WO2007141248A1 - Verfahren zur herstellung von linearen, methylierten polyglycerolderivaten und ihre verwendung zur funktionalisierung von oberflächen - Google Patents
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- C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
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- C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
- C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
Definitions
- the invention relates to a process for the preparation of defined linear, methylated polyglycerol derivatives on Giycidylmethyletherbasis having a degree of polymerization of 1 to 1000 with narrow molecular weight distributions determined by GPC (Gel Permeation Chromatography) and polydispersities less than 2, preferably less than 1.1 (PS standard), by ring-opening anionic polymerization of the glycidyl methyl ether in the presence of a hydrogen-active starter compound under basic catalysis.
- the invention relates to polymers of the general forms! 1.
- the invention also relates to the use of these linear, methylated Polyglcerolderivate for the functionalization of any surfaces.
- surfaces that have a coating with the new polyglycerol derivatives have excellent protein-resistant properties.
- Protei nresistente Oberfi Stahlenbe Anlagenungen play z. B. in medical technology a large Roile.
- medical implants are made of different materials, which are selected according to the specific biochemical and mechanical properties. These include z. As surgical or orthopedic screws, plates, joint prostheses, artificial heart valves, vascular prostheses, stents or implantable drug depots. The materials must be suitable for permanent use in the body, but they have z. T. significant disadvantages in terms of their biocompatibility. Also in the field of medical devices or biosensors protein-repellent materials are indispensable to suppress biofilm formation by non-specific adsorption of biological species such as bacteria, cells or even viruses at solid-liquid interfaces. In addition, z. B.
- PEG polyethylene glycol derivatives
- DE 103 11 163 A1 discloses protein-repellent compounds based on hyperbranched and dendritic polymer films for surface modification.
- These polymers are glycerol-derived ethers and / or ether alcohols which have at least one thioctic acid group for immobilization.
- the large number of free OH groups in the hyperbranched and dendritic polyglycerols represents a potential that allows the compounds to mimic sugars and glycoproteins, thus leading to long-term biocompatibility problems.
- the authors also found that fully methylated polyglycerol with a thioctic acid group could not confer protein repellency to immobilize a gold surface.
- the invention therefore an object of the invention to find other materials for coating surfaces that show good protein resistance and on the other hand are easy and inexpensive to produce.
- defined linear, methylated Pofyglycerole having a degree of polymerization of 1 to 1000 with narrow molecular weight distributions determined by GPC and polydispersities less than 2, preferably less than 1.1 (PS standard) have protein resistance and in comparison to the highly branched and dendritic polyglycerols DE 103 11 163 A1 even have improved protein-resistant properties.
- these defined linear, linearized methylated polyglycerols are easy to prepare when poiymerized glycidyl methyl ether by means of ring-opening anionic polymerization in the presence of a starter compound under basic catalysis.
- the epoxide ring is opened by base catalysis, preferably at the unsubstituted end, and the linear, methylated polymers are formed.
- the invention therefore preferably linear, methylated polyglycerols of the general formula I.
- X C 1 to C 20 -alkyl, aryl, OH, NH 2 or SH 1 where the groups OH, NH 2 or SH can also be provided with a protective group
- An aryl radical is understood to mean a substituted or unsubstituted phenyl or naphthyl radical or a heterocyclo. The radicals may be substituted by OH, NH 2 , CH 3 and halogen.
- Aryl is preferably a phenyl radical.
- Heterocycles are 5- and 6-membered heterocycles containing heteroatoms of at least one other element, preferably nitrogen, oxygen or sulfur.
- halogen is meant in particular F, Cl, Br and J.
- Preferred compounds according to the invention are those polyglycerols of the general formula I in which X is NH 2 .
- Y is OH.
- m is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5.
- the number n more preferably means 1 to 30, most preferably 5 to 20, especially preferably 10 to 20.
- Anionic polymerization is known to the person skilled in the art.
- the peculiarity of the anionic polymerization is that there is virtually no chain transfer and no termination reactions, so that the chain reaction can continue while there are still monomers, unless one adds substances to the chain termination. Since it is a so-called living polymerization, the molecular weight of a desired oligo- or polymers on the ratio of monomer to initiator can be very well adjusted.
- Examples include: Methanol, ethanol, n-, sec-, tert-butanol,
- Phenol, benzyl alcohol, diols such as. B. monoethylene glycol, 1,3-propylene glycol, 1, 4-ButyIendiol, hexamethylene glycol,
- Aminoalkanols preferably Ami ⁇ opropanols, in particular 3-aminopropano! et al homologous
- Preferred Schutz devis ⁇ for the OH, NH 2 or SH group are, for. B. Trimethyisilyl (TMS) ethers, benzyl groups and tert-Butoxycarbonyi (BOC) and 4-methoxybenzyl or triphenylmethyl.
- TMS Trimethyisilyl
- BOC tert-Butoxycarbonyi
- the starter compounds II are first partially deprotonated by a strong base, preferably with an alkali metal, preferably potassium or a alkali metal hydroxide or alkoxide, preferably potassium hydroxide or tert-butoxide.
- a strong base preferably with an alkali metal, preferably potassium or a alkali metal hydroxide or alkoxide, preferably potassium hydroxide or tert-butoxide.
- the basic initiator system is dissolved or dispersed, preferably under inert gas (eg N 2 , Ar) 1 in an inert solvent such as diethylene glycol dimethyl ether (Diglyme®), dioxane or dimethoxyethane (DME).
- inert gas eg N 2 , Ar
- an inert solvent such as diethylene glycol dimethyl ether (Diglyme®), dioxane or dimethoxyethane (DME).
- the compounds of the general formula I are prepared by bringing an alcohol derivative of the general formula II into contact with the strong base in diethylene glycol dimethyl ether, then adding the glycidyl methyl ether (the monomer) and polymerizing to the target compound I.
- the monomer solution is preferably metered in under inert gas (eg N 2 , Ar) to the initiator mixture.
- the reaction temperatures are usually 4O 0 C to 150 0 C, preferably 70 to 120 0 C. In general, the reaction is carried out under atmospheric pressure.
- the workup of the polymer is preferably carried out by treatment with an acidic ion exchanger.
- an acidic ion exchanger Preference is given to a sulfonated polystyrene resin in Methanoi used to terminate the polymerization, particularly preferably Lewatit K1131 (Bayer AG).
- Methanoi used to terminate the polymerization, particularly preferably Lewatit K1131 (Bayer AG).
- filtration of the ion exchanger and distilling off the solvent optionally further purification of the polymer follows and the polymer is z. B. freed of solvent residues in vacuo.
- protecting groups for X are removed by final cleavage according to techniques known per se. So z. B. the removal of benzyl groups, preferably with H 2 in the presence of Pd / C.
- the present inventive synthesis is simple and allows the preparation of decorative compounds I from non-toxic starting compounds.
- the simple procedure allows a yield in the multi-gram scale.
- the new compounds thus prepared are due to their reactive end groups capable of any surfaces such. As glass, metals and polymers, preferably by forming kovIERer bonds to functionalize.
- the compounds I according to the invention exhibit good protein-resistant properties which correspond to or are even superior to those of PEG-coated surfaces.
- the surfaces which are coated with the linear, methylated polyglycerols according to the invention are substantially more oxidation-resistant.
- the new compounds have the advantage that it can not come in the long term to biocompatibility problems, since they have no free OH groups, which can imitate sugar or glycoproteins in comparison with the known highly branched and dendritic polyglycerols except a possible terminal OH group.
- this terminal OH group additionally offers the possibility of attaching further functional groups or also suitable linker groups which are able to selectively and specifically immobilize proteins.
- the compounds I are also highly versatile polymeric intermediates which can be used in a variety of ways, which - open up a wide range of variation and offer a wide range of possible applications through the targeted control of the degree of polymerization and the degree of functionalization.
- the invention therefore also relates to the use of the polyglycerol derivatives of the general formula according to the invention! for coating surfaces of any materials.
- they are used for coating medical devices, devices or biosensors intended for contact with body fluids, e.g.
- in vivo sensors or medical implants such as, for example, surgical or orthopedic screws, plates, joint prostheses, artificial heart valves, vascular prostheses, stents or impla ⁇ tierbare drug depots.
- products of the optical industry, such. B in contact lenses can be coated with the polyglycerol derivatives according to the invention.
- the protein-resistant coating is applied to prevent nonspecific protein adsorption from biofluids, which is typically the first step in surface biofifing formation.
- polyglycerol derivatives according to the invention are suitable as filter materials or for coating materials in filtration technology.
- Correspondingly modified surfaces can in a further preferred embodiment for the coupling of ligands to the terminal functional Group of the polymer and used to produce specific protein interaction with simultaneous suppression of non-specific adsorption.
- the solvents were purchased in reagent grade and before the
- Resin with suifonic acid groups was supplied by Lanxesstechnik GmbH.
- the mass spectroscopic data were obtained either on a Var / a spectrometer CH6 (EI-MS) or a Va ⁇ an spectrometer CH5-DF (FAB-MS) using m-nitrobenzyl alcohol (mNBA) as standard or on a Bruker Ultraflex II Instrument (Maidi-TOF) using ⁇ -hydroxycinnamic acid (HCCA) as matrix material. Elemental analyzes were performed on a Vario EL Ili elemental analyzer. Analytical GPC measurements were performed on an Agilent 1100 Series instrument with UV detector (254 nm) and refractive index detector (35 ° C.).
- Polystyrene standards were used for calibration, and calculations were made with the PSS W / n-GPC software. Measurements were made in THF as eluent (1 ml / min, 25 ° C) using three PLgel 5 ⁇ mm / xec / C columns (7.5 x 300 mm in length / l of D.) at one pressure of 93 bar (column pressure). The FT-IR measurements were taken with sodium bromide plates on a Nicolet Avator 320 FT-! R instrument operating at 4000 nm to 400 nm and analyzed using the EZ OMNIC ESP 5.2 software program.
- Polymers 6b and 6c were prepared in the same manner, taking into account each monomer / initiator ratio, and showed the same NMR data.
- Lysozyme (chicken protein, E.C. 3.2.1.17, L6876) and pepsin (muscle, E.C.
- Phosphate-buffered saline (PBS, 10X concentrated, 900 g / L NaCl, 79.5 g / L Na2HPO4 and 14.4 g / L KH2PO4, pH 7.4) was purchased from Cambrex. 11-
- SAM self-aggregating
- the chip now having concatenated carboxylic acid anhydride groups on the SAM, was immediately placed in a flask with a freshly prepared solution of each amine (10 mM in anhydrous NMP) which was to couple to the surface. After 30-40 minutes, the goid chip was rinsed with ethanol for 30 seconds and dried under an argon stream. All chips were used directly for contact angle measurements and SPR experiments
- SPR Surface Plasmon Resonance Spectroscopic
- Example 2 Surface modification and assay for protein adsorption
- a glass substrate to which a thin gold film (50 nm) was vapor-deposited was exposed to a 1 M solution of the derivative in methanol for 18 hours.
- protein adsorption was performed to the modified glass surface by SPR (Surface Plasmon Resonance) spectroscopy according to the instructions of Whitesides et al. (Langmuir 2001, 17, 1225).
- the respective surfaces were treated with a protein solution of 1 mg / ml fibrinogen in PBS immediately after their preparation and with a protein solution of 2 mg / ml fibrinogen in PBS after a 2-week storage at 4 ° C in PBS.
- the flow rate was 10 ⁇ l / min in all tests, the exposure time was 25 minutes.
- the reference layer showed 100% protein adsorption after 25 minutes.
- the fibrinogen treatment of both the surface coated with the inventive linear methylated polymer and the surface coated with the hyperbranched polyglycerol via a thioctic acid linker did not result in protein adsorption.
- Figure 1 shows the SPR sensogram of adsorption of fibrinogen to a gold surface modified by polymers 1 and 3 and mono-amino-functionalized PEG compared to HDT, the insert showing amplification of the critical part of the plot.
- Scheme 1 shows the synthesis of the terminal mono-amino-functionalized linear poly (methylglycerol) 1 and linear polyglycerin 3 according to the invention and a schematic illustration of the subsequent surface immobilization of 1, 3 and monoamino-functionalized PEG according to the "anhydride method" (reference 3).
- Fig. 2 also demonstrates surface immobilization with the compounds of the invention.
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von definiert aufgebauten linearen , methylierten Polyglycerolderivaten auf Glycidyimethyletherbasis mit einem Poiymerisationsgrad von 1 bis 1000 mit engen Molmasseverteiiungen ermitteit durch GPC (Gel Permeation Chromatography) und Polydispersitäten kleiner 2, vorzugsweise kleiner 1.1 (PS-Standard), durch ringöffnende anionische Polymerisation des Glycidylmethylethers in Gegenwart einer wasserstoffaktiven Starterverbindung unter basischer Katalyse. Insbesondere betrifft die Erfindung Polymere der allgemeinen Formel I. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung dieser linearen, methylierten Polyg Iceroiderivate zur Funktionaiisierung beliebiger Oberflächen. So weisen Oberflächen, die eine Beschichtung mit den neuen Polyg lycerol-Derivaten besitzen, hervorragende proteinresistente Eigenschaften auf.
Description
Verfahren zur Herstellung von linearen, methylierten Polyglycerolderivaten und ihre Verwendung zur FunktionaEisierung von Oberflächen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von definiert aufgebauten linearen, methylierten Polyglycerolderivaten auf Giycidylmethyletherbasis mit einem Polymerisationsgrad von 1 bis 1000 mit engen Molmasseverteilungen ermittelt durch GPC (Gel Permeation Chromatography) und Polydispersitäten kleiner 2, vorzugsweise kleiner 1.1 (PS-Standard), durch ringöffnende anionische Polymerisation des Glycidylmethyiethers in Gegenwart einer wasserstoffaktiven Starterverbindung unter basischer Katalyse. Insbesondere betrifft die Erfindung Polymere der allgemeinen Forme! 1. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung dieser linearen, methylierten Polyglcerolderivate zur Funktionalisierung beliebiger Oberflächen. So weisen Oberflächen, die eine Beschichtung mit den neuen Polyglycerol-Derivaten besitzen, hervorragende proteinresistente Eigenschaften auf.
Protei nresistente Oberfiächenbeschichtungen spielen z. B. in der Medizintechnik eine große Roile. So werden medizinische Implantate aus verschiedenen Materialien angefertigt, die nach den spezifischen biochemischen und mechanischen Eigenschaften ausgewählt werden. Dazu gehören z. B. chirurgische bzw. orthopädische Schrauben, Platten, Gelenkprothesen, künstliche Herzklappen, Gefäßprothesen, Stents oder auch implantierbare Wirkstoffdepots. Die Materialien müssen für einen dauerhaften Einsatz im Körper geeignet sein, sie weisen aber z. T. erhebliche Nachteile hinsichtlich ihrer Biokompatibilität auf. Auch im Bereich medizinischer Geräte oder Biosensoren sind proteinabweisende Materialien unabkömmlich um die Biofilmbildung durch unspezifische Adsorption biologischer Spezies wie z.B. Bakterien, Zellen oder auch Viren an fest-flüssigen Grenzflächen zu unterdrücken. Darüber hinaus werden z. B. auch in der Optik Produkte benötigt, die proteinresistent sind und eine gute Biokompatibilität besitzen.
Um die Biokompatibilität von einzusetzenden Materialien zu erhöhen, werden verschiedene Verbindungen angewandt, mit denen die Oberflächen der entsprechenden Materialien in geeigneter Weise beschichtet werden. Neben kohlenstoffbasierten Schichten, gewinnen auch Kunststoffschichten immer mehr an Bedeutung. Gegenwärtig finden insbesondere Polyethylenglykol-Derivate (PEG) weite Verbreitung bei der Beschichtung z. B. von biomedizinischen Geräten, Implantaten und optischen Materialien, jedoch sind diese Derivate als oxidationsempfindlich bekannt. Es wird deshalb nach Substanzen gesucht, die nicht auf der Derivatisierung von Ethyieneinheiten beruhen.
So sind aus DE 103 11 163 A1 proteinabweisende Verbindungen auf der Basis hyperverzweigter und dendritischer Polymerfilme zur Oberflächenmodifizierung bekannt Diese Polymere sind von Glycerin abgeleitete Ether und/oder Etheralkohole, die mindestens eine Thioctinsäuregruppe zur Immobilisierung besitzen. Gegenwärtig gibt es allerdings noch kein Material, das vollständig resistent ist und eine Adsorption von Proteinen, Bakterien, Zellen und/oder Viren völlig verhindern kann. So stellen die große Anzahl von freien OH-Gruppen in den hochverzweigten und dendritischen Polyglycerolen ein Potential dar, das den Verbindungen gestattet, Zucker und Glycoproteine nachzuahmen, was so langfristig zu Biokompatibilitätsproblemen führt. Die Autoren stellten allerdings auch fest, dass vollständig methyliertes Polyglycerin mit einer Thioctinsäure- Gruppe zur Immobilisierung einer Goldoberfläche keinerlei proteinabweisende Eigenschaften verleihen konnte.
Von Metzke et al wurde dagegen in J. Am. Chem. Soc. 2003, 125:7760-7761 ein aus methylierten Zuckereinheiten dargestellter Seitenketten-Polyether beschrieben, der Proteinresistenz besitzt. Jedoch ist das Verfahren kompliziert und die Produkte sind nur über eine langwierige, mehrstufige Synthese zugängig.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, weitere Materialien zur Beschichtung von Oberflächen zu finden, die zum einen gute Proteinresistenz zeigen und die andererseits einfach und kostengünstig herstellbar sind.
Überraschenderweise wurde jetzt gefunden, dass definiert aufgebaute lineare, methylierte Pofyglycerole mit einem Polymerisationsgrad von 1 bis 1000 mit engen Molmasseverteilungen ermittelt durch GPC und Polydispersitäten kleiner 2, vorzugsweise kleiner 1.1 (PS-Standard) Proteinresistenz besitzen und im Vergleich zu den hochverzweigten und dendritischen Polyglycerolen aus DE 103 11 163 A1 sogar verbesserte proteinresistente Eigenschaften aufweisen.
Darüber hinaus sind diese definiert aufgebauten linearen, methylierten Polyglycerole leicht herstellbar, wenn man Glycidylmethylether mittels ringöffnender anionischer Polymerisation in Gegenwart einer Starterverbindung unter basischer Katalyse poiymerisiert. Der Epoxidring wird durch die Basenkatalyse bevorzugt am unsubstituierten Ende geöffnet und es kommt zur Ausbildung der linearen, methylierten Polymere.
Gegenstand der Erfindung sind deshalb bevorzugt lineare, methylierte Polyglycerole der allgemeinen Formel I
worin bedeutet
X = C1 bis C20 -Alkyl, Aryl, OH, NH2 oder SH1 wobei die Gruppen OH, NH2 oder SH auch mit einer Schutzgruppe versehen sein können, Y = OH, COOR, N3, NH2, SH, Halogen, Keton und R = C1 bis C6 - Alkyl, m = 0 bis 30, n = beliebige Zahl, vorzugsweise 1 bis 100.
Unter einem Arylrest wird ein substituierter oder unsubstituierter Phenyi- oder Naphthylrest oder ein Heterocycius verstanden. Die Reste können durch OH, NH2, CH3 und Halogen substituiert sein. Bevorzugt bedeutet Aryl einen Phenylrest. Heterocyclen sind 5- und 6-Ringheterocyclen, welche Heteroatome aus mindestens einem anderen Element, vorzugsweise Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthalten.
Unter Halogen versteht man insbesondere F, Cl, Br und J.
Erfindungsgemäß bevorzugte Verbindungen sind solche Polyglycerole der allgemeinen Formel I, in denen X NH2 bedeutet. In besonders bevorzugten Verbindungen bedeutet Y OH. m ist vorzugsweise 1 bis 10, besonders bevorzugt 1 bis 5. Die Zahl n bedeutet besonders bevorzugt 1 bis 30, ganz besonders bevorzugt 5 bis 20, speziell bevorzugt 10 bis 20.
Anionische Polymerisation ist dem Fachmann bekannt. Die Besonderheit an der anionischen Polymerisation ist, dass praktisch keine Kettenübertragung und keine Abbruchreaktionen stattfinden, so dass die Kettenreaktion weitergehen kann, solange noch Monomere vorhanden sind, es sei denn man gibt Stoffe zum Kettenabbruch hinzu. Da es sich also um eine so genannte lebende Polymerisation handelt, kann das Molekulargewicht eines gewünschten Oligo- oder Polymeren über das Verhältnis von Monomer zu Initiator sehr gut eingestellt werden.
Erfindungsgemäß dient als wasserstoffaktive Starterverbindung ein Alkoholderivat der Forme! II
X-<CH2)m-OH II,
worin X und m die o. g. Bedeutungen besitzen.
Beispielhaft seien genannt:
Methanol, Ethanol, n-, sec-, tert-Butanol,
Phenol, Benzylalkohol, Diole, wie z. B. Monoethylenglykol, 1,3-Propylenglykol, 1 ,4-ButyIendiol, Hexamethylenglykol,
Aminoalkanole, vorzugsweise Amiπopropanole, insbesondere 3-Aminopropano! u.a. Homologe,
Mercaptoalkanole, vorzugsweise 2-Mercaptoethano! u.a. Homologe.
Bevorzugte Schutzgruppeπ für die OH, NH2 oder SH-Gruppe sind z. B. Trimethyisilyl (TMS)-ether, Benzylgruppen und tert-Butoxycarbonyi (BOC) sowie 4-Methoxybenzyl oder Triphenylmethyl.
Die Starterverbindungen Il werden als erstes durch eine starke Base partiell deprotoniert, bevorzugt mit einem Alkalimetall, vorzugsweise Kalium oder einem Aikalimetallhydroxid oder -alkoxid, vorzugsweise Kaliumhydroxid oder -tert- butoxid. Zur Vermeidung von Durchmischungsproblemen wird das basische Initiatorsystem, vorzugsweise unter Inertgas (z.B. N2, Ar)1 in einem inerten Lösungsmittel, wie z.B. Diethylenglycoidimethylether (Diglyme®), Dioxan oder Dimethoxyethan (DME) gelöst oder dispergiert.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden die Verbindungen der allgemeinen Formel I hergestellt, indem man ein Alkoholderivat der allgemeinen Formel Il in Diethylengiycoldimethylether mit der starken Base in Kontakt bringt, anschließend den Glycidylmethylether (das Monomer) zusetzt und zur Zielverbindung I polymerisiert. Die Monomerlösung wird vorzugsweise unter Inertgas (z. B. N2, Ar) zur Initiatormischung zudosiert.
Die Reaktionstemperaturen betragen üblicherweise 4O0C bis 1500C, vorzugsweise 70 bis 1200C. In der Regel wird die Reaktion unter Normaldruck durchgeführt.
Die Aufarbeitung des Polymers erfolgt bevorzugt durch Behandlung mit einem sauren Ionenaustauscher. Bevorzugt wird ein sulfoniertes Polystyrolharz in
Methanoi zum Beenden der Polymerisation einsetzt, besonders bevorzugt Lewatit K1131 (Bayer AG). Nach Abfiltration des Ionenaustauschers und Abdestillation des Lösungsmittels schließt sich ggf. eine weitere Aufreinigung des Polymers an und das Polymer wird z. B. im Vakuum von Lösungsmittelresten befreit.
Gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppen für X werden durch abschließende Abspaltung nach an sich bekannten Techniken entfernt. So erfolgt z. B. die Abspaltung von Benzylgruppen bevorzugt mit H2 in Gegenwart von Pd/C.
In folgendem Schema ist dfe Reaktion kurz dargestellt:
1 ) 1äq. Base (z.B. KOtBu oder K) z.B. in abs Diglyme, vzw. 80°C X - {CH2)m-OH _—_ > II 2) GSycidyimethyiether bei vzw 1100C1 vzw. 15h
I,
wobei X und m und n = die o. g. Bedeutungen besitzen und Y = OH ist.
Nach erfolgter Polymerisation kann die endständige sekundäre Hydroxygruppe in Verbindung I (Y = OH) durch an sich bekannte Reaktionen (Endgruppenfunktionalisierungen) z. B. verestert, verethert, halogeniert, sulfidiert, alkyliert, aminfert oder azidiert werden um so Polymere zu erhalten, die die unter Y genannten funktionellen Gruppen aufweisen.
Im Falle von X = OH, NH2 oder SH bieten die einsetzbaren Alkoholderivate der allgemeinen Formel Il - mit leicht abspaϊtbaren Schutzgruppen versehen - die Möglichkeit, eine weitere Funktionalität in der Zielverbindung I (Oligo- oder Polymer) bereitzustellen. Die Kettenlänge m des Alkylspacers zwischen Alkohol und der weiteren Funktionalität X des Alkohol-Derivats Il ist dabei beliebig variierbar.
Die vorliegende erfindungsgemäße Synthese ist einfach und gestattet die Herstellung der Zierverbindungen I aus nicht-toxischen Ausgangsverbindungen. Darüber hinaus wird durch die einfache Verfahrensweise eine Ausbeute im MultiGramm-Maßstab ermöglicht.
Die so hergestellten neuen Verbindungen sind aufgrund ihrer reaktiven Endgruppen in der Lage beliebige Oberflächen, wie z. B. Glas, Metalle und Polymere, vorzugsweise durch Ausbildung kovaienter Bindungen zu funktionalisieren. Die erfindungsgemäßen Verbindungen I zeigen gute proteinresistente Eigenschaften, die denen PEG-beschichteter Oberflächen entsprechen oder sogar überlegen sind. Im Unterschied zu den PEG-Schichten sind die Oberflächen, die mit den erfindungsgemäßen linearen, methylierten Polyglyceroien beschichtet sind, wesentlich oxidationsbeständiger.
Weiterhin haben die neuen Verbindungen den Vorteil, dass es auch langfristig nicht zu Biokompatibilitätsproblemen kommen kann, da sie im Vergleich mit den bekannten hochverzweigten und dendritischen Polyglyceroien außer einer eventuellen terminalen OH-Gruppe keine freien OH-Gruppen besitzen, die Zucker oder Glycoproteine nachmachen können. Insbesondere der lineare Aufbau der vorliegenden Oligo- oder Polymerketten, der eine sehr flexible Struktur gewährt, sowie die Anwesenheit von Wasserstoffbrücken-Akzeptoren und die Abwesenheit von Wasserstoffbrücken-Donoren (außer ggf. der terminalen Hydroxygruppe wenn Y = OH) garantieren eine gute Proteinresistenz.
Darüber hinaus bietet diese terminale OH-Gruppe, wie bereits ausgeführt, zusätzlich die Möglichkeit weitere funktionelle Gruppen oder auch geeignete Linker-Gruppen anzubringen, die in der Lage sind, Proteine selektiv und spezifisch zu immobilisieren. Dadurch kann an einer Oberfläche, die mit einem linearen, methylierten Polyglycerol der allgemeinen Formel I beschichtet ist, sowohl eine unspezifische Adsorption von Proteinen unterdrückt als auch eine spezifische Adsorption gefördert werden. Die Verbindungen I stellen demzufolge auch vielseitig verwendbare hochfunktionelle polymere Zwischenstufen dar, die - eine große Variationsbreite eröffnen und durch die gezielte Steuerung des Polymerisationsgrades sowie des Funktionalisierungsgrades vielfältige Anwendungsmöglichkeiten bieten.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Polyglycerolderivate der allgemeinen Formel ! zur Beschichtung von Oberflächen beliebiger Materialien. Insbesondere werden sie zum Beschichten medizinischer Geräte, Vorrichtungen oder Biosensoren verwendet, die für den Kontakt mit Körperflüssigkeiten vorgesehen sind, z. B. Katheter, in vivo Sensoren oder medizinische Implantate, wie z, B. chirurgische oder orthopädische Schrauben, Platten, Gelenkprothesen, künstliche Herzklap- pen, Gefäßprothesen, Stents oder auch implaπtierbare Wirkstoffdepots. Auch Produkte der optischen Industrie, wie z. B bei Kontaktlinsen, können mit den erfindungsgemäßen Polyglycerolderivaten beschichtet werden.
Die proteinresistente Beschichtung wird aufgebracht, um die nichtspezifische Proteinadsorption aus Bioflüssigkeiten zu verhindern, die in der Regel die erste Stufe der Biofifmbildung auf Oberflächen darstellt.
Darüber hinaus eignen sich die erfindungsgemäßen Polyglycerolderivate als Filtermaterialien oder zur Beschichtung von Materialien in der Filtrationstechnik.
Entsprechend modifizierte Oberflächen können in einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante zur Kupplung von Liganden an die terminale funktionelle
Gruppe des Polymeren und zur Erzeugung spezifischer Proteinwechselwirkung mit gleichzeitiger Unterdrückung der nicht-spezifischen Adsorption verwendet werden.
Die genannten Anwendungsmöglichkeiten steüen jedoch nur eine Auswahl dar und die Erfindung soll nicht auf diese beschränkt werden.
Im Folgenden wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher erläutert.
E. Synthese und Charakterisierung von Monomeren und der erfindungsgemäßen Polymere
Allgemeines: Alle Reaktionen unter wasserfreien Bedingungen wurden in flammgetrockneten Schlenk-Glasgeräten unter Inertgasatmosphäre durchgeführt.
Die Lösungsmittel wurden in Reagenzienqualität bezogen und vor der
Verwendung einmal destilliert. Wasserfreie Lösungsmittel wurden entweder als ultratrockene Lösungsmitte! (< 0,005% Wasser) von Äcros Organics in mit
Septum verschlossenen Flaschen bezogen oder bei Polymerisationsreaktionen durch Trocknen gemäß literaturbekannten Verfahren frisch bereitet. Frisch destillierte, absolute Lösungsmittel wurden - sofern sie nicht gerade gebraucht wurden - im Kühlschrank aufbewahrt und innerhalb wenigstens einer Woche . verbraucht. Glycidyimethylether als Monomer für die Polymerisation wurde von
TCI mit 85% Reinheit bezogen und zur weiteren Reinigung vor der Verwendung frisch destilliert.- Lewatit® K1131 , ein stark saures, gelartiges polymerbasiertes
Harz mit Suifonsäure-Gruppen wurde von Lanxess Deutschland GmbH geliefert.
Alle übrigen Reagenzien wurden in Reagenzienqualität im Handel bezogen und ohne weitere Reinigung eingesetzt. Die H-NMR- und C-NMR-Spektren wurden in Konzentrationen von 100 g/l auf einem ßm/cer-Spektrometer AC 250 oder AMX 500 aufgenommen, das mit 250 MHz oder 500 MHz bzw. 62,5 MHz oder 125 MHz betrieben wurde. Die kernmagnetischen chemischen
Verschiebungen wurden als δ-Werte in ppm angegeben, und das deuterierte Lösungsmittel wurde als innerer Standard verwendet Die Zuordnung der NMR- Peaks erfolgt nach den in den Formelbildern der chemischen Strukturen angegebenen Zahlen. Die massenspektroskopischen Daten wurden entweder auf einem Var/a/i-Spektrometer CH6 (EI-MS) oder einem Vaπan-Spektrometer CH5- DF (FAB-MS) unter Verwendung von m-Nitrobenzyialkohol (mNBA) als Standard oder auf einem Bruker Ultraflex li-lnstrument (Maidi-TOF) unter Verwendung von α-Hydroxyzimtsäure (HCCA) als Matrixmaterial erhalten. Die Elementaranalysen wurden auf einem Vario EL Ili-Elementaranalysengerät durchgeführt. Die analytischen GPC-Messungen wurden auf einem Agilent 1100 Series-Instrument mit UV-Detektor (254 nm) und Brechungsindexdetektor (350C) durchgeführt. Zur Kalibrierung wurden Polystyrol-Standards verwendet, und die Berechnungen wurden mit der PSS W/n-GPC-Software durchgeführt. Die Messungen erfolgten in THF ais Elutionsmittel (1 ml/min, 25°C), unter Verwendung von drei PLgel 5 μ m m/xec/-C-Säulen (7,5 x 300 mm Länge/l. D.) bei einem Druck von 93 bar (Säulendruck). Die FT-IR-Messungen wurden mit Natriumbromid-Platten auf einem Nicolet Avator 320 FT-!R-instrument mit einem Betriebsbereich von 4000 nm bis 400 nm aufgenommen und mit dem Software-Programm EZ OMNIC ESP 5.2 analysiert.
Synthese von Ethoxyethylglycidy lether (4) als Monomer für die
Polymerisation:'' Glycidol (0,8 mol; 53,1 ml) wurde mit frisch destilliertem Ethylvinylether (3,12 mol; 300 ml; 4 Äq.) gemischt und auf einem Eisbad auf 00C abgekühlt. Zu der gerührten Lösung wurde eine katalytische Menge p-TsOH-H2θ
(0,008 mol, 1 ,52 g; 0,01 Aq.) langsam zugegeben, und die Reaktion wurde zum Erwärmen auf Raumtemperatur belassen. Sobald im DC nach 3 h vollständiger Umsatz zu erkennen war, wurde die Reaktion durch Zugabe von wässrigem
gesättigtem NaHC03 (100 ml) neutralisiert. Die abgetrennte organische Schicht wurde getrocknet (Na2SO4), und anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft, um das Rohprodukt als gelbliche Flüssigkeit zu ergeben. Zur weiteren Reinigung wurde das Rohprodukt im Vakuum destilliert, und das resultierende farblose flüssige Produkt (111 g; 95%) wurde bis zur Verwendung unter Ar-Atmosphäre über einem Molekularsieb (3Ä) im Kühlschrank aufbewahrt. 1H-NMR (500 MHz; CDCI3): 5 4,64 (m, 1 H, H-4); 3,73-3,68 (m, 0,5H; H-6); 3,62-3,50 (m, 1 ,5H1 H-6); 3,45-3,33 (m, 1 ,5H, H-3); 3,32-3,27 (m, 0,5H1 H- 3); 3,05-3,00 (m, 1 H, H-2); 2,70-2,66 (m, 1 H, H-1); 2,54-2,47 (m, 1 H, H-1'); 1 ,19 (t, 3J5,4 = 5,36, 3H1 H-5); 1 ,09 (t, 3J7,6 - 7,21 , 3H, H-7); 13C-NMR (125 MHz; CDCI3): δ 99,4 (C-4); 65,5(C-3); 60,6 (C-6); 50,6 (C-2); 44,3 (C-1); 19,5 (C-5); 15,0 (C-7); EI-MS (30 0C): m/z 145 [M-H]+; 131 [M-CH3]+; 101 [M-OCH2CH3]+; 89 [M-CH2(CHCH2O)]+; 73 [M-CH(CH3)OCH2CH3I+; IR (KBr-Platten) vmax/crτϊ1: 3053 (m, Vc-H des Epoxids); 2981 , 2931 (vs, s, vc-H von CH3 und CH2); 1480, 1445 (m, m, δC-H von CH3 und CH2); 1385 (s, δsymm„ C-H von CH3); 1254 (m, vc-o des Epoxids); 1136, 1087, 1058 (vs, vs, vs, vc-o); 931 , 857 (m, m, δc-o des Epoxids). Analyse berechnet für C7H14O3 + H2O: C: 51 ,1 ; H: 9,74. Gefunden: C: 51 ,86; H: 8,76
Darstellung von 3-Dibenzylaminopropan-1-ol (5): 3-Amϊnopropanol (105 mmol, 8,00 ml) wurde in Acetonitril (120 ml) gelöst und mit TEA (842 mmol, 118 ml, 8,00 Äq.) gemischt. Zu der gerührten Lösung wurde Benzylbromid (421 mmol, 50,0 ml, 4,00 Äq.) durch einen Tropftrichter bei Raumtemperatur langsam zugesetzt, und es wurde weitere 5 h am Rückfluss gerührt (700C), bis im DC vollständiger Umsatz des Ausgangsmaterials zu erkennen war. Anschließend wurde das ausgefallene Hydrobromid-Saiz von TEA abfiltriert, das Filtrat wurde
unter vermindertem Druck eingeengt, und die erhaltene gelbe Flüssigkeit wurde mit Wasser (10O mI) gemischt. Die wässrige Phase wurde mit Diethylether extrahiert (3 x 50 ml), die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (Na2SO4) und im Vakuum eingeengt. Zur weiteren Reinigung wurde das Rohprodukt über Kieselgel filtriert (Ethylaceiat/Hexan 8:1), um nach Trocknen im Hochvakuum die Titelverbindung (21 ,7 g, 81 %) ais farblose Flüssigkeit zu ergeben.
1H-NMR (500 MHz; Aceton-d6): δ 7,42-7,22 (m, 10H, Ar-H); 3,80 (brs, OH); 3,57 (s, 4H, H-4); 3,56 (t, 2H1 3J112 = 6,37, H-1); 2,56 (t, 2H5 3J3,2 = 6,87, H-3); 1 ,76 (m, 2H, H-2). 13C-NMR (125 MHz; Aceton-d6): δ 141 ,4, 130,6, 130,0, 128,6 (Ar-C); 62,8 (C-1); 59,9 (C-4); 53,0 (C-3); 31 ,6 (C-2); EI-MS (80 0C): m/z 255 [Mf, 210 [M-C2H5O]+, 164 [M-PhCH2J+, 91 [PhCH2]+, 73 [M-2xPhCH2]+; IR (KBr) vmax/cm'1: 3357 (s, VO-H); 3084, 3061 , 3027 (m, m, s, vc.H(arom,)); 2945, 2803 (vs, s, VC-H von CH2); 1601 , 1584, 1494 (m, w, vs, vc=c arom,); 1452 (vs, VC-H von CH2); 1367 (m, VO-H); 1069 (vs, VC-OH); 746, 698 (vs, vs, vc-H(arom,)); Analyse berechnet für C17H21NO: C: 79,96; H: 8,29; N: 5,49. Gefunden: C: 79,79; H: 8,22; N: 5,55.
Allgemeines Verfahren für die anionische ROP-Polymerisation unter Bildung mit terminalem Amin funktionaJisierter, linearer Polyglycerin-
1 p Derivate: ' Kalium wird zu abs. DME gegeben und die Mischung bei 85°C unter Argon-Atmosphäre gerührt, bis der Hauptteil des Kaliums gelöst ist. Dann wird der Polymerisationsstarter 5 in äquimoiarem Verhältnis zugesetzt, und die Mischung wird gerührt, bis afles Kalium verschwunden ist, was zeigt, dass die Starterverbindung vollständig deprotoniert ist. Anschließend wird die gerührte Lösung bei Verwendung von Glycidylmethylether als Monomer auf 1050C erhitzt, oder auf 115°C, wenn der Ethoxyethylglycidylether 4 ais Monomer eingesetzt wird. Das jeweilige Monomer wird der deprotonierten Starterverbindung 5 unter Ar-Atmosphäre zugesetzt, und das Molekulargewicht des Polymers wird über das Verhältnis Monomer/Initiator eingestellt. Die Polymerisation läuft 20 Stunden lang. Nach Kühlen auf RT wird die Reaktion durch Zugabe von Methanol und Lewatit® K1131 zum Stillstand gebracht und eine weitere Stunde gerührt. Die Lösung wird
vom Lewatit abfiltriert, und die Polymerlösung wird unter vermindertem Druck eingeengt. Zur Reinigung von Saizen wird das erhaltene Polymer in Diethylether gelöst und zentrifugiert. Anschließend wird die obere klare Flüssigkeitsschicht von unlöslichen Salzen am Boden des Gefäßes dekantiert, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck verdampft, um das gewünschte Polymer zu ergeben, das im Hochvakuum getrocknet wird.
Herstellung des benzylgeschützten aminfunktionalisierten linearen Polymethylglycerϊns 6 a, b, c: Zur Herstellung von 6 a wurde Kalium (12,4 mmol; 484 mg) in abs. DME (10 ml) vorgelegt, und anschließend wurde das Dibenzylaminopropano! 5 (12,4 mmol; 3,17 g, 1 Äq.) gemäß dem allgemeinen Verfahren vollständig deprotoniert. Frisch destillierter Glycidylmethylether (74,4 mmol, 6,7 ml, 6 Äq.) wurde bei 1050C zugegeben, und die Polymerisation wurde weitere 20 h weiterlaufen lassen. Zum Löschen wurden Methanol (10 ml) und Lewatit K1131 (0,5 g) bei RT zugegeben, und die Mischung wurde eine weitere Stunde gerührt. Die weitere Aufarbeitung erfolgte in Anlehnung an das aligemeine Verfahren und ergab das gewünschte Polymer (8,4 g; 98%) in Form einer hellgelben Flüssigkeit. 1H-NMR (500 MHz; Aceton-d6): 5 7,42-7,20 (m, Ar- H); 3,84-3,35 (H-4, H-5, H-6, H-3, Ar-CH2); 3,31 (LPG(OMe); 2,52 (t, H-1); 1 ,77 (m, H-2); 13C-NMR (125 MHz; Aceton-d6): δ 141,7; 130,4; 129,9; 128,5 (Ar-C); 80,4 (C-5); 74,3 (C-4); 71,7 (C-6); 70,9 (C-3); 59,1 (OMe), 58,9 (Ar-CH2); 52,0 (C-I); 29,1 (C-2), GPC (PS-Standard): MJM^, = 1,05; FAB-MS (mNBA): 785 [M(n = 6)+H]+.
Die Polymere 6 b und 6 c wurden auf die gleiche Weise hergestellt, wobei das jeweilige Monomer/Initiator- Verhältnis berücksichtigt wurde, und zeigten die gleichen NMR-Daten. GPC (PS-Standard): Mn/Mw = 1 ,08; FAB-MS (mNBA): 1159 [M(n = 10)+Na]+ ; 6 c: GPC (PS-Standard): MJMW = 1 ,16, Maldi-TOF : 1687 [M(n = 16)+Na]+.
Herstellung des benzylgeschützten aminfunktionalisierten linearen Polyglycerins 7: Zur Herstellung von 7 wurde Kalium (3,58 mmol; 140 mg) in abs. DME (6 ml) vorgefegt, und anschließend wurde das Dibenzylaminopropanol 5 (3,58 mmol; 914 mg, 1 Äq.) gemäß dem allgemeinen Verfahren vollständig deprotoniert. Frisch destillierter Ethoxyethylglycidylether 4 (57,3 mmol, 8,4 g, 16 Äq.) wurde bei 115°C zugegeben, und die Polymerisation wurde weitere 20 h weiterlaufen lassen. Zum Löschen wurden Methanol (10 mi) und Lewatit K1131 (0,5 g) bei RT zugegeben, und die Mischung wurde eine weitere Stunde gerührt. Die weitere Aufarbeitung erfolgte in Anlehnung an das allgemeine Verfahren und ergab das gewünschte Polymer 7 a (5,5 g; 90%) in Form einer hellgelben Flüssigkeit. 1H-NMR (500 MHz, CDCI3): 5 7,36-7,19 (m, Ar-H); 4,70 (CH(Me)OCH2CH3); 3,90 (br s, OH); 3,75-3,40 (m, H-3, H-4, H-5, H-6, Ar-CH2, CH(Me)OCH2CH3); 2,49 (t, H-1); 1 ,77 (t, H-2); 1 ,29 (s, CH(Me)OCH2CH3); 1 ,19 (s, CH(Me)OCH2CH3). 13C-NMR (125 MHz; Aceton-d6): δ 141 ,5, 130,2, 129,7, 128,3 (Ar-C); 101 ,2 (CH(Me)OCH2CH3); 80,5 (C-5); 71 ,7 (C-4); 68,5 (C-3); 66,6 (C-6); 61 ,9 (CH(Me)OCH2CH3); 59,7 (Ar-CH2); 52,1 (C-1); 25,5 (C-2); 21 ,3 (CH(Me)OCH2CH3); 16,8 (CH(Me)OCH2CH3); GPC (PS-Standard): MJMW = 1 ,06.
Für die nachfolgende Umwandlung des Polymers 7 a in 7 b wurde das Acetal- geschützte lineare Polyglycerin 7 a (2 g) in THF gelöst (20 ml). Es wurde Salzsäure (12 M, 1 ml) zugegeben, und die Mischung wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei das entschützte Polymer 7 b auszufallen begann. Anschließend wurde das THF dekantiert, und das Polymer wurde mit THF (10 ml) und Aceton (3 x 20 ml) gewaschen und durch wiederholtes Lösen in Methanol und Ausfällen in Aceton gereinigt. Das gewünschte Polymer 7 b wurde als farbloses viskoses Öl mit einer Ausbeute von 87% (1 ,0 g) erhalten. 1H-NMR (500 MHz, D2O): δ 7,60-7,45 (m, Ar-H); 3,88-3,15 (m, Ar-CH2, H-3, H-4, H-5, H- 6); 3,22 (m, H-1); 2,06 (m, H-2); 13C-NMR (125MHz, D2O, TMS als innerer Kalibrierungsstandard): δ 146,9, 133,2, 132,4, 131 ,6 (Ar-C)5 81 ,8 (C-5), 71 ,0 (C- 4), 64,7 (C-3); δ2,9 (C-6); 59,4 (Ar-CH2); 52,1 (C-1); 25,6 (C-2), Maldi-TOF: 1018 [M(n = 10)+Na]+.
a, n = 6
1 b, n = 10 R - Me c, n = 16
3 n = 10, R = H
Herstellung der linearen PoEygEyceππ-Derivste 1 a, b, c und 3 durch Kydrogenofyse von 6 a, b, c und 7 b: Das jeweilige Polymer S a, b, c oder 7 b
(1 g) wurde in MeOH (20 ml) gelöst. Pd/C (250 mg, 25 Gew.-%) wurde zugesetzt, und die Reaktion wurde in einer H2-Atmosphäre 3 Tage bei RT ablaufen lassen.
Dann wurde die Mischung durch Celite® filtriert, um den Katalysator zu entfernen, und das Fiitrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Ein jedes Polymer 1 s, b, c und 3 wurde nach Trocknen im Hochvakuum als hellgelbes viskoses Öl in quantitativer Ausbeute erhalten 1H-NlViR (250 MHz; CDCI3): δ 3,89-3,24 (H-4, H-
5, H-6, H-3); 3,21 (OMe); 2,64 (m, H-1); 1 ,57 (m, H-2); 13C-NMR (62,5 MHz; CDCI3): δ 78,3 (C-5); 72,2 (C-4); 70,3 (C-3); 69,6 (C-6); 58,7 (OMe); 39,1 (C-1); 31 , 1 (C-2). 3: 1H-NMR (500 MHz, MeOH-d4): δ 3,89-3,44 (m, H-3, H-4, H-5, H-6, -NH2, -OH); 3,05 (m, H-1 ); 1 ,92 (m, H-2); 13C-NMR (125 IVlHz1 MeOH-d4: δ 81 ,4 (C-5), 70,5 (C-4), 64,3 (C-3); 62,5 (C-6); 35,7 (C-1); 29,3 (C-2).
Beispiel 1
Synthese von einem linearen, methyüerten Polygiycerolderivat der Forme! I, worin X einen Dibenzyiaminopropanylrest bedeutet, mit einem theoretisch eingestellten MG von 1500g/mol
In einem Zweihaiskolben werden 5ml absoluter Diethyienglycoidimethylether unter Argon vorgelegt und sukzessiv 65,5mg (1 ,66mmol) elementares Kalium und 428mg (1 ,68mmol, 1äq.) 3-Dibenzylaminopropan-1ol hinzugefügt. Das sich langsam hell orange färbende Reaktionsgemisch wird bei 8O0C solange gerührt (ca. 5h) bis eine quantitative Deprotonierung des Alkohols durch vollständigen Umsatz des Kaliums angezeigt wird. Anschließend wird die Initiatorlösung bei 1100C mit 2,13ml (23,7mmoi, 14äq.) frisch destilliertem, trockenen Glycidylmethyiether versetzt und für weitere 15h unter Argon gerührt, wobei eine Rotbraunfärbung der Lösung zu beobachten ist. Nachdem die Polymerisation durch Zugabe von 1g saurem Ionenaustauscher Lewatit K1131 in 10ml Methanol bei Raumtemperatur beendet und 1 h gerührt worden ist, wird der Ionenaustauscher abfiltriert und das Lösungsmittel abdestilliert. Das erhaltene orangefarbene Oligomer wird zur weiteren Reinigung in Chloroform gelöst, von eventuell verbleibenden, unlöslichen Kaiiumsalzen abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert Nach Abspaltung der Benzylgruppen (z. B. mit H2 und Pd/C), Filtration und Trocknung am Hochvakuum erhält man das gewünschte Oligomer als orange, viskose Flüssigkeit, deren Reinheit NMR- spektroskopisch untersucht wurde.
II. Untersuchung der Proteinadsorption mittels Oberflächenplasmon- resonanz-Spektroskopie (SPR)
Aligemeines: Sofern nichts anderes angegeben ist, waren alle verwendeten Chemikalien von Reagenzienqualität. Fibrinogen (aus Rinderplasma, F8630),
Lysozym (Hühner-Eiweiß, E.C. 3.2.1.17, L6876) und Pepsin (Muskel, E.C.
3.4.23.1 , P7012) wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Rinderserumalbumin wurde von Serva erhalten. Alle Proteine wurden eingesetzt wie erhalten.
Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS; 10-fach konzentriert; 900 g/l NaCI, 79,5 g/l Na2HPO4 und 14,4 g/l KH2PO4; pH 7,4) wurde von Cambrex bezogen. 11-
Mercaptoundecansäure, wasserfreies N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP)1 Trϊfiuor- essigsäureanhydrid (TFAA), wasserfreies DMF1 Hexadecanthiol (HDT), Triethyi- amin (TEA), Natriumdodecylsulfat (SDS) wurden von Acros bezogen. PBS wurde vor der Verwendung frisch hergestellt durch Verdünnen von 100 ml einer PBS- Lösung (10-fach konzentriert) in 900 ml deionisiertem Wasser, filtriert und durch 0,22 μm-Filter entgast. Proteinlösung (1 mg/ml in PBS) und SDS-Lösung (0,5 Gew.-% in PBS) wurden frisch bereitet und durch 0,2 μm-Fiiter filtriert. Goldbeschichtete Sensorchips wurden von Biacore bezogen und bei 5°C im Kühlschrank aufbewahrt. Die SPR-Messungen wurden mit einem Biacore 3000- Instrument durchgeführt.
Herstellung einer selbstaggregierenden (SAM) HDT-Bezugsmonoschϊcht auf Au-Substrat: Die Bezugs-SAMs von HDT wurden hergestellt, indem das Gold-Substrat über Nacht in eine ethanolische HDT-Lösung (2 mM) eingetaucht wurde. Anschließend wurde die Oberfläche 30 s mit Ethanol gespült und unter einem Argon-Strom getrocknet.
Allgemeines Verfahren zur Herstellung gemischter SAMs mit Hilfe der
"Anhydrid-Methode" : Die Gold-Chips wurden in einer Lösung von 11- Mercaptoundecansäure (2 mM) in Ethanol/Wasser/Essigsäure (85/10/5, V/V/V) über Nacht inkubiert, anschließend 30 s mit Ethanol gespült und unter einem
Argon-Strom getrocknet. Der saubere Goid-Chip wurde 25-30 min ohne Rühren in eine frisch bereitete Lösung von TFAA (0,1 M) und TEA (0,2 M) in wasserfreiem DMF eingelegt. Dann wurde der Gold-Chip aus der TFAA/TEA- Lösung genommen, 30 s mit CH2CI2 gespült und unter einem Argon-Strom getrocknet. Der Chip, der nunmehr verkettete Carbonsäureanhydrid-Gruppen auf der SAM aufwies, wurde sofort in einen Kolben mit einer frisch bereiteten Lösung des jeweiligen Amins (10 mM in wasserfreiem NMP) verbracht, das an die Oberfläche koppeln sollte. Nach 30-40 min wurde der Goid-Chip 30 s mit Ethanol gespült und unter einem Argon-Strom getrocknet. Alle Chips wurden unmittelbar für die Kontaktwinkelmessungen und die SPR-Experimente eingesetzt
Aligemeines Verfahren für die oberfϊächenplasmonresonanzspektros- kopischen (SPR) Messungen: Die Adsorption der Testproteine an die hergestellten SAMs wurde in Anlehnung an die Vorschrift von Whiteside3 gemessen, die wie folgt ist: (i) 3 min Fließen einer Lösung von SDS (0;5 Gew.-% in PBS) über die SAM-Oberf!äche und anschließend 10 min Spülen der
Oberfläche mit PBS-Puffer; (ii) 30 min Fließen einer Lösung des entsprechenden
Proteins (1 mg/mL in PBS); und schließlich (iii) weitere 10 min Fließenlassen des
PBS-Puffers über die Oberfläche. Die Fließgeschwindigkeit belief sich bei allen Experimente auf 10 μl/min.
Kontaktwinkelmessungen: Die abnehmenden und zunehmenden Kontaktwinkel von Wasser auf den gemischten SAMs wurden mit einem Kontaktwinkel- Goniometer Rame Hart Modell 100 gemessen. Die Flüssigkeitstropfen wurden mit einer Mikrometerspritze von GILMONT® auf die Oberfläche gebracht. Die angegebenen Werte für die Kontaktwinkel sind Mittelwerte aus drei bis fünf Messungen, die an verschiedenen Stellen der Oberfläche vorgenommen wurden.
Beispiel 2 Oberflächenmodifikation und Prüfung auf Proteinadsorption
Zur kovalenten Anbindung des in Beispiel 1 hergestellten Polyglycerol-Derivats wurde ein Glassubstrat auf das ein dünner Gold-Film (50nm) aufgedampft wurde, einer 1M Lösung des Derivats in Methanol über einen Zeitraum von 18h ausgesetzt Nach gründlichem Spülen mit Methanol und Wasser wurde die Proteinadsorption an die modifizierte Glasoberfläche mittels SPR (Oberflächenplasmonen-Resonanz) - Spektroskopie nach der Vorschrift von Whitesides et al. (Langmuir 2001 , 17, 1225) verfolgt.
In gleicher Weise wurde eine Goldoberfläche mit einem hochverzweigten Polyglycerol gemäß DE 103 11 163 A1 (Molmasse: 2500g/mol, Thioctinsäure- Linker) bereitgestellt und getestet. Eine mit 11-Hexadekanthiol beschichtete Oberfläche diente zum Vergleich.
Die jeweiligen Oberflächen wurden mit einer Proteinlösung aus 1 mg/ml Fibrinogen in PBS unmittelbar nach ihrer Fertigung und mit einer Proteinlösung aus 2mg/ml Fibrinogen in PBS nach einer 2-wöchigen Lagerung bei 4°C in PBS behandelt. Die Flussrate betrug bei allen Tests 10μl/min, die Einwirkzeit lag jeweils bei 25min.
Ergebnisse
Test 1 - 1 mg/ml Fibrinogen in PBS
Die Referenzschicht zeigte nach den 25min eine 100%ige Proteinadsorption. Die Fibrinogen-Behandlung sowohl der mit erfindungsgemäßem linearen, methylierten Polymer beschichteten Oberfläche als auch der mit dem hochverzweigten Polyglycerol über einen Thioctinsäure-Linker beschichteten Oberfläche ergab keine Proteinadsorption.
Test 2 - 2mg/m! Fibrinogen in PBS nach 2 Wochen Lagerzeit Die Proteinadsorption der mit dem hochverzweigten Polyglycerol über einen Thioctinsäure-Linker beschichteten Oberfläche lag bei 7,6%, die Proteinadsorption der mit dem erfindungsgemäßen linearen, methylierten Polymer beschichteten Oberfläche lag dagegen bei 0,11 %.
Resume: Es wurde festgestellt, dass die mit dem erfindungsgemäßen Polymer nach Beispiel 1 beschichtete Goldoberfläche, auch nach zwei Wochen kaum veränderte proteinresistente Eigenschaften aufweist. Im Unterschied dazu hatte eine mit hochverzweigtem Polyglycerol (Molmasse: 2500g/mol, Thioctinsäure- Linker) beschichtete Goldoberfläche unter den gleichen Bedingungen nach zwei Wochen bereits ungefähr 10% ihrer Proteinresistenz verloren.
Dies spricht eindeutig für die Langlebigkeit der Proteinresistenz der erfindungsgemäßen Verbindungen.
Weitere Untersuchungen der Polymere 1 und 3 im Hinblick auf ihre Proteinresistenzeigenschaften mit vier Testproteinen
Fibrinogen (Fib, 340 kDA, p!=5,5) und Albumin (BSA, 66 KDA, ρl=4,8) wurden als Blutplasmaproteine eingesetzt. Pepsin (Pep, 34 kDA, pl =2) und Lysozym (Lys, 14 kDA, pl=12) sind vergleichsweise kiein und unter den Untersuchungsbedingungen (pH=7,4; PBS) gegensätzlich geladene Modell- Proteine zur Untersuchung der elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Oberflächen.
Fig. 1 zeigt das SPR-Sensogramm der Adsorption von Fibrinogen an eine Goldoberfläche, die durch die Polymere 1 und 3 modifiziert ist und durch monoaminofunktionalisiertes PEG im Vergleich zu HDT, wobei die Einfügung eine Amplifikation des entscheidenden Teils der Darstellung zeigt.
Tab. 1 fasst die Molekulargewichte der gemessenen Verbindungen zusammen (M), die Anzahl der sich wiederholenden Einheiten der Polymere (n), die speziell resultierenden Kontaktwinkel der Oberflächen nach Immobilisierung (θ) und die verschiedenen Mengen an adsorbierten Proteinen in % HDT.
Im FaIi des Poly(methylglyceroi)1 wurden drei verschiedene Moiekulargewichte untersucht (Tab. 1). In Fig. 1 ist aus Gründen der Klarheit jedoch nur die Kurve der besten Verbindung 1c mit einem Molekulargewicht von 1.500 g/moi gezeigt.
Tab. 1 : Menge an adsorbiertem Fibrinogen, Pepsin, Albumin und Lysozym in % HDT, Kontaktwinkel der entsprechenden Oberfläche
Compound Ma nb Fib Pep BSA Lys θc
HDT 258 .. 100.0 100 0 100 0 100 0 98
PEG-OH" 281 6 0.6 2 7 0.0 0.3 34
3 820 10 5 9 1 9 4.3 10 0 23
1» 600 6 1.8 0 0 1 8 3.4 48
Ib 1000 Ϊ0 0.7 0.2 0.0 0.3 45
Ic 1500 16 0.1 0.0 0.0 0 0 46
a) MG in g/moi b) durchschnittliche Anzahl der sich wiederholenden Einheiten des Poiymers °) Kontaktwinkeimessung siehe oben d) α-(Amino)-po!y(ethylene glycol)
Exzellente protein resistente Eigenschaften wurden insbesondere für das lineare Poly(methylgfycerol) 1c mit MG > 1.000 g/mo! gefunden. Das Polymer ist hochflexibel und hydrophober als PEG oder Polymer 3 und zeigt die beste Proteinexistenz gegenüber den getesteten Proteinen.
Zusammenfassend zeigt Schema 1 die Synthese des erfindungsgemäßen terminal monoaminofunktionalisierten linearen Poly(methylglycerols) 1 und linearen Polygiycerofs 3 und ein schematische Illustration der nachfolgenden Oberflächenimmobilisierung von 1 , 3 und monoaminofunktionalisiertem PEG gemäß der „Anhydrid-Methode" (Lit.-stelle 3).
Fig. 2 demonstriert ebenfalls die Oberflächenimmobilisierung mit den erfindungsgemäßen Verbindungen.
Literatur
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(3) Chapman, R. G.; Ostuni, E.; Yan, L.; Whitesides, G. M., Langmuir 2000, 16, 6927-6936; Chapman, R. G.; Ostuni, E.; Takayama, S.; Holmlin, E.; Yan, L.; Whitesides, G. M., J. Am. Chem. Soc. 200O1 122, 8303-8304; PaIe- Grosdemange, C; Simon, E. S,; Prime, K. L.; Whitesides, G M., J. Am. Chem. Soc. 1991 , 113, 12-20.
Claims
1. Verfahren zur Herstellung eines linearen, methylierten Polyglycerols mit einem Polymerisationsgrad von 1 bis 1000 und mit engen Moimasseverteilungen ermittelt durch GPC und Polydispersitäten kleiner 2, dadurch gekennzeichnet, dass Glycidylmethylether durch ringöffnende anionische Polymerisation in Gegenwart eines Alkoholderivats als wasserstoffaktiver Starterverbindung in einem inerten Lösungsmittel unter basischer Katalyse polymerisiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die vorhandene terminale Hydroxylgruppe funktionalisiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Polyglycerole die folgende allgemeine Formel 1 besitzen:
worin bedeutet
X = d- bis C2o-Aikyl, Aryl, OH, NH2 oder SH1 wobei die Gruppen OH, NH2 oder SH auch mit einer abspaltbaren Schutzgruppe versehen sein können, Y = OH, COOR, N3, NH2, SH, Halogen, Keto, R = d- bis C6 -Alkyl, m = 0 bis 30, n = beliebige Zahl, vorzugsweise 1 bis 100.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Katalysator ein Alkalimetall, vorzugsweise Kalium oder ein Alkalialkoxid, vorzugsweise Kalium-tert-butoxid, eingesetzt wird.
5. Lineare, methylierte Poiyglycerole, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
6. Verwendung der linearen, methylierten Poiyglycerole gemäß Anspruch 5 zum Beschichten von Oberflächen.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie zum Beschichten von Oberflächen medizinischer Geräte, Biosensoren, Implantaten und optischer Produkte verwendet werden.
8. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Filtermateriaüen oder zum Beschichten von Materialien für die Filtrationstechnik verwendet werden,
9. Verwendung nach Anspruch 6 zur Kupplung von Liganden an die terminale funktionelle Gruppe des Polymeren und Erzeugung spezifischer Proteinwechselwirkung mit gleichzeitiger Unterdrückung der nicht-spezifischen
Adsorption.
10. Polygiycerole der aligemeinen Formel !
wohn bedeutet
X = d- bis C2o-Alkyi, Aryl, OH, NH2 oder SH, wobei die Gruppen OH, NH2 oder SH auch mit einer abspaltbaren Schutzgruppe versehen sein können,
Y = OH, COOR, N3, NH2, SH, Halogen, Keto, R = C1- bis C6 -Alkyl, m = 0 bis 30, n = beliebige Zahl, vorzugsweise 1 bis 100,
11. Polyglycerole nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass X NH2 bedeutet.
12. Polygiyceroie nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass Y OH bedeutet.
13. Polygiyceroie nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass m 1 bis 10 ist, vorzugsweise 1 bis 5.
14. Polyglycerole nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass n 1 bis 30 ist, vorzugsweise 5 bis 20, besonders bevorzugt 10 bis 20.
15. Verwendung der Polygiyceroie der Ansprüche 10 bis 14 zur Beschichtung von Oberflächen biomedizinischer Geräte und Vorrichtungen, in vivo Biosensoren, Implantaten und Kontaktlinsen.
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