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Die Minimierung beziehungsweise die Vermeidung der Zelladhäsion ist in vielen Applikationen wie der Stammzellkultur, der Generierung von Embryonic Bodies und in 3 D Zellkulturen unabdingbar. Diese Minimierung der Zelladhäsion im Zellkulturgefäß wird im Stand der Technik über unterschiedliche nasschemische Verfahren realisiert werden. Das Problem vieler solcher Schichten zusätzlich zu den hohen Herstellungskosten besteht jedoch darin, dass ihre zellabweisende Funktion durch notwendige Sterilisationsverfahren meist zerstört oder zumindest drastisch verringert wird.
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Diese Erfindung beschreibt die Generierung von zellabweisenden Oberflächen mittels niederdruck-, niedertemperatur Plasmapolymerisationen, welche mittels geeigneter Monomerwahl und Prozessparametern ohne Verlust der zellabweisenden Aktivität mit gängigen Methoden wie Elektronenstrahl und Gamma-bestrahlung sterilisierbar sind.
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Die Zelladhäsion auf synthetischen Oberflächen ist ein sehr komplexer Prozess, der noch immer Gegenstand intensiver Forschung ist (P. Roach, D. Eglin, K. Rohde, C. C. Perry, J. Mater Sci Mater Med 2007, 18(7), 1263-1277). Vereinfacht dargestellt aggregieren Wassermoleküle in Abhängigkeit von den physikalischen und/oder chemischer Grenzflächencharakteristika der synthetischen Plattform auf deren Oberfläche. Diese so gebildete spezifische Hydrathülle hat einen steuernden Einfluss auf die Adsorption verschiedener, für die Zelladhäsion wichtiger, Biomoleküle wie bsp. Proteine und deren Orientierung mittels zwischenmolekularer Wechselwirkungen. Als Resultat bildet sich innerhalb von Minuten bis Stunden eine komplexe Matrix von Proteinen, durch welche die Zelladhäsion gesteuert wird.
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Somit kann an der Grenzfläche Plattform/Proteinmatrix mittels chemischer Funktionalisierung der Plattform eingegriffen werden, um beispielsweise die Zelladhäsion zu unterbinden (K. Uhlig, Angew. Chem. 2008, 42, 5666-5668).
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Als grenzflächenaktive Funktionsschichten haben sich hydrogelartige, unpolare und aprotische Grenzflächen als besonders geeignet erwiesen.
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Die zur Funktionalisierung und Erzeugung von biomolekülabweisenden Schichten gehörenden Substanzen sind in einer Vielzahl der Fälle PEG's (Polyethylenglykole).
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In nasschemischen Funktionalisierungsschritten werden im allgemeinen PEG oder PEG Derivate auf einer Plattform mittels bifunktionellen Crosslinkern fixiert oder nur mittels Adhäsion durch elektrostatische Wechselwirkungen aufgebracht. In Plasmaverfahren können geeignete Bausteine (bsp. Diglyme) mittels Mikrowellenplasma als hoch amorphe PEG ähnliche Plasmapolymere abgeschieden werden (J. Yang, C. J. Gao, Materials Science and Technology 2008, 24/3, 261-265.)
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In all diesen Verfahren spielt eine Sterilisierbarkeit der Funktionsschichten keine Rolle.
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Im Falle von Antifouling Applikationen im Bereich der Zellkultur ist jedoch die Sterilisierbarkeit der Funktionsschicht von großem Vorteil. Bislang sind die Herstellung aseptisch hergestellter Plattformen Stand der Technik.
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In der Schrift
DE 19801038 „Bioaktive und hydrophile Beschichtung von polymeren Substraten“ wird die Beschichtung von polymeren Substraten beschrieben, bei der die Beschichtung über einen Haftvermittler fest an das Substrat gebunden wird. Charakteristika ist hier die fehlende Sterilisierbarkeit und die einhergehende Limitierung auf Bakterienkulturen.
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Die Erfindung
DE102006027125A1 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von definiert aufgebauten linearen, methylierten Polyglycerolderivaten auf Glycidylmethyletherbasis mit einem Polymerisationsgrad von 1 bis 1000 mit engen Molmasseverteilungen, ermittelt durch GPC (Gel Permeation Chromatography), und Polydispersitäten kleiner 2, vorzugsweise kleiner 1,1 (PS-Standard), durch ringöffnende anionische Polymerisation des Glycidylmethylethers in Gegenwart einer wasserstoffaktiven Starterverbindung unter basischer Katalyse. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung dieser linearen, methylierten Polyglycerolderivate zur Funktionalisierung beliebiger Oberflächen. So weisen Oberflächen, die eine Beschichtung mit den neuen Polyglycerolderivaten besitzen, hervorragende proteinresistente Eigenschaften auf. Eine Sterilisierbarkeit und Nutzung in der Zellkultur ist nicht gegeben.
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EP000002252410B1 Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es einen Träger zur Immobilisierung von Nukleinsäuren bei gleichzeitiger Minimierung unspezifischer Bindungen von Proteinen sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung zur Verfügung zu stellen. Eine Nutzung in der Zellkultur ist zur Zellabweisung ist nicht gegeben.
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Die von C. Cassinelli (Surface Modification of Polymeric Biomaterials, Plenum Press New York 1997) beschriebene thermische Ablösung von Zellen auf Poly(N-Isopropylacryamid) gepfropften Petrischalen hat als Nachteil die Notwendigkeit der thermischen Belastung zur Zellablösung für derzeit im Fokus stehende Applikationen wie der Embryonic Body Formation.
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In
DE 10162435 wird eine Oberflächenbeschichtung bei 500 °C - 1000°C durchgeführt, was für viele Zellkulturplattformen nicht praktikabel ist.
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Beschreibung der Erfindung
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Die Lösung des zugrunde liegenden Problems der ressourcenschonenden Herstellungvon zellabweisenden, sterilisierbaren Oberflächen liegt in der Plasmapolymerisation von Ethylenglykolen wie Ethylenglycoldimethylether oder Diglyme bei niedrigen Temperaturen und geringem Energieeintrag unter Nutzung von Edelgasen als Trägergasen. Mittels geeigneter Parameterwahl ist die resultierende zellabweisende Schicht auch in sterilisiertem Zustand funktionsfähig.
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Aus der
WO 01/031339 A1 ist die Anwendung der Plasmapolymerisation bekannt. Dabei wird ein ultradünner ca. 200nm vernetzter Polymerfilm auf einem Substrat mit kontrollierbarer chemischer Funktionalität abgeschieden. Die Eigenschaften des Substrats bleiben dabei weitgehend unbeeinträchtigt. Plasmen oder ionische Gase werden üblicherweise durch ein elektrisches Feld angeregt. Es handelt sich um ein äußerst reaktives chemisches Milieu, das Ionen, Elektronen, neutrale Teilchen und elektromagnetische Strahlung umfasst. Bei reduziertem Druck lassen sich Bedingungen schaffen, bei denen sich die Temperatur der Elektronen deutlich von jener der Ionen und der neutralen Teilchen unterscheidet. Es wurde von H. K. Yasuda, Plasma Polymerisation, Academic Press, London 1985, beschrieben, dass organische Verbindungen (Monomere) rein oder zusammen mit anderen Gasen, z.B. Argon, polymerisieren, wobei sowohl Oberflächen in Kontakt mit dem Plasma als auch stromabwärts der Entladung beschichtet werden. Die Plasmapolymerisation ist eine effektive Route zur lösungsmittelfreien Generierung dünner (>5 nm) Schichten. Die Erzeugung eines kalten Plasmas geschieht im Vakuum durch eine elektrische Entladung, durch die eine sehr reaktive Umgebung bestehend aus Ionen, Radikalen, Elektronen und metastabilen Teilchen erzeugt wird. Durch die Wahl geeigneter Reaktionsbedingungen wie Aktivierung, Druck, Leistungseintrag, Trägergase und organische Ausgangsverbindungen (Monomere) kann eine Polymerisation der Reaktionspartner und die Abscheidung des gebildeten Plasmapolymers auf Substraten erreicht werden. Plasmapolymere unterscheiden sich meist drastisch von herkömmlichen Polymeren aufgrund des Fehlens einer kontinuierlichen Wiederholeinheit sowie einem hohen Grad der Vernetzung. Grund hierfür ist das Vorkommen einer Vielfalt an reaktiven Spezies im Plasma und einer daraus folgenden geringeren Selektivität im Vergleich zu herkömmlichen Synthesewegen. Grundbedingung für die Nutzung potentieller Monomere ist das Verbringen der meist flüssigen Vorläufer in die Gasphase unter den gewählten Reaktionsbedingungen.
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So wird in der
DE 603 04 163 T2 eine Oberflächenmodifikation durch Plasmapolymerisation beschrieben, wodurch eine Oberfläche, die ungleichmäßig ist und lokale Oberflächenbereiche definiert, hergestellt wird. Diese Oberfläche weist eine erhöhte Affinität für biologische Moleküle, die der Oberfläche ausgesetzt sind, auf. Dies wird dadurch erreicht, dass ein Teil des Plasmas durch eine Öffnung abgezogen wird. Alternativ kann ein Plasma an der Spitze oder in einer Mikrokapillare angeregt werden.
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Das Material des Substrats des Trägers ist aus Kunststoff, aus einer Gruppe umfassend ein kohlenstoff- oder siliziumbasiertes Polymer, aus einer Gruppe umfassend Polystyrol (PS), Polyethylen (PE), Polyethylenterephthalat (PET, PETP, PBTP), Polypropylen (PP), Polyvinylchlorid (PVC), Polyamide, Nitrozellulose, Polymethylmetacrylat (PMMA), Styrolacrylnitril (SAN), Polycarbonat (PC), Cycloolefin-Copolymere (COC) wie Cyclopenten-Polyetheylen-Copolymer, Cyclohexan-Polyetheylen-Copolymer, Cyclohepten-Polyetheylen-Copolymer sowie Cycloolefin-Polymere (COP) oder dgl., Ditanalpentoxid, Glas, Metall bzw. Kombinationen daraus, gebildet, wodurch aus dem Stand der Technik bekannte als auch neue Materialien mit Eigenschaften ausgerüstet werden können, die eine Nutzung in der Zellkultur zulassen. Besonders vorteilhaft zeigen sich auch Materialhybride aus Kunststoff und Glas.
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Vor oder während der Plasmapolymerisation kann eine Aktivierung der Oberfläche des Substrats im Plasma durchgeführt werden. Auf vorteilhafte Weise wird mittels einer zweistufigen Synthese, bestehend aus Plasmabehandlung zur Aktivierung gefolgt von einer Plasmapolymersiation, eine Schicht abgeschieden, welche in der Lage ist, die bisherigen Limitierungen hinsichtlich Wirtschaftlichkeit und somit Nutzbarkeit in der Suspensionszellkultur, Stammzellkultur oder auch Makrophagenkultur zu überwinden. Durch eine vorgeschaltete Aktivierung können auch Verunreinigungen des Substrats bzw. an der Oberfläche des Substrats eliminiert werden. Die Aktivierung kann mit einem Reaktionsgemisch umfassend ein Trägergas und ein Reaktionsgas in einem Reaktor durchgeführt wird, wobei das Trägergas ein Inertgas und das Reaktionsgas ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Sauerstoff, Ammoniak, H2, N2, CO2, C2H2, ist, womit kostengünstige Gase zur wirtschaftlichen Produktion plasmapolymerisierter Oberflächen verwendet werden können.
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In einer Weiterbildung ist vorgesehen, dass zwischen der Aktivierung und der Plasmapolymerisation ein Spülgas, vorzugsweise eine Inertgas, dem Reaktor, insbesondere der Reaktionskammer, zugeführt wird, wodurch beispielsweise die Plasmapolymerisation störende Produkte aus der Reaktionskammer abtransportiert werden. Durch die Aktivierung der Substrate mittels Träger- und Reaktionsgase, wie z.B. O2/Ar oder NH3/Ar Plasmen, bei höherer Leistungseinkopplung werden auch Bindungsstellen generiert.
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Die Aktivierung und/oder Plasmapolymerisation kann bei einer Leistungseinkopplung aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,1 W, vorzugsweise 2 W, insbesondere 3 W, und einer oberen Grenze von 500 W, vorzugsweise 100 W, insbesondere 10 W, erfolgen. Bei einer zweistufigen Synthese erfolgt die Aktivierung vorzugsweise bei einer Plasmaleistung aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 2 W und einer oberen Grenze von 300 W und die Plasmapolymerisation bei einer Plasmaleistung aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,1 W und einer oberen Grenze von 5 W durchgeführt wird. Der gewählte Leistungseintrag ermöglicht die Gewährleistung der größtmöglichen Beibehaltung der strukturellen und funktionellen Eigenschaften der Monomere.
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Auch durch Bildung der Beschichtung durch gepulste Plasmen wird ermöglicht, die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der Monomere beizubehalten.
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Die zumindest eine Monomerspezies kann flüssig oder gasförmig zugeführt werden, wobei die flüssigen Monomere direkt in den Reaktor eingespritzt werden können und unter den dort gegebenen Druckbedingungen in die Gasphase übergehen oder außerhalb verdampft und als Gas eindosiert werden. Eine Vorreinigung der Monomere mittels wiederholter vorgeschalteter Entgasungs-/Begasungs- oder Einfrier-/Entgasungszyklen ist nicht notwendig.
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Der Druck während der Aktivierung und/oder Plasmapolymerisation ist aus einem Bereich mit einer oberen Grenze von 1,5 mbar, vorzugsweise 0,5 mbar, und einer unteren Grenze von 0,05 mbar, vorzugsweise 0,2 mbar, ausgewählt, wodurch optimale Druckverhältnisse für die Plasmapolymerisation gegeben sind.
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Die Aktivierung wird für einen Zeitraum mit einer unteren Grenze von 1 min, vorzugsweise, 5 min, und einer oberen Grenze von 15 min, vorzugsweise 10 min, und/oder die Plasmapolymerisation für einen Zeitraum mit einer unteren Grenze von 20 min, vorzugsweise, 60 min, und einer oberen Grenze von 180 min, vorzugsweise 120 min, durchgeführt
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Das Fassungsvermögen der Reaktionskammer für das erfindungsgemäße Verfahren umfasst zwischen 0,01 m3 und 0,8 m3.
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Ausführungsbeispiel 1:
- Argon und Dimethoxyethan werden wie vom Hersteller bezogen eingesetzt.
- Grundkörper aus Polystyrol, Cycloolefinpolymer und Glas werden in der Reaktionskammer platziert und der Druck auf 0,1 mbar reduziert. Es erfolgt die Dosierung von Argon und Dimethoxyethan unter einer Druckeinstellung auf 0,9 mbar und die Leistungseinkopplung von 3 W für 60 min. Die Reaktionskammer wird auf 25°C temperiert.
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Durch die hergestellten Oberflächen ist die Zellabweisung von erfindungsgemäß hergestellten Oberflächen um ein vielfaches höher als bei herkömmlich hergestellten, wie beispielsweise im Stand der Technik, beschriebenen Oberflächen. Die Bindungseigenschaften der funktionalisierten Oberfläche werden mit Hilfe von Zellkultur Tests überprüft, wobei sich eine um den Faktor 10 niedrigere Bindungseigenschaft für erfindungsgemäße Oberflächen im Vergleich zu herkömmlichen Oberflächen wie TC Oberflächen oder Suspensionskulturoberlächen nachweisen lässt. Die Sterilisierbarkeit ist gegeben, wenn die Reaktortemperatur unter 30°C verbleibt und gleichzeitig Ar als trägergas eingesetzt wird.
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- 1: Vergleich für eine schlechte Sterilisierbarkeit (D1-31) und einer guten Sterilisierbarkeit (D1-32) - OD-Werte der Kristallviolettfärbung im Vergleich zu den Referenzen TC und Suspension . Die Sterilisierbarkeit hängt vom Einsatz an Trägergas und der Einhaltung einer Reaktortemperatur unter 30 °C ab. Es werden unterschiedliche Zelllinien eingesetzt (Vero = Nierenzellen grüne Meerkatze, Makro = Makrophagen, CaCo = Adenokarzinom Zellen, MDCK = Nierenzelle Cocker, HaCaT = Humane keratinozyten, CHO, Chines hamster ovary, HELA = Henrietta Lacks,).
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 19801038 [0010]
- DE 102006027125 A1 [0011]
- EP 000002252410 B1 [0012]
- DE 10162435 [0014]
- WO 01/031339 A1 [0016]
- DE 60304163 T2 [0017]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- P. Roach, D. Eglin, K. Rohde, C. C. Perry, J. Mater Sci Mater Med 2007, 18(7), 1263-1277 [0003]
- K. Uhlig, Angew. Chem. 2008, 42, 5666-5668 [0004]
- J. Yang, C. J. Gao, Materials Science and Technology 2008, 24/3, 261-265 [0007]
- C. Cassinelli (Surface Modification of Polymeric Biomaterials, Plenum Press New York 1997) [0013]
