WO2008001676A1 - Bactérie d'acide lactique utilisée pour améliorer l'intolérance au lactose - Google Patents

Bactérie d'acide lactique utilisée pour améliorer l'intolérance au lactose Download PDF

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WO2008001676A1
WO2008001676A1 PCT/JP2007/062522 JP2007062522W WO2008001676A1 WO 2008001676 A1 WO2008001676 A1 WO 2008001676A1 JP 2007062522 W JP2007062522 W JP 2007062522W WO 2008001676 A1 WO2008001676 A1 WO 2008001676A1
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lactic acid
strain
food
lactobacillus
acid bacteria
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PCT/JP2007/062522
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Tadao Saitou
Haruki Kitazawa
Yasushi Kawai
Hiroyuki Itou
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The Food Science Institute Foundation
Tohoku University
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to a lactic acid bacterium useful for improving lactose intolerance and use thereof.
  • Lactose intolerance is a constitution that easily causes uncomfortable digestive symptoms such as diarrhea and abdominal pain due to indigestion of ratatoses (lactose) in ingested milk. This lactose intolerance is generally considered to become more prominent with aging, but is also observed in infancy. Lactose To reduce symptoms of intolerance, it is necessary to avoid consumption of products containing latatoses. The inability to take dairy products, which are a good source of calcium, can reduce the risk of osteoporosis in older people, for example. It is a great obstacle for nutrition. Osteoporosis is one of the biggest diseases that threatens our country, which is rapidly aging, and it is particularly important to promote the active intake of dairy products in order to reduce the risk of osteoporosis in the elderly.
  • Ratatoose is usually decomposed and absorbed by latatolytic enzymes produced by cells in the lining of the small intestine.
  • various microorganisms such as lactic acid bacteria produce latatose-degrading enzymes and degrade latatoses.
  • Liver lactic acid bacteria and yeast-containing yogurt and lactobacillus beverages are thought to be relatively less likely to cause lactose intolerance because some of the ratatoses are degraded and are not maintained.
  • these bacteria gradually grow in the intestine and increase the ability of extra-intestinal lath in the intestine. As a result, lactose intolerance itself is improved.
  • Non-patent Document 2 Non-patent Document 2
  • a lactic acid bacterium capable of degrading latatose continuously in the human intestine as well as having a high latatase activity is necessary. The search has not progressed much.
  • intestinal lactic acid bacteria include bacteria with high intestinal adhesion.
  • a method for searching for such a highly intestinal adherent for example, a method for screening a lactic acid bacterium having a high intestinal adherence suitable for each human blood type by measuring the binding ability to human intestinal mucin. Yes (Patent Document 1). This method is considered to be indispensable to adhere to the surface of intestinal epithelial cells in order for lactic acid bacteria to infect humans and establish in the intestine, using Takahashi et al.'S colonic mucin (RCM).
  • Non-patent document 3 Screening of Lactobacillus acidophilus gnolepe lactic acid bacteria using polystyrene beads coated with large intestine mucin (RCM) revealed that surface protein (SLP) derived from lactic acid bacteria that strongly bound to the RCM was Reported that it was also bound to the mucus layer.
  • SLP surface protein derived from lactic acid bacteria that strongly bound to the RCM was Reported that it was also bound to the mucus layer.
  • Non-patent document 3 etc.] and the chemical structure of the sugar chain constituting human large intestine mucin differed depending on the ABO blood group (for example, non-patent document 4).
  • the screening method has not been applied to applications other than the search for lactic acid bacteria suitable for each blood group.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2004-101249
  • Non-Patent Document 1 Tadao Saito, Toshitoshi Ito, Yoshio Kanno, Yukiko Yamazaki, Discovery of a new pathway of ratatoses utilization system in Lactob acillus gasseri (Gaseri fungus) of human intestinal tract, Journal of Biotechnology, (2001), 79 ( 6), pp.172-173
  • Non-Patent Document 2 Marteau P, Minekus M, Have thigh r R, Huis in't Veld JH, Survival of lactic acid bacteria in a dynamic model of the stomach and small intestine: validation a nd the effects of bile., J Dairy Sci, (1997) 80 (6), pp.1031-1037
  • Non-Patent Document 3 Takahashi N, Saito T, Ohwada S, Ota H, Hashiba H, Itoh T, ⁇ A new screening method for the selection of Lactobacillus acidophilus group lactic acid bac teria with high adhesion to human colonic mucosa., Biosci Biotechnol Biochem, (19 96), 60 (9), pp.1434--1438
  • Non-Patent Document 4 Junko Amano, Blood-type glycan structure on gastrointestinal mucin Toward elucidation of the mechanism of bacterial infection, Biochemistry, Japan Biochemical Society, (1999) 71 (4), pp.274-277 Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a lactic acid bacterium having an ability to improve lactose intolerance.
  • the present invention includes the following.
  • a lactic acid bacterium having an ability to ameliorate lactose intolerance characterized by selecting a bacterium having enhanced intestinal adhesion and exonuclease activity from Lactobacillus lactic acid bacteria. How to Leeung.
  • surface plasmon resonance analysis is used to select the ability of lactic acid bacteria to bind to at least one of human type A intestinal mucin, human type B intestinal mucin, and human type 0 intestinal mucin. It is more preferable to select a bacterium having an RU value of 100 RU or more indicating the binding ability as a bacterium having enhanced intestinal adhesion.
  • the latatolytic enzyme activity enhanced by the selected bacterium is preferably at least one latatase activity of ⁇ -galatatosidase, phospho- ⁇ -galatatosidase, and phospho- ⁇ -glucosidase.
  • the Lactobacillus lactic acid bacterium to be screened is Lactobacillus gasseri or Lactobacillus mucosae.
  • [0013] A lactic acid bacterium obtained by the method of the above [1], wherein both intestinal tract adhesion and exonuclease activity are enhanced.
  • Lactobacillus gasseri OLL2836 strain (Accession No. BP-241), Lactobacillus' Gas A lactic acid bacterium which is one of Seri OLL2948 strain (Accession No. NITE BP-242) and Lactobacillus mucosae OLL284 8 strain (Accession No. MTE BP-243).
  • a lactose intolerance improving agent comprising at least one lactic acid bacterium according to [3] above.
  • Lactose intolerance improving agents include Lactobacillus gasseri OLL2836 strain (Accession number NIT E BP-241), Lactobacillus gasseri OLL2948 strain (Accession number NITE BP-242), and Ratatobacillus mucosae OLL2848. More preferably, the strain (accession number NITE BP-243) contains at least three lactic acid bacteria.
  • the foods and drinks include Lactobacillus 'Gasseri OLL2836 strain (Accession number NITE BP_241), Lactobacillus' Gasseri OLL2948 strain (Accession number NITE BP-242), and Lactobacillus mucosa OLL2848 strain (Accession number NITE BP- Those containing at least the three lactic acid bacteria of 243) are more preferred.
  • the food or drink is preferably an infant food, infant food, nursing food, elderly food, sick food, health functional food, supplement, fermented milk, or lactic acid bacteria beverage.
  • This food / beverage product is particularly suitable as a food / beverage product for improving lactose intolerance.
  • lactic acid strains useful for improving lactose intolerance can be efficiently selected. Moreover, if the lactic acid strain of this invention is used, the medicine useful for improvement of lactose intolerance and various food-drinks can be manufactured.
  • Fig. 1 shows the results of a P- ⁇ -gal activity test for a representative strain having high intestinal adhesion.
  • FIG. 2 shows the results of a P- ⁇ -glc activity test for a representative strain having high intestinal adhesion.
  • FIG. 3 shows the results of a ⁇ -gal activity test for a representative strain having high intestinal adherence.
  • the present invention relates to a method for screening a lactic acid bacterium having an ability to improve lactose intolerance by selecting a bacterium having enhanced intestinal adhesion and latatolytic enzyme activity from Lactobacillus lactic acid bacteria.
  • Lactobacillus lactic acid bacteria to be used for screening in the method of the present invention refers to bacteria classified as Lactobacillus or any bacterial species belonging to the genus Lactobacillus according to a normal taxonomic technique. Means.
  • the taxonomic method is not particularly limited, and includes conventional morphological taxonomy and taxonomy based on physiological 'biochemical properties' that have been used for the classification of known extra-L.
  • molecular phylogenetic classification based on homology analysis using 16S rDNA allotment lj, especially its V3 base sequence.
  • Lactobacillus lactic acid bacteria include Lactobacillus bulgaricus (7 Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus), Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus acidopmlus, Lactobacillus casei, Lactobacill us plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus brevis (Lactobacillus brevis), Lactobacillus brevis (Lactobacillus brevis) buchneri), Fukutono, Chinores 'Fa 1- Mentum (Lactobacillus fermentum), Lactobacillus helveticus, Ratatococcus' Lactococcus lactis, La ⁇ Powers that are limited to Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus mucosae, etc.
  • enteric lactic acid bacteria are preferred as Lactobacillus genus Lactobacillus, particularly Lactobacillus gasseri and Lactobacillus * mucosae.
  • Lactobacillus genus Lactobacillus particularly Lactobacillus gasseri and Lactobacillus * mucosae.
  • Lactobacillus refers to multiple types of Lactobacillus milk It may be a cell population or cell mixture containing acid bacteria cells, or may be a collection of individual strains of Lactobacillus lactic acid bacteria.
  • the intestinal adhesion and lactose-degrading enzyme activity of the lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus as described above are measured, and the bacteria in which both are enhanced are selected.
  • intestinal adherence refers to the ability of lactic acid bacteria to bind to the intestinal epithelial cell surface of a subject.
  • lactic acid bacteria against at least one intestinal mucin of human type A intestinal mucin, human type B intestinal mucin, and human type O intestinal mucin are used.
  • the binding ability is measured, and the obtained measurement value can be used as a value indicating intestinal adhesion.
  • the binding ability of lactic acid bacteria to intestinal mucin can be measured by a method using surface plasmon resonance analysis described in, for example, Patent Document 1 and International Application WO2006 / 067940.
  • a bacterium with an RU value of 100 RU or more indicating the ability of lactic acid bacteria to bind to intestinal mucin may be selected as a lactic acid strain candidate as a bacterium with enhanced intestinal adhesion. I like it.
  • Blood group antigens include commercially available sugar chain probes (for example, manufactured by Seikagaku Corporation) or neoglycoprotein 'Blood Group A Trisaccari de- BSA (for example, Calbiochem) or neoglycoprotein' Blood Groop B Trisaccaride e_BSA ( For example, Calbiochem) can be used, and anti-blood group antigen antibodies can be prepared by using various antibody production methods known to those skilled in the art using the antigen as an antigen.
  • sugar chain probes for example, manufactured by Seikagaku Corporation
  • neoglycoprotein 'Blood Group A Trisaccari de- BSA for example, Calbiochem
  • neoglycoprotein' Blood Groop B Trisaccaride e_BSA for example, Calbiochem
  • anti-blood group antigen antibodies can be prepared by using various antibody production methods known to those skilled in the art using the antigen as an antigen.
  • human type A intestinal mucin human type B intestinal mucin, human type 0
  • BIACORE a biosensor (biological intermolecular analysis device)
  • BIACORE1000 a biosensor (biological intermolecular analysis device)
  • the BIACORE system is an analyzer that monitors the interaction (binding and dissociation) of biological molecules in real time without using labels, based on the principle of surface plasmon resonance spectrum (SPR). Specifically, the intermolecular interaction between the ligand (hereinafter also referred to as probe) and the analyte is measured.
  • probe the ligand
  • lactic acid bacteria were used as the analyte
  • human colon mucin A type, B type, ⁇ type
  • a simple explanation of the principle used in this device is that by bonding and dissociating substances on the gold film and measuring the change in the refractive index of the reflected light due to the mass change on the gold film due to the bond / dissociation, The amount of material bound on the gold film is calculated. More specifically, in the apparatus, a glass substrate on which a gold film called a sensor chip is affixed is placed in the middle of a flow path for flowing a sample or a reagent so as to be exposed to the flow. While the sample is flowing through the flow path, the polarized light of 760 nm is condensed into a wedge shape with a prism etc. on the sensor chip, reflected on the gold film, and the refractive index of the reflected light is monitored.
  • the change in the angle of the surface plasmon resonance spectrum is shown in proportion to the change in the amount of binding. Therefore, in the BIACORE system, the probe is first flowed through the flow path, the probe is immobilized on the gold film of the sensor chip in advance, and then the site where the probe is not bound is blocked, and then the binding / dissociation reaction with the probe is performed. By monitoring the refractive index of the reflected light over time while flowing the substance to be examined (analyte) in the flow path, the force S can be calculated from the amount of change.
  • a change of 0.1 ° in the surface plasmon resonance spectrum is defined as 1000 resonance units (RU), and the change in the refractive index of reflected light is expressed based on a value (RU value) in units of resonance units.
  • one resonance unit (RU) corresponds to a mass change of lpg / lmm 2 on the surface of the sensor chip.
  • the amount of substance binding to the gold film on the sensor chip is the time before the substance binding (before addition) and when the binding is complete. It can be calculated from the difference in RU values.
  • the amount of binding between the probe (each human intestinal mucin in the present invention) and the analyte (lactic acid bacteria in the present invention) can be determined as the mass change (p g ) per sensor chip lmm 2, that is, the RU value.
  • the amount of binding (RU value) corresponds to the ability of the analyte to bind to the probe.
  • CM5 Gold film (typically 50 nm) is applied to the glass surface, and a carboxymethyl dextran layer (typically lOOnm) is provided on the surface.
  • carboxy group of the carboxymethyl dextran layer and In addition to the ligand (probe) immobilized on the sensor chip via the amino group, thiol group, aldehyde group or carboxyl group of the ligand), CM4, CM3, Cl, SA, NTA, Ll, HPA, etc. is there.
  • intestinal mucin may be immobilized on the sensor chip as a probe, for example, according to the manufacturer's instructions for the BIACORE system.
  • the immobilization method may be, for example, a physical adsorption method or a covalent bond adsorption.
  • CM5 BIACORE
  • EDC N-ethynole-N '-(3-dimethylaminopropyl-carbodiimide hydrochloride
  • a mixed reagent EDC / NHS
  • PHC a mixed reagent
  • PHC / NHS N-hydroxysuccinimide
  • the human intestinal mucin is covalently bound to the carboxyl group on the sensor chip, and ethanolamine hydrochloride-NaOH (pH 8.5) is used, and the probe binds to the carboxyl group on the sensor chip. Blocking the base site, In also preferred.
  • the present invention can be a tube mucin (HC M) immobilized sensor chip, HCM immobilization of the sensor chip specifically limited such les, but preferably a 1000 ⁇ 2000RU.
  • a sample (analyte solution) containing lactic acid bacterial cells is flowed through the flow path, and the HCM (probe) on each HCM-immobilized sensor chip and the lactic acid bacterial cells (analyte) in the analyte solution.
  • the amount of binding is calculated.
  • an example of the measurement conditions of BIACORE1000 that can be used for this analysis is shown below.
  • Running buffer HBS-EP buffer (pH 7.4)
  • Regeneration solution 1M guanidine hydrochloride solution 5 ⁇ 1
  • the RU value obtained by subtracting the RU value before the analyte binding from the RU value after the analyte binding is calculated with the lactic acid bacteria as the analyte and each intestinal mucin as the probe. It can be used as a binding amount (pg) per lmm 2 , that is, a value indicating the binding ability of lactic acid bacteria to intestinal mucin.
  • Judgment when the ability of lactic acid bacteria to bind to intestinal mucin shows a value of 100 RU or more for at least one of human type A intestinal mucin, type B intestinal mucin, and type 0 intestinal mucin, Judgment is “enhanced” or “high intestinal adherence”.
  • the RU value may vary depending on the measurement conditions in the BIACORE system.
  • the temperature condition in this method is, for example, 20 to 40 ° C, preferably 20 to 30 ° C, more preferably 23 to 28 ° C.
  • the concentration of a preferable analyte solution (sample) in the present method is 0.1 to 0.5 mg / mL, and a preferable flow rate in the present method is 3 to 10 / il / min.
  • the RU value does not change even when the above conditions are changed, and therefore whether or not the intestinal tract adherence is high can be determined based on “100 RU”.
  • the lactic acid bacteria Intestinal adherence is enhanced. Furthermore, in the screening method of the present invention, it can be said that the intestinal adherence is higher as the RU value is higher, that is, the intestinal adherence is enhanced than that of normal lactic acid bacteria.
  • a lactic acid bacterium having a RU value of 100 RU or more, more preferably 300 RU or more, particularly preferably 1000 RU or more as a binding ability to at least one human intestinal mucin is used as a bacterium having enhanced intestinal adhesion. It ’s better to select.
  • Ratatase activity (latatose degradation) of at least one latatolytic enzyme among ⁇ -galatatosidase ( ⁇ -gal), phospho- ⁇ -galatatosidase ( ⁇ - ⁇ -gal), and phospho- ⁇ -dalcosidase ( ⁇ - ⁇ -glc) (Enzyme activity) is measured, and a strain having the enhanced activity is selected.
  • lyophilized cells were suspended in 0.05M phosphate buffer, and the mixture was stirred vigorously with a toluene-acetone mixture (1: 9 (v / v)).
  • a toluene-acetone mixture (1: 9 (v / v)
  • 0-nitrophenyl- / 3-D-galactopyranoside ONPGal
  • P- / 3-gal is used for measuring latatase activity.
  • 0_Nitrophenyl- ⁇ _D-galactopyranoside_6_phosphate ONPGa ⁇ 6P
  • ⁇ NPGlc_6P 0-nitrophenyl- ⁇ -D-darcobilanoside-6-phosphate
  • O_Nitrophenol ( ⁇ ) ⁇ ⁇ ⁇ released per minute is defined as 1 unit and converted to activity value. From the activity value, the activity value per lmg of cells and the activity value per lmg of protein contained in the culture supernatant are calculated.
  • Lactic acid bacteria having particularly high lactase activity in which latatose-degrading enzyme activity is enhanced as compared with normal lactic acid bacteria can be selected.
  • ⁇ -gal has a lactatase activity (also referred to as / 3-gal activity in the present invention) of 15 units or more, preferably 100 units per mg of protein in the culture supernatant. It is particularly preferred to select strains that are greater than.
  • a strain showing 15 units or more, preferably 45 units or more per mg of protein in the culture supernatant can be selected. Particularly preferred.
  • ⁇ - ⁇ _glc activity in the present invention
  • intestinal adherence and exolytic activity of the lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus are obtained as described above.
  • Lactobacillus 'Gaseri' or Lactobacillus 'Mukosae' are obtained as described above.
  • the present invention also relates to a lactic acid strain thus selected. Lactobacillus lactic acid bacteria obtained in this way grow and settle well in the intestinal tract, and retain the ability to break down lacese (lactose) very efficiently, which is very useful for improving lactose intolerance. It is.
  • “improvement of lactose intolerance” refers to an unpleasant digestive symptom of lactose intolerance (abdominal pain, diarrhea, tummy, etc.) It means to reduce the frequency of appearance of the sensation (such as a feeling of ruffles) or to completely prevent the onset, or to reduce the severity of symptoms.
  • “Lactose intolerance improvement ability” refers to the ability of lactic acid bacteria to improve lactose intolerance in this way.
  • Lactobacillus genus Lactobacillus belonging to the genus Lactobacillus genus Lactobacillus that have both intestinal adhesion and lactose-degrading enzyme activity significantly enhanced are actually obtained. I was able to.
  • These three lactic acid bacteria are Lactobacillus gasseri OLL2836 strain (hereinafter referred to as OLL2836 strain), Lactobacillus gasseri OLL2948 strain (hereinafter referred to as OLL2948 strain), and Lactobacillus mucosae OLL2848 strain (hereinafter referred to as OLL2836 strain).
  • OLL2836 strain Lactobacillus gasseri OLL2836 strain
  • OLL2948 strain Lactobacillus gasseri OLL2948 strain
  • OLL2836 strain Lactobacillus mucosae OLL2848 strain
  • the deposited OLL2836, OLL2948, and OLL2848 strains have the properties shown in Table 1 below.
  • Lactobacilli MRS Broth (MRS medium; for example, Difco, Ref. No. 288160) in Table 1 is a medium that can be suitably used for culturing these lactic acid strains.
  • Table 2 shows the typical composition of MRS medium.
  • Lithium phosphate 2.20 g
  • the lactic acid bacterium according to the present invention can reach the intestine in an alive state by oral administration, can settle in the intestine, and exhibits a strong exonuclease activity, thereby improving lactose intolerance. be able to. Moreover, in the fermented product manufactured using the lactic acid bacteria according to the present invention, the degradation rate of latatoose (lactose) is improved due to the high activity and latatolytic activity.
  • the present invention contains a Lactobacillus lactic acid bacterium (a lactobacillus according to the present invention) obtained by using the above screening method and having significantly enhanced both intestinal adherence and rasogenic enzyme activity.
  • the present invention also relates to a lactose intolerance improving agent.
  • This lactose intolerance improving agent of the present invention is effective for improving lactose intolerance by being administered to a subject who has or is suspected of having lactose intolerance, That is, the ability to reduce the frequency of occurrence of uncomfortable digestive symptoms of lactose intolerance (such as abdominal pain, diarrhea, or tummy sensation of tummy) or the onset of symptoms completely, or the severity of symptoms of lactose intolerance Can be reduced.
  • the lactose intolerance improving agent of the present invention also has an effect of preventing the onset of lactose intolerance.
  • the lactose intolerance improving agent of the present invention contains at least one lactic acid bacterium according to the present invention (one or more strains).
  • the lactose intolerance improving agent of the present invention comprises, as lactic acid bacteria according to the present invention, Lactobacillus gasseri OLL2836 strain (Accession No. NITE BP-241), Lactobacillus gasseri OLL2948 strain (Accession No. MTE BP-242), and lactose It preferably contains at least one selected from Bacillus mucosae OLL2848 strain (Accession No. NIT E BP-243).
  • the lactose intolerance improving agent of the present invention contains at least Lactobacillus gasseri OLL28.
  • 36 strains accesion No. MTE BP-241
  • Lactobacillus gasseri OLL2948 accesion No. ⁇ BP-242
  • Lactobacillus mucosae OLL2848 accesion No. MTE BP-243. contains. Lactose intolerance improving agents containing a combination of these three lactic acid bacteria can bind to intestinal mucins with blood group antigens of type A, B, and O, and are effective for a wide range of subjects. It is.
  • the lactose intolerance improving agent of the present invention may be a composition containing the purified lactic acid bacteria according to the present invention, and a fermented product, a culture, or a product produced using the lactic acid bacteria.
  • a composition containing a concentrate of The lactic acid bacterium according to the present invention contained in the lactose intolerance improving agent of the present invention may be a living cell, a dead cell, a wet cell or a dry cell.
  • the lactose intolerance improving agent of the present invention is a composition containing the lactic acid bacteria according to the present invention in a living state.
  • the lactose intolerance improving agent of the present invention is not limited, but may be in any form such as liquid, gel, powder, granule, solid, capsule or tablet.
  • the lactose intolerance improving agent of the present invention is a pharmaceutically acceptable carrier or additive in addition to the lactic acid bacterium according to the present invention as an active ingredient or a culture, fermentation product, or concentrate thereof. May be contained.
  • carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polybutyl alcohol, polybulur pyrrolidone, carboxybule polymer, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch.
  • artificial cell structures such as ribosomes can be mentioned.
  • the additives used are selected appropriately or in combination depending on the dosage form of the preparation.
  • the lactose intolerance improving agent of the present invention can be administered orally or parenterally (for example, intragastric administration, enteral administration, etc.), and it is particularly preferable to administer it orally.
  • the lactose intolerance improving agent of the present invention to be administered is a solid preparation such as a tablet, granule, powder, pill, or capsule, a liquid preparation such as a liquid preparation, a suspension, or a syrup. Or the like. When used as a liquid preparation, it may be supplied as a dry product intended to be redissolved when the lactose intolerance improving agent of the present invention is used.
  • the oral solid preparation may contain additives such as binders, excipients, lubricants, disintegrants, wetting agents and the like generally used in pharmacy.
  • Oral liquid preparations may contain additives such as stabilizers, buffers, taste-masking agents, preservatives, fragrances, and coloring agents that are commonly used in pharmacology.
  • the dose of the lactose intolerance improving agent of the present invention varies depending on the age and weight of the administration subject, the administration route, and the number of administrations, and can be varied widely within the discretion of those skilled in the art.
  • the dose of the lactic acid bacterium according to the present invention contained in the lactose intolerance improving agent of the present invention is suitably 1 to 1000 mg / kg / day.
  • the lactose intolerance improving agent of the present invention may be administered once or repeatedly at intervals of 6 to 8 hours.
  • Subjects to which the lactose intolerance improving agent of the present invention is administered are preferably, but not limited to, mammals including humans, domestic animals, pets, experimental (test) animals and the like. Furthermore, infants, adults, and elderly mammals that are suspected of being lactose intolerant are also preferred as subjects of the present invention, and mammals that have reduced ratatoses due to aging or disease, etc. A mammal having a genetic predisposition to lactose intolerance or an environmental predisposition is more preferable as a subject to which the lactose intolerance improving agent of the present invention is administered. Since the lactose intolerance improving agent of the present invention is less likely to cause side effects, it can be used very effectively for continuous use.
  • the present invention also relates to a food or drink containing the lactic acid bacteria belonging to the genus Bacillus which has both the intestinal tract adhesion and the activity of exonuclease degrading enzyme, both of which are remarkably enhanced, obtained using the above screening method.
  • the food or drink of the present invention is not particularly limited, but is particularly preferably a food and drink for improving lactose intolerance.
  • lactose intolerance improvement '' refers to subjects with an indication of lactose intolerance, strength, or suspicion of it, and unpleasant digestive symptoms of lactose intolerance (abdominal pain) , Diarrhea, tummy feeling, etc.) Is intended to completely prevent or reduce the severity of symptoms of lactose intolerance.
  • “food and drink” is not limited, but the type of food and drink containing the lactic acid bacteria according to the present invention including drinks, foods and functional foods is not particularly limited.
  • beverages containing lactic acid bacteria according to the present invention fermented milk (such as yogurt), lactic acid bacteria beverages, milk beverages (such as coffee milk and fruit milk), tea-based beverages (such as green tea, tea and oolong tea), fruit and vegetable-based beverages (Beverages containing fruit juices such as oranges, apples and grapes, and vegetable juices such as tomatoes and carrots), alcoholic beverages (beer, sparkling wine, wine, etc.), carbonated beverages and soft drinks .
  • existing reference books such as “Latest 'Soft Drinks” (2003) (Kokai Co., Ltd.) can be referred to.
  • the food containing the lactic acid bacterium according to the present invention is not particularly limited and may be a fresh food or a cache food, but the lactic acid bacterium according to the present invention is particularly suitable as a food. Examples include fermented milk and lactic acid bacteria beverages that can be delivered to the intestines alive.
  • the food containing lactic acid bacteria according to the present invention may be a dairy product such as yogurt or cheese, or a starter for producing fermented milk.
  • the “functional food” of the present invention means a food having a certain functionality for a living body, and includes, for example, food for specified health use (including conditional tokuho [food for specified health use]) and food with nutritional function.
  • Functional foods, special-purpose foods, dietary supplements, health supplements, supplements (for example, in various dosage forms such as tablets, coated tablets, dragees, capsules and liquids) and beauty foods (for example, diet foods) Includes so-called health foods in general.
  • the functional food of the present invention also includes health food to which a health claim based on the food standard of Codex (FAO / WHO Joint Food Standards Committee) is applied.
  • More specific examples preferable as the functional food of the present invention include special-purpose foods such as foods for patients, pregnant women's milk powder, infant formulas, and elderly foods.
  • the lactic acid bacteria according to the present invention can gradually improve the intestinal environment with mild action, improve the resolution of ratatoses in the intestine, improve lactose intolerance, and reduce the symptoms.
  • infant formula or liquid formula for the treatment of lactose intolerance in weak infants for example, it can be added to the normal infant formula
  • infants such as infant formula
  • Suitable functional foods of the present invention further include supplements for infants, subjects for maternal / lactating women, and supplements for elderly people for subjects exhibiting lactose intolerance due to innate or acquired factors. And sick supplements.
  • Preferable examples of functional foods containing lactic acid bacteria according to the present invention include health functional foods.
  • the health functional food system was established not only for normal foods but also for foods in the form of tablets, capsules, etc., based on domestic and external trends and consistency with conventional food systems for specified health use.
  • functional health foods consist of two types: foods for specified health use (individual permission type) and functional foods for nutrition (standard type).
  • new types such as conditional tokuho [food for specified health use] are included.
  • the functional food of the present invention introduces and establishes the lactic acid bacteria according to the present invention in the intestine, and improves (preferably, continuously) the intestinal leuth resolution, resulting in lactose intolerance. It is preferable to have an effect of improving the symptoms.
  • the functional food of the present invention may be intended primarily for uses other than the improvement of lactose intolerance.
  • the functional food of the present invention (preferably, food for specified health use or conditional tokuho [food for specified health use]) improves the intestinal extra-cellular resolution, thereby improving lactose intolerance or its symptoms. It may be a description or display of the effect to be performed. Such description or labeling may have been approved for labeling based on the provisions established in the Health Functional Food System.
  • the functional food of the present invention is in the form of solid preparations such as tablets, granules, powders, pills and capsules, liquid preparations such as liquids, suspensions and syrups, or preparations such as gels.
  • solid preparations such as tablets, granules, powders, pills and capsules
  • liquid preparations such as liquids, suspensions and syrups
  • preparations such as gels.
  • normal food and drink for example, fermented milk, beverages, powdered tea leaves, confectionery, etc. It may be.
  • the blending amount of the lactic acid bacteria according to the present invention in the food or drink is not particularly limited, and may vary depending on the case.
  • the specific blending amount can be appropriately determined by those skilled in the art in consideration of the type of food and drink, the desired taste and texture.
  • a blending amount such that the total amount of lactic acid bacteria according to the present invention is 0.001 to 100% by weight, particularly 0.1 to 100% by weight, is appropriate.
  • the lactic acid bacteria according to the present invention may be contained in the food and drink by any appropriate method available to those skilled in the art.
  • the lactic acid bacteria according to the present invention may be directly mixed into a raw material for food and drink.
  • the lactic acid bacteria according to the present invention may be applied, coated, permeated or sprayed on food and drink.
  • the lactic acid bacteria according to the present invention may be uniformly dispersed in food or drink, or may be unevenly distributed. You may prepare the capsule etc. which put the lactic acid bacteria based on this invention.
  • the lactic acid bacteria according to the present invention may be wrapped with an edible film or an edible coating agent. Moreover, after adding an appropriate excipient
  • the lactic acid bacteria based on this invention you may shape
  • Such processed products that may be further processed by the food and drink containing the lactic acid bacteria according to the present invention are also included in the scope of the present invention.
  • the food / beverage products containing the milk fermented product manufactured using the lactic acid bacteria based on this invention are especially preferable.
  • the food or drink of the present invention is not particularly limited, but it is particularly preferable to contain the lactic acid bacteria according to the present invention in a living state.
  • Additives include, but are not limited to, color formers (sodium nitrite, etc.), coloring agents (gardenia pigment, red 102, etc.), flavorings (orange flavors, etc.), sweeteners (stevia, astel palm, etc.) , Preservatives (sodium acetate, sorbic acid, etc.), emulsifiers (sodium chondroitin sulfate, propylene glycol fatty acid esters, etc.), antioxidants (EDTA disodium, vitamin C, etc.), pH regulators (taenoic acid, etc.), chemical Seasonings (such as sodium inosinate), thickeners (such as xanthan gum), swelling agents (such as calcium carbonate), antifoaming agents (such as phosphate phosphate), binders (such as sodium polyphosphate), nutrition enhancement Agents (calcium fortifier,
  • the food or drink of the present invention contains at least one lactic acid bacterium according to the present invention (one or more strains).
  • the lactic acid bacteria according to the present invention include Lactobacillus gasseri OLL2836 strain (Accession number MTE BP-241), Lactobacillus gasseri OLL2948 strain (Accession number BP BP-242), and Lactobacillus mucosa. It preferably contains at least one selected from the OLL2848 strain (Accession No. MTE BP-243).
  • the food and drink of the present invention comprises at least Lactobacillus gasseri OLL2836 strain (Accession No.
  • MTE BP_241 Ratobacillus gasseri OLL2948 strain (Accession No. MTE BP-242), and Lactobacillus mucosa.
  • the subject who ingests or administers the food or drink of the present invention is not limited, but is preferably a human, a domestic animal (pig, horse, etc.), a pet animal (Inu, cat, etc.), an experiment.
  • (Test) Mammals including animals (rodents such as mice and rats, and rabbits).
  • rodents such as mice and rats, and rabbits.
  • infants, adults, and elderly mammals that are suspected of being lactose intolerant are also preferred as subjects of the present invention, and mammals that have reduced latatose resolution due to aging or disease, etc.
  • Mammals having a genetic or environmental predisposition to lactose intolerance are also preferred as subjects for ingesting or administering the food or drink of the present invention.
  • test lactic acid bacteria used in the following are human-derived lactic acid strains provided by Meiji Dairies Co., Ltd., American Type Culture Collection (ATCC), RIKEN Microbiology Storage Facility (JCM), MAFF Livestock Experiment Station (NIAI) ), And a lactic acid strain obtained from the National Collections of Food Bacteria (NCFB) in the UK, and a total of 104 lactic acid strains isolated from infant feces by a modified LBS agar by the present inventors.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • JCM RIKEN Microbiology Storage Facility
  • MAFF Livestock Experiment Station a lactic acid strain obtained from the National Collections of Food Bacteria (NCFB) in the UK, and a total of 104 lactic acid strains isolated from infant feces by a modified LBS agar by the present inventors.
  • NCFB National Collections of Food Bacteria
  • lactic acid bacteria include Lactobacillus bulgaricus, Lattobacillus noles' Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus acidophilus, us lactis), Lactobacillus gasseri, Lattobacillus crispatus, Lactobacillus crispatus, Fuchno Chinores 1 ⁇ (Lactobacillus johnsonii), and various strains of Lactobacillus mucosae
  • strains with unidentified strains were included.
  • the strain described as OLL or MEP in the strain name indicates a strain possessed by Meiji Dairies Co., Ltd.
  • each lactic acid bacterium was dispersed in a sterilized 10% (w / v) skim milk medium (Snow Brand Milk Products Co., Ltd., Sapporo) and stored at _80 ° C in a deep freezer until use. .
  • each strain was subcultured 3 times in MRS medium (Difco, Detroit, MI, USA).
  • MRSL medium in which 2% glucose was replaced with ratatose
  • the obtained bacterial cell culture solution was inoculated to a newly prepared MRSL medium at 1%, and then cultured at 37 ° C for 18 hours.
  • the cells collected by centrifugation of the main culture thus prepared (6,000 X g, 20 minutes, 4 ° C) are washed with 0.05 M phosphate buffer (pH 6.8), and then suspended in distilled water. It became cloudy and then freeze-dried.
  • strains with high intestinal adhesion were selected using the Atsey system developed by the present inventors for examining the binding ability to intestinal mucin.
  • the Atsy system used is also described in detail in international application WO2006 / 067940.
  • each strain was inoculated and then subcultured 3 times in MRS medium. After culturing at 37 ° C for 12 hours, 500 ⁇ ⁇ was dispensed into a 1.5 ml tube. This culture solution is centrifuged (6,000 mm, 4 ° C, 10 minutes), and the cells obtained by removing the supernatant are washed twice in PBS buffer (pH 7.2) and suspended in distilled water. Freeze-dried. The bacterial cells were prepared to a concentration of 0.1 mg / ml using HBS-EP buffer (0.01 M HEPES (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Surfactant P20) to prepare an analyte solution. [0078] 2. Preparation of human intestinal mucin (HCM) and production of HCM-immobilized sensor chip
  • Human intestinal mucin was prepared and immobilized on a sensor chip.
  • Human type A intestinal tract (blood type A human-derived large intestine), human type B intestine (blood type B human-derived large intestine), and human type O intestinal tract (blood type 0 human-derived large intestine) Received a sample collection from the graduate School of Medicine, Tohoku University. This sample was collected through the Ethics Committee of the graduate School of Medicine, Tohoku University, and with the consent of the patient.
  • a mucus mucin layer was collected from the normal large intestine portion of the intestinal tract by a surface layer removal method.
  • the mucous mucin layer consists of Folch solvent (mixed form-methanol (2: l (v / v)); J.
  • the moving bed was 4M guanidine hydrochloride solution and the column for gel filtration chromatography was Toyopearl HW_65F (90cm X 2.6cm, Tosoh. Tokyo. Japan). Measure the absorbance of protein at 280 ⁇ m by phenol sulfate method (measurement of absorbance at 490 nm after reaction). As a result, protein has absorption (280 nm absorbance) and the highest peak of neutral sugar content.
  • the mucin fraction of the large intestine was fractionated with a molecular weight of about 2 million or more in gel filtration chromatography as a guideline, and the purified product thus obtained was used for human A according to the blood type of the human.
  • HCM human colon mucin
  • B-type intestinal mucin B-.
  • O_H M M O type intestinal mucin
  • Immobilization of each HCM obtained as described above to the sensor chip for BIACORE was performed by a amine coupling method in a nano sensor BIACORE1000 (BIACORE).
  • BIACORE1000 a nano sensor BIACORE1000
  • 75.0 mg / ml N-ethyl _N '-(3-dimethylaminopropyl-carbodi) was applied to sensor chip CM5 (BIAC ORE) into which carboxymethyldextran group had been introduced in advance.
  • a mixed reagent (EDC / NHS) mixed with 50 ⁇ 1 of midhydrochloride (EDC) and 50 ⁇ 1 of 11.5 mg / ml ⁇ -hydroxysuccinimide (NHS) was used to activate the carboxy group in carboxymethyldextran. It was.
  • the HCM immobilization amount shown as the difference between report points before EDC / NHS introduction and after ethanolamine solution addition was 1000-2000 RU.
  • the HCM-immobilized sensor chip thus obtained was then used for testing the analyte solution.
  • BIACORE1000 biosensor BIACORE1000
  • Running buffer HBS-EP buffer (pH 7.4)
  • Regeneration solution 1M guanidine hydrochloride solution 5 ⁇ 1
  • the amount of binding (interaction) between the analyte and the probe is expressed as a value in units of resonance units (RU).
  • 1 Resonance unit (RU) means that the substance lpg is bound per lmm 2 on the surface of the sensor chip. That is, based on the binding / dissociation curve obtained in this analysis, the value obtained by subtracting the RU value before binding from the RU value after binding is the lmm 2 between each lactic acid bacterium as an analyte and each intestinal mucin as a probe. It corresponds to the amount of binding per hit. This amount of binding corresponds to the binding ability between the lactic acid bacteria and each intestinal mucin.
  • the binding ability to at least one intestinal mucin was 100 RU or more.
  • the strains that showed values were selected from 104 lactic acid bacteria. In the selected strain, it can be said that the intestinal adhesion is enhanced (higher intestinal adhesion) than other average lactic acid strains. Representative examples of the selected strains and the analysis results are shown in FIGS.
  • the solution in which the reaction was stopped was repeatedly concentrated and dried at 40 ° C. using a rotary evaporator (Tokyo Science Machine, Tokyo) to remove 0-nitrophenyl (ONP) generated in the reaction.
  • the concentrated reaction mixture was mixed with activated carbon (50 g) and allowed to stand at 4 ° C for 2 hours to adsorb chemically synthesized ONPGlc_6P and unreacted ONPGlc to activated charcoal. It was washed with double volume of distilled water (2 L) and desalted.
  • the elution of ⁇ NPGlc_6P adsorbed on activated carbon was performed using a pyridine: water: ethanol mixture (1: 1: 1 (v / v), 600 ml).
  • the eluate was repeatedly concentrated on a rotary evaporator at 40 ° C to remove pyridine. Subsequently, it was subjected to preparative paper chromatography (PPC). That is, 100 PPC filter paper (Whatman, 3MM, 46 X 57cm, Maidstone, England) Using a ⁇ 1 micropipette, apply the above-mentioned roughly purified ONPGlc-6P in a straight line, and simply use the ascending method using butanol: pyridine: water (6: 4: 3 ( ⁇ / ⁇ / ⁇ )) as the developing solvent. Expanded.
  • PPC preparative paper chromatography
  • ONPG1C-6P was extracted by immersing the cut paper in distilled water and stirring at 4 ° C. After extraction, the filter paper is removed, the aqueous layer is concentrated on a rotary evaporator, and the mixed reaction by-product is a TOYOPEARL HW40S column using distilled water as the mobile phase (2.6 ⁇ X 90 cm, Tosoichi, Tokyo) It was removed by gel filtration using.
  • the ONPGlc-6P fraction was collected from each eluted fraction using thin layer chromatography (TLC, Silicatel 60, 10 ⁇ 10 cm, Merck, Darmstadt, Germany).
  • TLC thin layer chromatography
  • the developing solvent for TLC was simply developed using butanol: 2-propanol: water (3: 12: 4 (v / v / v)).
  • a 5% (v / v) sulfuric acid-methanol solution was sprayed evenly onto a thin layer plate, and detected by heating for 3 minutes in a dryer (Yamato, Tokyo) heated to 150 ° C.
  • the collected ONPGlc-6P fraction was lyophilized to obtain purified ONPGlc-6P.
  • the purity was confirmed by TLC and the structure was confirmed by ⁇ -NMR.
  • the 104 lactic acid bacteria strains prepared in Example 1 were measured for the -gal, P- ⁇ -gal, and P_i3-glc ratatase activities using the Fisher method. That is, for each strain, 0.5 mg of freeze-dried cells were suspended in 1.0 ml of 0.05M phosphate buffer (pH 6.8), and toluene-acetone mixture (1: 9 (v / v)) 50 ⁇ 1 was added to the solution. Stir vigorously for 3 minutes.
  • Lactic acid strains with high intestinal adherence and high ratatase activity based on the measurement results of intestinal adherence and ⁇ -gal, ⁇ - ⁇ -gal and ⁇ - ⁇ -glc activities shown in the above examples were selected.
  • three strains of lactic acid OLL2836, OLL2948, OLL2836, strains with high intestinal adherence and markedly high activity for any one of ⁇ _gal, ⁇ - ⁇ -gal, and ⁇ _ ⁇ _glc latatase activity.
  • OLL2848 strain were selected ( Figures 1-3).
  • many lactic acid bacterial strains with relatively high latatase activity are excluded because of their low intestinal adherence (RU values of less than 100 RU for human intestinal mucins of type A, B, and O). It became the result.
  • OLL2836 strain showed P- ⁇ -gal activity of 46.576 units / mg protein
  • 0948 strain showed P-glc activity of 50.194 units / mg protein
  • the strain OLL2848 showed ⁇ -gal activity of 107.090 units / mg protein. These activities were considerably higher than those of other lactic acid strains with high intestinal adherence. In addition, these strains also showed very high values for RU values indicating intestinal adhesion.
  • OLL2836 strain is particularly strong and capable of binding to human type B intestinal mucin and human type O intestinal mucin
  • OLL2948 and OLL2848 are particularly strong in binding to human type A intestinal mucin. Indicated.
  • each of these lactic acid strains alone can be expected to have an effect of colonizing in the intestinal tract and continuously degrading ratatose, and in addition, by using the three strains in combination, It has been shown that subjects with different blood types will be able to obtain an effect of erosion, even high, and latatoses.
  • OLL2836, OLL2948 and OLL2848 strains further bacterial species identification tests were conducted.
  • L., OLL2836 and OLL2948 were identified as bacteria belonging to Lactobacillus gasseri and OLL2848 as Lactobacillus mucosae (see Examples below).
  • These three lactobacillus strains were obtained from the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Deposit Center (2-5-8 Kisarazu Kazusa, Chiba, Japan) on June 9, 2006 (original deposit date) The application for deposit was made and received.
  • the receipt numbers for this deposit application are NITE AP_241 for OLL2836, NITE AP-242 for OLL2948, and NITE AP-243 for OLL2848, and the deposit numbers are NITE P-241, NITE P-242, and NITE P, respectively. -243.
  • These deposited strains were transferred to the deposit under the Budapest Treaty (international deposit) on March 27, 2007, and were deposited on June 9, 2006 as the original deposit date.
  • These international deposit numbers are NITE BP_241 for OLL2836, NITE BP_242 for OLL2948, and SNITE BP-243 for OLL2848. The mycological properties of these strains were confirmed as shown in Table 1 above.
  • a lactic acid strain having high intestinal adhesion and high ratatase activity can be obtained. Furthermore, iL-gal P- ⁇ -gal and ⁇ - ⁇ _glc were assayed for ratatase activity, and those strains that showed markedly high activity for each of the three latatolytic enzymes were selected. In combination, we were able to obtain a very useful combination of lactic acid bacteria that can be applied to a wide range of subjects.
  • the lactic acid strain obtained by the method of the present invention can be effectively used to improve lactose intolerance as a useful probiotic lactic acid strain that can settle in the intestinal tract and continuously reduce latatoses. Conceivable.
  • Bacterial species were identified for the three lactic acid strains OLL2836, OLL2948 and OLL2848 selected in Example 5. Identification was performed by 16S rDNA nucleotide sequence analysis based on amplification and sequencing of the V3 region. In the following, the identification tests performed on OLL2848 and OLL2948 strains are described as examples. However, the OLL2836 strain was identified in the same manner.
  • universal primers 27F 5, -GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ', SEQ ID NO: 1) and 518R (5, _ATTAC CGCGGCTGCTGG-3', SEQ ID NO: 2) were used.
  • PCR conditions are 95 cycles at 95 ° C for 10 minutes, 55 ° C for 3 minutes, 72 ° C for 1 minute, 39 cycles at 95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute] One cycle was performed.
  • the DNA fragment amplified by the above PCR reaction was then subjected to electrophoresis. Electrophoresis was performed under a constant voltage of 100 V using 2% agarose gel as the electrophoresis gel and 1 X TBE buffer (90 mM Tris-boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.0) as the electrophoresis buffer. Mupid-2 (Cosmo Bio, Tokyo) was used as the electrophoresis apparatus. As a molecular weight marker, a 100b DNA ladder (TaKaRa, Kyoto) was used. After electrophoresis, the gel was stained by immersing it in ethidium bromide (EB) solution (0.5 Aig / ml) for 10 minutes.
  • EB ethidium bromide
  • the gel after agarose gel electrophoresis and staining was irradiated with UV light using a UV transilluminator TRANS-20 (Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo), and the target DNA fragment was confirmed and cut out.
  • DNA was extracted using the DNA fragment purification kit MagExtractor (TOYOBO, Osaka). That is, after the excised agarose gel was transferred to a 1.5 ml tube, 400 / l adsorbed liquid was added and heated to 55 ° C. to completely dissolve it. Next, 15 ⁇ l of magnetic beads were added to the reaction solution and stirred, and then allowed to stand at room temperature for 1 minute.
  • the nucleotide sequence of the V3 region of OLL2848 strain showed 99.6% homology with the sequence of the V3 region of Lactobacillus mucosae.
  • the nucleotide sequence of the V3 region of OLL2948 strain showed 99.2% homology with the sequence of the V3 region of Lactobacillus gasseri. Therefore, OLL2848 was identified as a lactic acid bacterium belonging to Lactobacillus mucosae and OLL2948 as a lactic acid bacterium belonging to Lactobacillus gasseri.
  • the method of the present invention can be used to efficiently select lactic acid strains useful for improving lactose intolerance.
  • the lactic acid strain obtained by the method of the present invention can be conveniently used as an active ingredient for drugs, functional foods and the like that can be easily administered to patients and can continuously improve lactose intolerance.
  • sequences of SEQ ID Nos: 1 to 3 are primers.

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Description

明 細 書
乳糖不耐症を改善するための乳酸菌
技術分野
[0001] 本発明は、乳糖不耐症を改善するのに有用な乳酸菌とその利用に関する。
背景技術
[0002] 「乳糖不耐症」は、摂取した乳中のラタトース (乳糖)の消化不良が原因で、下痢や 腹痛などの不快な消化器症状を容易に生じる体質である。この乳糖不耐症は、一般 的には加齢に伴って顕著になると考えられているが、乳幼児期にも認められる。乳糖 不耐症の症状を軽減するためには、ラタトースを含む製品の摂取を避ける必要がある 力 良好なカルシウム源である乳製品を摂取できないことは、例えば高齢者の骨粗鬆 症のリスクを高め、栄養面でも大きな障害となる。骨粗鬆症は高齢化が急速に進む我 が国を脅かす最大の疾病の一つであり、高齢者の骨粗鬆症リスクを低減させる意味 で、乳製品の積極的な摂取を促すことは殊に重要である。
[0003] ラタトースは、通常、小腸内層の細胞で産生されるラタトース分解酵素によって分解 され、吸収される。一方、乳酸菌等の様々な微生物がラタトース分解酵素を産生し、 ラタトースを分解することが知られている。生きた乳酸菌や酵母を含むヨーグルトや乳 酸菌飲料は、ラタトースの一部が分解されてレ、るため乳糖不耐症の症状を比較的起 こしにくいと考えられており、さらに、それらの継続的な経口摂取によって腸内でそれ らの菌が徐々に増殖し、腸内のラ外ース分解能が増大する結果、乳糖不耐症自体 の改善にもつながるとされている。
[0004] 以前から、乳酸菌のラタトース代謝には、 β -ガラタトシダーゼ（ β -gal)およびフォス フォ- β -ガラタトシダーゼ（Ρ- β -gal)という 2種類のラタトース分解酵素が関与するこ とが知られているが、さらに本発明者らにより、乳酸菌が有するフォスフォ _ j3 _ダルコ シダーゼ (P- β -glc)という 3つ目のラタトース分解酵素の存在も明らかにされた（非特 許文献 1)。これらラタトース分解酵素の活性が高い乳酸菌は、乳糖不耐症の症状軽 減に効果的と考えられる。しかし非腸管系乳酸菌の中には、高いラ外ース分解活性 を有するものがあるが、一般的にヒト腸管内で生育できなレ、ものもあると認識されてい る。このような乳酸菌では、ヒト腸管内で持続的にラタターゼの産生ができず、経口摂 取した分以上のラタターゼ活性を望めないと考えられる（非特許文献 2)。従って、乳 酸菌の経口投与により乳糖不耐症を改善するためには、ラタターゼ活性が高いだけ でなぐヒト腸内で持続的にラタトースを分解できる乳酸菌が必要であるが、そのような 乳酸菌の探索はまだあまり進んでいない。
ところで、腸管系乳酸菌の中には腸管付着性の高い菌が存在することが知られて いる。そのような腸管付着性の高い菌を探索する方法として、例えば、ヒト腸管ムチン への結合能を測定することにより、ヒトの各血液型に適合した腸管付着性の高い乳酸 菌をスクリーニングする方法がある（特許文献 1)。この方法は、乳酸菌がヒトに初期感 染し腸管へ定着するためには腸上皮細胞表面に接着することが不可欠であると考え られてレ、ること、高橋らの大腸ムチン (RCM)を用いた乳酸菌スクリーニングの報告 [ 大腸ムチン（RCM)をコートしたポリスチレンビーズを用いてラクトバチルス.ァシドフィ ルスグノレープ乳酸菌株をスクリーニングしたところ、その RCMに強く結合した乳酸菌 株由来の表層タンパク質 (SLP)がヒト大腸粘液層にも結合したとの報告。非特許文献 3など]、ヒト大腸ムチンを構成する糖鎖の化学構造が ABO式血液型により異なるとの 報告 (例えば、非特許文献 4)等に基づいて構築されたものである。しかし、各血液型 に適合した乳酸菌の探索以外の用途へのこのスクリーニング方法の適用は、まだほ とんどなされていない。
特許文献 1：特開 2004— 101249号公報
非特許文献 1 :齋藤忠夫、伊藤敞敏、舘野義男、山崎由紀子、ヒト腸管起源の Lactob acillus gasseri (ガセリ菌）におけるラタトース資化系の新経路の発見、生物工学会誌、 (2001)、 79(6)、 pp.172-173
非特許文献 2： Marteau P, Minekus M, Have腿 r R， Huis in't Veld JH、 Survival of la ctic acid bacteria in a dynamic model of the stomach and small intestine: validation a nd the effects of bile.、 J Dairy Sci、 (1997) 80(6)、 pp.1031-1037
非特許文献 3 : Takahashi N， Saito T， Ohwada S, Ota H, Hashiba H, Itoh T、〃A new screening method for the selection of Lactobacillus acidophilus group lactic acid bac teria with high adhesion to human colonic mucosa. 、 Biosci Biotechnol Biochem、 (19 96)、 60(9)、 pp.1434- 1438
非特許文献 4 :天野純子、消化管ムチン上の血液型糖鎖構造 細菌感染のメカニズ ム解明に向けて、生化学、社団法人日本生化学会、 (1999) 71(4)、 pp.274〜277 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、乳糖不耐症を改善する能力を有する乳酸菌を提供することを目的とす る。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、一部のラタトバ チルス属乳酸菌においては腸管付着性およびラ外ース分解酵素活性が共に増強さ れうることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
[0008] すなわち、本発明は以下を包含する。
[0009] [1]ラクトバチルス属乳酸菌から腸管付着性およびラ外ース分解酵素活性が共に増 強された菌を選抜することを特徴とする、乳糖不耐症の改善能を有する乳酸菌をスク リーユングする方法。
[0010] この方法では、その菌の選抜において、ヒト A型腸管ムチン、ヒト B型腸管ムチン、お よびヒト〇型腸管ムチンのうち少なくとも 1つに対する乳酸菌の結合能を表面ブラズモ ン共鳴解析を用いて測定し、その結合能を示す RU値が 100 RU以上である菌を腸管 付着性が増強された菌として選抜することが、より好ましい。
[0011] この方法において、選抜される菌で増強されるラタトース分解酵素活性は、好ましく は、 β -ガラタトシダーゼ、フォスフォ- β -ガラタトシダーゼ、およびフォスフォ- β -グル コシダーゼのうち少なくとも 1つのラタターゼ活性である。
[0012] この方法において、好適には、スクリーニングを行うラクトバチルス属乳酸菌は、ラタ トバチノレス.ガセリ（Lactobacillus gasseri)、またはラタトバチノレス.ムコサェ（Lactobacil lus mucosaeノで ¾)る。
[0013] [2]上記 [1]の方法により得られる、腸管付着性およびラ外ース分解酵素活性が共に 増強された乳酸菌。
[0014] [3]ラクトバチルス'ガセリ OLL2836株（受託番号 ΝΠΈ BP- 241)、ラクトバチルス 'ガ セリ OLL2948株（受託番号 NITE BP-242)、およびラクトバチルス'ムコサェ OLL284 8株（受託番号 MTE BP-243)のうちのいずれかである乳酸菌。
[0015] [4]上記 [3]の乳酸菌を少なくとも 1つ含有する乳糖不耐症改善剤。
[0016] この乳糖不耐症改善剤としては、ラクトバチルス'ガセリ OLL2836株（受託番号 NIT E BP-241)、ラクトバチルス.ガセリ OLL2948株（受託番号 NITE BP-242)、およびラタ トバチルス.ムコサェ OLL2848株（受託番号 NITE BP-243)の 3つの乳酸菌を少なくと も含有するものがより好適である。
[0017] [5]上記 [3]の乳酸菌を少なくとも 1つ含有する飲食品。
[0018] この飲食品としては、ラクトバチルス'ガセリ OLL2836株（受託番号 NITE BP_241)、 ラクトバチルス'ガセリ OLL2948株（受託番号 NITE BP-242)、およびラクトバチルス. ムコサェ OLL2848株（受託番号 NITE BP-243)の 3つの乳酸菌を少なくとも含有する ものがより好適である。
[0019] この飲食品としては、乳児用食品、幼児用食品、授乳婦用食品、高齢者用食品、 病者用食品、保健機能食品、サプリメント、発酵乳、または乳酸菌飲料が好ましい。
[0020] この飲食品は、とりわけ、乳糖不耐症改善用の飲食品として好適である。
発明の効果
[0021] 本発明のスクリーニング方法によれば、乳糖不耐症の改善に役立つ乳酸菌株を効 率良く選抜することができる。また本発明の乳酸菌株を用いれば、乳糖不耐症の改 善に有用な薬剤や様々な飲食品を製造することができる。
[0022] 本明細書は本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願第 2006-175897号の 開示内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0023] [図 1]図 1は、腸管付着性が高い代表的な菌株についての P- β -gal活性試験の結果 を示す。
[図 2]図 2は、腸管付着性が高い代表的な菌株についての P- β -glc活性試験の結果 を示す。
[図 3]図 3は、腸管付着性が高い代表的な菌株についての β -gal活性試験の結果を 示す。 発明を実施するための最良の形態
[0024] 以下、本発明を詳細に説明する。
[0025] 1.乳糖 而碗の己ケ 食!^ する乳酸 のスクリーニング 法
本発明は、ラクトバチルス属乳酸菌から、腸管付着性およびラタトース分解酵素活 性が共に増強された菌を選抜することにより、乳糖不耐症の改善能を有する乳酸菌 をスクリーニングする方法に関する。
[0026] 本発明の方法においてスクリーニングに供する「ラタトバチルス属乳酸菌」とは、通 常の分類学的手法に従ってラクトバチルス属（Lactobacillus)またはラクトバチルス属 に属するいずれかの細菌種に分類される細菌を意味する。その分類学的手法は特 に限定されず、既知のラ外バチルス属菌の分類に用いられてきた従来の形態学的 分類法や生理'生化学的性状に基づく分類法を包含するが、例えば菌種未同定の 細菌については、 16S rDNA配歹 lj、特にその V3領域の塩基配列を用いた相同性解析 に基づく分子系統学的分類法を用いることが、分類を明確にする上でより好ましい。 ラクトバチルス属乳酸菌に属する細菌種の具体例としては、ラクトバチルス ·ブルガリ カス (Lactobacillus bulgaricus ま 7こは Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)、フ クトノくチノレス 'ァノレフレッキー (Lactobacillus delbrueckii^また fま Lactobacillus delbrue ckii subsp. delbrueckiiリ、フクトノ、チノレス 'ァシトノイノレス (Lactobacillus acidopmlus)、 ラクトバチルス ·カゼィ（Lactobacillus casei)、ラクトバチルス ·プランタラム（Lactobacill us plantarum) ,ラクトノくチノレス'ブレビス (Lactobacillus brevis)、ラタトバチノレス'ブフ ネリ (Lactobacillus buchneri)、フクトノ、チノレス'ファ1 ~メンタム (Lactobacillus fermentu m)、ラクトバチルス 'ヘルべティカス（Lactobacillus helveticus)、ラタトコッカス 'ラタティ ス (Lactococcus lactis)、フク卜ノヽチノレス-クリスノ タス (Lactobacillus crispatus)、ラク卜 バチルス ·ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii)、ラタトバチルス ·サリバリウス（Lactob acillus salivarius)、フクトノくチノレス 'ガでリ (Lactobacillus gasseri)、フクトノ チノレス'ムコ サェ（Lactobacillus mucosae)などが挙げられる力 これらに限定されるものではない 。本発明の方法では、ラ外バチルス属乳酸菌として、腸管系乳酸菌が好ましぐとり わけラクトバチルス ·ガセリおよびラクトバチルス *ムコサェが好ましい。本方法におい てスクリーニングに供する「ラタトバチルス属乳酸菌」は、複数種のラクトバチルス属乳 酸菌細胞を含む細胞集団または細胞混合物であってもよいし、ラクトバチルス属乳酸 菌の個別の菌株の集合であってもよレ、。
[0027] 本発明では、以上のようなラクトバチルス属乳酸菌について、腸管付着性およびラ クトース分解酵素活性を測定し、それらが共に増強されている菌を選抜する。
[0028] ここで「腸管付着性」とは、被験体の腸上皮細胞表面への乳酸菌の結合能を言う。
本発明に係る乳酸菌の腸管付着性の測定には、典型的には、ヒト A型腸管ムチン、ヒ ト B型腸管ムチン、およびヒト O型腸管ムチンのうち少なくとも 1つの腸管ムチンに対す る乳酸菌の結合能を測定し、得られた測定値を、腸管付着性を示す値として用いるこ とができる。腸管ムチンに対する乳酸菌の結合能の測定は、例えば特許文献 1およ び国際出願 WO2006/067940に記載の表面プラズモン共鳴解析を利用した方法によ つて行うことができる。表面プラズモン共鳴解析を用いる場合には、腸管ムチンに対 する乳酸菌の結合能を示す RU値が 100 RU以上である菌を、腸管付着性が増強され た菌として選抜乳酸菌株の候補とすることが好ましレ、。
[0029] この腸管ムチンへの結合能のアツセィ系を、以下にさらに具体的に説明する。まず 、血液型別のヒト腸管ムチンを調製するため、各血液型 (A型、 B型、および O型）のヒ ト腸管から表層部分を採取し、塩酸グァニジン等の可溶化剤を用いてゲルろ過を行 レ、、タンパク質吸収（280醒の吸光度）と中性糖含量が高いことを目安にして目的の 画分を採取し、精製する。このゲルろ過精製の詳細については、例えば、 Purushotha man S. et al, Adherence of shigella dysentenae 1 to Human Colonic Mucin. し u rr. Miorobiol., 42(6), p.381-387 (2001)に記載されたヒト大腸ムチンの精製方法を参 考にすることができる。精製後、抗血液型抗原抗体を用いて、調製したヒト腸管ムチ ンに血液型抗原が発現していることを確認することが、より好ましい。具体例として、 実施例に記載の方法を挙げることができる。血液型抗原としては、市販の糖鎖プロ一 ブ（例えば、生化学工業製）あるいはネオグリコプロテイン ' Blood Group A Trisaccari de- BSA (例えば、 Calbiochem社)やネオグリコプロテイン ' Blood Groop B Trisaccarid e_BSA (例えば、 Calbiochem社)などを用いることができ、それを抗原として、当業者 に公知の各種抗体作製法により抗血液型抗原抗体を作製することができる。
[0030] 本発明のスクリーニング方法では、ヒト A型腸管ムチン、ヒト B型腸管ムチン、ヒト〇型 腸管ムチンのそれぞれのヒト腸管ムチンをプローブとして表面プラズモン共鳴スぺタト ノレ解析を行うことにより、それらヒト腸管ムチンに対する乳酸菌の結合能を測定するこ とができる。表面プラズモン共鳴スペクトル解析には、バイオセンサー（生体分子間相 互解析装置）である BIACOREシステム（BIACORE社）、例えば BIACORE1000を用い ること力 Sできる。
BIACOREシステムとは、表面プラズモン共鳴スペクトル（SPR)の原理に基づき、生 体分子の相互作用（結合および解離）を、標識を用いることなぐリアルタイムでモニ ターする解析装置である。具体的には、リガンド（以降、プローブともいう）とアナライト 間の分子間相互作用を測定する。本発明においては、アナライトとして乳酸菌を、リ ガンドとしてヒト大腸ムチン (A型、 B型、〇型）をそれぞれ用いた。表面プラズモン共鳴 の原理については詳細な解説書が多数刊行されている。この装置で用いる原理を簡 単に説明すれば、金膜上で物質を結合 Z解離させて、その結合/解離による金膜 上の質量変化に伴う反射光の屈折率の変化を測定することにより、金膜上に結合し た物質の量を算出するというものである。より具体的には、該装置では、センサーチッ プと呼ばれる金膜が貼られたガラス基板が、試料や試薬を流す流路の途中にその流 れに曝露されるように設置されており、その流路に試料等を流しながら、センサーチッ プに 760nmの偏光をプリズム等でくさび型に集光させ、金膜上で反射させて、その反 射光の屈折率をモニターすると、金膜上の物質の結合量の変化に比例して、表面プ ラズモン共鳴スぺタトノレの角度の変化が示される。そこで BIACOREシステムでは、ま ずプローブを流路に流して予めセンサーチップの金膜上にプローブを固定化し、次 いでプローブが結合していない部位をブロッキングした後、そのプローブとの結合/ 解離反応を調べるべき物質 (アナライト）を流路に流しつつ、経時的に反射光の屈折 率をモニターすることにより、その変化量から、プローブとアナライトとの結合量を算出 すること力 Sできる。このシステムでは、表面プラズモン共鳴スペクトルの角度 0.1° の変 化を 1000レゾナンスユニット（RU)と定義し、レゾナンスユニットを単位とする値（RU値 )に基づいて反射光の屈折率の変化を表す。ここで 1レゾナンスユニット（RU)はセン サーチップ表面上での lpg/lmm2の質量変化に相当する。すなわち、センサーチッ プ上の金膜への物質の結合量は、物質の結合前（添加前）の時点と結合完了時点 の RU値の差から算出できる。 BIACOREシステムを用いれば、プローブ（本発明では 各ヒト腸管ムチン）とアナライト（本発明では乳酸菌）との結合量をセンサーチップ lmm 2当たりの質量変化 (pg)、すなわち RU値として求めることができ、その結合量 (RU値） がプローブへのアナライトの結合能に相当する。
[0032] なお BIACOREシステムで使用されうるセンサーチップには、該センサーチップに固 定化する物質 (プローブ）、固定化方法、使用目的などに応じてレ、くつかの種類があ り、例えば、最もスタンダードな CM5 (ガラス面に金膜 (典型的には 50nm)が貼られ、 その表面上にカルボキシルメチルデキストラン層（典型的には lOOnm)を備える。この カルボキシルメチルデキストラン層の持つカルボキシル基、およびリガンドの持つアミ ノ基、チオール基、アルデヒド基またはカルボキシル基を介してリガンド（プローブ）を センサーチップに固定化する）以外にも、 CM4、 CM3、 Cl、 SA、 NTA、 Ll、 HPAなど 力 Sある。
[0033] 本発明においてセンサーチップに腸管ムチンをプローブとして固定化するには、例 えば BIACOREシステムのメーカー使用説明書に従って実施すればよい。固定化方 法は、例えば、物理的吸着による方法または共有結合による吸着であってもよい。一 例として、センサーチップとして CM5 (BIACORE社）を用いる場合には、まず、 N -ェチ ノレ- N'-(3-ジメチルァミノプロピル-カルボジイミド塩酸塩（EDC)および N-ヒドロキシス クシンイミド (NHS)を 1:1で混合した混合試薬 (EDC/NHS)を流路に流し、センサーチ ップ上のカルボキシルメチルデキストラン中のカルボキシル基を活性化させた後、固 定化用酢酸バッファー（PH4.0)にヒト腸管ムチン溶液（A-HCM、 B-HCM、 O-HCM のそれぞれを別個に使用）をカ卩えた混合溶液を調製してさらに流路に流し、了 ン.力 ップリング反応により、ヒト腸管ムチンをセンサーチップ上のカルボキシノレ基に共有結 合させる。さらにエタノールァミン塩酸塩- NaOH (pH8.5)を用レ、、プローブが結合して レヽなレ、センサーチップ上のカルボキシル基部位をブロッキングして、腸管ムチン（HC M)固定化センサーチップとすることも好ましい。本発明において、センサーチップへ の HCM固定化量は特に限定されなレ、が、 1000〜2000RUであるのが好ましい。
[0034] 次いで、乳酸菌菌体を含む試料 (アナライト溶液）を流路に流し、各 HCM固定化セ ンサーチップ上の HCM (プローブ）と、アナライト溶液中の乳酸菌菌体（アナライト）と の結合量を算出する。限定するものではないが、この解析に使用できる BIACORE10 00の測定条件の一例を下記に示す。
[0035] ランニング緩衝液： HBS-EPバッファー（pH7.4)
アナライト溶液（サンプル）の添加量: 20 μ 1
流速： 3 μ 1/分
反応温度： 25°C
再生溶液： 1Mグァニジン塩酸塩溶液 5 μ 1
このような測定で得られた結合/解離曲線に基づき、アナライト結合後の RU値から アナライト結合前の RU値を差し引いた RU値を、アナライトである乳酸菌とプローブで ある各腸管ムチンとの lmm2当たりの結合量 (pg)、すなわちその乳酸菌の腸管ムチン への結合能を示す値として用いることができる。本発明では、乳酸菌の腸管ムチンへ の結合能が、ヒト A型腸管ムチン、 B型腸管ムチン、〇型腸管ムチンのうち少なくとも 1 つに対して 100 RU以上の値を示した場合、「腸管付着性が増強された」または「腸管 付着性が高い」と判断することとする。
[0036] なお RU値は、 BIACOREシステムでの測定条件により変化しうる。本方法における 温度条件は、例えば、 20〜40°C、好ましくは、 20〜30°C、より好ましくは 23〜28°Cであ る。また、本方法における好ましいアナライト溶液 (サンプル）の濃度は 0.1〜0.5mg/m L、本方法における好ましい流速は 3〜10 /i l/分である。上記範囲であれば、上記諸 条件を変化させても RU値に変動はないため、腸管付着性が高いかどうかを「100 RU 」を基準として判断できる。さらに、アナライト溶液の濃度等の諸条件を上記範囲外に 変化させた場合でも、上記条件における RU値に換算した場合に 100 RUと同等の結 合能が示される場合には、その乳酸菌の腸管付着性は増強されている。さらに本発 明のスクリーニング方法では、 RU値が高い菌ほど腸管付着性が高ぐすなわち通常 の乳酸菌よりも腸管付着性が増強されていると言うことができる。本発明では、少なく とも 1つのヒト腸管ムチンに対する結合能として 100 RU以上、より好ましくは 300 RU以 上、特に好ましくは 1000 RU以上の RU値を示す乳酸菌を、腸管付着性が増強された 菌として選抜することが好ましレ、。
[0037] さらに、本発明のスクリーニング方法では、上記ラクトバチルス属乳酸菌について、 β -ガラタトシダーゼ（ β -gal)、フォスフォ- β -ガラタトシダーゼ（Ρ- β -gal)、およびフ ォスフォ- β -ダルコシダーゼ（Ρ- β -glc)のうち少なくとも 1つのラタトース分解酵素の ラタターゼ活性 (ラタトース分解酵素活性）の測定を行って、該活性が増強されてレ、る 菌株を選抜する。
[0038] 具体的には、 Fisher法に従って、凍結乾燥菌体を 0.05Mリン酸緩衝液に懸濁し、そ れをトルエン -アセトン混液（1 :9 (v/v) )をカ卩えて激しく撹拌し、その懸濁液に、 j3 _gal のラタターゼ活性測定用であれば 0-ニトロフエニル- /3 -D-ガラクトピラノシド（ONPGal )を、 P- /3 -galのラタターゼ活性測定用であれば 0_ニトロフエニル- β _D-ガラクトピラ ノシド _6_ホスフェート（ONPGa卜 6P)を、あるいは P- β -glcのラタターゼ活性測定用で あれば 0-ニトロフヱニル- β -D-ダルコビラノシド -6-ホスフェート（〇NPGlc_6P)を添加 したリン酸緩衝液をカ卩えて、 37°Cで 15分間反応させる。反応後、 0.5M炭酸ナトリウム 溶液を加えて反応を停止させ、遠心分離 (6，000 X rpm、 10分間、 4°C)により菌体成 分を除去し、上清の 405nmにおける吸光度を、吸光光度計（例えば Multiskan MS-U V (Labsystems、 Helsinki, Finland) )を用いて測定する。 1分間に遊離する o_ニトロフ ェノール（ΟΝΡ) Ι μ πιοΙを 1ユニットとして定義し、活性値に換算する。その活性値から 、菌体 lmg当たりの活性値および培養上清に含まれるタンパク質 lmg当たりの活性値 をそれぞれ算出する。
[0039] なおタンパク質の定量には、例えば BCA法に基づく Micro BCA Protein Assay Reag ent Kit (Pierce, Rockford, Illinois, U.S.A)を用い、 2時間反応後、 540nmでの吸光度 を吸光光度計（例えば、 Multiskan MS-UV)を用いて測定することができる。検量線は ゥシ血清アルブミン（BSA)を用いて作成すればょレ、。その検量線に基づレ、て上清中 に含まれるタンパク質の量を算出できる。
[0040] 以上のようにして算出した、 β _gal、 Ρ- β _gal、および Ρ_ β -glcのそれぞれについて の菌体 lmg当たりの活性値および培養上清に含まれるタンパク質 lmg当たりの活性 値から、該ラクターゼ活性が特に高い（通常の乳酸菌よりもラタトース分解酵素活性 が増強されてレ、る）乳酸菌を選抜することができる。
[0041] 限定するものではなレ、が、例えば β -galのラタターゼ活性（本発明では /3 -gal活性 とも呼ぶ）が、培養上清中のタンパク質 lmg当たり 15ユニット以上、好ましくは 100ュニ ット以上である菌株を選抜することが特に好ましい。また P- β -galのラタターゼ活性（ 本発明では P- i3 -gal活性とも呼ぶ）については、培養上清中のタンパク質 lmg当たり 15ユニット以上、好ましくは 45ユニット以上を示す菌株を選抜することが特に好ましい 。さらに P- β _glcのラタターゼ活性 (本発明では Ρ- β _glc活性とも呼ぶ）については、 培養上清のタンパク質 lmg当たり 25ユニット以上、好ましくは 50ユニット以上を示す菌 株を選抜することが特に好ましレ、。
[0042] 本発明の方法では、以上のようにして、上記ラクトバチルス属乳酸菌（より好ましくは ラクトバチルス'ガセリ菌またはラクトバチルス'ムコサェ菌）について腸管付着性およ びラ外ース分解酵素活性をそれぞれ測定し、その結果、腸管付着性とラ外ース分 解酵素活性が共に増強された乳酸菌株を、効率良く選抜することができる。本発明 は、そのようにして選抜された乳酸菌株にも関する。こうして得られたラクトバチルス属 乳酸菌は、腸管内で良好に増殖し、定着し、ラ外ース (乳糖)を非常に効率良く分解 できる能力を保持するため、乳糖不耐症の改善に大変有用である。本発明において 「乳糖不耐症の改善」とは、ラ外ースを含む飲食品（乳製品など)を摂取する際に、 乳糖不耐症の不快な消化器症状 (腹痛、下痢、おなかのゴロゴロ感など）が現れる頻 度を低減させるかもしくは発症を完全に阻止すること、または症状の重篤度を軽減す ることを意味する。また「乳糖不耐症の改善能」は、乳酸菌がそのようにして乳糖不耐 症を改善することができる能力を言う。
[0043] 本発明では、このようなスクリーニング方法を用いることにより、腸管付着性とラクト ース分解酵素活性が共に顕著に増強された 3菌株のラ外バチルス属乳酸菌を、実 際に取得することができた。それら 3つの乳酸菌は、ラクトバチルス'ガセリ OLL2836 株（以降、 OLL2836株ともレ、う）、ラクトバチルス.ガセリ OLL2948株（以降、 OLL2948 株ともレ、う）、およびラクトバチルス'ムコサェ OLL2848株（以降、 OLL2848株ともいう） である。これらの乳酸菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄 託センターに寄託された。これらの寄託に関する情報は、以下の通りである。
[0044] (1)寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
(2)寄託機関の連絡先：日本国千葉県木更津巿かずさ鎌足 2— 5— 8
(3)寄託日（原寄託日 )：平成 18年 (2006年) 6月 9日付 (4)受託番号および受領番号：
'ラタトバチルス'ガセリ（Lactobacillus gasseri) OLL2836株：
受託番号 MTE BP-241 (原寄託の受領番号 ΝΠΈ AP-241)
•ラクトバチルス'ガセリ（Lactobacillus gasseri) OLL2948株：
受託番号 NITE BP-242 (原寄託の受領番号 NITE AP-242)
•ラクトバチルス ·ムコサェ（Lactobacillus mucosae) OLL2848株：
受託番号 NITE BP-243 (原寄託の受領番号 NITE AP_243
寄託したこれら OLL2836株、 OLL2948株、および OLL2848株は、以下の表 1に示す 性質を有する。
[表 1]
Figure imgf000013_0001
表 1中の Lactobacilli MRS Broth (MRS培地；例えば、 Difco, Ref. No.288160)は、こ れらの乳酸菌株の培養に好適に使用可能な培地である。 MRS培地の典型的な組成 を表 2に示す。
[表 2] MRS培地組成
プロテオースぺプトン 10. 0 g
ビーフエキス （Beef Extract) 10. 0 g
酵母エキス (Yeast Extract) 5. 0 g
デキストロース 20. 0 g
ポリソルベート 80 1. 0 g
クェン酸アンモニゥム 2. 0 g
酢酸ナトリウム 5. 0 g
硫酸マグネシウム 0. 1 g
硫酸マンガン 0. 05 g
リン酸ニ力リ ウム 2. 0 g
蒸留水 1 L
[0047] 表 1に示す 3つの菌株は、乳糖不耐症の改善能が特に高いと考えられ、本発明に おいて特に有利に使用することができる。
[0048] 2.本発明に係る乳酸菌を含有する乳糖不耐症 5女善吝 II
本発明に係る乳酸菌は、経口投与により、生存した状態で腸に届き、腸に定着し、 強力なラ外ース分解酵素活性を発揮することができ、その結果として乳糖不耐症を 改善することができる。また本発明に係る乳酸菌を用いて製造される発酵物では、高 レ、ラタトース分解活性によりラタトース（乳糖）の分解率が向上している。
[0049] 従って本発明は、上記スクリーニング方法を用いて得られる、腸管付着性とラ外ー ス分解酵素活性が共に顕著に増強されたラクトバチルス属乳酸菌 (本発明に係る乳 酸菌）を含有する、乳糖不耐症改善剤にも関する。この本発明の乳糖不耐症改善剤 は、乳糖不耐症を示している力 たはその疑いがある被験体に対して投与することに より、乳糖不耐症を改善する効果が得られ、すなわち、乳糖不耐症の不快な消化器 症状 (腹痛、下痢、おなかのゴロゴロ感など）が現れる頻度を低減させる力もしくは発 症を完全に阻止し、または乳糖不耐症の症状の重篤度を軽減することができる。本 発明の乳糖不耐症改善剤は、乳糖不耐症の発症予防効果も有する。
[0050] 本発明の乳糖不耐症改善剤は、本発明に係る乳酸菌を少なくとも 1つ（1菌株以上） 含有する。本発明の乳糖不耐症改善剤は、本発明に係る乳酸菌として、ラクトバチル ス'ガセリ OLL2836株（受託番号 NITE BP-241)、ラクトバチルス'ガセリ OLL2948株（ 受託番号 MTE BP-242)、およびラクトバチルス'ムコサェ OLL2848株（受託番号 NIT E BP-243)から選択される少なくとも 1つを含有することが好ましい。特に好適な実施 形態では、本発明の乳糖不耐症改善剤は、少なくとも、ラクトバチルス'ガセリ OLL28 36株（受託番号 MTE BP-241)、ラクトバチルス'ガセリ OLL2948株（受託番号 ΝΠΈ BP-242)、およびラクトバチルス 'ムコサェ OLL2848株（受託番号 MTE BP-243)の 3 つの乳酸菌をレ、ずれも含有する。この 3つの乳酸菌を組み合わせて含有する乳糖不 耐症改善剤は、 A型、 B型、 O型のいずれの血液型抗原を有する腸管ムチンにも結 合できるため、広範な被験体に対して有効である。
[0051] 本発明の乳糖不耐症改善剤は、本発明に係る乳酸菌の精製菌体を含む組成物で もよレ、し、当該乳酸菌を用いて製造された発酵物、培養物、またはそれらの濃縮物を 含む組成物でもよい。本発明の乳糖不耐症改善剤に含まれる本発明に係る乳酸菌 は、生菌体であっても死菌体であってもよぐ湿潤菌であっても乾燥菌であってもよい 。しかし、より好ましい実施形態では、本発明の乳糖不耐症改善剤は、本発明に係る 乳酸菌を生存状態で含有する組成物である。本発明の乳糖不耐症改善剤は、限定 するものではないが、液体状、ゲル状、粉末状、顆粒状、固形状、カプセル状、また はタブレット状等の任意の形態であってよい。
[0052] 本発明の乳糖不耐症改善剤は、適量を添加することにより、乳糖不耐症改善作用 を飲食品や医薬組成物に付与することができる。本発明の乳糖不耐症改善剤は、有 効成分としての本発明に係る乳酸菌またはその培養物、発酵物、もしくはそれらの濃 縮物等に加えて、医薬製剤上許容される担体または添加物を含有していてもよい。こ のような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲ ン、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボキシビュルポリマー、アルギン 酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、キ サンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコー ノレ、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸 、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソノレビトーノレ、カルボキシメチルセルロース、医 薬添加物として許容される界面活性剤などの他、リボゾームなどの人工細胞構造物 などが挙げられる。使用される添加物は、製剤の剤形に応じて適宜または組み合わ せて選択される。
[0053] 本発明の乳糖不耐症改善剤は、経口的または非経口的（例えば、胃内投与や腸 内投与など）に投与することができるが、特に経口的に投与することが好ましい。経口 的に投与される本発明の乳糖不耐症改善剤は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセ ノレ剤などの固形製剤、ジエル剤、あるいは液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤 等の剤形であってよい。液体製剤として用いる場合には、本発明の乳糖不耐症改善 剤を使用する際に再溶解させることを意図した乾燥物として供給してもよい。
[0054] 上記剤形のうち経口用固形製剤は、薬学上一般に使用される結合剤、賦形剤、滑 沢剤、崩壊剤、湿潤剤などの添加剤を含有してもよい。また、経口用液体製剤は、薬 学上一般に使用される安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤などの添 加剤を含有してもよい。
[0055] 本発明の乳糖不耐症改善剤の投与量は、投与対象の年齢および体重、投与経路 、投与回数により異なり、当業者の裁量によって広範囲に変更することができる。例え ば、経口的に投与する場合には、本発明の乳糖不耐症改善剤に含まれる本発明に 係る乳酸菌の投与量は、 l〜1000mg/kg/dayが適当である。本発明の乳糖不耐症改 善剤は、単回投与でもよいが、 6〜8時間の間隔で反復的に投与してもよい。
[0056] 本発明の乳糖不耐症改善剤を投与する対象は、限定するものではないが、好まし くはヒト、家畜、愛玩動物、実験 (試験)動物等を含む哺乳動物である。さらに、乳糖 不耐症であるかその疑いがある乳幼児期、成人期、高齢期の哺乳動物も本発明の 被験体として好ましぐまた加齢もしくは病気などによりラタトース分解能が低下した哺 乳動物や、乳糖不耐症の遺伝的素因または環境的素因を有する哺乳動物が、本発 明の乳糖不耐症改善剤を投与する被験体としてより好ましい。本発明の乳糖不耐症 改善剤は、副作用の心配が少ないことから、継続的に利用する上で非常に有用に用 レ、ることができる。
[0057] 3.本発明に係る乳酸菌 含有する飲食品
本発明は、上記スクリーニング方法を用いて得られる腸管付着性とラ外ース分解 酵素活性が共に顕著に増強されたラ外バチルス属乳酸菌を含有する、飲食品にも 関する。本発明の飲食品は、限定するものではないが、特に乳糖不耐症改善用の飲 食品であることが特に好適である。 「乳糖不耐症改善用」とは、乳糖不耐症を示して レ、る力、またはその疑レ、がある被験体を投与対象とし、乳糖不耐症の不快な消化器症 状 (腹痛、下痢、おなかのゴロゴロ感など）が現れる頻度を低減させる力もしくは発症 を完全に阻止すること、または乳糖不耐症の症状の重篤度を軽減することを目的とし ていることを意味する。
[0058] 本発明において「飲食品」とは、限定するものではないが、飲料、食品および機能 性食品を包含する本発明に係る乳酸菌を含有する飲食品の種類は、特に限定され ない。例えば本発明に係る乳酸菌を含む飲料として、発酵乳 (ヨーグルトなど）、乳酸 菌飲料、乳飲料 (コーヒー牛乳、フルーツ牛乳など）、お茶系飲料 (緑茶、紅茶および ウーロン茶など）、果物 ·野菜系飲料 (オレンジ、りんご、ぶどうなどの果汁や、トマト、 ニンジンなどの野菜汁を含む飲料）、アルコール性飲料 (ビール、発泡酒、ワインなど )、炭酸飲料および清涼飲料等の飲料を例示することができる。各種飲料の製造法 等については、既存の参考書、例えば「最新'ソフトドリンクス」 (2003) (株式会社光琳 )等を参考にすることができる。
[0059] 本発明に係る乳酸菌を含有する食品は、特に限定されず、生鮮食品であってもよ いしカ卩ェ食品であってもよいが、特に好適な食品として、本発明に係る乳酸菌を生き たまま腸まで届けることが可能な発酵乳や乳酸菌飲料が挙げられる。本発明に係る 乳酸菌を含有する食品は、ヨーグルトやチーズ等の乳製品'発酵乳の製造用のスタ 一ターであってもよレヽ。
[0060] また、本発明に係る乳酸菌を含有する飲食品として、機能性食品はとりわけ好まし レ、。本発明の「機能性食品」は、生体に対して一定の機能性を有する食品を意味し、 例えば、特定保健用食品（条件付きトクホ [特定保健用食品]を含む)および栄養機能 食品を含む保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サブリメ ント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセルおよび液剤などの各種剤形のもの）お よび美容食品（例えばダイエット食品）などのいわゆる健康食品全般を包含する。本 発明の機能性食品はまた、コーデックス (FAO/WHO合同食品規格委員会）の食品 規格に基づく健康強調表示（Health claim)が適用される健康食品を包含する。
[0061] 本発明の機能性食品として好ましいより具体的な例には、病者用食品、妊産婦 '授 乳婦用粉乳、乳児用調製粉乳、高齢者用食品等の特別用途食品がある。本発明に 係る乳酸菌は、温和な働きで徐々に腸内環境を改善し、腸内でのラタトース分解能 を向上させ、乳糖不耐症を改善し、その症状をも軽減することができるため、体力の 弱い乳幼児の乳糖不耐症の治療のための乳幼児用調製粉乳または液体調製乳に おける使用（例えば、通常の乳幼児用調製乳の原料に添加すればよい)や、授乳婦 用粉乳等の妊婦用または授乳婦用食品ならびに体力の低下した高齢者や病者の乳 糖不耐症の治療のための高齢者用食品および病者用食品における使用は特に好 適である。
[0062] 本発明の好適な機能性食品としては、さらに、先天的または後天的要因で乳糖不 耐症を示す被験体のための乳幼児用サプリメント、妊産婦 ·授乳婦用サプリメント、高 齢者用サプリメントおよび病者用サプリメントが挙げられる。
[0063] 本発明に係る乳酸菌を含有する機能性食品の好ましい例として、保健機能食品が 挙げられる。保健機能食品制度は、内外の動向、従来からの特定保健用食品制度と の整合性を踏まえて、通常の食品のみならず錠剤、カプセル等の形状をした食品を 対象として設けられた。この制度の下、保健機能食品は、特定保健用食品 (個別許 可型）と栄養機能食品 (規格基準型)の 2種類の類型からなる。さらに、条件付きトクホ [特定保健用食品]等の新たな類型も含まれる。
[0064] 本発明の機能性食品は、本発明に係る乳酸菌を腸内に導入し定着させ、腸内のラ 外ース分解能を (好ましくは持続的に）向上させ、その結果として乳糖不耐症を改善 する効果を有することが好ましい。本発明の機能性食品は、乳糖不耐症の改善以外 の用途を第一目的とするものでもよい。本発明の機能性食品（好ましくは、特定保健 用食品または条件付きトクホ [特定保健用食品])は、腸内のラ外ース分解能を向上 させ、それにより乳糖不耐症またはその症状を改善する効果について、記載または 表示したものであってよい。そのような記載または表示は、保健機能食品制度におい て定められた規定に基づいて表示承認されたものでありうる。例えば本発明の機能 性食品においては、「おなかの調子を整えたい方に適する」「おなかの調子を良好に 保つ」「腸内環境を整える」「牛乳に弱い方に適する」などの記載が考えられるが、こ れらに限定されない。
[0065] 本発明の機能性食品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤 、液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤、あるいはジヱル剤などの製剤の形状で あってもよいし、通常の飲食品の形状 (例えば、発酵乳、飲料、粉状茶葉、菓子など） であってもよい。
[0066] 本発明に係る乳酸菌の飲食品への配合量は特に限定されず、場合に応じて様々 であってよい。具体的な配合量は、飲食品の種類や求める味や食感を考慮して、当 業者が適宜定めることができる。しかし通常は、本発明に係る乳酸菌の総量が、 0.00 1〜100重量％、特に 0.1〜100重量％となるような配合量が適当である。
[0067] 本発明に係る乳酸菌は、当業者が利用可能である任意の適切な方法によって、飲 食品に含有させればよい。例えば、本発明に係る乳酸菌を、飲食品の原料中に直接 混合してもよい。本発明に係る乳酸菌は、飲食品に塗布、被覆、浸透または吹き付け てもよい。本発明に係る乳酸菌は、飲食品中に均一に分散させてもよいし、偏在させ てもよレ、。本発明に係る乳酸菌を入れたカプセルなどを調剤してもよい。本発明に係 る乳酸菌を、可食フィルムや食用コーティング剤などで包み込んでもよい。また本発 明に係る乳酸菌に適切な賦形剤等を加えた後、錠剤などの形状に成形してもよい。 本発明に係る乳酸菌を含有させた飲食品はさらに加工してもよぐそのような加工品 も本発明の範囲に包含される。さらに、本発明に係る乳酸菌を用いて製造した乳発 酵物を含有する飲食品は、特に好ましい。いずれにせよ、本発明の飲食品は、限定 するものではないが、本発明に係る乳酸菌を生きた状態で含有することがとりわけ好 ましい。
[0068] 本発明の飲食品の製造においては、飲食品に慣用的に使用されるような各種添加 物を使用してもよい。添加物としては、限定するものではないが、発色剤（亜硝酸ナト リウム等)、着色料 (クチナシ色素、赤 102等）、香料 (オレンジ香料等)、甘味料 (ステ ビア、アステルパーム等）、保存料 (酢酸ナトリウム、ソルビン酸等）、乳化剤（コンドロ ィチン硫酸ナトリウム、プロピレングリコール脂肪酸エステル等）、酸化防止剤（EDT Aニナトリウム、ビタミン C等）、 pH調整剤（タエン酸等）、化学調味料 (イノシン酸ナトリ ゥム等）、増粘剤 (キサンタンガム等）、膨張剤 (炭酸カルシウム等）、消泡剤（リン酸力 ルシゥム)等、結着剤 (ポリリン酸ナトリウム等）、栄養強化剤 (カルシウム強化剤、ビタ ミン A等）等が挙げられる。さらに、ォタネニンジンエキス、ェゾゥコギエキス、ユーカリ エキス、杜仲茶エキス等の機能性素材をさらに添加してもよい。
[0069] 本発明の飲食品は、本発明に係る乳酸菌を少なくとも 1つ（1菌株以上)含有する。 本発明の飲食品は、本発明に係る乳酸菌として、ラクトバチルス'ガセリ OLL2836株（ 受託番号 MTE BP-241)、ラクトバチルス'ガセリ OLL2948株（受託番号 ΝΠΈ BP-24 2)、およびラクトバチルス'ムコサェ OLL2848株（受託番号 MTE BP-243)から選択さ れる少なくとも 1つを含有することが好ましい。特に好適な実施形態では、本発明の飲 食品は、少なくとも、ラクトバチルス'ガセリ OLL2836株（受託番号 MTE BP_241)、ラ タトバチルス.ガセリ OLL2948株（受託番号 MTE BP-242)、およびラクトバチルス-ム コサェ OLL2848株（受託番号 ΝΠΈ BP-243)の 3つの乳酸菌をいずれも含有する。こ の 3つの乳酸菌を組み合わせて含有する飲食品は、 A型、 B型、〇型のいずれの血 液型抗原を有する腸管ムチンにも結合できるため、広範な被験体に対して有効であ る。
[0070] 本発明の飲食品を摂取または投与する被験体は、限定するものではないが、好ま しくは、ヒト、家畜（ブタ、ゥマなど）、愛玩動物 (ィヌ、ネコなど）、実験 (試験)動物（マ ウス、ラットなどの齧歯動物やゥサギなど）を含む哺乳動物である。さらに、乳糖不耐 症であるかその疑いがある乳幼児期、成人期、高齢期の哺乳動物も本発明の被験 体として好ましぐまた加齢もしくは病気などによりラタトース分解能が低下した哺乳動 物や、乳糖不耐症の遺伝的素因または環境的素因を有する哺乳動物も、本発明の 飲食品を摂取または投与する被験体として好ましい。
実施例
[0071] 以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的 範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
[0072] [実施例 1]供試乳酸菌の培養および調製
以下で用いる供試乳酸菌としては、明治乳業株式会社から提供を受けたヒト由来 乳酸菌株、米国 American Type Culture Collection (ATCC)、理化学研究所微生物 系統保存施設（JCM)、農林水産省畜産試験場（NIAI)、および英国 National Collecti ons of Food Bacteria (NCFB)より入手した乳酸菌株、ならびに本発明者らにより幼児 糞便より変法 LBSァガーを用いて分離した乳酸菌株の合計 104株を使用した。これら 供試乳酸菌には、ラクトバチルス 'ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus)、ラタトバチ ノレス 'ァシドフイノレス (Lactobacillus acidophilus)、ラクトコッカス'ラクテイス (Lactococc us lactis)、ラクトバチルス'ガセリ（Lactobacillus gasseri)、ラタトバチルス 'クリスパタス (Lactobacillus crispatus)、フクトノ チノレス *ジヨンソニ1 ~~ (Lactobacillus johnsonii)、お よびラクトバチルス'ムコサェ（Lactobacillus mucosae)に属する様々な菌株の他、菌 種未同定の株が含まれていた。なお、菌株名に OLLまたは MEPと記載された菌株は 、明治乳業株式会社保有菌株を示す。
[0073] 各供試乳酸菌の菌体を、滅菌した 10% (w/v)スキムミルク培地（雪印乳業株式会社 、札幌）中に分散し、使用するまでディープフリーザー中で _80°C下に保存した。
[0074] 培養にぉレ、ては、各菌株は、 MRS培地（Difco、 Detroit, MI, USA)で 3回、継代培養
(37°C、 24時間）した後、 MRSL培地（2%グルコースをラタトースに置換した MRS培地） で 2回継代培養（37°C、 24時間）した。次いで、得られた菌体培養液を新たに調製し た MRSL培地に 1%接種し、その後 37°Cで 18時間培養した。こうして調製した本培養 液を遠心分離 (6,000 X g、 20分間、 4°C)して集菌した菌体を、 0.05Mリン酸緩衝液 (p H6.8)で洗浄後、蒸留水に懸濁し、その後凍結乾燥を行った。
[0075] [実施例 2]腸管付着性株の選抜
上記の供試乳酸菌株の中から、本発明者らによって開発された腸管ムチンへの結 合能を調べるアツセィ系を用いて、腸管付着性の高い (RU値力 S100以上)菌株を選抜 した。使用したアツセィ系については国際出願 WO2006/067940にも詳細に記載され ている。
[0076] 具体的には、ヒト A型腸管ムチン、ヒト B型腸管ムチン、ヒト O型腸管ムチンのそれぞ れに対する乳酸菌の結合能を、バイオセンサー BIACORE1000 (BIACORE社）を用い て表面プラズモン共鳴スペクトル解析を行うことにより、測定した。
[0077] 1.アナライト 液の調製
まず各菌株を、起菌後、 MRS培地にて 3回継代し、 37°Cで 12時間培養した後、 1.5ml 容チューブに 500 μ ΐ分注した。この培養液を遠心分離（6,000卬 m、 4°C、 10分）し、上 清を除去して得た菌体を PBSバッファー（pH7.2)中で 2回洗浄後、蒸留水に懸濁し、 凍結乾燥した。本菌体を HBS- EPバッファー（0.01M HEPES (pH7.4)、 0.15M NaCl、 3 mM EDTA、 0.005% Surfactant P20)を用いて 0.1mg/ml濃度に調製し、アナライト溶 液とした。 [0078] 2.ヒト腸管ムチン（HCM)の調製および HCM固定化センサーチップの作製
ヒト腸管ムチンの調製およびセンサーチップへの固定化を行った。ヒト A型腸管（血 液型 A型のヒト由来の大腸）、ヒト B型腸管（血液型 B型のヒト由来の大腸）、およびヒト O型腸管 (血液型〇型のヒト由来の大腸)は、東北大学大学院医学系研究科より、標 本採取試料として分譲を受けた。なお、この試料採取は、東北大学大学院医学系研 究科の倫理委員会を経て実施し、また患者の同意を得て行われたものである。それ ら腸管の大腸正常部位から、粘液ムチン層を表層搔き取り法で採取した。粘液ムチ ン層は、 Folch溶媒（クロ口ホルム-メタノール混液（2: l (v/v) ) ; J. Folch et al.，： J. Biol. Chem. (1957) 226, p.497- 500)およびジェチルエーテルにより脱脂後乾燥させ、 4M 塩酸グァニジン溶液により 37°Cで 2時間抽出した。次いで、この抽出物についてゲル ろ過により精製を行った。ゲルろ過精製法は、 Purushothaman S. S. et al, "Adherenc e of Shigella dysenteriae 1 to Human Colonic Mucin. し urr. MiorobioL , 42(6), p.381 -387 (2001)に記載されたヒト大腸ムチンの精製方法に基づき実施した。移動層は 4M 塩酸グァニジン溶液、ゲルろ過クロマトグラフィー用のカラムは Toyopearl HW_65F (9 0cm X 2.6cm, Tosoh. Tokyo. Japan)を用いた。得られたカラム抽出液について、中性 糖をフエノール硫酸法（反応後に 490nmの吸光度を測定する）で、タンパク質を 280η mの吸光度を測定し、その結果、タンパク質吸収（280nmの吸光度）があり、かつ中性 糖含量の最も高いピークを選択し、さらにゲルろ過クロマトグラフィーにおける分子量 約 200万以上を目安として大腸ムチン画分を分取した。こうして得られた精製物を、由 来するヒトの血液型に対応して、それぞれヒト A型腸管ムチン、ヒト B型腸管ムチン、ヒ ト〇型腸管ムチンとした。以下、それらのヒト腸管ムチン（human colon mucin : HCM)の うち、 A型腸管ムチンを A- HCM、 B型腸管ムチンを B-HCM、 O型腸管ムチンを〇_HC Mと呼ぶことがある。得られた各 HCMについては、それぞれの血液型のヒト血液型基 質抗原性を抗原抗体反応により確認した。
[0079] 以上のようにして得られた各 HCMの BIACORE用センサーチップへの固定化は、ノ ィォセンサー BIACORE1000 (BIACORE社）において、ァミンカップリング法により行つ た。まず、予めカルボキシメチルデキストラン基を導入したセンサーチップ CM5 (BIAC ORE社）に対して、 75.0mg/mlの N-ェチル _N'-(3 -ジメチルァミノプロピル-カルボジィ ミド塩酸塩（EDC) 50 μ 1および 11.5mg/mlの Ν-ヒドロキシスクシンイミド（NHS) 50 μ 1を 混合した混合試薬（EDC/NHS)を流し、カルボキシメチルデキストラン中のカルボキ シル基を活性化させた。次いで、 120 /i lの固定化用酢酸バッファー（10mM、 ρΗ4.0) に、上記で精製されたいずれかの HCM溶液（A_HCM、 B-HCM、 O-HCM)を 30 μ 1カロ えた混合溶液を調製して流し、ァミン'カップリング反応により HCMをセンサーチップ 上のカルボキシル基に共有結合させた。さらに、 1Mエタノールァミン塩酸塩 _Na〇H ( PH8.5)を用いて、プローブが結合していないセンサーチップ上の部位の残存活性基 のブロッキングを行った。ランニングバッファ一としては HBS-EPバッファーを用いた。
EDC/NHS導入前とエタノールァミン溶液添加後のレポートポイントの差として示され る HCM固定化量は、 1000〜2000 RUとした。こうして得られた HCM固定化センサーチ ップを、次に、上記アナライト溶液の試験に用いた。
[0080] 3.表面プラズモン共鳴スペクトル解析
バイオセンサー BIACORE1000 (BIACORE社）をさらに用いて、各 HCM固定化セン サーチップ上の HCMと、上記アナライト溶液中の乳酸菌菌体との結合量を解析した。 この解析に使用した BIACORE1000の測定条件を下記に示す。
[0081] ランニング緩衝液： HBS-EPバッファー（pH7.4)
アナライト溶液（サンプル）の添加量: 20 μ 1
流速： 3 μ 1/分
反応温度： 25°C
再生溶液： 1Mグァニジン塩酸塩溶液 5 μ 1
BIOACOREシステムによる解析においては、アナライトとプローブとの結合量（相互 作用）は、レゾナンスユニット（RU)を単位とした値で表される。 1レゾナンスユニット（R U)とは、センサーチップの表面上 lmm2当たりに物質 lpgが結合したことを意味する。 すなわち、この解析で得られた結合/解離曲線に基づき、結合後の RU値から結合 前の RU値を差し引いた値が、アナライトである各乳酸菌とプローブである各腸管ムチ ンとの lmm2当たりの結合量に相当する。この結合量は、その乳酸菌と各腸管ムチンと の結合能に相当する。
[0082] この解析の結果、少なくとも 1つの腸管ムチンに対する結合能として 100 RU以上の 値を示した菌株を、供試乳酸菌 104株の中から選抜した。選抜された菌株では、腸管 付着性が他の平均的な乳酸菌株よりも増強されている (腸管付着性が高い）と言える 。選抜された菌株の代表例およびその解析結果を、図：!〜 3に示す。
[0083] [実施例 3] P_ j3 _glc活性の測定に用いる ONPG1C-6Pの合成および精製
以下では、腸管付着性が高ぐかつ高レ、ラ外ース分解酵素活性をも有する菌株を さらに選抜することを試みた。そこで本実施例では、まず、その活性測定に用いる〇N PGlc-6Pの調製を行つた。
[0084] 1.〇NPGlc_6Pの化学合成
フォスフォ- /3 -ダルコシダーゼ（P- β -glc)活性の測定に用いる 0-ニトロフエニル- /3 -D—クノレコヒフノシト -6-ホスフェート (o-Nitrophenyl— β -D-glucopyranoside 6-phosp hate ; ONPGlc - 6P)は、 Hengstenbergと Morseの合成方法 (Hengstenberg, W. and M. L.Morse、 Synthesis of o-Nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside 6-phosphate, Carb ohydr. Res, 10、 pp.463-465 (1969) )の改良法に従って化学合成した。具体的には 、まず、 0-ニトロフエニル - j3 - D -ダルコビラノシド（ONPGlcゝ Sigma, St. Louis, USA) の 0.9gを、予め氷上で冷却してから混合した 54 μ 1蒸留水と 840 μ 1のォキシ塩化リンを 含むリン酸トリメチル 7.5mlに溶解した。次レ、で本混合液を氷上で 5時間撹拌しながら 反応させた。反応後、氷片（蒸留水）を加え、濃アンモニア水を滴下しながら pHメータ 一を用いて溶液を中和（PH7.0)し、反応を停止させた。
[0085] 2. ONPGlc- 6Pの精製
上記で反応を停止させた溶液について、ロータリーエバポレーター（東京理科機械 、東京）を用いて 40°Cでの濃縮乾固を繰り返すことにより、反応で生じた 0-ニトロフエ ニル (ONP)を除去した。次いで、濃縮した反応液を活性炭（50g)と混合し、 4°C下で 2 時間静置することにより、化学合成された ONPGlc_6Pおよび未反応の ONPGlcを活性 炭に吸着させた後、それを 20倍量の蒸留水（2L)で洗浄し、脱塩を行った。活性炭に 吸着した〇NPGlc_6Pの溶出は、ピリジン：水：エタノール混液（1 : 1 : 1 (v/v)、 600ml) を用いて行った。溶出液は 40°C下でのロータリーエバポレーターで濃縮を繰り返し、 ピリジンの除去を行った。続いて、調製ペーパークロマトグラフィー（PPC)に供した。 すなわち、 PPC用濾紙（Whatman, 3MM、 46 X 57cm, Maidstone, England)上に、 100 β 1マイクロピペットを用いて上記の粗精製 ONPGlc-6Pを直線状に塗布し、展開溶媒 としてブタノール：ピリジン：水（6 :4: 3 (ν/ν/ν))を用いて上昇法で単展開させた。 2日間 を要する展開終了後、ドラフトチャンバ一内でその濾紙を乾燥させてから、 UVトランス イルミネーター（302nm、フナコシ、東京）を用いて ONPGlc- 6Pおよび ONPGlcのバン ドを確認し、 ONPGlc_6Pのバンドのみを切り出した。切り出した濾紙を蒸留水に浸し、 ー晚、 4°Cで撹拌することで、 ONPG1C-6Pの抽出を行った。抽出後、濾紙を除去し、 水層をロータリーエバポレーターで濃縮した後、混在している反応副産物を、蒸留水 を移動相とする TOYOPEARL HW40Sカラム（2· 6 φ X 90cm、東ソ一、東京）を用いた ゲルろ過により除去した。ゲルろ過後、各溶出画分を薄層クロマトグラフィー（TLC、 Si licagel 60、 10 X 10cm, Merck, Darmstadt, Germany)を用いて ONPGlc- 6P画分を回 収した。 TLCの展開溶媒には、ブタノール：2—プロパノール：水（3 : 12 : 4 (v/v/v) )を 用いて単展開した。風乾後、 5 % (v/v)硫酸-メタノール溶液を薄層板に均等に噴霧 し、 150°Cに加温した乾燥器 (Yamato、東京）内で 3分間加熱して検出した。回収した ONPGlc-6P画分の凍結乾燥を行い、精製 ONPGlc-6Pとした。この精製品については 、 TLCにより純度を確認し、 ^-NMRにより構造の確認を行った。
[実施例 4] β -gal、 Ρ- β -galおよび Ρ_ β -glc活性の測定
実施例 1で調製した供試乳酸菌 104株について、 Fisher法を用いて、 -gal、 P - β - galおよび P_ i3 -glcのラタターゼ活性の測定を行った。すなわち、各菌株について、 凍結乾燥菌体 0.5mgを 0.05Mリン酸緩衝液（pH6.8) 1.0mlに懸濁し、トルエン-アセトン 混液（1 :9 (v/v) ) 50 β 1をカ卩えて 3分間激しく撹拌した。この懸濁液 25 μ 1に、 0-ニトロフ ェニル- β -D-ガラクトピラノシド（ONPGal)、 0-ニトロフエニル- β -D-ガラクトピラノシド -6-ホスフェート（ONPGa卜 6Ρ)または上記で調製した o_ニトロフエニル- β - D -ダルコ ピラノシド -6-ホスフェート（ONPGlc-6P)を含む 0.05Μリン酸緩衝液（ρΗ6.8) 100 μ 1を カロえて、 37°Cで 15分間反応させた。反応後、 0.5M炭酸ナトリウム溶液 125 μ ΐをカロえ て反応を停止させ、遠心分離 (6, 000 X rpm、 10分間、 4°C)により菌体成分を除去し、 上清の 405nmにおける吸光度を Multiskan MS_UV (Labsystems、 Helsinki, Finland)を 用いて測定した。 1分間に遊離する 0-ニトロフエノール（ONP) 1 μ molを 1ユニットとして 定義し、該ユニットを単位として、菌体 lmg当たりの活性値および培養上清に含まれ るタンパク質 lmg当たりの活性値をそれぞれ算出した。
[0087] なお、タンパク質の定量には、 BCA法に基づく Micro BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, Illinois, U.S.A)を用い、 2時間反応後、 540nmでの吸光度を M ultiskan MS-UVを用いて測定した。検量線はゥシ血清アルブミン（BSA)を用いて作 成し、そこからタンパク質の量を算出した。図:!〜 3には、実施例 2で選抜された菌株 の代表例についてのラタターゼ活性測定の結果を示している。
[0088] [実施例 5]乳酸菌株の選抜
上記実施例にぉレ、て示された腸管付着性および β -gal, Ρ- β -galおよび Ρ- β -glc 活性の測定結果に基づき、腸管付着性が高ぐかつラタターゼ活性も高い乳酸菌株 の選抜を行った。その結果、腸管付着性が高ぐかつ β _gal、 Ρ- β -galおよび Ρ_ β _g lcのうちいずれかのラタターゼ活性について顕著に高い活性を示す菌株として 3つの 乳酸菌株（OLL2836株、 OLL2948株、および OLL2848株）が選抜された（図 1〜3)。 一方で、ラタターゼ活性が比較的高い乳酸菌株の多くは、腸管付着性が低い (A型、 B型、 O型のいずれのヒト腸管ムチンに対しても RU値が 100 RU未満）ために排除され る結果となった。
[0089] 図：!〜 3に示す通り、 OLL2836株は 46.576ユニット/ mgタンパク質の P- β -gal活性を 示し、 0しし2948株は50.194ユニット/ mgタンパク質の P- -glc活性を示し、 OLL2848 株は 107.090ユニット /mgタンパク質の β -gal活性を示した力 これらの活性値は、腸 管付着性が高い他の乳酸菌株と比較してもそれぞれかなり高い値であった。しかもこ れらの菌株は、腸管付着性を示す RU値についても、かなり高い値を示した。具体的 には、 OLL2836株はヒト B型腸管ムチンおよびヒト O型腸管ムチンに対してとりわけ強 レ、結合能を示し、 OLL2948株および OLL2848株はヒト A型腸管ムチンに対して特に 強い結合能を示した。
[0090] 以上の結果から、これらの乳酸菌株について、それぞれ単独で、腸管内に定着し て持続的にラタトースを分解する効果が期待できることに加え、当該 3菌株を組み合 わせて用いることにより、レ、ずれの血液型の被験体にぉレ、ても高レ、ラタトース分解効 果を得られるであろうことが示された。
[0091] OLL2836株、 OLL2948株および OLL2848株については、さらに菌種同定試験を行 レヽ、 OLL2836株および OLL2948株がラクトバチルス'ガセリ（Lactobacillus gasseri)、 OLL2848株がラクトバチルス'ムコサェ（Lactobacillus mucosae)に属する菌として、そ れぞれ同定した（後述の実施例を参照）。この 3つの乳酸菌株については、独立行政 法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター (日本国千葉県木更津巿か ずさ鎌足 2— 5— 8)に、 2006年 6月 9日（原寄託日）付で寄託申請がなされ、受託さ れた。この寄託申請に係る受領番号は、 OLL2836株が NITE AP_241、 OLL2948株が NITE AP-242, OLL2848株が NITE AP-243であり、また寄託番号はそれぞれ NITE P -241、 NITE P-242, NITE P-243である。これらの寄託菌株は、 2007年 3月 27日付 けでブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）に移管され、 2006年 6月 9日を原寄託 日として受託された。それら国際寄託番号は、 OLL2836株が NITE BP_241、 OLL294 8株が NITE BP_242、 OLL2848株力 SNITE BP-243である。これら菌株の菌類学的性 質は、上述の表 1の通りであることが確認された。
[0092] 以上のように、本発明のスクリーニング方法を用いることにより、腸管付着性が高ぐ かつラタターゼ活性も高い乳酸菌株を取得できることが示された。さらに、 iS -gal P- β -galおよび Ρ- β _glcについてラタターゼ活性を測定し、その 3種のラタトース分解酵 素のそれぞれについて顕著に高い活性を示した菌株を選抜し、得られた菌株を組み 合わせることにより、広範な被験者に適用できる非常に有用な乳酸菌の組み合わせ も取得することができた。本発明の方法で得られる乳酸菌株は、腸管内に定着して持 続的にラタトースを低減することができる有用なプロバイオティック乳酸菌株として乳 糖不耐症の改善に効果的に使用できると考えられる。
[0093] [実施例 6]菌種同定
実施例 5で選抜された 3つの乳酸菌株 OLL2836株、 OLL2948株および OLL2848株 について、菌種の同定を行った。同定は、 V3領域の増幅 ·配列決定に基づく 16S rD NA塩基配列解析によって行った。以下では OLL2848株および OLL2948株で行った 同定試験を例として記載するが、 OLL2836株についても基本的に同様にして同定が なされた。
[0094] 1.ダイレクト PCR法による潠抜株の 16S rDNA断片の検出
◦LL2848株および OLL2948株を、 MRS培地で上述の通り継代培養した後、ダイレク ト PCRを行った。 0.6ml容マイクロチューブにミリ Q水を 4 /i lずつ分注し、これに、滅菌 楊枝を用いて搔き取った菌体をそれぞれ懸濁した。この懸濁液に、 Taq DNAポリメラ ーゼ（TaKaRa、京都）、 10 X PCRバッファー、 dNTP Mix (TaKaRa,京都）、一組のプラ イマ一を加えて PCR反応液とした。一組のプライマーとしては、ユニバーサルプライマ 一 27F (5，-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、配列番号 1)、および 518R (5，_ATTAC CGCGGCTGCTGG-3'、配列番号 2)を用いた。 PCR条件は、〔95°C 10分間、 55°C3分 間、 72°C 1分間〕を 1サイクル、 〔95°C30秒間、 55°C30秒間、 72°C30秒間〕を 39サイクル 、および〔72°C 1分間〕 1サイクルとして、行った。
[0095] 2.ァガロースゲル雷気泳動
以上の PCR反応により増幅した DNA断片を、次に電気泳動にかけた。電気泳動は 、泳動ゲルに 2%ァガロースゲルを、泳動バッファーには 1 X TBEバッファー（90mM T ris-ホウ酸、 2mM EDTA、 pH8.0)を用レ、、 100Vの定電圧下で行った。泳動装置は、 M upid-2 (コスモバイオ、東京）を用いた。分子量マーカーは、 100b DNAラダー（TaKaR a、京都）を用いた。泳動後のゲルの染色は、ェチジゥムブロマイド（EB)溶液（0.5 Ai g /ml)に 10分間浸すことにより行った。
[0096] 3.ァガロースゲルからの DNA柚出
ァガロースゲル電気泳動および染色後のゲルに、 UVトランスイルミネーター TRANS ILLMINATOR TM-20 (フナコシ薬品株式会社、東京）で UVを照射し、 目的の DNA断 片を確認して、切り出した。 DNA断片精製キット MagExtractor (TOYOBO、大阪）によ り DNAを抽出した。すなわち、切り出したァガロースゲルを 1.5ml容チューブに移した 後、 400 / lの吸着液をカ卩え、 55°Cに加温して完全に溶解させた。次いで、その反応 液に 15 μ 1の磁性ビーズをカ卩えて撹拌した後、 1分間室温で放置した。遠心分離 (6，0 00卬 m、 5秒間、 4°C)した後、上清を除去し、 500 μ 1の洗浄液をカ卩ぇ撹拌した。再び 遠心分離（6,000卬 m、 5秒間、 4°C)した後、 1mlの 75%エタノールをカ卩ぇ撹拌して、遠 心分離（15，000rpm、 1分間、 4°C)した後、上清を除去した。 15 μ 1の蒸留水を力卩ぇ撹 拌した後、遠心分離（15,000 rpm、 1分間、 4°C)により回収した上清を精製 DNA溶液 とした。
[0097] 4. DNA配列の決定および相同性解析 精製した DNAについて、プライマー 27F(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，、配 列番号 3)を用い、塩基配列決定を行った。塩基配列決定はオペロン'バイオテクノロ ジー株式会社にて行った。こうして OLL2848株について決定された 16S rDNAの V3領 域の塩基配列を配列番号 4として、 OLL2948株について決定された 16S rDNAの V3 領域の塩基配列を配列番号 5として示した。これらの塩基配列について、 日本 DNA データバンク（DDBJ)のウェブ上でプログラム BLASTNにより相同性解析を行った。
[0098] その結果、 OLL2848株の V3領域の塩基配列は、ラクトバチルス.ムコサェ（Lactoba cillus mucosae)の V3領域の配列との間で 99.6%の相同性を示した。一方、 OLL2948 株の V3領域の塩基配列は、ラクトバチルス'ガセリ（Lactobacillus gasseri)の V3領域 の配列との間で 99.2%の相同性を示した。このこと力ら、 OLL2848株はラクトバチルス •ムコサェ、 OLL2948株はラクトバチルス ·ガセリにそれぞれ属する乳酸菌として同定 された。
産業上の利用可能性
[0099] 本発明の方法は、乳糖不耐症の改善に有用な乳酸菌株を効率よく選抜するために 用いることができる。本発明の方法により得られる乳酸菌株は、患者に簡便に投与で き、かつ乳糖不耐症を持続的に改善できる薬剤や機能性食品等の有効成分として 有利に使用することができる。
配列表フリーテキスト
[0100] 配列番号 1〜3の配列はプライマーである。
[0101] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願の全体を参照により本明 細書に取り入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[1] ラ外バチルス属乳酸菌力も腸管付着性およびラ外ース分解酵素活性が共に増強 された菌を選抜することを特徴とする、乳糖不耐症の改善能を有する乳酸菌をスクリ 一ユングする方法。
[2] ヒト A型腸管ムチン、ヒト B型腸管ムチン、およびヒト〇型腸管ムチンのうち少なくとも
1つに対する乳酸菌の結合能を表面プラズモン共鳴解析を用いて測定し、その結合 能を示す RU値が 100 RU以上である菌を腸管付着性が増強された菌として選抜する
、請求項 1に記載の方法。
[3] ラタトース分解酵素活性が、 β -ガラタトシダーゼ、フォスフォ- β -ガラタトシダーゼ、 およびフォスフォ- β -ダルコシダーゼのうち少なくとも 1つのラタターゼ活性である、請 求項 1または 2に記載の方法。
[4] ラクトバチルス属乳酸菌力 ラクトバチルス'ガセリ（Lactobacillus gasseri)、またはラ タトバチルス'ムコサェ（Lactobacillus mucosae)である、請求項 1〜3のいずれか 1項 に記載の方法。
[5] 請求項 1〜4のいずれ力 1項に記載の方法により得られる、腸管付着性およびラ外 ース分解酵素活性が共に増強された乳酸菌。
[6] ラクトバチルス'ガセリ OLL2836株（受託番号 ΝΠΈ BP-241)、ラクトバチルス'ガセリ
◦LL2948株（受託番号 NITE BP-242)、およびラクトバチルス'ムコサェ OLL2848株 (受託番号 NITE BP-243)のうちのいずれかである乳酸菌。
[7] 請求項 5または 6に記載の乳酸菌を少なくとも 1つ含有する乳糖不耐症改善剤。
[8] ラクトバチルス'ガセリ OLL2836株（受託番号 NITE BP-241)、ラクトバチルス'ガセリ
◦LL2948株（受託番号 NITE BP-242)、およびラクトバチルス'ムコサェ OLL2848株 (受託番号 NITE BP-243)の 3つの乳酸菌を少なくとも含有する、請求項 7に記載の乳 糖不耐症改善剤。
[9] 請求項 5または 6に記載の乳酸菌を少なくとも 1つ含有する飲食品。
[10] ラクトバチルス'ガセリ OLL2836株（受託番号 ΝΠΈ BP-241)、ラクトバチルス'ガセリ
OLL2948株（受託番号 NITE BP-242)、およびラクトバチルス 'ムコサェ OLL2848株 (受託番号 NITE BP-243)の 3つの乳酸菌を少なくとも含有する、請求項 9に記載の飲 乳児用食品、幼児用食品、授乳婦用食品、高齢者用食品、病者用食品、保健機 能食品、サプリメント、発酵乳および乳酸菌飲料力 なる群から選択される、請求項 9 または 10に記載の飲食品。
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