WO2008018637A1 - Eau fonctionnelle pour améliorer la capacité ostéogénique - Google Patents

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Yoshimitsu Abiko
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Nihon University
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Definitions

  • the present invention relates to functional water having physiological activity, particularly functional water having a bone formation promoting action, and use thereof.
  • Osteoporosis is a syndrome in which the bone mass per unit volume in bone tissue is reduced while maintaining the ratio of bone mineral and bone matrix, and this bone loss is more pronounced than the decrease due to physiological aging.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide functional water that can promote bone formation of osteoblasts, and use thereof.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above problems.
  • functional water containing hydrogen ie, hydrogen-dissolved water
  • the present invention has been completed by finding that it has an effect on the treatment and prevention of the disease in an osteoporosis model animal. That is, the present invention is as follows.
  • the functional water of the present invention can have, for example, a hydrogen content of 0.350 ppm or more and a redox potential of ⁇ 300 mV or less.
  • a pharmaceutical composition comprising the functional water according to (1) above.
  • Examples of the pharmaceutical composition of the present invention include, for example, a composition for preventing and / or treating osteoporosis, and a composition for preventing and / or treating bone formation inhibitory symptoms due to inflammatory diseases. Can do.
  • a method for preventing and / or treating osteoporosis comprising administering the functional water according to (1) above or the pharmaceutical composition according to (5) above to a patient.
  • a method for preventing and / or treating a bone formation-suppressing symptom caused by an inflammatory disease comprising administering the functional water according to (1) above or the pharmaceutical composition according to (5) above to a patient.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the operation procedure of each culture system of the mouse osteoblast-like cell line MC3T3-E1.
  • FIG. 2 is a graph showing the influence of hydrogen-dissolved water and active oxygen (hydrogen peroxide solution) on the calcium deposition of mouse osteoblast-like cell culture strain MC3T3-E1.
  • Fig. 3 is a photograph showing an X-ray image of the femur of an ovariectomized osteoporosis model rat with a low Ca diet.
  • bone nodule formation In order to confirm the inhibitory effect of the active oxygen on the suppression of the function of osteoblast bone formation (hereinafter also referred to as bone nodule formation) by active oxygen, Reactive oxygen stimulation with was performed, and changes in bone nodule formation ability were observed. So As a result, it was confirmed that the expression levels of genes such as alkaline phosphatase, bone shaloprotein and type I collagen in osteoblasts were decreased, and the ability to form bone nodules was suppressed or decreased.
  • the present inventor conducted various culture experiments of osteoblasts using hydrogen-dissolved water.
  • the ability of osteoblasts to form bone nodules could be significantly increased compared to a system that did not contain hydrogen-dissolved water.
  • hydrogen-dissolved water is included before culturing. The ability to form bone nodules was significantly recovered compared to the system without this.
  • osteoblasts when treating osteoblasts with hydrogen peroxide before culturing, if hydrogen-dissolved water is also added, the ability to form bone nodules is reduced or reduced compared to the system without hydrogen-dissolved water. Was able to be suppressed.
  • seeing the effect on osteoblast-like cells is substantially the same as seeing the effect on osteoblasts.
  • the present inventor made an osteoporosis model animal by extracting an animal's ovary as an in ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ experiment, and gave hydrogen-dissolved water as drinking water to the model animal. Compared to the animals that did not receive it, the symptoms of osteoporosis could be effectively prevented or treated.
  • hydrogen-dissolved water becomes functional water that can be effectively used to promote bone formation.
  • hydrogen-dissolved water is used as bone nodules of osteoblasts.
  • the present inventors have found that the ability to form can be significantly increased, and that in in ′, hydrogen-dissolved water can effectively prevent or treat the symptoms of osteoporosis.
  • the functional water of the present invention contains hydrogen and is used as hydrogen-dissolved water.
  • hydrogen-dissolved water means an aqueous solution in which hydrogen is dissolved in raw water.
  • Raw water means all known water such as tap water, purified water, distilled water, natural water, activated carbon-treated water, ion exchange water, pure water, and ultrapure water.
  • the dissolved hydrogen may be molecular hydrogen or atomic hydrogen, and is not limited. If the raw water already contains hydrogen, use it as hydrogen-dissolved water. 2007/065984 Can be.
  • the amount of hydrogen contained in the functional water of the present invention is not particularly limited, and can be arbitrarily set according to the usage form of the functional water of the present invention. Therefore, the amount of hydrogen contained is not limited to the amount that can be dissolved under normal temperature and normal pressure (for example, 25 ° C, 1 atm), and may be an amount exceeding the saturated concentration, or under various pressure and temperature conditions. It may be an amount in a range that can be dissolved.
  • the hydrogen content is preferably, for example, in the range of 0.350 ppm or more, and more preferably in the range of 0.450 ppm or more.
  • the hydrogen content may be in the range of, for example, 0.350 to 1.50 ppm, 0.350 to 1.33 ppm, 0.350 to; l.00 ppm, 0.350 to 0.500 ppm, or .350 to 0.450 ppm.
  • the hydrogen content is in the above range, the bone formation promoting action by the functional water of the present invention is effectively exhibited.
  • the oxidation-reduction potential of the functional water of the present invention is not particularly limited, and can be arbitrarily set as in the above-described hydrogen content, but is preferably in the range of ⁇ 300 mV or less, for example. -Is in the range of 350mV or less.
  • the oxidation-reduction potential may be in the range of, for example, -300 to -750 mV, -300 to -700 mV, -300 to -650 mV, -300 to -605 mV, or -350 to -605 mV.
  • the functional water of the present invention is not limited as long as hydrogen is dissolved in the raw water as described above, and other physical properties of the solution are not limited. For example, whether hydrogen-dissolved water is acidic, neutral or alkaline is not particularly limited.
  • the method for producing the functional water of the present invention is not limited, and any known method capable of dissolving hydrogen in the raw water can be applied.
  • the functional water is produced by a method of bubbling hydrogen gas into the raw water. can do.
  • the functional water of the present invention can contain other components in addition to hydrogen.
  • Preferred examples of other components include various vitamins, amino acids and reducing agents.
  • the content ratio of the above-mentioned other components is not limited, and can be set as appropriate as long as the bone formation promoting effect by containing hydrogen is not impaired.
  • the functional water of the present invention is extremely useful for promoting bone formation.
  • the functional water of the present invention contains human or non-human animal osteoblasts and osteoblast-like cells. 2007/065984 It is extremely useful for promoting the bone forming ability of cells, cells, or living tissues or tissue pieces containing these cells.
  • “promoting the ability to form bone” means to further improve the ability to form bone and to restore all or part of the ability to form bone that has been suppressed or reduced.
  • the beverage, food and feed of the present invention are all characterized by containing the functional water of the present invention described above.
  • the content ratio of the functional water of the present invention is not limited, and can be appropriately set according to the type and state of the beverage, food or feed. However, in order to prevent dissolved hydrogen from being lost during storage, it is preferable to store it in a sealed pack or the like. Further, the beverage, food and feed of the present invention can contain other components as needed in addition to the functional water of the present invention.
  • beverage of the present invention examples include vegetable juice, fruit juice, milk beverage, dairy beverage, tea, soft drink, soup, alcoholic beverage, carbonated beverage, mineral water, first-class water, coffee, soy milk, nourishing tonic drink and Various other beverages are listed.
  • the form of the food and feed of the present invention is not limited, and is generally handled as food and feed in a state that can contain water, such as a fluid form, a gel form, and various types of retort processed. All known ones can be exemplified.
  • Examples of the food of the present invention include yogurt, cream, miso, chickenpox, pudding, jelly, jam, ice cream, sorbet, mayonnaise, dressing, stew, pasta sauce and other various foods.
  • Examples of the feed of the present invention include livestock feed, pet food, and other feeds.
  • livestock food include food for cattle, pigs, horses, birds, and the like.
  • pet food include pet food such as dogs, cats and birds.
  • composition 7 065984 The pharmaceutical composition of the present invention comprises the functional water of the present invention described above. As described above, the functional water of the present invention is excellent in bone formation promoting action. Therefore, the pharmaceutical composition can be preferably used for preventing and Z or treating osteoporosis, or for preventing and Z or treating the symptoms of bone formation suppression due to inflammatory diseases.
  • the said pharmaceutical composition may consist only of the functional water of this invention, and may contain another component other than the functional water of this invention.
  • examples of other ingredients include various pharmaceutical ingredients (such as various pharmaceutically acceptable carriers) required depending on the usage (form of use) of the pharmaceutical composition.
  • Other components can be appropriately contained within a range that does not impair the effect exhibited by the functional water of the present invention.
  • the blending ratio of the functional water of the present invention which is an active ingredient, is not limited, and is an osteogenesis promoting action, specifically, an action of improving or once suppressing osteogenic bone forming ability. It can be set as appropriate so that the effect of restoring the reduced or reduced bone forming ability can be effectively exhibited.
  • the hydrogen content of the functional water of the present invention to be used is preferably within the range described in the section 2) 1).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to human or non-human mammals in various administration routes, specifically, oral or parenteral (eg, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration). Can be administered. Therefore, although the functional water of the present invention can be used alone as a pharmaceutical composition, it is formulated into an appropriate dosage form using a pharmaceutically acceptable carrier by a method commonly used depending on the administration route. can do.
  • oral or parenteral eg, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration.
  • the preferable dosage form is not limited as long as it is a liquid dosage form that can contain the functional water of the present invention.
  • oral preparations for example, syrups and capsules are preferable, and for parenteral preparations,
  • an injection including an instillation
  • Carriers that can be used to formulate these preparations include, for example, commonly used excipients, colorants, and flavoring agents, and if necessary, stabilizers, emulsifiers, absorption promoters, surfactants, pH Conditioner, antiseptic, antioxidant, extender, wetting agent, surface activator, 2007/065984 Dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, soothing agents, etc. can be mentioned, and known ingredients that can be used as raw materials for pharmaceutical preparations can be blended and formulated into conventional preparations. Is possible.
  • Non-toxic ingredients that can be used in the pharmaceutical composition of the present invention include, for example, animal and vegetable oils such as soybean oil, beef tallow, and synthetic glycerides; hydrocarbons such as liquid paraffin, squalane, and solid paraffin; polyoxyethylene Surfactants such as fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, glycerin fatty acid esters, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, and polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymers; Water soluble polymers such as mouthwater, polyacrylolic acid, carboxybulol polymer, polyethylene glycololole, polybulurpyrrolidone, and methylcellulose; lower alcohols such as ethanol and isopropanol; glycerin, propylene darico Polyhydric alcohols (polyols) such as dipropylene glycol, sorbitol, and polyethylene glycol; sugars such as glucose and sucrose; inorganic
  • the effective dose is, for example, the degree of symptoms, age, sex, body weight, dosage form, type of salt, and disease
  • the effective dose is, for example, the degree of symptoms, age, sex, body weight, dosage form, type of salt, and disease
  • a person with a body weight of 60 kg may be administered 200-l, 000 ml per day, once or in multiple doses. it can.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is orally administered, its dosage form and effective dosage depend on the administration subject, administration route, formulation properties, patient condition, doctor's judgment, etc. For example, in the case of an adult, a person weighing 60 kg may be administered 300 to 3,000 ml per day, preferably 500 to 3,000 ml, once or in several divided doses. Considering that the efficiency of the administration route is different, the required dose can be set widely as appropriate.
  • the method for confirming the osteogenesis promoting action of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited.
  • the present invention also provides administration of the pharmaceutical composition to a patient.
  • JP2007 / 065984 Prevention and Z or treatment method of osteoporosis, and prevention and Z or treatment method of osteogenesis suppression due to inflammatory disease, comprising administering functional water (functional water for promoting bone formation) to a patient Is included.
  • the present invention includes functional water for promoting osteogenesis for the prevention and / or treatment of osteoporosis, or for the prevention and / or treatment of osteogenesis suppression symptoms due to inflammatory diseases.
  • the present invention provides a method for promoting osteogenesis for the production and production of a pharmaceutical composition for preventing and / or treating osteoporosis, or for preventing and / or treating osteogenesis suppression symptoms caused by inflammatory diseases. This includes the use of functional water. 5. Culture of bone-forming cells
  • the osteogenic cell and Z or tissue medium of the present invention is characterized by containing the functional water of the present invention described above.
  • the type of the culture medium of the present invention is not limited, and various known liquid media can be preferably exemplified, but various known solid media may be used as long as they can contain water.
  • the types of osteogenic cells and Z or tissue are not limited, and examples include osteoblasts and osteoblast-like cells of human or non-human animals, and living tissue or tissue fragments containing these cells.
  • the content of the functional water of the present invention is not limited, and the bone forming ability of the bone-forming cells and / or tissues to be cultured is improved or reduced or reduced. It can be set as appropriate so that the recovery action can be effectively exhibited. Further, the hydrogen content of the functional water of the present invention to be used is preferably within the range described in the section 2. (1).
  • the medium of the present invention can contain other components in addition to the functional water of the present invention.
  • the functional water of the present invention can contain other components in addition to the functional water of the present invention.
  • the type of bone-forming cells and Z or tissue to be cultured, etc. can be included.
  • the present invention also includes a method for culturing osteogenic cells and / or tissues, wherein the osteogenic cells and / or tissues are cultured in the medium of the present invention.
  • various culture procedures and conditions (culture temperature, culture time, etc.) can be appropriately set according to conventional methods according to the type of osteogenic cells and Z or tissue to be cultured.
  • the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
  • the mouse osteoblast-like cell line MC3T3-E1 was cultured in an incubator at 37 ° C., 95% Air, and 5% CO 2 using 75 cm 2 tissue culture flasks.
  • MEM Gibco
  • antibiotics gentamicin, amphotericin, penicillin
  • a culture solution using MQ obtained with a Millipore monopure water apparatus was prepared as a solvent component, and the culture cells in 1 above were cultured by exchanging this culture solution. . Incubation was performed for 3 hours in an incubator at 37 ° C, 95% Air and 5% CO 2 atmosphere.
  • the cultured cells were cultured.
  • the culture conditions were the same as in (2-1) above. By this treatment, Thus, it was stimulated with active oxygen for 3 hours.
  • the cultured cells after the three types of pretreatment performed in step 2 above are appropriately transferred to each wall of another multi-wall plate, and for each system, culture using MQ and culture using hydrogen-dissolved water Went. Details of each culture are shown in (3-1) and (3-2) below.
  • a total of 6 culture systems were designated (A) to (F) as shown in Fig. L (iii). Further, each of the culture systems (A) to (F) was cultured in four culture periods of 7, 14, 21, 21 and 30 days.
  • the culture was carried out by exchanging with the culture solution prepared in 2. (2-1) above.
  • the type of the culture solution was not changed, but the culture solution was exchanged in the same manner as the other systems.
  • Culture is 37. C, 95% Air and 5% CO 2 atmosphere in an incubator, and the culture medium was changed three times a week.
  • the culture was carried out by exchanging the culture solution (without H 2 0 2 ) using hydrogen-dissolved water prepared in 2. (2-3) above.
  • the culture conditions were the same as in (3-1) above. 4. Measurement of calcium concentration
  • 6-week-old Sprague-Dawley female rats (Shizuoka experimental animals) were preliminarily raised for 1 week and then used for the experiments.
  • One group consists of 6 animals, and 6 groups, 4 of which are subjected to bilateral ovariectomy (OVX) from the back according to the usual method, and the group of osteoporosis model rats (OVX group).
  • the remaining two groups were sham-operated (sham group) as a control for the OVX group.
  • Hydrogen-containing water was prepared by saturating hydrogen gas in distilled water (content of hydrogen: about 1.33 ppm, oxidation-reduction potential: about -700 mV). This hydrogen-containing water was newly replaced twice a day (once in the morning) and allowed the rats to drink freely. The hydrogen content (dissolved hydrogen concentration) of hydrogen-containing water was measured using a portable dissolved hydrogen meter (Toa Decay Co., Ltd.).
  • the animals were administered with pentobarbital sodium (Nembutal ®, Dainippon Pharmaceutical) intravenously at a dose of 25 mg / kg to general anesthesia, and the surgical field was shaved with an electric varistor and then disinfected with dilute iodine tincture. . Thereafter, the egg nest was removed from the back of the animal according to a conventional method.
  • pentobarbital sodium Nambutal ®, Dainippon Pharmaceutical
  • mice were prepared as 6 animals per group, animals in groups 1 to 3 were bred with normal Ca diet, and animals in groups 4 to 6 were bred with low Ca diet.
  • the first group was sham operated and given distilled water (sham-Ca group)
  • the second group was given distilled water with OVX (OVX-Ca group)
  • the third group was hydrogen with OV Group given water (OVX-Ca-Hy group)
  • Group 4 received sham surgery and given distilled water (sham-LCa group)
  • Group 5 received OVX distilled water (OVX) -LCa group
  • Group 6 was a group that was given hydrogen-containing water by OVX (OVX-LCa-Hy group).
  • Table 1 The details of the first to sixth groups are summarized in Table 1 below.
  • the experimental period is about 9 months, during which the general condition of the animals is observed daily. Once a week, body weight, feed intake and water intake were measured. However, the hydrogen-containing water in the drinking water was newly replaced twice a day (once in the morning). mi
  • the right femur was imaged using an ultra-sensitive Ultra Speed (75 mm x 55 mm) X-ray film from Kodak with dental dental X-rays.
  • Figure 3 shows the results.
  • action ie, the enhancement and recovery effect
  • the functional water of the present invention can be used for various uses such as beverages, foods, feeds, osteogenic cells and media for tissue culture, and pharmaceutical compositions, and also for osteoporosis. It can be said to be extremely useful because it can be used in prevention and / or treatment methods and prevention and / or treatment methods of osteogenesis suppression symptoms caused by inflammatory diseases.

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Description

明 細 書 骨形成能を促進する機能性水 技術分野
本発明は、 生理活性を有する機能性水、 特に骨形成促進作用を有する機能性水、 及びその用途に関する。 背景技術
高齢化社会の進行に伴い、 糖尿病、 高血圧、 骨粗鬆症などの生活習慣病といわ れる疾患が多くなつてきている。 その中でも、 骨粗鬆症やそれに伴う骨折頻度の 増加は深刻な社会問題となっている。 骨粗鬆症は骨組織における単位体積あたり の骨量が骨塩と骨基質の比率を保つたまま減少した症候群であり、 この骨量減少 は生理的老化による減少よりも著明である。
骨粗鬆症をはじめとする女性の加齢及び老年性疾患の原因は、 更年期における 女性ホルモンの急激な減少に由来する。 治療法として、 女性ホルモン補充療法が 用いられているが、 内因性のエストロゲンは、 その作用が強力であり、 副作用も 数多く報告されている。 従って、 それに代わる安全でかつ安価な骨粗鬆症の治療 薬及び予防薬が求められている。
ところで、 骨粗鬆症及び炎症性疾患においては、 骨形成が抑制されることが知 られている。 これは、 生体内の活性酸素による骨芽細胞の骨形成能に対する機能 抑制が関与しているためと考えられている。 生体内の活性酸素は、 各種代謝系を 通じて生成されることが知られている。 また、 炎症性の疾患部位においては、 免 疫細胞のマクロファージ等により活性酸素が生成され、 外来異物を攻撃する細胞 障害作用の手段として用いられている。
近年、 高濃度の水素溶存水に活性酸素を除去する作用があることが報告されて いる。 このような水素溶存水の用途については、 薬理機能性として、 水酸化ス ト レス性疾患及び自己免疫疾患 （特に関節リウマチ） の予防及び治療、 並びに老化 防止に用いることが知られているが （特開 2005- 126384号公報） 、 骨形成の促進 こついては不明である 発明の開示
本発明が解決しようとする課題は、 骨芽細胞の骨形成を促進し得る機能性水、 及びその用途を提供することにある。
本発明者は、 上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。 その結果、 水素を含 む機能性水 （すなわち水素溶存水） 力 骨芽細胞様細胞の骨結節形成能をより高 めることができること、 及び一旦抑制され又は低下した骨結節形成能を回復でき ること、 さらには骨粗鬆症モデル動物において該疾患の治療及び予防に効果を示 すことを見出し、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明は以下の通りである。
(1)水素を含むことを特徴とする骨形成促進用の機能性水。
本発明の機能性水は、 例えば、 含有水素量を 0.350ppm以上とすることができ、 酸化還元電位を - 300mV以下とすることができる。
(2) 上記 (1)記載の機能性水を含有する飲料。
(3) 上記 (1)記載の機能性水を含有する食料。
(4) 上記 (1)記載の機能性水を含有する飼料。
(5) 上記 (1)記載の機能性水を含む医薬組成物。
本発明の医薬組成物としては、 例えば、 骨粗鬆症を予防及び/又は治療するた めの組成物、 並びに、 炎症性疾患による骨形成抑制症状を予防及び/又は治療す るための組成物を挙げることができる。
(6) 上記 (1)記載の機能性水若しくは上記 (5)記載の医薬組成物を患者に投与する ことを含む、 骨粗鬆症の予防及び Z又は治療方法。
(7) 上記 (1)記載の機能性水若しくは上記 (5)記載の医薬組成物を患者に投与する ことを含む、 炎症性疾患による骨形成抑制症状の予防及び/又は治療方法。
(8)骨粗鬆症の予防及び/又は治療用の上記 (1)記載の機能性水。
(9) 炎症性疾患による骨形成抑制症状の予防及び/又は治療用の上記 (1)記載の 機能性水。 (10) 骨粗鬆症を予防及び/又は治療するための医薬の製造のための上記 (1)記 載の機能性水の使用。
(11) 炎症性疾患による骨形成抑制症状を予防及ぴ Z又は治療するための医薬の 製造のための上記 (1)記載の機能性水の使用。
(12)上記 (1)記載の機能性水を含む、 骨形成用細胞及ぴノ又は組織の培地。
(13) 上記 (12)記載の培地中で骨形成用細胞及び/又は組織を培養することを特 徴とする、 前記細胞及び/又は組織の培養方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 マウス骨芽細胞様細胞株 MC3T3-E1の各培養系の操作手順を示す概 略図である。
図 2は、 マウス骨芽細胞様細胞培養株 MC3T3-E1のカルシウム沈着に対する 水素溶存水及び活性酸素 （過酸化水素水） の影響を示すグラフである。
図 3は、 低 Ca食による卵巣摘出骨粗鬆症モデルラットの大腿骨の X線像を表す 写真である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。 本発明の範囲はこれらの説明に拘束されるこ とはなく、 以下の例示以外についても、 本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変 更し実施し得る。
なお、 本明細書は、 本願優先権主張の基礎となる特願 2006 - 219801号明細書 の全体を包含する。 また、 本明細書において引用された全ての刊行物、 例えば先 行技術文献、 及び公開公報、 特許公報その他の特許文献は、 参照として本明細書 に組み込まれる。
1 . 本発明の概要
本発明者は、 活性酸素により骨芽細胞の骨形成 （以下、 骨結節形成とも言う） の機能が抑制されることについて、 その抑制効果を確認するため、 骨芽細胞に対 して過酸化水素による活性酸素刺激を行い、 骨結節形成能の変化を観察した。 そ の結果、 骨芽細胞におけるアルカリホスファターゼ、 骨シァロタンパク質及ぴ I 型コラーゲン等の遺伝子発現レベルが低下し、 骨結節形成能が抑制される又は低 下することが確認された。
次いで、 本発明者は、 水素溶存水を用いた骨芽細胞の各種培養実験を行った。 その結果、 水素溶存水を含む培地中で骨芽細胞を培養した場合、 水素溶存水を 含まない系に比べて骨芽細胞の骨結節形成能を有意に高めることができた。 また、 培養前に、 一旦、 骨芽細胞を過酸化水素水で処理して骨結節形成能を抑制又は低 下させた後、 水素溶存水を含む培地で培養した場合は、 水素溶存水を含まない系 に比べて骨結節形成能を有意に回復することができた。 さらに、 培養前に骨芽細 胞を過酸化水素水で処理する際に、 併せて水素溶存水も加えておいた場合、 水素 溶存水を加えない系に比べて骨結節形成能の抑制又は低下を抑えることができた。 なお、 当業者においては、 骨芽細胞様細胞に関する影響をみることと、 骨芽細胞 に関する影響をみることとは実質的に同一である。
また本発明者は、 in νϊνひ実験として、 動物の卵巣を摘出することにより骨粗 鬆症モデル動物を作製し、 このモデル動物に飲料水として水素溶存水を与えた結 果、 水素溶存水を与えなかった動物に比べて、 骨粗鬆症の症状を効果的に予防又 は治療することができた。
以上の知見に基づき、 本発明者は、 水素溶存水が骨形成の促進に有効に用い得 る機能性水となること、 例えば、 in 'か oにおいて水素溶存水が骨芽細胞の骨結 節形成能を有意に高めることができること、 及び in ' においては水素溶存水 が骨粗鬆症の症状を有効に予防又は治療し得ることを見出し、 本発明を完成した。
2 . 骨形成促進用の機能性水
本発明の機能性水は、 水素を含むものであり、 水素溶存水として使用するもの である。 ここで 「水素溶存水」 とは、 原水に水素が溶解している水溶液を意味す る。 「原水」 とは、 水道水、 精製水、 蒸留水、 天然水、 活性炭処理水、 イオン交 換水、 純水、 超純水など、 公知のすべての水を意味する。 また、 溶解している水 素は、 分子状水素であってもよいし原子状水素であってもよく、 限定はされない。 なお、 原水が既に水素を含んだものである場合は、 そのまま水素溶存水として用 2007/065984 いることができる。
本発明の機能性水の含有水素量は、 特に限定はされず、 本発明の機能性水の用 途ゃ保存形態などに応じて任意に設定することができる。 そのため、 含有水素量 は、 常温常圧下 （例えば 25°C, 1気圧下） で溶存可能な量には限定されず、 飽和 濃度を超える量であってもよいし、 様々な圧力及び温度条件下で溶存可能な範囲 の量であってもよい。 また、 上記含有水素量は、 例えば、 0.350ppm以上の範囲 であることが好ましく、 より好ましくは 0.450ppm以上の範囲である。 上記含有 水素量は、 例えば、 0.350〜1.50ppm、 0.350- 1.33ppm, 0.350〜； l.00ppm、 0.350〜0.500ppm、 又はひ.350〜0.450ppmの範囲であってもよい。 含有水素量 が上記範囲である場合、 本発明の機能性水による骨形成促進作用が効果的に発揮 される。
本発明の機能性水の酸化還元電位は、 特に限定はされず、 上記含有水素量と同 様に、 任意に設定することができるが、 例えば - 300mV以下の範囲であることが 好ましく、 より好ましくは - 350mV以下の範囲である。 また、 上記酸化還元電位 は、 例えば、 -300〜- 750mV、 - 300〜- 700mV、 -300〜- 650mV、 -300〜- 605mV、 又は- 350〜- 605mVの範囲であってもよい。 酸化還元電位が上記範囲 である場合、 本発明の機能性水による骨形成促進作用が効果的に発揮される。 本発明の機能性水は、 上述のように原水に水素が溶解しているものであればよ く、 その他の溶液物性については限定はされない。 例えば、 水素溶存水は、 酸性、 中性及ぴアルカリ性のいずれであるかは、 特に限定されない。
本発明の機能性水の製造方法は、 限定はされず、 原水に水素を溶解させること ができる公知のすべての方法を適用することができ、 例えば原水に水素ガスをバ ブリングする方法等により製造することができる。
本発明の機能性水は、 水素以外に他の成分を含むことができる。 他の成分とし ては、 例えば、 各種ビタミン類、 アミノ酸及び還元剤等が好ましく挙げられる。 上記他の成分の含有割合は、 限定はされず、 水素を含有させたことによる骨形 成促進作用が損なわれない範囲で、 適宜設定することができる。
本発明の機能性水は、 骨形成を促進するために極めて有用なものである。 具体 的には、 本発明の機能性水は、 ヒト又は非ヒト動物の骨芽細胞及び骨芽細胞様細 2007/065984 胞、 及びノ又はこれら細胞を含む生体組織又は組織片の骨形成能を促進するため に極めて有用なものである。 ここで、 「骨形成能を促進する」 とは、 骨形成能を さらに向上させること、 及びノ又はー且抑制され若しくは低下した骨形成能の全 部又は一部を回復させることを意味する。
3 . 飲料、 食料及び飼料
本発明の飲料、 食料及び飼料は、 いずれも、 上述した本発明の機能性水を含む ことを特徴とするものである。
本発明の飲料、 食料及び飼料において、 本発明の機能性水の含有割合は、 限定 はされず、 飲料、 食料又は飼料の種類及び状態等に応じて、 適宜設定することが できる。 但し、 溶存した水素が保管中に消失しないようにするため、 密封パック 等に保存することが好ましい。 また、 本発明の飲料、 食料及ぴ飼料は、 本発明の 機能性水以外に、 必要に応じ適宜他の成分を含むことができる。
本発明の飲料としては、 例えば、 野菜ジュース、 果物ジュース、 乳飲料、 乳性 飲料、 お茶、 清涼飲料、 スープ、 アルコール飲料、 炭酸飲料、 ミネラルウォータ 一等の水、 コーヒー、 豆乳、 滋養強壮ドリンク及びその他の各種飲料が挙げられ る。
本発明の食料及び飼料は、 その形態は限定されず、 流動状のもの、 ゲル状のも の及ぴ各種レトルト加工されたものなど、 一般に水分を含み得る状態で食料及び 飼料として取り扱われている公知のものが全て例示できる。
本発明の食料としては、 例えば、 ヨーグルト、 クリーム、 味噌、 水餡、 プリン、 ゼリー、 ジャム、 アイスクリーム、 シャーベット、 マヨネーズ、 ドレッシング、 シチュー、 パスタソース及びその他の各種食料が挙げられる。
本発明の飼料としては、 例えば、 家畜用の餌、 ペットフード及びその他飼料等 が挙げられる。 家畜用の餌としては、 例えば、 牛、 豚、 馬及び鳥等の餌が挙げら れる。 ペットフードとしては、 例えば、 犬、 猫及び鳥等のペットフードが挙げら れる。
4 . 医薬組成物 7 065984 本発明の医薬組成物は、 前述した本発明の機能性水を含むことを特徴とするも のである。 本発明の機能性水は、 前述した通り、 骨形成促進作用に優れたもので ある。 そのため、 当該医薬組成物は、 骨粗鬆症を予防及び Z又は治療するため、 あるいは、 炎症性疾患による骨形成抑制の症状を予防及ぴ Z又は治療するために 好ましく使用することができる。
本発明においては、 当該医薬組成物は、 本発明の機能性水のみからなるもので あってもよいし、 本発明の機能性水以外に他の成分を含むものであってもよい。 他の成分としては、 当該医薬組成物の用法 （使用形態） に応じて必要とされる製 薬上の各種成分 （薬学的に許容し得る各種担体等） が挙げられる。 他の成分は、 本発明の機能性水により発揮される効果が損なわれない範囲で適宜含有すること ができる。
本発明の医薬組成物中、 有効成分である本発明の機能性水の配合割合は、 限定 はされず、 骨形成促進作用、 具体的には骨芽細胞の骨形成能の向上作用あるいは 一旦抑制され若しくは低下した骨形成能の回復作用を効果的に発揮することがで きるように、 適宜設定することができる。 また、 使用する本発明の機能性水の含 有水素量は、 前記 2ズ 1)の項で述べた範囲内であることが好ましい。
本発明の医薬組成物は、 ヒト又は非ヒト哺乳動物に対し、 種々の投与経路、 具 体的には、 経口又は非経口 （例えば静脈注射、 筋肉注射、 皮下投与、 直腸投与、 経皮投与） で投与することができる。 従って、 医薬組成物として本発明の機能性 水を単独で用いることも可能であるが、 投与経路に応じて慣用される方法により 薬学的に許容し得る担体を用いて適当な剤形に製剤化することができる。
好ましい剤形としては、 液状である本発明の機能性水を含有しうる剤形であれ ば限定はされず、 経口剤では、 例えば、 シロップ剤及びカプセル剤等が好ましく 挙げられ、 非経口剤では、 例えば、 注射剤 （点滴剤を含む） 等が好ましく挙げら れる。 注射剤として使用する場合は、 水素を生理食塩水に溶解させることが好ま しレ、。
これら製剤の製剤化に用い得る担体としては、 例えば、 通常用いられる賦形剤、 着色剤、 及び矯味矯臭剤のほか、 必要に応じ、 安定化剤、 乳化剤、 吸収促進剤、 界面活性剤、 pH調整剤、 防腐剤、 抗酸化剤、 増量剤、 湿潤化剤、 表面活性化剤、 2007/065984 分散剤、 緩衝剤、 保存剤、 溶解補助剤、 及び無痛化剤等が挙げられ、 医薬品製剤 の原料として用いることができる公知の成分を配合して、 常法により製剤化する ことが可能である。
本発明の医薬組成物に使用可能な無毒性の成分としては、 例えば、 大豆油、 牛 脂、 及び合成グリセライド等の動植物油；流動パラフィン、 スクヮラン、 及び固 形パラフィン等の炭化水素；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、 ソルビタン脂 肪酸エステル、 グリセリン脂肪酸エステル、 ポリオキシエチレンソルビタン脂肪 酸エステル、 ポリオキシエチレン硬化ひまし油、 及ぴポリオキシエチレン一ポリ ォキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤； ヒ ドロキシェチルセル口 ース、 ポリアク リノレ酸、 カルボキシビュルポリマー、 ポリエチレングリコーノレ、 ポリビュルピロリ ドン、 及びメチルセルロース等の水溶性高分子；エタノール、 及ぴイソプロパノール等の低級アルコール； ク"リセリン、 プロピレンダリコール、 ジプロピレングリコール、 ソルビトール、 及びポリエチレングリコール等の多価 アルコール (ポリオール) ；グルコース、 及ぴショ糖等の糖；塩ィヒナトリウム、 リン酸ナトリゥム等の無機塩；精製水等が挙げられ、 いずれもその塩またはその 水和物であってもよい。
本発明の医薬組成物を非経口投与 （例えば注射投与） する場合、 その有効な投 与量は、 例えば、 症状の程度、 年齢、 性別、 体重、 投与形態、 塩の種類、 及ぴ疾 患の具体的な種類等に応じて異なり、 限定はされないが、 例えば、 成人の場合は 体重 60kgの人で 1日あたり 200〜l，000mlを、 それぞれ 1回で又は複数回に分け て投与することができる。
本発明の医薬組成物を経口投与する場合、 その投与形態及び有効な投与量は、 投与対象、 投与経路、 製剤の性質、 患者の状態、 及び医師の判断等に左右される ものであり、 限定はされないが、 例えば、 成人の場合は体重 60kgの人で 1日あ たり 300〜3，000ml、 好ましくは 500〜3，000mlを、 それぞれ 1回で又は複数回に 分けて投与することができる。 投与経路の効率が異なることを考慮すれば、 必要 とされる投与量は適宜広範に設定することができる。
本発明の医薬組成物の骨形成促進作用の確認方法は、 特に限定はされない。 また本発明は、 当該医薬組成物を患者に投与する、 すなわち前述した本発明の JP2007/065984 機能性水 （骨形成促進用の機能性水） を患者に投与することを含む、 骨粗鬆症の 予防及び Z又は治療方法、 ならびに炎症性疾患による骨形成抑制症状の予防及び Z又は治療方法を含むものである。 さらに本発明は、 骨粗鬆症の予防及び/又は 治療用の、 あるいは炎症性疾患による骨形成抑制症状の予防及び/又は治療用の、 骨形成促進用の機能性水を含むものである。 さらに本発明は、 骨粗鬆症を予防及 び/又は治療するための、 あるいは炎症性疾患による骨形成抑制症状を予防及ぴ /又は治療するための医薬組成物の製造のための、 骨形成促進用の機能性水の使 用を含むものである。 5 . 骨形成用細胞等の培養
本発明の骨形成用細胞及び Z又は組織の培地は、 前述した本発明の機能性水を 含むことを特徴とするものである。
本発明の培地の種類は、 限定はされず、 公知の各種液体培地が好ましく例示で きるが、 水分を含有しうるものであれば公知の各種固形培地であってもよい。 骨形成用細胞及ぴ Z又は組織の種類は、 限定はされず、 ヒト又は非ヒト動物の 骨芽細胞及び骨芽細胞様細胞など、 ならびにこれら細胞を含む生体組織又は組織 片が挙げられる。
本発明の培地中、 本発明の機能性水の含有割合は、 限定はされず、 培養する骨 形成用細胞及び/又は組織の骨形成能の向上作用あるいはー且抑制され若しくは 低下した骨形成能の回復作用を効果的に発揮することができるように、 適宜設定 することができる。 また、 使用する本発明の機能性水の含有水素量は、 前記 2 .(1)の項で述べた範囲内であることが好ましい。
本発明の培地は、 本発明の機能性水以外に他の成分を含むことができ、 例えば、 培養する骨形成用細胞及び Z又は組織の種類等に応じ、 培地成分として通常必要 とされる公知の成分を含むことができる。
また本発明は、 上記本発明の培地中で骨形成用細胞及び/又は組織を培養する ことを特徴とする、 骨形成用細胞及び/又は組織の培養方法も含む。 当該培養方 法において、 各種培養手順及び条件等 （培養温度及び培養時間等） は、 培養する 骨形成用細胞及び Z又は組織の種類等に応じ、 常法に従い適宜設定することがで 4 きる 以下に、 実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、 本発明はこれらに 限定されるものではない。
〔実施例 1〕
マウス骨芽細胞様細胞培養株 MC3T3-E1のカルシウム沈着 （骨結節形成） に 対する、 水素溶存水及び過酸化水素水 （活性酸素） の影響を調べるため、 以下の 手順で実験を行った。 1 . 試料細胞の調製 （図 1 (0を参照）
マウス骨芽細胞様細胞株 MC3T3-E1を、 75cm2組織培養フラスコを用いて、 37 °C、 95%Air及び 5%C02雰囲気のインキュベータ一中で培養した。 培養液には、 10%FBS、 及び抗生物質 (ゲンタマイシン、 アンフォテリシン、 ペニシリン） を含むひ- MEM (Gibco) を用い、 培養液は週 3回交換した。 細胞の継代は、 コ ンフルェントになる前にトリプシンにて播きかえて行った。
2 . 前処理 （図 l (ii)を参照）
上記 1 .で得られた培養細胞を 3つの系に分けて、 マルチゥエルプレートの各 ゥエルに適宜移し、 それぞれの系に対して下記 (2-1)、 （2-2)又は (2-3)の処理を行 つた。
(2-1) 純水 （MQ) による処理
上記 1 .で用いた培養液中、 溶媒成分として、 ミリポア一純水装置で得られた MQを用いた培養液を調製し、 この培養液に交換して上記 1 .の培養細胞を培養し た。 培養は、 37°C、 95%Air及び 5%C02雰囲気のインキュベータ一中で、 3時 間行った。
(2-2) H2O2水による処理
上記 (2-1)で調製した培養液に、 終末濃度 400 μ Μ Η202となるように Η202水を 添加した培養液を調製し、 この培養液に交換して上記 1 .の培養細胞を培養した。 培養条件は、 上記 (2-1)と同様にして行った。 この処理によって、 培養細胞に対 して活性酸素により 3時間刺激したこととなる。
(2-3) H202水と水素溶存水との混合液による処理
上記 (2-1)で調製した培養液において、 MQの代わりに MQに水素を溶存させた 水素溶存水 （含有水素量： 0.350〜0.450ppm， 酸化還元電位： - 300〜- 605mV) を用いた培養液を調製した。 次いで、 得られた培養液に、 終末濃度 400 μ Μ Η2Ο2となるように Η202水を添加した培養液を調製し、 この培養液に交換して上 記 1 .の培養細胞を培養した。 培養条件は、 上記 (2-1)と同様にして行った。 この 処理によって、 水素溶存水により直接的に活性酸素の消去を行ったことになる。 3 . 培養 （図 l ii)を参照）
上記 2 .で行った 3種の前処理後の培養細胞を、 別のマルチウヱルプレートの 各ゥヱルに適宜移し、 それぞれの系について、 MQを用いた培養と、 水素溶存水 を用いた培養とを行った。 各培養の詳細を下記 (3-1)及び (3-2)に示す。 合計 6種 の培養系を図 l (iii)に示す通り（A)〜(F)とした。 また、 培養系 (A)〜(F)のそれぞ れについて、 7、 1 4、 2 1及び 3 0日間の 4種の培養期間で培養を行った。
(3-1) MQを用いた培養
上記 2 .(2-1)で調製した培養液に交換して培養を行った。 なお、 培養系 (A)につ いては、 培養液の種類に変更は無いが、 他の系と同様に培養液の交換を行った。 培養は、 培養は、 37。C、 95%Air及ぴ 5%CO2雰囲気のインキュベータ一中で 行い、 培養液は週 3回交換した。
(3-2) 水素溶存水を用いた培養
上記 2 .(2-3)で調製した水素溶存水を用いた培養液 （H202は含まない） に交換 して培養を行った。 培養条件は、 上記 (3-1)と同様にして行った。 4 . カルシウム濃度の測定
Sigma #587カルシウム測定キットを用いて、 各培養系 (A)〜(F)の培養後の力 ルシゥム濃度 （mg/dl) を定量的に測定した。 カルシウム濃度が高いほど、 MC3T3-E1細胞株のカルシウム沈着が大きいことを示し、 骨結節形成能が高い ことを意味する。 具体的には、 培養後の各細胞は、 上清を取り除き PBSにて 2回洗浄した後、
0.5M HC1を加えて 1時間室温にて放置して、 採取した。 次いで、 前記キットを 用い、 マイクロプレートリーダーにて 550nmでの吸光度測定を行った。 その結 果を図 2に示す。 なお、 カルシウム濃度の算出は、 以下の式に従って行った。
Ca2+ concentration、mg/dl)
= [Sample OD/Ca2+ standard ODJ X standard concentration、mg/dl)
5 . 考察
図 2のグラフに示す結果より、 水素溶存水を含む培地中で培養した場合 （ (B),(D),(F)) は、 水素溶存水を含まない系 （(B)，(D)，(F)に対し順に (A)，(C),(E)) に比べて細胞の骨結節形成能が有意に高いことが確認された。 特に、 培養系 (A) と (B)とでは有意差が顕著であつた。
また、 培養前に、 一旦、 細胞を H202で処理して骨結節形成能を抑制又は低下 させた後 （(C)，(D)) 、 水素溶存水を含む培地で培養した場合 （(D)) は、 水素溶 存水を含まない系 （(C)) に比べて骨結節形成能を有意に回復できることが確認 された。
さらに、 培養前に H202で処理する際に、 併せて水素溶存水も加えておいた場 合 （(E)，(F)) は、 水素溶存水を加えない系 （(C)，(D)) に比べて骨結節形成能の 抑制又は低下が抑えられることが確認された。
〔実施例 2〕
in oにおける水素含有水の骨量減少に対する抑制作用を明らかにする目的 で、 卵巣摘出骨粗鬆症モデルラットを用いて、 体重、 子宮重量、 骨密度及び血清 の骨代謝マーカーを測定し、 水素含有水の骨代謝に対する作用について検討した。
1 . 実験動物
実験動物は、 6週齢の Sprague-Dawley 系雌ラット （静岡実験動物） を 1週 間予備飼育した後、 実験に用いた。 1群 6匹の計 6群に分け、 そのうち 4群は常 法に従い背部より両側卵巣摘出術 （OVX) を施し、 骨粗鬆症モデルラットの群 (OVX群） とした。 残りの 2群は、 OVX群に対する対照として、 偽手術 (sham) を施した群 （sham群） とした。 2週間の予備飼育をした後、 9週齢 より、 与える飼料の違いによって、 正常 Ca飼料 （1.12%Ca含有の粉末飼料 MF®, オリエンタル酵母工業（以下同様）） 群と、 低 Ca飼料 （0.05%Ca含有の粉 末飼料， オリエンタル酵母工業（以下同様）） 群とに分け、 OVX ラットには飲料 水として蒸留水又は水素含有水 （含有水素量：約 1.33ppm， 酸化還元電位：約- 700mV) を自由飲水させた。 動物の飼育は、 室温 23±1°C、 湿度 60±10%、 12 時間ごとの明暗サイクルの環境下で行った。 2 . 実験材料
水素含有水は、 蒸留水に水素ガスを飽和させて作製した （含有水素量：約 1.33ppm, 酸化還元電位：約- 700mV) 。 この水素含有水を 1日 2回 （朝晚 1回 ずつ） 新しく入れ替えて、 ラットに自由飲水させた。 なお、 水素含有水の含有水 素量 (溶存水素濃度）は、 ポータブル溶存水素計 （東亜ディケーケー株式会社） を 用いて測定した。
3 . 実験方法
動物は、 ペントバルビタールナトリウム （ネンブタール ®, 大日本製薬） を 25mg/kg の用量で静脈内投与して全身麻酔し、 手術野を電気バリ力ンで剃毛し た後、 希ヨードチンキ液で消毒した。 その後、 常法に従って、 動物の背部から卵 巣を摘出した。
動物は、 1群 6匹として 6群用意し、 第 1〜 3群の動物は正常 Ca飼料で飼育 し、 第 4〜 6群の動物は低 Ca飼料で飼育した。 そして、 第 1群は偽手術をし蒸 留水を与えた群 （sham-Ca群） 、 第 2群は OVXで蒸留水を与えた群 （OVX-Ca 群） 、 第 3群は OV で水素含有水を与えた群 （OVX-Ca-Hy群） 、 第 4群は偽 手術をし蒸留水を与えた群 （sham-LCa群） 、 第 5群は OVXで蒸留水を与えた 群 （OVX-LCa 群） 、 第 6群は OVX で水素含有水を与えた群 （OVX-LCa-Hy 群） とした。 以上、 第 1〜 6群の詳細について、 下記の表 1にまとめた。
実験期間は、 約 9力月間とし、 実験期間中は、 動物の一般状態を毎日観察し、 週 1回、 体重、 飼料摂取量及ぴ摂水量を測定した。 ただし、 飲料水の水素含有水 は 1日 2回 （朝晚 1回ずつ） 新しく入れ替えた。 mi
Figure imgf000015_0001
4 . 軟 X線及び骨密度測定
歯科用デンタル X線による Kodak 社製の超高感度の Ultra Speed (75mmx55mm) の X線フィルムを用い、 右大腿骨を画像処理した。 その結果 を図 3に示す。
5 . 軟 X線及び骨密度測定の結果
軟 X線画像 （図 3 ) に基づいて、 海綿骨の骨梁変化を形態学的に検討した結果、 正常 Ca飼料及ぴ低 Ca飼料を与えた動物は、 いずれも、 sham群に比べて OVX 群の方が、 有意に骨量低下傾向が認められた。 また、 低 Ca飼料を与えた動物に おいては、 OVX-LCa群に比べて OVX-LCa-Hy群の方が、 骨量の増加が認めら れた。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 骨形成促進作用、 すなわち骨形成能の亢進及び回復作用に優 れた機能性水を提供することができる。 また本発明の機能性水は、 飲料、 食料、 飼料、 骨形成用細胞及ぴノ又は組織培 養用培地、 並びに医薬組成物等の各種用途に用いることができ、 さらに、 骨粗鬆 症の予防及び/又は治療方法、 並びに炎症性疾患による骨形成抑制症状の予防及 び/又は治療方法に用いることができるため、 極めて有用性が高いものであると 言える。

Claims

請求 の 範 囲
1 . 水素を含むことを特徴とする骨形成促進用の機能性水。
2 . 含有水素量が 0.350PPII1以上である請求項 1記載の機能性水。
3 . 酸ィ匕還元電位が- 300mV以下である請求項 1又は 2記載の機能性水。
4 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の機能性水を含有する飲料。
5 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の機能性水を含有する食料。
6 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の機能性水を含有する飼料。
7 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の機能性水を含む医薬組成物。
8 . 骨粗鬆症を予防及び Z又は治療するための請求項 7記載の組成物。
9 . 炎症性疾患による骨形成抑制症状を予防及び Z又は治療するための請求項 7 記載の組成物。
1 0 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の機能性水を含む、 骨形成用細胞及び
/又は組織の培地。
1 1 . 請求項 1 0記載の培地中で骨形成用細胞及び Z又は組織を培養することを 特徴とする、 前記細胞及び Z又は組織の培養方法。
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