコースを含む DMEM培地（DMEM - LG、 Gibco)に、 20 mM HEPES、 100 units/mlペニシリン、 100 μ g/mlストレプトマイシン、 2 mM L -グルタミン、 1 mMピルビン酸ナトリウムおよび 10% FBSを加えた培地に懸濁する。細胞密度を、 10²〜10⁶個ん m²として培養フラスコに接種し、 37 °C、 5% CO の条件下で培養する。培地を 1〜7日毎に交換し、；!〜 3週間培養を継続することにより、間葉系幹細胞を取得することができる。

[0058] 子宮内膜から間葉系幹細胞を取得する方法としては、安全かつ効率的に取得される方法であれば特に限定されないが、例えば、 Am.J.Pathol., 163， 2259-2269 (2003) に記載の方法があげられる。外科手術により摘出されたヒト子宮内膜組織を細切し、細胞を培養可能な培地、好ましくは α _ΜΕΜ、 DMEM, MDM等に 1〜20%の動物由来の血清、好ましくは 5〜10%の FBSを加えた培地で培養する。培地にはペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質を加えても良い。さらに、細胞の分離を良くするために、 3型コラゲナーゼ等のコラーゲン分解酵素およびデォキシリボヌクレアーゼ I等の DNA分解酵素を培地に添加し、 20〜40 °C、好ましくは 37 °Cの条件で、 10分間〜 5 時間、好ましくは 1時間、緩やかに振盪する。個々の子宮内膜腺を顕微鏡で観察しな力 ¾分離し、適当な培養容器、例えば 24-ゥエル培養皿を用いて 37 °C、 5% COの条件下で培養することにより、間葉系幹細胞を取得することができる。

[0059] 歯、歯胚、歯周辺組織から間葉系幹細胞を取得する方法としては、安全かつ効率的に取得される方法であれば特に限定されないが、例えば Lancet, 364， 149-155(20 04)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97， 13625-13630 (2000)に記載の方法があげられる。ヒトの歯としては、乳歯、または切歯、犬歯、小臼歯、大臼歯等の永久歯のいずれでも良い。例えば、抜歯した第三大臼歯 (親知らず）の歯根の表面から歯周靭帯 (perio dontal ligament)を慎重に分離し、コラゲナーゼ、トリプシン、プロナーゼ、エラスターゼ、デイスパーゼ、ヒアルロニダーゼ等の蛋白分解酵素を用いて、 37 °Cで 1時間消化反応を行う。ストレイナー、メッシュ、フィルタ一等を用いて、組織残渣を除くことにより間葉系幹細胞を取得することができる。また、抜歯した第三大臼歯 (親知らず）の表面を PBS等で洗浄した後、セメント質とエナメル質の結合部を切断して髄質を露出させ、歯冠および歯根から歯髄組織を慎重に分離し、上記と同様の方法で蛋白分解酵素処理した後、組織残渣を除くことにより間葉系幹細胞を取得することもできる。

[0060] また、上記以外の間葉系幹細胞単離方法として、間葉系幹細胞に発現する表面抗原、間葉系幹細胞特異的な遺伝子のプロモーターおよびェンノヽンサ一を持つレポ一ターベクターを用いて間葉系幹細胞を単離する方法があげられる。具体的には、 AC

133抗原を用いて幹細胞単離を単離する方法（US6468794)、 Sox遺伝子（US2002/01 35539)、 Nestin遺伝子または Musashi遺伝子 (特開 2002-034580)のプロモーターおよびェンハンサーを持つレポーターベクターを用いて間葉系幹細胞を単離する方法等力 fcげられる。

[0061] また、 H_0eChst33342の細胞外排出能を指標にした FACS分画法を用いてサイドポピユレーシヨン（side population) (SP)中に幹細胞を濃縮させる方法 [Journal of Experim ental Medicine, 183， 1797-806 (1996)]を用いて幹細胞を分離することもできる。また、 SH2陽性， SH4陽性， CD29陽性， CD44陽性， CD71陽性， CD90陽性， CD 106陽性， CD 120a陽性， CD124陽性， CD14陰性， CD34陰性，および CD45陰性の細胞を間葉系幹細胞として、セルソーターや磁気ビーズを用いて分離する方法 [Science, 284, 14 3-147 (1999)]を用いることもできる。

[0062] 間葉系幹細胞の培養に用いる培地としては、例えば組織培養の技術基礎編第三版、朝倉書店 (1996)等に記載された細胞培養用培地があげられるが、ゥシゃヒト等の血清を 1〜20%添加した α _ΜΕΜ、 DMEM、 IMDM等の細胞培養用培地が好ましい。培養条件は、細胞が培養可能であればいかなる条件でもよいが、培養温度は 33〜3 7 °Cが好ましぐ 5〜10%の COガスで満たしたインキュベーターで培養することが好ましい。間葉系幹細胞は、通常の組織培養用のプラスチック製培養皿に接着させて増殖させることが好ましい。細胞が培養皿一面に増殖する頃、培地を除去して、トリプシン EDTA溶液を加えることで細胞を浮遊させる。浮遊させた細胞は、 PBSまたは細胞培養用の培地で洗浄後、細胞培養用の培地で 2倍から 20倍に希釈して新し!/、培養皿に播種することで、さらに継代培養することができる。

(1 2)低分子 RNAの取得

上記の各種方法で取得した間葉系幹細胞から全 RNAを抽出し、該 RNAを用いて間葉系幹細胞で発現するマイクロ RNAを含有する低分子 RNAを以下のようにして取得すること力 Sでさる。

[0063] 低分子 RNAの取得法としては、具体的には、ジーンズアンドデベロップメント（Ge nes & Development) 15, 188-200 (2000)に記載の方法に準じて、 15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動による低分子 RNAの分離及び切り出し、 5 '末端脱リン酸化、 3 'ーァダプターライゲーシヨン、リン酸化、 5 '—アダプターライゲーシヨン、逆転写、 PCR増幅、コンカテマ一化、ベクターへのライゲーシヨンを順次経て、低分子 RNAをクローニングし、そのクローンの塩基配列を決定する方法等があげられる。あるいは、例えば、サイエンス（Science) 294, 858-862 (2001)に記載の方法に準じて、 15%ポリアクリルァミドゲル電気泳動による低分子 RNAの分離及び切り出し、 5 ' アデニル化 3 '—ァダプターライゲーシヨン、 5 ' アダプターライゲーシヨン、逆転写、 PCR増幅、コンカテマ一化、ベクターへのライゲーシヨンを順次経て、低分子 RNAをクローユングし、そのクローンの塩基配列を決定する方法等があげられる。

[0064] あるいは、 Nucleic Acids Research 34， 1765-1771 (2006)に記載の方法により、 15% ポリアクリルアミドゲル電気泳動による低分子 RNAの分離及び切り出し、 5 '末端脱リン酸化、 3 ' アダプターライゲーシヨン、リン酸化、 5 ' アダプターライゲーシヨン、逆転写、 PCR増幅、マイクロビーズベクターへのライゲーシヨンを順次経て、低分子 RNAをクローユングし、そのマイクロビーズの塩基配列を読み取ることで塩基配列を決定することにより低分子 RNAを取得すること力 Sもできる。

[0065] また、 small RNA Cloning Kit (タカラバイオ社製）を用いて低分子 RNAを取得することもできる。

(1 3)マイクロ RNAの同定

取得した低分子 RNA配列がマイクロ RNAであるかは、アールェヌエイ（RNA)，9 ， 277-279 (2003)に記載の基準に従うか否かで判定できる。例えば、上記方法で取得して塩基配列を決定した低分子 RNAの場合、以下のようにしておこなうことができる [0066] すなわち、取得した低分子 RNA塩基配列に対応する DNA配列を 5'末端側および 3 '末端側にそれぞれ 50 nt程度伸ばした周辺ゲノム配列を取得し、そのゲノム配列から転写されることが予測される RNAの 2次構造を予測する。その結果、ヘアピン構造を有し、且つ該低分子 RNAの塩基配列がヘアピンの片鎖に位置する場合、該低分子 R NAはマイクロ RNAであると判定できる。ゲノム配列は一般に公開されており、例えば、 UCSC Genome Bioinformatics (http://genome.ucsc.edu/)力、ら入手 4目である。また、 2次構造予測も様々なプログラムが公開されており、例えば、 RNAfold [Nucleic A cids Research 31， 3429—3431 (2003)]や Mfold [Nucleic Acids Research 31， 3406—341 5 (2003)]等を用いること力 Sできる。また、既存のマイクロ RNA配列は miRBase (11570 97436265.13)というデータベースに登録されており、ここに記載の配列と同一か否かで、既存のマイクロ RNAと同一か否かを判定することができる。

[0067] このようにして間葉系幹細胞から同定したマイクロ RNAとして、例えば、配列番号 1 〜29、 78〜80のいずれかで表される塩基配列を有する核酸等をあげることができる

〇

また、同定したマイクロ RNAに対応するゲノム配列と、他の生物のゲノム配列とを比較し、配列番号;!〜 29、 78〜80のいずれかで表される塩基配列と 60%以上の同一性を有する塩基配列を有する核酸、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、更に好ましくは 95%以上の同一性を有する塩基配列を有する核酸を、その生物でのマイクロ RNAとして同定すること力 Sできる。

(1 -4)マイクロ RNA前駆体の同定

上記（1 3)で同定したマイクロ RNAの塩基配列をもとに、マイクロ RNAを含むゲノム配列をマイクロ RNA前駆体として同定することができる。本発明の間葉系幹細胞由来のマイクロ RNA前駆体としては、例えば、配列番号 30〜73、 8；!〜 83のいずれかで表される塩基配列を有する核酸等をあげることができる。

[0068] 更に、同定したマイクロ RNA前駆体に対応するゲノム配列と、他生物のゲノム配列とを比較し、配列番号 30〜73、 8；!〜 83のいずれかで表される塩基配列と 60%以上の同一性を有する塩基配列を有する核酸、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90% 以上、最も好ましくは 95%以上の同一性を有する塩基配列を有する核酸を、その生物でのマイクロ RNA前駆体として同定することができる。

2.核酸の合成

上記 1のようにして一旦マイクロ RNAおよびマイクロ RNA前駆体が同定され、その塩基配列が決定された後は、塩基配列に基づいてリボヌクレオチドの重合体である R NAだけでなく、デォキシリボヌクレオチドの重合体である DNAを合成することができる。例えば、上記 1で同定した RNAの塩基配列をもとに、 DNAの塩基配列を決定することができる。 RNAの塩基配列に対応する DNAの塩基配列は、 RNAの配列に含まれる U (ゥラシル)を T (チミン）に読み替えることで一義的に決定できる。また、リボヌクレオチドとデォキシリボヌクレオチドが混合した重合体や、ヌクレオチド類似体を含む重合体も同様にして合成することができる。

[0069] 本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を合成する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等にて製造すること力 Sできる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスフォロチォエート法、ホスホトリエステノレ法、 CEM法 [Nucleic Acid Research, 35， 3287 (2007)]等をあげることができ、例えば、 ABI3900ハイスループット核酸合成機（ァプライドバイオシステムズ社製）により合成すること力 Sできる。酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたは DNAを铸型として典型的なファージ RNAポリメラーゼ、例えば、 T7、 Τ3、または SP6RNAポリメラーゼを用いた転写をあげることができ

3. マイクロ RNAおよび該マイクロ RNA前駆体の機能を検出する方法

マイクロ RNAは、ヘアピン構造を有するマイクロ RNA前駆体力細胞質内で RNase III endonucleaseの一種である Dicerと呼ばれる蛋白質によるプロセシングを経て生成され、標的塩基配列を有する mRNAの翻訳を抑制する。従って、当該機能を有しているか否かで得られた核酸がマイクロ RNAであるか否かを検出することができる。

[0070] 例えば、一本鎖 RNA力 SRNaselll endonucleaseによりプロセシングされるか否かで機能を測定すること力できる。具体的には、機能を検出したい一本鎖 RNAを RNaselll en donucleaseと反応させ、反応産物を電気泳動した際、マイクロ RNA前駆体としての機能を有していれば、プロセシングを受けた 20-25塩基長程度のバンドが検出することにより、マイクロ RNAの機能を有するかを検出することができる。 RNaselll endonuclea seは、マイクロ RNA前駆体をプロセシングする活性を有するものであれば特に限定されないが、 Dicer蛋白質を用いることが好ましい。具体的には、 si-RNAse III™ (タカラバイオ社製）、 Cold Shock- DICER (タカラバイオ社製）、 Recombinant Dicer Enzyme ( Stratagene社製)、 BLOCK— iT Dicer RNAi Transfection Kit (Invitrogen社製)、 X— tre me GENE siRNA Dicer Kit (ロシュ.アプライド 'サイエンス社製）などより入手でき、反応条件は添付の条件に従うことで実施できる。

[0071] マイクロ RNAの機能を検出する別の方法としては、標的塩基配列を有する mRNA の翻訳を抑制するか否かで機能を測定する方法をあげることができる。

マイクロ RNAは、その標的塩基配列を 3 '末端側 untranslated region (3 ' UTR)に含む mRNAの翻訳を抑制することが知られている [Current Biology, 15, R458-R460 (20 05)]。そこで、測定しょうとする一本鎖 RNAに対する標的塩基配列を、適当なレポ一ター遺伝子発現ベクターの 3 ' UTRに揷入した DNAを作製して、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入し、その細胞に一本鎖 RNAを発現させた時に、レポーター遺伝子の発現を測定することで、マイクロ RNAの機能を有して!/、るか否かを検出することができる。

[0072] レポーター遺伝子発現ベクターは、レポーター遺伝子の上流にプロモーターを有しており、宿主細胞においてレポーター遺伝子が発現できるものであればいかなるものでもよい。レポーター遺伝子としては、あらゆるレポーター遺伝子を使用することが可能であるが、例えば、ホタル 'ルシフェラーゼ遺伝子、ゥミシィタケ 'ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフエ二コール'ァセチルトランスフェラーゼ遺伝子、 /3—グルクロニダ一ゼ遺伝子、 /3—ガラクトシダーゼ遺伝子、 /3 -ラクタマーゼ遺伝子、ェクオリン遺伝子、グリーン 'フルォレツセント'プロテイン遺伝子および DsRed蛍光遺伝子などが利用できる。こうした性質を有するレポーター遺伝子発現ベクターとして、例えば、 psiCHE C -1 (Promega社製）、 psiCHECK-2 (Promega社製）、 pGL3_Control (Promega社製）、 pGL4 (Promega社製）、 pRNAi- GL (タカラバイオ社製）、 pCMV-DsRed- Express (CL ONTECH社製）等を例示することができる。また、一本鎖 RNAは、後述の 6に記載した方法で発現させることができる。

[0073] 具体的には以下のようにして検出することができる。まず宿主細胞をマルチウエルプレート等に培養し、標的配列を有したレポーター遺伝子発現ベクターと一本鎖 RN Aを発現させる。その後、レポーター活性を測定し、一本鎖 RNAを発現させない場合に比べて、一本鎖 RNAを発現させた場合のレポーター活性を測定することで、マイク口 RNAの機倉を検出すること力 Sできる。

4.本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いてマイクロ RNA およびマイクロ RNA前駆体の発現を検出する方法

以下に、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いて、マイク口 RNAおよびその前駆体の発現を検出する方法について説明する。

[0074] マイクロ RNAおよびその前駆体の発現量を検出する方法としては、例えば、（1)ノーザンハイブリダィゼーシヨン、（2)ドットブロットハイブリダィゼーシヨン、（3)in situハイブリダィゼーシヨン、（4)定量的 PCR、（5)デフアレンシャル 'ノヽイブリダィゼーシヨン、（6)マイクロアレイ、（7)リボヌクレアーゼ保護アツセィ等が挙げられる。

[0075] ノーザンブロット法とは、検体由来 RNAをゲル電気泳動で分離後、ナイロンフィルタ一等の支持体に転写し、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列をもとに適宜標識をしたプローブを作製し、ハイブリダィゼーシヨンおよび洗浄をおこなうことで、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体に特異的に結合したバンドを検出する方法であり、具体的には、例えば、 Science 294, 853- 858 (2001)に記載の方法等に従って行うことができる。

[0076] 標識プローブは、例えば、ニック'トランスレーション、ランダム ·プライミングまたは 5' 末端のリン酸化等の方法により放射性同位体、ビォチン、ジゴキシゲニン、蛍光基、化学発光基等を、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基酉己列と相補的な配列を有する DNAや RNA、あるいは LNAに取り込ませることで調製できる。標識プローブの結合量は本発明の核酸、マイクロ RN Aまたはマイクロ RN A前駆体の発現量を反映することから、結合した標識プローブの量を定量することで本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の発現量を定量することができる。電気泳動、メンブレンの移行、プローブの調製、ハイブリダィゼーシヨン、核酸の検出については、モレキュラー 'クローニング第 3版に記載の方法により行うことができる。

[0077] ドットブロットハイブリダィゼーシヨンは、組織や細胞から抽出した RNAをメンブラン上に点状にスポットして固定し、プローブとなる標識したポリヌクレオチドとハイブリダィゼーシヨンを行レ、、プローブと特異的にハイブリダィズする RNAを検出する方法である。プローブとしてはノーザンハイブリダィゼーシヨンと同様のものを用いることができる。 RNAの調製、 RNAのスポット、ハイブリダィゼーシヨン、 RNAの検出については、モレキュラー 'クローニング第 3版に記載の方法により行なうことができる。

[0078] in situハイブリダィゼーシヨンは、生体から取得した組織のパラフィンまたはクリオスタツト切片、あるいは固定化した細胞を検体として用い、標識したプローブとハイプリダイゼーシヨンならびに洗浄の工程を行い、顕微鏡観察により、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の組織や細胞内での分布や局在を調べる方法である [Methods in Enzymology, 254， 419 (1995)]。プローブとしてはノーザンハイブリダィゼーシヨンと同様のものを用いることができる。具体的には、 Nature Method 3， 2 7 (2006)に記載の方法に従って、マイクロ RNAを検出することができる。

[0079] 定量的 PCRでは、検体由来 RNAから、逆転写用プライマーと逆転写酵素を用いて合成した cDNA (以後、該 cDNAを検体由来 cDNAと称する）を測定に用いる。 cDNA合成に供する逆転写用プライマーとして、ランダムプライマーあるいは特異的 RTプライマー等を用いることができる。特異的 RTプライマーとは、本発明の核酸、マイクロ RN Aまたはマイクロ RNA前駆体およびその周辺ゲノム配列に対応する塩基配列に相補する配列を有するプライマーを!/、う。

[0080] 例えば、検体由来 cDNAを合成後、これを铸型とし、本発明の核酸、マイクロ RNA またはマイクロ RNA前駆体およびその周辺ゲノム配列に対応する塩基配歹 IJ、ある!/ヽは逆転写用プライマーに対応する塩基配列から設計した铸型特異的なプライマーを用いて PCRを行い、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を含む cDNAの断片を増幅させ、ある一定量に達するまでのサイクル数から検体由来 RNAに含まれる本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の量を検出する。铸型特異的なプライマーとしては、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA 前駆体およびその周辺ゲノム配列に対応する適当な領域を選択し、その領域の塩基配列の 5'端 20〜40塩基の配列からなる DNAまたは LNA、および 3'端 20〜40塩基と相補的な配列からなる DNAまたは LNAの組を用いることができる。具体的には、 Nucleic Acids Research, 32， e43 (2004)に記載の方法等に準じて行うことができる。

または、 cDNA合成に供する逆転写用プライマーとして、ステム'ループ構造を有した特異的 RTプライマーを用いることもできる。具体的には、 Nucleic Acid Research, 3 3， el79 (2005)に記載の方法、あるいは、 TaqMan MicroRNA Assays (アプライドバイォシステムズ社製）を用いて行うことができる。

別の検体由来 cDNA合成法として、検体由来 RNAに対して polyAポリメラーゼにより p olyA配列を付加し、オリゴ dT配列を含む塩基配列を逆転写用プライマーとして用いることにより、逆転写反応を行うこともできる。具体的には、 miScript System (キアゲン社製）や QuantiMir RT Kit (System Biosciences社製）を用いて行うことができる。

更に、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を少なくとも 1っ以上含む塩基配列に対応する DNAあるいは LNAを固定化させたフィルターあるいはスライドガラスやシリコンなどの基盤に対して、検体由来 RNAあるいは cDNAをハイブリダイゼーシヨンし、洗浄を行うことにより、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の量の変動を検出することができる。このようなハイブリダィゼーシヨンに基づく方法には、ディファレンシャルハイブリダィゼーシヨン [Trends Genet., 7， 314 ( 1991)]やマイクロアレイ [Genome Res., 6， 639 (1996)]を用いる方法があげられる。いずれの方法もフィルターあるいは基盤上に U6RNAに対応する塩基配列などの内部コントロールを固定化することで、対照検体と標的検体の間での本発明核酸の量の違いを正確に検出することができる。また対照検体と標的検体由来の RNAをもとにそれぞれ異なる標識の dNTP (dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTPの混合物）を用いて標識 cDNA 合成を行い、 1枚のフィルターあるいは 1枚の基盤に 2つの標識 cDNAを同時にハイブリダィズさせることで正確な本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の定量を行うことができる。更には、対照検体および/または標的検体由来の RNA を直接標識してハイブリダィズさせることで本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイク口 RNA前駆体の定量をおこなうこともできる。例えば、 Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 101， 9740-9744 (2004)や Nucleic Acid Research, 32， el88 (2004)、 RNA, 13， 151-159 (2 007)等に記載のマイクロアレイを用いてマイクロ RNAを検出することができる。具体的には、 mirVana miRNA Bioarray (Ambion社製）と同様にして検出または定量すること力 Sできる。

[0082] リボヌクレアーゼ保護アツセィでは、まず本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイク口 RNA前駆体あるいはその周辺ゲノム配列に対応する塩基配列の 3'端に T7プロモ一ター、 SP6プロモーターなどのプロモーター配列を結合し、標識した NTP (ATP、 GT P、 CTP、 UTPの混合物）および RNAポリメラーゼを用いたイン.ビトロの転写系により、標識したアンチセンス RNAを合成する。該標識アンチセンス RNAを、検体由来 RNAと結合させて、 RNA-RNAノヽイブリツドを形成させた後、 1本鎖 RNAのみを分解するリボヌクレアーゼ Aで消化する。該消化物をゲル電気泳動し、 RNA-RNAハイブリッドを形成することにより消化から保護された RNA断片を、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体として、検出または定量する。具体的には、 mirVana miRNA D etection Kit (Ambion社製）を用いて検出または定量することができる。

5.本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いてマイクロ RNA および該マイクロ RNA前駆体の栾を掄出する方法

以下に本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いて、マイクロ RNAおよびその前駆体の変異を検出する方法について説明する。

[0083] マイクロ RNAおよびマイクロ RNA前駆体の変異を検出する方法として、正常型の該マイクロ RNAと変異型のマイクロ RNA、および正常型のマイクロ RNA前駆体と変異型のマイクロ RNA前駆体とのハイブリダィズにより形成されるへテロ二本鎖を検出する方法を用いることができる。

ヘテロ二本鎖を検出する方法としては、（1)ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二本鎖検出法 [Trends genet., 7， 5 (1991)]、（2)—本鎖コンフオメーシヨン多型解析法 [Genomics, 16， 325-332 (1993)]、（3)ミスマッチの化学的切断法（CCM， c hemical cleavage or mismatchesノ [Human Genetics (1996), Ί om Strachan and Andre w P. Read, BIOS Scientific Publishers Limited], (4)ミスマッチの酵素的切断法 [Nat ure Genetics, 9， 103—104 (1996)]、（5)変性ゲル電気泳動法 [Mutat. Res., 288， 103 -112 (1993)]等の方法があげられる。

[0084] ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるへテロ二本鎖検出法は、例えば、以下のようにして行う。まず、検体由来 DNAあるいは検体由来 cDNAをテンプレートに対し、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列を含むゲノムの塩基配列を基に設計したプライマーにより、 200 bpよりも小さい断片として増幅する。へテロ二本鎖が形成された場合は、変異を持たないホモ二本鎖よりも移動度が遅ぐそれらは余分なバンドとして検出することができる。特製のゲル（Hydro-link, MDEなど）を用いたほうが分離度はよい。 200 bpよりも小さい断片の検索ならば、揷入、欠失、ほとんどの 1塩基置換を検出することができる。ヘテロ二本鎖解析は、次に述べる一本鎖コンフオメーシヨン解析と組み合わせた 1枚のゲルで行うことが望ましい。

[0085] 一本鎖コンフオメーシヨン多型解析（SSCP解析； single strand conformation polymor phism analysis)では、検体由来 DNAあるいは検体由来 cDNAをテンプレートにして、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列を含むゲノムの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いて、 200bpよりも小さい断片として増幅した DNAを、変性後に、未変性ポリアクリルアミドゲル中で泳動する。 DNA増幅を行う際にプライマーを同位体あるいは蛍光色素で標識する力、、または未標識の増幅産物を銀染色することにより、増幅した DNAをバンドとして検出すること力 Sできる。野生型のパターンとの相違を明らかにするために、コントロールの検体も同時に泳動すると、変異を持った断片を移動度の違!/、から検出できる。

[0086] ミスマッチ化学的切断法（CCM法）では、検体由来 DNAあるいは検体由来 cDNAをテンプレートに、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配歹 IJを含むゲノムの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅した DNA断片を、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体に同位体あるいは蛍光標識をとり込ませた標識核酸とハイブリダィズさせ、四酸化オスミウムで処理することでミスマツチして!/、る場所の DNAの一方の鎖を切断させ変異を検出することができる。 CCM は最も感度の高い検出法の 1つであり、キロベースの長さの検体にも適応できる。

[0087] 上記、四酸化オスミウムの代わりに T4ファージリゾルベースとエンドヌクレアーゼ VII のような細胞内でミスマッチの修復に関与する酵素と RNaseAと組み合わせることで、酵素的にミスマッチを切断することもできる。

変十生ゲノレ電気泳動法（denaturing gradient gel electrophoresis： DGGE法）では、検体由来 DNAあるいは検体由来 cDNAをテンプレートに、本発明の核酸、マイクロ RNA またはマイクロ RNA前駆体の塩基配列を含むゲノムの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅した DNA断片を化学的変性剤の濃度勾配や温度勾配を有するゲノレを用いて電気泳動する。増幅した DNA断片はゲル内を一本鎖に変性する位置まで移動し、変性後は移動しなくなる。変異がある場合とない場合では増幅した DNAのゲル内での移動が異なることから、変異の存在を検出できる。検出感度を上げるにはそれぞれのプライマーにポリ (G:C)端末を付けるとよ!/、。

[0088] また、検体由来 DNAあるいは検体由来 cDNAの塩基配列を直接的に決定し、解析することにより、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の変異を検出することあでさる。

6.本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を発現させる方法

本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体は、細胞内に導入して本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体が転写されることにより生合成されるようなベクターを用いることにより発現させること力 Sできる。具体的には、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列あるいは、その塩基配列を含むゲノムの塩基配列をもとに、ヘアピン部分を含む DNA断片を調製し、発現ベクター内のプロモーター下に挿入して発現プラスミドを造成し、次に該発現プラスミドを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することにより本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を発現させることができる。

[0089] 発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能でかつ染色体中への組込みが可能で、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列を含むゲノム遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであれば、いかなるものでもよく、例えば、 RNA polymerase II(pol II)系プロモーターや U6RNAや H1RNAの転写系である RNA polymerase IlKpol III)系プロモーター等をあげることができる。 pol II系プロモーターとしては例えば、サイトメガロウィルス（ヒト CMV)の IE(immediate early)遺伝子のプロモーター、 SV40の初期プロモーター等をあげることができる。それらを用いた発現ベクターとして、例えば、 pCDNA6.2-GW/miR (Invitrogen社製）、 pSilencer 4.1- CMV (Ambion社製）等を例示することができる。 pol III系プロモーターとしては U6RNA や H1RNAあるいは tRNAのプロモーターをあげることができる。それらを用いた発現べクタ一として、例えば、 SINsi-hHl DNA (タカラバイオ社製）、 pSINsi_hU6 DNA (タカラバイオ社製）、 pENTR/U6 (Invitrogen社製）等をあげることができる。

[0090] または、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列を含むゲノム遺伝子をウィルスベクター内のプロモーター下流に揷入して組換えウィルスベクターを造成し、該ベクターをパッケージング細胞に導入して組換えウィルスを生産して、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列を含むゲノム遺伝子を発現させることもできる。

[0091] ノ /ケージング細胞はウィルスのパッケジ一ングに必要な蛋白質をコードする遺伝子のいずれかを欠損している組換えウィルスベクターの該欠損する蛋白質を補給できる細胞であればいずれの細胞もよぐ例えばヒト腎臓由来の HEK293細胞、マウス繊維芽細胞 MH3T3などを用いることができる。パッケージング細胞で補給する蛋白質としては、レトロウイルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来の gag, pol, envなどの蛋白質が、レンチウィルスベクターの場合は HIVウィルス由来の gag, pol, env, vpr, vpu, vif, tat, rev, neぬどの蛋白質、アデノウイルスベクターの場合はアデノウイルス由来の ΕΙΑ,ΕΙΒなどの蛋白質、また、アデノ随伴ウィルスベクターの場合は R印 (ρ5， ρ 19， p40), Vp(Cap)などの蛋白質を用いることができる。

[0092] 発現ベクターを用いる以外にも、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA 前駆体を、ベクターを用いずに直接細胞に導入することもできる。本手法に用いる核酸は DNAや RNA、あるいはヌクレオチド類似体の他、これらのキメラ分子、あるいは該核酸の誘導体も用いることができる。具体的には、 Pre-miR™miRNA Precursor Molec ules (Ambion社製）や miRIDIAN microRNA Mimics (GEヘルスケア社製）と同様にして本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を発現させることができる。

7.本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いてマイクロ RNA およびマイクロ RNA前駆体の発現を抑制する方法本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体は、アンチセンス技術 [バィォサイエンスとインダストリ一， 50， 322 (1992)、化学， 46， 681 (1991)、 Biotechnology ， 9， 358 (1992)、 Trends in Biotechnology, 10， 87 (1992)、 Trends in Biotechnology, 10， 152 (1992)、細胞工学， 16， 1463 (1997)]、トリプル.ヘリックス技術 [Trends in Biot echnology, 10， 132 (1992)]、リホケム技術 [Current Opinion in Chemical Biology, 3， 274 (1999)、 FEMS Microbiology Reviews, 23， 257 (1999)、 Frontiers in Bioscience, 4， D497 (1999)、 Chemistry & Biology, 6， R33 (1999)、 Nucleic Acids Research, 26， 5 237 (1998)、 Trends In Biotechnology, 16， 438 (1998)]、デコイ DNA法 [Nippon Rinsho - Japanese Journal of Clinical Medicine, 56， 563 (1998)、 Circulation Research, 82, 1023 (1998)、 Experimental Nephrology, 5， 429 (1997)、 Nippon Rinsho - Japanese Jo urnal of Clinical Medicine, 54， 2583 (1996)]、あるいは siRNA (short interfering RNA) を用いて、その発現を抑制することができる。

[0093] アンチセンスとは、ある標的核酸の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸を塩基配列特異的にハイブリダィゼーシヨンさせ、該標的核酸の発現を抑制できるものをいう。アンチセンスに用いる核酸は DNAや RNAまたはヌクレオチド類似体の他、これらのキメラ分子、あるいは該核酸の誘導体も用いることができる。具体的には、 Natu re 432， 226 (2004)等に記載の方法に従うことでアンチセンスを作製し、発現を抑制すること力 Sできる。具体的には、 Anti-miR™miRNA Inhibitors (Ambion社製）や miRIDI AN microRNA Inhibitors (GEヘルスケア社製）と同様にして本発明の核酸、マイクロ R NAまたはマイクロ RNA前駆体の発現を抑制することができる。

[0094] siRNAとは、ある標的核酸の塩基配列を含む短!/、二本鎖 RNAであり、 RNA干渉（RN Ai)により、該標的核酸の発現を抑制できるものをいう。 siRNAの酉己歹 IJは、標的とする塩基配列から文献 [Genes Dev. , 13， 3191 (1999)]の条件に基づいて適宜設計することができる。選択した 19塩基の配列および相補的な配列それぞれの 3'端に TTを付加した配列を有する 2本の RNAを DNA合成機により合成し、アニーリングすることにより si RNAを作製できる。また、 pSilencer 1.0- U6 (Ambion社製）、 pSUPER (01igoEngine社 )等の siRNA発現用ベクターに上記の選択した 19塩基の配列に相当する DNAを揷入することにより、該遺伝子の発現を抑制できる siRNAを発現するベクターを作製すること力 Sできる。

[0095] 例えば、間葉系幹細胞、肥満細胞または癌細胞で発現するマイクロ RNAまたは該マイクロ RNA前駆体に特異的なアンチセンスまたは siRNAを用いて、間葉系幹細胞、肥満細胞または癌細胞で発現するマイクロ RNAまたは該マイクロ RNA前駆体の発現の抑制を行うことができる。すなわち、該マイクロ RNAまたは該マイクロ RNA前駆体に特異的なアンチセンスまたは siRNAを投与することにより該マイクロ RNAの発現を抑制し、間葉系幹細胞、肥満細胞または癌細胞におけるマイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の作用を制御することができる。

[0096] 例えば、間葉系幹細胞、肥満細胞または癌細胞で発現するマイクロ RNAまたはその前駆体の発現異常による患者の場合、該マイクロ RNAまたはその前駆体に特異的なアンチセンスまたは siRNAを患者に投与することにより、間葉系幹細胞、肥満細胞または癌細胞の機能を制御し、上記発現異常により発症する疾患の治療をすることができる。すなわち、該マイクロ RNAまたはその前駆体に特異的なアンチセンスまたは siRNAは、間葉系幹細胞、肥満細胞の異常に起因する疾患または細胞の増殖異常に起因する疾患の治療剤として有用である。

[0097] 該マイクロ RNAまたはその前駆体に特異的なアンチセンスまたは siRNAを上記治療剤として使用する場合は、アンチセンスまたは siRNAを単独、あるいはレトロウィルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクターなどの適当なベクタ一に挿入した後、下記 10、 11に記載した常法に従って医薬製剤とし、投与することができる。

8.本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いて遺伝子の機能をネ ffl l!llする

本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いて遺伝子の機能を抑制する方法としては、マイクロ RNAが標的塩基配列を有する mRNAの翻訳を抑制する活性を利用して、標的配列を有した遺伝子の機能を抑制する方法であれば、いかなる方法でもよぐ例えば、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を発現させ細胞内のマイクロ RNA量を増加させることにより、標的配列を有する m RNAの機能を抑制し、遺伝子の機能を抑制する方法をあげることができる。なお、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を発現させるには、上記 6で記載した方法により行なうことができる。配列番号;!〜 29、 78〜80のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロ RNAの標的塩基配列を有する mRNAとしては、例えば、それぞれ前述の表 1 14で示される遺伝子群を例示することができる。

9.本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いて細胞を分離する

生体内から取り出した各種細胞から、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ R NA前駆体を発現する細胞を分離する方法としては、本発明の核酸、マイクロ RNA またはマイクロ RNA前駆体の塩基配列と相補する塩基配列を有する核酸に蛍光標識したプローブを細胞に導入し、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA 前駆体とハイブリダィゼーシヨンさせ、標識プローブとハイブリダィゼーシヨンした細胞のみを、ソーティング機能を有したフローサイトメーターで分離することにより、行うことができる。

[0098] 蛍光標識プローブとしては、ハイブリダィゼーシヨンした時に特異的な蛍光を発するものであれば、いかなるものでもよぐ例えば、モレキュラービーコン [Biochimica et Bi ophysica Acta 1479， 178 (1998)]や FRET[Proc.Natl.Acad.Sci. USA 103， 263 (2006)

]等があげられる。

モレキュラービーコンは、一方の末端に蛍光官能基を共有結合により導入し、もう一方の末端に蛍光消光を引き起こすダブシル基等を導入した核酸で、通常の水溶液中ではヘアピン構造をとるように塩基配列が設計されている。両末端に導入した蛍光官能基と蛍光消光団は互いに隣接するためプローブ単独では蛍光が観測されない、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体とハイブリダィゼーションすると蛍光官能基と蛍光消光団が引き離され、強い蛍光が観測できる。

[0099] FRETとは、 2種以上の蛍光官能基間の分子励起エネルギー移動現象である。具体的にはエネルギー供与体を末端に導入した核酸プローブとエネルギー受容体を末端に導入した核酸プローブの 2種を用意する。 2つのプローブの塩基配列は、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体とハイブリダィゼーシヨンした後に導入した 2つの蛍光官能基が近接するように設計すると、プローブ単独では供与体の発光のみが観測される力本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体とプローブがハイブリダィゼーシヨンを引き起こすと、 2つのプローブが近接するため、供与体のエネルギーが受容体に移動し、受容体に基づく発光が主として観測できる

〇

[0100] ソーティング機能を有したフローサイトメーターによる細胞の分離の方式としては、水電荷方式、セルキヤプチヤー方式などがあげられる（フローサイトメーター自由自在

、 pl4-23、秀潤社、 1999年）。どちらの方法も細胞の蛍光測定を行い、蛍光強度を電気信号に変換することにより蛍光強度を定量し、その量に応じて細胞を分離すること力 ^sできる。具体的には、 BD FACSAriaセルソーター（ベタトン'ディッキンソン社製）や EPICS ALTRA HyPerSort (ベックマン'コールター社製）などを用いて測定することができる。

10.本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いてマイクロ RNA ぉょぴ該マイクロ RNA前駆体のまたは機食!^促進または制させろ物スクリーユングすろ法

本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いて、マイクロ RNA またはその前駆体の発現または機能を促進または抑制させる物質をスクリーニングすること力 Sできる。例えば、本発明のマイクロ RNAおよびマイクロ RNA前駆体の塩基配列から、スクリーニングの標的とする塩基配列を選択して、該塩基配列を有する核酸を発現する細胞を利用して、選択したマイクロ RNAまたはその前駆体の発現または機能を促進または抑制させる物質をスクリーニングすることができる。

[0101] スクリーニングに用いる、マイクロ RNAおよびマイクロ RNA前駆体の塩基配列を有する核酸を発現する細胞としては、間葉系幹細胞、肥満細胞または癌細胞のほか、上記 6で記載したように、該塩基配列を有する核酸を発現するベクターを動物細胞や酵母などの宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞や、該塩基配列を有する核酸をベクターを用いずに直接導入した細胞等を用いることもできる。

[0102] 具体的なスクリーニング方法としては、（a)スクリーニングの標的とするマイクロ RNA またはその前駆体の発現量の変化を指標にする方法の他、マイクロ RNAは標的配列を有する mRNAの翻訳を抑制するため、（b)スクリーニングの標的とするマイクロ R NAまたはその前駆体の標的配列を有する mRNAの発現量の変化を指標にする方法力 Sfcげること力 Sでさる。

(a)スクリーニングの標的とするマイクロ RNAまたはその前駆体の発現量の変化を指標にするスクリーニング方法

該塩基配列を有する核酸を発現する細胞に対し、試験物質を接触させ、選択した核酸の発現量の変化を指標に、マイクロ RNAおよびその前駆体の発現を促進または抑制させる物質を得る。核酸の発現量は、上記 3で記載した方法により検出することができる。

(b)スクリーニングの標的とするマイクロ RNAまたはその前駆体の標的配列を有する mRNAの発現量の変化を指標にするスクリーニング方法

該塩基配列を有する核酸を発現する細胞に対し、試験物質を接触させ、選択した核酸の標的配列を有する mRNA発現量の変化を指標に、マイクロ RNAおよびその前駆体の発現または機能を促進または抑制させる物質を得る。または、本発明の塩基配列を有する一本鎖 RNAに対する標的配列を、適当なレポーター遺伝子発現べクタ一の 3 ' UTRに揷入した DNAを作製して、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入し、その細胞に試験物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現量の変化を指標に、マイク口 RNAおよびその前駆体の発現または機能を促進または抑制させる物質を得る。標的配列の選択は、上記 8で記載した方法により行なうことができ、配列番号;!〜 2 9でいずれかで表される塩基配列からなるマイクロ RNAの標的配列を有する mRNAとしては、例えば、それぞれ前述の表 1 14で示される遺伝子群を例示することができ

11.本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を含有する診断薬および-冶

本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体および、その塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体は、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の発現を制御することにより、間葉系幹細胞、肥満細胞の異常に起因する疾患、または細胞の増殖異常に起因する疾患の治療薬として利用することができる。また、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体は、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の定量または本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の変異を検出することにより、間葉系幹細胞、肥満細胞の異常に起因する疾患、または細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬として利用することができる。間葉系幹細胞の異常としては、増殖または分化の異常等があげられ、それに起因する疾患として、癌、骨形成不全症、軟骨形成不全症、糖尿病等をあげることができる。肥満細胞の異常としては、肥満細胞の分化や脱顆粒、炎症性メディエーター産生、サイト力イン産生、ケモカイン産生等の異常が挙げられ、それに起因する疾患として、アトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性疾患等をあげることができる。細胞の増殖異常に起因する疾患としては、癌及び、細胞の異常増殖や組織の過形成等が原因となっている動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎、自己免疫疾患等をあげることができる。

[0104] 本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を含有する診断薬は、目的の診断法に応じて、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の定量あるいは変異の検出を行うために必要な試薬、例えば緩衝剤、塩、反応用酵素、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体と結合する標識された蛋白、および検出用発色剤等を含んでもよい。

[0105] 本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体または、その塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する治療剤は、単独で投与することもできるが、通常は薬理学的に許容される 1つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として投与するのが望ましい。

[0106] 投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましぐ経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげること力 Sでき、望ましくは静脈内投与をあげることができる。

投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。 [0107] 経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。

乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、ォリーブ油、大豆油などの油類、 P-ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、スト口べリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。

[0108] カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビュルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。

[0109] 非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。

注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。

[0110] 担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体、さらには用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。

投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なる力通常成人 1日当たり 10 H g/kg〜20 mg/kgである。

[0111] また、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体および、その塩基配歹 IJと相補的な塩基配列を有する核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する治療薬は、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA 前駆体または、その塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を発現するベクターと核酸治療薬に用いる基剤とを調合することにより製造することもできる [Nature Genet., 8， 42(1994)]。

[0112] 核酸治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでもよく、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラタトース、デキストラン、グルコース等の溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等があげられる。また常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、 pH調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油又はレシチンもしくは非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を、粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。本発明の治療剤は、治療の直前に液体の場合はそのままで、個体の場合は必要により滅菌処理をした上記の基剤に溶解して治療に使用することができる。

[0113] 本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を含有するベクターは、上記 6で作製した組換えウィルスベクターウィルスベクターをあげることができ、より具体的には、レトロウイルスベクター及びレンチウィルスベクター等をあげることができる

〇

例えば、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を、アデノウィルス.へキソン蛋白質に特異的なポリリジンーコンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウイルスベクターに結合させることにより、ウィルスベクターを調製することができる。該ウィルスベクターは安定に目的の細胞に到達し、エンドソームによる細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され核酸を効率的に発現させることカでさる。

[0114] また、（-)鎖 RNAウィルスであるセンダイウィルスをベースにしたウィルスベクターも開発されており（W097/16538、 W097/16539)、当該センダイウィルスを用いて、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を組み込んだセンダイウィルスを作製すること力でさる。

本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体は、非ウィルス核酸移入法によっても移入することができる。例えば、リン酸カルシウム共沈法 [Virology, 52， 4 56-467 (1973) ; Science, 209， 1414-1422 (1980)]、マイクロインジェクション法 [Proc.N atl.Acad.Sci. USA, 77， 5399-5403 (1980) ; Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 77， 7380-7384 (1980) ; Cell, 27， 223-231 (1981) ; Nature, 294， 92-94 (1981)]、リボソームを介した膜融合-介在移入法 [Proc.Natl.Acad.ScL USA, 84， 7413-7417 (1987) ; Biochemistry, 28， 9508-9514 (1989) ;J. Biol. Chem. , 264， 12126-12129 (1989) ; Hum. Gene Ther., 3， 267-275， (1992) ; Science, 249， 1285-1288 (1990) ; Circulation, 83， 2007-2011 (19 92)]あるいは直接 DNA取り込みおよび受容体-媒介 DNA移入法 [Science, 247， 1465- 1468 (1990) ; J. Biol. Chem., 266， 14338-14342 (1991) ; Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 8 7, 3655-3659 (1991) ;J. Biol. Chem. , 264， 16985-16987 (1989) ; BioTechniques, 11， 474-485 (1991) ; Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 87， 3410-3414 (1990) ; Proc.Natl.Acad.Sc i. USA, 88， 4255-4259 (1991) ; Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 87， 4033-4037 (1990) ; Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA, 88， 8850-8854 (1991) ; Hum. Gene Ther. , 3， 147-154 (1991) ]等により移入すること力 Sできる。

リボソームを介した膜融合一介在移入法は、リボソーム調製物を目的とする組織に直接投与することにより、本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を当該組織の局所に取り込み、および発現させること力 Sできる [Hum. Gene Ther., 3， 39 9 (1992)]。 DNAを病巣に直接ターゲッティングするには、直接 DNA取り込み技術が好ましい。

受容体-媒介 DNA移入は、例えば、ポリリジンを介して、蛋白質リガンドに DNA (通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態をとる）を結合することによつて行う方法をあげることができる。リガンドは、目的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンドー DNAコンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合および DNA—蛋白質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。 DNAの細胞内破壊を防止するために、アデノウイルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。

12· 細から細への hおよび雷平 ¼

間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化過程における影響を調べる方法としては、例えば以下のようにして確認する方法があげられる。具体的には、間葉系幹細胞から骨芽細胞へ分化を誘導する条件下で、本発明の核酸、マイクロ RNA、マイクロ RNA 前駆体または、該マイクロ RNAの標的遺伝子に対する siRNAを上記 6の方法に従つて間葉系幹細胞に導入し、培養する。骨芽細胞への分化が進むに伴い発現が上昇する遺伝子または蛋白質を解析し、陰性対照と比較する。

[0116] 間葉系幹細胞から骨芽細胞へ分化誘導させる方法としては、間葉系幹細胞から骨芽細胞へ分化誘導させることができる方法であれば!/、かなる方法でもよ!/、が、例えば、 Science, 284, 143-147 (1999)に記載の方法があげられる。具体的には、間葉系幹細胞を培養器に播種した後、デキサメサゾン、ァスコルビン酸ー2リン酸、および /3— グリセ口フォスフェートを含む細胞培養用培地中で 1〜4週間培養を続けることにより、間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化させることができる。

[0117] 骨芽細胞への分化に伴い発現が上昇する遺伝子の定量的な解析法としては、 RT- Pし R ^reverse transcription— polymerase chain reactionノ、ノーザンプロット角早析、トツトブロットハイブリダィゼーシヨン法、 DNAマイクロアレイ等があげられる。

骨芽細胞への分化に伴い発現が上昇する蛋白質の定量的な解析法としては、ゥェスタンプロット解析、該蛋白質に特異的に反応する抗体を用いた免疫組織染色、 ELI SA等があげられる。

[0118] 骨芽細胞への分化に伴い発現が上昇する遺伝子または蛋白質としては、 I型コラーゲン、ォステオカルシン、ォステオネタチン、ォステオポンチン、ボーンシァロプロティン（bone sialoprotein) , Runx2 (runt-related gene 2)、ァノレカジフォスファタ一T(ALP) 等があげられる。

また、骨芽細胞への分化程度を評価する方法としては、該骨芽細胞中の ALP酵素活性を利用して細胞を染色すること、あるいは、 ALP酵素活性を測定する方法があげられる。該細胞染色のより具体的な方法は、骨芽細胞中の ALP酵素により加水分解された基質のリン酸エステルのアルコール部分をジァゾニゥム塩でカップリングし、ァゾ色素で酵素活性部位に沈殿させる方法があげられる。基質としては、例えばナフトール AS-MXリン酸を、ァゾ色素としては、例えばファーストバイオレット青をあげることカできる。これらカ含まれてレヽるキット、 ί列え ίί leukocyte alkaline phosphatase (Sigma 社製）等を用いてもよい。また、 ALP酵素活性の測定キットとして、例えばアルカリ性ホスファ B-テストヮコー（和光純薬株式会社製）等を用いてもよ!/、。

[0119] 更に、骨芽細胞が産生した石灰化成分を検出することによつても骨芽細胞への分化を確認することもできる。石灰化成分を検出する方法としては、フォンコッサ (von ossa)染色、ァリザリンレッド（Alizarin Red)染色等の染色法があげられる。

フォンコッサ染色とは、硝酸銀を用いて石灰化成分であるリン酸カルシウムを検出する方法である。具体的には、パラフィン等で固定した細胞に対し 1〜5%の硝酸銀水溶液を反応させ光に当て、黒く呈色したリン酸カルシウムが存在する部分を定量、例えば該呈色面積を計測することにより骨芽細胞への分化程度を評価することができる。

[0120] ァリザリンレッド染色とは、ァリザリン赤 Sがカルシウムに対して特異的な結合を示しレーキを形成することを利用した方法である。具体的には、パラフィン等で固定した細胞に対し 0.01〜5%ァリザリン赤 S溶液を反応させる、赤紫色〜橙赤色に呈色した部分を定量、例えば該呈色面積を計測することにより骨芽細胞への分化程度を評価すること力 Sでさる。

13. »の ffi†牛の禾呈》測定すろ去

ヒト肥満細胞は、安全かつ効率的に取得される方法であれば特に限定されないが、例えば、ヒトの肺、皮膚、胎児肝臓などから公知の方法 [J. Immunol. Methods, 169， 1 53 (1994); J. Immunol., 138， 861 (1987); J. Allergy Clin. Immunol., 107， 322 (2001); J. Immunol. Methods. , 240， 101 (2000)]により調製することができる。また、公知の方法 [J. Immunol., 157， 343， (1996); Blood, 91， 187 (1998); J. Allergy Clin. Immunol., 106， 141 (2000); Blood, 97， 1016 (2001); Blood, 98， 1127 (2001); Blood, 100， 3861 (2002); Blood, 97， 2045 (2001)]に従って、ヒトの臍帯血、末梢血、骨髄、肺あるいは皮膚から調製した単核球を、幹細胞因子（以下、 SCFと略す）の存在下で培養し、肥満細胞に分化させることにより、調製することができる。

[0121] また、ヒト月巴満細胞から樹立した細胞株を用いることもできる。ヒト月巴満細胞株としては、ヒト肥満細胞の性質をよく保持していることが知られている LAD2 [Leuk. Res. , 27， 671 (2003); Leuk. Res., 27， 677 (2003)]等があげられる。

肥満細胞の活性化を調べる方法としては、例えば活性化抑制、脱顆粒抑制、炎症性メディエーター産生抑制、サイト力イン産生抑制およびケモカイン産生抑制のうちの少なくとも 1つの作用を有していることを確認する方法があげられる。具体的には、本発明で用いる核酸、マイクロ RNA、マイクロ RNA前駆体または、該マイクロ RNA の標的遺伝子に対する siRNAを肥満細胞に導入し、 IgEを添加して培養した後、抗 Ig E抗体の添加等によりヒト肥満細胞を活性化し、放出された (i)脱顆粒の指標となるヒスタミンゃ /3 —へキソサミニダーゼ、（ii)LTC4、 LTD4、 LTE4、 PGD2等の炎症性メデイエ一ター、（iii)TNF- aや GM-CSF等のサイト力イン、（iv)IL_8、ト 309、 MIP-1 a等のケモ力イン等を測定する。本発明で用いる核酸、マイクロ RNA、マイクロ RNA前駆体または、該マイクロ RNAの標的遺伝子に対する siRNAを導入しな力た場合の測定値と比較することにより確認できる。また、肥満細胞に、本発明で用いる核酸、マイクロ R NA、マイクロ RNA前駆体または、該マイクロ RNAの標的遺伝子に対する siRNAを導入し、アポトーシスが誘導されることを、クロマチン DNAの断片化の測定や TUNEL 法等によって検出することより、アポトーシス誘導作用を有していることを確認できる。肥満細胞の活性化は、脱顆粒の代わりに、 TNF- aや GM-CSF等のサイト力イン産生、 IL-8,ト 309、 MIP-1 a等のケモカイン産生、 LTC4, LTD4, LTE4, PGD2等の炎症メディエーター産生等を測定することによつても調べることができる [Blood 100， 386 1 (2002) ]。

14. 糸田朐仙,の細の歹直》測定すろ去

細胞増殖の測定法としては、細胞数や細胞増殖速度を反映する指標を測定できる方法であれば特に限定されない。生細胞数測定、 DNA合成速度測定、総蛋白質量測定などを用いることができる。生細胞数を評価する方法としては、細胞中の ATP量を測定する方法があげられる。細胞中の ATP量は培養下の細胞数と比例関係にあることが知られている (J. Immunol. Meth. 160， 81-88 (1993))。細胞中の ATP量測定のより具体的な方法は、 MTT法、 XTT法などが挙げられる（J. Immunol. Meth. 65, 55-63 (1983))。また、 ATP依存性酵素ルシフェラーゼによるルシフェリン基質の発光にて AT Pを測定する方法もあげられる。細胞中の ATP量の測定キットとして、例えば CellTite- GloR Luminescent Cell viability Assay(Promega社製)等を用いてもよい。

15. #；細朐,の細朐,死の程度を測定する方法細胞死の程度を測定する方法としては、死細胞を Propium Iodide等の色素で染色する方法や、細胞死に伴い細胞外に漏出した酵素の活性を測定する方法等を用いること力 Sできる。後者については、例えば細胞外に漏出したアデニル酸 Kinaseの酵素活性を測定する方法が利用できる。より具体的には、 ToxiLight(R) Non-Destructive Cytotoxicity BioAssay Kit (Lonza社製)等を用いてもよい。

[0123] また、細胞死の中でも特に癌との関係で重要なアポトーシス（programmed cell deat h)に限定してその程度を測定することもできる。細胞のアポトーシスを評価する方法としては、 DNAの断片化の程度を測定する方法や、細胞膜の構成脂質の変化を測定する方法、アポトーシスに伴って誘導される細胞中のプロテアーゼであるカスパーゼ 3/7活性を測定する方法があげられる。細胞中のカスパーゼ 3/7活性測定のより具体的な方法は、カスパーゼ 3/7活性により遊離されたルシフェリン基質を、ルシフェラーゼ酵素反応によるルシフェリン発光にて測定する方法があげられる。細胞中のカスパーゼ 3/7活性の測定キットとして、例えば Caspase-GloR 3/7 Assay(Promega社製）等を用いてもよい。

[0124] 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例 1

[0125] 間葉系幹細胞からのマイクロ RNAの柚出

(1) RNA抽出

ヒト間葉系幹細胞（以下、 hMSCと称す）は Cambrex社より入手し、 20%ゥシ胎児血清 (FBS) (JRH Bioscience社製）を含む IMDM培地（Invitrogen社製）で 37°Cの 5%CO 濃度のインキュベータ一中で培養した。培養中の hMSCから TRIZOL reagent (Invitro gen社製）を用いて、製品に添付された方法に従い全 RNAを抽出した。

(2)低分子 RNAのクローニング

上記（1)で取得した hMSC由来 total RNA200 gを用いて、 Lauらの方法（Science 2 94， 858-862， 2001)に従い、 15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動による低分子 RNAの切り出し、 5 '—アデニル化 3 '—アダプターライゲーシヨン、 5 ' アダプターライゲーシヨン、逆転写、 PCR増幅、コンカテマ一化、 pCR2.1-TOPOベクターへのライゲーションを順次進め、低分子 RNAのクローニングを行なった。次に、クローユングした低分子 RNAの塩基配列を決定した。なお 5'—アデニル化 3'—アダプタ一は、 IDT社製の miRNA Cloning Linkerを用いた。

実施例 2

[0126] マイクロ RNAの同定

実施例 1で得られた低分子 RNAについて、まず、既知マイクロ RNAデータベースである miRBase (http://microma.sanger.ac.uk/)と比較して基酉己歹 IJがー致しな力、つたものを選抜した。それらの塩基配列に対応する DNA配列を 5'側および 3'側にそれぞれ 50nt程度伸ばした周辺ゲノム配列を UCSC Genome Bioinformatics (http：〃 genom e.ucsc.edu/)力、ら取得し、そのゲノム配列から転写されることが予測される RNAの 2次構造を RNAfoldを用いて予測した。その結果、 2種がヘアピン構造の片鎖に位置する新規マイクロ RNAであることが判明した。その塩基配列および、これらのマイクロ R NAを含むマイクロ RNA前駆体の塩基配列を表 15— 20に示す。それぞれの塩基配列を有するマイクロ RNAにっき、 KHK_miR_001から 029という名前を付与した。一つのマイクロ RNAが異なる位置のゲノム配列に由来するヘアピン構造を取り得る場合はその全てを記載した。なお、表 16— 20は、表 15の続きを示している。

[0127] 2次構造の一例として、 KHK_miR_001のヘアピン構造を図 1に示す。

[0128] [表 15]

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17]

18]

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実施例 3

マイクロ RNAの機能の掄出

実施例 2で得られたマイクロ RNAについて、 Dicer蛋白質でプロセシングを受けるか否かを調べることにより、マイクロ RNAとしての機能を有するか否かを調べることができる。

実施例 2で得られたマイクロ RNAのうち、 KHK_miR_001で示されるマイクロ RNAの機能の検出は以下のようにして行うことができる。まず、配列番号 30で表される塩基配列を有する一本鎖 RNAを合成し、 X-treme GENE siRNA Dicer Kit (ロシュ'ァプライド ' ·サイエンス社製）に添付の Dicer Enzymeと反応させる。次に、反応産物を 15%ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、 20-25塩基の大きさのバンドが検出できることでマイクロ RNAとしての機能を有していることを検出できる。

実施例 4

[0135] マイクロ RNAの現量の検出

実施例 2で得られたマイクロ RNAにつ!/、て、 hMSCと HeLa細胞での発現量を定量的 RT-PCRを用いて調べた。

hMSCおよび HeLa細胞は実施例 1と同様の方法で全 RNAを抽出し、 Thermo-X (Invi trogen社製）と random hexamer (Invitrogen社製）を用いて製品に添付された方法に従い、それぞれ template cDNAを合成した。全 RNA1 μ Lから合成し、最終的に 200 μ Lとなるように水で希釈した。以下の定量的 RT-PCR解析には、このうち 2 しを使用した。

[0136] 実施例 2で得られたマイクロ RNAのうち、 KHK_miR_007で示されるマイクロ RNAの発現を調べるため、下記のようにして定量的 RT-PCRを行った。試薬は宝酒造社製のキット（For Real Time PCR Ta aRa Ex Taq R-PCR Version2.1)を用いた。 2.0 μしの上記 template cDNA、 4.0 μ Lの 5 X R— PCRバッファー（Mg²⁺ free), 0.4 μ Lの 250 mM Mg²⁺溶液、 0.6 a 1の dNTPs (10 mmol/L)、 1.0 μ Lの SYBRグリーン I (1/2500希釈）、各 0.06 Lのマイクロ RNA特異的プライマー（100 mol/L), 0.2 μ L( ExTaq R- P CR Version,および 11.68 Lの水からなる反応液を調製後、 AB画己列検出システム（ ABI PRISM 7700、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて PCRを行った。

[0137] マイクロ RNA特異的プライマーは、以下のように設計した。

配列番号 45の塩基配列の 5 '末端側と 3 '末端側にそれぞれ、配列番号 74と配列番号 75で表される塩基配列を有するプライマーを合成した。また、バックグラウンド補正用に、 U6RNA発現量を検出するため、配列番号 76と配列番号 77で示される塩基配歹 IJを有するプライマーを合成した。

[0138] 反応条件は、 KHK_miR_007検出には最初 95°Cで 5分間加熱後、 95°Cで 15秒、 65°C で 1分間からなるサイクルを 45サイクル繰り返し、最後に 25°Cで 2分間加熱する条件を用い、 U6RNA検出には最初 95°Cで 5分間加熱後、 95°Cで 15秒、 60°Cで 1分間からなるサイクルを 45サイクル繰り返し、最後に 25°Cで 2分間加熱する条件を用いた。また、ネガティブコントロールとして、铸型 cDNAの代わりに滅菌水を用いた PCRも行った。 [0139] 発現量は、シグナル強度が 1000に達する時のサイクル数 (Ct値)を求めた後、ネガテイブコントロールの Ct値から上記値を引き、 A Ct値で計算した。同様に U6RNAの A C t値を算出し、 hMSCおよび HeLa細胞での U6RNAの A Ct値の平均値をバックグラウンドとして、その差で補正した。 A Ct値が 1.0減少すると発現量が 2.0倍減少することから、 hMSCと HeLa細胞の KHK_miR_007の補正済 Δ Ct値を相対発現量として計算した。その結果、図 2に示したように、 KHK_miR_007は、 hMSCにおいて強く発現していることが判明した。

実施例 5

[0140] マイク PRNA» 制現した細の # 糸田朐

実施例 1で得られたマイクロ RNAの前駆体を hMSCに導入し、骨芽細胞へ分化誘導をおこなう条件下で培養し、該マイクロ RNA前駆体の影響を調べた。

hMSCを 24穴プレートに 1穴あたり 6·2χ10³個になるように播種し、 20% FBSを含む Μ DM培地でー晚培養した。 1日後、マイクロ RNA前駆体をリポフエクシヨン法、具体的には、 Lipofectamine2000 (Invitrogen社製）を用いて、終濃度力 ¾0nMとなるよう hMSCに導入した。マイクロ RNAの前駆体は、 KHK— miR— 001， 006， 008， 009， 010， 012， 017， 0 18， 019， 020， 022， 024の Pre_miR™miRNA Precursor Moleculesとして Ambion社で合成されたものを用いた。これは化学合成された二本鎖の核酸分子で、それぞれ配列番号 1、 6、 8、 9、 10、 12、 17、 18、 19、 20、 22、 24で表される塩基酉己歹 IJ力、らなる核酸力 S、 miRNAが活性を有する要因となる RISCに類似した複合体に取り込まれて、 miR NAと同様の機能を有するようにデザインされている。また、配列番号 4のヒトゲノム配列に対応する配列について、配列番号 4より 3 '側に 2塩基付加した配列（配列番号 8 4)からなる核酸を用意し、 KHK_miR_004_2の Pre- miR™miRNA Precursor Moleculesとして、 Ambion社で合成したものも用いた。リポフエクシヨンは、製品に添付された方法に従った。

[0141] リボフヱクシヨンの 1日後、培地を骨芽分化誘導培地 [20%FBSを含む MDM培地中に、 0.1 mol/Lデキサメサゾン、 50 mol/Lァスコルビン酸一 2リン酸（Sigma社製）、 10 mmol/L β—グリセ口フォスフイト（Sigma社製）]へ交換し、 3日に一度の頻度で、骨芽分化誘導培地を交換して培養を続けた。培養開始から 2週間後に、細胞の形態を位相差顕微鏡 (Nikon社製）下で観察し、更にアルカリフォスファターゼ染色を行って、骨芽細胞を検出した。具体的にはまず、細胞をリン酸緩衝液（phosphate-buffered saline： PBS) (Invitrogen社製）で 1回洗浄し、固定液（10% formalin/PBS)で 5分間固定した。蒸留水で洗浄した後、喑所で Nap hthol AS-MXリン酸（Sigma社製）と Fast Violet B溶液との混合溶液（Sigma社製）と 30 分間反応させ、アルカリフォスファターゼ反応をおこなった。更に蒸留水で洗浄し、位相差顕微鏡下で赤く染まって!/、る骨芽細胞を観察し、デジタルカメラ (Nikon社製）で撮影した。

[0142] その結果、 KHK— miR— 001， 006， 010， 017， 019， 024の Pre- miR™ miRNA Precursor Moleculesを導入した hMSCは、マイクロ RNA前駆体非導入 hMSCと比べて、細胞数が少なぐアルカリフォスファターゼ染色された陽性細胞の数も少ないことが見出された。マイクロ RNA前駆体は細胞中でマイクロ RNAに変換されるので、本実施例で用いたマイクロ RNAは、 hMSCに対して、増殖を抑制する活性および骨芽細胞への分化を抑制する活性を有することが明らかになった。

実施例 6

[0143] マイクロ RNAを強制発現したヒト肥満細胞の脱頼粒に及ぼす作用

実施例 1で得られたマイクロ RNAの前駆体を、ヒト肥満細胞株である LAD2に導入して脱顆粒を誘導し、該マイクロ RNA前駆体の影響を調べた。

LAD2は最近樹立されたヒト肥満細胞株で、ヒト肥満細胞の性質をよく保持してレ、ることが知られている [Leuk. Res., 27， 671 (2003); Leuk. Res. , 27， 677 (2003)]。 Nation al Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health (Bethesd a, MD 20892-1881， USA)より LAD2を入手し、 100 ng/mLの SCFを含む Stem Pro-34 培地 [Invitrogen社製]で培養した。

[0144] LAD2を 6穴プレートに 1穴あたり 5xl0⁵個になるように播種し、マイクロ RNA前駆体をリボフヱクシヨン法、具体的には、 Gene Silencer (Genlantis社製）を用いて、終濃度力 S30nMとなるよう導入した。マイクロ RNAの前駆体は、 KHK_miR_001， 004_2， 006， 00 8， 009， 010， 012， 017， 018， 019， 020， 022， 024の Pre- miR™miRNA Precursor Molec ulesとして Ambion社で合成されたものを用いた。リポフエクシヨンは、製品に添付された方法に従った。

[0145] リポフエクシヨン法により該マイクロ RNA前駆体を導入した 2日後に、 1 μ g/mLのヒトミエローマ I_gE (コスモバイオ社製）を添加して 37°Cの 5%CO濃度のインキュベーター中で一晩培養した。翌日、遠心分離により培地を除き、タイロード (Tyrode)緩衝液（1 26.1 mmol/L NaCl、 4.0 mmol/L KC1、 1.0 mmol/L CaCl、 0.6 mmol/L MgCl 、 0.6 m mol/L H PO 、 10 mM HEPES 、 5.6 mmol/L D-グルコース、 0.1%ゥシ血清アルブミ

2 4

ン、 ρΗ7·4)で洗浄した後、タイロード緩衝液を 3.9mL添加して細胞を懸濁し、 96ゥエル •プレートに 1ゥエルあたり 100 しずつ分注した。次いで、最終濃度 10 g/mLとなるよぅゥサギ抗ヒ HgE抗体（ダコ社製）を加え、 37°Cの 5%CO濃度のインキュベータ一中で 20分間インキュベートし、脱顆粒を誘導した。遠心により上清を回収し、上清中の β -へキソサミニダーゼ活性を測定することにより、脱顆粒の程度を測定した。 /3 -へキソサミニダーゼ活性は、回収した上清 50 Lに、 40 mmol/Lクェン酸緩衝液（ρΗ 4.5 )に溶解した 4 mmol/L p-ニトロフエニル N_ァセチル- β -ダルコサミニド（シグマ社製）を 50 しをカロえ、 37°Cで 1時間インキュベート後、 0.2 mol/Lグリシン（pH 10.7)を 100〃 L加えたサンプルの 405 nmにおける吸光度をプレートリーダー 1420 ARVOsx (パーキンエルマ一社製）を用いて測定することにより測定した。ゥサギ抗ヒ HgE抗体を添加しないで同様の実験を行うことにより、 IgE受容体を介した刺激がないときの自発的な /3 -へキソサミニダーゼの放出量を測定した。また、ゥサギ抗ヒ HgE抗体の代わりに最終濃度 1%のトリトン X-100を添加して同様の実験を行うことにより、 LAD2中の全 /3 -へキソサミニダーゼ活性を測定した。脱顆粒の割合を、全 β -へキソサミニダーゼ活性に対する上清中の /3 -へキソサミニダーゼ活性の割合（％)で算出し、表 21に示した

〇

[0146] [表 21]

その結果、 H _miR_001, 017， 018， 019， 022導入により、 IgE受容体刺激による LA D2の脱顆粒が促進されることが明らかになった。

実施例 7

[0147] マイクロ RNA» ^ させた糸田朐,ネ朱におけろ糸田朐,率、アポトーシス應

実施例 1で得られたマイクロ RNAの前駆体を大腸癌由来細胞株に導入し、生細胞率、アポトーシス活性に及ぼすマイクロ RNA前駆体の影響を調べた。

DLD-1ヒト大腸癌由来細胞株（以下、 DLD-1と称す）は American Type Culture Coll ection (ATCC) (以下、 ATCCと称す）より入手した（ATCC CCL— 221)。 10%ゥシ胎児血清（FBS) (JRH Biosciences社製）を含む RPMI1640培地（Invitrogen社製）で 37 °Cの 5%CO濃度のインキュベータ一中で培養した。

[0148] DLD-1を 96穴プレートに 1穴あたり 2500個になるように播種し、 10% FBSを含む RP Ml培地でー晚培養した。 1日後、マイクロ RNA前駆体をリポフエクシヨン法、具体的には、 Lipofectamine2000 (Invitrogen社製）を用いて、終濃度が 5nM或いは 25nMとなるよう DLD-1に導入した。マイクロ RNAの前駆体は、 KHK_miR_001， 004_2， 006， 008， 009， 010， 012， 017， 018， 019， 020， 022， 024の Pre- miR™miRNA Precursor Molecule sとして Ambion社で合成したものを用いた。また、 Pre-miR miRNA Precursor Molec ules-Negative Control #2 (以下、 miR_negacon#2と称す）（Ambion社製）も DLD-1に導入し、陰性対照とした。リポフエクシヨンは、製品に添付された方法に従った。

[0149] リポフエクシヨン法により該マイクロ RNA前駆体を導入した 3日後、 CellTiter-Glo™ Luminescent Cell Viability Assay (Promega社製）を用いて生細胞率を測定した。対照区（Lipofectamine2000のみ）の DLD-1の生細胞率を 1.0としてそれぞれの相対生細胞率を計算した。その結果、表 22に示したように、 H _miR_008, 010， 017導入により 40%以上の生細胞率の減少が認められた。

[0150] [表 22]

またリポフエクシヨン法により該マイクロ RNA前駆体を導入した 2日後に、 Caspase-G lo^R 3/7 assay (Promega社製）を用いて製品に添付された方法に従いカスパーゼ 3/7 活性を測定した。対照区（Lipofectamine2000のみ）の DLD-1のカスパーゼ 3/7活性値を 1.0としてそれぞれの相対カスパーゼ 3/7活性値を計算した。その結果、表 23に示したように、 H _miR_008, 009， 010， 017導入により 150%以上のカスパーゼ 3/7活性の増加が認められた。

[表 23]

実施例 8 [0152] マイクロ RNAを強制発現させた卵巣癌由来細胞株における生細胞率、アポトーシス碰

実施例 1で得られたマイクロ RNAの前駆体を卵巣癌由来細胞株に導入し、生細胞率、アポトーシス活性に及ぼすマイクロ RNA前駆体の影響を調べた。

A2780ヒト卵巣癌由来細胞株（Nature, 295， 116-119 (1982) ; Science, 224， 994-99 6 (1984); Semin. Oncol. , 11， 285-298 (1984))は、 5%FBS (JRH Biosciences社製）を含む RPMI1640培地（Invitrogen社製）で 37°Cの 5%CO濃度のインキュベータ一中でロ^:した。

[0153] Α2780を 96穴プレートに 1穴あたり 2500個になるように播種し、 10%FBSを含む RPMI 培地でー晚培養した。 1日後、マイクロ RNA前駆体をリポフエクシヨン法、具体的には、 Lipofectamine2000 (Invitrogen社製）を用いて、終濃度が 5nM或いは 25nMとなるよう A2780に導入した。マイクロ RNAの前駆体は、 KHK_miR_001， 004_2， 006， 008， 009， 010， 012， 017， 018， 019， 020， 022， 024の Pre-miR™ miRNA Precursor Moleculesとして Ambion社で合成したものを用いた。また、 miR_negacon#2 (Ambion社製）も A2780 に導入し、陰性対照とした。

[0154] リポフエクシヨン法により該マイクロ RNA前駆体を導入した 3日後、 CellTiter-Glo™ Luminescent Cell Viability Assay (Promega社製）を用いて生細胞率を測定した。対照区（Lipofectamine2000のみ）の A2780の生細胞率を 1.0としてそれぞれの相対生細胞率を計算した。その結果、表 24に示したように、 H _miR_001, 004_2, 006， 008， 0 10， 017， 019， 020， 022導入により 40%以上の生細胞率の減少が認められた。逆に、 KHK_miR_018導入では、生細胞率の増加が認められた。

[0155] [表 24]

またリポフエクシヨン法により該マイクロ RNA前駆体を導入した 2日後に、 Caspase-Gl o^R 3/7 assay (Promega社製）を用いて製品に添付された方法に従いカスパーゼ 3/7 活性を測定した。対照区（Lipofectamine2000のみ）の A2780のカスパーゼ 3/7活性値を 1.0としてそれぞれの相対カスパーゼ 3/7活性値を計算した。その結果、表 25に示したように KHK_miR_010導入により 150%以上のカスパーゼ 3/7活性の増加が認められ。

[0156] [表 25]

産業上の利用可能性

[0157] 本発明により、新規な核酸配列を有する核酸、マイクロ RNAおよびマイクロ RNA前駆体が提供される。本発明の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体により、マイクロ RNAの発現または変異の検出、細胞の分離、標的配列を有する遺伝子の翻訳の抑制、マイクロ RNAの機能の促進または抑制させる物質のスクリーニング、間葉系幹細胞の増殖または分化の異常に起因する疾患の診断または治療をすること、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断または治療をすること、癌及び細胞の異常増殖や組織の過形成等が原因となっている疾患の診断または治療をすることができ配列表フリーテキスト

配列番号 74—人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 75—人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 76—人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 77—人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請求の範囲

[1] 配列番号 1〜29および 78〜80のいずれかで表される塩基配列と 90%以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸。

[2] 配列番号 1〜29および 78〜80のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補

[3] 配列番号 1〜29および 78〜80のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロ RN A。

[4] 請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の核酸を含むマイクロ RNA前駆体。

[5] 配列番号 30〜73および 8；!〜 83のいずれかで表される塩基配列と 80%以上の同一性を有する塩基配列からなる請求項 4記載のマイクロ RNA前駆体。

[6] 配列番号 30〜73および 8；!〜 83のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダィズする請求項 4または 5記載のマイクロ RN

A前駆体。

[7] 配列番号 30〜73および 8；!〜 83のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロ R NA前駆体。

[8] 請求項;!〜 7のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体に対して相補的な塩基配列からなる核酸。

[9] 請求項;!〜 7のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体と、該核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸。

[10] 請求項;!〜 9のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いることを特徴とするマイクロ RNAの発現を検出する方法。

[11] 請求項;!〜 9のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いることを特徴とするマイクロ RNAの変異を検出する方法。

[12] 請求項;!〜 9のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いることを特徴とする細胞を分離する方法。

[13] 請求項;!〜 9のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を発現するベクター。

[14] 請求項;!〜 9のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いることを特徴とする該核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の標的塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制する方法。

[15] 請求項;!〜 9のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を用いることを特徴とするマイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の発現または機能を促進或いは抑制させる物質をスクリーニングする方法。

[16] 請求項;!〜 9のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖および/または分化の異常に起因する疾患の診断薬。

[17] 請求項;!〜 9のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖および/または分化の異常に起因する疾患の治療薬。

[18] 請求項;!〜 9のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を導入した細胞。

[19] 請求項 13に記載のベクターを導入した細胞。

[20] 配列番号が 1、 17、 18、 19、 22のいずれかである、請求項 1〜4のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。

[21] 配列番号が 1、 17、 18、 19、 22のいずれかである、請求項 1〜4のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒促進剤。

[22] 配列番号が 30、 58、 59、 60、 61、 65のいずれかである、請求項 5〜7のいずれか 1 項に記載のマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。

[23] 配列番号が 30、 58、 59、 60、 61、 65のいずれかである、請求項 5〜7のいずれか 1 項に記載のマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒促進剤。

[24] 配列番号が 1、 17、 18、 19、 22のいずれかである、請求項 1〜4のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは配列番号が 30、 58、 59 、 60、 61、 65のいずれかである、請求項 5〜7のいずれ力、 1項に記載のマイクロ RN A前駆体に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。

[25] 配列番号が 1、 17、 18、 19、 22のいずれかである、請求項 1〜4のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは配列番号が 30、 58、 59 、 60、 61、 65のいずれかである、請求項 5〜7のいずれ力、 1項に記載のマイクロ RN A前駆体に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒抑制剤。

[26] 配列番号が 1、 17、 18、 19、 22のいずれかである、請求項 1〜4のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは配列番号が 30、 58、 59 、 60、 61、 65のいずれかである、請求項 5〜7のいずれ力、 1項に記載のマイクロ RN A前駆体と、該核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。

[27] 配列番号が 1、 17、 18、 19、 22のいずれかである、請求項 1〜4のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは配列番号が 30、 58、 59 、 60、 61、 65のいずれかである、請求項 5〜7のいずれ力、 1項に記載のマイクロ RN A前駆体と、該核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒促進剤または脱顆粒抑制剤。

[28] 酉己歹 IJ番号力、 4、 6、 8、 9、 10、 17、 18、 19、 20、 22のいずれ力、である、請求項；!〜 4のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。

[29] 酉己歹 IJ番号力 30、 34、 42、 43、 44、 46、 47、 48、 58、 59、 60、 61、 62、 65のいずれかである、請求項 5〜7のいずれか 1項に記載のマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。

[30] 酉己歹 IJ番号力、 4、 6、 8、 9、 10、 17、 18、 19、 20、 22のいずれ力、である、請求項；!〜 4のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは配歹 IJ番号カ 30、 34、 42、 43、 44、 46、 47、 48、 58、 59、 60、 61、 62、 65のいずれ力、である、請求項 5〜7のいずれか 1項に記載のマイクロ RNA前駆体に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。

[31] 酉己歹 IJ番号力、 4、 6、 8、 9、 10、 17、 18、 19、 20、 22のいずれ力、である、請求項；!〜 4のいずれ力、 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは配歹 IJ番号カ 30、 34、 42、 43、 44、 46、 47、 48、 58、 59、 60、 61、 62、 65のいずれ力、である、請求項 5〜7のいずれか 1項に記載のマイクロ RNA前駆体と、該核酸、マイク口 RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。

[32] 疾患が癌、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎および自己免疫疾患からなる群から選ばれる疾患である請求項 28〜31のいずれか 1項に記載の診断薬または治療薬。

[33] 酉己歹 IJ番号力、 4、 6、 8、 9、 10、 17、 19、 20、 22のいずれ力、である、請求項；!〜 4の V、ずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤。

[34] 酉己歹 IJ番号力 30、 34、 42、 43、 44、 46、 47、 48、 58、 59、 61、 62、 65のいずれ力、である、請求項 5〜7のいずれか 1項に記載のマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤。

[35] 酉己歹 IJ番号力、 4、 6、 8、 9、 10、 17、 19、 20、 22のいずれ力、である、請求項；!〜 4のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは配列番号力 30、 34、 42、 43、 44、 46、 47、 48、 58、 59、 61、 62、 65のレヽずれ力、である、請求項 5〜7のいずれ力、 1項に記載のマイクロ RNA前駆体に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖促進剤。

[36] 酉己歹 IJ番号力、 4、 6、 8、 9、 10、 17、 19、 20、 22のいずれ力、である、請求項；!〜 4のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは配列番号力 30、 34、 42、 43、 44、 46、 47、 48、 58、 59、 61、 62、 65のレヽずれ力、である、請求項 5〜7のいずれ力、 1項に記載のマイクロ RNA前駆体と、該核酸、マイクロ RN Aまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と力なる二本鎖核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。

[37] 配列番号が 18である、請求項;!〜 4のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、細胞の増殖促進剤。

[38] 配列番号が 60である、請求項 5〜7のいずれか 1項に記載のマイクロ RNA前駆体を有効成分として含有する、細胞の増殖促進剤。

[39] 配列番号が 18である、請求項;!〜 4のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは配列番号が 60である、請求項 5〜7のいずれか 1項に記載のマイクロ RNA前駆体に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤。

[40] 配列番号が 18である、請求項;!〜 4のいずれか 1項に記載の核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体もしくは配列番号が 60である、請求項 5〜7のいずれか 1項に記載のマイクロ RNA前駆体と、該核酸、マイクロ RNAまたはマイクロ RNA前駆体の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤。