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Die
Erfindung betrifft eine beheizbare Reaktionskammer zum Prozessieren
eines Biochips.
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Ein
Biochip weist ein in der Regel ebenflächiges Substrat mit unterschiedlichen
Fängermolekülen auf,
die an auf der Oberfläche
des Substrates vorbestimmten Punkten, den Spots, angeordnet sind.
Eine mit einer Markierung versehene Probensubstanz reagiert mit
bestimmten Fängermolekülen nach
dem Schlüssel-Schloss-Prinzip.
Meistens bestehen die Fängermoleküle aus DNA-Sequenzen
(siehe z. B.
EP 373
203 B1 ) oder Proteinen. Derartige Biochips werden auch
Arrays bzw. DNA-Arrays genannt. Die Markierungen sind oftmals Fluoreszenz-Marker.
Mit einem optischen Lesegerät
wird die Fluoreszenz-Intensität
der einzelnen Spots erfasst. Diese Intensität korreliert mit der Anzahl
der mit den Fängermolekülen immobilisierten
markierten Probenmoleküle.
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Aus
der
WO 2005/108604
A2 bzw. der
DE
10 2004 022 263 A1 geht eine beheizbare Reaktionskammer
zum Prozessieren eines Biochips hervor. Diese Reaktionskammer weist
eine elastische Membran auf. Auf der Membran ist ein Silizium-Biochip angeordnet.
Als Heizeinrichtung ist eine Nickel-Chrom-Dünnfilm-Leiterbahn vorgesehen.
Derartige Nickel-Chrom-Dünnfilm-Leiterbahnen
besitzen einen hohen elektrischen Widerstand und eine dementsprechend
hohe Heizleistung. Neben der Leiterbahn für die Widerstandsheizung ist
eine zusätzlich Leiterbahn
zur Temperaturmessung vorgesehen.
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Bei
dieser bekannten Reaktionskammer (10, 11)
ist eine Gehäusewandung
als Membran ausgebildet, damit der Biochip 6 mittels eines
Stößels 12 gegen
ein der Membran 13 gegenüberliegendes Deckglas 23 gedrückt werden
kann. Hierdurch wird eine in der Reaktionskammer befindliche Reaktionsflüssigkeit 26 von
der Oberfläche
des Biochips verdrängt
und stört
nicht bei der optischen Detektion. Zwischen der Membran 13 und
dem Deckglas 23 ist eine Dichtung 22 angeordnet.
Die Probenflüssigkeit 26 wird
mittels einer Einfüllkanüle 19,
die durch die Dichtung 22 gestoßen wird, eingefüllt. Beim Stößeln wird
mittels einer Druckausgleichskanüle 20 überschüssige Probenflüssigkeit 26 aus
der Reaktionskammer 5.2 abgeleitet.
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In
der
WO 01/02 094 A1 werden
Mittel zur Temperaturbeaufschlagung von Biochips beschrieben, die
mikrostrukturierte Widerstandsheizleitungen umfassen.
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In
der
US 5,759,846 und
der
US 6,130,056 ist
jeweils eine Reaktionskammer zur Aufnahme von biologischen Geweben
beschrieben. In der Reaktionskammer befindet sich eine flexible
Leiterplatte mit Elektroden. Durch Zusammendrücken des biologischen Gewebes
und der flexiblen Leiterplatte kann ein elektrischer Kontakt zwischen
dem biologischen Gewebe und den Elektroden der flexiblen Leiterplatte hergestellt
werden, so dass an dem biologischen Gewebe unmittelbar ein elektrischer
Abgriff erfolgen kann.
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In
der
DE 10 2005
019 195 A1 ist eine chemische Reaktionspatrone mit mehreren
Kammern beschrieben. Durch Abrollen einer Walze an der Oberfläche der
Patrone können
Flüssigkeiten
von einer Kammer in eine weitere Kammer befördert werden. Weiterhin ist
eine Metallstange vorgesehen, mit welcher Druck, Schwingung, Hitze,
Kühle oder ähnliches
auf die Patrone ausgeübt
werden kann, um die chemische Reaktion in der Patrone zu beschleunigen.
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Aus
K. Shen et al. Sensors and Actuators B 105 (2005), Seiten 251–258, „A Microchip-based PCR
device using flexible printed circuit technology” ist es bekannt eine flexible
Leiterplatte zum Heizen einer Reaktionskammer zu verwenden, die
für ein PCR
Verfahren vorgesehen ist. Die Reaktionskammer besteht aus einer
Glasplatte, einem Rahmen und einer Kunststoffabdeckung. Auf der
Außenseite
der Glasplatte ist die flexible Leiterplatte entweder unmittelbar
mittels einer Klebeverbindung oder mittels eines dazwischen befindlichen
Kupferchips angeordnet. Aufgrund der guten thermischen Eigenschaften der
flexiblen Leiterplatte wurden Heizraten von 8°C/s erzielt. Auf der flexiblen
Leiterplatte ist eine Leiterbahn ausgebildet, die sowohl zum Heizen
als auch zum Messen der Temperatur verwendet wird. Das Heizen erfolgt
während
eines „Heating
state” und
das Messen der Temperatur während
eines „Sensing
state”,
die zeitlich versetzt durchgeführt
werden.
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine einfache, kostengünstige beheizbare
Reaktionskammer zum Prozessieren eines Biochips zu schaffen, mit
der zum einen sehr effizient geheizt werden kann und zum anderen
das aus der
WO 2005/108604
A2 bekannte Stößeln möglich ist.
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Die
Aufgabe wird durch eine beheizbare Reaktionskammer mit den Merkmalen
des Anspruchs 1 gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Reaktionskammer sind in den jeweiligen
Unteransprüchen
angegeben.
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Die
beheizbare Reaktionskammer zum Prozessieren eines Biochips weist
eine aus einer flexiblen Leiterplatte ausgebildete Kammerwand auf.
Auf der flexiblen Leiterplatte ist eine als Heizeinrichtung dienende
Leiterbahn ausgebildet, die im Folgenden als Heiz-Leiterbahn bezeichnet
wird. Die flexible Leiterplatte dient einerseits als flexible Membran,
die von einem Stößel betätigt werden
kann, um auf einen darauf angeordneten Biochip gegen ein gegenüberliegendes
Sichtfenster der Reaktionskammer zu drücken. Andererseits dient die
flexible Leiterplatte gleichzeitig als Heizeinrichtung, da durch
die darauf befindliche Heiz-Leiterbahn ein Heizstrom geleitet werden
kann, der eine Wärme
erzeugt, die an die Reaktionskammer abgegeben wird.
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Die
Heiz-Leiterbahn ist mäanderförmig ausgebildet,
so dass sie gleichmäßig eine
vorbestimmte Fläche
abdeckt, wobei die Leiterbahn über
ihre gesamte Länge
eine konstante Dicke und Breite aufweist. Die Heizleiterbahn kann
auch mit der Form einer Doppelspirale verlaufen. Vorteilhaft ist,
dass die Leiterbahn kreuzungsfrei ausgebildet ist, damit sie aus
einer Kupferlage hergestellt werden kann.
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Da
die flexible Leiterplatte zwei Funktionen (elastische Membran, Heizeinrichtung)
in sich vereint, kann gegenüber
herkömmlichen
beheizbaren Reaktionskammern zum Prozessieren eines Biochips ein
Bauteil entfallen. Dies führt
zu einer wesentlichen Minderung der Wärmekapazität im Bereich der Kammerwand,
an der die Heizeinrichtung vorhanden ist. Dadurch wird der Wärmeübertrag
auf den Biochip wesentlich effizienter als dies bei bekannten beheizbaren
Reaktionskammern der Fall ist. Hierbei ist insbesondere zu berücksichtigen,
dass flexible Leiterplatten grundsätzlich sehr dünn sind
und selbst nur eine geringe Wärmekapazität besitzen.
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Die
beheizbare Reaktionskammer weist eine Mess- und Steuereinrichtung
auf, die derart ausgebildet ist, dass die Heiz-Leiterbahn der flexiblen Leiterplatte
sowohl zum Heizen als auch zum Messen der Temperatur verwendet wird.
Hierdurch ist es möglich, in
dem Bereich in dem der Biochip in der Reaktionskammer auf der flexiblen
Leiterplatte angeordnet ist, gleichmäßig die Leiterbahn in mäanderförmig verlaufende
Schleifen zu verlegen, so dass der Biochip gleichmäßig über seiner
gesamten Fläche
beheizt wird.
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Die
Messeinrichtung weist zwei identische Messkanäle auf, die zum Messen des
Stromes bzw. der Spannung an der als Heizeinrichtung dienenden Leiterbahn
vorgesehen sind. Da sowohl der Strom als auch die Spannung an der
Heiz-Leiterbahn
gemessen werden, kann die Heiz-Leiterbahn gleichzeitig zum Messen
als auch zum Heizen verwendet werden, da der Strom entsprechend
der geforderten Heizleistung variiert werden kann.
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Die
als Heizeinrichtung dienende Heiz-Leiterbahn auf der flexiblen Leiterplatte
ist mit einem Widerstand von etwa 5 bis 10 Ohm bei Raumtemperatur ausgebildet.
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Die
Heiz-Leiterbahn auf der flexiblen Leiterplatte ist vorzugsweise
aus Kupfer ausgebildet, da die Kupfer-Leiterbahnen zum einen kostengünstig und
zum anderen sehr präzise
herstellbar sind. Die Heiz-Leiterbahn aus Kupfer weist vorzugsweise
zumindest eine Reinheit von 99% auf, da der Temperaturkoeffizient
von reinem Kupfer im hier relevanten Temperaturbereich sehr konstant
ist.
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Die
Messung der Spannung an der als Heizeinrichtung dienenden Leiterbahn
erfolgt vorzugsweise mittels einer vier-Punkt-Messung.
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Die
flexible Leiterplatte kann mit zwei leitenden Lagen ausgebildet
sein, wobei die eine leitende Lage als Leiterbahn ausgebildet ist,
die als Heizeinrichtung dient und die andere leitende Lage mit einer flächigen,
den gesamten beheizten Bereich abdeckenden leitenden Schicht, insbesondere
Kupferschicht, ausgebildet ist, so dass die erzeugte Wärme schnell
und gleichmäßig auf
der gesamten zu beheizenden Fläche
verteilt wird.
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Bei
der beheizbaren Reaktionskammer wird die Heiz-Leiterbahn der flexiblen
Leiterplatte sowohl zum Heizen der Reaktionskammer als auch zum Messen
der Temperatur mit einem Heiz-/Messstrom versorgt. Hierdurch müssen im
zu heizenden Bereich nicht zwei separate Leiterbahnen zum Heizen
und zum Messen der Temperatur vorgesehen werden, wodurch es möglich ist,
die Leiterbahn gleichmäßig mäanderförmig über den
gesamten zu heizenden Bereich zu verlegen.
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Die
Temperaturmessung erfolgt mit einer Abtastrate von zumindest 1000
Hz bzw. etwa 3000 Hz. Hierdurch wird ein sehr exaktes Einstellen
eines sich zeitlich verändernden
Temperaturprofils möglich.
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Die
Reaktionskammer ist derart ausgebildet, dass innerhalb eines Temperaturintervalls
um eine Soll-Temperatur ein PI-Regler und außerhalb dieses Intervalls ein
P-Regler verwendet wird. Hierdurch wird ein Überschwingen der Temperatur
vermieden und dennoch schnell und präzise die Solltemperatur eingestellt.
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Die
Reaktionskammer wird anhand in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsbeispielen erläutert. Die
Zeichnungen zeigen:
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1 einen
Grundkörper
einer erfindungsgemäßen Kartusche
in einer Ansicht von unten,
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2 eine
Ausführung
der Reaktionsfelder (Spots) auf einem Biochip mit optisch undurchlässiger und
nicht fluoreszierender Rückseite,
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3 ein
Ausführungsbeispiel
einer erfindungsgemäß verwendeten
flexiblen Leiterplatte mit interner Heiz-/Messstruktur und integriertem
EEPROM,
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4 ein
erstes Ausführungsbeispiel
für einen
auf einen Grundkörper
aufgebrachten Biochip mit Flex-Leiterplatte,
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5 ein
zweites Ausführungsbeispiel
für einen
auf einen Grundkörper
aufgebrachten Biochip mit Flex-Leiterplatte,
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6 ein
Ausführungsbeispiel
der erfindungsgemäßen Anordnung
des Inlays mit dem zugehörigen
Optikmodul,
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7 ein
Ausführungsbeispiel
der erfindungsgemäßen Anordnung,
ausgestattet mit einer transparenten Blende in einem nicht transparenten Grundkörper,
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8 ein
Ausführungsbeispiel
der erfindungsgemäßen Kartusche,
ausgestattet mit einer nichttransparenten Blende an einem transparenten Grundkörper,
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9 den
Ausschnitt der ausgeleuchteten Fläche im Probenraum des Inlays
ohne Blende,
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10 das
Verfahrensprinzip des Einfüllens einer
Probenflüssigkeit
durch Kanülen
in den Reaktionsraum nach dem Stand der Technik,
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11 das
Verfahrensprinzip der Verdrängung
des Flüssigkeitsüberstandes
mittels Stößeln nach
dem Stand der Technik,
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12 eine
Kartusche mit Inlay und einer Flex-Leiterplatten-Stabilisierungsscheibe,
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13 ein
bevorzugtes Ausführungsbeispiel eines
Layouts der Flex-Leiterplatte,
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14 eine
Meß- und
Heizelektronik in einem schematisch vereinfachten Schaltbild,
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15 eine
Regelungsverfahren in einem Flußdiagramm,
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16 eine
Kühleinrichtung
in einer schematisch grob vereinfachten Darstellung,
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17 ein
erstes Ausführungsbeispiel
der Kühleinrichtung
in einer schematisch vereinfachten Schnittdarstellung,
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18 ein
zweites Ausführungsbeispiel
der Kühleinrichtung
in einer schematisch vereinfachten Schnittdarstellung,
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19 eine
alternative Heiz-/Kühleinrichtung
zum Beheizen und Kühlen
der Reaktionskammer, und
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20 eine
Abwandlung der Heiz-/Kühleinrichtung
aus 19.
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Kartusche:
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Anhand
der 1–9 und 12 wird eine
Kartusche mit einem Biochip beschrieben.
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Ein
beispielsweise mittels Spritzguss aus Kunststoff hergestellter Grundkörper 1 enthält an der Unterseite
eine Aussparung für
einen Befüllkanal 7, der
von einer Befüllöffnung 9 zu
einer Reaktionskammer 5 führt (1, 6),
und Aussparungen für
die Reaktionskammer 5, einen Ausgleichskanal 4 zwischen
der Reaktionskammer 5 und einem Ausgleichsraum 2 und
eine Aussparung für
den Ausgleichsraum 2. Die Befüllöffnung 9 ist mit einem
sich konisch verjüngenden
Abschnitt ausgebildet (6), der das Einführen einer
Pipettenspitze erleichtert. In der Befüllöffnung ist ein Rückschlagventil 8 angeordnet.
Im Ausgleichskanal 4 befindet sich ein Sichtfenster 3,
durch das erkannt werden kann, ob sich im Ausgleichskanal 4 eine
Probenflüssigkeit
befindet. Zumindest im Bereich der Reaktionskammer 5 ist
der Grundkörper 1 transparent
ausgebildet und bildet somit ein Detektionsfenster 14 durch
das ein darunter angeordneter Biochip 6 detektierbar ist.
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Die
Verbindungskanäle
sind möglichst
kurz und mit einem möglichst
kleinen Querschnitt ausgebildet, damit das Totvolumen klein und
der notwendige Überschuss
an Probenflüssigkeit
gering gehalten wird.
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An
der Unterseite des Grundkörpers 1 befindet
sich eine flexible Leiterplatte 10, die im Folgenden als
Flex-Leiterplatte 10 bezeichnet wird (3). Die
Flex-Leiterplatte 10 ist mit der Unterseite des Grundkörpers 1 derart
verbunden, dass die Aussparungen 7, 5, 4, 3, 2 nach
unten hin begrenzt werden und einen durchgängigen kommunizierenden, in
sich abgeschlossenen Fluidkanal bilden.
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Die
Flex-Leiterplatte 10 enthält Kontaktflächen 10.1,
ein digitales Speichermedium 10.2 (z. B. ein EEPROM) und
eine interne Heiz-/Messstruktur 10.3 (3).
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In
der Reaktionskammer 5 befindet sich ein Biochip 6 (2),
der eine Anzahl M·N
Reaktionsfelder 6.1 aufweist. Zur Vermeidung von optischen Rückreflexen
und unerwünschter
Fluoreszenzstrahlung von der Flex-Leiterplatte 10 ist der
Biochip 6 auf der Rückseite
optisch undurchlässig
und nicht fluoreszierend, z. B. mit Schwarzchrom 6.2 beschichtet. Die
Flex-Leiterplatte 10 bildet eine Begrenzungswand der Reaktionskammer 5.
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Es
wird zuerst der Biochip 6 auf der Flex-Leiterplatte 10 fixiert
und anschließend
die Flex-Leiterplatte 10 mit dem Grundkörper 1 verbunden.
Die Verbindung zwischen der Flex-Leiterplatte 10 und dem Biochip 6 erfolgt
mit einer Haftverbindungsschicht 17, wie z. B. einem geeigneten
Klebeband (geeignet für biologische
Reaktionen) oder mit einem Silikonkleber.
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Anschließend wird
die Flex-Leiterplatte 10 mit dem aufgebrachten Biochip 6 zum
Grundkörper 1 justiert
und an ihm fixiert und bildet ein Inlay 11. Eine dauerhafte,
temperatur- und wasserbeständige
Verbindung kann z. B. mittels biologisch-verträglichen Klebeband, mit Silikonkleber,
durch Laserschweißen, durch
Ultraschallschweißen
oder andere biologisch verträgliche
Klebstoffe realisiert werden.
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Dabei
gibt es die Möglichkeit,
die Flex-Leiterplatte 10 großflächig mit dem Klebeband (oder
Klebstoff) zu beschichten, den Biochip 6 über der Heiz-/Messstruktur 10.3 der
Flex-Leiterplatte aufzukleben, und dann den Grundkörper 1 zum
Biochip 6 zu justieren und die Flex-Leiterplatte 10 über der
gesamten Fläche
des Grundkörpers 1 zu
fixieren (4).
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Eine
zweite Möglichkeit
der Verbindung von Flex-Leiterplatte 10, Biochip 6 und
Grundkörper 1 besteht
in der gezielten flächigen
Verklebung des Biochips 6 mit der Flex-Leiterplatte 10 (Kleber nur
unter dem Biochip) und der anschließenden Fixierung des Grundkörpers 1 nur
außerhalb
der Reaktionskammer 5 (5). Mit
dieser Art der Verklebung ist der Wärmeübergang von der Heiz-/Messstruktur 10.3 in
der Flex-Leiterplatte 10 in die Reaktionskammer 5 effizienter.
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Die
so vormontierte Einheit des Inlays 11, bestehend aus Grundkörper 1,
Biochip 6, Flex-Leiterplatte 10 und Rückschlagventil 8 wird
zur einfacheren Handhabung und Stabilisierung in ein Kartuschengehäuse 28 eingepresst
(12). Das Kartuschengehäuse ist aus einer oberen und
einer unteren Hälfte 28.1, 28.2 ausgebildet,
die einen quaderförmigen Hohlraum
begrenzen, in den das Inlay 11 formschlüssig aufgenommen ist. Die beiden
Hälften 28.1 und 28.2 des
Kartuschengehäuses
weisen jeweils im Bereich der Reaktionskammer 5 eine etwa
rechteckförmige
Aussparung 29.1 bzw. 29.2 auf. In der Aussparung 29.2 der
unteren Hälfte 28.2 des
Kartuschengehäuses
kann eine Stabilisierungsscheibe 24 angeordnet sein, die
an der Flex-Leiterplatte 10 des Inlays 11 anliegt
und etwa mittig eine Öffnung
aufweist, die kleiner als die Aussparung 29.2 der unteren
Hälfte 28.2 des
Kartuschengehäuses
ist. Ob eine Stabilisierungsscheibe 24 zweckmäßig ist,
hängt davon
ab, wie hoch der Druck innerhalb der Reaktionskammer 5 ist
und wie stark die Flex-Leiterplatte hierdurch ausgebogen wird.
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Befüllvorgang:
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Die
Probenflüssigkeit
wird mittels einer Spritze oder Pipette an der Befüllöffnung 9 durch
das Rückschlagventil 8 über den
Befüllkanal 7 in
die Reaktionskammer 5 eingespritzt. Die Probenflüssigkeit füllt zunächst die
Reaktionskammer 5 aus und strömt dann in den Ausgleichskanal 4 und
eventuell in den Ausgleichsraum 2. Die Befüllungsmenge
wird vorzugsweise derart bemessen, dass keine Probenflüssigkeit
in den Ausgleichsraum 2 gelangt. Beim Befüllvorgang
entsteht im Inlay 11 ein Überdruck und die Luft im Ausgleichsraum 2 wird
komprimiert. Durch das Sichtfenster 3 im Ausgleichskanal 4 kann
der Befüllstand überwacht
werden. Da die Volumina des Befüllkanals 7,
der Reaktionskammer 5 und des Ausgleichskanals 4 bekannt
sind, kann mit einem konstanten Flüssigkeitsvolumen, auch ohne
Betrachtung des optischen Fensters, befüllt werden.
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Der
druckdichte Abschluss mit dem Rückschlagventil 8 erzeugt
beim Befüllen
der Kartusche einen Überdruck
in der Reaktionskammer. Die Luft im Ausgleichsraum wird komprimiert.
Mit der Variation der Volumina von Reaktionskammer 5 und
Ausgleichsraum 2 kann der Überdruck gezielt eingestellt werden.
Der Überdruck
liegt im Bereich von 0 bar bis 1 bar. Bei gleichen Volumina der
Reaktionskammer und des Ausgleichsraumes verdoppelt sich der Innendruck
bei der Befüllung.
Während
der Durchführung
der temperaturgesteuerten biologischen Nachweisreaktion können Temperaturen
bis 100°C
auftreten. Die thermische Ausdehnung der Probenflüssigkeit
führt zu
einem Ausweichen in den Ausgleichskanal 4. Beim Abkühlvorgang
zieht sich die Probenflüssigkeit
wieder zurück.
Die Druckunterschiede bei Tmax und Tmin (im kalten und heißen Zustand) sind nur minimal,
da die Luft im Ausgleichsraum 2 komprimiert wird. Das Volumen
des Ausgleichsraums ist deutlich größer als die Volumenzunahme
der Probenflüssigkeit
bei Erwärmung.
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Die
Stabilisierungsscheibe 24 kann eine Ausdehnung der elastischen
Flex-Leiterplatte 10 beim Befüllvorgang minimieren, ohne
die Fähigkeit des
elastischen Andrückens
des Biochips 6 an das Detektionsfenster 14 zu
verlieren (12).
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Eine
Druckerhöhung
um 1 bar in der Kartusche hat den Vorteil, dass der Siedepunkt der
Probenflüssigkeit
von 100°C
auf ca. 125°C
ansteigt. Die Bildung von Luftblasen im Reaktionsraum wird damit minimiert.
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Heizeinrichtung für Temperaturgesteuerte biologischen
Nachweisreaktion:
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Der
Ablauf einer temperaturgesteuerten biologischen Nachweisreaktion
erfordert die Einstellung genauer Temperaturen der Probenflüssigkeit
im Reaktionsraum. Dabei werden bei der Durchführung einer PCR z. B. Temperaturen
zwischen 30°C
und 98°C
angesteuert. Die Temperaturverteilung der Probenflüssigkeit
muss im Reaktionsraum homogen sein und Temperaturänderungen
(Heizen, Kühlen) sollen
schnell erfolgen.
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Auf
der Flex-Leiterplatte 10 befindet sich eine Heiz-/Messstruktur,
die bei Stromführung
durch den ohmschen Widerstand als Heizer wirkt. Damit wird die Probenflüssigkeit
im Reaktionsraum auf die erforderliche Temperatur T erwärmt. Die
Heiz-/Messstruktur kann gleichzeitig als Temperaturdetektor eingesetzt
werden, indem die Widerstandskennlinie R(T) zur Bestimmung der Temperatur
verwendet wird.
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Die
Flex-Leiterplatte 10 mit der integrierten Heiz-Leiterbahn
verursacht lokale Temperaturschwankungen. Direkt über den
Heiz-/Messstrukturen befinden sich Hotspots. Eine Temperaturhomogenisierungsschicht 21 (7)
auf der Flex-Leiterplatte 10 bewirkt eine Homogenisierung
der Temperaturverteilung auf der Oberseite der Flex-Leiterplatte 10.
Die Temperaturhomogenisierungsschicht 21 ist eine Kupferschicht,
die vernickelt und mit einer zusätzlichen
Goldschicht versehen ist. Die Goldschicht hat den Vorteil, dass
sie für
biologische Materialen inert ist und somit in der Reaktionskammer
biologische Materialen unmittelbar mit dieser Schicht in Berührung kommen
können.
Diese Reaktionskammer kann deshalb auch für andere Experimente als solche
mit Biochip verwendet werden. Diese Homogenisierungsschicht besitzt
eine gute thermische Leitfähigkeit.
Anstelle einer kombinierten Kupfer-Nickel-Gold-Beschichtung könnte auch
eine relativ dicke Kupferschicht vorgesehen werden.
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Eine
in die Flex-Leiterplatte integrierte Heizleiterbahn hat eine niedrige
eigene Wärmekapazität. Damit
sind höhere
Heizraten der Probenflüssigkeit
im Reaktionsraum realisierbar.
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Ein
bevorzugtes Ausführungsbeispiel
des Layouts der Flex-Leiterplatte 10 ist in 13 gezeigt. Die
mäanderförmige Heiz-/Messstruktur 10.3 ist
aus einer dünnen
Leiterbahn mit einer Breite von 60 μm und einer Stärke von
16 μm ausgebildet.
Sie ist etwa 480 mm lang. Bei Raumtemperatur weist sie einen elektrischen
Widerstand von etwa 6 bis 8 Ohm auf. Die Leiterbahn ist aus Kupfer,
vorzugsweise Kupfer mit einer Reinheit von 99,99% ausgebildet. Derart reines
Kupfer weist einen Temperaturkoeffizienten auf, der im hier relevanten
Temperaturbereich nahezu konstant ist. In ihrer Gesamtheit bildet
die Heiz-/Messstruktur 10.3 eine Raute mit einer Kantenlänge von
etwa 9 mm. Es gibt bereits Prototypen von flexiblen Leiterplatten
mit einer Kupferschicht, die eine Stärke von 5 μm aufweist und auf welchen Strukturen
mit einer Breite von 30 μm
ausgebildet sind. Mit derartigen Leiterbahnen würde eine Widerstand von etwa
100 Ohm bis 120 Ohm erzielt werden.
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Der
Biochip 6 weist lediglich eine Kantenlänge von 3 mm auf, womit die
durch die Heiz-/Messstruktur 10.3 und
der Temperaturhomogenisierungsschicht 21 gebildete Raute
eine größere Fläche als der
Biochip abdeckt.
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Die
Endpunkte der mäanderförmigen Heiz-/Messstruktur
gehen jeweils in eine sehr breite Leiterbahn 30.1 und 30.2 über, die
zum Zuführen
des Heizstromes dienen und selbst aufgrund ihrer großen Breite
nur einen geringen Widerstand besitzen. Weiterhin sind an diesen
beiden Leiterbahnen 30.1 und 30.2 jeweils eine
weitere Leiterbahn 31.1 und 31.2 im Bereich der
Anbindungsstelle der mäanderförmigen Heiz-/Messstruktur
angebunden. Diese beiden weiteren Leiterbahnen 31.1 und 31.2 dienen
zum Abgreifen des Spannungsabfalls an der Heiz-/Messstruktur. Dies
wird unten näher
erörtert.
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Die
Flex-Leiterplatte 10 weist Leiterbahnen 32 und
entsprechende Kontaktstellen 33, 34 zum Anschließen eines
elektrischen Halbleiterspeichers auf. Dieser Halbleiterspeicher
dient zum Speichern von Kalibrierdaten für die Heizeinrichtung und der
Daten der biologischen Experimente, die mit dem Biochip der Kartusche
durchzuführen
sind. Diese Daten sind somit verwechslungssicher abgespeichert.
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14 zeigt
ein Ersatzschaltbild einer Schaltung einer Mess- und Steuereinrichtung
zum Heizen und Messen des Heizstromes mittels der mäanderförmigen Heiz-/Messstruktur bzw.
Heiz-Leiterbahn. Die Heiz-/Messstruktur 10.3 ist im Ersatzschaltbild
als Widerstand dargestellt, der in einer Reihe mit einem Strommesswiderstand 35 und
einer steuerbaren Stromquelle 36 geschaltet ist. Die Spannung
am Strommesswiderstand 35 und an der Heiz-/Messstruktur 10.3 werden
jeweils mittels eines separaten Messkanals 37, 38 abgegriffen.
Die beiden Messkanäle 37, 38 sind
identisch ausgebildet mit jeweils einem aus zwei Operationsverstärkern bestehenden
Impedanzwandler 39, einem Operationsverstärker 40 zum
Verstärken
des Messsignals, einem Anti-Aliasingfilter 41 und
einem A/D-Wandler 42, mit dem das analoge Messsignal in
einen digitalen Messwert umgesetzt wird. Die beiden Messkanäle 37, 38 sind
somit hochohmig und identisch zueinander ausgebildet.
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Die
Operationsverstärker 40 der
beiden Messkanäle 37, 38 sind
vorzugsweise Operationsverstärker
mit lasergetrimmtem Innenwiderstand, deren Verstärkung sehr präzise einstellbar
ist. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel
wird hierfür
der Operationsverstärker
LT 1991 der Firma Linear Technology eingesetzt. Die beiden A/D-Wandler 42 der
beiden Messkanäle 37, 38 werden
vorzugsweise durch einen synchronen Zwei-Kanal A/D-Wandler realisiert, der
beide Kanäle
gleichzeitig erfasst. Hierdurch wird sichergestellt, dass die Messwerte
in beiden Kanälen jeweils
zu identischen Zeiten abgetastet werden. Dies gewährleistet,
dass die am Strommesswiderstand abgegriffene Spannung und die am
Heizelement bzw. an der Heiz-/Messstruktur 10.3 abgegriffene
Spannung jeweils gleichzeitig abgegriffen werden und somit auf dem
gleichen Heiz- bzw. Messstrom beruhen, der durch den Strommesswiderstand 35 bzw.
die Heiz-/Messstruktur 10.3 fließt.
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Da
der Heiz- bzw. Messstrom gemessen wird, kann dieser Strom gleichzeitig
zum Heizen und zum Messen verwendet werden. Bei herkömmlichen Messvorrichtungen
wird ein konstanter Messstrom eingespeist, der nicht am Sensor gemessen
wird. Ein solcher Messstrom kann nicht variiert werden und zum Heizen
verändert
werden, weshalb das Heizen und Messen unabhängig voneinander ausgeführt wird.
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Da
bei einem Heiz- und Messstrom das Heizen und Messen gleichzeitig
ausgeführt
wird, wird eine präzisere
Regelung der Temperatur möglich.
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Die
Messung der Temperatur erfolgt mit einer hohen Abtastrate von z.
B mehr als 1.000 Hz vorzugsweise zumindest etwa 3.000 Hz. Dies erlaubt eine
extrem präzise
Einstellung der Temperatur. Es hat sich gezeigt, dass mit knapp
unter 3.000 Hz eine Heizrate von 85°C/sec mit einer Genauigkeit
von 0,1°C
gesteuert werden kann.
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Beim
Abkühlen
fließt
ein Heiz- und Messstrom von ca. 50 mA und beim Halten einer Temperatur
von ca. 350 mA bis 400 mA.
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Durch
die Ausbildung der Heiz-/Messstruktur 10.3 als lange, dünne, schmale
Leiterbahn wird selbst bei Verwendung von Kupfer als Leiterbahnmaterial
ein ausreichend hoher Widerstand erzielt, der mit der oben erläuterten
4-Punkt-Messung auch bei geringem Heizstrom zuverlässig abgetastet
werden kann. Die 4-Punkt-Messung ist unabhängig von parasitären Widerständen. Denn,
da die erfindungsgemäße Heiz-/Messstruktur 10.3 sowohl
als Heizelement als auch als Messwiderstand zum Messen der Heizspannung
dient, ist es nicht möglich,
beliebig hohe „Messströme” an diese
Heiz-/Messstruktur 10.3 anzulegen,
denn diese Messströme
wirken auch als Heizströme
und würden
zu einer signifikanten Temperaturerhöhung führen, die jedoch nicht immer
gewünscht
ist. Es liegen somit Randbedingungen vor, die unter gewissen Prozessbedingungen
einen sehr geringen Messstrom erfordern, um nicht die Temperatur
der Reaktionskammer in unerwünschter
Weise zu Verändern.
Da zwei identische Messkanäle 37, 38 verwendet
werden, die zeitgleich die Messspannung mit einer sehr hohen Impedanz
abgreifen und sehr präzisen
Verstärkern
messen, können
selbst geringe Spannungsabfälle
an den Widerständen 35 und 10.3 zuverlässig detektiert
werden. Da die Messkanäle identisch
sind, kürzen
sich systematische Messfehler heraus, da der Widerstand R der Heiz-/Messstruktur 10.3 gemessen
wird, der Quotient aus dem Heizstrom und der Heizspannung bzw. der
beiden Messsignale ist.
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Die
Heiz-/Messstruktur 10.3 ist auf der von dem Biochip 6 abgewandten
Seite der Flex-Leiterplatte 10 ausgebildet.
Auf der gegenüberliegenden Seite
der Flex-Leiterplatte ist die durchgehende Temperaturhomogenisierungsschicht 21 vorgesehen,
die zu einer gleichmäßigen, schnellen
Wärmeverteilung führt und
eine entsprechende gleichmäßige und schnelle
Erwärmung
des Biochips 6 erlaubt. Zudem besitzt die Flex-Leiterplatte
lediglich eine Wärmekapazität von etwa
12 mJ/K was zu einer schnellen Wärmeübertragung
der erzeugten Wärme
auf die in der Reaktionskammer befindlichen Probenflüssigkeit und
den Biochip führt.
-
Bei
herkömmlichen
vergleichbaren Heizeinrichtungen wurden meistens Leiterbahnen aus
einem Material mit einem höheren
spezifischen Widerstand als Kupfer, wie z. B. NiCr verwendet und
für das
Heizen als auch für
das Messen werden zwei separate Leiterbahnen vorgesehen, da es bisher
als schwierig erachtet wurde, mit einer Kupferleiterbahn gleichzeitig
zu Heizen als auch die Temperatur zu Messen. Bisher wurden auch
vor allem Siliziumsubstrate als Heizelemente verwendet, da sie aufgrund
ihrer hohen Wärmeleitfähigkeit
vorteilhaft zur schnellen Verteilung der Wärme erschienen. Derartige Siliziumsubstrate
besitzen jedoch eine Wärmekapazität, die etwas
mehr als das 10-fache
der Wärmekapazität der erfindungsgemäßen Flex-Leiterplatte
beträgt.
Hierdurch wird der Heizvorgang sehr träge.
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Die
mit der oben erläuterten
Messschaltung erhaltenen Messwerte werden einer digitalen Steuereinrichtung 43 zugeführt, die über eine
Leitung 44 die steuerbare Stromquelle 36 ansteuert.
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In
der Steuereinrichtung 43 wird das schematisch in 15 gezeigte
Regelverfahren ausgeführt.
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Dieses
Verfahren zum Durchführen
eines Temperaturprofils beginnt mit dem Schritt S1. Im Schritt S2
wird der Temperaturwert gemessen, das heißt der Widerstand der Heiz-/Messstruktur 10.3 wird
aus den beiden Messwerten berechnet und in einen Temperaturwert
gemäß einer
Tabelle umgesetzt.
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Im
Schritt S3 wird die Differenz zwischen der gemessenen Ist-Temperatur
und einer Soll-Temperatur berechnet. Dieser Wert wird als Delta-Wert
bezeichnet. Die Soll-Temperatur
verändert
sich mit der Zeit. Die Funktion, die diese zeitlich veränderliche Temperatur
beschreibt, wird als Temperaturprofil bezeichnet, das an der Reaktionskammer
angelegt werden soll.
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Im
Schritt S4 wird abgefragt, ob der Delta-Wert größer als ein vorbestimmtes Minimum
ist. Wenn die Antwort auf diese Frage „Ja” ist, geht der Verfahrenablauf
auf den Schritt S5 über,
in dem abgefragt wird ob dieser Delta-Wert kleiner als einer vorbestimmtes
Maximum ist. Ist das Ergebnis wiederum „Ja”, geht der Verfahrensablauf
auf einen Block von Verfahrensschritten S6, S7, S8 über, mit
welchen ein Integral-Anteil eines Regelungswertes (Schritt S6) berechnet
wird, zum Delta-Wert ein Offset-Wert hinzu addiert wird (Schritt
S7) und anhand des derart veränderten
Delta-Wertes ein Proportional-Anteil (Schritt S8) berechnet wird.
Eine Stellgröße ergibt sich
durch Addieren des Integral-Anteils und des Proportional-Anteils.
Das Addieren des Offset-Werts bewirkt, dass mit höherer Heizleistung
geheizt wird.
-
Ergibt
sich bei einer der beiden obigen Abfragen (Schritt S4) bzw. Schritt
(S5) ein „Nein” als Ergebnis,
so geht der Verfahrensablauf direkt auf den Schritt S7 über, womit
die Berechnung des Integral-Anteils ausgelassen wird. Dies heißt, dass
nur innerhalb eines vorbestimmten Bereiches um die Soll-Temperatur
ein Integral-Anteil berechnet wird. Dieser Bereich um die Solltemperatur
beträgt
etwa +/–1°C bis +/–2°C. Der Integral
Anteil wird somit nur verwendet, wenn die gemessene Ist-Temperatur schon
relativ nahe an der gewünschten
Soll-Temperatur ist. Hierdurch wird zum einen ein Überschwingen
der Ist-Temperatur aufgrund des sehr trägen Intergral-Anteils verhindert.
Andererseits ermöglicht der
Integral-Anteil in der letzten Regelungsphase eine sehr präzise und
schnelle Annäherung
an die gewünschte
Soll-Temperatur.
-
Im
Schritt S9 wird geprüft,
ob die Stellgröße kleiner
als ein vorbestimmtes Minimum ist. Ist dies der Fall, geht der Verfahrensablauf
auf den Schritt S10 über,
mit dem die Temperatur mit maximaler Kühlleistung gesenkt wird.
-
Ergibt
im Schritt S9 die Abfrage, dass die Stellgröße nicht kleiner als ein vorbestimmtes
Minimum ist, dann geht der Verfahrensablauf auf den Schritt S10 über, in
dem geprüft
wird, ob die Stellgröße kleiner
als Null ist. Ist dies der Fall, geht der Verfahrensablauf auf den
Schritt S12 über,
in dem die Stellgröße auf Null
gesetzt wird. Dies bedeutet, dass die Reaktionskammer ohne zusätzliche
Kühlleistung abgekühlt wird
bzw. dass der Kühlstempel
von der Reaktionskammer entfernt wird. Hierdurch wird ein Überschwingen
vermieden.
-
Ergibt
die Abfrage im Schritt S11 hingegen, dass die Stellgröße nicht
kleiner als Null ist, dann bedeutet dies, dass die Temperatur erhöht werden muss.
Demgemäß wird im
Schritt S13 eine Temperaturerhöhung
entsprechend der ermittelten Stellgröße durchgeführt. Dies heißt, dass
ein zur Stellgröße proportionales
Stellsignal an die steuerbare Stromquelle 36 abgegeben
wird, die einen entsprechenden Heizstrom durch die Heiz-/Messstruktur 10.3 erzeugt.
-
Im
Schritt S14 wird geprüft,
ob das Ende des Temperaturprofils erreicht worden ist. Ist dies
der Fall, wird der Verfahrensablauf mit dem Schritt S15 beendet.
Ansonsten geht der Verfahrensablauf wieder auf den Schritt S2 über. Dieser
Regelvorgang wir mit der Abtastfrequenz wiederholt, die zumindest 1.000
Hz, insbesondere zumindest etwa 3.000 Hz beträgt.
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Kühleinrichtung
für temperaturgesteuerte
biologische Nachweisreaktionen:
-
16 zeigt
das Grundprinzip der verwendeten Kühleinrichtung 50.
Diese Kühleinrichtung 50 weist
einen Kühlkörper auf,
der im folgenden als Kühlstempel 51 bezeichnet
wird. Die Besonderheit dieses Kühlstempels 51 liegt
darin, dass er bezüglich der
Kartusche 28 beweglich angeordnet ist, so dass er mit einer
Kühlfläche mit
der Kartusche 28 derart in Kontakt bringbar ist, dass die
Reaktionskammer 5 der Kartusche 28 gekühlt werden
kann. Es ist sowohl möglich,
den Kühlstempel 51 ortsfest
anzuordnen und die Kartusche 28 mit einem Linearantrieb
zu bewegen oder die Kartusche ortsfest anzuordnen und den Kühlstempel 51 mittels
eines Linearantriebes zu bewegen.
-
Der
Kühlstempel 51 ist
mit einer Kühleinheit 52 versehen,
die ein Kühlelement
in Form eines Peltier-Elementes, einen Kühlkörper und einen Lüfter umfasst.
Mit dieser Kühleinheit 52 kann
der Kühlstempel 51 auf
eine vorbestimmte Temperatur gekühlt
werden. Weiterhin weist die Kühleinrichtung 50 einen
Linearantrieb 53 auf, mit dem der Kühlstempel hin und her bewegt
werden kann. Der Kühlstempel 51 weist
eine Stirnfläche
auf, die im folgenden als Kühlfläche 54 bezeichnet
wird, und mit der Kartusche in Kon takt gebracht werden kann. Die
Größe des Kühlstempels 51 ist
derart bemessen, dass die Kühlfläche 54 im
Bereich der Reaktionskammer 5 zum Kühlen an der Kartusche bzw.
an der Flex-Leiterplatte 10 in Berührung gebracht werden kann.
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Die
Wärmekapazität des Kühlstempels 51 ist im
Gegensatz zur Wärmekapazität der Flex-Leiterplatte 10 bzw.
der Reaktionskammer 5 sehr groß. Bei den unten beschriebenen
Ausführungsbeispielen
beträgt
z. B. die Wärmekapazität des Kühlstempels 51 etwa
8 bis 9 J/K. Die gesamte Wärmekapazität der Reaktionskammer 5 beträgt hingegen
lediglich etwa 0,5 J/K. Hierdurch ist zum einen ein hoher Wärmetransfer
sicher gestellt. Zum anderen bedeutet die hohe Wärmekapazität des Kühlstempels 51, dass dessen
Temperatur auch beim Abkühlen
der Reaktionskammer 5 um einen sehr hohen Temperaturunterschied
nicht wesentlich verändert
wird. Dies hat zur Folge, dass der Kühlstempel 51 mit relativ
geringer Kühlleistung
auf seiner Arbeitstemperatur gehalten werden kann. Durch die große Wärmekapazität des Kühlstempels
wird somit der notwendige schnelle Abkühlvorgang der Reaktionskammer 5 zeitlich von
der Kühleinheit 52 entkoppelt,
die vom Kühlstempel 51 allmählich bei
relativ geringer Kühlleistung
die Wärme
nach außen
abführt.
-
Weiterhin
kann der Kühlstempel 51 konstant auf
einem gegenüber
den Temperaturen in der Reaktionskammer relativ geringen Temperaturniveau,
von z. B. 20°C
gehalten werden, wodurch schnelle Abkühlvorgänge erzielt werden, insbesondere
beim Durchführen
von PCR-Reaktionen, bei welchen wiederholt z. B. von einer Temperatur
von 98°C
auf eine Temperatur von 40°C
bis 60°C
abgekühlt
werden muss.
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In
dem Moment, wo die Temperatur der Reaktionskammer 5 die
Zieltemperatur erreicht hat oder kurz vorher wird der Kühlstempel 51 von
der Reaktionskammer 5 wegbewegt. Gegebenenfalls kann etwas
geheizt werden, um die Endtemperatur einzuregeln. Dies ist typischerweise
der Fall, wenn die Solltemperatur über der Raumtemperatur liegt.
Falls die Temperatur unter die Solltemperatur fällt, wird automatisch geheizt.
Soll, wie es bei manchen biologischen Tests notwendig ist, eine
Temperatur unterhalb der Raumtemperatur in der Reaktionskammer eingestellt
werden, wird der Kühlstempel
auf diese Temperatur eingestellt und dauerhaft gegen die Reaktionskammer
gedrückt.
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In
speziellen Anwendungen, bei welchen man eine geringer Kühlrate wünscht, kann
zusätzlich zum
anliegenden Kühlstempel 51 gleichzeitig
geheizt werden. Dies ist insbesondere bei geringeren Temperaturänderungen
von maximal etwa 40°C
bis 50°C zweckmäßig. Dies
kann aber auch dazu eingesetzt werden, um eine Temperatur unterhalb
der Raumtemperatur zu halten, wobei der auf eine Temperatur unterhalb
der Ziel temperatur abgekühlte
Stempel permanent mit der Reaktionskammer in Kontakt steht. Eine
verringerte Kühlrate
kann auch durch Verringern der Andruckkraft, mit der der Kühlstempel
gegen die Reaktionskammer gedrückt
wird, erzielt werden.
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Ein
erstes Ausführungsbeispiel
der erfindungsgemäßen Kühleinrichtung
ist in 17 gezeigt. Diese Kühleinrichtung
weist wiederum einen Kühlstempel 51,
eine Kühleinheit 52 und
einen Linearantrieb 53 auf.
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Als
Linearantrieb sind beispielsweise Schrittmotoren oder Servogetriebemotoren
mit Spindel- oder Schneckengetriebe, Linearschrittmotoren, Piezolinearmotoren,
Motoren mit Ritzel und Zahnstange, Hubmagnete, Drehmagnete, Voice-Coil-Magnete, Motoren
mit Kurvenscheiben usw. geeignet.
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Der
Kühlstempel 51 ist
zylinderrohrförmig ausgebildet.
Er besteht aus Metall, wie zum Beispiel Kupfer oder Aluminium. Im
Inneren des Kühlstempels 51 lagert
beweglich ein stift- oder stabförmiger Stößel 55,
der aus einem Kunststoff oder Metall, wie zum Beispiel Kupfer oder
Aluminium ausgebildet ist. Der Stößel 55 ist längsverschieblich
im Kühlstempel 51 angeordnet.
Der Stößel ist
möglichst
dünn ausgebildet
und an seinem zur Reaktionskammer weisenden Ende abgerundet, so
dass er möglichst
punktförmig
gegen die Reaktionskammer drückt.
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Der
Kühlstempel 51 ist
aus Metall ausgebildet, da Metall wärme gut leitet. Er kann auch
aus einem anderem gut wärme
leitenden Material ausgebildet sein, wie z. B. spezielle Keramiken
(Aluminiumoxidkeramik, etc.) oder Kunststoffe mit bestimmten Füllstoffen,
wie z. B. Grafit, Metallpulver oder winzigen Metallkügelchen,
Kunststoffnanoröhrchen, Al2O3-Keramikpulver.
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Die
aus der Kühleinrichtung 50 hervorstehende
Stirnfläche 54 des
Kühlstempels 51 bildet
eine Kühlfläche 54.
Am von der Kühlfläche entfernten
Umfangsbereich des Kühlstempels 51 ist
dieser mit zwei ebenen Flächen
ausgebildet, an welchen Kühlelemente 56 in
Form von Peltier-Elementen befestigt sind. Diese Kühlelemente
sind Bestandteile der Kühleinheit 52,
die weiterhin noch Lüfter 57 und
Kühlkörper 58 aufweist.
Die Lüfter 57 sind
hierbei in ein Gehäuse
zum Aufnehmen eines Abschnittes dieses Kühlstempels 51 integriert.
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Der
Kühlstempel 51 weist
an seiner rückwärtigen,
der Kühlfläche 54 gegenüberliegenden
Stirnfläche
eine Buchse 59 aus einem schlecht wärmeleitenden Material, wie
zum Beispiel Kunststoff auf. Diese Buchse 59 begrenzt einen
Hohlraum. Der Stößel 55 er streckt
sich mit seinem rückwärtigen Ende
in diesen Hohlraum und weist einen pfropfenförmigen Endkörper 60 auf, der in
der Buchse 59 gleitend lagert. Zwischen diesem Endkörper 60 und
der am Kühlstempel 51 anliegenden
Wandung der Buchse 59 ist eine Feder 61 gespannt,
die den Stößel mit
einer Kraft derart beaufschlagt, dass der Stößel 55 mit seiner
vom Endkörper 60 abgewandten
freien Stirnfläche
(Bestandteil der Kühlfläche 54)
in den Kühlstempel 51 hineingezogen
wird.
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Die
Buchse 59 ist im Gehäuse
mittels eines Kunststoffrings 62 fixiert. Weiterhin befindet
sich im Gehäuse
ein Linearantrieb 63 zum Beaufschlagen des Endkörpers 60 bzw.
des Stößels 55 mit
einer Kraft, die ihn mit seinem freien Ende ein Stück aus dem
Kühlstempel 51 herausdrückt. Die
gesamte Einheit bestehend aus dem Kühlstempel 51, dem
Stößel 55,
der Kühleinheit 52,
und dem Linearantrieb 63 ist in Axialrichtung des Kühlstempels 51 gleitend
gelagert und an den Linearantrieb 53 gekoppelt. Diese Kopplung
erfolgt mittels einer Feder 64. Die Feder weist eine bestimmte
Kraft-Weg-Kennlinie auf und erlaubt somit über eine Wegsteuerung am Linearantrieb 53 die
Andruckkraft des Kühlstempels 51 an
die Flex-Leiterplatte 10 zu steuern, ohne dass die Kraft mit
einem zusätzlichen
Kraftsensor gemessen oder geregelt wird. Diese Art der Einstellung
der Druckkraft genügt
den Anforderungen, da die Toleranzen bezüglich der eingestellten Kraft
in weiten Bereichen unkritisch sind.
-
Der
Kühlstempel 51 ist
an allen freien und zugänglichen
Stellen thermisch isoliert. Hierzu ist beispielsweise handelsüblicher,
feinporiger Schaumstoff vorgesehen. Die Kühlfläche 54 des Kühlstempels 51 ist
plangedreht und poliert. Die Kühlelemente 56 sind
in Reihe geschaltet und mit einer Steuerelektronik verbunden. Weiterhin
ist an der Oberfläche
des Kühlstempels 51 ein
Temperatursensor zum Messen der Temperatur des Kühlstempels vorgesehen. Die Temperaturregelung
am Kühlstempel 51 erfolgt
mit einem PI-Regler. Die Abtastung der Temperatur erfolgt beispielsweise
mit einer Abtastrate von 2 Hz.
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Aufgrund
der großen
Wärmekapazität des Kühlstempels 51 und
des Stößels 55,
der gleichermaßen
mit dem Kühlstempel 51 kühl gehalten
wird, erwärmt
sich dieser zweiteilige Kühlkörper lediglich um
etwa 2°C
bei einer Abkühlung
der Reaktionskammer um eine Temperatur von etwa 40°C. Die erforderliche
Kühlleistung
ist relativ gering und beträgt etwa
1–2 W.
Dies erlaubt, dass die Kühleinrichtung mit
Batterien betrieben werden kann.
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Ein
zweites Ausführungsbeispiel
der erfindungsgemäßen Kühleinrichtung
ist in 18 gezeigt. Gleiche Teile dieses
zweiten Ausführungsbeispiels
sind mit gleichen Bezugszeichen wie in 17 gekennzeichnet.
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Auch
die Kühleinrichtung 50 nach
dem zweiten Ausführungsbeispiel
umfasst einen zylinderrohrförmigen
Kühlstempel 51 mit
einer Kühlfläche 54,
einen darin beweglich angeordneten Stößel 55, zwei Kühleinheiten 52 mit
jeweils einem Kühlelement 56, einem
Lüfter 57 und
einem Kühlkörper 58,
einen Linearantrieb 63 zum Betätigen des Stößels 55 und eine
Feder 61, die den Stößel mit
seinem freien Ende in den Kühlstempel 51 zieht.
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Das
zweite Ausführungsbeispiel
der Kühleinrichtung 50 unterscheidet
sich vom ersten Ausführungsbeispiel
dadurch, dass der Kühlstempel 51 ortsfest
angeordnet ist und ein Linearantrieb 65 zum Bewegen der
Kartusche 28 vorgesehen ist. Dieser Linearantrieb 65 ist
mittels einer Feder 66 an eine Halterung (nicht dargestellt)
zur Aufnahme der Kartusche gekoppelt. Die Halterung ist linear gelagert.
In die Halterung kann die Kartusche mit reproduzierbarer Position
eingesetzt werden. Über
die Kraft-Weg-Kennlinie der Feder 66 kann mittels einer Wegsteuerung
die Kraft eingestellt werden, mit welcher die Kartusche gegen den
Kühlkörper 51, 55 gedrückt wird.
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Die
Linearantriebe 53, 63 und 65 sind derart ausgebildet,
dass sie aktiv zurückgezogen
werden können,
um die Kartusche auszutauschen.
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Bei
dieser Vorrichtung ist vorteilhaft, dass lediglich die im Vergleich
zur übrigen
Kühleinrichtung kleine
Kartusche 28 bewegt wird.
-
Um
bestimmte Temperaturprofile auszuführen, deren kühlste Temperaturen
etwa 10°C
bis 20°C über Raumtemperatur
liegen, ist es nicht notwendig, aktiv zu kühlen. Hierzu genügt es, am
Kühlstempel eine
Kühleinheit
in Form von Kühlrippen
oder dergleichen vorzusehen, an welchen die vom Kühlstempel aufgenommene
Wärme über Konvektion
und Strahlung abgeben wird. Die Kühlraten sind bei solchen Vorrichtungen
prinzipbedingt geringer als bei einer aktiven Kühlung. Aber eine solche Kühleinheit
würde der
Anforderungen vieler in der Praxis verwendete Temperaturzyklen genügen. Als
Kühleinheiten
sind auch andere Systeme einzeln oder in Kombination möglich, wie
z. B. eine Wasserkühlung
oder die Erzeugung sehr kalter Luft mittels eines Wirbelrohres, das
an den Kühlstempel
geblasen wird.
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Kombinierte Heiz-/Kühleinrichtung:
-
19 und 20 zeigen
jeweils eine kombinierte Heiz-/Kühleinrichtung
zum Beheizen und Kühlen
der Reaktionskammer 5 der Kartusche 28 bzw. einer
anderen Kartusche 71, die wiederum eine Reaktionskammer 5 zur
Aufnahme eines Biochips 6 aufweist, jedoch nicht mit eigenen
Heizmitteln versehen ist. Die Reaktionskammer 5 ist in
einem Teilbereich von einer dünnen
Platte 72 aus gut wärmeleitendem
Material begrenzt, die biegsam ausgebildet sein kann. Die Platte 72 liegt
frei mit ihrer von der Reaktionskammer abgewandten Seite, so dass
sie von der Heiz-/Kühleinrichtung 70 berührt werden
kann.
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Die
Heiz-/Kühleinrichtung 70 weist
einen Heizstempel 73 mit einer zur Platte 72 weisenden Kontaktfläche 74 auf.
Der Heizstempel 73 ist aus Metall ausgebildet und mit einem
Heizmittel 75, wie z. B. mit um den Heizstempel 73 gewickelten
Heizdrähten, versehen.
Das Heizmittel 75 ist mit einer Steuereinrichtung (nicht
dargestellt) verbunden, mit welcher der Heizstempel 73 auf
eine vorbestimmte Temperatur beheizt werden kann. An der Kontaktfläche 74 ist ein
Temperatursensor 76 angeordnet, der die Temperatur der
Kontaktfläche 74 erfasst.
Der Temperatursensor ist auch mit der Steuereinrichtung verbunden, so
dass die Steuereinrichtung die Temperatur des Heizstempels 73 regeln
kann. Der Heizstempel 73 ist über eine Achse 77 mit
einem Linearantrieb 78 verbunden, mit welchem der Heizstempel 73 zur
Platte 72 bewegt werden kann, bis er diese mit einem vorbestimmten
Druck berührt
oder von der Platte 72 der Kartusche 71 weggezogen
werden kann, so dass ein vorbestimmter Luftspalt zwischen dem Heizstempel 73 und
der Platte 72 besteht.
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Auf
der Achse 77 lagert beweglich ein Kühlstempel 79, der
die Achse 77 umschließt.
Der Kühlstempel 79 ist
aus Metall ausgebildet und in Längsrichtung
der Achse 77 verschieblich angeordnet. Der Kühlstempel 79 ist
mit einem weiteren Linearantrieb 80 verbunden, mit welchem
die Position des Kühlstempels 79 auf
der Achse 77 einstellbar ist. Der Kühlstempel 79 kann
durch den Linearantrieb 80 in Richtung zum Heizstempel 73 bewegt
werden, bis der Kühlstempel 79 den
Heizstempel 73 an seiner von der Kontaktfläche 74 abgewandten
Seite unter Druck berührt.
Der Kühlstempel 79 kann
auch vom Heizstempel 73 derart entfernt werden, dass dazwischen
ein Luftspalt ausgebildet ist. Am Kühlstempel 79 ist eine
Kühleinheit 81 mit
einem Peltier-Element, Kühlkörper und
Lüfter
angeordnet, um den Kühlstempel
auf eine vorbestimmte Temperatur zu kühlen.
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Der
Kühlstempel 79 weist
eine wesentlich größere Masse
und Volumen als der Heizstempel 73 auf. Dadurch besitzt
der Kühlstempel 79 eine
wesentlich größere Wärmekapazität als der
Heizstempel 73. Dies hat zur Folge, dass wenn der Kühlstempel 79 den
Heizstempel 73 berührt,
dieser zusammengesetzte Stempel thermisch vom Kühlstem pel dominiert wird und
als ein die Reaktionskammer kühlender Stempel
wirkt. Das Volumen und die Masse des Heizstempels 73 ist
gering. Hierdurch kann der Heizstempel 73 mit geringer
Energie auf vorbestimmte Temperaturen aufgeheizt werden.
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Der
Kühlstempel 79 wird
auf einer vergleichsweise geringen Temperatur mittels der Kühleinheit 81 gehalten.
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Soll
in dieser Heiz-/Kühleinrichtung
ein vorbestimmter Temperaturzyklus abgefahren werden, so wird während der
Heizphasen der Heizstempel 73 gegen die Platte 72 der
Kartusche 71 gedrückt.
Hierbei ist der Kühlstempel 79 mit
Abstand zum Heizstempel 73 angeordnet. Der Heizstempel 73 wird
mittel seines Heizmittels 75 geheizt, bis an der Grenzfläche zwischen
der Kontaktfläche 74 und
der Platte 72 die gewünschte
Temperatur eingestellt ist.
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Bei
Kühlphasen
wird das Heizmittel 75 ausgeschaltet und der Kühlstempel 79 durch
den Linearantrieb 80 gegen den Heizstempel 73 gedrückt. Der Heizstempel 73 steht
wiederum in Kontakt mit der Platte 72 der Kartusche 71.
Aufgrund der wesentlich größeren Wärmekapazität des Kühlstempels 79 gegenüber der
Wärmekapazität des Heizstempels 73 wird
dem Heizstempel 73 schnell viel Wärme entzogen, wodurch der Heizstempel
abkühlt
und als Kühlmittel
für die
Reaktionskammer 5 der Kartusche 71 dient. Auch
während
der Kühlphase
wird die Temperatur an der Grenzfläche zwischen dem Heizstempel 73 und
der Platte 72 vom Temperatursensor 76 überwacht.
Ist die gewünschte
Temperatur erzielt, so werden sowohl Heizstempel 73 als
auch Kühlstempel 79 vom
Linearantrieb 78 zurückgezogen
oder es wird lediglich der Kühlstempel 79 zurückgezogen
und dem Heizstempel 73 wird mittels des Heizmittels 75 Wärme zugeführt, falls
die Temperatur der Reaktionskammer 5 über der Raumtemperatur gehalten
werden muss. Soll die Temperatur der Reaktionskammer unterhalb der
Raumtemperatur gehalten werden, dann kann es auch zweckmäßig sein,
wenn der Heizstempel 73 weiterhin an der Reaktionskammer 5 anliegt
und gleichzeitig der Kühlstempel 79 den
Heizstempel 73 berührt.
Durch Energiezufuhr vom Heizmittel 75 kann der Wärmestrom
von – bzw.
zur Reaktionskammer 5 derart gesteuert werden, dass deren Temperatur
konstant gehalten wird.
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Es
ist vorteilhaft, wenn die Berührungsfläche zwischen
dem Heizstempel 73 und dem Kühlstempel 79 möglichst
großflächig ausgebildet
ist, da dann ein hoher Wärmefluss
ermöglicht
wird.
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Eine
zweite Ausführungsform
einer Heiz-/Kühleinrichtung 82 ist
in 20 gezeigt. Diese zweite Ausführungsform unterscheidet sich
etwas von der in 19 gezeigten Ausführungsform.
Sie dient auch zum Berühren
einer Kartusche 71 mit einer Platte 72 mittels
eines Heizstempels 83 mit einer Kontaktfläche 84.
Der Heizstempel 83 ist wiederum mit einem Heizmittel 85 und
einem Temperatursensor 86 auf der Kontaktfläche 84 versehen.
Der Heizstempel 83 ist auf einer Achse 87 angeordnet,
die mit einem ersten Linearantrieb 88 verbunden ist, mit
dem der Heizstempel mit der Platte 72 in Berührung gebracht
werden kann und von dieser wegbewegt werden kann. An der Achse 87 ist
ein Kühlstempel 89 beweglich
angeordnet, der wiederum mit einem Linearantrieb 90 in
Verbindung ist, so dass der Kühlstempel 89 mit
dem Heizstempel 83 in Berührung gebracht werden kann.
Am Kühlstempel 89 ist
eine Kühleinheit 91 angeordnet,
mit welcher der Kühlstempel 89 auf eine
vorbestimmte Temperatur gekühlt
und auf dieser Temperatur gehalten werden kann. Weiterhin ist auf der
Achse 87 ein Zusatzheizstempel 92 in Axialrichtung
beweglich angeordnet. Der Zusatzheizstempel 92 ist mit
einem weiteren Linearantrieb 93 verbunden, so dass der
Zusatzheizstempel 92 mit dem Heizstempel 83 in
Berührung
gebracht werden kann oder von diesem entfernt werden kann. Der Zusatzheizstempel 92 ist
mit einem Heizmittel 94 versehen, wie z. B. einer Wicklung
aus Heizdrähten,
um auf eine vorbestimmte Temperatur geheizt zu werden.
-
Das
Volumen und die Masse des Kühlstempels 89 bzw.
des Zusatzheizstempels 92 sind größer als die des Heizstempels 83.
Während
einer Heiz- bzw. Kühlphase
wird der Zusatzheizstempel 92 bzw. der Kühlstempel 89 mit
dem Heizstempel 83 in Berührung gebracht, um so den Heizstempel 83 schnell auf
eine vorbestimmte Temperatur zu heizen bzw. auf eine vorbestimmte
Temperatur abzukühlen.
Im Übrigen
funktioniert diese kombinierte Heiz-/Kühleinrichtung 82 genauso
wie die in 19 gezeigt Heiz/-Kühleinrichtung 70.
-
Diese
beiden Heiz-/Kühleinrichtungen
können
noch mit einem Stößel (nicht
dargestellt) versehen werden, der sich durch die Achsen 77 bzw. 87 erstreckt
und die Platte 72, falls sie flexibel ausgebildet ist,
beaufschlagen kann, um den Biochip gegen ein gegenüberliegendes
Detektionsfenster (nicht dargestellt) zu drücken.
-
Diese
beiden kombinierten Heiz-/Kühleinrichtung
werden vorzugsweise mit einer Kartusche 71 verwendet, die
eine starre Platte 72 aus einem gut wärmeleitenden Material aufweist,
um eine schnelle Wärmeübertragung
zwischen der Reaktionskammer und dem Heizstempel zu ermöglichen.
Hierbei ist das der Platte 72 gegenüberliegende Detektionsfenster elastisch
ausgebildet, wobei beim Lesen des Biochips die Detektionseinrichtung
(nicht dargestellt) mit einer durchsichtigen Platte gegen das Detektionsfenster gedrückt wird,
so dass dieses auf dem Biochip 6 aufliegt. Hierdurch wird
Probenflüssigkeit
zwischen dem Biochip 6 und dem Detektionsfenster verdrängt und
die einzelnen Spots des Biochips können zuverlässig abgetastet werden. Ein
solches Detektionsfenster kann aus einem transparenten, elastischen
Kunststoffmaterial ausgebildet sein.
-
Bildaufnahme:
-
Nach
durchgeführter
temperaturgesteuerter biologischer Nachweisreaktion wird bei Verwendung der
Kartusche mit Flex-Leiterplatte 10 die Flex-Leiterplatte
durch Andrücken
des Stößels 55 elastisch
verformt, so dass der aufgeklebte Biochip an die Detektionsfläche drückt (6).
Um den Luftdruck im Ausgleichsraum 2 zu überwinden,
muss eine Kraft F0 aufgewendet werden. Bei
einer Fläche
von ca. 0,5 cm2 benötigt man nur ca. 5 N um einen
Druck von 1 bar aufzubauen. Zusätzlich
muss noch eine bestimmte Kraft F1 aufgewendet
werden, um die elastische Flex-Leiterplatte 10 mit aufgebrachten
Biochip 6 mittels des Stößels 55 so zu verformen,
dass der Biochip 6 gleichmäßig an die Detektionsfläche gedrückt wird.
Die Summe der Kräfte
F0 + F1 soll nicht über 30 N
liegen.
-
Beim
Stößeln wird
die überstehende,
Farbstoffmoleküle
enthaltende Probenflüssigkeit,
der Flüssigkeitsüberstand,
zwischen Biochip und Detektionsfläche weggedrückt. Sie strömt durch
den Ausgleichskanal
4 in den Ausgleichsraum
2.
Eine Beleuchtungseinheit eines Optikmoduls (nicht dargestellt) regt
nur noch die auf dem Biochip gebundenen Farbstoffmoleküle zur Fluoreszenz
an. Die Beleuchtungs- und Detektionseinheit des Optikmoduls detektiert
nach dem Stößeln nur
das Fluoreszenzlicht der auf dem Biochip gebundenen Farbstoffmoleküle. Ein geeignetes
Optikmodul ist in der internationalen Patentanmeldung
WO 2007/135091 A2 beschrieben, auf
die hier Bezug genommen wird.
-
Ohne
spezielle Blendenausführung
im Optikmodul erfolgt die Ausleuchtung des Biochips im Reaktionsraum
dabei kreisförmig.
Es wird nicht nur der rechteckige Biochip 6 beleuchtet,
sondern auch Bereiche 5.1 des Reaktionsraumes neben dem
Biochip in denen eine farbstoffhaltige Probenflüssigkeit 26 nicht
verdrängt
wurde (9). Diese Bereiche fluoreszieren intensiv. Bei
der optischen Abbildung des Biochips durch das Optikmodul auf einen
Detektor erscheinen diese Bereiche zwar außerhalb des Biochips, aber
infolge der hohen Farbstoffkonzentration der Probenflüssigkeit
neben dem Biochip streut ein Teil des Fluoreszenzlichtes auch in
Richtung Biochip und auf die Reaktions felder (Spots). Der Detektor
detektiert neben der Fluoreszenzstrahlung der Spots durch die direkte
Beleuchtung auch die indirekte Fluoreszenzstreustrahlung aus den
Bereichen neben dem Biochip. Damit erhält das Bild der Spots auf dem Biochips
eine lokale inhomogene, die Bildauswertung störende Untergrundbeleuchtung.
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Mittels
einer rechteckigen Blende 18, 19, die auf dem
Grundkörper über der
Reaktionskammer 5 aufgebracht, oder in diesen integriert
ist und geometrische Abmessungen etwas kleiner als der Biochip (7, 8)
aufweist, wird die optische Fluoreszenzanregung des Farbstoffes
im Reaktionsraum neben dem Biochip verhindert.
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Diese
Blende 18 kann beim Spritzguss eines transparenten Grundkörpers 1 als
optisch absorbierende Blende (8) oder
beim Spritzguss eines nichttransparenten Grundkörpers als transparente optische
Blende 19 bzw. Detektionsfenster 14 eingebracht
werden (7). Die Blende kann auch nachträglich auf
das optische Beobachtungsfenster (Detektionsfläche) aufgebracht werden.
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Die
Transmission der Blendenschicht sollte kleiner als 10–2 sein.
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Wiederholtes Durchführen der
temperaturgesteuerten biologischen Nachweisreaktionen
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Im
Gegensatz zu bekannten Vorrichtungen (z. B.
DE 10 2004 022 263 A1 ),
bei der die Probenflüssigkeit
vor der Bildaufnahme durch den Stößelvorgang irreversibel aus
einem Reaktionsraum verdrängt
wird, besteht in der erfindungsgemäßen Kartusche
28 die
Möglichkeit,
nach erfolgter Bildaufnahme die temperaturgesteuerte biologische
Nachweisreaktion weiterzuführen.
Wird der Stößel
55 zurückgefahren,
weicht die Flex-Leiterplatte
10 infolge
des Überdrucks
in der Reaktionskammer
5 und dem Ausgleichsraum
2 zurück und die
Probenflüssigkeit
aus dem Ausgleichsraum
2 fließt zurück in die Reaktionskammer
5,
auch zwischen den Biochip
6 und das Deckglas. Damit kann
auch nach erfolgter Detektion die temperaturgesteuerte biologische
Nachweisreaktion fortgeführt
werden.
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Prinzipiell
kann mit der erfindungsgemäßen Kartusche
zu jedem Zeitpunkt der biologischen Reaktion eine Detektion der
Spots auf dem Biochip vorgenommen werden.
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Auslesen und Einschreiben von Daten:
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Alle
Informationen über
die Kartusche, einschließlich
Biochip, müssen
vom Biochipreader ausgelesen werden. Zum Ansteuern exakter Temperaturen
bei der Durchführung
Fahren der temperaturgesteuerten biologischen Nachweisreaktion werden
die für
eine bestimmte Flex-Leiterplatte spezifischen Kalibrierungsdaten
des Heizers auf der Flex-Leiterplatte benötigt. Auch
die Informationen über
die auf den Biochip aufgebrachten Reaktionsfelder (Spots), ID-Nummern,
Belichtungszeiten für
die Bildaufnahme, usw., müssen
vom Reader ausgelesen werden, um die temperaturgesteuerte biologische
Reaktion zu steuern und eine Protokollierung und Archivierung zu
ermöglichen.
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Die
notwendigen Informationen können
als Dot-Code oder als Bar-Code auf die Kartusche aufgebracht werden.
Zum Auslesen dieser Codes benötigt
man einen Dot-Code-Reader
(oder Bar-Code-Reader). Ein Speichern aktueller Daten ist damit nicht
möglich.
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Flexibler
ist der Einsatz von beschreibbaren und auslesbaren manipulationssicheren
Speichermedien 10.2 die vorteilhafterweise auf der Flex-Leiterplate
integriert sind.
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Neben
der Kontaktflächen 10.1 der Heiz-/Messstruktur
kann auch die Kontaktierung eines elektrisch programmierbaren nichtflüchtigen Speichers
auf der Flex-LP erfolgen (3). Damit können Informationen
digital abgespeichert und zu jedem Zeitpunkt abgefragt werden. Die
speicherbare Datenmenge ist dabei deutlich größer als bei aufgebrachten Bar-
oder Dotcodes.
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Bei
einem kontaktierten elektrisch programmierbaren nichtflüchtigen
Speicher können
auch Informationen während
der PCR oder beim Auslesen des Biochips gespeichert werden. Außerdem können die
Daten manipulationssicher gespeichert werden. Nach einer erfolgten
Prozessierung kann die Kartusche auch als „prozessiert” markiert
werden um eine erneute, ungewollte Prozessierung zu verhindern.