CN113215105A - Elmo2过表达间充质干细胞的构建及其在骨折治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于骨折的干细胞治疗技术领域，具体涉及ELMO2过表达间充质干细胞的构建及其在骨折治疗中的应用，本发明根据ELMO2的TSS上游序列设计特异的sgRNA，利用该sgRNA将失去核酸内切酶活性且融合了VP64、p65激活结构域和Rta的dCas9特异地导向ELMO2基因的转录起始位点TSS，通过转录因子的激活作用促进MSCs中ELMO2的转录，成功构建了稳定过表达ELMO2的MSCs，本发明方法可促进MSCs对TNFα趋化作用的敏感性，将MSCs特异性地导向骨折损伤部位，从而提高了MSCs在治疗骨折中的特异性和疗效。

Description

ELMO2过表达间充质干细胞的构建及其在骨折治疗中的应用
技术领域
本发明属于骨折的干细胞治疗技术领域，具体涉及ELMO2过表达间充质干细胞的构建及其在骨折治疗中的应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是干细胞家族的重要成员，是一群中胚层来源且具有自我更新及多向分化能力的细胞，最早发现于骨髓，在脂肪、羊水、脐血、牙体等组织中也可提取出MSCs。MSCs在标准的组织培养环境中贴壁生长，并表达CD73，CD90和CD105等特定的细胞表面标志物，但缺乏CD45，CD34，CD14，CD11b,CD79α,CD19以及HLA-DR这些特定标志物。同时，MSCs在体外有分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞的能力。由于MSCs自身具有多向分化及免疫调节的特点，使其在细胞输注治疗免疫性疾病及机体损伤方面被广泛应用。目前在全球范围内已有877项MSCs移植被作为细胞疗法的临床研究正在开展。
人体内骨代谢的稳态由骨形成和骨吸收两个过程来维持，其中，MSCs作为成骨细胞的主要来源，介导骨的形成过程，而骨吸收过程则主要由破骨细胞来介导。生理过程中骨形成与骨吸收保持平衡能将骨量维持在一定水平，但当出现骨折创伤时，骨代谢的稳态被打破，进而开始骨修复的过程，即首先在坏死组织和死骨引起炎症，接着形成骨痂并进行塑形完成骨折的修复。此过程中损伤的局部组织产生炎症反应并释放信号分子，激活特定组织及循环中的MSCs，通过趋化作用使MSCs迁移到损伤部位，发挥其成骨分化的骨修复作用，此过程称为归巢。
MSCs本身具备的成骨分化及向损伤局部迁移的能力，使其在作为细胞疗法输注治疗骨折上备受关注。有研究通过静脉注射荧光标记的MSCs可观察到在骨折模型小鼠的损伤部位检测到荧光，提示静脉输注MSCs可定位到骨折部位参与骨痂的形成及骨折端的修复。同时，为了优化MSCs输注促进骨折修复的疗效，有学者通过应用促进MSCs归巢的分子如BMP2、SDF-1、SOX11等促进MSCs迁移到骨折部位部，促进其参与骨折后的组织修复过程。
目前，通过MSCs输注治疗各种疾病(如系统免疫性疾病等)的临床疗效及安全性已经受到了广泛认可，也有许多相关的临床试验正在开展，但MSCs输注治疗骨折损伤的临床应用仍受到很大限制。MSCs通过静脉输注到体内后通过血液循环被带到各个器官中，未经修饰的MSCs细胞表面有多种受体(如CXCR4、CX3CR1等)，可受多种人体微环境因子(如TGF-β、IL-1β、SDF-1等)的刺激，促进MSCs迁移到局部并停留在相应的组织器官中，阻碍其向损伤部位的炎症部位迁移。因此，当MSCs静脉注射时，常因其对损伤部位的炎症因子的刺激特异性不足而滞留在非损伤部位，从而影响对骨折修复的治疗效果。同时，因为MSCs本身具有免疫调节作用，有研究表明MSCs具有抑制多种免疫细胞例(如T细胞、NK细胞、树突状细胞等)的免疫功能，降低免疫细胞本身正常免疫所需要的表面受体和炎症因子的表达，可能导致免疫相关的并发症。针对MSCs输注的上述不足，有学者对MSCs进行修饰以期后提高了其治疗的效果，并取得了一定的进展。有研究报道，通过以慢病毒作为载体在MSCs中过表达CXCR5表面受体，可以提高其对CXCL13趋化因子招募信号的敏感性及特异性，提高其在迁移到接触性皮炎小鼠炎症部位聚集并停留的能力，从而优化MSCs的治疗效果。但目前大多使用慢病毒或腺病毒等病毒作为载体对MSCs进行基因表达的干预，因慢病毒及腺病毒是病毒来源，有潜在的危险性，因此现有的基因修饰手段在临床应用上仍具有一定的局限性。因此，有必要开发一种新的MSCs修饰方法，以提高其用于临床的可行性和安全性。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种过表达ELMO2的间充质干细胞的构建方法，根据ELMO2的TSS上游序列设计特异的sgRNA，利用该sgRNA将融合了转录因子VP64、p65激活结构域和Rta的dCas9特异地导向ELMO2的TSS位点，通过转录因子的激活作用促进MSCs中ELMO2的转录，成功构建了稳定过表达ELMO2的MSCs，并提高了MSCs在治疗骨折中的特异性和疗效。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明的首要目的提供了一种过表达ELMO2的间充质干细胞的构建方法，其特征在于，根据ELMO2的转录起始位点(Transcription start site，TSS)上游序列设计特异的sgRNA，再通过sgRNA将融合了转录因子VP64、p65激活结构域(NF-κB的亚基)和Rta(Epstein-Barr病毒R反式激活因子)的dCas9特异地导向ELMO2的TSS位点，通过转录因子的激活作用促进ELMO2在MSCs中转录，构建得到过表达ELMO2的MSCs，所述ELMO2的TSS上游序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
作为本发明的一个优选实施方式，上述的一种过表达ELMO2的间充质干细胞的构建方法，包括以下步骤：
S1、根据如SEQ ID NO:1所示的ELMO2的TSS上游序列设计特异的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
S2、将dSp-VP64-p65-RTA质粒，sgRNA与opti-MEM培养基混合得到预混液1；
S3、将辅助转染试剂与opti-MEM培养基混合得到预混液2；
S4、将预混液1和预混液2混合后加入细胞培养基中，经室温孵育后将培养基加入培养MSCs细胞的孔板里，48小时后，向培养基中添加嘌呤霉素筛选能存活的MSCs，构建得到过表达ELMO2的MSCs。
细胞的运动能力和迁移过程需要细胞骨架重排的参与，而ELMO2(Engulfment andcell motility proteins family,ELMO，吞噬和运动蛋白家族)在其中起到重要的作用。ELMO2是一种参与细胞运动和骨架改变的蛋白，通过与DOCK1(Dedicator ofcytokinesis1，DOCK1，鸟苷酸交换因子中的DOCK蛋白家族)和RAC1(Rac Family Small GTPase 1，RAC1，小GTP结合蛋白的RAS超家族)结合，形成复合物激活介导细胞间链接和相互作用的Rac和Rho GTP酶，从而调控细胞变形和向特定区域的迁移。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是人体内具有多向分化潜能的干细胞，是成骨分化的主要来源，在骨骼发育和骨修复中有关键作用。当人体因创伤导致骨折时，骨折早期损伤局部的炎症细胞通过分泌大量的炎症因子招募更多的炎症细胞并释放更多有趋化作用的炎症因子形成正反馈，在后期骨修复过程中，通过特异的炎症因子招募MSCs到骨折局部进行成骨分化修复损伤的骨头。临床上已有研究使用MSCs输注治疗骨折、促进骨修复的应用，但因MSCs本身可响应多种趋化信号，特异性不足，往往全身输注MSCs后遍布全身各器官组织，而没有特异性地富集到骨折部位，而且对MSCs进行基因修饰过表达靶基因使其迁移能力增强的传统方法大多使用慢病毒或者腺病毒，因该方法的基因载体是病毒来源，在临床应用上存在生物安全性的隐患，导致其在临床治疗骨折的应用中受到限制。
为此，本发明根据ELMO2的TSS上游序列设计特异的sgRNA，再将融合了转录因子VP64、p65激活结构域和Rta的dCas9特异地导向ELMO2的TSS位点，通过转录因子的激活作用促进MSCs中ELMO2的转录，成功构建了稳定过表达ELMO2的MSCs，通过体外和体内实验进一步验证发现，ELMO2过表达MSCs在输注治疗骨折中具有可行性、有效性和安全性。
优选地，所述dSp-VP64-p65-RTA质粒与sgRNA的用量比为：5μg：(20-30)ng。进一步地，所述dSp-VP64-p65-RTA质粒与sgRNA的用量比为：5μg：25ng。
优选地，在预混液1中，所述sgRNA的浓度为(20-30)ng/150μL。进一步地，所述sgRNA的浓度为25ng/150μL。
优选地，所述预混液1与预混液2的体积比为1:1。
优选地，步骤S4中，室温孵育的时长不少于15min。
优选地，所述辅助转染试剂与opti-MEM培养基的体积比为1:(25-35)。进一步地，所述辅助转染试剂与opti-MEM培养基的体积比为1:29。
优选地，所述MSCs细胞的浓度为1×105个/孔。
本发明的第二个目的是提供采用上述的构建方法构建得到的过表达ELMO2的间充质干细胞。
本发明的第三个目的是提供上述的过表达ELMO2的间充质干细胞在骨折治疗中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明根据ELMO2的TSS上游序列设计特异的sgRNA，利用该sgRNA将失去核酸内切酶活性且融合了VP64、p65激活结构域(NF-κB的亚基)和Rta(Epstein-Barr病毒R反式激活因子)的dCas9特异地导向ELMO2基因的转录起始位点TSS，通过转录因子的激活作用促进MSCs中ELMO2的转录，成功构建了稳定过表达ELMO2的MSCs，本发明方法可促进MSCs对TNFα趋化作用的敏感性，将MSCs特异性地导向骨折损伤部位，从而提高了MSCs在治疗骨折中的特异性和疗效。本发明具有以下优点：
(1)骨折早期会在损伤部位出现炎症反应，中性粒细胞和单核细胞等免疫细胞分泌大量有趋化作用的炎症因子如TNFα、CCL2等，其中TNFα为招募MSCs的关键趋化因子，但未有研究表明ELMO2可影响MSCs的迁移能力，本发明首创通过基因修饰技术提高MSCs对TNFα招募信号的敏感性，将MSCs特异富集于骨折损伤部位，从而提高MSCs输注促进骨折修复的作用；
(2)使MSCs过表达的传统基因修饰方法一般是采用慢病毒/腺病毒转染，通过病毒载体将基因转入细胞内，但因载体来源于病毒，故致使其临床应用受阻；dSp-VP64-p65-RTA是一种核酸内切酶活性丧失、且与激活转录的转录因子VP64、p65激活结构域和Rta融合表达的质粒，是通过新型的CRISPR/Cas9基因编辑技术制备得到的，本发明通过特异sgRNA将其定位到ELMO2的TSS位点上，激活其表达，因CRISPRa/dCas9系统的sgRNA和dCas9是核酸和蛋白质，不涉及生物来源的载体，排除了潜在的生物危险性，因此，对比传统的慢病毒/腺病毒的过表达技术，本发明方法无生物来源的的应用风险，靶向性强，过表达的效果好，应用此方法对MSCs进行基因修饰，过表达ELMO2，可安全有效地使MSCs输注到体内，并且在TNFα的趋化作用下特异地迁移到骨折受损部位参与骨修复。
附图说明
图1为ELMO2过表达MSCs的构建及效果验证的实验流程图(泳道1为未融合VP64、p65和Rta的对照质粒载体，泳道2为ELMO2过表达的MSCs)；
图2为ELMO2过表达MSCs的Western blot图；
图3为ELMO2过表达MSCs迁移能力的划痕实验结果(A为转染了未融合VP64、p65和Rta的对照质粒，B为转染了ELMO2过表达质粒的MSCs)；
图4为ELMO2过表达MSCs对TNFα趋化敏感性的transwell结晶紫染色结果(A为转染了未融合VP64、p65和Rta的对照质粒，B为转染了未融合VP64、p65和Rta的对照质粒+TNFα，C为转染了ELMO2过表达质粒的MSCs，D为转染了ELMO2过表达质粒的MSCs+TNFα)；
图5为ELMO2过表达MSCs向TNFα趋化的小动物体内成像图(A为转染了未融合VP64、p65和Rta的对照质粒，B为转染了未融合VP64、p65和Rta的对照质粒+TNFα，C为转染了ELMO2过表达质粒的MSCs，D为转染了ELMO2过表达质粒的MSCs+TNFα)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
实施例1构建稳定过表达ELMO2的MSCs及其应用
按照图1所示的实验流程构建稳定过表达ELMO2的MSCs，并验证其应用效果，具体如下：
(1)构建稳定过表达ELMO2的MSCs
在UCSC网站找到ELMO2(ENST00000396391.5)的TSS上游250bp的碱基序列(SEQ IDNO:1：ATAATAACATACCACACAGCATTGCTGTGTGGATTAAATGAATTAATATATGTAAAGCCCTTAAAATAGTGCCTTAGCATTATGTAATTGCTAGCTAATGTCATCATCTAAGGAAGTATTATATAGAGCGATGAGAACTCGCTTTGGAGTCCTAAGACCTAGGCTTGAGACCCAGTTCTGATGTGTTGGGTTGATTTAGTTTTATTTCTTTTCCCTCCCTTCATTTTTTTTCTTTCCTTCCTTCTTTTAG)，通过sgRNA设计网站(http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)针对上述的TSS上游序列设计sgRNA，以该sgRNA作为将dCas9导向ELMO2 TSS的靶标，设计过程中，通过哈佛大学sgRNA设计网站(http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)预测挑选得分最高的序列(SEQ ID NO:2：AAGGAAAGAAAAAAAATGA)设计得到sgRNA，然后使用工具质粒dSp-VP64-p65-RTA(addgene，#99670)可通过sgRNA的导向作用将其靶标至特定的基因并促进其表达。具体方法为：
将5μg dSp-VP64-p65-RTA质粒，25ng sgRNA与opti-MEM(ThermoFisher，31985070)培养基混合至总体积为150μL，得到预混液1；将辅助转染试剂Lipofectamine3000(ThermalFish，L3000-015)5μL与opti-MEM混合至150μL，得到预混液2；将预混液1和预混液2混合，室温孵育15分钟后将上述的混合液添加到3mL已添加10％FBS的DMEM培养基中，然后加入24h前已种入1×105个MSCs/孔的六孔板里，48小时后，通过质粒所带的嘌呤霉素抗性基因，向培养基中添加嘌呤霉素(1μg/mL)筛选细胞，能存活的MSCs即为质粒转入并正常过表达的MSCs。挑选出嘌呤霉素筛选后的MSCs，用Western blot验证ELMO2的过表达效率(如图2所示)后用于后续试验。
(2)通过划痕实验和transwell结晶紫染色评估过表达ELMO2后MSCs对TNFα趋化作用的反应性
在孔板中央放置划痕实验二孔插件，设置两组，对照组为转染了未融合VP64、p65和Rta的对照质粒(pdCas9，addgene，#46569)的MSCs，实验组为转染了ELMO2过表达质粒的MSCs，在插件两孔中种下细胞，24h后拔出插件，在中央形成划痕，24h后显微镜下拍照观察MSCs向划痕迁移的情况。
往Transwell上室分别种入转染了对照质粒的MSCs和转染了ELMO2过表达质粒的MSCs，同时在Transwell下室设置TNFα刺激组合不加TNFα组，TNFα刺激组下室加入含100ng/mL TNFα的培养基，不加TNFα组加入普通培养基，24h后将上室取出泡入4％多聚甲醛固定15min，用结晶紫染料浸染15min，用PBS浸洗3次，用棉签将上室滤膜上层的染料拭净，在显微镜下拍照观察滤膜下层的MSCs细胞数，对比不同组间MSCs迁移能力的差异。
由图1可观察到过表达ELMO2后的MSCs向中间划痕迁移的数量增多，说明其迁移能力明显增强。图2的结晶紫染色可将transwell上室迁移到膜下层的MSCs显现出来，可观察到TNFα刺激未修饰MSCs迁移到下层增多，提示TNF可趋化MSCs的迁移，而ELMO2过表达后的MSCs不仅可增强MSCs的迁移能力，还能提高MSCs对TNFα趋化作用的敏感性。
(3)通过模型小鼠验证ELMO2过表达MSCs向TNFα趋化的能力
构建pLenti-CBh-3FLAG-luc2-tCMV-mNeonGreen-F2A-Puro过表达荧光素酶的慢病毒【由和元生物技术(上海)股份有限公司进行构建】，以50MOI的病毒量添加至3mL 10％FBS DMEM培养基中，再按5μL/mL培养基的量加入慢病毒辅助转染试剂polybrene(Merckmillipore，TR-1003-G)得到慢病毒培养物，再将慢病毒培养物加入24h前已种入1×105个MSCs/孔的六孔板里，换液48h后同样以嘌呤霉素(1μg/mL)筛选细胞，存活下来的即为过表达荧光素酶的MSCs(即荧光素酶MSCs)，然后按照实施例1的方法构建ELMO2过表达的荧光素酶MSCs，并以ELMO2过表达的荧光素酶MSCs注射裸鼠(中山大学东校区动物实验中心)，将小鼠随机分为等额的四组，分别注射转染了对照质粒Vector(未融合VP64、p65和Rta)的荧光素酶MSCs、注射Vector荧光素酶MSCs同时注射TNFα、注射ELMO2过表达的荧光素酶MSCs、注射ELMO2过表达的荧光素酶MSCs的同时注射TNFα；注射TNFα时，在注射点前后左右5cm处同时注射50μL的100ng的TNFα，通过小动物活体成像仪(品牌：PerKinElmer，型号：IVISSpectrum)观察小鼠体内MSCs的荧光在皮下的扩散范围并评估其对TNFα趋化作用的敏感性。
如图3所示，TNFα对MSCs有趋化作用，在MSCs注射点四个方向同时注射TNFα后MSCs迁移扩散的范围变大；而过表达ELMO2的MSCs对TNFα趋化作用的敏感性更高。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中山大学附属第八医院（深圳福田）
<120> ELMO2过表达间充质干细胞的构建及其在骨折治疗中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ELMO2的TSS上游序列
<400> 1
ataataacat accacacagc attgctgtgt ggattaaatg aattaatata tgtaaagccc 60
ttaaaatagt gccttagcat tatgtaattg ctagctaatg tcatcatcta aggaagtatt 120
atatagagcg atgagaactc gctttggagt cctaagacct aggcttgaga cccagttctg 180
atgtgttggg ttgatttagt tttatttctt ttccctccct tcattttttt tctttccttc 240
cttcttttag 250
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA
<400> 2
aaggaaagaa aaaaaatga 19

Claims (10)

1.一种过表达ELMO2的间充质干细胞的构建方法，其特征在于，根据ELMO2的TSS上游序列设计特异的sgRNA，再通过sgRNA将融合了转录因子VP64、p65激活结构域和Rta的dCas9特异地导向ELMO2的TSS位点，通过转录因子的激活作用促进ELMO2在MSCs中转录，构建得到过表达ELMO2的MSCs，所述ELMO2的TSS上游序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的一种过表达ELMO2的间充质干细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、根据如SEQ ID NO:1所示的ELMO2的TSS上游序列设计特异的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
S2、将dSp-VP64-p65-RTA质粒，sgRNA与opti-MEM培养基混合得到预混液1；
S3、将辅助转染试剂与opti-MEM培养基混合得到预混液2；
S4、将预混液1和预混液2混合后加入细胞培养基中，经室温孵育后将培养基加入培养MSCs细胞的孔板里，48小时后，向培养基中添加嘌呤霉素筛选能存活的MSCs，构建得到过表达ELMO2的MSCs。
3.根据权利要求2所述的一种过表达ELMO2的间充质干细胞的构建方法，其特征在于，所述dSp-VP64-p65-RTA质粒与sgRNA的用量比为：5μg：(20-30)ng。
4.根据权利要求2所述的一种过表达ELMO2的间充质干细胞的构建方法，其特征在于，在预混液1中，所述sgRNA的浓度为(20-30)ng/150μL。
5.根据权利要求2所述的一种过表达ELMO2的间充质干细胞的构建方法，其特征在于，所述预混液1与预混液2的体积比为1:1。
6.根据权利要求2所述的一种过表达ELMO2的间充质干细胞的构建方法，其特征在于，步骤S4中，室温孵育的时长不少于15min。
7.根据权利要求2所述的一种过表达ELMO2的间充质干细胞的构建方法，其特征在于，所述辅助转染试剂与opti-MEM培养基的体积比为1:(25-35)。
8.根据权利要求2所述的一种过表达ELMO2的间充质干细胞的构建方法，其特征在于，所述MSCs细胞的浓度为1×105个/孔。
9.采用权利要求1-8任一项所述的构建方法构建得到的过表达ELMO2的间充质干细胞。
10.权利要求9所述的过表达ELMO2的间充质干细胞在骨折治疗中的应用。
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