WO2008026719A1

WO2008026719A1 - Procédé d'amplification d'acide nucléique

Info

Publication number: WO2008026719A1
Application number: PCT/JP2007/066979
Authority: WO
Inventors: Masafumi Toyama
Original assignee: Toyo Seikan Kaisha, Ltd.
Priority date: 2006-08-31
Filing date: 2007-08-31
Publication date: 2008-03-06
Also published as: KR20090046876A; EP2058396A4; US20100015617A1; EP2058396A1; US7939299B2

Description

明細書

核酸の増幅方法

技術分野

[0001] 本発明は、核酸の増幅方法、特には、特定のプライマーと環状 1本鎖 DNAとの組合せを用いる核酸の増幅方法、前記方法を利用して標的遺伝子の存在の有無を検出する方法及び前記方法に使用する検出用キットに関するものである。

背景技術

[0002] 現在、研究機関、医療機関、検査機関その他様々な現場にお!/、て、標的遺伝子の特異的な塩基配列に基づく分析 '検出方法が数多く用いられている。例えば、ヒト '動物など生体由来の試料 (体液や細胞片）や環境由来の試料に含まれる病原菌、カビ、ダニなどのアレルゲンといった病原性の微生物 ·微小動物、ウィルスや花粉などの存在を分析 ·検出する場合にも、それらの検出対象が有する標的遺伝子の特異的な塩基配列を検出する方法が用いられている。これら核酸 (DNA、 RNA)を検出する方法は、タンパク質を検出する方法と比較して、短時間且つ高感度で行うことができる。また、試料中に本来含まれる核酸の量が検出限界以下であっても、無細胞系を用いて比較的簡単に且つ特異的に増幅することができる。これらの利点から、核酸を増幅する方法を利用して、あるいは核酸を増幅する方法と組合せて、標的遺伝子の特異的な塩基配列を検出する方法が数多く開発されている。

現在、最も一般的に使用されている核酸の増幅手法としては、温度サイクルを利用して铸型の変性、铸型へのプライマーのアニーリング、 DNAポリメラーゼ伸長反応のサイクルを数十回行い、プライマー対によって挟まれる領域の核酸を増幅する PCR 法が挙げられる。しかし、温度サイクルを利用して核酸を増幅する方法では、温度サイタルを制御するための機器 (サーマルサイクラ一など）が高価であることや、核酸の増幅に最適な温度サイクルの検討'設定などが必要とされる。

よって近年、温度サイクルを利用せずに一定温度条件下で DNAポリメラーゼ伸長反応を進行させる核酸増幅方法が考えられてきた。その代表的なものが LAMP (Loo p-Mediated Isothermal Amplification)法である（特許文献 1)。 LAMP法では、標的遺伝子の 6つの領域に対して、合成される DNA鎖の 3'末端が常にループを形成して次の DNA増幅反応の複製起点となるような、 4つのプライマーを設計して用い、標的遺伝子の核酸分子を増幅させて!/、る。

また、特許文献 2では、標的遺伝子中の 2箇所の不連続な隣接領域に相補的な塩基配列を 5'末端及び 3'末端に有し且つ標的遺伝子に相補的でないリンカ一領域を有する直鎖 DNA分子をプローブとして設計し、標的遺伝子に対して前記プローブをループ状にハイブリダィズさせ並置する 5'末端と 3'末端との間をリガーゼで連結して環状化させ、前記リンカ一領域に相補的なプライマーを用いて、環状化した前記プローブの塩基配列を増幅する方法について記載する。

しかしながら、これら既存の方法にはコスト、検出方法の設計及び操作、検出感度といった点において課題も残されており、これらの課題を充分に満足する新たな核酸増幅方法及び検出方法が必要とされて!/、る。

[0003] 特許文献 1：国際公開第 2000/28082号パンフレット

特許文献 2：特表 2005— 508599号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 本発明の目的は、特定の塩基配列を有する核酸を簡便に且つ短時間で効率的に増幅させることができる、新規な原理に基づく核酸の増幅方法を提供することである

〇

また本発明の目的は、前記増幅方法を利用して、試料中の標的遺伝子の存在の有無を迅速且つ明確に検出することができる、高感度な検出方法を提供することである。

また本発明の更なる目的は、これらの方法に有用な特定のプライマーと環状 1本鎖 DNAとの組合せを含む、核酸増幅用キット及び検出用キットを提供することである。また本発明の更なる目的は、前記環状 1本鎖 DNAを 1本鎖 DNA断片から簡便に、かつ高収率で製造する方法を提供することである。

課題を解決するための手段

[0005] 本発明者は、特異的塩基配列を有する铸型核酸分子に対して、前記塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーと、前記プライマーと同一の塩基配列を含む環状 1本鎖 DNAとの組合せを用いて DNAポリメラーゼ伸長反応を連鎖的に行うことにより、周期的な温度制御の必要なぐ簡便且つ短時間の操作で、前記特異的な塩基配列の核酸を効率的に増幅させることができることを見出した。

また本発明者は、上述する核酸の増幅方法を利用して、試料中の標的遺伝子の有無、特には、生体又は環境に由来する試料中のアレルゲン、ウィルス、病原菌等といつた微生物の存在の有無を、迅速且つ高感度に検出できることを見出した。

これらの方法、及びこれらの方法に有用なキットは、具体的には以下の通りである。

[0006] 本発明の核酸の増幅方法は、

(a)増幅対象の塩基配列を含む DNAを铸型とし、前記塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマー対を用いて DNAポリメラーゼ伸長反応を行って、直鎖状 DNA 断片を得ること；及び

(b)前記プライマー対の少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状 1本鎖 DNAを铸型とし、（a)により得られた直鎖状 DNA断片の 3'末端を複製起点として、鎖置換型 DNAポリメラーゼ伸長反応を連鎖的に行うこと；

を含むことを特徴とする。

(a)と (b)とは、使用する鎖置換型 DNAポリメラーゼが活性を有する温度で行われる、好ましくは、（a)と (b)とを同一温度条件下で行う。

また、好ましくは、増幅対象の塩基配列を含む DNAが、 RNAを铸型とする逆転写によって得られた DNA鎖を含むものである。

[0007] 本発明の核酸の増幅方法に有用なキットは、

(i)増幅対象の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマー対；

(ii)前記プライマー対の少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状 1本鎖 DNA;

(iii)鎖置換型 DNAポリメラーゼ；

(iv) dNTP；

を含む、核酸増幅用キットである。

[0008] 本発明の 2本鎖の標的核酸分子を検出する方法は、

(a)標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配歹 IJを有するプライマー対、前記プライマー対の少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状 1本鎖 DNA、鎖置換型 DNAポリメラーゼ及び dNTPを、検出対象の試料に添加して、前記鎖置換型 DNAポリメラーゼが活性を有する温度にて酵素反応させること；

(b)酵素反応させた試料中で、核酸が増幅されたか否かを確認すること；及び

(c)核酸が増幅された場合に、検出対象の試料中に 2本鎖の標的核酸分子が存在すると決定すること；

を含む。

[0009] 本発明の 1本鎖の標的核酸分子を検出する方法は、

(a)標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配歹 IJを有するプライマー、標的核酸分子の前記標的塩基配列の領域と別の領域の標的塩基配列を有するブライマ一、これらのプライマーの少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状 1本鎖 D NA、逆転写酵素、鎖置換型 DNAポリメラーゼ及び dNTPを、検出対象の試料に添加して、前記鎖置換型 DNAポリメラーゼが活性を有する温度にて酵素反応させること；

(d)核酸が増幅された場合に、検出対象の試料中に 1本鎖の標的核酸分子が存在すると決定すること；

を含む。

[0010] 本発明の 2本鎖の標的核酸分子を検出する方法に有用なキットは、

(i) 2本鎖の標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配歹 IJを有するブライマ一対；

(iii)鎖置換型 DNAポリメラーゼ；及び

(iv) dNTP；

を含む、 2本鎖の標的核酸分子の検出用キットである。

[0011] 本発明の 1本鎖の標的核酸分子を検出する方法に有用なキットは、

(i)l本鎖の標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配歹 IJを有するブライマ一 (ii)標的核酸分子の前記標的塩基配列の領域と異なる領域の標的塩基配列を有す

(iiiXi)及び (ii)のプライマーの少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状 1本鎖 D NA ;

(iv)鎖置換型 DNAポリメラーゼ；及び

(v) dNTP；

を含む、 1本鎖の標的核酸分子の検出用キットである。

好ましくは、（vi)逆転写酵素を更に含む、前記検出用キットである。

[0012] 本発明はまた、環状 1本鎖 DNAの製造方法であって、

a)直鎖状 1本鎖 DNAと、前記直鎖状 1本鎖 DNAの 5 '末端領域および 3 '末端領域の相補配列を隣接して有するアダプターポリヌクレオチドと、耐熱性リガーゼとを含む反応混合物を調製する工程、

b)直鎖状 1本鎖 DNAとアダプターポリヌクレオチドの相補配列を結合させることにより、前記直鎖状 1本鎖 DNAの 5 '末端と 3 '末端とを隣接させる工程、

c)前記直鎖状 1本鎖 DNAの 5 '末端と 3 '末端とを連結する工程、

d)環状化された 1本鎖 DNAとアダプターポリヌクレオチドを解離させる工程、を含む、前記製造方法を提供する。

発明の効果

[0013] 本発明は、新規で効率的な核酸増幅方法を提供する。

また本発明は、前記核酸増幅方法を利用して標的遺伝子の有無を検出する、簡易的且つ迅速な検出方法を提供する。この検出方法を用いることにより、病原性微生物やウィルスその他に特異的な標的遺伝子を簡易的な操作で迅速且つ明確に検出すること力 Sでさる。

また本発明は、これらの方法に有用な、プライマーと環状 1本鎖 DNAとの組合せを提供する。

また本発明は、耐熱性 DNAリガーゼを使用して環状 1本鎖 DNAを製造する方法を提供するものであり、同一酵素反応混合物内で反復してライゲーシヨン反応を行うことにより、直鎖状 1本鎖 DNAから環状 1本鎖 DNAを高収率で合成することが可能である。

発明を実施するための最良の形態

[0014] 本発明の核酸増幅方法においては、 DNAポリメラーゼ伸長反応によって、増幅対象とする塩基配列を 1回又は複数回反復して含む多様な鎖長の増幅産物が得られ、これらの増幅産物が铸型又は複製起点として役割を果たす更なる DNAポリメラーゼ伸長反応が連鎖的に進行して、増幅対象とする塩基配列を効率的に増幅することができる。

本発明の増幅対象の塩基配歹 I] (本明細書中では「標的塩基配列」とも呼ぶ）を含む铸型 DNAは 1本鎖又は 2本鎖の直鎖状又は環状の DNAであり、この铸型 DNA中に含まれる増幅対象の塩基配列は、铸型 DNA中において特異的な領域の塩基配列である。また、本発明の方法は、逆転写酵素を用いて RNA分子に相補的な塩基配列を合成した cDNAを铸型 DNAとして行うこともできる。この場合には、本発明の増幅対象の塩基配列は、 RNA分子中ゥラシル (U)であった塩基がチミン (T)に置き換わった塩基配列である。

[0015] 本発明の増幅方法に用いるプライマー対は、铸型 DNA中の増幅対象の標的塩基配列に相補的な塩基配列を有するものであり、铸型 DNAに基づいて、プライマー対に挟まれた領域 (プライマー対の塩基配列を含む）を直鎖状 DNA断片として得ることができるものであればよい。よって、铸型 DNAが 2本鎖の DNAである場合には、プライマ一対の各プライマーは、別々の鎖上の標的塩基配列を有する。铸型 DNAが 1本鎖の DNAである場合には、プライマー対のうち一方のプライマーは、铸型 DNA鎖上に存在する増幅対象の塩基配列とは異なる領域の標的塩基配列を有する。

本発明の方法は、少なくとも 1つのプライマー対を用いて行うことができ、複数のプライマー対を用いる場合、その数に上限はないが、例えば入れ子として設計して用いることもできる。例えば 1〜5対、好ましくは 1〜3対、より好ましくは 2〜3対、特に好ましくは 2対である。

各プライマーは、対をなすプライマーや他のプライマー対のプライマーと同一の配列や相補的な配列を有してレ、なレ、方が好ましレ、。

対をなすプライマーが結合する領域間の相対距離 (塩基数）は、本発明の反応が進行するのであれば特に制限はないが、最も内側のプライマー対のプライマーが結合する領域間の相対距離はより少なレ、方が好ましく、その外側のプライマー対と隣接する内側のプライマー対とが結合する領域間の相対距離もより少な!/、方が好ましレ、。上記相対距離 (塩基数）は、好ましくは Ob〜lkbであり、より好ましくは 0〜； 100bであ本発明に使用するプライマーとしては、铸型 DNAと相補的な 2重鎖を形成し得るのであれば特に制限はないが、 8〜40merのものが好ましぐより好ましくは 16〜25mer のものである。また、铸型 DNA (標的塩基配歹 IJ)又はプライマーの GC含量、二次構造のとり易さ等、その他プライマー設計において一般的に考慮される性質についても、当業者の技術常識の範囲内のものである。このようなプライマーの設計及び合成は、本技術分野で通常用いられている設計プログラム等の手法を用いて行うことができ逆転写酵素を用いて RNA分子中の塩基配列を合成した cDNAを铸型 DNAとして用いる場合も、同様に、該 RNA分子が 2本鎖である力、 1本鎖であるかに応じて、上述のようにプライマー対を設計することができる。

本発明の方法で使用する環状 1本鎖 DNAは、プライマー対の少なくとも一方のプライマーと同一の塩基配列を少なくとも 1つ含むものであり、その少なくとも一方のプライマーと同一の塩基配列とは、増幅対象の塩基配列と相補的な塩基配列を有するものである。

環状 1本鎖 DNAは、 1つのプライマーと同一の塩基配列が一定の間隔で反復して複数含まれるように設計されてもよぐまた異なる複数のプライマーと同一の塩基配列が 1回又は複数回反復して含まれてレ、てもよ!/、。複数のプライマー対を用いる場合、環状 1本鎖 DNAに含まれる塩基配列は、最も内側に用いたプライマー対の塩基配列の少なくとも一方と同一であるのが好ましい。

環状 1本鎖 DNA中、プライマーと同一の塩基配列以外の領域の塩基配列は、本発明が特異的に反応するのであれば特に制限はないが、少ない方が好ましい。また、 3'→5 'ェキソヌクレアーゼ活性を持たない鎖置換型 DNAポリメラーゼを使用する場合、プライマーと同一の塩基配列の 5'側にチミン (T)を 1塩基付加することが好ましい環状 1本鎖 DNAの鎖長は、本発明が特異的に反応するのであれば特に制限はないが、 16b〜； !Okbのものが好ましぐより好ましくは 20〜； 100bである。このような環状 1本鎖 DNAの設計及び合成は、本技術分野で通常用いられて!/、る設計プログラム等の手法を用いて行うことができる。また、環状 1本鎖 DNAは後述の環状 1本鎖 DN Aの製造方法により製造することも可能である。

本発明の方法で使用する DNAポリメラーゼは鎖置換型 5'_3'DNAポリメラーゼ活性を有するものであり、塩基対の相補鎖を正しく合成するものが好ましい。また 3'→5' ェキソヌクレアゼ活十生は持って!/、ても良レ、が持って!/、な!/、ものが好ましく、 5'→3 'ェキソヌクレアーゼ活性は持たないものが好ましい。 DNAポリメラーゼの至適温度は、 50〜90°Cであるのが好ましぐより好ましくは 60〜72°Cである。このような DNAポリメラーゼとしては、列えば Bacillus stearothermophilus由来の Bst DNA Polymerase lar ge fragment Pyrococcus属細菌由来の Deep Vent (exo— ) DNA polymerase(New E

R

ngland Biolabs Incorporation製)、 Herculase^(R)II Fusion DNA polumerase (STRATAGE NE社製)、 Thermococcus属由来の Vent (exo—) DNA Polymerase、 Therminator

R

DNA Polymerase 、 Therminator il DNA Polymerase (New England Biolabs Incorpor ation製）、 KOD Dash DNA polymerase (東洋紡社製)といったものが、単独で、あるいはキットの形態で入手可能である。互いの酵素活性を妨げない限りは、 2種類以上の DNAポリメラーゼを併用することもできる。

DNAポリメラーゼによる伸長反応は、一般的な核酸増幅に使用されるバッファー ( Tris-HCU KC1、 (NH ) SO 、 MgSOなどの塩類を含む）、例えば使用する DNAポリメ

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ラーゼに付属の最適化された組成のものを用いてもよ!/、。

上述するような適切なバッファーに、铸型 DNA、本発明のプライマー対、本発明の環状 1本鎖 DNA、鎖置換型 DNAポリメラーゼ及び基質となる 4種のデォキシリボヌクレオシド 3リン酸（dNTP : dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP)を添加し、この反応溶液を鎖置換型 DNAポリメラーゼが該酵素活性を有する温度、例えば 50〜90°C、好ましくは 60〜72°Cに保つことによって、温度サイクル制御なしに同一容器内で 1回の操作にて核酸を効率的に増幅することができる。また、複数のプライマー対を用いる場合は、本発明の反応温度条件をさらに低い条件、例えば 30〜50°Cに設定することができる。 DNAポリメラーゼ伸長反応の温度条件は、用いる鎖置換型 DNAポリメラーゼの活性を有する温度に依存する。使用する鎖置換型 DNAポリメラーゼが該酵素活性を有する温度の範囲内であれば、必ずしも増幅反応全体を通して同一温度（等温)を保たなくてもよレ、が、増幅反応全体を通して同一温度（等温）に保つこと（同一温度条件下)が好ましい。

核酸の増幅は、 DNAポリメラーゼ伸長反応で核酸が増幅される際に反応溶液中で生成するピロリン酸マグネシウムの沈殿によって確認することができる（国際公開第 2 001/083817号パンフレット）。また、本技術分野で通常使用される核酸染色蛍光色素など、例えばェチジゥムブ口ミドゃ SYBR Green I(CAMBREX社製)等を常法に従つて用いて、蛍光の有無や強度により、核酸の増幅を確認することもできる。

次に、図面を用いて、本発明の核酸の増幅方法の態様を具体的に説明する。まず、第一段階で、増幅対象の特異的な塩基配列を含む铸型 DNAとプライマー対との DNAポリメラーゼ伸長反応によって、直鎖状 DNA断片が得られる（図 1)。

2本鎖の铸型 DNA中の 2つの特異的な塩基配列の領域 A、 Bを増幅対象とする場合、各領域の一方の鎖上の配列を A1及び Bl、他方の鎖上の配列を A2及び B2と規定する。プライマー対のうち、一方のプライマーは A1と相補的な塩基配歹 1]、すなわち A2の塩基配列を有するように設計し、他方のプライマーは B2と相補的な塩基配歹 IJ、すなわち B1を有するように設計する（図 1、（i))。

このプライマー対と前記铸型 DNAとの DNAポリメラーゼ伸長反応によって、 5'末端に A2と同一の塩基配列を有し 3'末端に B2と同一の塩基配列を有する直鎖状 DN A断片と、 5'末端に B1と同一の塩基配列を有し 3'末端に A1と同一の塩基配列を有する直鎖状 DNA断片との組合せが得られる。この得られた直鎖状 DNA断片力第二段階が開始される際の複製起点となる（図 1、（ii))。

第二段階で铸型となる環状 1本鎖 DNAは、プライマー対の少なくとも一方と同一の塩基配列 (A2及び/又は B1)を含むように設計する（図 2、（i))。図 2では、 A2及び B 1の各々と同一の塩基配列を含む環状 1本鎖 DNAを示している。上述するように、得られる直鎖状 DNA断片は各々 3'末端にプライマー対と相補的な塩基配列 (A1又は B2)を有するため、その直鎖状 DNA断片の 3'末端領域 (Al、 B2)力環状 1本鎖 D NA中のプライマー対と同一の塩基配列 (A2、 B1)領域に対してァニールして複製起点となり、環状 1本鎖 DNAを铸型として DNAポリメラーゼ伸長反応が起こる（図 2、 (i)) o合成された DNA鎖は、鎖置換型 DNAポリメラーゼによって剥されながらローリングサークル様に伸長する（図 2、（ii))。その剥されて伸長する DNA鎖に対して、反応溶液中に存在するプライマーがァニールして複製起点となって DNAポリメラーゼ伸長反応が起こり（図 2、（iii))、前記プライマーを複製起点として合成し剥された DN A鎖は、反応溶液中に存在するプライマー又は環状 1本鎖 DNAに対してァニールして DNAポリメラーゼ伸長反応が起こる（図 2、（iv))。

上で説明する第一段階の過程と第二段階の過程は、一旦、第二段階を開始する引き金となる直鎖状 DNA断片が合成された後は並列して同時進行する。また、このように連鎖的な増幅反応が進行し、結果として、増幅対象の特異的な塩基配列を 1回又は複数回反復して含む、多様な鎖長の DNA鎖が合成される。

[0019] 本発明の別の態様は、上述の核酸増幅方法の原理を利用する、標的遺伝子の検出方法である。本検出方法は、検出目的、検出対象の試料の由来、標的遺伝子などに応じて、多様な産業にお!/、て様々な場面で行うことができる。

標的遺伝子が検出される試料としては、例えば、ヒトその他動物由来の体液や組織片から調製したものであってもよぐ環境由来の土壌や海水、植物から調製したものであってもよく、工場で製造'加工された飲料や食料品、医薬品などであってもよい。これらは、直接、あるいは必要に応じて、適当な操作を用いて核酸 (DNA, RNA)抽出液として調製して、検出対象の試料として本発明の検出方法に用いることができる。このような試料の調製は、一般的な核酸検出方法に使用される通常の手法に従つて fiうこと力 Sできる。

標的遺伝子は、微生物（細菌、カビなど）、アレルゲン (例えばダニ、花粉など）、ゥィルスに特異的なものでもよぐまたヒトその他動物のゲノム中の野生型又は変異型の遺伝子であってもよい。

[0020] 本検出方法は、上述の核酸増幅方法の「铸型 DNA」及び「増幅対象の塩基配列」を、それぞれ本検出方法の「標的核酸分子 (すなわち標的遺伝子） J及び「標的遺伝子中の標的塩基配列」と置き換え、試料中に標的核酸分子 (すなわち標的遺伝子）が存在する場合には、上述の核酸増幅方法と同様の原理によって、標的遺伝子中の標的塩基配列の核酸が増幅されることを利用したものである。

2本鎖の標的核酸分子を検出する場合には、

(c)核酸が増幅された場合に、検出対象の試料中に 2本鎖の標的核酸分子が存在すると決定すること；によって、標的核酸分子を検出することができる。

1本鎖の標的核酸分子を検出する場合には、 2本鎖の標的核酸分子を検出する場合における「標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプライマー対」及び「前記プライマー対の少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状 1本鎖 DNA」は、それぞれ「標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプライマーと、標的核酸分子の前記標的塩基配列の領域と異なる領域の標的塩基配列を有するプライマーとの組合せ」及び「これらのプライマーの少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状 1本鎖 DNA」に置き換えて、標的核酸分子が 2 本鎖の場合と同様の操作により 1本鎖の標的核酸分子を検出することができる。標的核酸分子が RNAの場合には、上記 (a)の酵素反応の工程において、更に逆転写酵素 (RNA依存性 DNAポリメラーゼ）を試料に添加して酵素反応させることにより、上述の核酸増幅方法と同様、試料中の RNA分子に対して合成される cDNA鎖を铸型として核酸が増幅されるか否かを確認し、核酸が増幅された場合には標的 RNA 分子が存在すると決定することによって、標的 RNA分子の存在を検出することができ核酸の増幅は、上述と同様に、ピロリン酸マグネシウムの沈殿や、本技術分野で通常使用される核酸染色蛍光色素などを用いて、沈殿や蛍光の有無を指標として確認すること力 Sできる。また、ピロリン酸マグネシウムの生成量や蛍光の強度を指標として、検出対象の試料中に存在する標的遺伝子の核酸量の多少について比較することもできる。

このようにして、本検出方法を用いることにより、試料中に存在する標的遺伝子の核酸がごく微量であっても、同一の反応容器内で 1回の操作にて、標的遺伝子中の特異的塩基配列を効率的に増幅して検出することができる。本検出方法は、例えばマイク口チューブ、マイクロウェルプレート、マイクロチップなどの反応容器内で行ってもよぐまた HTS (High-Throughput Screening)などの技術を用いてもよい。

[0022] 本発明の環状 1本鎖 DNAの製造方法では、工程 a)において、直鎖状 1本鎖 DNA および前記直鎖状 1本鎖 DNAと相補的な配列を有するアダプターポリヌクレオチドおよび耐熱性リガーゼを含む反応混合物が調製される。

環状化に用いられる直鎖状 1本鎖 DNAの塩基の種類や数には特に制限はなぐ実際の細胞から単離されたゲノム配列でも、人工的に合成されたポリヌクレオチド配列であってもよぐ一般に環状化し得るに十分な数の塩基があればよぐ例えば少なくとも 20塩基以上、好ましくは 20〜200塩基、より好ましくは 30〜80塩基である。用いる耐熱性 DNAリガーゼに依存する力環状化に用いられる直鎖状 1本鎖 DNA が人工的に合成されたポリヌクレオチドの場合、 5'末端をリン酸化している方が望ましいが、リン酸化しなくても良い。また、その他の修飾はしない方が望ましい。

[0023] また、アダプターポリヌクレオチドは、前記直鎖状 1本鎖 DNAの 5'末端領域および

3'末端領域の相補配列を有し、具体的には、前記直鎖状 1本鎖 DNAの 5'末端領域および 3'末端領域の各相補配列を隣接して有する。本発明において、「5'末端領域」、「3'末端領域」とは、それぞれ直鎖状 1本鎖 DNAの 5'末端、 3'末端の最末端塩基を含む領域を意味し、その領域の長さは一般にポリヌクレオチドのアニーリングを行うために必要な値で当業者が設定することができる。例えば 5〜20塩基が適当であり、アダプターポリヌクレオチドの合成を考慮すると、 5'末端領域と 3'末端領域の合計で 15〜30塩基程度であることが好ましい。

[0024] 本発明の環状 1本鎖 DNAの製造方法において、「（5'末端領域および 3'末端領域の）相補配列」は、直鎖状 1本鎖 DNAの 5'末端および 3'末端の各領域の配列と完全に相補的な配列であることが好ましレ、が、前記直鎖状 1本鎖 DNAとのァニーリングが可能な限りにお!/、てミスマッチの塩基対を有して!/、てもよ!/、。そのような塩基対の数は反応条件や全体の領域の長さに依存するが、例えば各領域に 1個、 2個、 3個等、または各領域の全塩基の 1 %〜50%程度であり得る。ただし、当業者に理解されるように、ライゲーシヨンを効率的に行うためには、環状化の際に実際にリガーゼによる連結反応が行われる 5 '末端と 3 '末端の塩基は、それぞれアダプターの塩基と塩基対を形成してレ、ることが好ましレ、。

本発明のアダプターポリヌクレオチドは、上に説明した 5 '末端領域に相補的な配列と 3 '末端領域に相補的な配列を隣接して有する。ここで、「隣接する」とは、 5 '側から前記 5 '末端相補配列、次いで 3 '末端相補配列が、間に塩基を挟むことなく連続していることを意味する。このようなアダプターポリヌクレオチドは、図 6に示すように、直鎖状 1本鎖 DNAとアニーリングすることにより前記直鎖状 1本鎖 DNAを環状に配置させること力 S可倉となる。

本発明の環状 1本鎖 DNAの製造方法においては、直鎖状 1本鎖 DNAを環状化するためのライゲーシヨン反応に耐熱性 DNAリガーゼが使用される。耐熱性 DNAリガーゼとは、隣接した DNA鎖の 5 '末端と 3 '末端をホスホジエステル結合で連結する酵素であって、 2本鎖 DNAを 1本鎖 DNAに解離させるような高温（DNA解離温度）、例えば 80〜； 100°C、好ましくは 90〜95°Cでも実質的に活性を失わない酵素を意味する。例えば、一般的に解離温度として使用される 95〜； 100°Cに 30分〜 1時間程度さらしても 30%以上、好ましくは 50%以上の酵素活性を維持するようなリガーゼが挙げられ、一般に LCR反応への使用に適したものとして市販されるリガーゼであれば「耐熱性 DNAリガーゼ」に含まれると理解される。耐熱性 DNAリガーゼは、一般に高温環境に生息するパイロコッカス'フリオサス (Pyrococcus ibriosus)ゃァエロパイラム 'へノレニックス (Aeropyrum pemix八サーモコッ刀ス属 ( i，hermococcus spjなとの超好熱性菌ゃサ一マス'アクアティカス（Thermus aquaticus)などの高度好熱性菌から単離されるが、耐熱性をさらに高めるために組み換えが行われているものも本発明の方法に使用し得る。具体的には、（Stratagene社製の Pib DNAリガーゼや Epicentre 社製の Ampligase DNAリガーゼ、和光純薬工業社製耐熱性 DNAリガーゼ、 New Engl and Biolabs社製の 9° N^th DNA Ligase、 Taq DNA Ligase)などが挙げられる。 [0026] 本発明の環状 1本鎖 DNAの製造方法において、工程 a)で調製される反応混合物は、上記の直鎖状 1本鎖 DNA、アダプターポリヌクレオチド、耐熱性 DNAリガーゼを含む。これらの濃度、存在比率は当該分野の技術常識に基づいて適宜決定することカできる。直鎖状l本鎖DNAの濃度は例ぇばl〜100 _ί mol/l、好ましくは 20〜80 m ol/l、より好ましくは 40〜60 01₀1/1であり、アダプターポリヌクレオチドの濃度は例えば 0.05〜50 mol/l、好ましくは 1〜40 mol/l、より好ましくは 3〜12 mol/1などである力これらの範囲に限定されるものではない。また、好ましい直鎖状 1本鎖 DNAとァダブターポリヌクレオチドとのモル比は後述するライゲーシヨン反応の繰り返し回数などにより変動するが、例えば 100: 1〜1:5、好ましくは 50: 1〜1: 1、より好ましくは 20: 1〜4 : 1である。

なお、本発明の環状 1本鎖 DNAの製造方法では、後述するようにアダプターポリヌクレオチドは環状化した 1本鎖 DNAから解離して再利用することができるため、当初の反応混合物中にアダプターポリヌクレオチドが直鎖状 1本鎖 DNAよりも低い割合（例えば上に示したようなモル比 20: 1など）でしか存在しない場合であっても効率的に環状 1本鎖 DNAを製造することができる。

[0027] 耐熱性 DNAリガーゼの添加量は、例えば市販のものを使用する場合は、反応混合物中の DNAの濃度や量に基づいて製造者の指示に従って好ましい値を決定し得る。

また、工程 a)で調製される反応混合物はさらに、ライゲーシヨン反応に必要な様々な物質を含んでもよい。一般に、使用するリガーゼの種類に応じて反応バッファーの組成が決定される力、例えば Tris-HCl(pH 7.5), KC1、 MgCl、 ATP、 NAD(P)、 DTTなどを適切な濃度で含むことができる。実際には、市販のリガーゼに添付される反応バッファーを製造者の指示に従って使用すれば十分である。

[0028] 上記工程 a)で直鎖状 1本鎖 DNA、アダプターポリヌクレオチドおよび耐熱性 DNAリガーゼを含む反応混合物を調製した後、工程 b)から d)で、それぞれ直鎖状 1本鎖 D NAとアダプターポリヌクレオチドの結合（アニーリング）、ライゲーシヨン反応による環状化、熱変性による環状化一本鎖 DNAとアダプターポリヌクレオチドへの分離を行うことにより、環状一本鎖 DNAが製造される（図 6参照）。 [0029] より詳細には、工程 b)では、直鎖状 1本鎖 DNAとアダプターポリヌクレオチドの相補配列を結合させることにより、前記直鎖状 1本鎖 DNAの 5'末端と 3'末端とを隣接させる。直鎖状 1本鎖 DNAとアダプターポリヌクレオチドとの結合（アニーリング）は、反応混合物を適当な温度に置くことにより行われ、その温度は例えば 55〜65°C、好ましくは 60°Cである力当業者の理解するようにアダプターポリヌクレオチドの長さや T m 値によって適切な値は変動するため、適宜調整することが可能である。反応時間も同様にポリヌクレオチドの長さや反応温度との関係で任意に設定することができる。例えば 1秒から 3分まで、好ましくは 5秒から 1分まで、より好ましくは 10秒である力反応混合物が実質的に設定温度に到達していれば十分であり、より長い時間設定とすることも可倉である。

この工程 b)において直鎖状 1本鎖 DNAとアダプターポリヌクレオチドの相補配列が結合する際に直鎖状 1本鎖 DNAが曲がって 5'末端と 3'末端が隣接 ·接近した構造となるため、次の工程 c)において環状化（ライゲーシヨン反応）を効率的に行うことが可能となる。

[0030] 工程 c)では、前記直鎖状 1本鎖 DNAの 5'末端と 3'末端とを連結させる。すなわち、反応混合物を適切な温度に一定時間置くことにより、反応混合物中に含まれる DN Aリガーゼが作用して直鎖状 1本鎖 DNAの 5'末端と 3'末端を連結させる。反応温度は使用する耐熱性 DNAリガーゼの至適温度に設定することが好ましいが、当該リガーゼが活性を有する温度の範囲内で自由に設定することができる。例えば和光純薬工業社製耐熱性 DNAリガーゼを使用する場合、 60〜90°C、好ましくは 70°Cに設定される。適切な反応時間はリガーゼの種類や酵素量などに依存し、例えば 5〜30 分、好ましくは 10分である。

[0031] 工程 d)では、環状化された 1本鎖 DNAとアダプターポリヌクレオチドを解離させる。

即ち、反応混合物の DNAの解離温度（高温）に置くことにより、工程 c)が終了した時点で結合して!/、る環状 1本鎖 DNAとアダプターポリヌクレオチドを解離させる。反応温度は一般に使用される DNA解離温度であればよぐ例えば 90〜100°C、好ましくは 93〜98°C、例えば 95°Cに設定される。また、反応時間は例えば 1秒〜 1分、好ましくは 5〜30秒、より好ましくは 10秒に設定することができる。この工程によってァダプターポリヌクレオチドが当初の 1本鎖の状態に戻るため、後述するように再び工程 b) に戻って、環状化されずに残っている 1本鎖 DNAとの結合に再利用することが可能となる。

[0032] 好ましくは、本発明の環状 1本鎖 DNAの製造方法においては工程 b)から d)の一連の操作 (以下、サイクルとも表す）が反復して行われる。工程 b)から d)のサイクルを繰り返して、アダプターポリヌクレオチドを繰り返し利用しつつ直鎖状 1本鎖 DNAを次々と環状化させることにより、高収率で環状化 1本鎖 DNAを製造することが可能となる。反復回数は例えば少なくとも 2回、好ましくは 10回以上、より好ましくは 25回以上であり、直鎖状 1本鎖 DNAの枯渴、リガーゼ活性の低下、必要とする環状化 1本鎖 DN Aの収量などを考慮して当業者が適当な回数を決定することができる。

[0033] なお、本発明の環状 1本鎖 DNAの製造方法は、当該技術分野の技術常識に基づいて様々に変更、改良された方法をも包含する。例えば、工程 b)から d)を反復して行う場合、最初と最後を除く途中の各サイクルが工程 b)、 c)、 d)を含み、かっこの順で実施されればよぐ特に最初と最後のサイクルでは、環状 1本鎖 DNAを適切に製造するための手段を取り得ることを当業者は容易に理解する。

例えば、一般に、反応を開始した直後は反応混合物を解離温度に上げて非特異的なアニーリングを防止することが好ましい。本発明においては、例えば 95°Cで 2分間処理される。また、最後のサイクルでは工程 c)で反応混合物をライゲーシヨン温度に置!/、た後で、反応混合物をそれまでとは異なった解離条件で処理して (例えば 98 °Cで 2分間）環状 1本鎖 DNAとアダプターポリヌクレオチドを解離させてもよい。さらに、その後 4°Cに急冷して反応を終了させてもよい。

その他、サイクル毎に温度や時間の設定の変更や、工程 b)と c)を同一条件で一括して行うことなどの変更も可能である。

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例

[0034] 薬品名後に会社名を記していないものは、和光純薬工業社製である。また、特別に記さない限り、溶媒は水である。

(TEバッファー組成） 4mmol/l Tris— HC1 (トリス-ヒドロキシメチル-アミノメタン）塩酸

lmmol/1 エチレンジァミン四酢酸 2ナトリウム 2水和物（EDTA)

pH8. 0に調整

(1. 2 %TAE電気泳動用ゲル）

1. 2%ァガロース

4mmol/l Tris— HC1

lmmol/1 EDTA

lmmol/1 酢酸

(2. 0%TAE電気泳動用ゲル）

2. 0%ァガロース

4mmol/l Tris— HC1

lmmol/1 EDTA

lmmol/1 酢酸

[0035] 例 1

[標的の調製方法]

下記に示す酵素製品、 Kit製品は、特別に記さない限り取扱説明書に従った。 pUC 19 (タカラバイオ社）を制限酵素 Dral (タカラバイオ社）処理後、 1. 2%TAE電気泳動用ゲルを使用し、電気泳動漕である Mupid-ex (アドバンス社)を用いて電気泳動（100V、 50分）を行った。

その後、核酸染色試薬 SYBR GreenI (CAMBREX社製）で染色、ゲルからの目的 D NA断片（約 2kb)の切り出し、 DNA抽出キット NucleoSpin Extract Kit (MACHEREY- NAGEL社)を用いて回収し、標的調製液（lOmmol/1)とした。

[0036] [環状 1本鎖 DNAの合成]

環状 1本鎖 DNAの合成に用いたプライマーを表 1に記す。 43Cは、 5'末端にリン酸化修飾し、 Bindは、カートリッジ精製を行っている（Invitrogen社製）。

表 i ：環状 1 本鎖 D N Aの合成に用いたプライマー配列

名前配列 ( 5 ' 3 ' )

4 3 C ACAGCTATGACTCGACGTTGTAAAACGACGGCTCACACAGGAA

B i nd GTCATAGCTGTTTCCTGTGTG 表 1のプライマー 2本（43C : 75nmol/l Bind : 1.6nmol/l)と耐熱性の DNA連結酵素（耐熱性リガーゼ）を混合し、下記に示した温度で酵素反応を行った。

95°C 2分間工程 1

95°C 10秒間工程 2

60°C 10秒間工程 3 工程 2 4を 25サイクル

70°C 10分間工程 4

98°C 2分間工程 5

4 C 工程 6

反応終了後、 Genとるくん（タカラバイオ社)を添加し、エタノール沈殿を行った。その後、得られた DNAのペレットを 75%エタノールで 2回、 99. 5%エタノールで 1回洗浄し、 65°Cで乾燥させた後に、超純水で 30 1に溶解した。

その溶解液に Exonucleasel (タカラバイオ社）を添加し、 37°C 60分反応させた後、エタノール沈殿を行った。得られた DNAのペレットを 75%エタノールで 2回、 99. 5 %エタノールで 1回洗浄し、 65°Cで乾燥させた後に、 TEバッファーで 30 1に溶解し、環状 1本鎖 DNA調製液とした。

[特異的遺伝子増幅]

遺伝子検出に用いたプライマーを表 2に記す。共に HPLC精製を行っている（Invitr ogen社製）。

遺伝子検出反応には、下記を使用した。

酵素： Bst DNAポリメラーゼ（New England Biolabs Incorporation製） 4U/25 μ 標的：標的調製液 0. 5 1/25 1

λゲノム： λゲノム（タカラバイオ社） 0· 5ng/ ,1 1

(反応バッファー組成）

1/10量 Bst DNAポリメラーゼ付属のバッファー

1 μ mol/1 2のプフマー (Forward- in Reverse-in) 0.5mmol/l each dNTP

0.02 μ g/ml 環状 1本鎖 DNA調製液

各試薬を表 3の条件で混合し、 95°Cにて 5分間インキュベーションした後、 4°Cに急冷し、酵素を添加後、 63°Cにて 60分間インキュベーションした。

[DNA増幅の確認方法]

核酸染色試薬 SYBR Greenlを 1/10に希釈し、サンプノレ 25 1に対して 1 μ 1を混合し、 302nmの波長を当て高感度フィルターで観察した。結果を表 3と図 1に示す。表 3 ： D NAの増幅結果

以上の実験 1〜6の結果から、酵素 +標的を含むもの（実験 3および実験 6)では迅速な核酸の増幅が確認された。一方、酵素は存在するが標的を含まないもの（実験 2 および実験 5)では、核酸の増幅は確認されな力、つた。また、標的配列以外の DNA を含んで!/、ても核酸の増幅は確認されな力、つた（実験 5)ことから、配列を特異的に認識していること力 S確認された。尚、酵素を含んでいないもの（実験 1および実験 4)につ!/、ては核酸の増幅は行って!/、な!/、。

例 2

[特異的遺伝子増幅]

例 1と同様に調製した環状 1本鎖 DNA調製液を用いて特異的遺伝子増幅を行つた。

遺伝子検出に用いたプライマーを表 4に記す。共に HPLC精製を行っている（Invitr ogen社製）。

表 4 ：遺伝子険出に用いたプライマー配列

名前配列 (5' — 3' )

Forward-in CGACGTTGTAAAACGACGGC

Forwar d-out ACGCCAGGGTTTTCCCAGTC

Reverse-in CACACAGGAAACAGCTATGAC

Reverse-out TGGAATTGTGAGCGGATAAC 遺伝子検出反応には、下記を使用した。

酵素： Bst DNAポリメラーゼ（New England Biolabs Incorporation製） 4U/25 μ 1 標的：標的調製液 0. 5 1/25 1

λゲノム： λゲノム（タカラバイオ社） 0· 5ng/ ,1 1

(反応バッファー組成）

1/10量 Bst DNAポリメラーゼ付属のバッファー

1 μ mol/1 ¾4のプフマー (Forward-in Reverse-in)

0. 2 μ mol/1 表 4のプフイマ一 (Forward— out、 Reverse— outj

0. 5mmol/l each dNTP

1 11 mol/1 環状 1本鎖 DNA調製液

5% D imethylsulfoxide

各試薬を表 5の条件で混合し、 95°Cにて 5分間インキュベーションした後、 4°Cに急冷し、酵素を添加後、 63°Cにて 60分間インキュベーションした。

[DNA増幅の確認方法]

核酸染色試薬 SYBR Greenlを 1/10に希釈し、サンプル 25 1に対して 1 μ 1を混合し、 302nmの波長を当て高感度フィルターで観察した。結果を表 5に示す。

以上の実験 7〜； 12の結果から、酵素 +標的を含むもの（実験 9および実験 12)では迅速な核酸の増幅が確認された。一方、酵素は存在するが標的を含まないもの（実験 8および実験 11)では、核酸の増幅は確認されな力た。また、標的配列以外の D ΝΑを含んで!/、ても核酸の増幅は確認されな力、つた（実験 11)ことから、配列を特異的に認識していることが確認された。尚、酵素を含んでいないもの（実験 7および実験 10)につ!/、ては核酸の増幅は行って!/ヽなレ、。

上記実施例のように、本発明により核酸配列を特異的に認識し、かつ迅速な核酸増幅が可能であることが示された。

[0041] 例 3

[環状 1本鎖 DNAの合成]

表 1の 2種類のポリヌクレオチド（43C： 60 H mol/l、 Bind： 3 μ mol/1)と和光純薬工業社製耐熱性 DNAリガーゼ組換え体（1. 25ul)を合計 25ulに混合し、下記に示した条件で反応を行った。その他、前記耐熱性 DNAリガーゼに添付の反応バッファーを使用した。混合液中における最終的な組成は、耐熱性リガーゼ（1. 25ul/25ul)添付バッファー（2· 5ul/25ul)、表 1の 2種類のポリヌクレオチド（43じ：60 01₀1/1、 Bind : 3 μ mol/1)である。

この混合物を、例 1の [環状 1本鎖 DNAの合成]と同様の温度条件で酵素反応を行い、同様にエタノール沈殿を行い、 TEバッファーで 30 H 1に溶解した環状 1本鎖 DN A調製液を得た。

[0042] [環状 1本鎖 DNAの合成の確認]

環状 1本鎖 DNAの合成をポリメラーゼ反応により確認した。

0. 02 g/ml 環状 1本鎖 DNA調製液

1. 6nmol/l 2のフフイマ一 (porwara-inと Reverse-in)

4U/25 μ 1 Bst DNAポリメラーゼ (New England Biolabs Incorporation)

1. 6nmol/l 表 1のプライマー（Bind)

(反応バッファ一は、 Bst DNAポリメラーゼの製造者の指示に従った。 )

上記の反応混合物を調製した後、 63°C ' 60分インキュベートした。また、 Bindのプライマーを含まな!/、対照混合物を調製し、同様にインキュベートした。

この反応は、環状 1本鎖 DNAに対してアニーリングした Bindポリヌクレオチドがプライマ一となつて 3'方向に DNAを複製し、その複製された DNAをさらに铸型として Fと Rのプライマーにより DNAを増幅するものである。

[0043] [検出]

核酸染色試薬 SYBR Greenl (タカラバイオ社）を 1/10に希釈し、サンプノレ 25 1に対して 1 μ 1を混合し、 302nmの波長を当て高感度フィルターで観察した。また、 2· 0%ΤΑΕ電気泳動用ゲルを使用し、電気泳動漕である Mupid-ex (アドバンス社）を用いて電気泳動（100V、 60分）を行い、その後、核酸染色試薬 SYBR Green Iで染色し 254nmの波長を当て高感度フィルターで観察した。

結果を表 6、および図 7、図 8に示す。

表 6：環状 1本鎖合成確認の結果

図 7、図 8より長鎖の DNAが合成されていることが確認されたことから、環状 1本鎖 DNAが合成されていることを確認した。また、 Exonucleaselの処理で環状 1本鎖以外を分解し得ることも同時に確認できた。

[ライゲーシヨン反応の繰り返し反応による環状 1本鎖 DNAの濃度比較]

上記 [環状 1本鎖 DNAの合成]に示したのと同様の方法で、ライゲーシヨン反応を繰り返し行って、作製された環状 1本鎖 DNAの濃度の比較を行った。

反応混合物に加える直鎖状 1本鎖 DNAとアダプターポリヌクレオチドの濃度は、 43 C力 60 H mol/l、 Bindが 3 μ mol/1となるように調製した。

C :リガーゼなし

0 : (2)〜(4)のサィクル1回

E： (2)〜(4)のサイクル 25回

反応後、 Genとるくん（タカラバイオ社)を添加し、エタノール沈殿を行った。その後、 75%エタノールで 2回、 99. 5%エタノールで 1回洗浄し、 65°Cで乾燥させた後に、超純水で 30 1に溶解した。

溶解後、 Exonucleasel (タカラバイオ社）を添加し、 37°C、 60分反応させた後、 Gen とるくんを添カロし、エタノール沈殿を行った。その後、 75%エタノーノレで 2回、 99. 5 %エタノールで 1回洗浄し、 65°Cで乾燥させた後に、 TEバッファーで 25 1に溶解し、各濃度を吸光度（260nm)により検出した（図 9)。リガーゼを加えずに行った Cをゼ口点、とした。

図 9より、本発明の方法を用いてライゲーシヨンのサイクルを繰り返して行うことにより、、環環状状 11本本鎖鎖 DDNNAAがが高高収収率率でで製製造造さされれてて!!//、、るるここととがが分分かかっったた。。

図図面面のの簡簡単単なな説説明明

[[図図 11]]本本発発明明のの核核酸酸増増幅幅方方法法のの原原理理 ((第第一一段段階階))をを示示すす。。

[[図図 22]]本本発発明明のの核核酸酸増増幅幅方方法法のの原原理理 ((第第二二段段階階))をを示示すす。。

[[図図 33]]表表 33のの実実験験結結果果 ((実実験験 11〜〜実実験験 33))をを示示すす。。

[[図図 44]]表表 33のの実実験験結結果果 ((実実験験 44〜〜実実験験 66))をを示示すす。。

[[図図 55]]表表 33のの実実験験 11〜〜実実験験 33ののササンンププルルのの電電気気泳泳動動のの結結果果をを示示すす。。

[[図図 66]]本本発発明明のの方方法法にによよるる、、環環状状化化 11本本鎖鎖 DDNNAAのの製製造造のの概概略略をを示示すす。。

[[図図 77]]SSYYBBRR GGrreeeennllをを用用いいてて環環状状 11本本鎖鎖をを検検出出ししたた写写真真をを示示すす。。 AAははププラライイママーーをを加加ええずずににポポリリメメララーーゼゼ反反応応をを行行っったた対対照照ササンンププルルでであありり、、 BBはは通通常常のの合合成成反反応応をを行行っったた

[[図図 88]]電電気気泳泳動動にによよりり環環状状 11本本鎖鎖をを検検出出ししたたゲゲルル写写真真をを示示すす。。

[[図図 99]]ラライイゲゲーーシシヨヨンン反反応応をを 11回回、、おおよよびび 2255回回反反復復ししてて行行っったた場場合合のの、、環環状状 11本本鎖鎖合合成成 *

Claims

請求の範囲

[1] (a)増幅対象の塩基配列を含む铸型 DNAと、前記塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマー対とを用いて DNAポリメラーゼ伸長反応を行って、直鎖状 DNA 断片を得ること；及び

(b)前記プライマー対の少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状 1本鎖 DNAを铸型とし、（a)により得られた直鎖状 DNA断片の 3'末端を複製起点として、鎖置換型

DNAポリメラーゼ伸長反応を行うこと；

を含むことを特徴とする、核酸の増幅方法。

[2] (a)と (b)とを同一温度条件下で行う、請求項 1記載の方法。

[3] 増幅対象の塩基配列を含む铸型 DNA力 S、 RNAを铸型とする逆転写によって得られた DNA鎖を含むものである、請求項 1又は 2に記載の方法。

[4] (i)増幅対象の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマー対；

(ii)前記プライマー対と同一の塩基配列を同一分子上に含む環状 1本鎖 DNA;

(iii)鎖置換型 DNAポリメラーゼ；

(iv) dNTP；

を含む、核酸増幅用キット。

[5] 2本鎖の標的核酸分子を検出する方法であって、

を含む前記方法。

[6] 1本鎖の標的核酸分子を検出する方法であって、

(a)標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配歹 IJを有するプライマー、標的核酸分子の前記標的塩基配列の領域と異なる領域の標的塩基配歹 IJを有するプライマー、これらのプライマーの少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状 1本鎖 D NA、鎖置換型 DNAポリメラーゼ及び dNTPを、検出対象の試料に添加して、前記鎖置換型 DNAポリメラーゼが活性を有する温度にて酵素反応させること；

を含む前記方法。

[7] (i)2本鎖の標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配歹 IJを有するブライマ一対；

(iii)鎖置換型 DNAポリメラーゼ；及び

(iv) dNTP；

を含む、 2本鎖の標的核酸分子の検出用キット。

[8] (i)l本鎖の標的核酸分子の標的塩基配列に対して相補的な塩基配歹 IJを有するブライマ一

(ii)標的核酸分子の前記標的塩基配列の領域と異なる領域の標的塩基配列を有す

(iiiXi)及び (ii)のプライマーの少なくとも一方と同一の塩基配列を含む環状 1本鎖 D NA;

(iv)鎖置換型 DNAポリメラーゼ；及び

(v) dNTP；

を含む、 1本鎖の標的核酸分子の検出用キット。

[9] (vi)逆転写酵素を更に含む、請求項 8記載の検出用キット。

[10] 環状 1本鎖 DNAの製造方法であって、

a)直鎖状 1本鎖 DNAと、前記直鎖状 1本鎖 DNAの 5'末端領域および 3'末端領域の相補配列を隣接して有するアダプターポリヌクレオチドと、耐熱性リガーゼとを含む反応混合物を調製する工程、

b)直鎖状 1本鎖 DNAとアダプターポリヌクレオチドの相補配列を結合させることにより、前記直鎖状 1本鎖 DNAの 5'末端と 3'末端とを隣接させる工程、

c)前記直鎖状 1本鎖 DNAの 5'末端と 3'末端とを連結する工程、

d)環状化された 1本鎖 DNAとアダプターポリヌクレオチドを解離させる工程、を含む、前記製造方法。

[11] 工程 b)から d)の一連の操作を少なくとも 2回反復して行う請求項 10記載の環状 1本鎖 DNAの製造方法。

[12] 工程 a)で調製した反応混合物中における、直鎖状 1本鎖 DNAに対するアダプターポリヌクレオチドのモル比が 1未満である、請求項 10または 11記載の環状 1本鎖 DN

Aの製造方法。