DE102006027125A1

DE102006027125A1 - Verfahren zur Herstellung von linearen, methylierten Polyglycerolderivaten und ihre Verwendung zur Funktionalisierung von Oberflächen

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Publication number: DE102006027125A1
Application number: DE200610027125
Authority: DE
Inventors: Rainer Prof. Dr. Haag; Monika Dipl.-Ing. Wyszogrodzka; Marie Weinhart
Original assignee: Freie Universitaet Berlin
Current assignee: Freie Universitaet Berlin
Priority date: 2006-06-02
Filing date: 2006-06-02
Publication date: 2007-12-06
Also published as: WO2007141248A1; EP2044141A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von definiert aufgebauten linearen, methylierten Polyglycerolderivaten auf Glycidylmethyletherbasis mit einem Polymerisationsgrad von 1 bis 1000 mit engen Molmasseverteilungen, ermittelt durch GPC (Gel Permeation Chromatography), und Polydispersitäten kleiner 2, vorzugsweise kleiner 1,1 (PS-Standard), durch ringöffnende anionische Polymerisation des Glycidylmethylethers in Gegenwart einer wasserstoffaktiven Starterverbindung unter basischer Katalyse. Insbesondere betrifft die Erfindung Polymere der allgemeinen Formel I. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung dieser linearen, methylierten Polyglycerolderivate zur Funktionalisierung beliebiger Oberflächen. So weisen Oberflächen, die eine Beschichtung mit den neuen Polyglycerolderivaten besitzen, hervorragende proteinresistente Eigenschaften auf.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von definiert aufgebauten linearen, methylierten Polyglycerolderivaten auf Glycidylmethyletherbasis mit einem Polymerisationsgrad von 1 bis 1000 mit engen Molmasseverteilungen ermittelt durch GPC (Gel Permeation Chromatography) und Polydispersitäten kleiner 2, vorzugsweise kleiner 1.1 (PS-Standard), durch ringöffnende anionische Polymerisation des Glycidylmethylethers in Gegenwart einer wasserstoffaktiven Starterverbindung unter basischer Katalyse. Insbesondere betrifft die Erfindung Polymere der allgemeinen Formel I. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung dieser linearen, methylierten Polyglcerolderivate zur Funktionalisierung beliebiger Oberflächen. So weisen Oberflächen, die eine Beschichtung mit den neuen Polyglycerol-Derivaten besitzen, hervorragende proteinresistente Eigenschaften auf.
Proteinresistente Oberflächenbeschichtungen spielen z. B. in der Medizintechnik eine große Rolle. So werden medizinische Implantate aus verschiedenen Materialien angefertigt, die nach den spezifischen biochemischen und mechanischen Eigenschaften ausgewählt werden. Dazu gehören z. B. chirurgische bzw. orthopädische Schrauben, Platten, Gelenkprothesen, künstliche Herzklappen, Gefäßprothesen, Stents oder auch implantierbare Wirkstoffdepots. Die Materialien müssen für einen dauerhaften Einsatz im Körper geeignet sein, sie weisen aber z. T. erhebliche Nachteile hinsichtlich ihrer Biokompatibilität auf. Auch im Bereich medizinischer Geräte oder Biosensoren sind proteinabweisende Materialien unabkömmlich um die Biofilmbildung durch unspezifische Adsorption biologischer Spezies wie z. B. Bakterien, Zellen oder auch Viren an fest-flüssigen Grenzflächen zu unterdrücken. Darüber hinaus werden z. B. auch in der Optik Produkte benötigt, die proteinresistent sind und eine gute Biokompatibilität besitzen.
Um die Biokompatibilität von einzusetzenden Materialien zu erhöhen, werden verschiedene Verbindungen angewandt, mit denen die Oberflächen der entsprechenden Materialien in geeigneter Weise beschichtet werden. Neben kohlenstoffbasierten Schichten, gewinnen auch Kunststoffschichten immer mehr an Bedeutung. Gegenwärtig finden insbesondere Polyethylenglykol-Derivate (PEG) weite Verbreitung bei der Beschichtung z. B. von biomedizinischen Geräten, Implantaten und optischen Materialien, jedoch sind diese Derivate als oxidationsempfindlich bekannt. Es wird deshalb nach Substanzen gesucht, die nicht auf der Derivatisierung von Ethyleneinheiten beruhen.
So sind aus DE 103 11 163 A1 proteinabweisende Verbindungen auf der Basis hyperverzweigter und dendritischer Polymerfilme zur Oberflächenmodifizierung bekannt. Diese Polymere sind von Glycerin abgeleitete Ether und/oder Etheralkohole, die mindestens eine Thioctinsäuregruppe zur Immobilisierung besitzen. Gegenwärtig gibt es allerdings noch kein Material, das vollständig resistent ist und eine Adsorption von Proteinen, Bakterien, Zellen und/oder Viren völlig verhindern kann. So stellen die große Anzahl von freien OH-Gruppen in den hochverzweigten und dendritischen Polyglycerolen ein Potential dar, das den Verbindungen gestattet, Zucker und Glycoproteine nachzuahmen, was so langfristig zu Biokompatibilitätsproblemen führt. Die Autoren stellten allerdings auch fest, dass vollständig methyliertes Polyglycerin mit einer Thioctinsäure-Gruppe zur Immobilisierung einer Goldoberfläche keinerlei proteinabweisende Eigenschaften verleihen konnte.
Von Metzke et al wurde dagegen in J. Am. Chem. Soc. 2003, 125:7760-7761 ein aus methylierten Zuckereinheiten dargestellter Seitenketten-Polyether beschrieben, der Proteinresistenz besitzt. Jedoch ist das Verfahren kompliziert und die Produkte sind nur über eine langwierige, mehrstufige Synthese zugängig.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, weitere Materialien zur Beschichtung von Oberflächen zu finden, die zum einen gute Proteinresistenz zeigen und die andererseits einfach und kostengünstig herstellbar sind.
Überraschenderweise wurde jetzt gefunden, dass definiert aufgebaute lineare, methylierte Polyglycerole mit einem Polymerisationsgrad von 1 bis 1000 mit engen Molmasseverteilungen ermittelt durch GPC und Polydispersitäten kleiner 2, vorzugsweise kleiner 1.1 (PS-Standard) Proteinresistenz besitzen und im Vergleich zu den hochverzweigten und dendritischen Polyglycerolen aus DE 103 11 163 A1 sogar verbesserte proteinresistente Eigenschaften aufweisen.
Darüber hinaus sind diese definiert aufgebauten linearen, methylierten Polyglycerole leicht herstellbar, wenn man Glycidylmethylether mittels ringöffnender anionischer Polymerisation in Gegenwart einer Starterverbindung unter basischer Katalyse polymerisiert. Der Epoxidring wird durch die Basenkatalyse bevorzugt am unsubstituierten Ende geöffnet und es kommt zur Ausbildung der linearen, methylierten Polymere.
Gegenstand der Erfindung sind deshalb bevorzugt lineare, methylierte Polyglycerole der allgemeinen Formel I
worin bedeutet
X = C₁ bis C₂₀-Alkyl, Aryl, OH, NH₂ oder SH, wobei die Gruppen OH, NH₂ oder SH auch mit einer Schutzgruppe versehen sein können,
Y = OH, COOR, N₃, NH₂, SH, Halogen, Keton und R = C₁ bis C₆-Alkyl,
m = 0 bis 30,
n = beliebige Zahl, vorzugsweise 1 bis 100.
Unter einem Arylrest wird ein substituierter oder unsubstituierter Phenyl- oder Naphthylrest oder ein Heterocyclus verstanden. Die Reste können durch OH, NH₂, CH₃ und Halogen substituiert sein. Bevorzugt bedeutet Aryl einen Phenylrest. Heterocyclen sind 5- und 6-Ringheterocyclen, welche Heteroatome aus mindestens einem anderen Element, vorzugsweise Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthalten.
Unter Halogen versteht man insbesondere F, Cl, Br und J.
Anionische Polymerisation ist dem Fachmann bekannt. Die Besonderheit an der anionischen Polymerisation ist, dass praktisch keine Kettenübertragung und keine Abbruchreaktionen stattfinden, so dass die Kettenreaktion weitergehen kann, solange noch Monomere vorhanden sind, es sei denn man gibt Stoffe zum Kettenabbruch hinzu. Da es sich also um eine so genannte lebende Polymerisation handelt, kann das Molekulargewicht eines gewünschten Oligo- oder Polymeren über das Verhältnis von Monomer zu Initiator sehr gut eingestellt werden.
Erfindungsgemäß dient als wasserstoffaktive Starterverbindung ein Alkoholderivat der Formel II X-(CH₂)_m-OH II,worin X und m die o. g. Bedeutungen besitzen.
Beispielhaft seien genannt:
Methanol, Ethanol, n-, sec-, tert-Butanol,
Phenol, Benzylalkohol, Diole, wie z. B. Monoethylenglykol, 1,3-Propylenglykol, 1,4-Butylendiol, Hexamethylenglykol,
Aminoalkanole, vorzugsweise Aminopropanole, insbesondere 3-Aminopropanol u.a. Homologe,
Mercaptoalkanole, vorzugsweise 2-Mercaptoethanol u.a. Homologe.
Bevorzugte Schutzgruppen für die OH, NH₂ oder SH-Gruppe sind z. B. Trimethylsilyl(TMS)-ether, Benzylgruppen und tert-Butoxycarbonyl(BOC) sowie 4-Methoxybenzyl oder Triphenylmethyl.
Die Starterverbindungen II werden als erstes durch eine starke Base partiell deprotoniert, bevorzugt mit einem Alkalimetall, vorzugsweise Kalium oder einem Alkalimetallhydroxid oder -alkoxid, vorzugsweise Kaliumhydroxid oder -tert-butoxid. Zur Vermeidung von Durchmischungsproblemen wird das basische Initiatorsystem, vorzugsweise unter Inertgas (z. B. N₂, Ar), in einem inerten Lösungsmittel, wie z. B. Diethylenglycoldimethylether (Diglyme^®), Dioxan oder Dimethoxyethan(DME) gelöst oder dispergiert.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden die Verbindungen der allgemeinen Formel I hergestellt, indem man ein Alkoholderivat der allgemeinen Formel II in Diethylenglycoldimethylether mit der starken Base in Kontakt bringt, anschließend den Glycidylmethylether (das Monomer) zusetzt und zur Zielverbindung I polymerisiert. Die Monomerlösung wird vorzugsweise unter Inertgas (z. B. N₂, Ar) zur Initiatormischung zudosiert.
Die Reaktionstemperaturen betragen üblicherweise 40°C bis 150°C, vorzugsweise 70 bis 120°C. In der Regel wird die Reaktion unter Normaldruck durchgeführt.
Die Aufarbeitung des Polymers erfolgt bevorzugt durch Behandlung mit einem sauren Ionenaustauscher. Bevorzugt wird ein sulfoniertes Polystyrolharz in Methanol zum Beenden der Polymerisation einsetzt, besonders bevorzugt Lewatit K1131 (Bayer AG). Nach Abfiltration des Ionenaustauschers und Abdestillation des Lösungsmittels schließt sich ggf. eine weitere Aufreinigung des Polymers an und das Polymer wird z. B. im Vakuum von Lösungsmittelresten befreit.
Ggf. vorhandene Schutzgruppen für X werden durch abschließende Abspaltung nach an sich bekannten Techniken entfernt. So erfolgt z. B. die Abspaltung von Benzylgruppen bevorzugt mit H₂ in Gegenwart von Pd/C.
In folgendem Schema ist die Reaktion kurz dargestellt:
wobei X und m und n = die o.g. Bedeutungen besitzen und Y = OH ist.
Nach erfolgter Polymerisation kann die endständige sekundäre Hydroxygruppe in Verbindung I (Y = OH) durch an sich bekannte Reaktionen (Endgruppenfunktionalisierungen) z. B. verestert, verethert, halogeniert, sulfidiert, alkyliert, aminiert oder azidiert werden um so Polymere zu erhalten, die die unter Y genannten funktionellen Gruppen aufweisen.
Im Falle von X = OH, NH₂ oder SH bieten die einsetzbaren Alkoholderivate der allgemeinen Formel II – mit leicht abspaltbaren Schutzgruppen versehen – die Möglichkeit, eine weitere Funktionalität in der Zielverbindung I (Oligo- oder Polymer) bereitzustellen. Die Kettenlänge m des Alkylspacers zwischen Alkohol und der weiteren Funktionalität X des Alkohol-Derivats II ist dabei beliebig variierbar.
Die vorliegende erfindungsgemäße Synthese ist einfach und gestattet die Herstellung der Zielverbindungen I aus nicht-toxischen Ausgangsverbindungen. Darüber hinaus wird durch die einfache Verfahrensweise eine Ausbeute im Multi-Gramm-Maßstab ermöglicht.
Die so hergestellten neuen Verbindungen sind aufgrund ihrer reaktiven Endgruppen in der Lage beliebige Oberflächen, wie z. B. Glas, Metalle und Polymere, vorzugsweise durch Ausbildung kovalenter Bindungen zu funktionalisieren. Die erfindungsgemäßen Verbindungen I zeigen gute proteinresistente Eigenschaften, die denen PEG-beschichteter Oberflächen entsprechen. Im Unterschied zu den PEG-Schichten sind jedoch Oberflächen, die mit den neuen linearen, methylierten Polyglycerolen beschichtet sind, wesentlich oxidationsbeständiger.
Weiterhin haben die neuen Verbindungen den Vorteil, dass es auch langfristig nicht zu Biokompatibilitätsproblemen kommen kann, da sie, im Vergleich mit den bekannten hochverzweigten und dendritischen Polyglycerolen, keine freien OH-Gruppen besitzen, die Zucker oder Glycoproteine nachmachen können.
Insbesondere der lineare Aufbau der vorliegenden Oligo- oder Polymerketten, der eine sehr flexible Struktur gewährt, sowie die Anwesenheit von Wasserstoffbrücken-Akzeptoren und die Abwesenheit von Wasserstoffbrücken-Donoren (außer ggf. der terminalen Hydroxygruppe wenn Y = OH) garantieren eine gute Proteinresistenz.
Darüber hinaus bietet diese terminale ON-Gruppe, wie bereits ausgeführt, zusätzlich die Möglichkeit weitere funktionelle Gruppen oder auch geeignete Linker-Gruppen anzubringen, die in der Lage sind, Proteine selektiv und spezifisch zu immobilisieren. Dadurch kann an einer Oberfläche, die mit einem linearen, methylierten Polyglycerol der allgemeinen Formel I beschichtet ist, sowohl eine unspezifische Adsorption von Proteinen unterdrückt als auch eine spezifische Adsorption gefördert werden. Die Verbindungen I stellen demzufolge auch vielseitig verwendbare hochfunktionelle polymere Zwischenstufen dar, die eine große Variationsbreite eröffnen und durch die gezielte Steuerung des Polymerisationsgrades sowie des Funktionalisierungsgrades vielfältige Anwendungsmöglichkeiten bieten.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Polyglycerolderivate der allgemeinen Formel I zur Beschichtung von Oberflächen beliebiger Materialien. Insbesondere werden sie zum Beschichten medizinischer Geräte oder Biosensoren verwendet, zum Beschichten von medizinischen Implantaten, wie z. B. von chirurgischen bzw. orthopädischen Schrauben, Platten, Gelenkprothesen, künstlichen Herzklappen, Gefäßprothesen, Stents oder auch von implantierbaren Wirkstoffdepots bzw. zum Beschichten von Produkten der optischen Industrie, z. B bei Kontaktlinsen. Darüber hinaus eignen sie sich als Filtermaterialien bzw. zur Beschichtung von Materialien in der Filtrationstechnik.
Entsprechend modifizierte Oberflächen können in einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante zur Kupplung von Liganden an die terminate funktionelle Gruppe des Polymeren und zur Erzeugung spezifischer Proteinwechselwirkung mit gleichzeitiger Unterdrückung der nicht-spezifischen Adsorption verwendet werden.
Die genannten Anwendungsmöglichkeiten stellen jedoch nur eine Auswahl dar und die Erfindung soll nicht auf diese beschränkt werden.
Im Folgenden wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Beispiel 1
Synthese von einem linearen, methylierten Polyglycerolderivat der Formel I, worin X einen Dibenzylaminopropanylrest bedeutet, mit einem theoretisch eingestellten MG von 1500 g/mol
In einem Zweihalskolben werden 5 ml absoluter Diethylenglycoldimethylether unter Argon vorgelegt und sukzessiv 65,5 mg (1,66 mmol) elementares Kalium und 428 mg (1,68 mmol, 1 äq.) 3-Dibenzylaminopropan-1ol hinzugefügt. Das sich langsam hell orange färbende Reaktionsgemisch wird bei 80°C solange gerührt (ca. 5 h) bis eine quantitative Deprotonierung des Alkohols durch vollständigen Umsatz des Kaliums angezeigt wird. Anschließend wird die Initiatorlösung bei 110°C mit 2,13 ml (23,7 mmol, 14 äq.) frisch destilliertem, trockenen Glycidylmethylether versetzt und für weitere 15 h unter Argon gerührt, wobei eine Rotbraunfärbung der Lösung zu beobachten ist. Nachdem die Polymerisation durch Zugabe von 1 g saurem Ionenaustauscher Lewatit K1131 in 10 ml Methanol bei Raumtemperatur beendet und 1 h gerührt worden ist, wird der Ionenaustauscher abfiltriert und das Lösungsmittel abdestilliert. Das erhaltene orangefarbene Oligomer wird zur weiteren Reinigung in Chloroform gelöst, von eventuell verbleibenden, unlöslichen Kaliumsalzen abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Nach Abspaltung der Benzylgruppen (z. B. mit H₂ und Pd/C), Filtration und Trocknung am Hochvakuum erhält man das gewünschte Oligomer als orange, viskose Flüssigkeit, deren Reinheit NMR-spektroskopisch untersucht wurde.
Beispiel 2
Oberflächenmodifikation und Prüfung auf Proteinadsorption
Zur kovalenten Anbindung des in Beispiel 1 hergestellten Polyglycerol-Derivats wurde ein Glassubstrat auf das ein dünner Gold-Film (50 nm) aufgedampft wurde, einer 1 M Lösung des Derivats in Methanol über einen Zeitraum von 18 h ausgesetzt. Nach gründlichem Spülen mit Methanol und Wasser wurde die Proteinadsorption an die modifizierte Glasoberfläche mittels SPR (Oberflächenplasmonen-Resonanz) – Spektroskopie nach der Vorschrift von Whitesides et al. (Langmuir 2001, 17, 1225) verfolgt.
In gleicher Weise wurde eine Goldoberfläche mit einem hochverzweigten Polyglycerol gemäß DE 103 11 163 A1 (Molmasse: 2500 g/mol, Thioctinsäure-Linker) bereitgestellt und getestet. Eine mit 11-Hexadekanthiol beschichtete Oberfläche diente zum Vergleich.
Die jeweiligen Oberflächen wurden mit einer Proteinlösung aus 1 mg/ml Fibrinogen in PBS unmittelbar nach ihrer Fertigung und mit einer Proteinlösung aus 2 mg/ml Fibrinogen in PBS nach einer 2-wöchigen Lagerung bei 4°C in PBS behandelt. Die Flussrate betrug bei allen Tests 10 μl/min, die Einwirkzeit lag jeweils bei 25 min.
Ergebnisse
Test 1 – 1 mg/ml Fibrinogen in PBS
Die Referenzschicht zeigte nach den 25 min eine 100%ige Proteinadsorption. Die Fibrinogen-Behandlung sowohl der mit erfindungsgemäßem linearen, methylierten Polymer beschichteten Oberfläche als auch der mit dem hochverzweigten Polyglycerol über einen Thioctinsäure-Linker beschichteten Oberfläche ergab keine Proteinadsorption.
Test 2 – 2 mg/ml Fibrinogen in PBS nach 2 Wochen Lagerzeit
Die Proteinadsorption der mit dem hochverzweigten Polyglycerol über einen Thioctinsäure-Linker beschichteten Oberfläche lag bei 7,6 %, die Proteinadsorption der mit dem erfindungsgemäßen linearen, methylierten Polymer beschichteten Oberfläche lag dagegen bei 0,11 %.
Resume:
Es wurde festgestellt, dass die mit dem erfindungsgemäßen Polymer nach Beispiel 1 beschichtete Goldoberfläche, auch nach zwei Wochen kaum veränderte proteinresistente Eigenschaften aufweist. Im Unterschied dazu hatte eine mit hochverzweigtem Polyglycerol (Molmasse: 2500 g/mol, Thioctinsäure-Linker) beschichtete Goldoberfläche unter den gleichen Bedingungen nach zwei Wochen bereits ungefähr 10 % ihrer Proteinresistenz verloren.
Dies spricht eindeutig für die Langlebigkeit der Proteinresistenz der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines linearen, methylierten Polyglycerols mit einem Polymerisationsgrad von 1 bis 1000 und mit engen Molmasseverteilungen ermittelt durch GPC und Polydispersitäten kleiner 2, dadurch gekennzeichnet, dass Glycidylmethylether durch ringöffnende anionische Polymerisation in Gegenwart eines Alkoholderivats als wasserstoffaktiver Starterverbindung in einem inerten Lösungsmittel unter basischer Katalyse polymerisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die vorhandene terminale Hydroxylgruppe funktionalisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Polyglycerole die folgende allgemeine Formel I besitzen:
worin bedeutet X = C₁- bis C₂₀-Alkyl, Aryl, OH, NH₂ oder SH, wobei die Gruppen OH, NH₂ oder SH auch mit einer abspaltbaren Schutzgruppe versehen sein können, Y = OH, COOR, N₃, NH₂, SH, Halogen, Keto, R = C₁- bis C₆-Alkyl, m = 0 bis 30, n = beliebige Zahl, vorzugsweise 1 bis 100.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Katalysator ein Alkalimetall, vorzugsweise Kalium oder ein Alkalialkoxid, vorzugsweise Kalium-tert-butoxid, eingesetzt wird.
Lineare, methylierte Polyglycerole, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
Verwendung der linearen, methylierten Polyglycerole gemäß Anspruch 5 zum Beschichten von Oberflächen.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie zum Beschichten von Oberflächen medizinischer Geräte, Biosensoren, Implantaten und optischer Produkte verwendet werden.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Filtermaterialien oder zum Beschichten von Materialien für die Filtrationstechnik verwendet werden.
Verwendung nach Anspruch 6 zur Kupplung von Liganden an die terminate funktionelle Gruppe des Polymeren und Erzeugung spezifischer Proteinwechselwirkung mit gleichzeitiger Unterdrückung der nichtspezifischen Adsorption.