DE68906467T2

DE68906467T2 - Verfahren zur schnellen Anheftung endothelialer Zellen an eine Oberfläche sowie dadurch hergestellte Oberflächen.

Info

Publication number: DE68906467T2
Application number: DE89111839T
Authority: DE
Inventors: Lillian P Baldwin; Joseph A Dipisa; David B Montgomery; Joel L Williams
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1988-07-01
Filing date: 1989-06-29
Publication date: 1993-09-30
Anticipated expiration: 2009-06-30
Also published as: JPH0265867A; ES2054934T3; EP0348969B1; NZ229354A; EP0348969A1; AU620621B2; ATE89176T1; DE68906467D1; AU3598989A; JPH0520110B2; BR8903168A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anbringung von Endothelzellen an eine Oberfläche und insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Ablagerung einer Schicht von Endothelzellen auf einer polymeren Oberfläche und die dadurch hergestellten Oberflächen.
Während vieler Jahre sind ausgedehnte Untersuchungen durchgeführt worden, um Materialien zu finden, die gegen Körperflüssigkeiten biologisch und chemisch stabil sind. Dieses Untersuchungsgebiet hat mit der Entwicklung verschiedenener Objekte und Gegenstände, die mit Blut in Berührung gebracht werden können, wie z.B. künstliche Organe, Gefäßpfropfungen, Sonden, Kanülen, Katheter und dergleichen, zunehmend an Bedeutung gewonnen.
Synthetische Kunststoffe sind als bevorzugte Materialen für solche Gegenstände hervorgetreten. Jedoch haben solche Materialien den schwerwiegenden Nachteil, daß sie thrombogen sind. Selbst solche Kunststoffe wie Polytetrafluorethylen und die Silikonkautschuke, die mit Blut verträglicher als die meisten Kunststoffe sind, zeigen noch thrombogene Eigenschaften.
Der Thrombogenizität wurde üblicherweise durch die Verwendung von Antikoagulantien, wie z.B. Heparin, entgegengewirkt. Als Beispiele für die Heparinisierungsverfahren dienen die Offenbarungen in US-A-4 613 517 und US-A-4 521 564.
In den letzten drei Jahrzehnten sind künstliche Pfropfungen verwendet worden, um den Blutstrom in Ischämiegebieten wiederherzustellen, um den Blutstrom für Hämodialysepatienten bereitzustellen und Arterienaneurismen wiederherzustellen. Während diese Verfahren im allgemeinen anfänglich erfolgreich sind, ist die Langzeitprognose für Patienten, die solche Pfropfungen erhalten, nicht ermutigend, hauptsächlich weil sich geringe Pfropfungsdurchmesser (4 mm oder weniger) mit der Zeit zusetzen, aufgrund von Fibrinablagerungen und Zellanklebungen wegen der thrombogenen Natur des Pfropfmaterials.
Als die ideale Blutoberflächen-Grenzfläche ist lange Zeit natürlich vorkommendes, humanes Endothel angesehen worden, und viele gegenwärtige Untersuchungen sind auf Endothelialisierungsverfahren gerichtet worden. Madri et al., berichteten im Journal of Cell Biology, 97, 153 (1983), daß wenn Zellen auf interstitiellen Kollagenen wachsen gelassen werden, sie eine starke Zellvermehrung durchmachen und eine kontinuierliche Zellschicht bilden. Williams et al., Journal of Surgical Research, 38, 618 (1985) beschrieb die Vorbehandlung von prosthetischem Pfropfmaterial mit Fibronectin, Kollagen oder Blutplasma und berichtete, daß im wesentlichen kein Ankleben auf unbehandeltem Pfropfmaterial auftrat, daß aber dramatische Zunahme des Anklebens auf Protein-beschichteten Polyesterpfropfungen auftrat. Eine ähnliche Studie von Jarrell et al. (Annals of Surgery), 203, 671 (1986) zeigte einen hohen Prozentsatz festen Anklebens von Endothelzellen auf mit plättchenreichem Plasma beschichteten Polyester in 10 min, auf Amnion/Kollagenbeschichteten Polyester in 30 min und an einfaches Polyester in zwei Stunden, aber daß nur die Amnion/Kollagen-beschichtete Oberfläche vollständige Pfropfungsbedeckung aufwies.
In neuerer Zeit richtete sich die Aufmerksamkeit auf die schlechten Ergebnisse, die mit Gefäßpfropfungen von geringen Durchmessern erhalten wurden. Van Wachem et al., stellte in Biomaterials, 6, 403 (1985) klinische Erfolge mit Polymerpfropfungen, die größer als 4 mm waren, vor, aber daß Pfropfungen von weniger als 4 mm im allgemeinen enttäuschende klinische Ergebnisse wegen plötzlicher Verschlüsse ergaben. Ähnlich stellten Baker et al. in American Journal of Surgery, 150, 197 (1985) fest, daß langfristige Durchgängigkeit großer Durchmesser von Gefäßpfropfungen verhältnismäßig annehmbar ist, aber Pfropfungen mit kleinem Durchmesser (weniger als 4 mm) schlechte, langfristige Durchlässigkeitsraten zeigen.
Das Besiedeln von Polyestergefäßpfropfungen mit einem Innerndurchmesser von 4 mm mit Endothelzellen und die Durchlässigkeit nach der Implantation in Hunden wird von Belden et al. in Trans. Am. Soc. Artif. Inter. Organs, 28, 173 (1982) erörtert.
Modifikationen polymerer Oberflächen durch die Behandlung mit einer Vielfalt von Plasmen, um bestimmte Ergebnisse zu erhalten, sind wohlbekannt. Z.B. die Oberflächenbenetzbarkeit, statische Eigenschaften und die Aufnahmefähigkeit einer Oberfläche zur Ablagerung einer Schicht eines klebenden, polymeren Materials sind beschrieben worden. Die Doktorarbeit von Lee M. Smith, "Cell Adhesion As Influenced By Substrate Surface Properties" Department of Material Science and Engineering, der Universität Utah, 1978, S. 67, schlägt vor, daß Zellanklebung eine Funktion des Verhältnisses Kohlenstoff/Sauerstoff der Oberfläche ist. Van Wachem et al., (siehe oben) offenbaren, daß Endothelzellen auf Glas oder mit Glimmentladung behandeltem Polystyrol kultiviert werden können.
US-A-4 452 679 offenbart ein Verfahren, um eine polymere Oberfläche zu modifizieren, um durch die Behandlung der Oberfläche mit einem Plasma, bei dem wenigstens eine der neutralen, positiven oder negativen Arten des Plasmas von der Berührung mit der Oberfläche ausgeschlossen ist, spezifische, chemische Gruppen einzuführen.
Endothelzellen kleben teilweise, aber nicht zusammenfließend an einer unbehandelten Dacron -Polyesteroberfläche, diese Oberfläche wird in 24 Stunden zusammenfließend bedeckt, und es tritt dicht zusammenfließende Bedeckung bei einer mit einem Protein vorbehandelten Dacron Oberfläche, wie z.B. plättchenreichem Plasma, auf. In der vorliegenden Offenbarung wird die Bezeichnung zusammenfließend verwendet, um eine Oberfläche zu beschreiben, die im wesentlichen mit Zellen bedeckt ist, die in allen Richtungen aneinander angrenzend sind.
EP-A-0 124 200 offenbart die Modifikation von polymeren Oberflächen durch Plasmabehandlung, wobei das Plasma von einem gasförmigen Material erzeugt wird, das unter anderen Stickstoff und/oder Sauerstoff umfaßt.
Das gleiche gilt für "Biomaterials", Bd. 3, Nr. 2, April 1982.
Von "Biomaterials", Bd. 8, Nr. 5, September 1987 ist bekannt, daß starke, elektrostatische Wechselwirkung zwischen der negativ geladenen Zellmembran und einer positiv geladenen Oberfläche auftritt.
Von Bruce E. Jarrell, A.. Surg., Juni 1986, Seite 671 ist bekannt, daß eine zusammenfließende, berührungsgehemmte Monoschicht von Endothelzellen eine Dichte von 10&sup5; Endothelzellen pro cm² haben sollte.
Trotz der ausgedehnten Forschungen hinsichtlich antithrombogener, prosthetischer Vorrichtungen, ist das Problem der Thrombogenizität, insbesondere bezüglich der Pfropfungen bei kleinen Durchmessern nicht zufriedenstellend gelöst worden. Die gegenwärtige Erfindung ist auf die Lösung dieses Problems ausgerichtet.
Ein Gesichtspunkt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Oberfläche mit einer zusammenfließenden Schicht von Endothelzellen darauf, gemäß Anspruch 1. Ein polymeres Substrat wird einem Plasma ausgesetzt, das aus einem Material erzeugt wird, das Stickstoff enthält. Die Plasmabehandlung verursacht das Binden von Aminogruppen an dem Substrat. Das Aminogruppen enthaltende Substrat wird mit Endothelzellen in Berührung gebracht, die an dem Substrat ankleben. Die Dichte der Zellen in dem Berührungsmedium reicht aus, um das Ankleben der Zellen zu bewirken, wodurch eine zusammenfließende Schicht ohne starke Zellvermehrung auf einem Substrat gebildet wird. Es handelt sich um ein polymeres Substrat.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist ein antithrobogener Gegenstand, der ein Plasma-behandeltes Substrat mit einer zusammenfließenden Schicht von darauf angeklebten Endothelzellen, gemäß Anspruch 5, umfaßt. Die Gegenstände sind polymere Gegenstände und können jede beliebige Gestalt haben. Der bevorzugte Gegenstand ist eine Leitung mit einem Innendurchmesser von 0,5 mm oder größer. Eine bevorzugte, spezifische Ausführungsform ist eine Leitung mit einem Innendurchmesser von 2 bis 6 mm. Die Lumenwandung dieser Leitungen ist Plasma-behandelt und endothelialisiert.
Das Plasma kann aus jeder beliebigen Stickstoffquelle hergestellt sein, die ionisiert werden kann. Bevorzugte Plasmen werden aus Ammoniak hergestellt, am meisten bevorzugt aus Ammoniak, der eine niedrige Sauerstoffkonzentration enthält.
Das Plasma-behandelte Substrat kann mit den Endothelzellen in einem geeigneten Medium in Berührung gebracht werden, wie z.B. gepufferter Kochsalzlösung, vorzugsweise unter Inkubationsbedingungen, um die Bildung einer klebenden, zusammenfließenden Schicht der Zellen auf dem Substrat zu bewirken.
Auf diese Weise werden gemäß der Erfindung Gegenstände mit einer Plasma-behandelten polymeren Oberfläche und einer zusammenfließenden Schicht klebender Endothelzellen darauf durch ein Zweistufenverfahren hergestellt, das eine Vorbehandlung der Gegenstandsoberfläche mit einem Plasma umfaßt, um eine aminreiche Oberfläche und die Anbringung von Endothelzellen darauf zu erzeugen. Die Plasma-behandelte Oberfläche ist vor der Endothelialisierung unbegrenzt stabil und hat daher eine lange Lebensdauer. Da die Zellen schnell ankleben und ohne die starke Zellvermehrung zusammenfließen, kann eine prosthetische Vorrichtung mit der Plasma-behandelten Oberfläche der Erfindung aus dem Vorrat entnommen, endothelialisiert werden und innerhalb von Minuten einer Beschaffung von genügend Zellen für eine Implantation bereit sein. Die Vorteile der Geschwindigkeit für einen sich einer Operation unterziehenden Patienten sind offensichtlich.
Während diese Erfindung Ausführungsformen in vielen verschiedenen Formen genügt, werden hier bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung ausführlich beschrieben, wobei klar ist, daß die vorliegende Offenbarung als beispielhaft für die Prinzipien der Erfindung anzusehen ist und nicht beabsichtigt ist, die Erfindung auf die beschriebenen Ausführungsformen zu begrenzen.
Ein Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, die Oberflächen der organischen und anorganischen Substrate irreversibel zu modifizieren. Insbesondere gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Oberflächen der organischen und anorganischen Substrate durch das Binden spezifischer, chemischer, funktioneller Arten auf der Oberfläche des Substrats irreversibel modifiziert, indem solche Oberflächen mit einem Plasma eines gasförmigen Materials in Berührung gebracht werden, um die Zellablagerung und das Ankleben zu erleichtern.
Die vorliegende Erfindung kann eingesetzt werden, um die Oberflächen fester, polymerer Materialien, einschließlich natürlicher und synthetischer Additions- und Kondensationspolymere zu verändern. Solche polymeren Materialien schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, Polyolefine ein, wie z.B. Polyethylen, Polypropylen, Polyisobutylen und Ethylen-alpha-olefin-Copolymere, Acrylpolymere- und Copolymere, wie z.B. Polyacrylat, Polymethylmethacrylat, Polyethylacrylat; Vinylhalogenpolymere und Copolymere, wie z.B. Polyvinylchlorid; Polyvinylether, wie z.B. Polyvinylmethylether; Polyvinylidenhalogenide, wie z.B. Polyvinylidenfluorid und Polyvinylidenchlorid; Polyacrylnitril, Polyvinylketone; Polyvinylaromaten, wie z.B. Polystyrol; Polyvinylester, wie z.B. Polyvinylacetat; Copolymere von Vinylmonomeren untereinander und Olefinen, wie z.B. Ethylenmethylmethacrylat-Copolymere, Acrylnitrilstyrol-Copolymere, ABS-Harze und Ethylenvinylacetat-Copolymere; natürliche und synthetische Kautschuke, einschließlich Butadienstyrol-Copolymere, Polyisopren, synthetisches Polyisopren, Polybutadien, Butadienacrylnitril-Copolymere, Polychloroprenkautschuke, Polyisobutylenkautschuk, Ethylenpropylendienkautschuke, Isobutylenisopren-Copolymere und Polyurethankautschuke; Polyamide, wie z.B. Nylon 66 und Polycaprolactam; Polyester, wie z.B. Polyethylenterephthalat, Alkyd-Harze; Phenolformaldehyd-Harze; Harnstoffformaldehyd-Harze; Melaminformaldehyd-Harze; Polycarbonate; Polyoxymethylene; Polyimide; Polyether; Epoxy-Harze; Polyurethane; Wolle; Baumwolle; Seide; Rayon; Rayontriacetat; Cellulose; Celluloseacetat; Cellulosebutyrat; Celluloseacetatbutyrat; Cellophan; Cellulosenitrat; Cellulosepropionat; Celluloseether; und Carboxymethylcellulose.
Die Substrate können jede beliebige Form haben, verhältnismäßg flach oder gekrümmt und können jede beliebige Zusammensetzung haben, wie z.B. kontinuierlich oder teilchenförmig, porös oder undurchlässig und groß oder klein. Die Erfindung kann zur Änderung der Oberflächen von Kristallen, Pulvern, Platten, Streifen, Filmen Folien, Drähten, Fasern, Geweben, Fäden, Rohrleitungen und Gußformen, extrudierten oder gepreßten Gegenständen und dergleichen eingesetzt werden.
Für die meisten Plasmabehandlungen kann, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein herkömmlicher Plasmagenerator verwendet werden. Solche Generatoren können thermische, Radiofrequenz, Gleichstrom, Hörfrequenz und Mikrowellenplasmen einschließen, unter Verwendung interner und externer kapazitiver Kopplung, induktiver Kopplung, Widerstandskopplung und Hohlleitertechniken. Elektrische Anregung kann mittels einer Gleichstrom- oder niederfrequenten Wechselstrom-Glimmentladung durch interne Elektroden erzeugt werden oder durch Koppeln induktiver oder kapazitiver Mittel mit Höherfrequenzenergiequellen aus Hörfrequenzen bis hinauf über eine Radiofrequenz und in Mikrowellenfrequenzen hinein. Mikrowellen Hohlleitertechniken können auch verwendet werden. Als Beispiele für geeignete Plasmageneratoren dienen die von Branson/IPC hergestellten Plasmareaktoren, und Systeme zur Plasmaoberflächenbehandlung werden von Plasma Science Inc. hergestellt.
Für eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, worin eine Leitung mit einem kleinen Durchmesser mit Plasma behandelt wird, kann ein Gerät, wie es im EP-A-0 348 690 offenbart ist, verwendet werden.
Das Plasma kann aus irgendeinem Gas oder einer gasförmigen Mischung, die reaktionsfähige, funktionelle Gruppen aus dem Gas zur Verfügung stellt, die auf die Oberfläche gepfropft sind, hergestellt werden. Geeignete Gase sind z.B. Sauerstoff, Stickstoff und organische oder anorganische Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht aus Sauerstoff oder Stickstoff, wie z.B. Methanol, Acetonitril oder Blausäure. Bevorzugte Gase sind stickstoffhaltige, wie z.B. Stickstoff, aliphatische Amine mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydrazin, Ammoniak oder Mischungen derselben. Andere Bestandteile, wie z.B. Wasserstoff, Halogen und Inertgas, wie z.B. Helium, Sauerstoff, Neon, Krypton und Xenon können in dem Gasgemisch vorhanden sein.
Das bevorzugte Plasma bei der Herstellung der Oberflächenmodifikation zur Anklebung der Zellen wird von Ammoniak erzeugt, das eine niedrige Sauerstoffkonzentration enthält. Das Verhältnis Sauerstoff zu Ammoniak kann etwa 0,005 bis 0,8 sein , vorzugsweise etwa 0,01 bis 0,1. Das gewünschte Verhältnis kann dadurch erreicht werden, daß geeignete Mengen Gas in die Reaktionskammer nach herkömmlichem Auspumpen ausströmengelassen werden. Jedoch bleibt für die meisten Oberflächenbehandlungen gemäß der vorliegenden Erfindung genügend Sauerstoff nach dem Auspumpen in der Vakuumkammer, um das gewünschte Verhältnis zu erreichen. Es ist klar, daß die in der Kammer verbleibende Sauerstoffmenge mit dem Auspumpdruck in der evakuierten Kammer in Beziehung steht. Daher kann ein gewünschtes Sauerstoff-Stickstoff-Verhältnis innerhalb eines geeigneten Gesamtgasdrucks durch Evakuieren der Kammer auf einen vorher bestimmten Druck und Ausströmenlassen von Ammoniak in der geforderten Menge erhalten werden. Im allgemeinen kann eine enge Annäherung der gewünschten Sauerstoffkonzentration durch einfache Steuerung der Auspumpzeit erreicht werden.
Plasmaerzeugung für eine Oberflächenmodifikation gemäß der vorliegenden Erfindung kann in einem weiten Bereich der Energieeinstellungen, Radiofrequenzen, Einwirkungsdauer, Temperaturen und Gasdrücken durchgeführt werden. Bereiche für diese Parameter, die vorteilhafte Ergebnisse liefern, sind gemessene Gleichstrom- oder Wechselstrom-Energiedichtegrade von 0,001 bis 400 Watt pro Kubikzentimeter, Oszillationsfrequenzen bis zu 100 Megahertz, 2 Sekunden bis 12 Stunden, 0 bis 200 ºC und 1,3 x 10&supmin;&sup5; bis 1,3 x 10&supmin;¹ bar (0,01 bis 100 Torr). Bevorzugte Bereiche für diese Parameter sind 0,01 bis 200 Watt pro Kubikzentimeter, 5 bis 30 Megahertz, 5 Sekunden bis 120 Minuten, 10 - 50 ºC und 1,3 x 10&supmin;&sup5; bis 2,6 x 10&supmin;² bar (0,01 bis 20 Torr). Die Gasflußgeschwindigkeiten können von stillstehenden Bedingungen bis mehreren Volumenaustauschen pro Sekunden reichen.
Der Auspumpdruck, der die Sauerstoffkonzentration steuert, kann von 0,1 bis 100, vorzugsweise etwa 6,6 x 10&supmin;&sup6; bis 6,6 x 10&supmin;&sup5; bar (5 bis 50 Millitorr) reichen. Da diese Auspumpdrücke von der Kapazität der Pumpe abhängig sind, können sie in etwa 1 min bis 72 Stunden erreicht werden.
Die polymere Oberfläche der Erfindung, die durch Einwirkenlassen eines aus einem Ammoniak-Sauerstoff Gemisch erzeugten Plasmas modifiziert wurde, enthält an seiner Oberfläche gebundene Aminogruppen. Zusätzlich sind Sauerstoff enthaltende Gruppen, wie z.B. Carbonyl-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Ether- und Peroxidgruppen als Folge der Reaktion der Oberfläche mit reaktionsfähigen Sauerstoffarten vorhanden.
In den folgenden Beispielen werden polymere Substrate auf ein aus einer Sauerstoff-Ammoniak-Mischung erzeugtes Plasma einwirkengelassen. Die Plasma-behandelten Substratoberflächen können mit herkömmlicher Elektronenspektroskopie für die chemische Analyse (ESCA) untersucht werden, um Bindungsenergie-shifts zu messen und daraus die Natur der funktionellen Gruppen auf der Oberfläche zu bestimmen. Vergleichende ESCA Daten für die Plasma-modifizierten Oberflächen der Erfindung und unbehandelte Oberflächen sind in Tabelle 1 dargestellt.
Die Amino- und Sauerstoff-haltigen Gruppen, die auf den Substratoberflächen durch das Plasma eingeführt wurden, machen die Oberfläche für die Ablagerung und das Ankleben von Zellen geeignet. Im zweiten Schritt des Verfahrens der Erfindung können Endothelzelltypen auf den Plasma-behandelten Oberflächen der Erfindung angebracht werden. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Endothelzellen aus verschiedenen Quellen sind wohlbekannt, und die Bereitstellung von Zellen für das Ankleben an der Plasma-behandelten Substratoberfläche der Erfindung ist nicht Teil der Erfindung.
Endothelialisierung kann durch In-Berührung-Bringen der Plasma-behandelten Substratoberfläche mit ausreichenden, in einem Medium suspendierten Zellen durchgeführt werden, um die Bildung einer zusammenfließenden Schicht ohne die Forderung der starken Zellvermehrung zu bewirken. Gemäß der Erfindung wird diese Technik und das Suspendierende Medium als Aufschwemmen beziehungsweise als Aufschwemm-Medium bezeichnet.
Jegliches Aufschwemm-Medium, das für die Zellen nicht schädlich ist, kann verwendet werden. Bevorzugte Auf-Schwemm-Nedien sind Puffer, wie z.B. gepufferte Kochsalzlösung. Die Zellen kleben zusammenfließend minutenschnell, im allgemeinen in etwa 1 bis 60 Minuten. Falls gewünscht, kann das Ankleben durch Inkubieren der aufgeschwemmten Oberfläche bei einer Temperatur von etwa 10 bis 50 ºC, vorzugsweise bei 37 ºC, beschleunigt werden.
Die Anzahl der Zellen, die erforderlich sind, um die Plasma-behandelte Oberfläche aufzuschwemmen, variiert etwas in Übereinstimmung mit dem speziellen Polymer und der speziellen Oberflächenchemie nach der Plasmabehandlung. Im allgemeinen reicht es aus, wenn die Oberfläche mit etwa 10&sup5; Zellen pro Quadratzentimeter bedeckt ist, jedoch kann auch eine größere Konzentration verwendet werden. Die Bestimmung dieser Zahl und der Konzentration der Zellen in dem Aufschwemm-Medium, die nicht kritisch ist, fallen in den Bereich des Fachmanns. In ähnlicher Weise ist der Nachweis des Zellklebens und -Zusammenfließens durch Abtasten mit einem Elektronenmikroskop oder mit einem Lichtmikroskop nach dem Anfärben üblich.
In einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung werden antithrombogene Gegenstände mit einer Plasma-behandelten Oberfläche und einer zusammenfließenden Schicht von Endothelzellen, die direkt an die Plasma-behandelte Oberfläche angeklebt sind, zur Verfügung gestellt. Als Beispiele für Gegenstände, die als in dem Rahmen der Erfindung befindlich angesehen werden, sind prosthetische Vorrichtungen, die mit Blut in Berührung kommen und, als nicht begrenzende Beispiele, künstliche Herzen, Herzklappen, Nägel und vorzugsweise Gefäßpfropfungen einschließen. Der am meisten bevorzugte Gegenstand der Erfindung ist eine Gefäßpfropfung mit kleinem Durchmesser, wie z.B. eine Leitung mit einem Innendurchmesser von 6 mm oder weniger, mit einer Plasma-behandelten und endothelialisierten Lumenwand.

Beispiel I

Flache Polyurethanfilmproben wurden in einem RF Plasma-Entladungssystem modifiziert. Ein Paar Aluminumelektroden mit 20,3 cm (8 Inch) Durchmesser in einem Abstand von 9,5 cm (3 3/4 Inch) wurden im Innern einer 55,8 cm (22 Inch) langen Vakuumkammer mit 30,5 cm (12 Inch) Durchmesser verwendet. Hochfrequenz-Energie wurde von einem variablen Frequenzoszillator/Verstärkerpaar in ein "T" Anpassungs-Netzwerk durch einen Symmetrieumwandler in die Vakuumkammer unter Verwendung einer verschlossenen Durchführung abgegeben und dann wurden die abgeglichenen Leitungen mit den gegenüberliegenden horizontalen Elektroden verbunden. Die Filmproben wurden oben auf die untere Elektrode gelegt.
Die Kammer wurde auf 60 mTorr in 6 Minuten ausgepumpt. Während das Pumpen fortgesetzt wurde, wurde wasserfreies Ammoniakgas durch ein Feintriebventil in die Kammer bei einer Geschwindigkeit, die ausreicht, um 2,6 x 10&supmin;¹ bar (200 mTorr) Druck aufrechtzuerhalten, ausströmen gelassen. Nachdem das System 1 Minute auf diese Weise gespült war, wurde 2 Minuten lang ein 10,5 MHz RF Plasma von 25 Watt erzeugt, um den Film zu behandeln. Nach der Behandlung wurde das System auf Atmosphärendruck belüftet und die Proben entfernt.
Die Chemie der Probenoberflächen wurde unter Verwendung von ESCA gemessen und die resultierenden elementaren Zusammensetzungen für behandelte und unbehandelte Proben sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Elementare, atomare Prozentwerte für mit Plasma behandelte und reine Polyurethane Plasma-behandelt reines Polymer Substrat Kohlenstoff Sauerstoff Stickstoff Polyurethan

Beispiel II

Plasmabehandlung einer Polyurethanleitung mit kleinem Durchmesser

Die Innenwand eines Abschnitts einer Polystyrolröhre, die 15 cm lang ist und einen Innendurchmesser von 2,5 mm hat, wurde einem Plasma ausgesetzt, das in dem Plasmagenerator nach EP-A-0 348 690 erzeugt war. Die Bedingungen der Plasmabehandlung waren ähnlich denen, die in Beispiel I verwendet wurden, außer daß ein 11,4 MHz 75 Watt RF Plasma verwendet wurde und der Ammoniakgasdruck bei 1,86 x 10&supmin;² bar (14 Torr) aufrechtgehalten wurde. Die Behandlungsdauer betrug 25 Sekunden.

Beispiel III

Plasmabehandlung einer Polyurethanleitung mit kleinem Durchmesser

Die Innenwand eines Abschnitts einer Polyurethanröhre, die 100 cm lang ist und einen Innendurchmesser von 3,5 mm hat, wurde einem Plasma ausgesetzt, das wie in Beispiel II beschrieben, modifiziert war.

Beispiel IV

Allgemeines Verfahren zur Ablagerung von Endothelzellen auf einer Polymeroberfläche

Ein Plasma-behandelter Polymerfilm wurde in Scheiben geschnitten mit einer Fläche von 2 cm², und die Scheiben wurden in die Vertiefungen einer FALCON Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen gelegt. Eine Serie experimenteller Kontrollen wurde ebenfalls hergestellt, indem ein Milliliter einer 1%-igen Gelatine in jeweils sechs Vertiefungen und 1 ml einer 0,9%-igen Kochsalzlösung in weitere sechs Vertiefungen gefüllt wurde. Ein ml einer 0,9%-igen Kochsalzlösung wurde zu jeder Vertiefung, die eine Plasma-behandelte Polymerscheibe enthielt, hinzugefügt. Beide Platten mit 24 Vertiefungen wurden mit Parafilm abgedeckt und 24 Stunden bei 4 ºC gehalten, um hinreichende Hydratation von Test- und Kontrolloberflächen zu gewährleisten.
Die Gelatine- und Kochsalzlösungen wurden durch Aussaugen entfernt, und 0,8 ml der Vorratssuspension, die 2,5 x 10&sup5; Endothelzellen pro ml enthält, wurde in die Vertiefungen hineingegeben. Die Zellen wurden eine Stunde bei 37 ºC in einer 5%-igen Kohlendioxidatmosphäre inkubiert, dann mit Puffer gewaschen und unter Verwendung von Trypsin dekantiert. Die Testoberflächen und Kontrollen wurden wieder gewaschen, und die anklebenden Zellen wurden mit Hämatoxylin gefärbt. Die Zahl der anklebenden Zellen wurde unter Verwendung von Standard-Lichtmikroskop-Techniken bestimmt.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle II als anklebende Endothelzellpopulationsdichte in Zellen pro cm², für eine Vielfalt Plasma-behandelter Polymerformulierungen wiedergegeben. Tabelle II Endothelzellklebung an Plasma-behandelte Polymerscheiben Polymer* Dichte klebender Zellen (Zellen/cm²) Polyethylenterephthalat Probe Polystyrol Polyurethan Polyolefin Kochsalzlösung-Kontrolle Gelatinelösung-Kontrolle *Jede Polymerprobe stellt eine unterschiedliche Polymerformulierung dar.

Beispiel V

Wirkung der Plasmabehandlung auf das Kleben primärer Endothelzellen

Gemäß dem allgemeinen Verfahren zur Ablagerung von Endothelzellen auf einer Polymeroberfläche, wie in Beispiel IV beschrieben wurde, wurde ein Inoculum primärer Human- Endothelzellen auf Plasma-behandelte und reine Polyurethanscheibenproben angewendet. Zwei Polyurethantypen wurden untersucht, wobei die Ergebnisse des Zellklebens in Tabelle III dargestellt sind. Obwohl primäre Endothelzellen nicht die gleiche Neigung zur Bindung an Polymeroberflächen zeigen wie kultivierte Endothelzellen, ist die relative Affinität für Plasma-behandelte Polymeroberflächen höher als für unbehandelte reine Polymeroberflächen. Tabelle III Primäre Endothelzellklebung an Plasma-behandelte und reine Polyurethane Polymer Dichte klebender Zellen (Zellen/cm²) Mittelwert ± Standarabweichung Polyurethan Plasma-behandelt unbehandelt rein

Beispiel VI

Ablagerung von Zellen auf der Innenwand eines Plasmas

Behandelte Polyurethanleitung mit einem kleinen Durchmesser

Polyurethanleitungen des Beispiels III mit einem Innendurchmesser von 3,5 mm wurden unter Verwendung der in den Beispielen I und II beschriebenen Bedingungen Plasma-behandelt. Eine primäre Endothelzellpopulation wurde wie in Beispiel IV beschrieben, in Puffer bei einer Inokulationsdichte von 2 x 10&sup5; Endothelzellen pro Quadratzentimeter der Polymeroberfläche suspendiert, die für das innnere Lumen der Leitungen berechnet ist.
Jedes Rohr wurde in ein Trägerglasrohr eingeführt mit Verbindungsöffnungen, durch die die Zellsuspension und der Puffer eingeleitet wurden. Die Rohre wurden für die Inkubation in zwei Gruppen eingeteilt. Die Gruppe I wurde axial bei einer konstanten Geschwindigkeit von 360 pro min rotieren gelassen und Gruppe II wurde alle 15 Minuten in Zuwächsen von 90 axial rotieren gelassen. Beide Gruppen wurden eine Stunde bei 37 ºC in einer 5%-igen Kohlendioxidatmosphäre inkubiert. Eine Gelatinekontrolle wurde ebenfalls gemäß dem Verfahren von Beispiel IV hergestellt.
Die Ergebnisse der Zellklebung sind in Tabelle IV dargestellt. Beide Verfahren der Inkubation erlauben das Ankleben von Endothelzellen, jedoch wird eine gleichmäßigere Schicht mit der konstanten Rotationsmethode erreicht. Tabelle IV Endothelzellklebung an Plasma-behandelte Polyurethanleitungen Probennr. der Leitung Dichte der klebenden Zellen (Zellen/cm²) Gruppe I (konst. Rotation) Gruppe II (Zuwachsrotation) Probe Gelatinekontrolle

Claims

1. Verfahren zur Endothelialisierung einer Polymeroberfläche durch

(a) In-Berührung-Bringen der Oberfläche mit einem Plasma, das aus einem Gas, das Stickstoff enthält, erzeugt wurde, um reaktionsfähige funktionelle Aminogruppen aus dem Gas für die Oberfläche zur Verfügung zu stellen, dadurch gekennzeichnet, daß

(b) an der Oberfläche Endothelzellen durch Aufschwemmen einer zusammenfließenden Zellschicht ohne Erfordernis der starken Zellvermehrung angebracht wurden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das gasförmige Material weiterhin ein zweites Material umfaßt, das aus der aus Wasserstoff, Halogen, Argon Neon, Krypton und Xenon Sauerstoff und einer Sauerstoffverbindung bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, umfassend die Behandlung einer Lumenwandung einer Polymerleitung und das Aufschwemmen der Lumenwandung mit Endothelzellen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die zu behandelnde Lumenwandung einen Innendurchmesser von 4 mm oder weniger hat.

5. Antithrombogener Gegenstand, umfassend eine Plasmabehandelte Polymeroberfläche mit reaktionsfähigen, funktionellen, an dieselbe gebundenen Aminogruppen und eine zusammenfließende Schicht von Endothelzellen ohne die Erfordernis der starken Zellvermehrung, die an die die reaktionsfähigen funktionellen Aminogruppen enthaltende Oberfläche geklebt ist.

6. Gegenstand gemäß Anspruch 5, der aus der Gruppe, bestehend aus einer Platte, einem Streifen, einem Film, einer Folie, einer Faser, einem Gewebe, einer Leitung und einer Form ausgewählt ist.

7. Gegenstand gemäß Anspruch 5, worin die funktionellen Gruppen des weiteren Sauerstoff enthaltende Gruppen umfassen.

8. Gegenstand gemäß Anspruch 5 bis 7, der einen Innendurchmesser von weniger als etwa 6 mm hat, umfassend eine Plasma-behandelte Lumenwandung.