WO2008000770A1 - Beheizbare reaktionskammer zum prozessieren eines biochips und verfahren zum ansteuern einer solchen reaktionskammer - Google Patents

Beheizbare reaktionskammer zum prozessieren eines biochips und verfahren zum ansteuern einer solchen reaktionskammer Download PDF

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measuring
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Jana Lepschi
Jens GÖHRING
Stefan Heydenhaus
Manuel Ullrich
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Zenteris Gmbh
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Definitions

  • the invention relates to a heatable reaction chamber for processing a biochip and a method for driving such a reaction chamber.
  • a biochip has a generally planar substrate with different capture molecules, which are arranged on predetermined on the surface of the substrate points, the spots.
  • a labeled with a marker substance reacts with certain catcher molecules according to the key-lock principle.
  • the capture molecules are DNA sequences (see, e.g., EP 373 203 B1) or proteins.
  • Such biochips are also called arrays or DNA arrays.
  • the labels are often fluorescent markers.
  • An optical reader captures the fluorescence intensity of the individual spots. This intensity correlates with the number of labeled probe molecules immobilized with the capture molecules.
  • WO 2005/108604 A2 discloses a heatable reaction chamber for processing a biochip.
  • This reaction chamber has an elastic membrane.
  • a silicon biochip is arranged on the membrane.
  • a nickel-chromium thin-film conductor is provided.
  • Such nickel-chromium thin-film conductor tracks have a high electrical resistance and a correspondingly high heating power.
  • an additional trace for temperature measurement is provided.
  • a housing wall is designed as a membrane so that the biochip 6 can be pressed against a cover glass 23 lying opposite the membrane 13 by means of a plunger 12.
  • a reaction liquid 26 located in the reaction chamber is displaced from the surface of the biochip and does not interfere with the optical detection.
  • a seal 22 is arranged between the membrane 13 and the cover glass 23.
  • the sample liquid 26 is filled by means of a filling cannula 19, which is pushed through the seal 22.
  • WO 01/02 094 A1 describes means for applying temperature to biochips, which comprise microstructured resistance heating lines.
  • US Pat. Nos. 5,759,846 and 6,130,056 each describe a reaction chamber for receiving biological tissues.
  • the reaction chamber is a flexible circuit board with electrodes. By compressing the biological tissue and the flexible printed circuit board, an electrical contact between the biological tissue and the electrodes of the flexible printed circuit board can be produced so that an electrical tap can be made directly on the biological tissue.
  • the invention is based on the object to provide a simple, inexpensive heatable reaction chamber for processing a biochip, which can be heated on the one hand very efficiently and on the other hand, the known from WO 2005/108604 A2 tappets is possible. Furthermore, the invention is based on the object to provide a method for driving such a reaction chamber.
  • the object is achieved by a heatable reaction chamber having the features of claim 1 and by a method having the features of claim 21.
  • Advantageous embodiments of the invention are specified in the respective subclaims.
  • the heatable reaction chamber according to the invention for processing a biochip has a chamber wall formed from a flexible printed circuit board. On the flexible printed circuit board serving as a heating conductor is formed, which is hereinafter referred to as a heating conductor.
  • the flexible circuit board serves as a flexible membrane on the one hand, which can be actuated by a plunger to press on a biochip arranged thereon against an opposite window of the reaction chamber.
  • the flexible circuit board also serves as a heater, since a Walkerstrom can be passed through the heating conductor located thereon, which generates heat, which is delivered to the reaction chamber.
  • the heating conductor is meander-shaped, so that it covers a predetermined area evenly, wherein the conductor has a constant thickness and width over its entire length.
  • the Schuleiterbahn can also run with the shape of a double spiral. It is advantageous that the conductor is formed without crossing so that it can be made of a copper layer.
  • the flexible printed circuit board combines two functions (elastic membrane, heating device), a component can be dispensed with in comparison to conventional heatable reaction chambers for processing a biochip. This leads to a substantial reduction of the heat capacity in the region of the chamber wall at which the heating device is provided. As a result, the heat transfer to the biochip is much more efficient than is the case with known heatable reaction chambers. It should be noted in particular that flexible printed circuit boards are basically very thin and even have only a small heat capacity.
  • the heatable reaction chamber has a measuring and control device, which is designed such that the one heating conductor of the flexible printed circuit board is used both for heating and for measuring the temperature. This makes it possible, in the region in which the biochip is arranged in the reaction chamber on the flexible printed circuit board, to uniformly lay the conductor track in meandering loops, so that the biochip is heated uniformly over its entire surface.
  • the measuring device has two preferably identical measuring channels, which are provided for measuring the current or the voltage at the conductor track serving as a heating device. Since both the current and the voltage on the heating trace are measured, the heating trace can be used simultaneously for measuring also be used for heating, since the current can be varied according to the required heating power.
  • the serving as a heating heater trace on the flexible circuit board is formed with a resistance of about 5 to 10 ohms at room temperature.
  • the heating conductor on the flexible printed circuit board is preferably made of copper, since the copper interconnects can be produced cost-effectively and else very precisely.
  • the heating conductor made of copper preferably has at least a purity of 99%, since the temperature coefficient of pure copper in the temperature range relevant here is very constant.
  • the measurement of the voltage on the conductor track serving as a heating device is preferably carried out by means of a four-point measurement.
  • the flexible circuit board may be formed with two conductive layers, wherein the one conductive layer is formed as a conductor, which serves as a heater and the other conductive layer with a flat, the entire heated area covering the conductive layer, in particular copper layer is formed, so that the generated heat is distributed quickly and evenly over the entire surface to be heated.
  • the heating conductor track of the flexible printed circuit board is supplied with a heating / measuring current both for heating the reaction chamber and for measuring the temperature.
  • the temperature measurement is carried out with a sampling rate of at least 1000 Hz or about 3000 Hz. This allows a very accurate setting of a time-varying temperature profile possible.
  • the method for regulating the temperature of the reaction chamber is designed such that within a temperature interval about a setpoint temperature a PI controller and outside this interval a P controller is used. As a result, an overshoot of the temperature is avoided and yet quickly and precisely set the target temperature.
  • FIG. 1 shows a base body of a cartridge according to the invention in a view from below
  • reaction fields spots
  • biochip with optically impermeable and non-fluorescent back
  • FIG. 3 shows an embodiment of a flexible printed circuit board according to the invention with internal heating / measuring structure and integrated EEPROM,
  • Fig. 4 shows a first embodiment of an applied to a base body
  • FIG. 5 shows a second embodiment of an applied to a base body
  • FIG. 6 shows an embodiment of the inventive arrangement of the inlay with the associated optical module
  • FIG. 7 shows an exemplary embodiment of the arrangement according to the invention, equipped with a transparent panel in a non-transparent base body
  • FIG. 8 shows an exemplary embodiment of the cartridge according to the invention, FIG. equipped with a non-transparent panel on a transparent base
  • FIG. 10 shows the process principle of filling a sample liquid through cannulas in the reaction chamber according to the prior art, Fig. 1 1, the principle of the method of displacement of the supernatant by means of
  • FIG. 12 shows a cartridge with inlay and a flex circuit board stabilizing disk
  • FIG. 13 shows a preferred embodiment of a layout of the flex circuit board
  • FIG. 14 shows measuring and heating electronics in a schematically simplified circuit diagram
  • FIG. 15 shows a control method in a flow chart .
  • FIG. 16 shows a cooling device in a schematically simplified representation
  • FIG. 17 shows a first exemplary embodiment of the cooling device in a schematically simplified sectional view
  • FIG. 19 shows an alternative heating / cooling device for heating and cooling the reaction chamber
  • FIG. 20 shows a modification of the heating / cooling device of FIG. 19. embodiment
  • a cartridge with a biochip will be described with reference to FIGS. 1-9 and 12.
  • a basic body 1 produced, for example, by means of plastic injection molding contains on the underside a recess for a filling channel 7 which leads from a filling opening 9 to a reaction chamber 5 (FIGS. 1, 6) and recesses for the reaction chamber 5, a compensation channel 4 between the Reaction chamber 5 and a compensation chamber 2 and a recess for the compensation chamber 2.
  • the filling opening 9 is formed with a conically tapered portion (Fig. 6), which facilitates the insertion of a pipette tip.
  • a check valve 8 is arranged in the filling opening.
  • a viewing window 3 can be detected by the, whether in the compensation channel 4 is a sample liquid.
  • the main body 1 is transparent and thus forms a detection window 14 through which a biochip 6 arranged underneath can be detected.
  • the connecting channels are as short as possible and formed with the smallest possible cross section, so that the dead volume is small and the necessary excess of sample liquid is kept low.
  • a flexible printed circuit board 10 On the underside of the main body 1 is a flexible printed circuit board 10, which is referred to below as the flex circuit board 10 (FIG. 3).
  • the flex circuit board 10 is connected to the underside of the main body 1 such that the recesses 7, 5, 4, 3, 2 are limited to the bottom and form a continuous communicating, self-contained fluid channel.
  • the flex circuit board 10 includes pads 10.1, a digital storage medium 10.2 (e.g., an EEPROM), and an internal heating / measurement structure 10.3 ( Figure 3).
  • a digital storage medium 10.2 e.g., an EEPROM
  • an internal heating / measurement structure 10.3 Figure 3
  • the reaction chamber 5 there is a biochip 6 (FIG. 2) which has a number of MN reaction fields 6.1.
  • the biochip 6 on the back is optically opaque and non-fluorescent, eg with black chrome. stratifies 6.2.
  • the flex circuit board 10 forms a boundary wall of the reaction chamber 5.
  • the biochip 6 is fixed on the flex circuit board 10 and then the flex circuit board 10 is connected to the base body 1.
  • the connection between the flex circuit board 10 and the biochip 6 is made with an adhesive bonding layer 17, e.g. a suitable adhesive tape (suitable for biological reactions) or with a silicone adhesive.
  • a durable, temperature and water-resistant compound can, for. using biocompatible adhesive tape, silicone adhesive, laser welding, ultrasonic welding or other biocompatible adhesives.
  • a second possibility of the connection of flexible printed circuit board 10, biochip 6 and base body 1 consists in the targeted surface bonding of the biochip 6 with the flex circuit board 10 (adhesive only under the biochip) and the subsequent fixation of the base body 1 only outside the reaction chamber. 5 ( Figure 5). With this type of bonding, the heat transfer from the heating / measuring structure 10.3 in the flex circuit board 10 into the reaction chamber 5 is more efficient.
  • the pre-assembled unit of the inlay 1 consisting of base plate, biochip, flex circuit board and check valve is pressed into a cartridge housing 28 for easier handling and stabilization (FIG. 12).
  • the cartridge housing is formed from an upper and a lower half 28.1, 28.2, which define a cuboid cavity, in which the inlay is received positively.
  • the two halves 28.1 and 28.2 of the cartridge housing each have an approximately rectangular recess 29.1 or 29.2 in the region of the reaction chamber 5.
  • a stabilizing disc 24 may be arranged, which rests against the flex circuit board 10 of the inlay 1 1 and approximately centrally has an opening which is smaller than the recess 29.2 of the lower Half is 28.2 of the cartridge housing. Whether a stabilizing disc 24 is appropriate depends on how high the pressure within the reaction chamber 5 is and how much the flex circuit board is bent thereby.
  • the sample liquid is injected by means of a syringe or pipette at the filling opening 9 through the check valve 8 via the filling channel 7 into the reaction chamber 5.
  • the sample liquid first fills the reaction chamber 5 and then flows into the equalization channel 4 and possibly into the equalization chamber 2.
  • the filling quantity is preferably dimensioned such that no sample liquid enters the equalization chamber 2.
  • an overpressure and the air in the expansion chamber 2 is compressed.
  • the filling level can be monitored. Since the volumes of the filling channel 7, the reaction chamber 5 and the compensation channel 4 are known, can be filled with a constant volume of liquid, even without viewing the optical window.
  • the pressure-tight closure with the check valve 8 generates an overpressure in the reaction chamber during filling of the cartridge.
  • the air in the equalization chamber is compressed.
  • the overpressure can be adjusted specifically.
  • the overpressure is in the range of 0 bar to 1 bar.
  • the internal pressure doubles during filling.
  • temperatures of up to 100 ° C can occur.
  • the thermal expansion of the sample liquid leads to a deflection into the compensation channel 4.
  • the sample liquid withdraws again.
  • the pressure differences at T max and T min are only minimal, since the air in the expansion chamber 2 is compressed.
  • the volume of the compensation chamber is significantly larger than the increase in volume of the sample liquid when heated.
  • the stabilizer disk 24 can minimize expansion of the flexible flex circuit board 10 during the filling process without losing the ability of resiliently pressing the biochip 6 against the detection window 14 (FIG. 12).
  • the course of a temperature-controlled biological detection reaction requires the setting of accurate temperatures of the sample liquid in the reaction space. For example, when performing a PCR, temperatures between 30 ° C and 98 ° C are controlled. The temperature distribution of the sample liquid must be homogeneous in the reaction space and temperature changes (heating, cooling) should be fast.
  • the heating / measuring structure acts as a heater when current through the ohmic resistance.
  • the heating / measuring structure can be used simultaneously as a temperature detector by using the resistance characteristic R (T) to determine the temperature.
  • the flex circuit board 10 with the integrated heating conductor causes local temperature fluctuations. Hotspots are located directly above the heating / measuring structures.
  • a temperature homogenization layer 21 (FIG. 7) on the flex circuit board 10 effects homogenization of the temperature distribution on top of the flex circuit board 10.
  • the temperature homogenization layer 21 is a copper layer which is nickel plated and provided with an additional gold layer.
  • the gold layer has the advantage that it is inert to biological materials and thus biological materials in the reaction chamber can come into direct contact with this layer. This reaction chamber can therefore also be used for experiments other than biochip.
  • This homogenization layer has good thermal conductivity. Instead of a combined copper-nickel-gold coating, a relatively thick copper layer could also be provided.
  • a heat conductor track integrated into the flex PCB has a low own heat capacity. Thus, higher heating rates of the sample liquid can be realized in the reaction space.
  • the meander-shaped heating / measuring structure 10.3 is formed from a thin strip conductor having a width of 60 ⁇ m and a thickness of 16 ⁇ m. It is about 480 mm long. At room temperature, it has an electrical resistance of about 6 to 8 ohms.
  • the conductor track is formed of copper, preferably copper with a purity of 99.99%. Such pure copper has a temperature coefficient which is almost constant in the relevant temperature range here. In its entirety forms the Heating / measuring structure 10.3 a rhombus with an edge length of about 9 mm.
  • the biochip 6 only has an edge length of 3 mm, whereby the rhombus formed by the heating / measuring structure 10.3 and the temperature homogenizing layer 21 covers a larger area than the biochip.
  • the end points of the meandering heating / measuring structure in each case go into a very wide conductor track 30.1 and 30.2, which serve to supply the heating current and even have only a small resistance due to their large width. Furthermore, in each case one further conductor track 31.1 and 31.2 in the region of the connection point of the meandering heating / measuring structure are connected to these two conductor tracks 30.1 and 30.2. These two further interconnects 31.1 and 31.2 serve to pick up the voltage drop across the heating / measuring structure. This will be discussed in more detail below.
  • the flex circuit board 10 has conductor tracks 32 and corresponding contact points 33, 34 for connecting an electrical semiconductor memory.
  • This semiconductor memory is used for storing calibration data for the heater and the data of the biological experiments to be performed with the biochip of the cartridge. These data are thus stored without confusion.
  • FIG. 14 shows an equivalent circuit diagram of a circuit of a measuring and control device for heating and measuring the heating current by means of the meandering heating / measuring structure or heating conductor track.
  • the SchuVMess Modell 10.3 is shown in the equivalent circuit diagram as a resistor, which is connected in series with a current sense resistor 35 and a controllable current source 36.
  • the voltage at the current sense resistor 35 and at the SchwarzVMess Design 10.3 are each tapped by means of a separate measuring channel 37, 38.
  • the two measuring channels 37, 38 are identically formed, each with an existing two operational amplifiers impedance converter 39, an operational amplifier 40 for amplifying the measurement signal, an anti-AMA sing filter 41 and an A / D converter 42, with the analog measurement signal in a digital measured value is implemented.
  • the two measuring channels 37, 38 are thus high-impedance and identical to each other.
  • the operational amplifiers 40 of the two measuring channels 37, 38 are preferably operational amplifiers with laser-trimmed internal resistance whose amplification can be set very precisely. In the present embodiment, the operational amplifier LT 1991 of the company Linear Technology is used for this purpose.
  • the two A / D converters 42 of the two measuring channels 37, 38 are preferably realized by a synchronous two-channel A / D converter, which detects both channels simultaneously.
  • this current can be used simultaneously for heating and for measuring.
  • a constant measuring current is fed in, which is not measured at the sensor.
  • Such a measuring current can not be varied and changed for heating, which is why the heating and measuring are carried out independently.
  • the measurement of the temperature is carried out with a high sampling rate of z. B more than 1,000 Hz, preferably at least about 3,000 Hz. This allows an extremely precise adjustment of the temperature. It has been shown that at just below 3,000 Hz, a heating rate of 85 ° C / sec can be controlled with an accuracy of 0.1 ° C.
  • a heating and measuring current of approx. 50 mA flows and when holding a temperature of approx. 350 mA to 400 mA.
  • the heating / measuring structure 10.3 serves both as a heating element and as a measuring resistor for measuring the heating voltage, it is not possible to apply arbitrarily high "measuring currents" to this heating / measuring structure 10.3, since these measuring currents also act as heating currents and would lead to a significant increase in temperature, which is not always desirable.
  • the heating / measuring structure 10.3 is formed on the side facing away from the biochip 6 side of the flex circuit board 10.
  • the continuous temperature homogenization layer 21 is provided, which leads to a uniform, rapid heat distribution and allows a corresponding uniform and rapid heating of the biochip 6.
  • the flex circuit board only has a heat capacity of about 12 mJ / K resulting in rapid heat transfer of the generated heat to the sample liquid in the reaction chamber and the biochip.
  • the measured values obtained with the measuring circuit explained above are supplied to a digital control device 43, which controls the controllable current source 36 via a line 44.
  • step S2 the temperature value is measured, that is, the resistance of the heating / measuring structure 10.3 is calculated from the two measured values and converted into a temperature value according to a table.
  • step S3 the difference between the measured actual temperature and a target temperature is calculated. This value is called the delta value.
  • the setpoint temperature changes with time.
  • the function describing this time-varying temperature is called the temperature profile to be applied to the reaction chamber.
  • step S4 a query is made as to whether the delta value is greater than a predetermined minimum. If the answer to this question is "yes”, the process goes to step S5, in which it is asked if this delta value is less than a predetermined maximum, and if the result is "yes” again, the process goes to a block of method steps S6, S7, S8, with which an integral part of a control value (step S6) is calculated, an offset value is added to the delta value (step S7) and based on the thus changed delta value a proportional nal component (step S8) is calculated. A manipulated variable is obtained by adding the integral component and the proportional component. Adding the offset value causes heating at a higher heat output.
  • step S4 If a "No" results as a result in one of the two above queries (step S4) or step (S5), then the method goes directly to step S7, omitting the calculation of the integral part in that an integral component is calculated only within a predetermined range around the setpoint temperature.
  • This range around the setpoint temperature is approximately +/- 1 ° C to +/- 2 ° C.
  • the integral component is thus used only if the The measured actual temperature is already relatively close to the desired setpoint temperature, which prevents the actual temperature from overshooting due to the very slow integral component, while the integral component in the last control phase allows very precise and fast approximation to the desired target temperature.
  • step S9 it is checked whether the manipulated variable is smaller than a predetermined minimum. If this is the case, the process flow goes to step S10, with which the temperature is lowered with maximum cooling power. If, in step S9, the query indicates that the manipulated variable is not smaller than a predetermined minimum, then the method proceeds to step S10, in which it is checked whether the manipulated variable is less than zero. If this is the case, the procedure goes to step S12, in which the manipulated variable is set to zero. This means that the reaction chamber is cooled without additional cooling power or that the cooling stamp is removed from the reaction chamber. This avoids overshooting.
  • step S13 a temperature increase is performed in accordance with the determined manipulated variable. This means that a control signal proportional to the manipulated variable is delivered to the controllable current source 36, which generates a corresponding heating current through the heating / measuring structure 10.3.
  • step S14 it is checked whether the end of the temperature profile has been reached. If this is the case, the process flow is terminated with the step S15. Otherwise, the procedure goes back to the step S2.
  • This control process is repeated at the sampling frequency, which is at least 1,000 Hz, in particular at least about 3,000 Hz.
  • Cooling device for temperature-controlled biological detection reactions
  • FIG. 16 shows the basic principle of the cooling device 50 according to the invention.
  • This cooling device 50 has a cooling body, which is referred to below as a cooling piston 51.
  • the peculiarity of this cooling stamp 51 is that it is movably arranged relative to the cartridge 28 so that it can be brought into contact with a cooling surface with the cartridge 28 such that the reaction chamber 5 of the cartridge 28 can be cooled. It is both possible to arrange the cooling punch 51 in a stationary manner and to move the cartridge 28 with a linear drive or to arrange the cartridge in a stationary manner and to move the cooling punch 51 by means of a linear drive.
  • the cooling punch 51 is provided with a cooling unit 52, which comprises a cooling element in the form of a Peltier element, a heat sink and a fan. With this cooling unit 52, the cooling punch 51 can be cooled to a predetermined temperature. Furthermore, the cooling device 50 has a linear drive 53, with which the cooling piston can be moved back and forth. The cooling punch 51 has an end face, which is referred to below as the cooling surface 54, and with the cartridge in Kon- can be brought. The size of the cooling plunger 51 is dimensioned such that the cooling surface 54 in the region of the reaction chamber 5 for cooling on the cartridge or on the flex circuit board 10 can be brought into contact.
  • the heat capacity of the cooling plunger 51 in contrast to the heat capacity of the flex circuit board 10 and the reaction chamber 5 is very large.
  • the heat capacity of the cooling stamper 51 is about 8 to 9 J / K.
  • the total heat capacity of the reaction chamber 5, however, is only about 0.5 J / K.
  • the high heat capacity of the cooling stamp 51 means that its temperature is not changed significantly even when the reaction chamber 5 is cooled by a very high temperature difference. This has the consequence that the cooling piston 51 can be kept at its operating temperature with relatively low cooling capacity. Due to the large heat capacity of the cooling plunger, the necessary rapid cooling process of the reaction chamber 5 is thus temporally decoupled from the cooling unit 52, which gradually dissipates heat from the cooling plunger 51 at a relatively low cooling output.
  • the cooling piston 51 can be kept constant at a relative to the temperatures in the reaction chamber relatively low temperature level of z. B. 20 ° C, whereby rapid Abkühlvorêt be achieved, in particular when performing PCR reactions in which repeatedly z. B. from a temperature of 98 ° C to a temperature of 40 ° C to 60 ° C must be cooled.
  • the cooling punch 51 is moved away from the reaction chamber 5. If necessary, something can be heated to regulate the final temperature. This is typically the case when the setpoint temperature is above room temperature. If the temperature falls below the set temperature, it will automatically heat up. If, as is necessary in the case of some biological tests, a temperature below room temperature is set in the reaction chamber, the cooling stamp is set to this temperature and pressed permanently against the reaction chamber.
  • heating can take place simultaneously. This is particularly useful at lower temperature changes of about 40 ° C to 50 ° C maximum. However, this can also be used to maintain a temperature below room temperature, which is at a temperature below the target temperature. Temperature cooled plunger is permanently in contact with the reaction chamber. A reduced cooling rate can also be achieved by reducing the pressing force with which the cooling stamp is pressed against the reaction chamber.
  • FIG. 1 A first embodiment of the cooling device according to the invention is shown in FIG.
  • This cooling device in turn has a cooling piston 51, a cooling unit 52 and a linear drive 53.
  • linear drive for example, stepper motors or servo geared motors with spindle or worm gear, linear stepper motors, piezolinear motors, motors with pinion and rack, solenoids, rotary magnets, voice coil magnets, motors with cams, etc. are suitable.
  • the cooling punch 51 is cylindrical tube-shaped. It is made of metal, such as copper or aluminum.
  • a pin-shaped or rod-shaped plunger 55 which is made of a plastic or metal, such as copper or aluminum, is movably mounted.
  • the plunger 55 is arranged longitudinally displaceable in the cooling die 51.
  • the plunger is as thin as possible and rounded at its end facing the reaction chamber, so that it presses punctiform as possible against the reaction chamber.
  • the cooling punch 51 is formed of metal, since metal conducts heat well. He may also be formed of another good heat conductive material, such. As special ceramics (alumina ceramics, etc.) or plastics with certain fillers, such as. As graphite, metal powder or tiny metal beads, plastic nanotubes, AI 2 O 3 ceramic powder.
  • the protruding from the cooling device 50 end face 54 of the cooling plunger 51 forms a cooling surface 54.
  • cooling elements 56 are attached in the form of Peltier elements. These cooling elements are components of the cooling unit 52, which still has fan 57 and heat sink 58.
  • the cooling punch 51 has at its rear, the cooling surface 54 opposite end face a bush 59 made of a poor thermal conductivity material, such as plastic.
  • This bushing 59 defines a cavity.
  • the ram 55 extends with its rear end into this cavity and has a graft-shaped end body 60, which is slidably mounted in the sleeve 59. Between this end body 60 and the voltage applied to the cooling piston 51 wall of the bush 59, a spring 61 is stretched, which acts on the plunger with a force such that the plunger 55 with its remote from the end body 60 free end face (part of the cooling surface 54) in the cooling die 51 is pulled into it.
  • the bushing 59 is fixed in the housing by means of a plastic ring 62. Furthermore, there is in the housing, a linear drive 63 for acting on the end body 60 and the plunger 55 with a force that presses it with its free end a piece of the cooling die 51.
  • the entire unit consisting of the cooling punch 51, the plunger 55, the cooling unit 52, and the linear drive 63 is slidably mounted in the axial direction of the cooling plunger 51 and coupled to the linear drive 53. This coupling takes place by means of a spring 64.
  • the spring has a certain force-displacement characteristic and thus allows a travel control on the linear drive 53 to control the pressing force of the cooling punch 51 to the flex circuit board 10, without the force with an additional force sensor measured or regulated. This type of adjustment of the compressive force meets the requirements, since the tolerances with respect to the set force are uncritical in many areas.
  • the cooling stamp 51 is thermally insulated at all free and accessible locations. For this example, commercially available, fine-pored foam is provided.
  • the cooling surface 54 of the cooling punch 51 is turned flat and polished.
  • the cooling elements 56 are connected in series and connected to control electronics.
  • a temperature sensor for measuring the temperature of the cooling punch is provided on the surface of the cooling punch 51.
  • the temperature control on the cooling piston 51 is carried out with a PI controller. The sampling of the temperature takes place, for example, with a sampling rate of 2 Hz.
  • FIG. 17 A second embodiment of the cooling device according to the invention is shown in FIG. Like parts of this second embodiment are identified by the same reference numerals as in FIG. 17.
  • the cooling device 50 comprises a cylinder tube-shaped cooling plunger 51 with a cooling surface 54, a plunger 55 movably disposed therein, two cooling units 52 each having a cooling element 56, a fan 57 and a heat sink 58, a linear actuator 63 for actuating the Plunger 55 and a spring 61, which pulls the plunger with its free end in the cooling punch 51.
  • the second embodiment of the cooling device 50 differs from the first embodiment in that the cooling piston 51 is arranged stationary and a linear drive 65 is provided for moving the cartridge 28.
  • This linear drive 65 is coupled by means of a spring 66 to a holder (not shown) for receiving the cartridge.
  • the holder is linearly mounted. In the holder, the cartridge can be used with reproducible position.
  • the force-displacement characteristic curve of the spring 66 the force with which the cartridge is pressed against the heat sink 51, 55 can be set by means of a travel control.
  • the linear drives 53, 63 and 65 are designed such that they can be actively retracted to replace the cartridge.
  • cooling unit in the form of cooling fins or the like on the cooling plunger, at which the heat absorbed by the cooling plunger will be released via convection and radiation.
  • the cooling rates are inherently lower with such devices than with active cooling. But such a cooling unit would meet the requirements of many temperature cycles used in practice.
  • cooling units other systems are possible individually or in combination, such. Example, a water cooling or the production of very cold air by means of a vortex tube, which is blown to the cooling die.
  • Combined heating / cooling device 19 and 20 each show a combined heating / cooling device for heating and cooling the reaction chamber 5 of the cartridge 28 and another cartridge 71, which in turn has a reaction chamber 5 for receiving a biochip 6, but is not provided with its own heating means.
  • the reaction chamber 5 is limited in a portion of a thin plate 72 of good heat conducting material that may be formed flexible. The plate 72 is exposed with its side facing away from the reaction chamber, so that they can be touched by the heating / cooling device 70.
  • the heating / cooling device 70 has a heating punch 73 with a contact surface 74 facing the plate 72.
  • the heating punch 73 is formed of metal and with a heating means 75, such. B. provided with the heating stamp 73 heating wires provided.
  • the heating means 75 is connected to a control device (not shown), with which the heating punch 73 can be heated to a predetermined temperature.
  • a temperature sensor 76 is arranged, which detects the temperature of the contact surface 74.
  • the temperature sensor is also connected to the control device, so that the control device can regulate the temperature of the heating punch 73.
  • the heating punch 73 is connected via an axis 77 with a linear drive 78, with which the heating punch 73 can be moved to the plate 72 until it touches them with a predetermined pressure or can be pulled away from the plate 72 of the cartridge 71, so that a predetermined Air gap between the heating punch 73 and the plate 72 is made.
  • the cooling stamp 79 On the axis 77 movably supports a cooling ram 79 which surrounds the axis 77.
  • the cooling stamp 79 is formed from metal and arranged displaceably in the longitudinal direction of the axis 77.
  • the cooling ram 79 is connected to a further linear drive 80, with which the position of the cooling ram 79 on the axis 77 is adjustable.
  • the cooling punch 79 can be moved by the linear drive 80 in the direction of the heating punch 73 until the cooling punch 79 touches the heating punch 73 on its side facing away from the contact surface 74 under pressure.
  • the cooling stamp 79 can also be removed from the heating punch 73 such that an air gap is formed therebetween.
  • a cooling unit 81 with a Peltier element, heat sink and fan is arranged on the cooling stamp 79 in order to cool the cooling stamp to a predetermined temperature.
  • the cooling punch 79 has a much larger mass and volume than the heating punch 73. As a result, the cooling stamp 79 has a significantly greater heat capacity than the heating stamp 73. This has the consequence that when the cooling stamp 79 touches the heating stamp 73, this composite stamp thermally fromméstem- pel is dominated and acts as a reaction chamber cooling the stamp. The volume and mass of the heating punch 73 is small. As a result, the heating stamp 73 can be heated to predetermined temperatures with low energy.
  • the cooling punch 79 is held at a comparatively low temperature by means of the cooling unit 81.
  • the heating stamp 73 is pressed against the plate 72 of the cartridge 71 during the heating phases.
  • the cooling stamp 79 is arranged at a distance from the heating punch 73.
  • the heating punch 73 is heated by means of its heating means 75, until at the interface between the contact surface 74 and the plate 72, the desired temperature is set.
  • the heating means 75 is switched off and the cooling punch 79 is pressed by the linear drive 80 against the heating punch 73.
  • the heating punch 73 is in turn in contact with the plate 72 of the cartridge 71. Due to the much larger heat capacity of thedestempels 79 against the heat capacity of the Schustkovs 73 the Schustkov 73 quickly removed much heat, whereby the heating die cools and as a coolant for the reaction chamber 5 of the cartridge 71 is used.
  • the temperature at the interface between the heating punch 73 and the plate 72 is monitored by the temperature sensor 76.
  • both the heating stamp 73 and the cooling stamp 79 are retracted by the linear drive 78 or only the cooling stamp 79 is withdrawn and heat is supplied to the heating stamp 73 by means of the heating means 75 if the temperature of the reaction chamber 5 is above room temperature must be kept. If the temperature of the reaction chamber is to be kept below the room temperature, then it may also be expedient if the heating stamp 73 continues to abut against the reaction chamber 5 and at the same time the cooling stamp 79 contacts the heating stamp 73.
  • the heat flow from - or to the reaction chamber 5 can be controlled such that its temperature is kept constant.
  • FIG. 1 A second embodiment of a heating / cooling device 82 is shown in FIG. This second embodiment differs somewhat from the embodiment shown in FIG. It also serves to contact a cartridge 71 with a plate 72 by means of a heating punch 83 with a contact surface 84.
  • the heating punch 83 is in turn provided with a heating means 85 and a temperature sensor 86 on the contact surface 84.
  • the heating punch 83 is arranged on an axis 87, which is connected to a first linear drive 88, with which the heating punch can be brought into contact with the plate 72 and can be moved away from it.
  • a cooling punch 89 is movably arranged, which in turn is in communication with a linear drive 90, so that the cooling punch 89 can be brought into contact with the heating punch 83.
  • a cooling unit 91 is arranged, with which the cooling punch 89 can be cooled to a predetermined temperature and maintained at this temperature.
  • a tantroisstempel 92 is arranged to be movable in the axial direction on the axis 87.
  • the toaststempel 92 is connected to a further linear drive 93, so that theificatroisstempel 92 can be brought into contact with the heating die 83 or removed from it.
  • the romancestempel 92 is provided with a heating means 94, such as. B. a winding of heating wires to be heated to a predetermined temperature.
  • the volume and the mass of the cooling punch 89 and the beautibilities 92 are greater than that of the Schustkovs 83.
  • a heating or cooling phase of the beautus 92 and the cooling punch 89 is brought into contact with the Schustempel 83 so as the Schustempel 83rd to heat quickly to a predetermined temperature or to cool to a predetermined temperature.
  • this combined heating / cooling device 82 functions in the same manner as the heating / cooling device 70 shown in FIG.
  • These two heating / cooling devices can still be provided with a plunger (not shown) which extends through the axes 77 and 87, respectively, and can act on the plate 72, if flexible, to push the biochip against an opposite detection window (not shown). not shown).
  • the detection window opposite the plate 72 is designed to be elastic, wherein during the reading of the biochip the detection device (not shown) with a transparent plate against the detection window is pressed so that it rests on the biochip 6. As a result, sample liquid is displaced between the biochip 6 and the detection window and the individual spots of the biochip can be reliably scanned.
  • a detection window may be formed of a transparent, elastic plastic material.
  • the flex circuit board is elastically deformed by pressing the plunger 55 when the cartridge with flex circuit board 10 is used so that the glued biochip presses against the detection area (FIG. 6).
  • a force F 0 must be expended. With an area of about 0.5 cm 2 , you only need about 5 N to build up a pressure of 1 bar.
  • a certain force F 1 still has to be expended in order to deform the elastic flex circuit board 10 with applied biochip 6 by means of the plunger 55 in such a way that the biochip 6 is pressed uniformly against the detection surface.
  • the sum of the forces F 0 + F 1 should not exceed 30 N.
  • the illumination of the biochip in the reaction space is circular. Not only is the rectangular biochip 6 illuminated, but also areas 5.1 of the reaction space next to the biochip in which a dye-containing sample liquid 26 has not been displaced (FIG. 9). These areas fluoresce intensely. In the case of optical imaging of the biochip by the optical module onto a detector, these regions appear outside the biochip, but due to the high dye concentration of the sample liquid next to the biochip, part of the fluorescent light also scatters in the direction of the biochip and on the reaction surface. fields (spots). The detector detects not only the fluorescence radiation of the spots by the direct illumination but also the indirect fluorescence scattering radiation from the areas next to the biochip. Thus, the image of the spots on the biochip receives a local inhomogeneous, the image analysis disturbing background lighting.
  • This diaphragm 18 can be introduced as an optically absorbing diaphragm (FIG. 8) during the injection molding of a transparent main body 1 or as a transparent optical diaphragm 19 or detection window 14 during the injection molding of a nontransparent basic body (FIG. 7).
  • the aperture can also be subsequently applied to the optical observation window (detection surface).
  • the transmission of the diaphragm layer should be less than 10 "2 .
  • the cartridge 28 according to the invention makes it possible to continue the temperature-controlled biological detection reaction after image acquisition.
  • the flexible printed circuit board 10 deviates due to the overpressure in the reaction chamber 5 and the compensation chamber 2 and the sample liquid from the compensation chamber 2 flows back into the reaction chamber 5, also between the biochip 6 and the cover glass.
  • the temperature-controlled biological detection reaction can be continued.
  • the cartridges according to the invention can be used to detect the spots on the biochip at any time during the biological reaction.
  • Reading and writing data All information about the cartridge, including biochip, must be read out by the biochip reader. To drive accurate temperatures while performing the temperature-controlled biological detection reaction, the heater's specific calibration data for a particular flex PCB is needed on the flex circuit board. Also, the information on the biochip applied reaction fields (spots), ID numbers, exposure times for image acquisition, etc., must be read by the reader to control the temperature-controlled biological response and to allow a logging and archiving.
  • the necessary information can be applied to the cartridge as a dot code or as a bar code. To read these codes you need a dot code reader (or bar code reader). It is therefore not possible to save current data.
  • More flexible is the use of writable and readable tamper-resistant storage media 10.2 which are advantageously integrated on the flex circuit board.
  • the contacting of an electrically programmable non-volatile memory on the Flex-LP can also take place (FIG. 3). This information can be stored digitally and queried at any time. The storable amount of data is significantly larger than when bar or dot codes applied.
  • the biochip In a contacted electrically programmable non-volatile memory and information during PCR or read the biochip can be stored. In addition, the data can be stored tamper-proof. After a successful processing, the cartridge can also be marked as "processed" in order to prevent another, unwanted processing.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine beheizbare Reaktionskammer zum Prozessieren eines Biochips und ein Verfahren zum Ansteuern einer solchen Reaktionskammer. Die beheizbare Reaktionskammer zum Prozessieren eines Biochips, weist eine aus einer flexiblen Leiterplatte (10) ausgebildete Kammerwand auf, wobei auf der flexiblen Leiterplatte (10) eine als Heizeinrichtung dienende Leiterbahn (10.3) ausgebildet ist. Das Vorsehen einer flexiblen Leiterplatte als Wandung einer Reaktionskammer bewirkt eine geringe Wärmekapazität der Reaktionskammer im Bereich der Heizeinrichtung, wodurch ein schnelles Heizen ermöglicht wird.

Description

Beheizbare Reaktionskammer zum Prozessieren eines Biochips und Verfahren zum Ansteuern einer solchen Reaktionskammer
Die Erfindung betrifft eine beheizbare Reaktionskammer zum Prozessieren eines Biochips und ein Verfahren zum Ansteuern einer solchen Reaktionskammer.
Ein Biochip weist ein in der Regel ebenflächiges Substrat mit unterschiedlichen Fängermolekülen auf, die an auf der Oberfläche des Substrates vorbestimmten Punkten, den Spots, angeordnet sind. Eine mit einer Markierung versehene Probensubstanz reagiert mit bestimmten Fängermolekülen nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip. Meistens bestehen die Fängermoleküle aus DNA-Sequenzen (siehe z.B. EP 373 203 B1 ) oder Proteinen. Derartige Biochips werden auch Arrays bzw. DNA-Arrays genannt. Die Markierungen sind oftmals Fluoreszenz-Marker. Mit einem optischen Lesegerät wird die Fluoreszenz-Intensität der einzelnen Spots erfasst. Diese Intensität korreliert mit der Anzahl der mit den Fängermolekülen immobilisierten markierten Probenmoleküle.
Aus der WO 2005/108604 A2 geht eine beheizbare Reaktionskammer zum Prozessieren eines Biochips hervor. Diese Reaktionskammer weist eine elastische Membran auf. Auf der Membran ist ein Silizium-Biochip angeordnet. Als Heizeinrichtung ist eine Nickel-Chrom-Dünnfilm-Leiterbahn vorgesehen. Derartige Nickel-Chrom-Dünnfilm- Leiterbahnen besitzen einen hohen elektrischen Widerstand und eine dementsprechend hohe Heizleistung. Neben der Leiterbahn für die Widerstandsheizung ist eine zusätzlich Leiterbahn zur Temperaturmessung vorgesehen.
Bei dieser bekannten Reaktionskammer (Fig. 10, 1 1 ) ist eine Gehäusewandung als Membran ausgebildet, damit der Biochip 6 mittels eines Stößels 12 gegen ein der Membran 13 gegenüberliegendes Deckglas 23 gedrückt werden kann. Hierdurch wird eine in der Reaktionskammer befindliche Reaktionsflüssigkeit 26 von der Oberfläche des Biochips verdrängt und stört nicht bei der optischen Detektion. Zwischen der Membran 13 und dem Deckglas 23 ist eine Dichtung 22 angeordnet. Die Probenflüssigkeit 26 wird mittels einer Einfüllkanüle 19, die durch die Dichtung 22 gestoßen wird, eingefüllt. Beim Stößeln wird mittels einer Druckausgleichskanüle 20 überschüssige Probenflüssigkeit 26 aus der Reaktionskammer 5 abgeleitet.
In der WO 01/02 094 A1 werden Mittel zur Temperaturbeaufschlagung von Biochips beschrieben, die mikrostrukturierte Widerstandsheizleitungen umfassen. In der US 5,759,846 und US 6,130,056 ist jeweils eine Reaktionskammer zur Aufnahme von biologischen Geweben beschrieben. In der Reaktionskammer befindet sich eine flexible Leiterplatte mit Elektroden. Durch Zusammendrücken des biologischen Gewebes und der flexiblen Leiterplatte kann ein elektrischer Kontakt zwischen dem biologi- sehen Gewebe und den Elektroden der flexiblen Leiterplatte hergestellt werden, so dass an dem biologischen Gewebe unmittelbar ein elektrischer Abgriff erfolgen kann.
In der DE 10 2005 09 295 A1 ist eine chemische Reaktionspatrone mit mehreren Kammern beschrieben. Durch Abrollen einer Walze an der Oberfläche der Patrone können Flüssigkeiten von einer Kammer in eine weitere Kammer befördert werden. Weiterhin ist eine Metallstange vorgesehen, mit welcher Druck, Schwingung, Hitze, Kühle oder ähnliches auf die Patrone ausgeübt werden kann, um die chemische Reaktion in der Patrone zu beschleunigen.
Aus K. Shen et al. Sensors and Actuators B 105 (2005), Seiten 251 - 258, „A Micro- chip-based PCR device using flexible printed cireuit technology" ist es bekannt eine flexible Leiterplatte zum Heizen einer Reaktionskammer zu verwenden, die für ein PCR Verfahren vorgesehen ist. Die Reaktionskammer besteht aus einer Glasplatte, einem Rahmen und einer Kunststoffabdeckung. Auf der Außenseite der Glasplatte ist die fle- xible Leiterplatte entweder unmittelbar mittels einer Klebeverbindung oder mittels eines dazwischen befindlichen Kupferchips angeordnet. Aufgrund der guten thermischen Eigenschaften der flexiblen Leiterplatte wurden Heizraten von 8°C/s erzielt. Auf der flexiblen Leiterplatte ist eine Leiterbahn ausgebildet, die sowohl zum Heizen als auch zum Messen der Temperatur verwendet wird. Das Heizen erfolgt während eines „Heating State" und das Messen der Temperatur während eines „Sensing State", die zeitlich versetzt durchgeführt werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine einfache, kostengünstige beheizbare Reaktionskammer zum Prozessieren eines Biochips zu schaffen, mit der zum einen sehr effizient geheizt werden kann und zum anderen das aus der WO 2005/108604 A2 bekannte Stößeln möglich ist. Weiterhin liegt der Erfindung die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zum Ansteuern einer solchen Reaktionskammer zu schaffe.
Die Aufgabe wird durch eine beheizbare Reaktionskammer mit den Merkmalen des An- Spruchs 1 und durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 21 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den jeweiligen Unteransprüchen angegeben. Die erfindungsgemäße beheizbare Reaktionskammer zum Prozessieren eines Biochips weist eine aus einer flexiblen Leiterplatte ausgebildete Kammerwand auf. Auf der flexiblen Leiterplatte ist eine als Heizeinrichtung dienende Leiterbahn ausgebildet, die im Folgenden als Heiz-Leiterbahn bezeichnet wird. Die flexible Leiterplatte dient einerseits als flexible Membran, die von einem Stößel betätigt werden kann, um auf einen darauf angeordneten Biochip gegen ein gegenüberliegendes Sichtfenster der Reaktionskammer zu drücken. Andererseits dient die flexible Leiterplatte gleichzeitig als Heizeinrichtung, da durch die darauf befindliche Heiz-Leiterbahn ein Heizstrom geleitet werden kann, der eine Wärme erzeugt, die an die Reaktionskammer abgegeben wird.
Die Heiz-Leiterbahn ist mäanderförmig ausgebildet, so dass sie gleichmäßig eine vorbestimmte Fläche abdeckt, wobei die Leiterbahn über ihre gesamte Länge eine konstante Dicke und Breite aufweist. Die Heizleiterbahn kann auch mit der Form einer Doppelspirale verlaufen. Vorteilhaft ist, dass die Leiterbahn Kreuzungsfrei ausgebildet ist, damit sie aus einer Kupferlage hergestellt werden kann.
Da die flexible Leiterplatte zwei Funktionen (elastische Membran, Heizeinrichtung) in sich vereint, kann gegenüber herkömmlichen beheizbaren Reaktionskammern zum Prozessieren eines Biochips ein Bauteil entfallen. Dies führt zu einer wesentlichen Min- derung der Wärmekapazität im Bereich der Kammerwand, an der die Heizeinrichtung vorgesehen ist. Dadurch wird der Wärmeübertrag auf den Biochip wesentlich effizienter als dies bei bekannten beheizbaren Reaktionskammern der Fall ist. Hierbei ist insbesondere zu berücksichtigen, dass flexible Leiterplatten grundsätzlich sehr dünn sind und selbst nur eine geringe Wärmekapazität besitzen.
Nach einem bevorzugten Ausführungsbeispiel weist die beheizbare Reaktionskammer eine Mess- und Steuereinrichtung auf, die derart ausgebildet ist, dass die eine Heiz- Leiterbahn der flexiblen Leiterplatte sowohl zum Heizen als auch zum Messen der Temperatur verwendet wird. Hierdurch ist es möglich, in dem Bereich in dem der Bio- chip in der Reaktionskammer auf der flexiblen Leiterplatte angeordnet ist, gleichmäßig die Leiterbahn in mäanderförmig verlaufende Schleifen zu verlegen, so dass der Biochip gleichmäßig über seiner gesamten Fläche beheizt wird.
Die Messeinrichtung weist zwei vorzugsweise identische Messkanäle auf, die zum Messen des Stromes bzw. der Spannung an der als Heizeinrichtung dienenden Leiterbahn vorgesehen sind. Da sowohl der Strom als auch die Spannung an der Heiz- Leiterbahn gemessen werden, kann die Heiz-Leiterbahn gleichzeitig zum Messen als auch zum Heizen verwendet werden, da der Strom entsprechend der geforderten Heizleistung variiert werden kann.
Die als Heizeinrichtung dienende Heiz-Leiterbahn auf der flexiblen Leiterplatte ist mit einem Widerstand von etwa 5 bis 10 Ohm bei Raumtemperatur ausgebildet.
Die Heiz-Leiterbahn auf der flexiblen Leiterplatte ist vorzugsweise aus Kupfer ausgebildet, da die Kupfer-Leiterbahnen zum einen kostengünstig und zum anderen sehr präzise herstellbar sind. Die Heiz-Leiterbahn aus Kupfer weist vorzugsweise zumindest eine Reinheit von 99% auf, da der Temperaturkoeffizient von reinem Kupfer im hier relevanten Temperaturbereich sehr konstant ist.
Die Messung der Spannung an der als Heizeinrichtung dienenden Leiterbahn erfolgt vorzugsweise mittels einer vier-Punkt-Messung.
Die flexible Leiterplatte kann mit zwei leitenden Lagen ausgebildet sein, wobei die eine leitende Lage als Leiterbahn ausgebildet ist, die als Heizeinrichtung dient und die andere leitende Lage mit einer flächigen, den gesamten beheizten Bereich abdeckenden leitenden Schicht, insbesondere Kupferschicht, ausgebildet ist, so dass die erzeugte Wärme schnell und gleichmäßig auf der gesamten zu beheizenden Fläche verteilt wird.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Ansteuern der beheizbaren Reaktionskammer wird die Heiz-Leiterbahn der flexiblen Leiterplatte sowohl zum Heizen der Reaktionskammer als auch zum Messen der Temperatur mit einem Heiz-/Messstrom versorgt. Hierdurch müssen im zu heizenden Bereich nicht zwei separate Leiterbahnen zum Heizen und zum Messen der Temperatur vorgesehen werden, wodurch es möglich ist, die Leiterbahn gleichmäßig mäanderförmig über den gesamten zu heizenden Bereich zu verlegen.
Die Temperaturmessung erfolgt mit einer Abtastrate von zumindest 1000 Hz bzw. etwa 3000 Hz. Hierdurch wird ein sehr exaktes Einstellen eines sich zeitlich verändernden Temperaturprofils möglich.
Das Verfahren zum Regeln der Temperatur der Reaktionskammer ist derart ausgebil- det, dass innerhalb eines Temperaturintervalls um eine Soll-Temperatur ein Pl-Regler und außerhalb dieses Intervalls ein P-Regler verwendet wird. Hierdurch wird ein Überschwingen der Temperatur vermieden und dennoch schnell und präzise die Solltemperatur eingestellt. Die Erfindung wird anhand in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsbeispielen erläutert. Die Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 einen Grundkörper einer erfindungsgemäßen Kartusche in einer Ansicht von unten,
Fig. 2 eine Ausführung der Reaktionsfelder (Spots) auf einem Biochip mit optisch undurchlässiger und nicht fluoreszierender Rückseite,
Fig. 3 ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäß verwendeten flexiblen Leiter- platte mit interner Heiz-/Messstruktur und integriertem EEPROM,
Fig. 4 ein erstes Ausführungsbeispiel für einen auf einen Grundkörper aufgebrachten
Biochip mit Flex-Leiterplatte, Fig. 5 ein zweites Ausführungsbeispiel für einen auf einen Grundkörper aufgebrachten
Biochip mit Flex-Leiterplatte, Fig. 6 ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Anordnung des Inlays mit dem zugehörigen Optikmodul, Fig. 7 ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Anordnung, ausgestattet mit einer transparenten Blende in einem nicht transparenten Grundkörper, Fig. 8 ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Kartusche, ausgestattet mit einer nichttransparenten Blende an einem transparenten Grundkörper,
Fig. 9 den Ausschnitt der ausgeleuchteten Fläche im Probenraum des Inlays ohne
Blende, Fig. 10 das Verfahrensprinzip des Einfüllens einer Probenflüssigkeit durch Kanülen in den Reaktionsraum nach dem Stand der Technik, Fig. 1 1 das Verfahrensprinzip der Verdrängung des Flüssigkeitsüberstandes mittels
Stößeln nach dem Stand der Technik,
Fig. 12 eine Kartusche mit Inlay und einer Flex-Leiterplatten-Stabilisierungsscheibe, Fig. 13 ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel eines Layouts der Flex-Leiterplatte, Fig. 14 eine Meß- und Heizelektronik in einem schematisch vereinfachten Schaltbild, Fig. 15 eine Regelungsverfahren in einem Flußdiagramm,
Fig. 16 eine Kühleinrichtung in einer schematisch grob vereinfachten Darstellung, Fig. 17 ein erstes Ausführungsbeispiel der Kühleinrichtung in einer schematisch vereinfachten Schnittdarstellung,
Fig. 18 ein zweites Ausführungsbeispiel der Kühleinrichtung in einer schematisch ver- einfachten Schnittdarstellung,
Fig. 19 eine alternative Heiz-/Kühleinhchtung zum Beheizen und Kühlen der Reaktionskammer, und Fig. 20 eine Abwandlung der Heiz-/Kühleinhchtung aus Fig. 19. Ausführungsbeispiel
Kartusche:
Anhand der Figuren 1 -9 und 12 wird eine Kartusche mit einem Biochip beschrieben.
Ein beispielsweise mittels Sphtzguss aus Kunststoff hergestellter Grundkörper 1 enthält an der Unterseite eine Aussparung für einen Befüllkanal 7, der von einer Befüllöffnung 9 zu einer Reaktionskammer 5 führt (Fig. 1 , 6), und Aussparungen für die Reaktionskammer 5, einen Ausgleichskanal 4 zwischen der Reaktionskammer 5 und einem Ausgleichsraum 2 und eine Aussparung für den Ausgleichsraum 2. Die Befüllöffnung 9 ist mit einem sich konisch verjüngenden Abschnitt ausgebildet (Fig. 6), der das Einführen einer Pipettenspitze erleichtert. In der Befüllöffnung ist ein Rückschlagventil 8 angeord- net. Im Ausgleichskanal 4 befindet sich ein Sichtfenster 3, durch das erkannt werden kann, ob sich im Ausgleichskanal 4 eine Probenflüssigkeit befindet. Zumindest im Bereich der Reaktionskammer 5 ist der Grundkörper 1 transparent ausgebildet und bildet somit ein Detektionsfenster 14 durch das ein darunter angeordneter Biochip 6 detek- tierbar ist.
Die Verbindungskanäle sind möglichst kurz und mit einem möglichst kleinen Querschnitt ausgebildet, damit das Totvolumen klein und der notwendige Überschuss an Probenflüssigkeit gering gehalten wird.
An der Unterseite des Grundkörpers 1 befindet sich eine flexible Leiterplatte 10, die im Folgenden als Flex-Leiterplatte 10 bezeichnet wird (Fig. 3). Die Flex-Leiterplatte 10 ist mit der Unterseite des Grundkörpers 1 derart verbunden, dass die Aussparungen 7, 5, 4, 3, 2 nach unten hin begrenzt werden und einen durchgängigen kommunizierenden, in sich abgeschlossenen Fluidkanal bilden.
Die Flex-Leiterplatte 10 enthält Kontaktflächen 10.1 , ein digitales Speichermedium 10.2 (z.B. ein EEPROM) und eine interne Heiz-/Messstruktur 10.3 (Fig. 3).
In der Reaktionskammer 5 befindet sich ein Biochip 6 (Fig. 2), der eine Anzahl M N Re- aktionsfelder 6.1 aufweist. Zur Vermeidung von optischen Rückreflexen und unerwünschter Fluoreszenzstrahlung von der Flex-Leiterplatte 10 ist der Biochip 6 auf der Rückseite optisch undurchlässig und nicht fluoreszierend, z.B. mit Schwarzchrom be- schichtet 6.2. Die Flex-Leiterplatte 10 bildet eine Begrenzungswand der Reaktionskammer 5.
Es wird zuerst der Biochip 6 auf der Flex-Leiterplatte 10 fixiert und anschließend die Flex-Leiterplatte 10 mit dem Grundkörper 1 verbunden. Die Verbindung zwischen der Flex-Leiterplatte 10 und dem Biochip 6 erfolgt mit einer Haftverbindungsschicht 17, wie z.B. einem geeigneten Klebeband (geeignet für biologische Reaktionen) oder mit einem Silikonkleber.
Anschließend wird die Flex-Leiterplatte 10 mit dem aufgebrachten Biochip 6 zum Grundkörper 1 justiert und an ihm fixiert und bildet ein Inlay 1 1. Eine dauerhafte, tempe- ratur- und wasserbeständige Verbindung kann z.B. mittels biologisch-verträglichen Klebeband, mit Silikonkleber, durch Laserschweißen, durch Ultraschallschweißen oder andere biologisch verträgliche Klebstoffe realisiert werden.
Dabei gibt es die Möglichkeit, die Flex-Leiterplatte 10 großflächig mit dem Klebeband (oder Klebstoff) zu beschichten, den Biochip 6 über der Heiz-/Messstruktur 10.3 der Flex-Leiterplatte aufzukleben, und dann den Grundkörper 1 zum Biochip 6 zu justieren und die Flex-Leiterplatte 10 über der gesamten Fläche des Grundkörpers 1 zu fixieren (Fig. 4).
Eine zweite Möglichkeit der Verbindung von Flex-Leiterplatte 10, Biochip 6 und Grundkörper 1 besteht in der gezielten flächigen Verklebung des Biochips 6 mit der Flex- Leiterplatte 10 (Kleber nur unter dem Biochip) und der anschließenden Fixierung des Grundkörpers 1 nur außerhalb der Reaktionskammer 5 (Fig. 5). Mit dieser Art der Verklebung ist der Wärmeübergang von der Heiz-/Messstruktur 10.3 in der Flex-Leiterplatte 10 in die Reaktionskammer 5 effizienter.
Die so vormontierte Einheit des Inlays 1 1 , bestehend aus Grundplatte, Biochip, Flex- Leiterplatte und Rückschlagventil wird zur einfacheren Handhabung und Stabilisierung in ein Kartuschengehäuse 28 eingepresst (Fig. 12). Das Kartuschengehäuse ist aus einer oberen und einer unteren Hälfte 28.1 , 28.2 ausgebildet, die einen quaderförmigen Hohlraum begrenzen, in den das Inlay formschlüssig aufgenommen ist. Die beiden Hälften 28.1 und 28.2 des Kartuschengehäuses weisen jeweils im Bereich der Reakti- onskammer 5 eine etwa rechteckförmige Aussparung 29.1 bzw. 29.2 auf. In der Aussparung 29.2 der unteren Hälfte 28.2 des Kartuschengehäuses kann eine Stabilisierungsscheibe 24 angeordnet sein, die an der Flex-Leiterplatte 10 des Inlays 1 1 anliegt und etwa mittig eine Öffnung aufweist, die kleiner als die Aussparung 29.2 der unteren Hälfte 28.2 des Kartuschengehäuses ist. Ob eine Stabilisierungsscheibe 24 zweckmäßig ist, hängt davon ab, wie hoch der Druck innerhalb der Reaktionskammer 5 ist und wie stark die Flex-Leiterplatte hierdurch ausgebogen wird.
Befüllvorgang:
Die Probenflüssigkeit wird mittels einer Spritze oder Pipette an der Befüllöffnung 9 durch das Rückschlagventil 8 über den Befüllkanal 7 in die Reaktionskammer 5 eingespritzt. Die Probenflüssigkeit füllt zunächst die Reaktionskammer 5 aus und strömt dann in den Ausgleichskanal 4 und eventuell in den Ausgleichsraum 2. Die Befüllungsmenge wird vorzugsweise derart bemessen, dass keine Probenflüssigkeit in den Ausgleichsraum 2 gelangt. Beim Befüllvorgang entsteht im Inlay 1 1 ein Überdruck und die Luft im Ausgleichsraum 2 wird komprimiert. Durch das Sichtfenster 3 im Ausgleichskanal 4 kann der Befüllstand überwacht werden. Da die Volumina des Befüllkanals 7, der Reak- tionskammer 5 und des Ausgleichskanals 4 bekannt sind, kann mit einem konstanten Flüssigkeitsvolumen, auch ohne Betrachtung des optischen Fensters, befüllt werden.
Der druckdichte Abschluss mit dem Rückschlagventil 8 erzeugt beim Befüllen der Kartusche einen Überdruck in der Reaktionskammer. Die Luft im Ausgleichsraum wird komprimiert. Mit der Variation der Volumina von Reaktionskammer 5 und Ausgleichsraum 2 kann der Überdruck gezielt eingestellt werden. Der Überdruck liegt im Bereich von 0 bar bis 1 bar. Bei gleichen Volumina der Reaktionskammer und des Ausgleichsraumes verdoppelt sich der Innendruck bei der Befüllung. Während der Durchführung der temperaturgesteuerten biologischen Nachweisreaktion können Temperaturen bis 100°C auftreten. Die thermische Ausdehnung der Probenflüssigkeit führt zu einem Ausweichen in den Ausgleichskanal 4. Beim Abkühlvorgang zieht sich die Probenflüssigkeit wieder zurück. Die Druckunterschiede bei Tmax und Tmιn (im kalten und heißen Zustand) sind nur minimal, da die Luft im Ausgleichsraum 2 komprimiert wird. Das Volumen des Ausgleichsraums ist deutlich größer als die Volumenzunahme der Probenflüssigkeit bei Erwärmung.
Die Stabilisierungsscheibe 24 kann eine Ausdehnung der elastischen Flex-Leiterplatte 10 beim Befüllvorgang minimieren, ohne die Fähigkeit des elastischen Andrückens des Biochips 6 an das Detektionsfenster 14 zu verlieren (Fig. 12).
Eine Druckerhöhung um 1 bar in der Kartusche hat den Vorteil, dass der Siedepunkt der Probenflüssigkeit von 100°C auf ca. 125°C ansteigt. Die Bildung von Luftblasen im Reaktionsraum wird damit minimiert. Heizeinrichtung für Temperaturgesteuerte biologischen Nachweisreaktion:
Der Ablauf einer temperaturgesteuerten biologischen Nachweisreaktion erfordert die Einstellung genauer Temperaturen der Probenflüssigkeit im Reaktionsraum. Dabei wer- den bei der Durchführung einer PCR z.B. Temperaturen zwischen 30°C und 98°C angesteuert. Die Temperaturverteilung der Probenflüssigkeit muss im Reaktionsraum homogen sein und Temperaturänderungen (Heizen, Kühlen) sollen schnell erfolgen.
Auf der Flex-Leiterplatte 10 befindet sich eine Heiz-/Messstruktur, die bei Stromführung durch den ohmschen Widerstand als Heizer wirkt. Damit wird die Probenflüssigkeit im Reaktionsraum auf die erforderliche Temperatur T erwärmt. Die Heiz-/Messstruktur kann gleichzeitig als Temperaturdetektor eingesetzt werden, indem die Widerstandskennlinie R(T) zur Bestimmung der Temperatur verwendet wird.
Die Flex-Leiterplatte 10 mit der integrierten Heiz-Leiterbahn verursacht lokale Temperaturschwankungen. Direkt über den Heiz-/Messstrukturen befinden sich Hotspots. Eine Temperaturhomogenisierungsschicht 21 (Fig. 7) auf der Flex-Leiterplatte 10 bewirkt eine Homogenisierung der Temperaturverteilung auf der Oberseite der Flex-Leiterplatte 10. Die Temperaturhomogenisierungsschicht 21 ist eine Kupferschicht, die vernickelt und mit einer zusätzlichen Goldschicht versehen ist. Die Goldschicht hat den Vorteil, dass sie für biologische Materialen inert ist und somit in der Reaktionskammer biologische Materialen unmittelbar mit dieser Schicht in Berührung kommen können. Diese Reaktionskammer kann deshalb auch für andere Experimente als solche mit Biochip verwendet werden. Diese Homogenisierungsschicht besitzt eine gute thermische Leit- fähigkeit. Anstelle einer kombinierten Kupfer-Nickel-Gold-Beschichtung könnte auch eine relativ dicke Kupferschicht vorgesehen werden.
Eine in die Flex-Leiterplatte integrierte Heizleiterbahn hat eine niedrige eigene Wärmekapazität. Damit sind höhere Heizraten der Probenflüssigkeit im Reaktionsraum reali- sierbar.
Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel des Layouts der Flex-Leiterplatte 10 ist in Figur 13 gezeigt. Die mäanderförmige Heiz-/Messstruktur 10.3 ist aus einer dünnen Leiterbahn mit einer Breite von 60 μm und einer Stärke von 16 μm ausgebildet. Sie ist etwa 480 mm lang. Bei Raumtemperatur weist sie einen elektrischen Widerstand von etwa 6 bis 8 Ohm auf. Die Leiterbahn ist aus Kupfer, vorzugsweise Kupfer mit einer Reinheit von 99,99% ausgebildet. Derart reines Kupfer weist einen Temperaturkoeffizienten auf, der im hier relevanten Temperaturbereich nahezu konstant ist. In ihrer Gesamtheit bildet die Heiz-/Messstruktur 10.3 eine Raute mit einer Kantenlänge von etwa 9 mm. Es gibt bereits Prototypen von flexiblen Leiterplatten mit einer Kupferschicht, die eine Stärke von 5 μm aufweist und auf welchen Strukturen mit einer Breite von 30 μm ausgebildet sind. Mit derartigen Leiterbahnen würde eine Widerstand von etwa 100 Ohm bis 120 Ohm erzielt werden.
Der Biochip 6 weist lediglich eine Kantenlänge von 3 mm auf, womit die durch die Heiz- /Messstruktur 10.3 und der Temperaturhomogenisierungsschicht 21 gebildete Raute eine größere Fläche als der Biochip abdeckt.
Die Endpunkte der mäanderförmigen Heiz-/Messstruktur gehen jeweils in eine sehr breite Leiterbahn 30.1 und 30.2 über, die zum Zuführen des Heizstromes dienen und selbst aufgrund ihrer großen Breite nur einen geringen Widerstand besitzen. Weiterhin sind an diesen beiden Leiterbahnen 30.1 und 30.2 jeweils eine weitere Leiterbahn 31.1 und 31.2 im Bereich der Anbindungsstelle der mäanderförmigen Heiz-/Messstruktur angebunden. Diese beiden weiteren Leiterbahnen 31.1 und 31.2 dienen zum Abgreifen des Spannungsabfalls an der Heiz-/Messstruktur. Dies wird unten näher erörtert.
Die Flex-Leiterplatte 10 weist Leiterbahnen 32 und entsprechende Kontaktstellen 33, 34 zum Anschließen eines elektrischen Halbleiterspeichers auf. Dieser Halbleiterspeicher dient zum Speichern von Kalibrierdaten für die Heizeinrichtung und der Daten der biologischen Experimente, die mit dem Biochip der Kartusche durchzuführen sind. Diese Daten sind somit verwechslungssicher abgespeichert.
Figur 14 zeigt ein Ersatzschaltbild einer Schaltung einer Mess- und Steuereinrichtung zum Heizen und Messen des Heizstromes mittels der mäanderförmigen Heiz- /Messstruktur bzw. Heiz-Leiterbahn. Die HeizVMessstruktur 10.3 ist im Ersatzschaltbild als Widerstand dargestellt, der in einer Reihe mit einem Strommesswiderstand 35 und einer steuerbaren Stromquelle 36 geschaltet ist. Die Spannung am Strommesswider- stand 35 und an der HeizVMessstruktur 10.3 werden jeweils mittels eines separaten Messkanals 37, 38 abgegriffen. Die beiden Messkanäle 37, 38 sind identisch ausgebildet mit jeweils einem aus zwei Operationsverstärkern bestehenden Impedanzwandler 39, einem Operationsverstärker 40 zum Verstärken des Messsignals, einem Anti— AMa- singfilter 41 und einem A/D-Wandler 42, mit dem das analoge Messsignal in einen di- gitalen Messwert umgesetzt wird. Die beiden Messkanäle 37, 38 sind somit hochohmig und identisch zueinander ausgebildet. Die Operationsverstärker 40 der beiden Messkanäle 37, 38 sind vorzugsweise Operationsverstärker mit lasergetrimmtem Innenwiderstand, deren Verstärkung sehr präzise einstellbar ist. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wird hierfür der Operationsverstärker LT 1991 der Firma Linear Technology eingesetzt. Die beiden A/D-Wandler 42 der beiden Messkanäle 37, 38 werden vorzugsweise durch einen synchronen Zwei-Kanal A/D-Wandler realisiert, der beide Kanäle gleichzeitig erfasst. Hierdurch wird sichergestellt, dass die Messwerte in beiden Kanälen jeweils zu identischen Zeiten abgetastet werden. Dies gewährleistet, dass die am Strommesswiderstand abgegriffene Spannung und die am Heizelement bzw. an der HeizVMessstruktur 10.3 abgegriffene Spannung jeweils gleichzeitig abgegriffen werden und somit auf dem gleichen Heiz- bzw. Messstrom beruhen, der durch den Strommesswiderstand 35 bzw. die Heiz-/Messstruktur 10.3 fließt.
Da der Heiz- bzw. Messstrom gemessen wird, kann dieser Strom gleichzeitig zum Hei- zen und zum Messen verwendet werden. Bei herkömmlichen Messvorrichtungen wird ein konstanter Messstrom eingespeist, der nicht am Sensor gemessen wird. Ein solcher Messstrom kann nicht variiert werden und zum Heizen verändert werden, weshalb das Heizen und Messen unabhängig voneinander ausgeführt wird.
Da bei einem Heiz- und Messstrom das Heizen und Messen gleichzeitig ausgeführt wird, wird eine präzisere Regelung der Temperatur möglich.
Die Messung der Temperatur erfolgt mit einer hohen Abtastrate von z. B mehr als 1.000 Hz vorzugsweise zumindest etwa 3.000 Hz. Dies erlaubt eine extrem präzise Einstel- lung der Temperatur. Es hat sich gezeigt, dass mit knapp unter 3.000 Hz eine Heizrate von 85°C/sec mit einer Genauigkeit von 0,1 °C gesteuert werden kann.
Beim Abkühlen fließt ein Heiz- und Messstrom von ca. 50 mA und beim Halten einer Temperatur von ca. 350 mA bis 400 mA.
Durch die Ausbildung der HeizVMessstruktur 10.3 als lange, dünne, schmale Leiterbahn wird selbst bei Verwendung von Kupfer als Leiterbahnmaterial ein ausreichend hoher Widerstand erzielt, der mit der oben erläuterten 4-Punkt-Messung auch bei geringem Heizstrom zuverlässig abgetastet werden kann. Die 4-Punkt-Messung ist unabhängig von parasitären Widerständen. Denn, da die erfindungsgemäße Heiz-/Messstruktur 10.3 sowohl als Heizelement als auch als Messwiderstand zum Messen der Heizspannung dient, ist es nicht möglich, beliebig hohe „Messströme" an diese Heiz- /Messstruktur 10.3 anzulegen, denn diese Messströme wirken auch als Heizströme und würden zu einer signifikanten Temperaturerhöhung führen, die jedoch nicht immer gewünscht ist. Es liegen somit Randbedingungen vor, die unter gewissen Prozessbedingungen einen sehr geringen Messstrom erfordern, um nicht die Temperatur der Reaktionskammer in unerwünschter Weise zu Verändern. Da zwei identische Messkanäle 37, 38 verwendet werden, die zeitgleich die Messspannung mit einer sehr hohen Impedanz abgreifen und sehr präzisen Verstärkern messen, können selbst geringe Spannungsabfälle an den Widerständen 35 und 10.3 zuverlässig detektiert werden. Da die Messkanäle identisch sind, kürzen sich systematische Messfehler heraus, da der Widerstand R der Heiz-/Messstruktur 10.3 gemessen wird, der Quotient aus dem Heizstrom und der Heizspannung bzw. der beiden Messsignale ist.
Die Heiz-/Messstruktur 10.3 ist auf der von dem Biochip 6 abgewandten Seite der Flex- Leiterplatte 10 ausgebildet. Auf der gegenüberliegenden Seite der Flex-Leiterplatte ist die durchgehende Temperaturhomogenisierungsschicht 21 vorgesehen, die zu einer gleichmäßigen, schnellen Wärmeverteilung führt und eine entsprechende gleichmäßige und schnelle Erwärmung des Biochips 6 erlaubt. Zudem besitzt die Flex-Leiterplatte lediglich eine Wärmekapazität von etwa 12 mJ/K was zu einer schnellen Wärmeübertragung der erzeugten Wärme auf die in der Reaktionskammer befindlichen Probenflüssigkeit und den Biochip führt.
Bei herkömmlichen vergleichbaren Heizeinrichtungen wurden meistens Leiterbahnen aus einem Material mit einem höheren spezifischen Widerstand als Kupfer, wie z. B. NiCr verwendet und für das Heizen als auch für das Messen werden zwei separate Leiterbahnen vorgesehen, da es bisher als schwierig erachtet wurde, mit einer Kupfer- leiterbahn gleichzeitig zu Heizen als auch die Temperatur zu Messen. Bisher wurden auch vor allem Siliziumsubstrate als Heizelemente verwendet, da sie aufgrund ihrer hohen Wärmeleitfähigkeit vorteilhaft zur schnellen Verteilung der Wärme erschienen. Derartige Siliziumsubstrate besitzen jedoch eine Wärmekapazität, die etwas mehr als das 10-fache der Wärmekapazität der erfindungsgemäßen Flex-Leiterplatte beträgt. Hier- durch wird der Heizvorgang sehr träge.
Die mit der oben erläuterten Messschaltung erhaltenen Messwerte werden einer digitalen Steuereinrichtung 43 zugeführt, die über eine Leitung 44 die steuerbare Stromquelle 36 ansteuert.
In der Steuereinrichtung 43 wird das schematisch in Figur 15 gezeigte Regelverfahren ausgeführt. Dieses Verfahren zum Durchführen eines Temperaturprofils beginnt mit dem Schritt S1. Im Schritt S2 wird der Temperaturwert gemessen, das heißt der Widerstand der Heiz- /Messstruktur 10.3 wird aus den beiden Messwerten berechnet und in einen Temperaturwert gemäß einer Tabelle umgesetzt.
Im Schritt S3 wird die Differenz zwischen der gemessenen Ist-Temperatur und einer Soll-Temperatur berechnet. Dieser Wert wird als Delta-Wert bezeichnet. Die Soll- Temperatur verändert sich mit der Zeit. Die Funktion, die diese zeitlich veränderliche Temperatur beschreibt, wird als Temperaturprofil bezeichnet, das an der Reaktions- kammer angelegt werden soll.
Im Schritt S4 wird abgefragt, ob der Delta-Wert größer als ein vorbestimmtes Minimum ist. Wenn die Antwort auf diese Frage „Ja" ist, geht der Verfahrenablauf auf den Schritt S5 über, in dem abgefragt wird ob dieser Delta-Wert kleiner als einer vorbestimmtes Maximum ist. Ist das Ergebnis wiederum „Ja", geht der Verfahrensablauf auf einen Block von Verfahrensschritten S6, S7, S8 über, mit welchen ein Integral-Anteil eines Regelungswertes (Schritt S6) berechnet wird, zum Delta-Wert ein Offset-Wert hinzu addiert wird (Schritt S7) und anhand des derart veränderten Delta-Wertes ein Proportio- nal-Anteil (Schritt S8) berechnet wird. Eine Stellgröße ergibt sich durch Addieren des Integral-Anteils und des Proportional-Anteils. Das Addieren des Offset-Werts bewirkt, dass mit höherer Heizleistung geheizt wird.
Ergibt sich bei einer der beiden obigen Abfragen (Schritt S4) bzw. Schritt (S5) ein „Nein" als Ergebnis, so geht der Verfahrensablauf direkt auf den Schritt S7 über, womit die Be- rechnung des Integral-Anteils ausgelassen wird. Dies heißt, dass nur innerhalb eines vorbestimmten Bereiches um die Soll-Temperatur ein Integral-Anteil berechnet wird. Dieser Bereich um die Solltemperatur beträgt etwa +/- 1 °C bis +/-2°C. Der Integral Anteil wird somit nur verwendet, wenn die gemessene Ist-Temperatur schon relativ nahe an der gewünschten Soll-Temperatur ist. Hierdurch wird zum einen ein Überschwingen der Ist-Temperatur aufgrund des sehr trägen Intergral-Anteils verhindert. Andererseits ermöglicht der Integral-Anteil in der letzten Regelungsphase eine sehr präzise und schnelle Annäherung an die gewünschte Soll-Temperatur.
Im Schritt S9 wird geprüft, ob die Stellgröße kleiner als ein vorbestimmtes Minimum ist. Ist dies der Fall, geht der Verfahrensablauf auf den Schritt S10 über, mit dem die Temperatur mit maximaler Kühlleistung gesenkt wird. Ergibt im Schritt S9 die Abfrage, dass die Stellgröße nicht kleiner als ein vorbestimmtes Minimum ist, dann geht der Verfahrensablauf auf den Schritt S10 über, in dem geprüft wird, ob die Stellgröße kleiner als Null ist. Ist dies der Fall, geht der Verfahrensablauf auf den Schritt S12 über, in dem die Stellgröße auf Null gesetzt wird. Dies bedeutet, dass die Reaktionskammer ohne zusätzliche Kühlleistung abgekühlt wird bzw. dass der Kühlstempel von der Reaktionskammer entfernt wird. Hierdurch wird ein Überschwingen vermieden.
Ergibt die Abfrage im Schritt S1 1 hingegen, dass die Stellgröße nicht kleiner als Null ist, dann bedeutet dies, dass die Temperatur erhöht werden muss. Demgemäß wird im Schritt S13 eine Temperaturerhöhung entsprechend der ermittelten Stellgröße durchgeführt. Dies heißt, dass ein zur Stellgröße proportionales Stellsignal an die steuerbare Stromquelle 36 abgegeben wird, die einen entsprechenden Heizstrom durch die Heiz- /Messstruktur 10.3 erzeugt.
Im Schritt S14 wird geprüft, ob das Ende des Temperaturprofils erreicht worden ist. Ist dies der Fall, wird der Verfahrensablauf mit dem Schritt S15 beendet. Ansonsten geht der Verfahrensablauf wieder auf den Schritt S2 über. Dieser Regelvorgang wir mit der Abtastfrequenz wiederholt, die zumindest 1.000 Hz, insbesondere zumindest etwa 3.000 Hz beträgt.
Kühleinrichtung für temperaturgesteuerte biologische Nachweisreaktionen:
Figur 16 zeigt das Grundprinzip der erfindungsgemäßen Kühleinrichtung 50. Diese Kühleinrichtung 50 weist einen Kühlkörper auf, der im folgenden als Kühlstempel 51 bezeichnet wird. Die Besonderheit dieses Kühlstempels 51 liegt darin, dass er bezüglich der Kartusche 28 beweglich angeordnet ist, so dass er mit einer Kühlfläche mit der Kartusche 28 derart in Kontakt bringbar ist, dass die Reaktionskammer 5 der Kartusche 28 gekühlt werden kann. Es ist sowohl möglich, den Kühlstempel 51 ortsfest anzuord- nen und die Kartusche 28 mit einem Linearantrieb zu bewegen oder die Kartusche ortsfest anzuordnen und den Kühlstempel 51 mittels eines Linearantriebes zu bewegen.
Der Kühlstempel 51 ist mit einer Kühleinheit 52 versehen, die ein Kühlelement in Form eines Peltier-Elementes, einen Kühlkörper und einen Lüfter umfasst. Mit dieser Kühl- einheit 52 kann der Kühlstempel 51 auf eine vorbestimmte Temperatur gekühlt werden. Weiterhin weist die Kühleinrichtung 50 einen Linearantrieb 53 auf, mit dem der Kühlstempel hin und her bewegt werden kann. Der Kühlstempel 51 weist eine Stirnfläche auf, die im folgenden als Kühlfläche 54 bezeichnet wird, und mit der Kartusche in Kon- takt gebracht werden kann. Die Größe des Kühlstempels 51 ist derart bemessen, dass die Kühlfläche 54 im Bereich der Reaktionskammer 5 zum Kühlen an der Kartusche bzw. an der Flex-Leiterplatte 10 in Berührung gebracht werden kann.
Die Wärmekapazität des Kühlstempels 51 ist im Gegensatz zur Wärmekapazität der Flex-Leiterplatte 10 bzw. der Reaktionskammer 5 sehr groß. Bei den unten beschriebenen Ausführungsbeispielen beträgt z.B. die Wärmekapazität des Kühlstempels 51 etwa 8 bis 9 J/K. Die gesamte Wärmekapazität der Reaktionskammer 5 beträgt hingegen lediglich etwa 0,5 J/K. Hierdurch ist zum einen ein hoher Wärmetransfer sicher gestellt. Zum anderen bedeutet die hohe Wärmekapazität des Kühlstempels 51 , dass dessen Temperatur auch beim Abkühlen der Reaktionskammer 5 um einen sehr hohen Temperaturunterschied nicht wesentlich verändert wird. Dies hat zur Folge, dass der Kühlstempel 51 mit relativ geringer Kühlleistung auf seiner Arbeitstemperatur gehalten werden kann. Durch die große Wärmekapazität des Kühlstempels wird somit der notwendi- ge schnelle Abkühlvorgang der Reaktionskammer 5 zeitlich von der Kühleinheit 52 entkoppelt, die vom Kühlstempel 51 allmählich bei relativ geringer Kühlleistung die Wärme nach außen abführt.
Weiterhin kann der Kühlstempel 51 konstant auf einem gegenüber den Temperaturen in der Reaktionskammer relativ geringen Temperaturniveau, von z. B. 20 °C gehalten werden, wodurch schnelle Abkühlvorgänge erzielt werden, insbesondere beim Durchführen von PCR-Reaktionen, bei welchen wiederholt z. B. von einer Temperatur von 98 °C auf eine Temperatur von 40 °C bis 60 °C abgekühlt werden muss.
In dem Moment, wo die Temperatur der Reaktionskammer 5 die Zieltemperatur erreicht hat oder kurz vorher wird der Kühlstempel 51 von der Reaktionskammer 5 wegbewegt. Gegebenenfalls kann etwas geheizt werden, um die Endtemperatur einzuregeln. Dies ist typischerweise der Fall, wenn die Solltemperatur über der Raumtemperatur liegt. Falls die Temperatur unter die Solltemperatur fällt, wird automatisch geheizt. Soll, wie es bei manchen biologischen Tests notwendig ist, eine Temperatur unterhalb der Raumtemperatur in der Reaktionskammer eingestellt werden, wird der Kühlstempel auf diese Temperatur eingestellt und dauerhaft gegen die Reaktionskammer gedrückt.
In speziellen Anwendungen, bei welchen man eine geringer Kühlrate wünscht, kann zu- sätzlich zum anliegenden Kühlstempel 51 gleichzeitig geheizt werden. Dies ist insbesondere bei geringeren Temperaturänderungen von maximal etwa 40 °C bis 50 °C zweckmäßig. Dies kann aber auch dazu eingesetzt werden, um eine Temperatur unterhalb der Raumtemperatur zu halten, wobei der auf eine Temperatur unterhalb der Ziel- temperatur abgekühlte Stempel permanent mit der Reaktionskammer in Kontakt steht. Eine verringerte Kühlrate kann auch durch Verringern der Andrückkraft, mit der der Kühlstempel gegen die Reaktionskammer gedrückt wird, erzielt werden.
Ein erstes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Kühleinrichtung ist in Figur 17 gezeigt. Diese Kühleinrichtung weist wiederum einen Kühlstempel 51 , eine Kühleinheit 52 und einen Linearantrieb 53 auf.
Als Linearantrieb sind beispielsweise Schrittmotoren oder Servogetriebemotoren mit Spindel- oder Schneckengetriebe, Linearschrittmotoren, Piezolinearmotoren, Motoren mit Ritzel und Zahnstange, Hubmagnete, Drehmagnete, Voice-Coil-Magnete, Motoren mit Kurvenscheiben usw. geeignet.
Der Kühlstempel 51 ist zylinderrohrförmig ausgebildet. Er besteht aus Metall, wie zum Beispiel Kupfer oder Aluminium. Im Inneren des Kühlstempels 51 lagert beweglich ein stift- oder stabförmiger Stößel 55, der aus einem Kunststoff oder Metall, wie zum Beispiel Kupfer oder Aluminium ausgebildet ist. Der Stößel 55 ist längsverschieblich im Kühlstempel 51 angeordnet. Der Stößel ist möglichst dünn ausgebildet und an seinem zur Reaktionskammer weisenden Ende abgerundet, so dass er möglichst punktförmig gegen die Reaktionskammer drückt.
Der Kühlstempel 51 ist aus Metall ausgebildet, da Metall wärme gut leitet. Er kann auch aus einem anderem gut wärme leitenden Material ausgebildet sein, wie z. B. spezielle Keramiken (Aluminiumoxidkeramik, etc.) oder Kunststoffe mit bestimmten Füllstoffen, wie z. B. Grafit, Metallpulver oder winzigen Metallkügelchen, Kunststoffnanoröhrchen, AI2O3-Keramikpulver.
Die aus der Kühleinrichtung 50 hervorstehende Stirnfläche 54 des Kühlstempels 51 bildet eine Kühlfläche 54. Am von der Kühlfläche entfernten Umfangsbereich des Kühl- stempeis 51 ist dieser mit zwei ebenen Flächen ausgebildet, an welchen Kühlelemente
56 in Form von Peltier-Elementen befestigt sind. Diese Kühlelemente sind Bestandteile der Kühleinheit 52, die weiterhin noch Lüfter 57 und Kühlkörper 58 aufweist. Die Lüfter
57 sind hierbei in ein Gehäuse zum Aufnehmen eines Abschnittes dieses Kühlstempels 51 integriert.
Der Kühlstempel 51 weist an seiner rückwärtigen, der Kühlfläche 54 gegenüberliegenden Stirnfläche eine Buchse 59 aus einem schlecht wärmeleitenden Material, wie zum Beispiel Kunststoff auf. Diese Buchse 59 begrenzt einen Hohlraum. Der Stößel 55 er- streckt sich mit seinem rückwärtigen Ende in diesen Hohlraum und weist einen pfrop- fenförmigen Endkörper 60 auf, der in der Buchse 59 gleitend lagert. Zwischen diesem Endkörper 60 und der am Kühlstempel 51 anliegenden Wandung der Buchse 59 ist eine Feder 61 gespannt, die den Stößel mit einer Kraft derart beaufschlagt, dass der Stößel 55 mit seiner vom Endkörper 60 abgewandten freien Stirnfläche (Bestandteil der Kühlfläche 54) in den Kühlstempel 51 hineingezogen wird.
Die Buchse 59 ist im Gehäuse mittels eines Kunststoff rings 62 fixiert. Weiterhin befindet sich im Gehäuse ein Linearantrieb 63 zum Beaufschlagen des Endkörpers 60 bzw. des Stößels 55 mit einer Kraft, die ihn mit seinem freien Ende ein Stück aus dem Kühlstempel 51 herausdrückt. Die gesamte Einheit bestehend aus dem Kühlstempel 51 , dem Stößel 55, der Kühleinheit 52, und dem Linearantrieb 63 ist in Axialrichtung des Kühlstempels 51 gleitend gelagert und an den Linearantrieb 53 gekoppelt. Diese Kopplung erfolgt mittels einer Feder 64. Die Feder weist eine bestimmte Kraft-Weg-Kennlinie auf und erlaubt somit über eine Wegsteuerung am Linearantrieb 53 die Andruckkraft des Kühlstempels 51 an die Flex-Leiterplatte 10 zu steuern, ohne dass die Kraft mit einem zusätzlichen Kraftsensor gemessen oder geregelt wird. Diese Art der Einstellung der Druckkraft genügt den Anforderungen, da die Toleranzen bezüglich der eingestellten Kraft in weiten Bereichen unkritisch sind.
Der Kühlstempel 51 ist an allen freien und zugänglichen Stellen thermisch isoliert. Hierzu ist beispielsweise handelsüblicher, feinporiger Schaumstoff vorgesehen. Die Kühlfläche 54 des Kühlstempels 51 ist plangedreht und poliert. Die Kühlelemente 56 sind in Reihe geschaltet und mit einer Steuerelektronik verbunden. Weiterhin ist an der Ober- fläche des Kühlstempels 51 ein Temperatursensor zum Messen der Temperatur des Kühlstempels vorgesehen. Die Temperaturregelung am Kühlstempel 51 erfolgt mit einem Pl-Regler. Die Abtastung der Temperatur erfolgt beispielsweise mit einer Abtastrate von 2 Hz.
Aufgrund der großen Wärmekapazität des Kühlstempels 51 und des Stößels 55, der gleichermaßen mit dem Kühlstempel 51 kühl gehalten wird, erwärmt sich dieser zweiteilige Kühlkörper lediglich um etwa 2°C bei einer Abkühlung der Reaktionskammer um eine Temperatur von etwa 40 °C. Die erforderliche Kühlleistung ist relativ gering und beträgt etwa 1 - 2 W. Dies erlaubt, dass die Kühleinrichtung mit Batterien betrieben wer- den kann. Ein zweites Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Kühleinrichtung ist in Fig. 18 gezeigt. Gleiche Teile dieses zweiten Ausführungsbeispiels sind mit gleichen Bezugszeichen wie in Fig. 17 gekennzeichnet.
Auch die Kühleinrichtung 50 nach dem zweiten Ausführungsbeispiel umfasst einen zy- linderrohrförmigen Kühlstempel 51 mit einer Kühlfläche 54 , einen darin beweglich angeordneten Stößel 55, zwei Kühleinheiten 52 mit jeweils einem Kühlelement 56, einem Lüfter 57 und einem Kühlkörper 58, einen Linearantrieb 63 zum Betätigen des Stößels 55 und eine Feder 61 , die den Stößel mit seinem freien Ende in den Kühlstempel 51 zieht.
Das zweite Ausführungsbeispiel der Kühleinrichtung 50 unterscheidet sich vom ersten Ausführungsbeispiel dadurch, dass der Kühlstempel 51 ortsfest angeordnet ist und ein Linearantrieb 65 zum Bewegen der Kartusche 28 vorgesehen ist. Dieser Linearantrieb 65 ist mittels einer Feder 66 an eine Halterung (nicht dargestellt) zur Aufnahme der Kartusche gekoppelt. Die Halterung ist linear gelagert. In die Halterung kann die Kartusche mit reproduzierbarer Position eingesetzt werden. Über die Kraft-Weg-Kennlinie der Feder 66 kann mittels einer Wegsteuerung die Kraft eingestellt werden, mit welcher die Kartusche gegen den Kühlkörper 51 , 55 gedrückt wird.
Die Linearantriebe 53, 63 und 65 sind derart ausgebildet, dass sie aktiv zurückgezogen werden können, um die Kartusche auszutauschen.
Bei dieser Vorrichtung ist vorteilhaft, dass lediglich die im Vergleich zur übrigen Kühlein- richtung kleine Kartusche 28 bewegt wird.
Um bestimmte Temperaturprofile auszuführen, deren kühlste Temperaturen etwa 10°C bis 20°C über Raumtemperatur liegen, ist es nicht notwendig, aktiv zu kühlen. Hierzu genügt es, am Kühlstempel eine Kühleinheit in Form von Kühlrippen oder dergleichen vorzusehen, an welchen die vom Kühlstempel aufgenommene Wärme über Konvektion und Strahlung abgeben wird. Die Kühlraten sind bei solchen Vorrichtungen prinzipbedingt geringer als bei einer aktiven Kühlung. Aber eine solche Kühleinheit würde der Anforderungen vieler in der Praxis verwendete Temperaturzyklen genügen. Als Kühleinheiten sind auch andere Systeme einzeln oder in Kombination möglich, wie z. B. ei- ne Wasserkühlung oder die Erzeugung sehr kalter Luft mittels eines Wirbelrohres, das an den Kühlstempel geblasen wird.
Kombinierte Heiz-/Kühleinrichtung : Fig. 19 und 20 zeigen jeweils eine kombinierte Heiz-/Kühleinrichtung zum Beheizen und Kühlen der Reaktionskammer 5 der Kartusche 28 bzw. einer anderen Kartusche 71 , die wiederum eine Reaktionskammer 5 zur Aufnahme eines Biochips 6 aufweist, jedoch nicht mit eigenen Heizmitteln versehen ist. Die Reaktionskammer 5 ist in einem Teilbereich von einer dünnen Platte 72 aus gut wärmeleitendem Material begrenzt, die biegsam ausgebildet sein kann. Die Platte 72 liegt frei mit ihrer von der Reaktionskammer abgewandten Seite, so dass sie von der Heiz-/Kühleinrichtung 70 berührt werden kann.
Die Heiz-/Kühleinrichtung 70 weist einen Heizstempel 73 mit einer zur Platte 72 weisenden Kontaktfläche 74 auf. Der Heizstempel 73 ist aus Metall ausgebildet und mit einem Heizmittel 75, wie z. B. mit um den Heizstempel 73 gewickelten Heizdrähten, versehen. Das Heizmittel 75 ist mit einer Steuereinrichtung (nicht dargestellt) verbunden, mit welcher der Heizstempel 73 auf eine vorbestimmte Temperatur beheizt werden kann. An der Kontaktfläche 74 ist ein Temperatursensor 76 angeordnet, der die Temperatur der Kontaktfläche 74 erfasst. Der Temperatursensor ist auch mit der Steuereinrichtung verbunden, so dass die Steuereinrichtung die Temperatur des Heizstempels 73 regeln kann. Der Heizstempel 73 ist über eine Achse 77 mit einem Linearantrieb 78 verbunden, mit welchem der Heizstempel 73 zur Platte 72 bewegt werden kann, bis er diese mit einem vorbestimmten Druck berührt oder von der Platte 72 der Kartusche 71 weggezogen werden kann, so dass ein vorbestimmter Luftspalt zwischen dem Heizstempel 73 und der Platte 72 besteht.
Auf der Achse 77 lagert beweglich ein Kühlstempel 79, der die Achse 77 umschließt. Der Kühlstempel 79 ist aus Metall ausgebildet und in Längsrichtung der Achse 77 verschieblich angeordnet. Der Kühlstempel 79 ist mit einem weiteren Linearantrieb 80 verbunden, mit welchem die Position des Kühlstempels 79 auf der Achse 77 einstellbar ist. Der Kühlstempel 79 kann durch den Linearantrieb 80 in Richtung zum Heizstempel 73 bewegt werden, bis der Kühlstempel 79 den Heizstempel 73 an seiner von der Kontakt- fläche 74 abgewandten Seite unter Druck berührt. Der Kühlstempel 79 kann auch vom Heizstempel 73 derart entfernt werden, dass dazwischen ein Luftspalt ausgebildet ist. Am Kühlstempel 79 ist eine Kühleinheit 81 mit einem Peltier-Element, Kühlkörper und Lüfter angeordnet, um den Kühlstempel auf eine vorbestimmte Temperatur zu kühlen.
Der Kühlstempel 79 weist eine wesentlich größere Masse und Volumen als der Heizstempel 73 auf. Dadurch besitzt der Kühlstempel 79 eine wesentlich größere Wärmekapazität als der Heizstempel 73. Dies hat zur Folge, dass wenn der Kühlstempel 79 den Heizstempel 73 berührt, dieser zusammengesetzte Stempel thermisch vom Kühlstem- pel dominiert wird und als ein die Reaktionskammer kühlender Stempel wirkt. Das Volumen und die Masse des Heizstempels 73 ist gering. Hierdurch kann der Heizstempel 73 mit geringer Energie auf vorbestimmte Temperaturen aufgeheizt werden.
Der Kühlstempel 79 wird auf einer vergleichsweise geringen Temperatur mittels der Kühleinheit 81 gehalten.
Soll in dieser Heiz-/Kühleinrichtung ein vorbestimmter Temperaturzyklus abgefahren werden, so wird während der Heizphasen der Heizstempel 73 gegen die Platte 72 der Kartusche 71 gedrückt. Hierbei ist der Kühlstempel 79 mit Abstand zum Heizstempel 73 angeordnet. Der Heizstempel 73 wird mittel seines Heizmittels 75 geheizt, bis an der Grenzfläche zwischen der Kontaktfläche 74 und der Platte 72 die gewünschte Temperatur eingestellt ist.
Bei Kühlphasen wird das Heizmittel 75 ausgeschaltet und der Kühlstempel 79 durch den Linearantrieb 80 gegen den Heizstempel 73 gedrückt. Der Heizstempel 73 steht wiederum in Kontakt mit der Platte 72 der Kartusche 71. Aufgrund der wesentlich größeren Wärmekapazität des Kühlstempels 79 gegenüber der Wärmekapazität des Heizstempels 73 wird dem Heizstempel 73 schnell viel Wärme entzogen, wodurch der Heiz- Stempel abkühlt und als Kühlmittel für die Reaktionskammer 5 der Kartusche 71 dient. Auch während der Kühlphase wird die Temperatur an der Grenzfläche zwischen dem Heizstempel 73 und der Platte 72 vom Temperatursensor 76 überwacht. Ist die gewünschte Temperatur erzielt, so werden sowohl Heizstempel 73 als auch Kühlstempel 79 vom Linearantrieb 78 zurückgezogen oder es wird lediglich der Kühlstempel 79 zu- rückgezogen und dem Heizstempel 73 wird mittels des Heizmittels 75 Wärme zugeführt, falls die Temperatur der Reaktionskammer 5 über der Raumtemperatur gehalten werden muss. Soll die Temperatur der Reaktionskammer unterhalb der Raumtemperatur gehalten werden, dann kann es auch zweckmäßig sein, wenn der Heizstempel 73 weiterhin an der Reaktionskammer 5 anliegt und gleichzeitig der Kühlstempel 79 den Heizstempel 73 berührt. Durch Energiezufuhr vom Heizmittel 75 kann der Wärmestrom von - bzw. zur Reaktionskammer 5 derart gesteuert werden, dass deren Temperatur konstant gehalten wird.
Es ist vorteilhaft, wenn die Berührungsfläche zwischen dem Heizstempel 73 und dem Kühlstempel 79 möglichst großflächig ausgebildet ist, da dann ein hoher Wärmefluss ermöglicht wird. Eine zweite Ausführungsform einer Heiz-/Kühleinhchtung 82 ist in Fig. 20 gezeigt. Diese zweite Ausführungsform unterscheidet sich etwas von der in Fig. 19 gezeigten Ausführungsform. Sie dient auch zum Berühren einer Kartusche 71 mit einer Platte 72 mittels eines Heizstempels 83 mit einer Kontaktfläche 84. Der Heizstempel 83 ist wiederum mit einem Heizmittel 85 und einem Temperatursensor 86 auf der Kontaktfläche 84 versehen. Der Heizstempel 83 ist auf einer Achse 87 angeordnet, die mit einem ersten Linearantrieb 88 verbunden ist, mit dem der Heizstempel mit der Platte 72 in Berührung gebracht werden kann und von dieser wegbewegt werden kann. An der Achse 87 ist ein Kühlstempel 89 beweglich angeordnet, der wiederum mit einem Linearantrieb 90 in Verbindung ist, so dass der Kühlstempel 89 mit dem Heizstempel 83 in Berührung gebracht werden kann. Am Kühlstempel 89 ist eine Kühleinheit 91 angeordnet, mit welcher der Kühlstempel 89 auf eine vorbestimmte Temperatur gekühlt und auf dieser Temperatur gehalten werden kann. Weiterhin ist auf der Achse 87 ein Zusatzheizstempel 92 in Axialrichtung beweglich angeordnet. Der Zusatzheizstempel 92 ist mit einem weiteren Linearantrieb 93 verbunden, so dass der Zusatzheizstempel 92 mit dem Heizstempel 83 in Berührung gebracht werden kann oder von diesem entfernt werden kann. Der Zusatzheizstempel 92 ist mit einem Heizmittel 94 versehen, wie z. B. einer Wicklung aus Heizdrähten, um auf eine vorbestimmte Temperatur geheizt zu werden.
Das Volumen und die Masse des Kühlstempels 89 bzw. des Zusatzheizstempels 92 sind größer als die des Heizstempels 83. Während einer Heiz- bzw. Kühlphase wird der Zusatzheizstempel 92 bzw. der Kühlstempel 89 mit dem Heizstempel 83 in Berührung gebracht, um so den Heizstempel 83 schnell auf eine vorbestimmte Temperatur zu heizen bzw. auf eine vorbestimmte Temperatur abzukühlen. Im Übrigen funktioniert diese kombinierte Heiz-/Kühleinrichtung 82 genauso wie die in Figur 19 gezeigt Heiz/- Kühleinrichtung 70.
Diese beiden Heiz-/Kühleinrichtungen können noch mit einem Stößel (nicht dargestellt) versehen werden, der sich durch die Achsen 77 bzw. 87 erstreckt und die Platte 72, falls sie flexibel ausgebildet ist, beaufschlagen kann, um den Biochip gegen ein gegenüberliegendes Detektionsfenster (nicht dargestellt) zu drücken.
Diese beiden kombinierten Heiz-/Kühleinhchtung werden vorzugsweise mit einer Kartusche 71 verwendet, die eine starre Platte 72 aus einem gut wärmeleitenden Material aufweist, um eine schnelle Wärmeübertragung zwischen der Reaktionskammer und dem Heizstempel zu ermöglichen. Hierbei ist das der Platte 72 gegenüberliegende Detektionsfenster elastisch ausgebildet, wobei beim Lesen des Biochips die Detektionsein- richtung (nicht dargestellt) mit einer durchsichtigen Platte gegen das Detektionsfenster gedrückt wird, so dass dieses auf dem Biochip 6 aufliegt. Hierdurch wird Probenflüssigkeit zwischen dem Biochip 6 und dem Detektionsfenster verdrängt und die einzelnen Spots des Biochips können zuverlässig abgetastet werden. Ein solches Detektionsfenster kann aus einem transparenten, elastischen Kunststoffmaterial ausgebildet sein.
Bildaufnahme:
Nach durchgeführter temperaturgesteuerter biologischer Nachweisreaktion wird bei Verwendung der Kartusche mit Flex-Leiterplatte 10 die Flex-Leiterplatte durch Andrücken des Stößels 55 elastisch verformt, so dass der aufgeklebte Biochip an die Detekti- onsfläche drückt (Abb. 6). Um den Luftdruck im Ausgleichsraum 2 zu überwinden, muss eine Kraft F0 aufgewendet werden. Bei einer Fläche von ca. 0,5 cm2 benötigt man nur ca. 5 N um einen Druck von 1 bar aufzubauen. Zusätzlich muss noch eine bestimmte Kraft F1 aufgewendet werden, um die elastische Flex-Leiterplatte 10 mit aufgebrachten Biochip 6 mittels des Stößels 55 so zu verformen, dass der Biochip 6 gleichmäßig an die Detektionsfläche gedrückt wird. Die Summe der Kräfte F0 + F1 soll nicht über 30 N liegen.
Beim Stößeln wird die überstehende, Farbstoffmoleküle enthaltende Probenflüssigkeit, der Flüssigkeitsüberstand, zwischen Biochip und Detektionsfläche weggedrückt. Sie strömt durch den Ausgleichskanal 4 in den Ausgleichsraum 2. Eine Beleuchtungseinheit eines Optikmoduls (nicht dargestellt) regt nur noch die auf dem Biochip gebundenen Farbstoffmoleküle zur Fluoreszenz an. Die Beleuchtungs- und Detektionseinheit des Optikmoduls detektiert nach dem Stößeln nur das Fluoreszenzlicht der auf dem Biochip gebundenen Farbstoffmoleküle. Ein geeignetes Optikmodul ist in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP2007/054823 beschrieben, auf die hier Bezug genommen wird.
Ohne spezielle Blendenausführung im Optikmodul erfolgt die Ausleuchtung des Biochips im Reaktionsraum dabei kreisförmig. Es wird nicht nur der rechteckige Biochip 6 beleuchtet, sondern auch Bereiche 5.1 des Reaktionsraumes neben dem Biochip in denen eine farbstoffhaltige Probenflüssigkeit 26 nicht verdrängt wurde (Fig. 9). Diese Be- reiche fluoreszieren intensiv. Bei der optischen Abbildung des Biochips durch das Optikmodul auf einen Detektor erscheinen diese Bereiche zwar außerhalb des Biochips, aber infolge der hohen Farbstoffkonzentration der Probenflüssigkeit neben dem Biochip streut ein Teil des Fluoreszenzlichtes auch in Richtung Biochip und auf die Reaktions- felder (Spots). Der Detektor detektiert neben der Fluoreszenzstrahlung der Spots durch die direkte Beleuchtung auch die indirekte Fluoreszenzstreustrahlung aus den Bereichen neben dem Biochip. Damit erhält das Bild der Spots auf dem Biochips eine lokale inhomogene, die Bildauswertung störende Untergrundbeleuchtung.
Mittels einer rechteckigen Blende 18, 19, die auf dem Grundkörper über der Reaktionskammer 5 aufgebracht, oder in diesen integriert ist und geometrische Abmessungen etwas kleiner als der Biochip (Fig. 7, 8) aufweist, wird die optische Fluoreszenzanregung des Farbstoffes im Reaktionsraum neben dem Biochip verhindert.
Diese Blende 18 kann beim Sphtzguss eines transparenten Grundkörpers 1 als optisch absorbierende Blende (Fig. 8) oder beim Spritzguss eines nichttransparenten Grundkörpers als transparente optische Blende 19 bzw. Detektionsfenster 14 eingebracht werden (Fig. 7). Die Blende kann auch nachträglich auf das optische Beobachtungs- fenster (Detektionsfläche) aufgebracht werden.
Die Transmission der Blendenschicht sollte kleiner als 10"2 sein.
Wiederholtes Durchführen der temperaturgesteuerten biologischen Nachweisre- aktionen
Im Gegensatz zu bekannten Vorrichtungen (z.B. DE 10 2004 022 263 A1 ), bei der die Probenflüssigkeit vor der Bildaufnahme durch den Stößelvorgang irreversibel aus einem Reaktionsraum verdrängt wird, besteht in der erfindungsgemäßen Kartusche 28 die Möglichkeit, nach erfolgter Bildaufnahme die temperaturgesteuerte biologische Nachweisreaktion weiterzuführen. Wird der Stößel 55 zurückgefahren, weicht die Flex- Leiterplatte 10 infolge des Überdrucks in der Reaktionskammer 5 und dem Ausgleichsraum 2 zurück und die Probenflüssigkeit aus dem Ausgleichsraum 2 fließt zurück in die Reaktionskammer 5, auch zwischen den Biochip 6 und das Deckglas. Damit kann auch nach erfolgter Detektion die temperaturgesteuerte biologische Nachweisreaktion fortgeführt werden.
Prinzipiell kann mit der erfindungsgemäßen Kartusche zu jedem Zeitpunkt der biologischen Reaktion eine Detektion der Spots auf dem Biochip vorgenommen werden.
Auslesen und Einschreiben von Daten: Alle Informationen über die Kartusche, einschließlich Biochip, müssen vom Biochipreader ausgelesen werden. Zum Ansteuern exakter Temperaturen bei der Durchführung Fahren der temperaturgesteuerten biologischen Nachweisreaktion werden die für eine bestimmte Flex-Leiterplatte spezifischen Kalibrierungsdaten des Heizers auf der Flex- Leiterplatte benötigt. Auch die Informationen über die auf den Biochip aufgebrachten Reaktionsfelder (Spots), ID-Nummem, Belichtungszeiten für die Bildaufnahme, usw., müssen vom Reader ausgelesen werden, um die temperaturgesteuerte biologische Reaktion zu steuern und eine Protokollierung und Archivierung zu ermöglichen.
Die notwendigen Informationen können als Dot-Code oder als Bar-Code auf die Kartusche aufgebracht werden. Zum Auslesen dieser Codes benötigt man einen Dot-Code- Reader (oder Bar-Code-Reader). Ein Speichern aktueller Daten ist damit nicht möglich.
Flexibler ist der Einsatz von beschreibbaren und auslesbaren manipulationssicheren Speichermedien 10.2 die vorteilhafterweise auf der Flex-Leiterplate integriert sind.
Neben der Kontaktflächen 10.1 der Heiz-/Messstruktur kann auch die Kontaktierung eines elektrisch programmierbaren nichtflüchtigen Speichers auf der Flex-LP erfolgen (Fig. 3). Damit können Informationen digital abgespeichert und zu jedem Zeitpunkt ab- gefragt werden. Die speicherbare Datenmenge ist dabei deutlich größer als bei aufgebrachten Bar- oder Dotcodes.
Bei einem kontaktierten elektrisch programmierbaren nichtflüchtigen Speicher können auch Informationen während der PCR oder beim Auslesen des Biochips gespeichert werden. Außerdem können die Daten manipulationssicher gespeichert werden. Nach einer erfolgten Prozessierung kann die Kartusche auch als „prozessiert" markiert werden um eine erneute, ungewollte Prozessierung zu verhindern.
Bezugszeichenliste
1 Grundkörper
1.1 transparenter Grundkörper
1.2 nichttransparenter Grundkörper
2 Ausgleichsraum
3 Kontrollfenster
4 Ausgleichskanal
5 Reaktionskammer
5.1 ausgeleuchtete Fläche
6 Biochip
6.1 Reaktionsfelder (Spots)
6.2 Rückbeschichtung
7 Befüllkanal
8 Rückschlagventil
9 Befüllöffnung
10 Flex-LP
10.1 Kontaktflächen Flex-LP
10.2 Speichermedium
10.3 Heiz-/Messstruktur Flex-LP
1 1 Inlay
12 Stößel
13 Membran
14 Detektionsfenster
15
16 Haftverbindungsschicht
17 Trägerschicht
18 Blende (nichtransparent)
19 Einfüllkanüle
20 Druckausgleichsskanüle
21 Temperaturhomogenisierungsschicht
22 Dichtung
23 Deckglas
24 Stabilisierungsscheibe
25 Kartuschengrundkörper
26 Probenflüssigkeit
27 Optikmodul
28 Kartusche 28.1 obere Hälfte des Kartuschengehäuses
28.2 untere Hälfte des Kartuschengehäuses
29.1 Aussparung in 28.1
29.2 Aussparung in 28.2
30.1 Leiterbahn (Heizstrom)
30.2 Leiterbahn (Heizstrom)
31.1 Leiterbahn (Messstrom)
31.2 Leiterbahn (Messstrom)
32 Leiterbahn
33 Kontaktstelle
34 Kontaktstelle
35 Strommesswiderstand
36 Stromquelle
37 Messkanal
38 Messkanal
39 Impedanzwandler
40 Operationsverstärker
41 Anti-Aliasing-Filter
42 A/D-Wandler
43 Steuereinrichtung
44 Leitung
50 Kühleinrichtung
51 Kühlstempel
52 Kühleinheit
53 Linearantrieb
54 Kühlfläche
55 Stößel
56 Kühlelement
57 Lüfter
58 Kühlkörper
59 Buchse
60 Endkörper
61 Feder
62 Kunststoff ring
63 Linearantrieb
64 Feder
65 Linearantrieb
66 Feder 70 Heiz-/Kühleinrichtung
71 Kartusche
72 Platte
73 Heizstempel 74 Kontaktfläche
75 Heizmittel
76 Temperatursensor
77 Achse
78 Linearantrieb 79 Kühlstempel
80 Linearantrieb
81 Kühleinheit
82 Heiz-/Kühleinhchtung
83 Heizstempel 84 Kontaktfläche
85 Heizmittel
86 Temperatursensor
87 Achse
88 Linearantrieb 89 Kühlstempel
90 Linearantrieb
91 Kühleinheit
92 Zusatzheizstempel
93 Linearantrieb 94 Heizmittel

Claims

Patentansprüche
1. Beheizbare Reaktionskammer zum Prozessieren eines Biochips, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskammer (5) eine aus einer flexiblen Leiterplatte (10) ausgebildete Kammerwand aufweist, wobei auf der flexiblen Leiterplatte (10) eine als Heizeinrichtung dienende Leiterbahn (10.3) ausgebildet ist.
2. Beheizbare Reaktionskammer nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Heiz-Leiterbahn (10.3) mit einer Mess- und Steuereinrichtung verbunden ist, die derart ausgebildet ist, dass die Heiz-Leiterbahn sowohl zum Heizen als auch zum Messen der Temperatur angesteuert wird.
3. Beheizbare Reaktionskammer nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mess- und Steuereinrichtung zum gleichzeitigen Messen und Heizen mittels der Heiz-Leiterbahn (10.3) ausgebildet ist.
4. Beheizbare Reaktionskammer nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Mess- und Steuereinrichtung zwei Messkanäle (37, 38) zum Messen der Heizspannung und zum Messen des Heizstromes aufweist, die im wesentlichen i- dentisch ausgebildet sind.
5. Beheizbare Reaktionskammer nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Messkanäle jeweils eine AD-Wandler aufweisen, der Bestandteil eines synchronen Zwei-Kanal A/D-Wandlers ist.
6. Beheizbare Reaktionskammer nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mess- und Steuereinrichtung zum Abgreifen der an der Heiz-Leiterbahn (10.3) abfallenden Spannung und der an einem zur Heiz-Leitung (10.3) in Serie geschalteten Strommesswiderstand (35) geschaltet ist.
7. Beheizbare Reaktionskammer nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Mess- und Steuereinrichtung zum Abtasten der Temperatur mit einer Abtastrate von zumindest 1000 Hz bzw. etwa 3000 Hz ausgebildet ist.
8. Beheizbare Reaktionskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Heiz-Leiterbahn an der von der Reaktionskammer (5) abgewandten Seite der flexiblen Leiterplatte (10) angeordnet ist, und auf der nach innen zur Reaktionskammer (5) weisenden Seite der flexiblen Leiterplatte (10) eine Temperaturhomogenisierungsschicht (21 ) aus einem gut wärmeleitenden Material, insbesondere einem Metall, vorgesehen ist.
9. Beheizbare Reaktionskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Heiz-Leiterbahn (10.3) eine kreuzungsfreie Form, wie z. B. eine Mäan- derform oder die Form einer Doppelspirale, aufweist.
10. Beheizbare Reaktionskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Heiz-Leiterbahn (10.3) bei Raumtemperatur einen Widerstand von ca. 5 bis 100 Ohm aufweist.
1 1. Beheizbare Reaktionskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Heiz-Leiterbahn (10.3) aus Kupfer, vorzugsweise mit einer Reinheit von zumindest 99%, ausgebildet ist.
12. Beheizbare Reaktionskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass auf der flexiblen Leiterplatte (10) ein Halbleiterspeicher zum Speichern der für die jeweilige Reaktionskammer (5) spezifischen Daten angeordnet ist, der über
Leiterbahnen (32) mit einer Steuereinrichtung (43) zum Ansteuern des Heiz- und Messstromes ausgebildet ist.
13. Beheizbare Reaktionskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Biochip (6) im Bereich der Heiz-Leiterbahn (10.3) mit der flexiblen Leiterplatte verbunden ist.
14. Beheizbare Reaktionskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Heiz-Leiterbahn (10.3) über einen Bereich erstreckt, der größer als der Biochip (6) ist.
15. Beheizbare Reaktionskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskammer (5) Bestandteil einer Kartusche ist, in der ein Ausgleichsraum (2) ausgebildet ist, der mit der Reaktionskammer (5) über einen Aus- gleichskanal (4) kommunizierend verbunden ist.
16. Beheizbare Reaktionskammer nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass im Ausgleichskanal (4) ein Sichtfenster ausgebildet ist.
17. Beheizbare Reaktionskammer nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kartusche eine Befüllöffnung (9) ausgebildet ist, in der ein Rückschlagventil (8) angeordnet ist, und die Befüllöffnung (9) mit der Reaktionskammer (5) mittels eines Befüllkanals (7) kommunizierend verbunden sind.
18. Beheizbare Reaktionskammer nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Befüllöffnung (9) und dem Ausgleichsraum (2) ein kommunizie- render Fluidkanal ausgebildet ist, der in sich abgeschlossen ist.
19. Beheizbare Reaktionskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kühleinrichtung vorgesehen ist, die einen Kühlstempel (51 ;73; 79; 83; 89) aufweist, der zum Kühlen der Reaktionskammer (5) mit dieser in Berührung gebracht werden kann.
20. Beheizbare Reaktionskammer nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Kühleinrichtung einen Antrieb zum automatischen Bewegen des Kühlstempels aufweist, so dass dieser mit einer Kühlfläche die flexible Leiterplatte berühren kann.
21. Verfahren zum Ansteuern einer beheizbaren Reaktionskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass während einer Heizphase durch die Heiz-Leiterbahn ein Strom zum gleichzei- tigen Heizen und Messen der Temperatur geleitet wird.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass mit einer Abtastrate von zumindest 1000 Hz bzw. etwa 3000 Hz die Tempe- raturmessung ausgeführt wird.
23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass innerhalb eines vorbestimmten Temperaturintervalls um eine Soll-Temperatur ein Proportional-Integral-Regler und außerhalb dieses Temperaturintervalls ein
Proportional-Regler verwendet wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass eine Stellgröße anhand der Differenz aus einer Soll-Temperatur und einer Ist-
Temperatur ermittelt wird, und falls die Stellgröße kleiner als ein vorbestimmtes Minimum ist, wird der Kühlstempel gegen die Reaktionskammer gedrückt.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass wenn die Stellgröße kleiner als Null und größer als das Minimum ist, wird der Kühlstempel mit Abstand zur Reaktionskammer angeordnet.
26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass wenn die Stellgröße größer als Null ist die Reaktionskammer geheizt wird.
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