WO2008007804A1 - ANTICORPS ANTI-INTÉGRINE α-9 HUMAINE ET UTILISATION DE CELUI-CI - Google Patents

ANTICORPS ANTI-INTÉGRINE α-9 HUMAINE ET UTILISATION DE CELUI-CI Download PDF

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Masashi Kanayama
Daisuke Kurotaki
Shigeyuki Kon
Toshimitsu Uede
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    • G01N2333/70546—Integrin superfamily, e.g. VLAs, leuCAM, GPIIb/GPIIIa, LPAM

Definitions

  • the present invention relates to an antibody specifically recognizing human 9 integrin (particularly a monoclonal antibody), a chimeric antibody, a humanized antibody and a human antibody; a hybridoma cell producing the monoclonal antibody; A method for producing the hybridoma cell; a therapeutic agent containing the anti-human a9 integrin antibody; a diagnostic agent containing the human 9 integrin antibody; a compound that inhibits the activity of human 9 integrin. It relates to the screening method. Background art
  • Organisms are cells that are the smallest functional units that carry out biological phenomena, cells that work in the same way together to form tissues, and various tissues gather together to form organs with a certain function. As a whole, it conducts life activities that are harmonious and unified. Many tissues are basically composed of cells and extracellular matrix, and the structure is maintained by adhesion between cells and extracellular matrix and adhesion between cells and extracellular matrix. Up to now, the extracellular matrix has not been biologically active and has been thought of as a stuffing, but it has become clear that it actually plays an important role in almost all tissues. Adhesion activity between cells and extracellular matrix has become known, suggesting that it is involved not only in the role of cell scaffold but also in the regulation of various cell functions and the maintenance of tissue and organ homeostasis, The importance has become more recognized.
  • integrins are composed of ⁇ ; chain and] 3-chain 1: 1 heterodimers, and to date, 8 types of ⁇ -chains; 8 types of 8-chains were discovered, and in combination, at least 2 4 The type is identified and confirmed. Each integrin is known to recognize a specific extracellular matrix (ligand).
  • transmembrane cell adhesion proteins including integrins is not only the adhesion and fixation of cells and extracellular matrix, but also the information from extracellular matrix. It has been elucidated that it is converted into intracellular signals and is responsible for the regulation of cell proliferation, movement, cell death, differentiation and the like.
  • Integrins are classified as subfamily based on their ligand specificity and function, and R GD receptors that recognize ArGG 1 yA sp (RGD) sequences in collagen receptors, laminin receptors, fibronectin and vitronectin, etc. A distinction is made between leukocyte-specific receptors present only in leukocytes (Hynes R0. 2002. Integrins: Bidirectional, Allosteric Signaling Machines. Cell 110: 673-87; Miyasaka M. 2000. New edition of Adhesion Molecule handbook. Shu junsya.) The a4 and a9 integrins are subfamily members of none of these and are called the four integrin subfamily (Elise L.
  • Osteopontin (hereinafter abbreviated as OPN), which is a type of extracellular matrix (ECM), is a secreted acidic phosphorylated glycoprotein with a molecular weight of approximately 41 k Da, such as milk, urine, renal urine brush, It is a molecule that is widely expressed in osteoclasts, osteoblasts, macrophages, activated T cells, and tumor tissues.
  • the cell adhesion sequence GRGD S and human OPN have S VVYGLR sequences in the middle part of the molecule, mouse OPN has S LAYGLR sequences, and immediately after that there is a thrombin cleavage site.
  • a 4 j3 1 binds to both thrombin-cleaved OPN (non-cleaved OPN) and thrombin-cleaved N-terminal fragment (cleaved OPN), and a 9 ⁇ 1 is cleaved ⁇ ⁇ ⁇ Differences in the pattern of binding only have been found ( ⁇ ⁇ ⁇ . Yokosaki et al., (1999) The Journal of Biological Chemistry 274, 36328-36334; PM Green et al., (2001) FEBS Letters 503, 75- 79; ST Barry et al., (2000) Experimental Cell Research 258, 342-351).
  • the a4 and a9 integrins have many common ligands besides OPN.
  • Huai The EDA site of Bronectin, Propeptide-von von Willebrand Factor (pp-vWF), Tissue-type Transdaltaminase (tTG), Vaginal Blood Coagulation Factor, and Vascular Cell Adhesion Molecule-1 (VCAM—l) are known. ing.
  • a ligand that ⁇ 4 integrin specifically recognizes As a ligand that ⁇ 4 integrin specifically recognizes, CS-1 domain of fiproproten, Mad CAM-1 ( ⁇ 4/3 7) and the like are known.
  • the ligands specifically recognized by 9 integrins are known as tenascin C and plasmin.
  • amino acid sequences of ⁇ 4 and ⁇ 9 integrins and j81 integrin subunits are known and registered in GenB ank. These integrins are known to have high amino acid sequence similarity between species.
  • WO02 / 0 8 1 5 22 discloses the therapeutic effect of rheumatoid arthritis and hepatitis by suppressing OPN function using an OPN-deficient mouse and a neutralizing antibody against OPN.
  • This publication also states that SVVYGLR, which is a recognition sequence for 4 integrin and 9 integrin, is important for the development of inflammatory diseases, and that receptors for OPN are expressed in immunocompetent cells, etc. Is disclosed. Disclosure of the invention
  • the present inventors have focused on integrins, particularly 9 integrins, and as a result of conducting various studies, they have found that specific inhibitory antibodies against ⁇ 9 integrin have cancer suppressive effects and anti-inflammatory effects. completed.
  • the present invention provides the following anti-human ⁇ 9 integrin antibody, its producing cells, a therapeutic agent containing the antibody, a method for screening a compound that inhibits a9 integrin activity, and the like.
  • CDRH 1 in the heavy chain complementarity determining region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, 6, 17, 18, 9, or 41;
  • CDRH 2 is SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23 or 42 amino acid sequence,
  • CDRH 3 is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, 25, 26, 27 or 43, and
  • CDRL 1 in the light chain complementarity determining region (CDRL) is SEQ ID NO: 28, 29 , 30, 3 1 or 44 amino acid sequence,
  • CDRL 2 is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 2, 3, 34, 3 5 or 45,
  • CDRL 3 is SEQ ID NO: 3 6, 3 7, 38, 3 9 Or an anti-human a9 integrin antibody having a 46 amino acid sequence.
  • An anti-human ⁇ 9 integrin antibody having at least one of complementarity determining regions (CDRs) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, 20, 24, 28, 32 or 36.
  • An anti-human 9 integrin antibody having all complementarity determining regions (CDRs) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 20, 24, 28, 32 or 36.
  • An anti-human 9-integrin antibody having at least one of the complementarity determining regions (CDRs) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 7 2 1, 25, 29, 33 or 37.
  • An anti-human ⁇ 9 integrin antibody having all complementarity determining regions (CDRs) containing the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 7 2 1, 25, 29, 33, or 37.
  • An anti-human ⁇ 9 integrin antibody having at least one of complementarity determining regions (CDRs) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 82, 26, 30, 34, or 38.
  • An anti-human ⁇ 9 integrin antibody having all complementarity determining regions (CDRs) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 82, 26, 30, 34, or 38.
  • An anti-human ⁇ 9 integrin antibody having at least one of the complementarity determining regions (CDRs) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 9 23, 2 7, 3 1, 35 or 39.
  • An anti-human ⁇ 9 integrin antibody having all complementarity determining regions (CDRs) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45 or 46.
  • the anti-human 9 integrin antibody according to any one of (1) to (14), which is a monoclonal antibody.
  • a therapeutic agent for cancer, inflammatory disease, infectious disease, autoimmune disease or bone disease comprising the anti-human ⁇ 9 integrin antibody according to any one of (1) to (18) as an active ingredient.
  • Cancer inflammatory disease, infectious disease, autoimmunity comprising both the anti-human ⁇ 9 integrin antibody and the anti-human ⁇ 4 integrin antibody described in any of (1) to (18) as active ingredients
  • a therapeutic agent for diseases or bone diseases comprising both the anti-human ⁇ 9 integrin antibody and the anti-human ⁇ 4 integrin antibody described in any of (1) to (18) as active ingredients
  • a diagnostic agent for cancer, inflammatory disease, infectious disease, autoimmune disease or bone disease comprising the anti-human ⁇ 9 integrin antibody according to any one of (1) to (18) as an active ingredient.
  • the antibody of the present invention can suppress cancer by integrin function, such as cancer (for example, proliferation and metastasis of cancer cells), inflammatory disease (for example, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, hepatitis, bronchial asthma, ⁇ cotton fibrosis, diabetes, arteries Sclerosis, multiple sclerosis, inflammatory bowel disease (ulcerative colitis, Crohn's disease)), infection (eg hepatitis), autoimmune disease (eg systemic lupus erythematosus, polymyositis, autoimmune thyroid disease) It has therapeutic effects on tubulointerstitial nephritis, myasthenia gravis) and bone diseases (for example, osteoporosis).
  • cancer for example, proliferation and metastasis of cancer cells
  • inflammatory disease for example, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, hepatitis, bronchial asthma, ⁇ cotton fibrosis, diabetes, arteries Sclerosis, multiple
  • the pharmaceutical composition containing both the anti- ⁇ 9 integrin antibody and the anti- ⁇ 4 integrin antibody of the present invention has further improved therapeutic effects on cancer, inflammatory diseases and the like.
  • the antibody of the present invention can be used as a diagnostic agent because it can detect pathologically the expression of 9 integrin in cells and tissues.
  • FIG. 1 shows the results of analysis of the phase recognition region (C D R) of the anti-human 9 integrin antibody.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of examining the cell adhesion inhibitory effect of 5 clones of anti-human ⁇ 9 integrin antibody on human 9 integrin-expressing cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing the cell adhesion inhibitory effects of cancer cells when allowed to coexist anti Hitohi 9 integrin antibody and anti-human alpha 4 integrin antibody (human melanoma cells).
  • FIG. 4 is a graph showing the therapeutic effect of anti-mouse ⁇ 9 integrin antibody on rheumatoid disease models.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of examining the effect of anti-mouse ⁇ 9 integrin antibody on the treatment of arthritis using the mouse arthritis model.
  • FIG. 6 shows an arthritis suppression image by anti-mouse 9 integrin antibody.
  • FIG. 7 shows the results of examining the therapeutic effect of anti- ⁇ 9 integrin antibody after the onset of arthritis.
  • Figure 8 shows the effect of anti-mouse ⁇ 9-integrin antibody on the therapeutic effect of arthritis after the onset of arthritis. It is a figure which shows a result.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of measuring IL-17 and ROR Y t expression in mouse inguinal lymph nodes in order to examine the involvement of Thl7 in a mouse arthritis model.
  • Tysabri® (natalizumab), an antibody against 4 integrins, was frequently generated in January 2004 by Piogen plec Inc. (Biogen plec Inc., Massachusetts, USA) and Elan (Ireland, Ireland). It is approved by the US Food and Drug Administration (FDA) as a sclerosis treatment. Tysabri (registered trademark) has been clinically developed for diseases such as Crohn's disease and rheumatoid arthritis. An anti-human a 4 3 1 integrin monoclonal antibody called P 4 C 2 is used at the laboratory level.
  • 9 A 2 A monoclonal antibody called 9 A 2 (A. Wang et al,, (1996) Am. J. Respir., Cell Mol. Biol. 15, 664-672) is provided for laboratory use but is not used clinically.
  • an antibody that specifically reacts with human 9 integrin could be obtained by carefully proceeding the following points.
  • CHO-K1 cells which are hamster ovary-derived cells, were transfected, and a cell line overexpressing human ⁇ 9 integrin was established. did.
  • the present invention provides monoclonal antibodies against human ⁇ 9 integrin.
  • the term “antibody” refers to a whole antibody molecule or a fragment thereof (for example, a fragment of F ab, F ab ′, F (ab ′) 2 , etc.) that can bind to the antigen 9 integrin or a partial peptide thereof. ) And may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Preferably, in the present invention, it means a monoclonal antibody.
  • “antibody” includes chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies.
  • “Monoclonal antibody” in the present invention is highly specific for an antigen and recognizes a single antigen.
  • antibody fragment refers to a part of a full-length antibody, and is an antigen-binding region or a variable region.
  • antibody fragments include F ab, F ab ′, F (ab ′) 2 , and Fv fragments. These antibody fragments can be prepared by generally known methods such as papain digestion and pepsin digestion of antibodies.
  • chimeric antibody refers to a human mouse “chimeric antibody” in which the constant region of the anti-human ⁇ 9 integrin antibody obtained in the present invention has been genetically engineered to have the same constant region as the human antibody.
  • Humanized antibody means that the primary structure of the anti-human 9 integrin antibody obtained in the present invention other than the complementary recognition region of the ⁇ chain and L chain is genetically modified to a primary structure corresponding to a human antibody.
  • Heat antibody means a monoclonal antibody (see European Patent Publication No. 0546073) prepared using a transgenic animal into which a gene involved in human antibody production has been introduced.
  • the present invention first selects from the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 1, 12, 13, 4, or 15.
  • An anti-human ⁇ 9 integrin antibody that recognizes one or more amino acid sequences is provided.
  • the antibody according to a preferred embodiment of the present invention is selected from the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 1, 12, 13, 14 or 15. Recognize 3 or more, 4 or more, 5 or more, or 6 amino acid sequences.
  • Preferred antibodies of the present invention are: (1) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 11; (2) SEQ ID NO: 5; 3) Array (4) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 1 3, amino acid sequence (5) SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 1 (6) amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 15; (7) SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 13; (8) The amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 is specifically recognized.
  • the antibody according to a preferred embodiment of the present invention has at least one of complementarity determining regions (CDRs) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, 20, 24, 28, 32 or 36.
  • Further preferred antibodies comprise 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, or 6 of the complementarity determining regions (CDRs) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, 20, 24, 28, 32 or 36.
  • Anti-human ⁇ 9 integrin antibody having, particularly preferred antibodies are: (1) amino acid sequences of SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, and SEQ ID NO: 36; (2) SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20 And the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; (3) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, and SEQ ID NO: 36; (4) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, and SEQ ID NO: 24; or (5) the amino acid sequences of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 36;
  • An antibody according to another embodiment of the present invention has at least one complementarity determining region (CDR) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, 21, 25, 29, 33, or 37.
  • Further preferred antibodies comprise 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, or 6 of the complementarity determining regions (CDRs) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, 21, 25, 29, 33 or 37.
  • Particularly preferred antibodies are (1) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, and SEQ ID NO: 37; (2) SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21 And amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 (3) amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33, and SEQ ID NO: 37 (4) amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 25; or (5 ) Containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 37;
  • an antibody according to another embodiment of the present invention includes a small number of complementarity determining regions (CDRs) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, 22, 26, 30, 34, or 38. Have at least one. Further preferred antibodies have 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more or 6 of the complementarity determining regions (CDRs) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, 22, 26, 30, 34 or 38.
  • Anti-human 9 integrin antibodies particularly preferred antibodies are: (1) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, and SEQ ID NO: 38; (2) SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, And amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 (3) amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, and SEQ ID NO: 38 (4) amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, and SEQ ID NO: 26; or (5 ) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 38;
  • An antibody according to another embodiment of the present invention has at least one complementarity determining region (CDR) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, 23, 27, 31, 35 or 39.
  • Further preferred antibodies have 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more or 6 of the complementarity determining regions (CDRs) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, 23, 27, 31, 35 or 39
  • Anti-human ⁇ 9 integrin antibody, particularly preferred antibodies are: (1) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, and SEQ ID NO: 39; (2) SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: And amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 (3) amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, and SEQ ID NO: 39 (4) amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 27; or (5) the amino acid sequences of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 39;
  • An antibody according to another embodiment of the present invention has at least one complementarity determining region (CDR) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45 or 46.
  • Further preferred antibodies have 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more or 6 of the complementarity determining regions (CDRs) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45 or 46
  • Anti-human ⁇ 9 integrin antibody particularly preferred antibodies are: (1) amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, and SEQ ID NO: 46; (2) SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: And amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 (3) amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, and SEQ ID NO: 46 (4) amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43; or (5 ) SEQ ID NO: 43 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46; Contains the
  • Particularly preferred antibodies in the present invention are accession numbers FERM B P- 1 05 1 0, FERM BP— 1 05 1 1, FERM BP— 1 05 1 2, FERM BP— 1 0 5 1 3 or FERM BP— 1 0 8 3 Anti-human 9 integrin antibody produced by the hybridoma cells indicated by 2.
  • the 9 integrin used as an antigen in the present invention includes (1) a protein derived from any cell expressing human or other mammalian 9 integrin, or any tissue in which those cells exist, (2) 9 It may be a recombinant protein obtained by introducing and expressing a gene DNA encoding integrin, preferably cDNA, into a cell line such as bacteria, yeast or animal cells, or (3) a synthetic protein.
  • the 9 integrin of the present invention has an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence of 9 integrins of various mammals, particularly preferably the amino acid sequence of human 9 integrin (SEQ ID NO: 40). Polypeptides having are also included.
  • a polypeptide having substantially the same amino acid sequence means that the amino acid has a biological property substantially equivalent to that of a naturally occurring ⁇ 9 integrin, particularly preferably a human-derived ⁇ 9 integrin.
  • a plurality of amino acids in the acid sequence preferably 1 to 10 amino acids, particularly preferably 1 to several (eg 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2))
  • the amino acid sequence of the native 9 integrin particularly preferably the human 9 integrin, which has a substituted, deleted and modified or modified amino acid sequence.
  • a plurality of amino acids preferably 1 to 10 amino acids, particularly preferably 1 to several (eg 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2)) It means a mutant polypeptide having an amino acid sequence in which the amino acid is added. Further, it may be a mutated polypeptide having a plurality of such substitutions, deletions, modifications and additions.
  • Alpha 9 integrin of the present invention particularly alpha 9 integrin from human, genetically
  • it can be produced by appropriately using a method known in the technical field such as a chemical synthesis method or a cell culture method or a modification method thereof.
  • methods for producing mutant polypeptides include synthetic oligonucleotide site mutagenesis (gapped duplex method), point mutation at random by nitrite or sulfite treatment, B a
  • Examples include methods for preparing deletion mutants with enzymes such as 1 3, cassette mutation methods, linker scanning methods, misincorporation methods, mismatch primer methods, and DNA segment synthesis methods.
  • the 9 integrin of the present invention includes a “part” of the 9 integrin.
  • the “part” is a part including a region necessary for binding to an ⁇ 9 integrin ligand such as OPN, tenascin-C, VCAM-1, etc. Specifically, it is represented by SEQ ID NO: 1.
  • the “part” of the ⁇ 9 integrin can be produced by a gene recombination technique or a chemical synthesis method according to a method known in the art or a modification method thereof described later, or a cell culture method. It can be produced by appropriately cleaving the 9 integrin isolated by the above method, particularly preferably the ⁇ 9 integrin derived from human, using a protein segmentation enzyme or the like.
  • the cell itself that overexpresses 9 integrin on the cell membrane by a recombinant technique, or a membrane fraction thereof can be used.
  • the 9 integrin of the present invention also includes a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence of human ⁇ 9 integrin (SEQ ID NO: 40).
  • SEQ ID NO: 40 As a polypeptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40, specifically, it has an amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 15, Human ⁇ 9 integrin is exemplified.
  • cells that overexpress human ⁇ 9 integrin on the cell membrane by a recombinant technique are preferably used.
  • a gene encoding a human alpha 9 integrin (e.g., c D NA) using known genetic engineering techniques claw - Ngushi, cells that human alpha 9 integrin over-expressed on the cell membrane
  • the cell membrane fraction itself or its cell membrane fraction is prepared as an antigen.
  • the antigen is administered to an immunized animal per se, together with a carrier or diluent, at a site where antibody production is possible by administration.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration.
  • Administration is usually once every 1 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times.
  • warm-blooded animals used include mice, monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, rats, hamsters, hidges, goats, chickens, and the like. In the present invention, mice are preferably used. .
  • the subject of treatment is human and the ⁇ 9 integrin-inhibiting antibody-producing animal is a mouse
  • the myeloma cell a cell derived from mouse, rat, human or the like is used.
  • mouse myeloma ⁇ 3 U 1, ⁇ 3 ⁇ 63—Ag 8, P 3X63—Ag 8_U1, P 3NS 1—Ag 4, SP 2 / 0—Ag l 4, P 3X63—Ag 8—653, etc.
  • the production cell and the myeloma cell are preferably derived from the same species of animal, particularly from the same strain.
  • Myeloma cells can be stored frozen or passaged and maintained in a common medium supplemented with horse, rabbit or rabbit fetal serum.
  • cells in the logarithmic growth phase are preferably used.
  • P 3 X63-Ag 8-653 is preferably used.
  • Methods for fusing antibody-producing cells and myeloma cells to form a hybridoma include a method using polyethylene dallicol (PEG), a method using Sendai virus, and a method using an electrofusion device.
  • PEG polyethylene dallicol
  • splenocytes and myeloma cells are placed in an appropriate medium or buffer containing about 30 to 60% PEG (average molecular weight 1000 to 6000), 1 to 10: 1, preferably 5 to 10: 1.
  • the mixture is suspended at a temperature of about 25 to 37 ° C. and pH of 6 to 8 for about 30 seconds to 3 minutes. After the reaction is complete, remove the PEG solution, resuspend in the medium, and inoculate in a cellulose plate to continue the culture.
  • hybridoma cells that produce monoclonal antibodies are known or not. It can be performed according to a method according to this. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HA T (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). Any culture medium may be used as the selection culture medium as long as the hybridoma cells can grow.
  • HA T hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • Any culture medium may be used as the selection culture medium as long as the hybridoma cells can grow.
  • RPM I 16 40 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Strain)) or serum-free medium for hybridoma culturing (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is
  • Monoclonal antibodies can be prepared from such clones by repeating the limiting dilution method 1 to 5 times, preferably 2 to 4 times.
  • the obtained antibody can be purified to homogeneity. Separation and purification of antibodies may be carried out using the separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, chromatography columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. are appropriately selected and combined to separate and purify antibodies. (Antibodies: A Laboratory Manual. Har ⁇ Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) Force S, but is not limited to these. Columns used for affinity chromatography include protein A columns and protein G columns. For example, Hyper D, P0R0S, Sepharose FF (Amershara Biosciences) etc. are mentioned as a column using a protein A column.
  • the obtained antibody can be labeled with various labeling agents (for example, using known methods or commercially available kits).
  • Biotin labeling, FITC labeling, APC labeling In the present invention, a biotin labeling kit using Biotin Labeling Kit (Dojindo Laboratories) is preferably used.
  • the monoclonal antibody thus obtained is purified if necessary and then formulated in accordance with conventional methods to prevent cancer, inflammatory diseases, infectious diseases, autoimmune diseases and bone diseases, etc. Can be used.
  • These dosage forms as preventive and therapeutic agents can be parenteral preparations such as injections and infusions, and can be used as oral preparations by ingenuity.
  • carriers, diluents, or additives suitable for the dosage form can be used within the pharmacologically and pharmaceutically acceptable range.
  • the role of integrins is not only the adhesion and fixation of cells and extracellular matrix (ECM), but also converts information from the extracellular matrix into intracellular signals, and regulates cell growth, movement, cell death, differentiation, etc. It has been elucidated. Therefore, the obtained monoclonal antibody can block intracellular signal transduction of information from ECM by inhibiting the binding of ECM and 9 integrin, so that it can treat diseases involving ECM. is there.
  • ECM that binds to ⁇ 9 integrin, and OPN, fibronectin, propeptide von Willebrand factor (pp-vWF), tissue type transdaltaminase (tTG), ⁇ ⁇ blood coagulation factor, Vascular Cell Adhesion Molecule-1 (VC AM— l), tenascin C, plasmin, etc. are known.
  • OPN fibronectin
  • tTG tissue type transdaltaminase
  • tTG tissue type transdaltaminase
  • ⁇ ⁇ blood coagulation factor ⁇ ⁇ blood coagulation factor
  • VC AM— l Vascular Cell Adhesion Molecule-1
  • tenascin C plasmin, etc.
  • the preparation containing the antibody of the present invention (particularly, monoclonal antibody) as an active ingredient is cancer, for example, cancer cell proliferation, metastasis, inflammatory disease (for example, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, hepatitis, bronchial asthma, cotton fiber) , Diabetes, arteriosclerosis, multiple sclerosis, inflammatory bowel disease (ulcerative colitis, Crohn's disease)), infection (eg hepatitis), autoimmune disease (eg systemic lupus erythematosus, polymyositis, self It can be used as a therapeutic agent for immune thyroid disease, tubulointerstitial nephritis, myasthenia gravis) and bone disease (for example, osteoporosis).
  • the term “treatment” is used to mean “prevention”.
  • the dose varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc.
  • the antibody of the present invention is usually used as a single dose. 1 to 2 O mg Z kg body weight, preferably 0:! To 1 O mg / kg body weight, more preferably 0.1 to 5 mg / kg body weight, 1 to 10 times a month It is convenient to administer by intravenous injection to a degree, preferably about 1 to 5 times a month. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose or number of doses may be increased depending on the symptoms.
  • the antibody of the present invention can be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration comprises the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided as parenteral or oral dosage forms.
  • compositions for parenteral administration include injections, nasal drops, and suppositories.
  • Injections include dosage forms such as intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, and intravenous injections.
  • Such an injection is prepared, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above-mentioned antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily solution usually used for injections according to a known method.
  • aqueous solution for injection for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose, sucrose, mannitol, and other adjuvants are used, and appropriate solubilizers such as alcohol (eg, ethanol) are used.
  • polyalcohol eg, propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactant eg, polysorbate 80, polysorbate 20, HCO-50 (polyoxyethy 1ene 50 mo 1 adductofhydrogenated c astoroil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection is usually filled into appropriate ampoules, vials, and syringes.
  • a suppository used for rectal administration is prepared by mixing the above-described antibody into a usual nasal base or suppository base.
  • oral administration of proteins such as antibodies is difficult because they are degraded by the digestive tract, but there is also the possibility of oral administration due to the ingenuity of antibody fragments and modified antibody fragments and dosage forms.
  • the parenteral pharmaceutical composition is preferably prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient.
  • dosage forms of such dosage units include injections (ampoules, vials, prefilled 'syringes), nasal drops, suppositories, etc., usually 5 to 500 mg per dosage unit form, especially for injections 5-10 Omg
  • Other dosage forms preferably contain 10-250 mg of the antibody.
  • compositions may contain other active ingredients as long as they do not cause an unfavorable interaction by blending with the antibody.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention can contain an anti-human ⁇ 4 integrin antibody in addition to the above antibody.
  • the mixing ratio in this case is not particularly limited.
  • the ratio of anti-human ⁇ 9 integrin antibody: anti-human 4 integrin antibody can be adjusted within the range of 1 to 99:99 to 1.
  • the pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody of the present invention is used for inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, hepatitis, bronchial asthma, fibrosis, diabetes, cancer metastasis, arteriosclerosis, multiple sclerosis, granulomas, etc.
  • Diagnostic agent suppression of chronic rejection after organ transplantation, systemic autoimmune disease 'Lythematodes ⁇ Uveitis ⁇ Paint's disease ⁇ Multiple myositis ⁇ Filamentous proliferative nephritis ⁇ Diagnostic agent for autoimmune diseases such as sarcoidosis Can be used as Since the monoclonal antibody of the present invention can specifically recognize 9 integrin, quantification of 9 integrin in the test solution, especially by sandwich immunoassay, competitive method, immunometric method or nephrometry, etc. It can be used for quantitative purposes. In applying these individual immunological measurement methods to the measurement method of the present invention, it is not necessary to set special conditions and operations. If the ordinary conditions and procedures of each method are added to the ordinary technical considerations of those skilled in the art, a measurement system for L L P L or its salt will be established. For details on these general technical means, refer to reviews and textbooks.
  • ⁇ 9 integrin can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • various diseases associated with 9 integrins can be diagnosed by utilizing a method for quantifying 9 integrins in vivo using the antibody of the present invention. For example, if an increase or decrease in the 9 integrin concentration is detected, it can be diagnosed that the 9 integrin is likely to be a disease associated with the 9 integrin, such as an inflammatory disease or likely to be affected in the future.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used for specifically detecting 9 integrin present in a subject such as a body fluid or tissue. Also, use for the production of antibody columns used to purify 9 integrins, detection of ⁇ 9 integrin contained in each fraction during purification, and analysis of ⁇ 9 integrin behavior in test cells. Can do.
  • Peptide A is selected from the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1 0, 1 1, 1 2, 1 3, 1 4 or 15 Those having 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, or 8 amino acid sequences are preferred.
  • Peptide A can be synthesized by a known synthesis method. Further preferred peptides A are (1) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 1 2, and SEQ ID NO: 14; (4) amino acids of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 (5) amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 13; (6) amino acid of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 13 Or (7) SEQ ID NO: 5 and the amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • peptide A and a human a9 integrin ligand for example, tenascin C, plasmin, etc.
  • a human a9 integrin ligand for example, tenascin C, plasmin, etc.
  • the comparison between steps (i) and (ii) is performed by measuring, for example, the amount of ligand binding to peptide A.
  • C Inhibiting the activity of human 9 integrin for candidate compounds obtained by such a method Confirmation of whether or not to obtain a compound that inhibits the activity of human 9 integrin.
  • polypeptides, proteins, biologically derived non-peptide compounds, synthetic compounds, microbial cultures, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. can be used as test substances.
  • a known compound may be used.
  • the compound selected is cancer, inflammatory disease, infectious disease, autoimmunity as well as the antibody of the present invention Examples that can be used as preventive and / or therapeutic agents for diseases and bone diseases
  • Antibody preparation against human a; 9 integrin was performed by immunizing three BALB mice with reference to the Subtractive I ⁇ unization method (Williams CV, Stechmann CL, McLoon SC, Biotechniques. (1992) 12: 842-847). Went. First, CH0-K1 cells were administered intraperitoneally at 4 ⁇ 10 6 cells / mouse, and the next day and the next day, 4 mg / mouse of cyclophosphamide were intraperitoneally administered.
  • Hypridoma cells obtained here 1 K 11, 21 C5, 24 I 1 1 and 2 5 B 6 were obtained on February 15, 2006 and 28 S1 on May 29, 2007 in Tsukuba, Ibaraki Prefecture. East 1-chome 1 1 Central No. 6 (zip code 305-8566), Independent Administrative Agency National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary, FER MBP — 1 05 1 0, 1 05 1 1, 1 051 2 1 0 51 3 and FERM BP-10832.
  • the membrane was immersed in 10 mL of a ⁇ g / mL solution at room temperature for 3 hours.
  • the membrane was washed with a washing solution (T 1 TB S) and then allowed to react at room temperature for 1 minute with ECL detection Regent.
  • the fluorescence of the enzyme reaction product was observed, and the epitope was identified from the fluorescence intensity.
  • ⁇ 9 ⁇ 2 marketed as an anti-human ⁇ 9 integrin antibody was used.
  • 1 Kl 1 is the amino acid sequence of human ⁇ 9 integrin (79th to 9th to 6th (SEQ ID NO: 2) of SEQ ID NO: 40, 1 60th to 1 77th (SEQ ID NO: 5)) 238 1st 2 52nd (SEQ ID NO: 7) 2 7 7th 1 2 94th (SEQ ID NO 8) 454 1st 4 7 1st (SEQ ID NO 1 0) and 5 5 6th 1 5 73rd (SEQ ID NO: 1 1), 2 1 C 5: 79th 1 9 6th (SEQ ID NO: 2), 1 24— 1 4 1st (SEQ ID NO: 3), 1 60 0 1st 1 7 7th (SEQ ID NO: 5), 2 3 8th 1 25 2nd (SEQ ID NO: 7), 2 7 7th 1 2 94th (SEQ ID NO: 8), 40 9th 1 43 2nd (SEQ ID NO: 9), 4 54th — 47 1st (sequence number 1
  • the anti-human 9 integrin antibody obtained in the present invention recognizes an epitope different from Y9 A2 because the reactive peptide is different from ⁇ ⁇ ⁇ 9 A2 as a control. It can be said that is an anti-body.
  • MRNA was extracted from the hybridoma producing the human 9integrin antibody (1 ⁇ 1 1 2 1 C 5 24 1 1 1 25 ⁇ 6 2 8 S 1), and cDNA was prepared by reverse transcription. Using this cDNA as a saddle, PCR was performed using ScF V cloning primers (Light Primer Mix Heavy Primer Mix; Amersham Biosciences) to extend and amplify the variable regions of the antibody heavy and light chains, respectively. Next, the PCR product was incorporated into the pCRII TOPO vector based on conventional methods. This was sequenced to determine the amino acid sequence. The above procedure was repeated three times for each antibody.
  • 1 Kl 1 is the heavy chain CDR DYNMD (SEQ ID NO: 16) DI NPNNGGT I YNQKFQG (SEQ ID NO: 20) and SGV I STDY (SEQ ID NO: 24), and the light chain CDR is RAS QE I SGYL I (SEQ ID NO: 28) , AASTLD S (SEQ ID NO: 32) and YANYPP (SEQ ID NO: 36).
  • the light chain CDR is composed of KASQDVN I AVA (SEQ ID NO: 29), WAST RHT (SEQ ID NO: 33) and HYNTPW (SEQ ID NO: 37), and 24 I 1 1 is the heavy chain CDR of DTYVH (SEQ ID NO: 18) NI DPANGNTKY DPKFQG (SEQ ID NO: 22) and WL RHFYY AMD Y (SEQ ID NO: 26), light chain CDRs are RAS EN I YYS LA (SEQ ID NO: 30), NANS LED (SEQ ID NO: 34) and A YD VP Y (SEQ ID NO: 38), 25 B 6 has heavy chain CDRs SYGVH (SEQ ID NO: 19), VI WS GG S TNYN S ALM S (SEQ ID NO: 23) and D YGNYPWF AY (SEQ ID NO: 27).
  • the light chain CDR is composed of KAS QDVNTAVA (SEQ ID NO: 3 1), SASYRYT (SEQ ID NO: 3 5) and HYSTPC (SEQ ID NO: 39), 2831 is the heavy chain 001 is GYGVN (SEQ ID NO: 41), MI WGDG I TEYNS ALKSR (SEQ ID NO: 42) and DAS SGYGFAY (SEQ ID NO: 43), and the light chain CDR is composed of TA SS SVS S SYLH (SEQ ID NO: 44), STSNLAS (SEQ ID NO: 45), and YHRSPY (SEQ ID NO: 46). Turned out to be.
  • 9 integrins are OPN, fiapronectin, Extracellular matrix that can be targeted when the resulting anti-human 9 integrin antibody inhibits cell adhesion because it binds to ⁇ 9 ligands including extracellular matrix (ECM) such as syn-C and VC AM-1 It was investigated.
  • ECM extracellular matrix
  • hOPN (RAA) N-half converts the GRD sequence of human OPN to RAA sequence and purifies the N-terminal region up to the thrombin cleavage site from E. coli as a GST fusion protein and uses precision protease (Amersham Biosciences). GST is cleaved and removed.
  • VCAM-1 was obtained from R & D Systems.
  • Teneicin or AEIDGIEL peptide, human pronectin which is the teninecin C adhesion sequence region for ⁇ 9 integrin, synthesized CPEDGIHELFP peptide, a partial peptide within the EDA region that is important for adhesion to ⁇ 9 integrin, and bound it to BSA. The thing was used.
  • CHO-K1 cells human a9-CH0-K1 expressing human 9 integrin were used as cells that highly express human 9 integrin.
  • VCAM-1 (1.25 g / mL) was used as ECM, and P 1 H4 was used as the anti-human sigma 4 integrin antibody in the same manner as in Example 4.
  • Figure 3 shows the results. All cell adhesions involving VC AM-1 were not inhibited by the antibody, but were inhibited by the positive control (Y 9 A 2), 2 1 C 5 and 24 I 1 1 in the presence of anti-human 4 integrin antibody. It was observed. Since many cells expressing 9 integrin also express ⁇ 4 integrin, it is possible to suppress cell adhesion by using anti-human 9 integrin antibody and anti-human 9 integrin antibody together. Therefore, it was suggested that the enhancement effect of many diseases including cancer invasion can be expected.
  • a 7-week-old female mouse (Balb / c) was intraperitoneally administered with anti-mouse 9 integrin antibody (55A2C) and normal Hamster IgG (hereinafter abbreviated as NHG) as a control, each at 400 zg / mouse. Twenty-four hours later, 2 mg / mouse of arthritis-inducing type ⁇ collagen monoclonal antibody strength Kutel (Chondrex) was intravenously administered. Seventy-two hours after the administration of the type IV collagen monoclonal antibody cocktail, repeat 5 5A2 C or NHG 400 ⁇ g / animal was intraperitoneally administered. At the same time, LPS 50 g / animal was intraperitoneally administered.
  • Figure 4 shows the results. In the control NHG, the score increased and the onset of rheumatism was observed, but it was suggested that anti-mouse ⁇ 9 integrin antibody completely suppressed the onset of rheumatism. Therefore, it was found that the anti-integrin 9 integrin antibody has a therapeutic effect to suppress the onset and exacerbation of rheumatism.
  • helper sputum cells that control the immune system were previously thought to be broadly divided into Thl and Th2, but recently it has become clear that there are Thl7 cells and inhibitory T cells. It was also found that only Thl7 cells that are increased by interleukin (IL) -23 have the effect of increasing osteoclasts. Thl7 cells produce IL-17, causing inflammation of surrounding cells, and at the same time increasing osteoclast differentiation factor RANKL (receptor of activator of NF- ⁇ ligand) Creating an environment. In addition, inflammatory bone destruction did not occur in mice that disrupted IL-23 or 17 genes, and these factors have been reported to play an important role in bone destruction. Therefore, in order to investigate the effect of anti- ⁇ 9 integrin antibody on Thl7, we examined mouse arthritis model and anti-mouse 9 integrin antibody.
  • IL interleukin
  • mice Six-week-old female mice (Balb / c) were administered intra-peritoneally with anti-mouse 9 integrin antibodies (18R18D, 55A2C) and Normal Hamster IgG (hereinafter abbreviated as NHG) as controls for 3 mice each. did. 18R18D is an anti-alpha 9 integrin antibody having no ability cell adhesion inhibition, 55A2C is an antibody having cell adhesion inhibiting ability.
  • Figure 5 shows the results.
  • the NHG and 18R18D scores increased and the onset of arthritis was observed, but the anti-mouse ⁇ 9 integrin antibody 55A2C was found to suppress the onset of arthritis in a jj-like manner.
  • Anti-s9 integrin antibody was found to have an effect of preventing the onset of arthritis and an effect of suppressing exacerbation.
  • Figure 6 shows the arthritis suppression image by anti-9 integrin antibody. On the 6th day after LPS administration, it can be seen that 55A2C administration suppressed the monthly swelling of the joint.
  • anti-s9 integrin antibody has not only a preventive effect on arthritis but also a therapeutic effect after onset.
  • the amount of cytokines IL-6, TNF-s, IL-1 ⁇ , IFN-y and TGF-; 3
  • the expression of IL-6, IL-li3, and TGF- ⁇ mRNA was significantly suppressed in the 55A2C administration group compared to the NHG administration group (FIG. 8).
  • cytokines have been reported to be important for Thl7 differentiation, and the anti-integrin antibody suppresses arthritis by inhibiting the function of 9 integrin, which suppresses the production of cytokines important for Thl7 differentiation. It was speculated that this was caused by this.
  • the antibody of the present invention inhibits ⁇ 9 integrin function, thereby causing cancer (eg, proliferation and metastasis of cancer cells), inflammatory disease (eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, hepatitis, bronchial asthma, cotton fibrosis, diabetes, arteriosclerosis) , Multiple sclerosis, inflammatory bowel disease (ulcerative colitis, Crohn's disease)) infection (eg hepatitis), autoimmune disease (eg systemic lupus erythematosus, multiple myositis, autoimmune thyroid disease, It has therapeutic effects on tubulointerstitial nephritis, myasthenia gravis) and bone diseases (eg osteoporosis).
  • cancer eg, proliferation and metastasis of cancer cells
  • inflammatory disease eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, hepatitis, bronchial asthma, cotton fibrosis, diabetes, arteriosclerosis
  • the pharmaceutical composition containing both the anti-9 integrin antibody and the anti- ⁇ 4 integrin antibody of the present invention has further improved therapeutic effects on cancer, inflammatory diseases and the like.
  • the antibody of the present invention can be used as a diagnostic agent because it can pathologically detect the expression of ⁇ 9 integrin in cells and tissues.

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Description

明細書
抗ヒ ト α 9インテグリン抗体とその用途 技術分野
本発明は、 ヒ ト ひ 9インテグリンを特異的に認識する抗体 （特に、 モノクロ一 ナル抗体） 、 キメラ抗体、 ヒト化抗体ならびにヒト抗体；前記モノクローナル抗 体を産生するハイプリ ドーマ細胞；前記モノクローナル抗体の製造方法；前記ハ イブリ ドーマ細胞の製造方法；前記抗ヒト a 9インテグリン抗体を含有する治療 剤；前記ヒ ト ひ 9インテグリン抗体を含有する診断剤； ヒ トひ 9インテグリンの 活性を阻害する化合物のスクリ一二ング方法等に関する。 背景技術
生物体は、 生命現象を営む最小の機能単位である細胞、 同じ働きをする細胞が 集まつて組織を構成し、 種々の組織が集まつて協同して一定の機能を有する器官 を形成し、 全体として調和統一のとれた生命活動を営んでいる。 多ぐの組織は、 基本的に細胞と細胞外マトリックスから構成されており、 細胞と細胞外マトリツ タスが接着する細胞と細胞外マトリックス間接着と細胞間接着により構造を保つ ている。 細胞外マトリックスに関しては、 これまで生物活性はなく、 単なる詰め 物と考えられてきたが、 実はほとんど全ての組織で重要な役割を果たしているこ とが明らかになってきている。 細胞と細胞外マトリックス間接着活性が知られる ようになり、 細胞の足場としての役割だけでなく、 様々な細胞機能の調節や組織 、 器官の恒常性維持に関与していることが示唆され、 その重要性がより認識され るようになってきた。
細胞と細胞外マトリックスを連結する接着は、 インテグリンに代表される膜貫 通細胞接着タンパク質を介して行われる。 インテグリンは α;鎖と ]3鎖の 1 ： 1の ヘテロ二量体で構成され、 現在までに α鎖 1 8種類、 ；8鎖 8種類が発見され、 そ れらの組合せで、 少なくとも 2 4種類が同定確認されている。 各インテグリンは それぞれが特異的な細胞外マトリックス （リガンド） を認識することが知られて いる。 また、 インテグリンを含む膜貫通細胞接着タンパク質の役割は、 細胞と細 胞外マトリッタスの接着、 固定のみならず、 細胞外マトリックスからの情報を細 胞内シグナルに変換し、 細胞の増殖、 運動、 細胞死、 分化などの調節を担ってい ることが解明されてきている。
ィンテグリンはリガンドに対する特異性や機能からサブフアミリ一に分類され 、 コラーゲン受容体、 ラミニン受容体、 ファイブロネクテンゃビトロネクチンな どに含まれる A r g-G 1 y-A s p (RGD) 配列を認識する R GD受容体、 白血球にのみに存在する白血球特異的受容体に区別される （Hynes R0. 2002. Integrins: Bidirectional, Allosteric Signaling Machines. Cell 110: 673 - 87 ； Miyasaka M. 2000. New edition of Adhesion Molecule handbook. Shu junsya. ) 。 a 4と a 9インテグリンは、 これらにどれにも属さないサブファ ミリ一であり ひ 4インテグリンサブファミリーと呼ばれている （Elise L. Palmer, し urzio Rf iegg, Ronald Ferrando, Robert Pytela, Sheppard D. 1993. Sequence ana lissue Distribution of the Integrin a9 Subunit, a Novel Partner of 131 That Is Widely Distributed in Epithelia and Muscle. The Journal of Cell Biology 123： 1289-97) 。
細胞外マトリックス （ECM) の一種であるォステオポンチン （osteopontin ；以下、 O P Nと略称する） は分子量約 4 1 k D aの分泌型酸性リン酸化糖タン パク質であり、 乳汁、 尿、 腎尿細筆、 破骨細胞、 骨芽細胞、 マクロファ一ジ、 活 性化 T細胞、 腫瘍組織などに広く発現が認められている分子である。 分子中央部 に細胞接着配列 GRGD Sとヒト OPNでは S VVYGLR配列、 マウス OPN では S LAYGLR配列、 その直後にはトロンビン切断部位を有しており、 GR GDS配列を介して RGD受容体のインテグリンと、 S VVYGLR配列あるい は S LAYGLR配列を介してひ 4 (« 4 ^ 1) と ひ 9 (ひ 9 j3 1 ) インテグリ ンと接着する。
a 4 j3 1はトロンビンで切断されていない OPN (非切断型 OPN) とトロン ビンで切断された N末端フラグメント （切断型 OPN) の両方に結合し、 a 9 β 1は切断型 Ο Ρ Νにのみ結合するという様式の差も見出されている （Υ. Yokosaki et al. , (1999) The Journal of Biological Chemistry 274, 36328- 36334； P. M. Green et al.， (2001) FEBS Letters 503， 75-79； S. T. Barry et al. , (2000) Experimental Cell Research 258， 342—351) 。 a 4および a 9 インテグリンは、 OPN以外にも多くの共通するリガンドを有している。 フアイ ブロネクチンの EDA部位、 プロペプチド一フォンビルブラントファクター （p p -vWF) 、 組織型トランスダルタミナーゼ （t TG) 、 第 ΧΙΠ血液凝固因子 そして Vascular Cell Adhesion Molecule - 1 (VCAM— l) などが知られてい る。 また、 α 4インテグリンが特異的に認識するリガンドとしてフアイプロネク テンの CS— 1 ドメイン、 Ma d CAM— 1 ( α 4 /3 7 ) などが知られている。 ひ 9インテグリンが特異的に認識するリガンドは、 テネイシン C、 プラスミンな どが知られている。
α 4と α 9インテグリンおよび j8 1のインテグリンサブュニットのアミノ酸酉己 列は公知で G e nB a n kに登録されている。 また、 これらのインテグリンは種 間でアミノ酸配列の類似性が高いことが知られている。
WO02/0 8 1 5 22には、 O P N欠損マウスや O P Nに対する中和抗体を 用いた OPN機能抑制による、 リゥマチ様関節炎や肝炎の治療効果について開示 されている。 また、 この公報には、 炎症性疾患発症にはひ 4インテグリン、 ひ 9 ィンテグリンの認識配列である S V V Y G L R配列が重要であること、 O P Nに 対する受容体が免疫担当細胞などにおいて発現し、 炎症性疾患に開連しているこ とが開示されている。 発明の開示
現在、 癌、 炎症性疾患、 感染症、 自己免疫疾患および骨疾患の治療薬は種々 知られているが、 より改善された治療効果を有する癌、 炎症性疾患、 感染症、 自 己免疫疾患および骨疾患の予防薬および/または治療薬等を開発することが望ま れていた。
そこで、 本発明者らはインテグリン、 特にひ 9インテグリンに着目し、 種々の 研究を行った結果、 α 9インテグリンに対する特異的阻害抗体が癌抑制効果、 抗 炎症効果を有することを見出し、 本発明を完成した。 すなわち、 具体的には、 本 発明は以下に記載の抗ヒト α 9インテグリン抗体、 その産生細胞、 前記抗体を含 有する治療剤、 a 9インテグリン活性を阻害する化合物のスクリーニング方法等 を提供する。
( 1 ) 配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0、 1 1、 1 2、 1 3 、 1 4または 1 5のアミノ酸配列から選択される 1以上のァミノ酸配列を認識す る抗ヒト α 9インテグリン抗体。
( 2 ) 重鎖の相補性決定領域 （CDRH) における CDRH 1が配列番号 1 6、 1 7、 1 8、 1 9または 4 1のアミノ酸配列で、 CDRH 2が配列番号 20、 2 1、 22、 23または 42のアミノ酸配列で、 CDRH 3が配列番号 24、 25 、 26、 2 7または 43のァミノ酸配列であり、 軽鎖の相補性決定領域 （ C D R L) における CDRL 1が配列番号 28、 2 9、 30、 3 1または 44のァミノ 酸配列で、 CDRL 2が配列番号 3 2、 3 3、 34、 3 5または 45のアミノ酸 配列で、 CDRL 3が配列番号 3 6、 3 7、 38、 3 9または 46のアミノ酸配 列である抗ヒト a 9インテグリン抗体。
(3) 配列番号 1 6、 20、 24、 28、 3 2または 3 6のアミノ酸配列を含有 する相補性決定領域 (CDR) のうち、 少なくとも一つを有する抗ヒト α 9イン テグリン抗体。
( 4 ) 配列番号 1 6 20、 24、 28、 3 2または 36のアミノ酸配列を含有 する相補性決定領域 (CDR) を全て有する抗ヒトひ 9インテグリン抗体。
( 5 ) 配列番号 1 7 2 1、 25、 29、 3 3または 3 7のアミノ酸配列を含有 する相補性決定領域 (CDR) のうち、 少なくとも一つを有する抗ヒト ひ 9イン テグリン抗体。
(6) 配列番号 1 7 2 1、 2 5、 29、 3 3または 3 7のアミノ酸配列を含有 する相補性決定領域 (CDR) を全て有する抗ヒト α 9インテグリン抗体。
( 7 ) 配列番号 1 8 22、 26、 30、 34または 38のアミノ酸配列を含有 する相補性決定領域 (CDR) のうち、 少なくとも一つを有する抗ヒト α 9イン テグリン抗体。
(8) 配列番号 1 8 22、 26、 30、 34または 3 8のアミノ酸配列を含有 する相補性決定領域 (CDR) を全て有する抗ヒト α 9インテグリン抗体。
(9) 配列番号 1 9 23、 2 7、 3 1、 3 5または 3 9のァミノ酸配列を含有 する相補性決定領域 (CDR) のうち、 少なくとも一つを有する抗ヒト α 9イン テグリン抗体。
(1 0) 配列番号 1 9、 2 3、 2 7、 3 1、 3 5または 3 9のアミノ酸配列を含 有する相補性決定領域 （CDR) を全て有する抗ヒト α 9インテグリン抗体。
(1 1) 配列番号 4 1、 42、 4 3、 44、 45または 46のアミノ酸配列を含 有する相補性決定領域 （CDR) のうち、 少なくとも一つを有する抗ヒト α 9ィ ンテグリン抗体。
(1 2) 配列番号 4 1、 42、 43、 44、 45または 46のアミノ酸配列を含 有する相補性決定領域 （CDR) を全て有する抗ヒト α 9インテグリン抗体。
(1 3) ヒ ト ひ 9インテグリンと 9インテグリンのリガンドとの結合を阻害す る上記 （1) ないし （1 2) に記載の抗ヒト α 9インテグリン抗体。
(14) 受託番号 F E RM B P— 1 0 5 1 0、 FE RM B P— 1 0 5 1 1、 FERM B P— 1 05 1 2、 FERM B P— 1 0 5 1 3または F E RM B P— 1 08 3 2で標示されるハイプリ ドーマ細胞により産生される上記 (1) な いし （1 3) のいずれかに記載の抗ヒト α 9インテグリン抗体。
(1 5) モノクローナル抗体である上記 （1) ないし （1 4) のいずれかに記載 の抗ヒトひ 9インテグリン抗体。
(1 6) キメラ抗体である上記 （1) ないし （1 3) のいずれかに記載の抗ヒト a 9インテグリン抗体。
(1 7) ヒト化抗体である上記 （1) ないし （1 3) のいずれかに記載の抗ヒト ひ 9インテグリン抗体。
(1 8) ヒト抗体である上記 （1) ないし （1 3) のいずれかに記載の抗ヒ トひ 9インテグリン抗体。
(1 9) 上記 （1) ないし （1 8) のいずれかに記載の抗ヒト α 9インテグリ ン 抗体を有効成分として含む癌、 炎症性疾患、 感染症、 自己免疫疾患または骨疾患 の治療剤。
(20) 上記 （1) ないし （1 8) のいずれかに記載の抗ヒ ト α 9インテグリン 抗体と抗ヒト α 4インテグリン抗体の両方を有効成分として含む癌、 炎症性疾患 、 感染症、 自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
(2 1) 上記 （1) ないし （1 8) のいずれかに記載の抗ヒト α 9インテグリン 抗体を有効成分として含む癌、 炎症性疾患、 感染症、 自己免疫疾患または骨疾患 の診断剤。
(22) 配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0、 1 1、 1 2、 1 3、 14または 1 5のアミノ酸配列から選択される 1以上のアミノ酸配列を含有 するペプチドを用いることを特徴とする、 9インテグリンの活性を阻害する化 合物のスクリーニング方法, 発明の効果
本発明の抗体は、 ひ 9インテグリン機能抑制により、 癌 （例えば癌細胞の増殖、 転移） 、 炎症性疾患 （例えば関節リウマチ、 変形性関節症、 肝炎、 気管支喘息、 ■ 綿維症、 糖尿病、 動脈硬化、 多発性硬化症、 炎症性腸疾患 （潰瘍性大腸炎、 クロ ーン病） ） 、 感染症 （例えば肝炎） 、 自己免疫疾患 （例えば全身性エリテマトー デス、 多発性筋炎、 自己免疫性甲状腺疾患、 尿細管間質性腎炎、 重症筋無力症） および骨疾患 （例えば骨粗鬆症） 等に対する治療効果を奏する。 また、 本発明の 抗 α 9インテグリン抗体と抗 α 4インテグリン抗体の両者を含有する医薬組成物 は、 さらに改善された癌、 炎症性疾患等の治療効果を奏する。 本発明の抗体は、 細胞や組織におけるひ 9インテグリンの発現を病理学的に検出できることから、 診断薬としても利用できる。 図面の簡単な説明
図 1 (図 1一 1及び 1一 2 ) は、 抗ヒトひ 9インテグリン抗体の相捕認識領域 ( C D R) を解析した結果を示す図である。
図 2は、 抗ヒト α 9インテグリン抗体 5クローンの細胞接着阻害効果をヒトひ 9インテグリン発現細胞で調べた結果を示す図である。
図 3は、 抗ヒトひ 9インテグリン抗体と抗ヒト α 4インテグリン抗体を共存さ せた時の癌細胞 （ヒト ·メラノーマ細胞） の細胞接着阻害効果を示す図である。 図 4は、 抗マウス α 9インテグリン抗体のリゥマチ病態モデルにおけるリウマ チの治療効果を示す図である。
図 5は、 抗マウス α 9インテグリン抗体の関節炎治療効果を、 マウス関節炎モ デルで調べた結果を示す図である。
図 6は、 抗マウス 9インテグリン抗体による関節炎抑制像を示す。
図 7は、 抗 α 9インテグリン抗体の関節炎発症後の治療効果について調べた結 果を示す図である。
図 8は、 抗マウス α 9ィンテグリン抗体の関節炎発症後の治療効果における作 用機作を検討するために、 関節部のサイト力インの変化量を PCRで測定して調 ベた結果を示す図である。
図 9は、 マウス関節炎モデルにおける Thl7の関与について調べるために、 マ ウス鼠径リンパ節の IL- 17及び ROR Y tの発現を測定した結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[発明の経緯]
a 4インテグリンに対する抗体である Tysabri (登録商標） （natalizumab) は 2 0 0 4年 1 1月にパイオジェン 'アイデック （Biogen Idee Inc.、 米マサチュ 一セッッ州） とエラン （Elan Corporation アイルランド） が多発性硬化症治療 薬として米食品医薬品局 （F D A) 力 ら承認を受けている。 また、 Tysab ri (登 録商標） はクローン病、 リウマチ様関節炎等の疾患を対象として臨床開発されて いる。 なお、 P 4 C 2という抗ヒト a 4 3 1インテグリン ·モノクローナル抗体 が実験室レベルで用いられている。
しかし、 9インテグリンに対する抗体はヒ トおよびモルモットの α 9インテ ダリンに特異性を示す Υ 9 A 2と呼ばれるモノクローナル抗体 （A. Wang et al、 ， (1996) Am. J. Respir. , Cell Mol. Biol. 15、 664-672) が実験用として供 されているが、 臨床的に用いられていない。
本発明では、 以下の点を注意深く進めることにより、 ヒトのひ 9インテグリン に特異的に反応する抗体を得ることができた。
( 1 ) ヒ ト ひ 9インテグリン過剰発現株の作製
9インテグリンに対する抗体を作製するために、 ハムスターの卵巣由来細胞 である C H O— K 1細胞へ遺伝子導入を行い、 ヒト α 9インテグリンを過剩発現 する細胞株を樹立し、 この細胞を抗原としてマウスに免疫した。
( 2 ) ハイプリ ドーマのスクリーニング
細胞融合で得られた種々のハイブリ ドーマからヒト α 9インテグリンのみに反 応するクローンを効率よく得るために、 同じインテグリンフアミリーであるヒト 4インテグリンを C H O— K 1細胞に発現させた細胞を用いて他のインテグリ ンとは交差反応性を示さず、 親細胞 （C H O— K 1 ) の細胞表面抗原とは反応し ないクローンを選抜することにより、 効率的にヒト α 9インテグリンに特異的に 反応する阻害抗体を得た。 [本発明の抗ひ 9インテグリン抗体]
本発明はヒト α 9インテグリンに対するモノクローナル抗体を提供する。 本発 明において 「抗体」 とは、 抗原であるひ 9インテグリンまたはその部分ペプチド に結合し得る抗体分子全体またはその断片 （例えば、 F a b、 F a b' 、 F (a b' ) 2、 などの断片） を意味し、 ポリクローナル抗体であってもモノクローナ ル抗体であってもよい。 好ましくは、 本発明においてはモノクローナル抗体を意 味する。 また、 本発明において 「抗体」 は、 キメラ抗体、 ヒト化抗体、 ヒ ト抗体 を包含する。
本発明における 「モノクローナル抗体」 抗原に対して高度に特異的であり、 単 一の抗原を認識するものをいう。
本発明において、 「抗体断片」 とは、 全長抗体の一部を指し、 抗原結合領域ま たは可変領域のことである。 例えば、 抗体断片には F a b、 F a b' 、 F (a b ' ) 2、 および Fv断片が含まれる。 これらの抗体断片は抗体のパパイン消化、 ぺプシン消化など一般的に知られている方法で作製することができる。
上記 「キメラ抗体」 とは、 本発明で得られた抗ヒト α 9インテグリン抗体の定 常領域をヒ トの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変したヒト •マウス 'キメラ抗体 （欧州特許公開公報 Ε Ρ 0125023参照） を指す。 「 ヒト化抗体」 とは、 本発明で得られた抗ヒトひ 9インテグリン抗体の Η鎖と L鎖 の相補認識領域以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的 に改変した抗体を言う。 「ヒ ト抗体」 とは、 ヒ トの抗体産生に関与する遺伝子を 導入したトランスゲニック動物を用いて作製したモノクローナル抗体 （欧州特許 公開公報 Ε Ρ 0546073参照） を意味する。
より具体的には、 本発明は、 まず、 配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8 、 9、 10、 1 1、 12、 1 3、 14または 15のアミノ酸配列から選択される ' 1以上のアミノ酸配列を認識する抗ヒト α 9インテグリン抗体を提供する。 本発 明の好ましい態様による抗体は、 配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 、 10、 1 1、 12、 13、 14または 15のアミノ酸配列から選択される 2以 上、 3以上、 4以上、 5以上または 6個のアミノ酸配列を認識する。 本発明の好 ましい抗体は、 （1) 配列番号 2、 配列番号 5、 配列番号 7、 配列番号 8、 配列 番号 10、 および配列番号 1 1のァミノ酸配列； （ 2 ) 配列番号 5 ； (3) 配列 番号 7 ； (4) 配列番号 1、 配列番号 5、 配列番号 6、 配列番号 7、 および配列 番号 1 3のァミノ酸配列 （ 5 ) 配列番号 5、 配列番号 7、 配列番号 10、 および 配列番号 1 3のアミノ酸配列； （6) 配列番号 2、 配列番号 5、 配列番号 7、 配 列番号 8、 およぴ配列番号 1 5のァミノ酸配列； （ 7 ) 配列番号 5、 配列番号 7 、 配列番号 10、 および配列番号 13 ; (8) 配列番号 1 1のァミノ酸配列のァ ミノ酸配列を特異的に認識する。
また、 本発明の好ましい態様による抗体は、 配列番号 16、 20、 24、 28 、 32または 36のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域 （CDR) のうち、 少なくとも一つを有する。 さらに好ましい抗体は、 配列番号 16、 20、 24、 28、 32または 36のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域 （CDR) のう ち、 2以上、 3以上、 4以上、 5以上または 6個を有する抗ヒト α 9インテグリ ン抗体であり、 特に好ましい抗体は、 （1) 配列番号 16、 配列番号 20、 配列 番号 24、 および配列番号 36のァミノ酸配列； （ 2 ) 配列番号 16、 配列番号 20、 および配列番号 24のァミノ酸配列； （ 3 ) 配列番号 28、 配列番号 32 、 および配列番号 36のァミノ酸配列； （ 4 ) 配列番号 20、 およぴ配列番号 2 4のァミノ酸配列；または （ 5 ) 配列番号 24、 および配列番号 36のアミノ酸 配列；のアミノ酸配列を含有する。
また、 本発明の他の態様による抗体は、 配列番号 1 7、 21、 25、 29、 3 3または 37のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域 （CDR) のうち、 少な くとも一つを有する。 さらに好ましい抗体は、 配列番号 1 7、 21、 25、 29 、 33または 37のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域 （CDR) のうち、 2以上、 3以上、 4以上、 5以上または 6個を有する抗ヒトひ 9インテグリン抗 体であり、 特に好ましい抗体は、 （1) 配列番号 17、 配列番号 21、 配列番号 25、 および配列番号 37のァミノ酸配列； （ 2 ) 配列番号 17、 配列番号 21 、 および配列番号 25のァミノ酸配列 （ 3 ) 配列番号 29、 配列番号 33、 およ ぴ配列番号 37のァミノ酸配列 （ 4 ) 配列番号 21、 および配列番号 25のアミ ノ酸配列；または （5) 配列番号 25、 および配列番号 37のアミノ酸配列；の アミノ酸配列を含有する。
また、 本発明の他の態様による抗体は、 配列番号 1 8、 22、 26、 30、 3 4または 38のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域 （CDR) のうち、 少な くとも一つを有する。 さらに好ましい抗体は、 配列番号 18、 22、 26、 30 、 34または 38のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域 （CDR) のうち、 2以上、 3以上、 4以上、 5以上または 6個を有する抗ヒトひ 9インテグリン抗 体であり、 特に好ましい抗体は、 （1) 配列番号 18、 配列番号 22、 配列番号 26、 および配列番号 38のァミノ酸配列； （ 2 ) 配列番号 18、 配列番号 22 、 および配列番号 26のアミノ酸配列 （3) 配列番号 30、 配列番号 34、 およ ぴ配列番号 38のァミノ酸配列 （ 4 ) 配列番号 22、 およぴ配列番号 26のアミ ノ酸配列；または （ 5 ) 配列番号 26、 およぴ配列番号 38のァミノ酸配列；の アミノ酸配列を含有する。
また、 本発明の他の態様による抗体は、 配列番号 19、 23、 27、 31、 3 5または 39のァミノ酸配列を含有する相補性決定領域 （ C D R ) のうち、 少な くとも一つを有する。 さらに好ましい抗体は、 配列番号 19、 23、 27、 31 、 35または 39のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域 (CDR) のうち、 2以上、 3以上、 4以上、 5以上または 6個を有する抗ヒト α 9インテグリン抗 体であり、 特に好ましい抗体は、 （ 1 ) .配列番号 1 9、 配列番号 23、 配列番号 27、 および配列番号 39のァミノ酸配列； （ 2 ) 配列番号 19、 配列番号 23 、 および配列番号 27のアミノ酸配列 （3) 配列番号 31、 配列番号 35、 およ び配列番号 39のァミノ酸配列 （ 4 ) 配列番号 23、 およぴ配列番号 27のアミ ノ酸配列；または （5) 配列番号 27、 および配列番号 39のアミノ酸配列；の アミノ酸配列を含有する。
また、 本発明の他の態様による抗体は、 配列番号 41、 42、 43、 44、 4 5または 46のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域 （CDR) のうち、 少な くとも一つを有する。 さらに好ましい抗体は、 配列番号 41、 42、 43、 44 、 45または 46のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域 （CDR) のうち、 2以上、 3以上、 4以上、 5以上または 6個を有する抗ヒト α 9インテグリン抗 体であり、 特に好ましい抗体は、 （1) 配列番号 41、 配列番号 42、 配列番号 43、 およぴ配列番号 46のァミノ酸配列； （ 2 ) 配列番号 41、 配列番号 42 、 および配列番号 43のアミノ酸配列 （3) 配列番号 44、 配列番号 45、 およ ぴ配列番号 46のァミノ酸配列 （ 4 ) 配列番号 42、 および配列番号 43のアミ ノ酸配列；または （ 5 ) 配列番号 43、 および配列番号 46のァミノ酸配列；の アミノ酸配列を含有する。
本発明において特に好ましい抗体は、 受託番号 FERM B P- 1 05 1 0, FERM B P— 1 05 1 1、 FERM B P— 1 05 1 2、 FERM B P— 1 0 5 1 3または FERM BP— 1 0 8 3 2で標示されるハイプリ ドーマ細胞 により産生される抗ヒトひ 9インテグリン抗体である。
以下、 抗 9インテグリンモノクローナル抗体の作製について詳述するが、 該 抗体の作製はこれに限定されることはない。
[a 9インテグリン （抗原） ]
本発明において抗原として使用するひ 9インテグリンは、 （1) ヒトやその他 の哺乳動物のひ 9インテグリンを発現するあらゆる細胞、 またはそれらの細胞が 存在するあらゆる組織に由来するタンパク質、 （2) ひ 9インテグリンをコード する遺伝子 DNA、 好ましくは cDNAを細菌、 酵母、 動物細胞等の細胞株に導 入、 発現させた組換えタンパク質であってもよく、 また （3) 合成タンパク質で あってもよい。
また、 本発明のひ 9インテグリンには、 各種哺乳動物の 9インテグリンのァ ミノ酸配列、 特に好ましくはヒ ト ひ 9インテグリンのァミノ酸配列 （配列番号： 40) と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。
ここで 「実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」 とは、 天然型の α 9インテグリン、 特に好ましくはヒト由来の α 9インテグリンと実質的に同等 の生物学的性質を有する限り、 該ァミノ酸配列中の複数個のアミノ酸、 好ましく は 1ないし 1 0個のアミノ酸、 特に好ましくは 1ないし数個 （例えば、 1ないし 5個、 1ないし 4個、 1ないし 3個、 1ないし 2個） ） のアミノ酸が置換、 欠失 およぴ Ζまたは修飾されているアミノ酸配列を有する変異ポリぺプチド、 ならぴ に該天然型のひ 9インテグリン、 特に好ましくはヒト由来のひ 9インテグリンの アミノ酸配列中に、 複数個のアミノ酸、 好ましくは 1ないし 1 0個のアミノ酸、 特に好ましくは 1ないし数個 （例えば、 1ないし 5個、 1ないし 4個、 1ないし 3個、 1ないし 2個） ） のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有する変異ポリ ペプチドを意味する。 さらに、 そのような置換、 欠失、 修飾及び付加の複数を有 する変異ポリぺプチドであってもよい。
本発明の α 9インテグリン、 特にはヒト由来の α 9インテグリンは、 遺伝子組 換え技術のほか、 化学的合成法、 細胞培養方法等のような当該技術分野において 公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。 また、 変異ポリべプチドの製造方法としては、 例えば、 合成オリゴヌクレオチ ド部位突然変異導入法 （gapped duplex法） 、 亜硝酸あるいは亜硫酸処理によつ てランダムに点突然変異を導入する方法、 B a 1 3 1酵素等により欠失変異体を 作製する方法、 カセット変異法、 リンカ一スキャニング法、 ミスインコーポレー シヨン法、 ミスマッチプライマー法、 D NAセグメント合成法などを挙げること ができる。
また、 本発明のひ 9インテグリンには、 該 9インテグリンの 「一部」 も包含 される。 ここで 「一部」 とは、 O P N、 テネイシン- C、 VCAM- 1等の α 9インテグ リンリガンドと結合するために必要な領域を含む部分であり、 具体的には配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列の 2 9番目から 9 8 0番目を含む部分をいう。 該 α 9インテグリンの 「一部」 は、 後述する当該技術分野において公知の方法ある いはその修飾方法に従って、 遺伝子組換え技術または化学的合成法により製造す ることもできるし、 また細胞培養方法により単離したひ 9インテグリン、 特に好 ましくはヒト由来の α 9インテグリンをタンパク分角?酵素等により適切に切断す ることで製造することができる。
抗原としてはまた、 ひ 9インテグリンを組換え技術により細胞膜上に過剰発現 する細胞自体、 あるいはその膜画分等を用いることができる。
本発明のひ 9インテグリンには、 ヒト α 9インテグリンのアミノ酸配列 （配列 番号： 4 0 ) と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される 。 配列番号： 4 0で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有す るポリペプチドとして、 具体的には、 配列番号： 1から 1 5に表されるアミノ酸 配列を有する、 ヒト α 9インテグリンがあげられる。 また、 特に本発明ではヒト α 9インテグリンを組換え技術により細胞膜上に過剰発現する細胞自体が好適に 用いられる。 したがって、 後述するような、 ヒ ト α 9インテグリンをコードする 遺伝子 （例えば、 c D NA) を公知の遺伝子工学技術を用いてクロー-ングし、 ヒ ト α 9インテグリンを細胞膜上に過剰発現する細胞自体、 またはその細胞膜画 分を抗原として調製する場合もある。
[抗体産生細胞の調製] 抗原は、 免疫'される動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体 あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるた め、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与しても よい。 投与は通常 1〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜10回程度行われる。 用いられ る温血動物としては、 例えば、 マウス、 サル、 ゥサギ、.ィヌ、 モルモッ ト、 ラッ ト、 ハムスター、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリ等が挙げられるが、 本発明ではマウス が好適に用いられる。
治療の対象がヒ トであり、 α 9インテグリン阻害抗体産生動物がマウスの場合 には、 ヒトマウスキメラ抗体やヒト化抗体を用いるのが望ましく、 さらには、 抗 体産生に関与するヒ ト遺伝子を導入したマウス等のトランスジェニック動物を用 いてヒト型モノクローナル抗体を作成して用いるのが望ましい。
[抗体産生細胞とミエ口一マ細胞との細胞融合]
ミエローマ細胞としては、 マウス、 ラット、 ヒト等に由来する細胞が用いられ る。 例えばマウスミエローマ Ρ 3 U 1、 Ρ 3Χ63— Ag 8、 P 3X63— Ag 8_U1、 P 3NS 1— Ag 4、 S P 2/0— Ag l 4、 P 3X63— Ag 8— 653等があげられるが、 抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物、 特に同 系統の動物由来であることが好ましい。 ミエローマ細胞は凍結保存するか、 ゥマ 、 ゥサギまたはゥシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代して維持することが できる。 細胞融合には対数増殖期の細胞を用いるのが好ましい。 本発明では P 3 X63— Ag 8— 653が好適に用いられる。
抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイプリ ドーマを形成させる方 法としては、 ポリエチレンダリコール (PEG) を用いる方法、 センダイウィル スを用いる方法、 電気融合装置を用いる方法などがあげられる。 例えば PEG法 の場合、 約 30〜 60 %の PEG (平均分子量 1000〜 6000) を含む適当 な培地または緩衝液中に脾細胞とミエローマ細胞を 1〜 10 ： 1、 好ましくは 5 〜 1 0 ： 1の混合比で懸濁し、 温度約 25〜37°C、 pH6〜8の条件下で、 約 30秒〜 3分間程度反応させればよい。 反応終了後、 PEG溶液を除いて培地に 再懸濁し、 セルゥヱルプレート中に播種して培養を続ける。
レ、イブリ ドーマ細胞の選別]
モノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞の選別は、 公知あるいはそ れに準じる方法に従って行なうことができる。 通常、 HA T (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添カ卩した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別おょぴ育種用培地としては、 ハイプリ ドーマ細胞が生育できるものならばど のような培地を用いても良い。 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜2 0 %の 牛胎児血清を含む R PM I 1 6 4 0培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） あるいはハイプリ ドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常、 5日〜 3週間、 好 ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 % C 02下で行なうことができ る。
本発明のモノクローナル抗体の産生は、 新臨床免疫実験操作法 （part 3) 、 科 学評論社、 1997に記載される細胞 E L I S A法を用いて確認およびスクリーニン グできる。 免疫に用いた細胞をスクリーニングに使用するとバックグラウンドが 高くなることや偽陽性が多くなることが予想される場合、 免疫に用いた細胞とは 別の細胞で過剰発現するヒ ト α 9インテグリンに反応し、 かつ、 ヒ トひ 4インテ ダリンを過剰発現する細胞に反応しないクローンを抗ヒ ト α 9インテグリン抗体 とすることができる。 このようなクローンから限界希釈法を 1から 5回、 好適に は 2から 4回繰り返すことによりモノクローナル抗体を調製できる。
[抗体の分離精製]
得られた抗体は、 均一にまで精製することができる。 抗体の分離、 精製は通常 のタンパク質で使用されている分離、 精製方法を使用すればよい。 例えばァフィ 二ティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、 フィルター、 限外 濾過、 塩析、 透析、 S D Sポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、 等電点電気泳動等 を適宜選択、 組み合わせれば、 抗体を分離、 精製することができる （ Antibodies : A Laboratory Manual. Εα Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 力 S、 これらに限定されるものではない。 ァフィニテ ィークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、 プロテイン Aカラム、 プロテ イン Gカラムが挙げられる。 例えばプロテイン Aカラムを用いたカラムとして、 Hyper D, P0R0S, Sepharose F. F. (Amershara Biosciences) 等が挙げられる。
[抗体の標識化] 得られた抗体を、 公知の方法または市販のキットを用いて各種標識ィ匕 （例えば
、 ビォチン標識、 F I T C標識、 A P C標識） できる。 本発明では、 Biotin Labeling Kit (同仁化学） を用いたピオチン標識が好適に用いられる。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、 必要により精製した後、 常法 に従って製剤化し、 癌、 炎症性疾患、 感染症、 自己免疫疾患および骨疾患等の予 防およぴ Zまたは治療剤として用いることができる。 これらの予防およびノまた は治療剤としての剤形は注射剤、 点滴用剤などの非経口製剤とすることができ、 創意工夫により経口製剤として使用することができる。 また、 製剤化に当たって は、 薬事上および薬学的に許容される範囲内で、 剤形に適した担体、 希釈剤もし くは添加剤などを使用することができる。
[抗体の薬理学的効果]
インテグリンの役割は、 細胞と細胞外マトリックス （ECM) の接着、 固定のみ ならず、 細胞外マトリックスからの情報を細胞内シグナルに変換し、 細胞の増殖 、 運動、 細胞死、 分化などの調節を担っていることが解明されてきている。 従つ て、 得られたモノクローナル抗体は、 ECMとひ 9インテグリンとの結合を阻害す ることにより、 ECMからの情報の細胞内シグナル伝達を遮断できることから、 ECM が関与する疾患の治療が可能である。 α 9インテグリンに結合する ECM、 および ひ 9リガンドとして O P N、 ファイブロネクチン、 プロペプチド一フォンビルブ ラントファクター ( p p - v W F ) 、 組織型トランスダルタミナーゼ ( t T G) 、 第 Χ ΠΙ血液凝固因子、 Vascular Cell Adhesion Molecule- 1 (V C AM— l ) 、 テネイシン C、 プラスミンなどが知られている。 これらの ECMと α 9インテグ リンを発現している細胞や癌細胞を用い、 得られたモノクローナル抗体の存在下 での結合阻害を i n v i t r oで観察することにより、 本発明のモノクローナ ル抗体の対象疾患を見出すことができる。
—方、 抗ヒト α 9インテグリン抗体をヒトに対する治療用医薬品として用いる 場合、 その効果の確認が必要な前臨床開発段階における i n V i v oの病態モ デル動物ではヒトの抗原に対する抗体の効果が確認できない。 すなわち、 ヒ トに 投与して治療効果を確認する臨床試験を行う前に、 対象疾患に対する治療効果を 確認する動物実験が要求される。 マウスはその遺伝的背景が明らかとなっている 系統が多く、 ヒ トの疾患とほぼ同一の疾患を観察することができる病態モデルが 数多く知られているので、 実験動物として好適である。 し力 し、 一般的に抗体医 薬品は、 ヒトの抗原に対する抗体であり、 マウスの同じ対象の抗原と交差反応を 示すことは少なく、 マウスの対象抗原に対する抗体を調製して、 それを用いて動 物実験を行うことにより、 ヒ トで用いる抗体の薬理効果、 臨床試験に向けた投与 量の推定、 対象抗原以外への反応性、 副作用の発症などを観察し、 ヒトにおける 作用を反映することができる。 具体的には、 抗マウスひ 9インテグリン抗体を病 態モデルのマゥスに投与することにより、 抗ヒト α 9インテグリン抗体の対象疾 患が明らかになる。
[抗体を含有する医薬]
本発明の抗体 （特に、 モノクローナル抗体） を有効成分とする製剤は、 癌、 例 えば癌細胞の増殖、 転移、 炎症性疾患 （例えば関節リウマチ、 変形性関節症、 肝 炎、 気管支喘息、 綿維症、 糖尿病、 動脈硬化、 多発性硬化症、 炎症性腸疾患 （潰 瘍性大腸炎、 クローン病） ） 、 感染症 （例えば肝炎） 、 自己免疫疾患 （例えば全 身性エリテマトーデス、 多発性筋炎、 自己免疫性甲状腺疾患、 尿細管間質性腎炎 、 重症筋無力症） および骨疾患 （例えば骨粗鬆症） 等の治療剤として用いること ができる。 ここで、 「治療」 という用語は 「予防」 という意味を含む意味で用い られる。
投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 癌患者の予防および Ζまたは治療のために使用する場合には、 本発明の 抗体を 1回量として、 通常 0 . 0 1〜2 O m g Z k g体重程度、 好ましくは 0 . ：!〜 1 O m g / k g体重程度、 さらに好ましくは 0 . l〜5 m g / k g体重程度 を、 1月 1〜 1 0回程度、 好ましくは 1月 1〜 5回程度、 静脈注射により投与す るのが好都合である。 他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を 投与することができる。 症状が特に重い場合には、 その症状に応じて増量または 投与回数を増加させてもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することができ る。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記抗体またはその塩と薬理学的に許 容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 このような組成物 は、 非経口投与または経口に適する剤形として提供される。
すなわち、 非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 点鼻剤、 坐 剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤 、 点滴注射剤などの剤形を包含する。 このような注射剤は、 公知の方法に従って 、 例えば、 上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは 油性液に溶解、 懸濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液とし ては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖、 ショ糖、 マンニトール、 その他の補助薬 を含む等張液などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 ェ タノール） 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコ ール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルベート 80、 ポリソルベート 20、 HCO— 50 (p o l y o x y e t h y 1 e n e 50 m o 1 a d d u c t o f h y d r o g e n a t e d c a s t o r o i l) 〕 などと併用しても よい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤と して安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどを併用してもよい。 調製された 注射液は、 通常、 適当なアンプル、 バイアル、 シリンジに充填される。 直腸投与 に用いられる坐剤は、 上記抗体を通常の点鼻薬用基剤、 坐薬用基剤に混合するこ とによって調製される。 なお、 一般的に抗体などのタンパク質の経口投与は消化 器により分解されるため、 困難とされるが、 抗体断片や修飾した抗体断片と剤形 の創意工夫により、 経口投与の可能性もある。
上記の非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するような投薬単位の 剤形に調製されることが好適である。 このような投薬単位の剤形としては、 注射 剤 （アンプル、 バイアル、 プレフィルド 'シリンジ） 、 点鼻剤、 坐剤などが例示 され、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 とりわけ注射剤では 5~10 Omg その他の剤形では 10〜250mgの上記抗体が含有されてい ることが好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。 例えば、 本発明の医薬製剤は、 上記 抗体に加えて、 抗ヒト α 4インテグリン抗体を含有させることができる。 この場 合の混合比は特に限定されないが、 例えば、 抗ヒト α 9インテグリン抗体：抗ヒ ト 4インテグリン抗体の比率を 1〜99 ： 99〜1の比率の範囲内で調整する ことができる。 [本発明のモノクローナル抗体を含有する診断剤]
本発明のモノクローナル抗体を含有してなる医薬組成物は、 炎症性疾患、 例え ばリウマチ関節炎、 肝炎、 気管支喘息、 線維症、 糖尿病、 癌転移、 動脈硬化、 多 発性硬化症、 肉芽腫等の診断剤、 また臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、 全身性自 己免疫疾患 'エリテマトーデス ·ぶどう膜炎 ·ベ一チヱト病 ·多発性筋炎 ·糸状 体増殖性腎炎 ·サルコィドーシス等の自己免疫疾患の診断剤として用いることが できる。 本発明のモノクローナル抗体は、 ひ 9インテグリンを特異的に認識する ことができるので、 被検液中のひ 9インテグリンの定量、 特にサンドイッチ免疫 測定法、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどによる定量な どに使用することができる。 これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に 適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要としない。 それぞれの 方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて L L P L またはその塩の測定系を構築すればょレ、。 これらの一般的な技術手段の詳細につ いては、 総説、 成書などを参照することができる。
以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 α 9インテグリンを感度 良く定量することができる。 さらに、 本発明の抗体を用いる、 生体内でのひ 9ィ ンテグリンの定量法を利用することにより、 ひ 9インテグリンが関連する各種疾 患の診断をすることができる。 例えば、 ひ 9インテグリンの濃度の増減が検出さ れた場合は、 ひ 9インテグリンが関連する疾患、 例えば炎症性疾患である可能性 が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。 また、 本発明 のモノクローナル抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在するひ 9インテグリ ンを特異的に検出するために使用することができる。 また、 9インテグリンを 精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画に含まれる α 9イン テグリンの検出、 被検細胞内における α 9インテグリンの挙動の分析等に使用す ることができる。
[ヒト 9インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリ一二ング方法] 本発明の抗体が認識するヒ ト α 9インテグリン上のェピトープを利用して、 ヒ ト α 9インテグリンの活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる 。 具体的には、 本発明は、 配列番号 1 、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0 、 1 1 、 1 2、 1 3、 1 4または 1 5のアミノ酸配列から選択される 1以上のァ ミノ酸配列を含有するペプチド （以下、 「ペプチド A」 とレ、う） を用いることを 特徴とする、 ヒ ト ひ 9インテグリンの活性を阻害する低分子化合物のスクリー二 ング方法を提供する。
ペプチド Aとしては、 配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0、 1 1、 1 2、 1 3、 1 4または 1 5のアミノ酸配列から選択される 2以上、 3以 上、 4以上、 5以上、 6以上、 7以上、 または 8個のアミノ酸配列を有するもの が好ましい。 ペプチド Aは公知の合成法によって合成することができる。 さらに 好ましいペプチド Aは、 （1 ) 配列番号 2、 配列番号 5、 配列番号 7、 配列番号
8、 配列番号 9、 配列番号 1 0、 配列番号 1 1、 および配列番号 1 2のアミノ酸 配列； （2 ) 配列番号 5、 配列番号 7、 配列番号 8、 および配列番号 1 1のアミ ノ酸配列； ( 3 ) 配列番号 2、 配列番号 3、 配列番号 5、 配列番号 8、 配列番号
9、 配列番号 1 1、 配列番号 1 2、 および配列番号 1 4のァミノ酸配列； （ 4 ) 配列番号 5、 配列番号 7、 配列番号 1 0、 配列番号 1 3、 および配列番号 1 4の アミノ酸配列； （5 ) 配列番号 1、 配列番号 5、 配列番号 6、 配列番号 7、 およ び配列番号 1 3のァミノ酸配列； （ 6 ) 配列番号 1 0、 および配列番号 1 3のァ ミノ酸配列、 かまたは （7 ) 配列番号 5、 および配列番号 7のアミノ酸配列のァ ミノ酸配列を含有する。
本発明のスクリーニング方法においては、 例えば、 （i ) ペプチド Aと、 ヒ ト a 9インテグリンのリガンド (例えば、 テネイシン C、 プラスミンなど) とを接 触させた場合と （ii) ペプチド Aと、 リガンドおよび試験化合物とを接触させた 場合との比較を行なう。 工程 （ i ) と （ii) の比較は、 例えば、 ペプチド Aに対 するリガンドの結合量を測定することにより行う。 そのような結合量の比較を容 易にするために、 公知の手法によつて標識したリガンドを用いることが好ましい c このような方法によって得られた候補化合物について、 ヒ ト 9インテグリンの 活性を阻害するか否かの確認実験を行つて、 ヒ トひ 9インテグリンの活性を阻害 する化合物を得る。
ここで被験物質としては、 ポリペプチド、 タンパク質、 生体由来の非ペプチド 性化合物、 合成化合物、 微生物培養物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出 液等を用いることができ、 新規化合物であっても、 公知の化合物であっても良い。 選択される化合物は、 本発明の抗体同様、 癌、 炎症性疾患、 感染症、 自己免疫 疾患および骨疾患等の予防および/または治療剤として用いることができる 実施例
以下に実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、 これは本発明の範囲を 限定するものではない。
(実施例 1 )
[ヒ ト α 9インテグリンに対する抗体の作製]
ヒ ト a; 9インテグリンに対する抗体作製は、 Subtractive I脑 unization法 （ Williams C. V. ， Stechmann C. L. , McLoon S. C. , Biotechniques. ( 1992) 12:842-847) を参考にして BALBんマウス 3匹に対して免疫を行った。 まず、 CH0 - K1細胞を 4X106細胞/匹腹腔内投与し、 次の日とその次の日、 シクロホスフアミ ドを 4mg/匹、 腹腔内投与した。 シクロホスフアミド投与 2週間後、 ヒ ト《 9イン テグリン発現細胞 （ヒ ト a 9/CHO— K 1細胞） を 2X106細胞ノ匹を腹腔内投 与し、 さらにその 2週間後、 ヒ ト ひ 9ZCHO— K 1細胞を 3X106細胞 Z匹を腹 腔内投与した。 ヒ ト ひ 9ZCHO— K 1細胞に反応し、 且つ、 ヒ トひ 4インテグ リン発現 CHO— K 1細胞に反応しないクローンを抗 α 9インテグリン抗体とし た。その結果、 抗ヒ トひ 9インテグリン抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞 5ク ローン （1K1 1、 21 C 5、 24 1 1 1、 25B 6、 28 S 1) を樹立した。 ここで得られたハイプリ ドーマ細胞 1 K 1 1、 21 C5、 24 I 1 1および 2 5 B 6は、 2006年 2月 15日に、 28 S1は、 2007年 5月 29日に茨城 県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 、 独立行 政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにそれぞれ受託番号 FER M B P— 1 05 1 0、 1 05 1 1、 1 051 2、 1 0 51 3および FERM B P— 10832として寄託されている。
(実施例 2)
[抗ヒ トひ 9インテグリン抗体のェピトープ解析]
ヒ ト α 9インテグリンの Ν末端から、 1一 12番目のアミノ酸配列のペプチド. 、 4一 15番目のアミノ酸配列のペプチド、 7— 18番目のアミノ酸配列のぺプ チドというふうに、 3アミノ酸ずつ C末端方向にスライドさせたアミノ酸 12個 からなるペプチドを C6スぺーサーを配置して、 さらに |3 Alaを 2つ結合したセル口 ー ス 膜 上 で 、 5 nmol/spot に な る よ う 調 製 し た 。 Blocking buffer (Milk/0.05 Tween20 in PBS)で膜をブロッキングした後、 常法に基づいて 調製したペルォキシダーゼ標識抗ヒト ひ 9インテグリン抗体 （ 1 K 1 1、 2 1 C 5、 24 1 1 1および 2 5 B 6) Ι. Ομ g/mL溶液 10mLに膜を室温、 3時間浸した 。 膜を洗浄液 （T一 TB S) で洗浄した後、 ECL detection Regentで室温、 1分間反応させた。 酵素反応生成物の蛍光を観察し、 蛍光強度からェピトープを 同定した。 なお、 対照として抗ヒト α 9インテグリン抗体として市販されている Υ9 Α2を用いた。
以下の表 1に示すように、 1 Kl 1はヒト α 9インテグリンのアミノ酸配列 （ 配列番号 40の 79番目一 9 6番目 （配列番号 2) 、 1 6 0番目— 1 77番目 （ 配列番号 5) 、 238番目一 2 52番目 （配列番号 7) 、 2 7 7番目一 2 94番 目 （配列番号 8) 、 454番目一 4 7 1番目 （配列番号 1 0) および 5 5 6番目 一 5 73番目 （配列番号 1 1) を、 2 1 C 5は 79番目一 9 6番目 （配列番号 2 ) 、 1 24— 1 4 1番目 （配列番号 3) 、 1 6 0番目一 1 7 7番目 （配列番号 5 ) 、 2 3 8番目一 25 2番目 （配列番号 7) 、 2 7 7番目一 2 94番目 （配列番 号 8) 、 40 9番目一 43 2番目 （配列番号 9) 、 4 54番目— 47 1番目 （配 列番号 1 0) 、 5 56番目一 5 73番目 （配列番号 1 1 ) 、 5 9 2番目一 6 2 1 番目 （配列番号 1 2) 、 70 6番目一 7 2 3番目 （配列番号 14 ) および 9 3 1 番目一 9 5 1番目 （配列番号 1 5) を、 24 I 1 1は 7 9番目一 96番目 （配列 番号 2) 、 14 2番目一 1 5 6番目 （配列番号 4) 、 1 60番目一 1 7 7番目 （ 配列番号 5) 、 238番目一 2 5 2番目 （配列番号 7) 、 2 77番目一 2 94番 目 （配列番号 8) 、 5 56番目一 5 73番目 （配列番号 1 1 ) 、 706番目一 7 23番目 （配列番号 1 4) および 9 3 1番目— 9 5 1番目 （配列番号 1 5 ) を、 25 Β 6は 40番目一 5 1番目 （配列番号 1 ) 、 1 60番目一 1 7 7番目 （配列 番号 5) 、 208番目一 22 5番目 （配列番号 6) 、 23 8番目一 25 2番目 （ 配列番号 7) および 646番目一 6 5 7番目 （配列番号 1 3 ) を認識し、 これら の抗体は一部分のぺプチドでなく、 立体構造を認識していることが示唆された。 なお、 本発明で得られた抗ヒトひ 9インテグリン抗体は対照とした Υ 9 A 2と反 応するペプチドが異なることから、 Y9 A2とは異なるェピトープを認識する抗 体であるといえる。 表 1 ェピト一プマツビングの結果
Figure imgf000023_0001
(実施例 3 )
[抗ヒトひ 9インテグリン抗体の相補認識領域 （CDR) の解析]
ヒ ト ひ 9ィンテグリン抗体 ( 1 Κ 1 1 2 1 C 5 24 1 1 1 25 Β 6 2 8 S 1) を産生するハイプリ ドーマから mRNAを抽出して、 逆転写によって c DNAを作製した。 この cDNAを鍚型とし、 S c F Vクローニング用プライマ (Light Primer Mix Heavy Primer Mix；アマシャムバイオサイエンス社） を 用いて PCRを行い、 抗体の重鎖と軽鎖の可変領域をそれぞれ伸長 ·増幅した。 次に、 P CR産物を常法に基づいて pCRII TOPO vectorに組み込んだ。 これをシ ークエンスしてアミノ酸配列を決定した。 各抗体について 3回ずつ上記の操作を 行った。
図 1に示すように、 1 Kl 1は重鎖の CDRが DYNMD (配列番号 1 6) D I NPNNGGT I YNQKFQG (配列番号 20) および SGV I STDY (配列番号 24) で、 軽鎖の CDRが RAS QE I SGYL I (配列番号 28 ) 、 AASTLD S (配列番号 32) および YANYPP (配列番号 36) で構成 され、 21 C 5は重鎖の CDRが DYYMY (配列番号 1 7 ) 、 T I SDGGN YTYYPDS VKG (配列番号 21) および D R D G S S L F A Y (配列番号 25) で、 軽鎖の CDRが KASQDVN I AVA (配列番号 29) 、 WAST RHT (配列番号 33) および HYNTPW (配列番号 37) で構成され、 24 I 1 1は重鎖の CDRが DTYVH (配列番号 18) 、 N I DPANGNTKY DPKFQG (配列番号 22) および WL R H F Y Y AMD Y (配列番号 26 ) で、 軽鎖の CDRが RAS EN I YYS LA (配列番号 30) 、 NANS LED (配列番号 34) および A YD VP Y (配列番号 38) で構成され、 25 B 6は 重鎖の CDRが SYGVH (配列番号 1 9) 、 V I WS GG S TNYN S ALM S (配列番号 23) および D YGNYPWF AY (配列番号 27) で、 軽鎖の C DRが KAS QDVNTAVA (配列番号 3 1) 、 SASYRYT (配列番号 3 5) および HYSTPC (配列番号 39) で構成され、 2831は重鎖の001 が GYGVN (配列番号 41) 、 MI WGDG I TEYNS ALKSR (配列番 号 42) および DAS SGYGFAY (配列番号 43) で、 軽鎖の CDRが TA S S SVS S SYLH (配列番号 44) 、 STSNLAS (配列番号 45) およ び Y H R S P Y (配列番号 46 ) で構成されていることが判明した。
参考のために CDRと配列番号との対応を表 2に示す。
表 2
CDRと配列番号との対応表
Figure imgf000024_0001
(実施例 4)
[抗ヒト a 9インテグリン抗体の細胞接着阻害効果]
細胞接着する際にはひ 9インテグリンが OPN、 フアイプロネクチン、 テネィ シン C、 VC AM— 1などの細胞外マトリ ックス （ECM) を含む α 9リガンド と結合することから、 得られた抗ヒト 9インテグリン抗体が細胞接着を阻害す る際の対象となりえる細胞外マトリックスを検討した。
hOPN (RAA) N- halfはヒト O P Nの GRD配列を RAA配列に変換させてトロンビン切 断部位までの N末領域を GST融合タンパク質として大腸菌から精製し、 プレシ ジョンプロテアーゼ （アマシャムバイオサイエンス社） を用いて GSTを切断、 除去したタンパク質である。 VCAM— 1は R&D Systems社から入手した。 テ ネィシン ま α 9インテグリンに対するテネィシン C接着配列領域である AEIDGIEL ペプチド、 ヒ トフアイプロネクチンは、 α 9インテグリンとの接着に重要な EDA 領域内部分ペプチドである CPEDGIHELFPペプチドを合成し、 BSAと結合させたも のを利用した。 ヒ ト ひ 9インテグリン高発現細胞としてヒ ト ひ 9インテグリンを 発現した CHO— K1細胞 （ヒ ト a 9ノ CH0- K1) を用いた。
1.25〜5. O^g/mLのテネイシン C、 ファイブロネクチン、 VCAM— 1または hOPN (RAA) N- halfを 96ゥエルプレートに 50// 1ずつ添カ卩し、 37度で 1時間静置す ることにより固定化した。 ブロッキング液（0.5% BSA/ PBS)にてブロッキング後 、 PBSで 1度洗浄し、 0.25°/。 BSA添加 D-MEMで懸濁したヒ ト α 9 ZCHO - K1細胞と得ら れたモノクローナル抗体とを混合し、 細胞 1.0X105個/ ml、 抗体濃度 lO^g/raLと なるように 200μ 1ずつ添加した。 37°C、 5%C02下で 1時間反応後、 0.5% クリスタ ルバイォレッ ト（WAK0、 Osaka, Japan)/20%メタノール溶液を 50 μ 1ずつゥエルに 加え、 室温で 30分間放置することにより細胞の固定と染色を行った。 蒸留水でプ レートを洗浄後、 20%酢酸溶液にて転溶し、 590nmにおける吸光度を測定した。 なお、 陰性対照としてヒト ·ォステオボンチンに対するモノクローナル抗体 （5 A 1 ) 、 陽†生対照として市販の抗ヒト α 9インテグリン抗体 Υ 9 A 2を用いた。 図 2にその結果を示す。 テネイシン C関与の細胞接着は 21 C 5、 24 1 1 1 、 25 B 6および 28 S 1で阻害されたが、 1 K 1 1では阻害されなかった。 フ ァイブロネクチン関与の細胞接着は 21 C 5、 25 B 6および 28 S 1で阻害さ れ、 24 1 1 1で若干の阻害が観察されたが、 1 K 1 1では阻害されなかった。 VCAM— 1関与の細胞接着は 21 C 5、 24 1 1 1、 25 B 6および 28 S 1 で阻害が観察されたが、 1K 1 1では阻害されなかった。 hOPN (RAA) N - half関 与の細胞接着は 21 C 5、 24 1 1 1、 25 B 6および 28 S 1で阻害されたが 、 1 Kl 1では阻害されなかった。
(実施例 5)
[抗ヒト α 4インテグリン抗体と抗ヒトひ 9インテグリン抗体の共存下での細胞 接着阻害効果]
ひ 4および α 9インテグリンは多くの共通する E CMに結合する。 そこで、 両 方のインテグリンに対する抗体が存在することにより、 細胞接着阻害効果の增強 が考えられる。 そこで、 抗ヒ トひ 4インテグリン抗体と抗ヒ トひ 9インテグリン 抗体の共存下における癌転移抑制効果を i n V i t r oで調べるため、 α 4ィ ンテグリンと a 9インテグリンを発現している癌細胞であるヒト ·メラノーマ細 胞 （G 36 1 ) と E CMとの接着に及ぼす両抗体の影響を検討した。
ECMとして VCAM— 1 (1.25 g/mL) を、 抗ヒトひ 4インテグリン抗体は P 1 H4を用い、 実施例 4と同様に実施した。
図 3にその結果を示す。 VC AM— 1が関与する細胞接着は全て抗体で阻害さ れなかったが、 抗ヒトひ 4インテグリン抗体が共存すると、 陽性対照 （Y 9 A 2) 、 2 1 C 5および 24 I 1 1で阻害が見られた。 多くのひ 9インテグリンを 発現している細胞は α 4インテグリンをも発現していることからから、 抗ヒトひ 4インテグリン抗体と抗ヒトひ 9インテグリン抗体を併用することで細胞接着の 抑制が可能となり、 癌浸潤を含め多くの疾患抑制の増強効果が期待できると示唆 された。
(実施例 6)
[抗マウス α 9インテグリン抗体の抗リゥマチ効果]
7週齢の雌性マウス （Balb/c) に抗マウスひ 9インテグリン抗体 （5 5A2 C ) 、 コントロールとして正常 Hamster IgG (以後 NHGと省略） をそれぞれ 3匹 に 400 zg/匹を腹腔内投与した。 24時間後に関節炎惹起用タイプ Πコラーゲン モノクローナル抗体力クテル （Chondrex社） を 2 mg/mouse静脈投与した。 タイプ Πコラーゲンモノクローナル抗体カクテルを投与してから 7 2時間後に、 再ぴ 5 5A2 Cまたは NHG 400 μ g/匹を腹腔内投与した。 同時に L P S 50 g/匹 を腹腔内投与した。 L P S投与 3日前から L P S投与後 6日目までマウスを観察 し 、 Wood の方法 （ F. D. Wood, C, Pearson, A Tanaka, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. , 35, 456 (1969) ) に準じて関節炎の程度を採点し、 スコアを記録し た。
図 4にその結果を示す。 コントロールの N H Gではスコアが上昇し、 リウマチ の発症が観察されたが、 抗マウス α 9インテグリン抗体ではリゥマチの発症を完 全に抑制することが示唆された。 従って、 抗ひ 9インテグリン抗体はリゥマチの 発症や増悪を抑制する治療効果を有することがわかった。
(実施例 7 )
[抗マウス α 9インテグリン抗体の関節炎治療効果]
免疫系を制御するヘルパー Τ細胞は、 従来、 Thlと Th2に大別されると考えら れていたが、 最近、 Thl7細胞や抑制性 T細胞などが存在することが明らかにな つた。 また、 インターロイキン （IL) -23によって増加する Thl7細胞だけが破 骨細胞を増やす作用を持つことがわかった。 Thl7細胞は、 IL-17を産生すること で、 周囲の細胞の炎症を引き起こすと同時に破骨細胞分化因子 RANKL (receptor of activator of NF- κ Β ligand)を増やすことで、 破骨細胞ができやすい環境を 作り出している。 さらに、 IL- 23や 17の遺伝子を破壌したマウスでは、 炎症性 骨破壊が生じなかったことから、 これらの因子が骨破壊に重要な役割を果たすこ とが報告されている。 そこで、 抗 α 9インテグリン抗体の Thl7へ及ぼす影響を 調べるため、 マウスの関節炎モデルと抗マウス ひ 9インテグリン抗体で検討した。
6週齢の雌性マウス （Balb/c) に抗マウス 9インテグリン抗体 （18R18D、 55A2C) 、 コントロールとして Normal Hamster IgG (以後 NHGと省略） をそれぞ れ 3匹に 400 μ g/匹を腹腔内投与した。 18R18Dは細胞接着抑制能を有さない抗 α 9インテグリン抗体であり、 55A2Cは、 細胞接着抑制能を有する抗体である。 24時間後に関節炎惹起用タイプ IIコラーゲンモノクローナル抗体カクテル
(Chondrex社） を 2 mg/mouse静脈投与した。 タイプ IIコラーゲンモノクロ一 ナル抗体カクテルを投与してから 72時間後に、 再び 55A2Cまたは NHG 400 μ g/ 匹を腹腔内投与した。 同時に LPS 50 g/匹を腹腔内投与した。 LPS投与 3日前 から LPS投与後 6日目までマウスを観察し、 Woodの方法 （F. D. Wood,
C. M. Pearson, A Tanaka, Int. Arch. Allergy ppl. Immunol. 35, 456 (1969) ) に 準じて、 すなわち、 「0 ： 症状無し、 1 ： 四肢の指など小関節が一本のみ)！脹発 赤、 2 ： 小関節 2本以上、 あるいは手首や足首などの比較的大きな関節が腫脹発 赤、 3 ： 1本の手や足全体が腫脹発赤、 4 ： さらに 1本の手や足の全体的な月動長 が最大限に達している」 の評価項目を用いて、 関節炎の程度を採点し、 スコアを 記録した。
図 5にその結果を示す。 NHGと 18R18Dではスコアが上昇し、 関節炎の発症が 観察されたが、 抗マウス α 9インテグリン抗体 55A2Cでは関節炎の発症を J j的に 抑制することが分かった。 抗ひ 9インテグリン抗体は関節炎の発症予防効果とと もに増悪の抑制効果を有することがわかった。 また、 図 6に抗 9インテグリン 抗体による関節炎抑制像を示す。 LPS投与後 6日目で、 55A2C投与により関節の 月重脹が抑制されたことがわかる。
次に、 抗ひ 9インテグリン抗体の関節炎発症後の治療効果を検討した。 関節炎 惹起用タイプ II コラーゲンモノクローナル抗体カクテル （Chondrex社） を 2 mg/raouse静脈投与し、 72時間後に LPS 50 g/匹を腹腔内投与した。 その 3 日 後に 55A2Cあるいは NHGを腹腔内投与 （400 g/匹） し、 スコアを調べた。 その 結果、 図 7に示すように、 関節炎発症後に抗 ひ 9インテグリン抗体を投与しても、 関節炎の治療効果があることがわかった。
以上のことから、 抗ひ 9インテグリン抗体は関節炎に対して発症予防効果だけ でなく、 発症後の治療効果も有することが示唆されたので、 その作用機作につい て検討した。 関節炎発症マウスに抗 ひ 9インテグリン抗体を投与した後、 肢足関 節病変部のサイトカイン （IL- 6， TNF-ひ、 IL-1 β , IFN- y および TGF- ;3 ) の変 化量をリアルタイム PCRで測定した。 その結果、 55A2C投与群は NHG投与群と比 較して IL- 6、 IL-l i3 および TGF- α の mRNAの発現が有意に抑制されていた （図 8 ) 。 これらのサイトカインは Thl7 の分化に重要であることが報告されており、 抗 9インテグリン抗体による関節炎抑制効果は、 ひ 9インテグリンの機能の阻 害により、 Thl7 への分化に重要なサイトカイン産生が抑えられたことに起因す ると推測できた。
一方、 本関節炎モデルにおける Thl7 の関与について調べるために、 正常マウ スと LPS投与後 1 日目、 3 日目、 6 日目のマウス （BALBん、 6週齢、 雌性） のマ ウス鼠径リ ンパ節の IL- 17 及ぴ ROR y t ( retinoic acid-related orphan receptor y t :核内レセプターで、 Thl7 分化に関与する転写因子） の発現を測 定した。 その結果、 関節炎増悪に伴って有意に IL- 17、 ROR y tの mRNAの発現が 亢進することから、 本関節炎モデルでの Thl7 の関与が示唆された （図 9 ) 。 そ こで、 抗 α 9ィンテグリン抗体による α 9インテグリンの機能抑制が Thl7の分 化に及ぼす影響を検討するため、 抗ひ 9インテグリン抗体投与後、 肢足関節病変 部の IL-17および ROR y t発現量をリアルタイム PCRで測定した。 図 8に示すよ うに、 抗 0；9ィンテグリン抗体で両者の発現が有意に抑制されていた。 すなわち、 抗ひ 9インテグリン抗体は Thl7の分ィヒを抑制することがわかった。 産業上の利用可能性
本発明の抗体は、 α 9インテグリン機能抑制により、 癌 （例えば癌細胞の増殖、 転移） 、 炎症性疾患 （例えば関節リウマチ、 変形性関節症、 肝炎、 気管支喘息、 綿維症、 糖尿病、 動脈硬化、 多発性硬化症、 炎症性腸疾患 （潰瘍性大腸炎、 クロ ーン病） ） 、 感染症 （例えば肝炎） 、 自己免疫疾患 （例えば全身性エリテマトー デス、 多発性筋炎、 自己免疫性甲状腺疾患、 尿細管間質性腎炎、 重症筋無力症） および骨疾患 （例えば骨粗鬆症） 等に対する治療効果を奏する。 また、 本発明の 抗ひ 9インテグリン抗体と抗 α 4インテグリン抗体の両者を含有する医薬組成物 は、 さらに改善された癌、 炎症性疾患等の治療効果を奏する。 本発明の抗体は、 細胞や組織における α 9インテグリンの発現を病理学的に検出できることから、 診断薬としても利用できる。

Claims

請求の範囲
1. 配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1、 12、 1 3、
14または 1 5のアミノ酸配列から選択される 1以上のアミノ酸配列を認識する 抗ヒトひ 9インテグリン抗体。
2. 重鎖の相補性決定領域 （ C D R H) における C D R H 1が配列番号 16、 1
7、 18、 1 9または 41のアミノ酸配列で、 CDRH2が配列番号 20、 21 、 22、 23または 42のアミノ酸配列で、 CDRH3が配列番号 24、 25、
26、 27または 43のァミノ酸配列であり、 軽鎖の相補性決定領域 （C D R L ) における CDRL 1が配列番号 28、 29、 30、 31または 44のアミノ酸 配列で、 CDR L 2が配列番号 32、 33、 34、 35または 45のアミノ酸配 列で、 C D R L 3が配列番号 36、 37、 38、 39または 46のァミノ酸配列 である抗ヒト α 9インテグリン抗体。
.3. 配列番号 1 6、 20、 24、 28、 32または 36のアミノ酸配列を含有す る相補性決定領域 （CDR) のうち、 少なくとも一つを有する抗ヒト α 9インテ グリン抗体。
4. 配列番号 1 6、 20、 24、 28、 32または 36のアミノ酸配列を含有す る相補性決定領域 （CDR) を全て有する抗ヒト 9インテグリン抗体。
5. 配列番号 1 7、 21、 25、 29、 33または 37のァミノ酸配列を含有す る相補性決定領域 （CDR) のうち、 少なくとも一つ請求の範囲
6. 配列番号 1 7、 21、 25、 29、 33または 37のァミノ酸配列を含有す る相補性決定領域 （ C D R ) を全て有する抗ヒトひ 9インテグリン抗体。
7. 配列番号 1 8、 22、 26、 30、 34または 38のアミノ酸配列を含有す る相補性決定領域 （CDR) のうち、 少なくとも一つを有する抗ヒトひ 9インテ グリン抗体。
8. 配列番号 1 8、 22、 26、 30、 34または 38のアミノ酸配列を含有す る相補性決定領域 （ C D R ) を全て有する抗ヒトひ 9インテグリン抗体。
9. 配列番号 1 9、 23、 27、 31、 35または 39のアミノ酸配列を含有す る相補性決定領域 （CDR) のうち、 少なくとも一つを有する抗ヒト ο: 9インテ ダリン抗体。
10. 配列番号 19、 23、 27、 31、 35または 39のアミノ酸配列を含有 O 2008/007804 する相補性決定領域 （CDR) を全て有する抗ヒト α 9インテグリン抗体。
11. 配列番号 41、 42、 43、 44、 45または 46のアミノ酸配列を含有 する相補性決定領域 （CDR) のうち、 少なくとも一つを有する抗ヒト α 9イン テグリン抗体。
12. 配列番号 41、 42、 43、 44、 45または 46のアミノ酸配列を含有 する相補性決定領域 （CDR) を全て有する抗ヒト 9インテグリン抗体。
13. ヒ トひ 9インテグリンとひ 9インテグリンのリガンドとの結合を阻害する 請求項 1ないし 1 2に記載の抗ヒト α 9インテグリン抗体。
14. 受託番号 FERM BP— 105 10、 FERM BP— 1051 1、 F ERM BP— 10512、 FERM B P— 10513または F E RM BP
-10832で標示されるハイプリ ドーマ細胞により産生される請求項 1ないし 13のいずれかに記載の抗ヒト α 9インテグリン抗体。
15. モノクローナル抗体である請求項 1ないし 14のいずれかに記載の抗ヒト ひ 9インテグリン抗体。
16· キメラ抗体である請求項 1ないし 13のいずれかに記載の抗ヒト α 9イン テグリン抗体。
17. ヒト化抗体である請求項 1ないし 1 3のいずれかに記載の抗ヒト ひ 9イン テグリン抗体。
18. ヒト抗体である請求項 1ないし 1 3のいずれかに記載の抗ヒト《 9インテ グリン抗体。
19. 請求項 1ないし 18のいずれかに記載の抗ヒト ひ 9インテグリン抗体を有 効成分として含む癌、 炎症性疾患、 感染症、 自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。 20. 請求項 1ないし 18のいずれかに記載の抗ヒト α 9インテグリン抗体と抗 ヒト α 4インテグリン抗体の両方を有効成分として含む癌、 炎症性疾患、 感染症 、 自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
21. 請求項 1ないし 18のいずれかに記載の抗ヒト 9インテグリン抗体を有 効成分として含む癌、 炎症性疾患、 感染症、 自己免疫疾患または骨疾患の診断剤。 22. 配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1、 12、 1 3 、 14または 1 5のアミノ酸配列から選択される 1以上のアミノ酸配列を含有す るペプチドを用いることを特徴とする、 α 9インテグリンの活性を阻害する化合 物のスクリーユング方法。
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