WO2007125958A1 - テンサイ黒根病抵抗性品種選抜マーカーとその選抜方法 - Google Patents

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WO2007125958A1
WO2007125958A1 PCT/JP2007/058952 JP2007058952W WO2007125958A1 WO 2007125958 A1 WO2007125958 A1 WO 2007125958A1 JP 2007058952 W JP2007058952 W JP 2007058952W WO 2007125958 A1 WO2007125958 A1 WO 2007125958A1
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WO
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sugar beet
resistant
dna
black rot
seq
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PCT/JP2007/058952
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Kazunori Taguchi
Naoki Oogata
Kazuyuki Okazaki
Keiji Nakatsuka
Hiroyuki Takahashi
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National Agriculture And Food Research Organization
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a primer as a selection marker for sugar beet black rot resistant varieties, a method for selecting the same, a sugar beet black resistant cultivar obtained by the method, and a method for identifying a sugar beet black resistant gene.
  • Sugar beet root disease is caused by infecting Beta genus plants such as sugar beet (Beta vulgaris L.), which is a sugar-producing crop, by Aphanomyces cochlioides, a type of soil filamentous fungus. It is a difficult-to-control disease that develops. The main symptom is known as seedling blight, in which seedlings die off at the seedling stage, and root rot symptoms where wet black spots appear in the roots as shown in Fig. 1 at the late growth stage. (Non-patent document 1). The disease is caused not only by the production of sugar beets, but also by serious damage such as reduction of yield and infection to other sugar beets in the pile. In both cases, it is a major problem both in terms of contamination and reduction in sugar yield (Non-patent Document 2).
  • sugar beet root resistance varieties and sugar beet root resistance genes have been obtained.
  • Non-Patent Document 1 Tsutomu Hatakeyama, Fumio Tanaka, Tenna Kenkyukai, 2000, 42: 59-63.
  • Non-Patent Document 2 Taguchi Kazunori, Ogata Naosuke, Tanaka Seikatsu, Tenna Kenkyukai, 2001, 43: 36-
  • Non-Patent Document 3 Vos P, et al., Nucleic Acid Res., 1995, 23: 4407-4414
  • an object of the present invention is to develop an effective countermeasure method against sugar beet black root disease, thereby preventing reduction in sugar yield. Therefore, the first invention of the present application provides a method for finding a variety having resistance to sugar beet black root disease and selecting the variety with high accuracy by a molecular biological technique that does not depend on the phenotype. The purpose is to do.
  • the second invention of the present application aims to efficiently cultivate sugar beet black rot resistant varieties.
  • the third invention of the present application aims to provide a method for identifying a gene having resistance to sugar beet black root disease.
  • the present inventor has conducted extensive research and found a variety having high resistance to sugar beet black root disease.
  • Sarasuko the present inventor has found that the varietal DNA polymorphism of the cultivar using AFLP method (AFLP is a registered trademark) and the genetic allyl that makes resistance to sugar beet root disease a dominant phenotype by genetic analysis.
  • AFLP AFLP is a registered trademark
  • the inventions shown in the following (1) to (5) have been completed based on the findings of the present inventors, etc., and are provided as means for solving the above problems.
  • the present invention provides a tenser having a base sequence ability represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 5. Provide a primer for selecting black rot resistant varieties.
  • the present invention provides a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 6 to 8, or a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 6 to 8 having 90% or more homology.
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence having the nucleotide sequence is provided.
  • the present invention also provides seeds and progeny of sugar beet black rot resistant varieties having one or more of these polynucleotides.
  • the present invention includes a DNA extraction step for extracting cell force DNA of Beta genus including sugar beet, and a DNA cleavage step for cleaving the extracted DNA with a restriction enzyme based on the AFLP method.
  • a sugar beet black rot resistant variety selection is performed by selecting a sugar beet black rot resistant cultivar by detecting the polynucleotide comprising the nucleotide sequence according to (2) corresponding to the primer pair used in nucleic acid amplification. Provide a method.
  • the present invention relates to a sugar beet black root disease resistant variety of the genus Beta selected using the method for selecting a sugar beet black root disease resistant variety described in (3) above, and the sugar beet black root disease resistant variety Is used to provide seeds and progenies of the beta-root beetle resistant variety of the genus Beta, which are produced by crossing or crawling, and a method for producing the seeds.
  • the present invention relates to a genomic DNA of the genus Beta, in particular, a DNA of chromosome 3 in sugar beet, a base sequence having the base sequence described in (2), and the base sequence Provided is a method for identifying a sugar beet black root disease resistance gene by identifying the genetic gene of the sugar beet black root disease resistance gene using a genetic distance of about 2.2 cM from the locus of the sugar beet black root resistance gene. .
  • a cultivar exhibiting resistance to sugar beet black root disease can be indirectly detected with high accuracy by a molecular biological technique independent of phenotype. Can be selected.
  • a sugar beet black rot resistant cultivar of the present invention it is possible to efficiently breed a sugar beet black rot resistant cultivar without requiring much labor, time, or cost. It can be carried out. According to such sugar beet-resistant varieties, stable sugar yields can be secured against the disease, so the expectation in the sugar beet market is enormous and is expected to be used worldwide. In addition, the ripple effect is extremely large, such as a positive impact in the sugar industry.
  • a sugar beet black rot resistance gene belonging to the genus Beta linked to the sugar beet black rot resistant variety selection primer can be identified.
  • the best mode for carrying out each of the above inventions will be described below. However, the present invention is not limited to these embodiments, and various modifications can be made without departing from the scope of the invention. Can be implemented.
  • the first embodiment mainly relates to claims 1 to 18.
  • the second embodiment mainly relates to claims 19 to 23.
  • Embodiment 1 relates to an invention of a sugar beet black rot resistant variety selection method and a sugar beet black root resistant cultivar obtained by the selection method.
  • Embodiment 1 is composed of a sugar beet black root resistance resistant variety selection primer, a polypeptide, a sugar beet black root resistance resistant variety selection method, a sugar beet black root resistance resistant variety obtained by the selection method, and the like.
  • the configuration of this embodiment will be specifically described below.
  • “Sugar beetle black root disease resistant cultivar selection primer” refers to any one of SEQ ID NOs: 1 to 5. This is an oligonucleotide that functions as a DNA marker for detecting sugar beet black rot resistant varieties in the method for selecting sugar beet black rot resistant varieties described later. V and the offset primer also have a base sequence linked to a sugar beet black root disease resistance gene described later on the genome.
  • the nucleotide sequence is about 2.2 cM (centiorgan) for the primers represented by SEQ ID NOs: 1 and 2, and about 4.3 cM for the primers represented by SEQ ID NOs: 3 to 5, respectively. It is located away from the disease resistance gene.
  • n region the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 5
  • the base sequence represented by n is configured so as to be hybridizable to a part of the adapter. Yes.
  • the sugar beet black root resistant variety selection primer is the base sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • the n region (0205) is the core sequence site of the adapter described later. It has a base sequence complementary to all or part of the base sequence.
  • G region (0206) is a salt that exists in the genomic DNA of sugar beet. It consists of a base sequence.
  • the "adapter” is bound to the restriction enzyme cut end of the fragmented genomic DNA as shown in Fig. 2B in the nucleic acid amplification step of the method for selecting sugar beet black rot resistant varieties of this embodiment described later. It is configured as possible.
  • the adapter structure is composed of a cleavage end binding site (0201) that also has a single-strand partial force, and a core sequence site (0202) that consists of a double-stranded portion.
  • Two types of adapters are used: EcoRI adapters and Msel adapters.
  • the EcoRI adapter has an EcoRI cleavage end binding site
  • the Msel adapter has an Msel cleavage end binding site.
  • the base sequence and base number of the core sequence site in the two adapters may be in accordance with Non-Patent Document 3.
  • the base sequence and the number of bases of the core sequence site are not particularly limited, and may be any base sequence and any number of bases.
  • miscellaneous sugar beet black root disease resistant cultivar selection primer also has a nucleotide sequence other than the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 5, its 5 ′ end, and Z or 3 ′.
  • the base sequence of the additional region is preferably a base sequence (0203) following the 5 ′ side of the n region in the adapter base sequence as shown in FIGS. 2C and D.
  • an arbitrary base sequence may be used without being limited thereto.
  • the additional region has a 3 ′ terminal side, the base sequence of the additional region, as shown in FIGS.
  • 2C and 2D is the base sequence on the genomic DNA of the genus Beta that continues to the 3 ′ side of the G region, That is, it consists of a base sequence complementary to N (0204). Specifically, it is a base sequence on the polynucleotide represented by any one of claims 6 to 8, which is described later, and is homologous to the base sequence of the G region represented by the deviation of SEQ ID NOs: 1 to 5. 3 'base sequence following the typical region.
  • the primer has a total base number of 17 to 25 bases, and the effect can be sufficiently obtained. Therefore, when the sugar beet black rot resistant variety selection primer has the additional region, the additional region may be designed so that the total number of bases is 25 bases or less and the base region is 1 base or more and 8 bases or less. When the total number of bases of the primer is 16 bases or less, it is not preferable that nonspecific hybridization is easily generated with respect to the base sequence of the genomic DNA. In addition, using more than 26 bases is not preferable because it only increases the cost of the primer.
  • the Tm value of the sugar beet black spot resistant variety selection primer is preferably 50 ° C or higher. This is to enhance the distinctiveness of the cocoon type recognition in the method for selecting sugar beet black rot resistant varieties.
  • the sugar beet black rot resistant variety selection primer may be labeled with a fluorescent substance, a labeling substance, RI (radioisotope), or the like. This is for facilitating the detection of the polynucleotide amplified in the sugar beet black rot resistant cultivar by the method for selecting a sugar beet black rot resistant cultivar described later.
  • fluorescent substance as used herein means a substance that has a property of emitting fluorescence when it absorbs excitation light of a specific wavelength and enters an excited state and returns to the original ground state. For example, FAM, TET, HEX, Cy3, Cy5, Texas Red, FITC, etc. are applicable.
  • labeling substances include haptens such as digoxigenin (DIG) and piotin. Position labeled with the labeling substance etc. in the breed selection primer The position is not particularly limited as long as it is appropriately determined according to the properties of the labeling substance used. For example, 5′-end labeling may be performed by labeling with [ ⁇ - 33 P] ATP using T4 polynucleotide kinase or the like. The primer need only be labeled on at least one of the pair of primers used. To increase sensitivity, both primers may be labeled identically, or both primers may be labeled differently so that the same amplification product can be detected by different means.
  • DIG digoxigenin
  • piotin piotin
  • the sugar beet black rot resistant cultivar selection primer is a primer pair (hereinafter referred to as "SEQ ID NO: 1 and 2") having a nucleotide sequence ability.
  • First primer pair a primer pair consisting of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 3 and 4 (hereinafter referred to as“ second primer pair ”), and the base represented by SEQ ID NOs: 3 and 5
  • second primer pair a primer pair consisting of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 3 and 4
  • second primer pair a primer pair consisting of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 3 and 5
  • third primer pair that also has the ability to align is used.
  • the sugar beet black rot resistant cultivar is a cultivar of the genus Beta that has high resistance to the infection of the above-mentioned funa myces and does not suffer from or hardly suffers from sugar beet black root disease. It can be identified by the selection method of sugar beet black rot resistant varieties. “Cultivar” refers to sugar beet varieties such as Riki Butomaru, Monohomare, Yukinohide, or other species belonging to the genus Beta and capable of crossing with sugar beet. Genetically describing the sugar beet black rot resistant varieties of the present invention refers to those having at least one haplotype of a dominant sugar of the sugar beet black rot resistant gene whose phenotype is resistance to sugar beet black rot.
  • Beta genus generally refers to the genus Fudansou.
  • the Beta genus means a Beta genus plant species that can be crossed with sugar beet. Examples include sugar beet, table beet, chard beet, and feed beet.
  • Sugar beet which is a beet for sugar production, among the plant species belonging to the genus Beta, conforms to the gist of the present invention, which is a countermeasure method for reducing sugar yield caused by sugar beet black root disease.
  • the "sugar beet black rot resistance gene” is a gene that exists on the sugar beet genome, and that one of the aryl phenotypes exhibits a dominant phenotype that is highly resistant to infection with funa myces. This gene has unidentified power
  • the power of QTL analysis shown in Figure 5 is It has been found to exist on the third chromosome, and its locus has been estimated as shown in FIG. Therefore, in the present invention, for convenience, the gene is hereinafter referred to as Acrl (Aphanomyces cochlioides resistance 1), and the dominant allyl of the gene exhibiting resistance to infection with aphanosis is referred to as Acrl 1 .
  • the "polynucleotide” is an amplified fragment specifically amplified in the sugar beet black rot resistant variety in the development process of the sugar beet black rot resistant variety selection method of this embodiment.
  • Consists of a partial base sequence The base sequence has 90% or more homology with the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 6 to 8, or the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 6 to 8. It is represented by the base sequence.
  • Any polypeptide may be single-stranded or double-stranded. These base sequences are present in sugar beet genomic DNA, and the base sequence locus is strongly linked to the Acrl locus. Furthermore, the base sequence can be substituted with Acrl on the genome of another Beta genus by hybridization.
  • the polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 is composed of 135 bases.
  • the polynucleotide is a part of the amplified fragment specifically amplified in the sugar beet black rot resistant variety in the development process of the sugar beet black resistant cultivar selection method of the present embodiment using the first primer pair. is there.
  • the polynucleotide has a Msel cleavage terminal sequence (5′-TAA-3 ′: the same applies hereinafter) and an EcoRI cleavage terminal sequence (5′—AATTC-3 ′: the same applies hereinafter) at the end of the polynucleotide.
  • the polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 is composed of 172 bases.
  • the polynucleotide is a part of the amplified fragment specifically amplified in the sugar beet black rot resistant variety in the development process of the sugar beet black resistant cultivar selection method of the present embodiment using the second primer pair. is there.
  • At the end of the polynucleotide is SEQ ID NO: 6. Similar to the polynucleotides shown, it has Msel and EcoRI cleavage terminal sequences.
  • the base represented by n in the sequence is an undetermined base sequence.
  • the polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 is composed of 307 bases.
  • the polynucleotide is a part of the amplified fragment specifically amplified in the sugar beet black rot resistant variety in the development process of the sugar beet black resistant cultivar selection method of the present embodiment using the third primer pair. is there.
  • the end of the polynucleotide has Msel and EcoRI cleavage terminal sequences.
  • the "base sequence having 90% or more homology with the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 6 to 8” refers to the base represented by any one of the above-mentioned SEQ ID NOs: 6 to 8
  • a nucleotide sequence that has 90% or more identity with the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 6 to 8 is obtained.
  • deletion means that one or more bases are lost in the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 7 to 9.
  • substitution refers to one in which one or two or more consecutive bases are replaced with other different bases in the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 6 to 8.
  • duplications, insertions, or translocations with point mutations, inversions, or deletions refers to the addition of one or two or more consecutive bases to the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 6 to 8, in total! .
  • an insertion, duplication, or translocation without deletion is applicable.
  • All or part of the polynucleotide and its base sequence are used as an indicator, primer or probe for detecting sugar beet black rot resistant varieties according to the method for selecting sugar beet black rot resistant varieties. Can do.
  • an index for detecting sugar beet black rot resistant varieties for example, a method using the base length in the AFLP method can be mentioned. This will be described in detail in the detection step of the method for selecting a sugar beet black rot resistant variety below.
  • the nucleotide sequence of SNP linked to Acrl 1 is expressed by LNA (Locked Nucleic Acid) The thing replaced with is mentioned.
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • the primer Base sequence loci linked to Acrl 1 are selectively amplified from the genomic DNA of the genus Beta by the temperature difference that hybridizes to the vertical DNA.
  • the presence / absence of the amplified product includes a method for discriminating sugar beet resistant varieties.
  • the nucleotide sequence of SNP linked to Acrl 1 is replaced with PNA (Peptide Nucleic Acid) in the SNP at the terminal restriction site of the polynucleotide.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • probes containing SNP linked to Acrl 1 can be specifically detected by temperature differences with respect to genomic DNA fragments of the genus Beta. And the like, and the like, and the like, and the like, and the like, and the like, and the like, and the like, and the like, and the like, and the like, and the like, and the like, and the like, to identify the sugar beet black rot resistant variety.
  • a method of selectively amplifying a base sequence locus linked to Acrl 1 from genomic DNA belonging to the genus Beta by PCR-clamping using the probe is also included.
  • Seeds having sugar beet root resistance and / or progeny of sugar beet root resistant cultivars are: SEQ ID NOs: 6 to 8 and SEQ ID NOs: 6 to 8, and 90% of the nucleotide sequence represented by any one of them Seeds and Z or progeny produced by crossing or crawling using sugar beet black rot resistant varieties having one or more of the polynucleotides having the above-mentioned homologous nucleotide sequences, Acrl Seeds with 1 and Z or progeny.
  • the “seed and Z or progeny produced by clawing” means a clone seed and Z or progeny having the same genetic information obtained by culturing a part of the sugar beet black rot resistant variety.
  • clones and Z or clone progeny obtained by culturing the callus after inducing the callus induction by performing a known desemination treatment on the tissue obtained from root resistance of the sugar beet black rot resistant variety. Applicable.
  • the sugar beet black rot resistant variety selection method is a selective nucleic acid amplification method based on the AFLP method, which includes a "DNA extraction step”, a “DNA cleavage step”, a “nucleic acid amplification step”, and " It consists of “detection process”. Hereinafter, each process will be specifically described.
  • the "DNA extraction step” is a step of extracting DNA from cells belonging to the genus Beta.
  • the DNA extracted in the DNA extraction process may be mixed with mitochondrial DNA or chloroplast DNA as long as it contains genomic DNA, or may be total DNA. this is It is also the power that genomic DNA is required as a saddle shape in the subsequent processes.
  • the “Beta genus cell” may be any cell such as a leaf part, a stem part, or a root part as long as it is a cell constituting a plant body of the genus Beta.
  • the genomic DNA is a force that is contained in all cells. The green leaf portion is preferred.
  • the genomic DNA in the cell is hardly fragmented by its own DNA-degrading enzyme, it is easy to collect, and damage to the plant can be minimized during collection. by.
  • the cells belonging to the genus Beta may be used after the plant body is collected and frozen immediately. This is because the freezing treatment hardly affects the genomic DNA in the cells.
  • the “DNA cutting step” is a step of cutting the extracted DNA with a restriction enzyme.
  • restriction enzyme refers to a combination of EcoRI or EcoRI isosizomers and Msel or Msel isosizomers according to the AFLP method described in Non-Patent Document 3.
  • the method for selecting sugar beet black rot resistant cultivars is that sugar beet black rot resistant varieties and sugar beet black susceptible varieties produced by cleaving the genomic DNA of the genus Beta using these two different restriction enzymes The restriction enzyme cleavage pattern is used.
  • the method for selecting a sugar beet black rot resistant cultivar according to the present embodiment is a SNP (polynucleotide polymorphism) linked to Acrl in the genomic DNA of the genus Beta, and within the restriction sites of 3 ⁇ 4coRI and Z or Msel. There is a method that uses different ones between Acrl 1 and Acrl s .
  • the "nucleic acid amplification step” is a step of performing nucleic acid amplification using the above-described primer pair in a genomic DNA fragment obtained in the above-described DNA cutting step.
  • the sugar beet black rot resistant variety selection method of the present embodiment is based on the AFLP method. Therefore, the nucleic acid amplification step is composed of several steps. This will be described in detail in the method section of this embodiment.
  • Genomic DNA fragment refers to fragments of genomic DNA having various lengths obtained after the DNA cutting step.
  • the end of the genomic DNA fragment is the end cleaved by the restriction enzyme used. That is, the 5 ′ end and 3 ′ end are cleaved by EcoRI or EcoRI isosizomer, and cleaved by Z or Msel or Msel isosizomer.
  • the genomic DNA fragment functions as a cage in the nucleic acid amplification step.
  • Nucleic acid amplification refers to amplification of a specific region sandwiched between two primers by enzymatic reaction using DNA or the like as a saddle.
  • a method of performing nucleic acid amplification is called “nucleic acid amplification method”, and specific examples thereof include PCR method, ICAN method, LAMP method, NASBA method and the like.
  • the method for selecting sugar beet black rot resistant cultivar of the present embodiment includes a pair of genomic DNA fragments obtained in the DNA cutting step, a pair of the sugar beet black rot resistant cultivar selecting primer as a cocoon type, a primer, and an adapter, respectively. Use an adapter for AFLP.
  • the “detection step” is a polynucleotide containing the nucleotide sequence of the polynucleotide described in any one of claims 6 to 8 (hereinafter referred to as "amplification polynucleotide”) from the nucleic acid amplified in the nucleic acid amplification step. This is a step of detecting “nucleotide”.
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 or a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 A polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 or a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 when the second primer pair is used, and
  • a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 or a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 is detected. It is a process.
  • Aminified polynucleotide is the polynucleotide sequence described in any one of the nucleotide sequences of! / In any one of the constituent requirements of the polynucleotide, that is, in any one of claims 6 to 8. And a base sequence in which the adapter sequence of the sugar beet black rot resistance variety selection primer used in the nucleic acid amplification step is added to both 5 ′ and 3 ′ ends of the nucleotide sequence. . Therefore, the base length of the amplified polypeptide is as long as the adapter sequence is added.
  • the amplified polynucleotide, Ac rl derconnection those specifically amplified genomic DNA from strains with 1 hetero to homo or not amplified from normal ACRL s homozygote derived from genomic DNA. That is, whether or not the strain to be tested is a sugar beet black rot resistant variety can be determined based on the ability to detect these amplified polynucleotides.
  • the sugar beet black rot resistant variety selection method of this embodiment is strongly linked to Acrl.
  • this method indirectly determines the presence or absence of Acrl 1 by using different SNPs between Acrl 1 and Acrl s . Therefore, when crossover occurs between Acrl and the SNP, the amplified polynucleotide can be detected even in the genomic DNA derived from the Acrl s homozygous individual, that is, the sugar beet black rot susceptible variety.
  • the frequency at which such a so-called false detection occurs corresponds to the recombination value (RV) between Acrl and the SNP.
  • the frequency of occurrence of the false detection is about 2.2% between Acrl-SNP when using the first primer pair, about 4.3% between Acrl-SNP when using the second primer pair, It is about 4.3% between Acrl and SNP when the third primer is used.
  • These frequencies are extremely low compared to the false detection frequency (about 50%) of the conventional method for selecting sugar beet black rot resistant varieties that depend on the phenotype.
  • it when actually detecting resistance to sugar beet black root disease, it will be detected using two or three primer pairs rather than using only one primer pair for one individual. .
  • the false detection frequency by the selection method of the present embodiment is about 0.004% (0.022 X 0.043 X 0.043), This is no longer a negligible value. Therefore, the frequency of false detection caused by crossover of Acrl and SNP linked to it does not reduce the effect of the sugar beet black rot resistant variety selection method of this embodiment at all.
  • the sugar beet black root disease resistant varieties and the like are identified by the method for selecting sugar beet black root disease resistant varieties, and the sugar beet black root disease resistant varieties of the genus Beta and the sugar beet black rot resistant varieties of the genus Beta are progenies. And the seeds of the genus Beta that are resistant to sugar beet black root disease.
  • Method of producing seeds having resistance to sugar beet black rot of Beta genus and progeny of Z or Beta sugar beet root resistant cultivars by crossing or clawing means mating capable of producing seeds and Z or progeny Or any cloning method.
  • FIG. 3 shows an example of a process flow in the sugar beet black rot resistant variety selection method of the first embodiment.
  • DNA is extracted from cells belonging to the genus Beta (S0301 DNA extraction step).
  • the extracted DNA is fragmented with restriction enzymes (S0302 DNA fragmentation).
  • S0302 DNA fragmentation restriction enzymes
  • S0303 nucleic acid amplification step using the genomic DNA fragment obtained in the DNA fragmentation step as a saddle shape, nucleic acid amplification is performed using the two sugar beet black rot resistant variety selection primers as a pair (S 0303 nucleic acid amplification step).
  • S 0303 nucleic acid amplification step a polynucleotide containing the base sequence according to claim 1 is detected from the nucleic acid amplified in the nucleic acid amplification step (S0304 detection step).
  • the sugar beet black rot resistant variety selection method of Embodiment 1 is based on the AFLP method.
  • this is a method for detecting the presence or absence of SNP linked to sugar beet root resistance gene.
  • the SNP is different between Acrl 1 and Acrl s .
  • the basic technique and method of the sugar beet black spot resistant variety selection method of Embodiment 1 may be based on the well-known AFLP method. Hereinafter, the method in each step will be specifically described.
  • the DNA extraction method is not particularly limited as long as it is a method capable of extracting genomic DNA from cells belonging to the genus Beta.
  • a specific example is the CTAB (Cesyl Trimethyl Ammonium Bromide) method.
  • CTAB Cesyl Trimethyl Ammonium Bromide
  • An example of the specific method will be described in detail in Example 1.
  • a commercially available DNA preparation kit such as ISOPLANT (Nibonbon Gene) may be used.
  • DNA is cleaved with a combination of two types of restriction enzymes, namely EcoRI and Msel, or their iso-isozomers. It is sufficient to use commercially available restriction enzymes.
  • the kaffa composition, salt concentration, pH, etc. of each restriction enzyme may be determined according to commonly used reaction conditions.
  • the amount of restriction enzyme used in the reaction is appropriately determined according to the amount of DNA used in the reaction. For example, if the DNA amount of l i ug, may be used about 3 units EcoRI and Msel from each 2.
  • the order of restriction enzyme cleavage is not particularly limited.
  • reaction temperature and reaction time are appropriately selected according to the amount of DNA used in the reaction under conditions that allow sufficient genomic DNA fragmentation. For example: Use 2 units of restriction enzyme for the amount of DNA in g If so, the reaction temperature may be 37 ° C and the reaction time may be 1 to 2 hours. After the cleavage reaction, it is more preferable to heat the reaction solution from 70 ° C to about 80 ° C and then rapidly cool it to 4 ° C or less in order to prevent recombination between the cut ends.
  • the nucleic acid amplification step is composed of a plurality of steps. Usually, it is preferably carried out in three steps as shown in FIG. 4, but the number of steps is not particularly limited as long as the target polynucleotide can be efficiently amplified. For example, it may be composed of two stages, that is, a first stage adapter coupling process and a third stage selection process.
  • a first stage adapter coupling process and a third stage selection process.
  • the first stage is an adapter coupling step (S0401).
  • This step is characterized by attaching an adapter to the end of genomic DNA fragmented by restriction enzymes.
  • a DNA binding reaction method using T4 DNA ligase is common and convenient.
  • the buffer composition, salt concentration, pH, etc. of T4 DNA ligase may be determined according to generally used reaction conditions.
  • Two adapters, EcoRI adapter and Msel adapter, are used.
  • the adapter amount to add is equal.
  • the bonding reaction temperature may be in the range of 8 ° C to 30 ° C, but still preferably in the range of 15 ° C to 20 ° C.
  • the reaction time is lengthened as the binding reaction temperature is lower.
  • the method for binding the adapter is not particularly limited as long as the adapter can be bound to the end of the fragmented genomic DNA.
  • DNA binding reaction kits using various enzymes are commercially available and can be used. In this case, reaction conditions and the like may be performed according to the attached protocol.
  • the second stage is a preliminary amplification step (S0402).
  • preliminary nucleic acid amplification is performed using a pair of sugar beet root resistance resistant varieties preamplification primers to narrow down the target amplification polynucleotide!
  • the "sugar beet black rot resistant variety pre-amplification primer" is composed of a base sequence complementary to each of the two types of adapters and a specific base arranged on the 3 'end side.
  • the base sequence complementary to the adapter is composed of all or part of the EcoRI or Msel restriction site and all or part of the core sequence adjacent thereto and the complementary base sequence.
  • the number of bases complementary to the adapter is not particularly limited as long as it is 13 bases or more.
  • the specific base may be composed of one base or two bases. Usually, one base is sufficient. Whether this particular base is an ATGC is determined by the pair of primers selected for sugar beet black rot resistant varieties used in the next third stage. That is, the specific base is the base adjacent to the 3 'end side (extension direction side) of all or part of the EcoRI or Msel restriction site contained in the sugar beet black rot resistant variety selection primer to be used. It becomes. For example, if the pair of beetle black root disease resistant cultivar selection primers used in the third stage is a primer pair containing SEQ ID NOS: 1 and 2, respectively, the cultivar selection primer containing SEQ ID NO: 1 is restricted by EcoRI.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is G adjacent to the 3 ′ end C of the restriction site.
  • the breed selection primer containing SEQ ID NO: 2 contains TAA, which is part of the restriction site of Msel. Therefore, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is C, which is adjacent to the 3 'end A of the restriction site.
  • the nucleic acid amplification method used in the nucleic acid amplification step is not particularly limited as long as it can amplify the target polynucleotide.
  • PCR method ICAN method, LAMP method and the like can be mentioned.
  • PCR methods are convenient because various methods have been established.
  • the reaction conditions such as the reaction temperature and the number of cycles in the nucleic acid amplification method, optimum conditions may be appropriately determined according to known techniques in the respective methods mentioned above. In the present specification, reaction conditions when the PCR method is used in Example 1 to be described later are shown as an example, but the present invention is not limited thereto.
  • the third stage is a selection process (S0403).
  • the nucleic acid fragment amplified in the preliminary amplification step using a pair of sugar beet black spot resistant species selection primers is cocoon-shaped. Further, nucleic acid amplification is performed to amplify the target amplification polynucleotide.
  • the nucleic acid amplification method and the reaction conditions used in the selection step are conveniently performed in accordance with the nucleic acid amplification method of the second step.
  • the nucleic acid amplification method used here is not necessarily the same method as the nucleic acid amplification method in the second step.
  • the PCR method is used in the first stage pre-amplification process, and different nucleic acid amplification methods are used in combination, such as using the ICAN method in the third stage selection process.
  • the specific procedure and reaction conditions of each method may be performed in accordance with known techniques. In the present specification, the ability to show the reaction conditions when the PCR method is used in Example 1 described later as an example is of course not limited thereto.
  • the final amplification product solution obtained in the nucleic acid amplification step is used in the next detection step.
  • Gel electrophoresis is convenient for detection of the amplified polynucleotide.
  • a polynucleotide having a base length close to the amplified polynucleotide is also the power that can be distinguished. Another reason is that gel electrophoresis can be carried out without requiring special skill acquisition for those who are engaged in the field of molecular biology.
  • the base length of the amplified polynucleotide is such that the adapter sequence of the primer used in the nucleic acid amplification step is present at both ends of the base sequence of the polynucleotide according to any one of claims 6 to 8. It is added.
  • the added base length is in the range of 20 to 36 bases combined with adapter sequences at both ends.
  • the base length of the detected amplified polynucleotide ranges from 155 bases to 171 bases.
  • the base is applicable. However, these are deleted in the base sequence of the genomic DNA that is a cage type, If there are mutations such as substitutions and additions, they vary accordingly.
  • the use of a stacking gel is optional.
  • the amount of sample applied to the gel is not particularly limited as long as it is appropriately determined according to the amount of amplified polynucleotide to be detected, but was generally obtained in the selection step of the nucleic acid amplification step.
  • Amplification product solution 5 1Z swell is sufficient. If necessary, a loading buffer of about 1 ⁇ 1 may be added to 5 ⁇ 1 of the amplification product solution.
  • Electrophoresis is performed at 280 V for about 3 hours in an electrophoresis buffer (1 kg, etc.). At this time, size markers are run simultaneously.
  • As the size marker it is convenient to use a commercially available size marker such as an lOObp DNA ladder marker (TaKaRa).
  • genomic DNA genotype is known, negative control (Acr I s homo), and positive controls (or ACRL 1 Homo or Acrl 1 hetero).
  • At least one of the sugar beet black rot resistant variety selection primer pairs which is directly labeled with a fluorescent substance or RI, is used in the nucleic acid amplification step.
  • the method of use the method of indirectly labeling the fluorescent material using avidin protein or antibody labeled with a fluorescent material such as piotin or DIG, or the polynucleotide present in the gel after electrophoresis is intercalated. Examples thereof include a method of staining with a fluorescent substance capable of being force-reduced, such as Ethidium bromide, VistraGreen (Amersham), Cyber Green (registered trademark: Roche).
  • the polynucleotide in the gel can be visually recognized by chemical luminescence generated by irradiating the gel after the electrophoresis with the excitation wavelength light of the used fluorescent substance. Kemi If you can visually check the luminescence intensity, you can do it visually. Further, when the luminescence intensity is weak or the like, it can be visually recognized with a biochemiluminescence imaging device (light captcha).
  • the gel in the gel can be visually recognized by appropriately treating the gel after electrophoresis and then exposing it to an X-ray film or imaging plate (Fuji Film). All of these basic operations are known techniques, and the details may be performed according to their various protocols.
  • a polynucleotide having a base length close to the amplified polynucleotide in the sugar beet black susceptibility cultivar is not detected. Therefore, it can be distinguished by gel electrophoresis.
  • the base length of the amplified polynucleotide will be the susceptibility to sugar beet black root disease. There is a possibility to approximate the base length of other non-specific polynucleotides to be amplified in varieties.
  • the hybridization method is carried out using as a probe all or a part of any one of the polynucleotides described in the constituent requirements of the polynucleotide described in claim 6 to 8.
  • the amplified polynucleotide can be selectively detected.
  • the Southern hybridization method As the hybridization method used here, the Southern hybridization method or a known method based on it is convenient.
  • the general Southern hybridization method polynucleotides fractionated in the gel after electrophoresis are transferred to a membrane, and the labeled probe is hybridized to the target polypeptide on the membrane for detection. It is based on what to do.
  • This method is a very common technique in the field of molecular biology, and since it may be performed in accordance with it in the present embodiment, a detailed description is omitted.
  • the base sequence of the polypeptide as a probe when the first primer pair is used, the whole or a part of the base sequence of the polynucleotide represented by claim 6 is used.
  • the second primer pair when the whole or a part of the nucleotide sequence of the polynucleotide represented by claim 7 is used.
  • the third primer pair use all or part of the nucleotide sequence of the polynucleotide represented by claim 8.
  • probe This labeling may be carried out in accordance with the method of directly labeling the primer with a fluorescent substance, a labeling substance, or RI in the sugar beet black spot resistant variety selection primer.
  • the detection of the probe that has been and / or hybridized is appropriately determined according to the label of the probe. This can be done in accordance with the method of detecting the labeled sugar beet black rot resistant variety selection primer.
  • sugar beet black rot resistant variety selection primer of this embodiment and the sugar beet black root resistant cultivar selection method using the selection primer, By collecting only a part of the plant body, it is possible to indirectly select varieties that are dominantly resistant to sugar beet black root disease without depending on the phenotype with high accuracy.
  • Embodiment 2 relates to a method for identifying a sugar beet black root resistance gene Acrl.
  • the method for selecting a sugar beet black rot resistant cultivar according to Embodiment 1 was a method for detecting an amplified polynucleotide based on SNP linked to Acrl by the AFLP method.
  • the ratio of the sugar beet phenotype to the amplified polynucleotide from the sugar beet is determined based on the genomic DNA of the genus Beta! /, Acrl loci, and claims.
  • the recombination value between the nucleotide sequence having the nucleotide sequence according to any one of Items 6 to 8 can be calculated.
  • the genetic distance between the recombination value, the map function of Kosambi, and the force can be calculated.
  • This embodiment is a method for identifying an Acrl gene on a genome from a base sequence having the base sequence of the polynucleotide according to any one of claims 6 to 8 and the calculated genetic distance. It is.
  • the genomic DNA of the genus Beta is the base sequence locus having the base sequence described in any one of Claims 6 to 8, and the shift of any one of Claims 6 to 8. It is constructed by a sugar beet black spot resistance gene identification method that identifies Acrl using the genetic distance between the nucleotide sequence locus and the Acrl locus. The configuration of this embodiment will be specifically described below.
  • the "base sequence locus” of the present embodiment refers to the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 on the genome of the genus Beta or on the third chromosome in the case of sugar beet, or SEQ ID NO: 6
  • a base sequence having a homology of 90% or more with the base sequence represented by hereinafter referred to as “the base sequence according to claim 6”.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 or a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 (hereinafter referred to as “the nucleotide sequence according to claim 7”), or a sequence Either the base sequence represented by No. 8 or a base sequence having 90% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID No. 8 (hereinafter referred to as “base sequence according to claim 8”). It is an area with
  • each nucleotide sequence locus and the Acrl locus is about 2.2 cM in the case of the locus having the nucleotide sequence described in Table 1 to Claim 6, and described in Claim 7. In the case of a locus having the nucleotide sequence of about 4.3 cM, and in the case of the locus having the nucleotide sequence according to claim 8, it is about 4.3 cM.
  • Table 1 shows the results of serial analysis of the Acrl gene locus and each of the nucleotide sequence loci.
  • C1. 6, C1. 7, C1. Claims 6, 7, and 8 indicate base sequence loci having the base sequences
  • a and B indicate gene loci or base sequence loci.
  • each base sequence locus was detected by the presence or absence of the amplified polynucleotide by the method of the present embodiment, and the Acrl locus was detected by phenotype.
  • + indicates that an amplified polynucleotide is detected or a phenotype resistant to sugar beet root disease is confirmed, and one is that the amplified polynucleotide is not detected or is susceptible to sugar beet root disease. Indicates when the phenotype is confirmed.
  • the base sequence according to claim 6, the base sequence according to claim 7, and the base sequence locus having the base sequence according to claim 8, and the base sequence locus Acrl can be identified using the genetic distance between and the Acrl locus.
  • the genetic distance between the base sequence having the base sequence according to claim 6 on the genome and the Acrl locus is about 2.2 cM, about 2.2 Mb based on the base sequence Acrl exists at either left or right position.
  • the homologous region obtained by the search is used as a base sequence locus, and a plurality of genes around 2.2 Mb apart from the left and right are selected as candidate genes.
  • the whole nucleotide sequence of candidate genes is determined for sugar beet resistant cultivars and sugar beet susceptible varieties. If the number of candidate genes exceeds 50, select a known gene or a gene whose function is predicted, and then preferentially examine genes that are predicted to be related to sugar beet black root disease. ,.
  • the base sequence may be different depending on the type of mouthpiece. Selects the gene as a potential candidate gene. Subsequently, in the dominant candidate gene, a base sequence that is not found in sugar beet black susceptibility varieties is ligated to a vector as an Acrl 1 aryl candidate. After a known dedifferentiation treatment is performed on a tissue obtained from a sugar beet susceptibility cultivar, a callus is induced, and then a vector in which the gene is linked to the callus is introduced by a known technique. If the plant body obtained by culturing callus shows the phenotype of a sugar beet black rot resistant cultivar, it is an Acrl 1 candidate candidate Acrl gene. Become.
  • the method of combining a plurality of nucleotide sequence loci and the genetic distance between the plurality of nucleotide sequence loci and the Acrl gene locus is more preferred in the sugar beet black rot resistance gene identification method. Because, according to the base sequence locus of 2 or 3 points, it is also the ability to specify the Acrl locus as one point. That is, as in the linkage map shown in FIG.
  • the sequence locus and Acrl locus are 2.2 cM and 4.3 cM in the opposite directions, respectively, and the Acrl locus is also identified.
  • the base sequence having the base sequence according to claim 6 and the base sequence having the base sequence according to claim 7 are at a distance of 6.5 cM. This is because the physical distance between each nucleotide sequence locus corrected by comparison with the actual physical distance in the sequence and the Acr 1 locus can also be calculated.
  • the same gene The determination method may be performed in the same manner as the above method.
  • the region encoding the sugar beet root resistance gene can be limited on the genome, and the gene can be identified.
  • Acrl that is, the sugar beet root resistance resistant gene of the sugar beet root resistance gene, can be identified from the comparison of the nucleotide sequences of the sugar beet root resistance cultivar and the sugar beet root susceptibility cultivar. If the gene can be identified, a recombinant plant that introduces the sugar beet black susceptibility gene allyl into a sugar beet susceptibility cultivar that can be detected directly in the selection of sugar beet black smut resistant varieties will be prepared. By doing so, it is possible to easily obtain a sugar beet black rot resistant variety.
  • CTAB CTAB (ICN Biomedicals. Inc .: Same as below) 10g / lM Tris-HCl (pH8.0) 50ml / 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml / Polybulol pyrrolidone (WAKO Company) 5gZNaCl 40.9g mixed, then filled up to 500ml with sterile water.
  • CTAB 50g / NaCl 20.45g is mixed, then sterilized water is added to 500ml. The ones that have been improved.
  • CTAB precipitation buffer CTAB 5g / lM Tris— HCl (pH8.0) 25ml / 0.5M
  • EDTA pH 8.0 10ml mixed, then filled up to 500ml with sterile water.
  • Fresh sugar beet leaves (green leaves) were prepared from 0.3 g to 0.5 g, frozen by adding liquid nitrogen thereto, and then ground using a mortar and pestle.
  • Rhino total DNA solution ⁇ ⁇ , 5 X Reaction Buffer 50 mM Tris—Hcl (pH 7.5) 50 mM Mg-acetate 250 mM K—acetate) 2 1 supplied with the kit, EcoRlZMsel (1.25 each) attached to the kit Unit
  • the DNA cleavage reaction was performed at 37 ° C for 2 hours.
  • reaction solution was transferred to 70 ° C. and kept warm for 15 minutes.
  • thermophilic DNA polymerase (TAKARA) was used as the thermophilic DNA polymerase.
  • reaction solution containing the binding reaction product obtained after the first step is diluted 10 times with TE.
  • dNTP mix solution (dATP, dGTP, dCTP, dTT, also attached to Ex-Taq)
  • ⁇ -N primer and ⁇ -N primer used the following depending on the pair of sugar beet black spot resistant cultivar selection primers used in the next third step.
  • E-N primer E—G primer represented by SEQ ID NO: 9
  • M—N primer M—G primer represented by SEQ ID NO: 10
  • E -N primer A primer represented by SEQ ID NO: 11
  • M -N primer M— C primer represented by SEQ ID NO: 12
  • PCR reaction program 94 ° C for 5 minutes, followed by 20 cycles of 94 ° C for 30 seconds ⁇ 56 ° C for 1 minute ⁇ 7 2 ° C for 1 minute. Then, treat at 72 ° C for 10 minutes, and finally cool to 4 ° C and keep warm.
  • the target amplified polypeptide was preliminarily amplified.
  • reaction solution containing the preamplification reaction product obtained after the second step was diluted 50 times with TE to obtain a “1Z50 diluted template”.
  • PCR reaction program (First amplification reaction) Treat at 94 ° C for 5 minutes, and then carry out 13 cycles of 94 ° C for 30 seconds ⁇ 65 ° C for 30 seconds ⁇ 72 ° C for 1 minute. At this time, the annealing temperature of 65 ° C is touched down by 0.7 ° C for each cycle. (Second amplification reaction) Following the first amplification reaction, 20 cycles of 94 ° C for 30 seconds ⁇ 65 ° C for 30 seconds ⁇ 72 ° C for 1 minute are performed. Then, treat at 72 ° C for 10 minutes, and finally cool to 4 ° C and keep warm.
  • the target amplification polypeptide was amplified through the above steps.
  • 21 marker marker 0.25% BPB / 0.25% XC / 1 mM EDTA (pH 8.0) Z30% glycerol
  • the electrophoresis sample for the detection process was used.
  • Detection of amplified polynucleotide was performed here using acrylamide gel electrophoresis.
  • the polyacrylamide gel was placed in an electrophoresis tank (NA-1214A: Nippon Aidichi), and about 2.5 L of electrophoresis buffer (1 XTBE) was poured into the electrophoresis layer. After the comb was removed from the electrophoresis buffer and the wells were washed with the electrophoresis buffer, the electrophoresis samples obtained in the third stage of the nucleic acid amplification step were applied to the wells by 2 to 51 wells. A size ladder marker (100 bp DNA Ladder: TaKaRa) was applied to another well together with 2 ⁇ 1 of electrophoresis sample. Subsequently, electrophoresis was performed at 280 V—constant voltage for about 3 hours and 30 minutes.
  • NA-1214A Nippon Aidichi
  • the polyacrylamide gel is peeled off from the gel plate, and the gel is immersed in a solution obtained by diluting Vistra Green (Amersham) into lZlO- 4 with TBE, and gently loosened for about 15 minutes.
  • the nucleic acid in the gel was stained while vibrating.
  • the dyed gel was irradiated with a 274 nm ultraviolet lamp to record the pattern of the polynucleotide band.
  • Fig. 6 shows the banding pattern of the polynucleotide after gel electrophoresis by the method for selecting sugar beet black rot resistant cultivar of this example.
  • samples from al-a4 sugar beet black rot resistant varieties are shown in the left 4 lanes of the size m indicated by M, and from bl-b4 sugar beet black susceptibility varieties are shown in the right 4 lanes. Each sample obtained was applied. I uses the first primer pair, II uses the second primer pair, and III uses the third primer pair.
  • a polynucleotide band was detected at the position indicated by the arrow in al to a4 lanes, whereas in bl to b4 4 lanes Not detected.
  • a specific polynucleotide amplified polynucleotide
  • the test strain is a cultivar that is resistant to sugar beet black rot or a susceptible variety.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining root rot symptoms, which are symptoms of sugar beet black root disease.
  • A is a strain with no disease symptom, a strain corresponding to disease incidence index 0 (normal strain)
  • B is a strain corresponding to disease incidence index 3 with black lesions with internal rot
  • C is a disease symptom with internal rot Indicates the strain corresponding to the disease index 5 which has spread or died.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the structure of an adapter and the structure of a primer for selecting a sugar beet black rot resistance variety that binds to the adapter.
  • A is the EcoRI adapter
  • B is the EcoRI fragment of the genomic DNA fragment
  • C is the sugar beet black rot resistant variety selection primer (corresponding to claim 1)
  • D is the vertical genomic DNA to which the adapter is bound.
  • N and n are bases complementary to n
  • N is the base sequence on genomic DNA.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a process flow in the method for selecting a sugar beet black rot resistant variety of Embodiment 1;
  • FIG. 4 is a diagram for explaining a flow of steps constituting a nucleic acid amplification step in the method for selecting a sugar beet black rot resistant variety of Embodiment 1;
  • FIG. 5 A is a diagram showing the results of QTL analysis on the sugar beet root disease development index by individual in the sugar beet F2 generation.
  • B is a figure which shows the result of the QTL analysis regarding the sugar beet black root disease onset index in sugar beet F2 individual F3 system group.
  • the horizontal axis chr indicates the chromosome and the number indicates the chromosome number.
  • the vertical axis shows the odds logarithm, which is the possibility of the QTL position.
  • FIG. 6 is a view showing the results of selection for sugar beet black rot resistant varieties by the method for selecting sugar beet black rot resistant cultivars according to Embodiment 1.
  • FIG. 7 A linkage map of sugar beet root resistance gene Acrl and each nucleotide sequence having the nucleotide sequence of claims 6-8.
  • C1.6, C1.7, and C1.8 represent base sequence loci having the base sequences described in claim 6, claim 7, and claim 8, respectively.

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Abstract

【課題】テンサイ黒根病に対する有効な防除策として、テンサイ黒根病に対して抵抗性を有する品種を表現型に依存することなく、分子生物学的手法によって高い精度で選抜する方法の提供を目的とする。また、それによりテンサイ黒根病抵抗性品種の効率的な育成を行うことを目的とする。 【解決方法】テンサイ黒根病に対して抵抗性の優性表現型を有するアリルの遺伝子座と強く連鎖するテンサイ黒根病抵抗性品種選抜用プライマーを用いて、テンサイ黒根病抵抗性品種を選抜するＡＦＬＰ法に基づいた選抜方法を提供する。

Description

明 細 書
テンサイ黒根病抵抗性品種選抜マーカーとその選抜方法
技術分野
[0001] 本発明はテンサイ黒根病抵抗性品種の選抜マーカーとしてのプライマーとその選 抜方法、及びその方法によって得られるテンサイ黒根病抵抗性品種、並びにテンサ ィ黒根病抵抗性遺伝子の同定方法に関する。
背景技術
[0002] テンサイ黒根病は、土壌糸状菌の 1種であるァファノミセス菌（Aphanomyces co chlioides)が製糖用作物であるテンサイ（サトウダイコン： Beta vulgaris L.)等の B eta属植物に感染することで発症する難防除な病気である。その主な病徴としては、 幼苗期に苗が立ち枯れる苗立枯症や、生育後期に図 1に示すような湿潤な黒斑が根 部に現れて腐敗する根腐症状等が知られている (非特許文献 1)。その病害は、テン サイの生産現場にぉ 、て収穫量の低減や、パイル内における他のテンサイへの感染 等の甚大な被害のみならず、製糖産業にお!ヽても製糖過程における腐敗根の混入 や、糖収量の低減等にも渡り、いずれも大きな問題となっている (非特許文献 2)。
[0003] 当該病気に対する防除法は、現在日本や欧米各国で研究されているが未だに有 効なものはない。例えば、テンサイ圃場の透水性'排水性の改善、有効薬剤の探索、 又は抵抗性品種の選抜等が検討されている。しかし、圃場の透水性'排水性の改善 は、施工にあたり莫大な投資が必要となる場合があり、実現に困難を伴う。また、薬剤 による防除は、特効性を示すものが現在のところなぐさらに当該病気の罹患部位が 根部であることから薬剤が十分に行き渡らない等の問題を有している。抵抗性品種の 選抜は、当該病気の防除対策として最も有効と思われるが、従来技術による抵抗性 品種の選抜方法では表現型である根部の病徴に依存しているため、その選抜には 多大な労力、時間、そしてコストを必要とする他、環境要因等の影響で偶然病徴を示 さなカゝつた罹患株を抵抗性株と誤判定する等の問題がある。
[0004] テンサイ巿場は、全世界で年間 8600億円を越える巨大巿場である。テンサイ黒根 病はテンサイの収穫量、ひいては製糖原料の供給量を大きく左右し得ることから、当 該巿場に与える打撃は計り知れない。それゆえ、欧州の育種業界では現在も多大な 資金と労力を費やして、テンサイ黒根病抵抗性品種の育種に力を入れている。しカゝし ながら、今もってテンサイ黒根病抵抗性品種やテンサイ黒根病抵抗性遺伝子等に関 する有効な研究成果は得られて 、な ヽ。
非特許文献 1 :梶山努、田中文夫，てん菜研究会報， 2000, 42 : 59-63.
非特許文献 2 :田口和憲、大潟直榭、田中征勝，てん菜研究会報， 2001, 43 : 36-
43.
非特許文献 3 :Vos P, et al. , Nucleic Acid Res. , 1995, 23 :4407-4414
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の課題は、上記問題点に鑑み、テンサイ黒根病に対する有効な対策方法を 開発し、それによつて糖収量の低減を防止することである。そこで、本願の第一の発 明は、テンサイ黒根病に対して抵抗性を有する品種の発見と、当該品種を表現型に 依存することなぐ分子生物学的手法によって高い精度で選抜する方法を提供する ことを目的とする。また、本願の第二の発明は、それによつてテンサイ黒根病抵抗性 品種の効率的な育成を行うことを目的とする。さらに、本願の第三の発明は、テンサイ 黒根病に対して抵抗性を有する遺伝子の同定方法の提供を目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 上記課題を解決するために、本発明者は鋭意研究を重ねた結果、テンサイ黒根病 に対して高い抵抗性を有する品種を発見した。さら〖こ、本発明者は AFLP法 (AFLP は登録商標）を用いた当該品種の DNA多型、及び遺伝学的解析により、テンサイ黒 根病に対する抵抗性を優性の表現型とする遺伝子ァリルの遺伝子座と強く連鎖する テンサイ黒根病抵抗性品種選抜用プライマー、及びそれを用いたテンサイ黒根病抵 抗性品種選抜方法を開発することに成功した。以下の（1)から（5)に示す発明は、本 発明者らの係る発見等に基づいて完成されたものであり、上記課題を解決するため の手段として提供をするものである。
[0007] (1)本発明は、配列番号 1から 5のいずれか一で表される塩基配列力 なるテンサ ィ黒根病抵抗性品種選抜プライマーを提供する。
[0008] (2)本発明は、配列番号 6から 8のいずれか一で表される塩基配列、又は配列番号 6から 8のいずれか一で表される塩基配列と 90%以上の相同性を有する塩基配列か らなるポリヌクレオチドを提供する。また、本発明はこれらのポリヌクレオチドのうちい づれか一又は二以上を有するテンサイ黒根病抵抗性品種の種子及び後代を提供す る。
[0009] (3)本発明は、テンサイをはじめとする Beta属の細胞力 DNAを抽出する DNA抽 出工程と、 AFLP法に基づいて、抽出した DNAを制限酵素で切断する DNA切断ェ 程と、前記 DNA切断工程で得られるゲノム DNA断片を铸型に、前記（1)に記載の プライマーのうち二つをペアとして核酸増幅を行う核酸増幅工程と、前記核酸増幅ェ 程で増幅された核酸中から、核酸増幅で使用したプライマーペアに対応する前記（2 )に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドを検出する検出工程とによってテンサイ 黒根病抵抗性品種の選抜を行うテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法を提供する。
[0010] (4)本発明は、前記（3)に記載のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法を用いて選 抜される Beta属のテンサイ黒根病抵抗性品種と、当該テンサイ黒根病抵抗性品種を 用いて、交配、又はクローユングにより作製される Beta属のテンサイ黒根病抵抗性品 種の種子及び後代及びその生産方法を提供する。
[0011] (5)本発明は、 Beta属のゲノム DNA、特にテンサイでは第 3染色体の DNAお!、て 、 (2)に記載の塩基配列を有する塩基配列座、及び、その塩基配列座とテンサイ黒 根病抵抗性遺伝子の遺伝子座との遺伝学的距離が約 2. 2cMであることとを利用し て当該テンサイ黒根病抵抗性遺伝子を同定するテンサイ黒根病抵抗性遺伝子同定 方法を提供する。
発明の効果
[0012] 本発明のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法によれば、表現型に依存することな ぐ分子生物学的手法によってテンサイ黒根病に対して抵抗性を示す品種を高い精 度で間接的に選抜することができる。
[0013] また、本発明のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法によれば、多大な労力や時間 、あるいはコストを必要とすることなぐ効率的にテンサイ黒根病抵抗性品種の育種を 行うことができる。このようなテンサイ黒根病抵抗性品種によれば、当該病気に対して 安定した糖収量を確保できることからテンサイ市場における期待は大きぐ世界的な 利用が予想される。また、製糖産業界における好影響等も期待される等、その波及 効果は極めて大きい。
[0014] さらに、本発明のテンサイ黒根病抵抗性遺伝子同定方法によれば、前記テンサイ 黒根病抵抗性品種選抜プライマーに連鎖する Beta属のテンサイ黒根病抵抗性遺伝 子を同定することができる。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 以下に、前記各発明を実施するための最良の形態を説明するが、本発明はこれら の実施の形態に何ら限定されるものではなぐその要旨を逸脱しない範囲において、 種々なる様態で実施しうる。なお、実施形態 1は主に請求項 1から 18に関する。また 、実施形態 2は主に請求項 19から 23に関する。
[0016] くく実施形態 1》
[0017] く実施形態 1 :概要〉
[0018] 実施形態 1は、テンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法と当該選抜方法で得られるテ ンサイ黒根病抵抗性品種等の発明に関する。
[0019] 本発明者らが発見したテンサイ黒根病抵抗性品種に基づいて、当該病気に対する 抵抗性遺伝資源の研究を行った結果、テンサイ黒根病抵抗性遺伝子座と強く連鎖 する 3組のプライマーペアを開発することに成功した。これらのプライマーペアを用い ること〖こよって、本実施形態のテンサイ黒根病抵抗性品種を、その表現型に依存す ることなく、高い精度で選抜することができる。
[0020] く実施形態 1 :構成〉
[0021] 実施形態 1は、テンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマー、ポリペプチド、テンサイ 黒根病抵抗性品種選抜方法、及び当該選抜方法で得られるテンサイ黒根病抵抗性 品種等によって構成される。本実施形態の構成について以下で具体的に説明をす る。
[0022] (テンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマーの構成）
[0023] 「テンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマー」とは、配列番号 1から 5の 、ずれか一 で表される塩基配列力 なり、後述するテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法におい てテンサイ黒根病抵抗性品種を検出するための DNAマーカーとして機能するオリゴ ヌクレオチドである。 V、ずれのプライマーもその配列中にゲノム上で後述するテンサイ 黒根病抵抗性遺伝子と連鎖する塩基配列を有している。当該塩基配列は、配列番 号 1及び 2で表されるプライマーでは約 2. 2cM (センチモルガン）、また配列番号 3か ら 5で表されるプライマーでは約 4. 3cM、それぞれゲノム上でテンサイ黒根病抵抗 性遺伝子から離れた位置に存在する。
[0024] 図 2を用いてテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマーの構成について説明する 。配列番号 1から 5のいずれか一で表される塩基配列において、 nで表される塩基配 列（以下「n領域」とする。）は、アダプターの一部にハイブリダィズできるように構成さ れている。例えば、図 2Cで示すように、テンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマー が配列番号 1で表される塩基配列の場合であれば、 n領域 (0205)は、後述するァダ プターのコア配列部位の全部、又は一部の塩基配列と相補的な塩基配列を有して いる。また、配列番号 1から 5で表される塩基配列において、 n以外で表される塩基配 列（以下「G領域 (0206)」とする。 )は、 、ずれもテンサイのゲノム DNAに存在する塩 基配列から構成されている。
[0025] 「アダプター」とは、後述する本実施形態のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法の 核酸増幅工程において、図 2Bで示すような断片化されたゲノム DNAの制限酵素切 断末端部に結合可能なように構成されたものをいう。当該アダプターの構造は、図 2 Aで示すように 1本鎖部分力もなる切断末端結合部位 (0201)と、 2本鎖部分からな るコア配列部位（0202)と、力も構成される。アダプタ一は、 EcoRI用アダプターと M sel用アダプターの 2種類を用 、る。 EcoRI用アダプターは EcoRIの切断末端結合 部位を、また、 Msel用アダプタ一は Mselの切断末端結合部位を有する。前記二つ のアダプターにおけるコア配列部位の塩基配列及び塩基数は、非特許文献 3に準じ ればよい。ただし、コア配列部位の塩基配列や塩基数は特に限定するものではなぐ 任意の塩基配列及び任意の塩基数であっても構わない。
[0026] V、ずれのテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマーも、配列番号 1から 5の 、ずれ か一で表される塩基配列以外の塩基配列を、その 5'末側、及び Z又は 3'末側に付 加領域として有することができる。付加領域を 5'末側に有する場合、当該付加領域 の塩基配列は、図 2C及び Dで示すように、アダプターの塩基配列において n領域の 5'側に続く塩基配列（0203)が好ましい。ただし、それに限定されるものではなぐ任 意の塩基配列であっても構わない。また、付加領域を 3'末側に有する場合、当該付 加領域の塩基配列は、図 2C及び 2Dで示すように、 G領域の 3'側に続く Beta属のゲ ノム DNA上の塩基配列、すなわち N (0204)に相補的な塩基配列によって構成され る。具体的には、後述する請求項 6から 8のいずれか一で表されるポリヌクレオチド上 の塩基配列であって、配列番号 1から 5の 、ずれかで表される G領域の塩基配列に 相同的な領域に続く 3 '側の塩基配列となる。
[0027] 本実施形態のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法によれば、プライマーの全塩基 数は 17塩基以上 25塩基以内で、その効果を十分に得ることができる。したがって、 テンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマーは、前記付加領域を有する場合、全塩基 数で 25塩基以内となるように、付加領域を 1塩基以上 8塩基以内に設計するとよい。 当該プライマーの全塩基数が 16塩基以下の場合は、ゲノム DNAの塩基配列に対し て非特異的なハイブリダィゼーシヨンが生じやすくなること力も好ましくない。また、 26 塩基以上にすることは、プライマーのコストをいたずらに高くするだけであり、あまり好 ましくはない。
[0028] テンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマーの Tm値は、いずれも 50°C以上あること が好ましい。これは、テンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法において、铸型認識の特 異¾を高めるためである。
[0029] テンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマーは、蛍光物質、標識物質、または RI (放 射線同位元素)等で標識されていてもよい。これは、後述するテンサイ黒根病抵抗性 品種選抜方法にぉ 、て、テンサイ黒根病抵抗性品種で増幅されたポリヌクレオチド の検出を容易にするためである。ここでいう「蛍光物質」とは、特定波長の励起光を吸 収することで励起状態となり、元の基底状態に戻る際に蛍光を発する性質を有する 物質を意味する。例えば、 FAM、 TET、 HEX, Cy3、 Cy5、 Texas Red, FITC等 が該当する。また、「標識物質」とは、ジゴキシゲニン (DIG)等のハプテンやピオチン 等が該当する。当該品種選抜プライマーにおいて前記標識物質等で標識される位 置は、使用する標識物質等の性質に応じて適宜決定すればよぐ特に限定はしない 。例えば、 T4ポリヌクレオチドキナーゼ等を用いた〔γ—33 P〕ATPによる標識等によ つて 5'末端標識する等が挙げられる。当該プライマーの標識は、使用するプライマ 一ペアの少なくとも一方を標識すれば足りる。感度を上げるために双方のプライマー に同一の標識をしても構わないし、あるいは同一の増幅産物を異なる手段で検出可 能なように双方のプライマーに異なる標識をしても構わな 、。
[0030] なお、本実施形態のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法にぉ ヽて、テンサイ黒根 病抵抗性品種選抜プライマーは、配列番号 1と 2で表される塩基配列力もなるプライ マーペア（以下「第 1プライマーペア」とする。）、配列番号 3と 4で表される塩基配列か らなるプライマーペア（以下「第 2プライマーペア」とする。）、そして配列番号 3と 5で 表される塩基配列力もなるプライマーペア（以下「第 3プライマーペア」とする。 )を用 いることを前提とする。
[0031] 「テンサイ黒根病抵抗性品種」とは、前記ァファノミセス菌の感染に対して高 、抵抗 性を有し、テンサイ黒根病に罹患しない若しくは罹患しにくい Beta属の品種であって 、本発明のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法によって同定可能なものをいう。「品 種」とは、力ブトマル、モノホマレ、ユキノヒデ等のテンサイ品種、または Beta属に属し 、かつテンサイと交雑可能な種が該当する。本発明のテンサイ黒根病抵抗性品種を 遺伝学的に説明すると、テンサイ黒根病に対する抵抗性を表現型とするテンサイ黒 根病抵抗性遺伝子の優性ァリルを少なくとも一方のハプロタイプに有するものをいう
[0032] 「Beta属」とは、一般的にはァカザ科フダンソゥ属を指す。ただし、本発明において Beta属とは、テンサイと交雑可能な Beta属植物種を意味する。例えば、テンサイ、テ 一ブルビート、フダンソゥ、飼料用ビート等が挙げられる。 Beta属植物種の中でも特 に製糖用ビートであるテンサイは、テンサイ黒根病による糖収量低減に対する対策方 法という本発明の趣旨に即する。
[0033] 「テンサイ黒根病抵抗性遺伝子」とは、テンサイのゲノム上に存在し、その一のァリ ルがァファノミセス菌の感染に対して高い抵抗性の優性表現型を示す遺伝子である 。当該遺伝子は未同定ではある力 図 5で示す QTL解析の結果力 もテンサイでは 第三染色体上に存在することが判明しており、また、図 7で示すようにその遺伝子座 も推定されている。そこで、本発明においては以下、便宜的に当該遺伝子を Acrl ( Aphanomyces cochlioides resistance 1)とし、またァファノ^セス菌の感染に 対して抵抗性を示す当該遺伝子の優性ァリルを Acrl1とする。これに対して、ァファノ ミセス菌の感染に対して感受を示す当該遺伝子の劣性ァリルを Acrlsとする。なお、 一般的なテンサイはテンサイ黒根病に対して感受性であることから、その遺伝子型は Acrlsホモ、すなわち AcrlsZAcrlsである。
[0034] (ポリヌクレオチドの構成要件）
[0035] ここで 、う「ポリヌクレオチド」は、 、ずれも本実施形態のテンサイ黒根病抵抗性品 種選抜方法の開発過程で、テンサイ黒根病抵抗性品種で特異的に増幅された増幅 断片の一部の塩基配列から構成される。当該塩基配列は、配列番号 6から 8のいず れか一で表される塩基配列、又は配列番号 6から 8の 、ずれか一で表される塩基配 列と 90%以上の相同性を有する塩基配列で表される。いずれのポリペプチドも 1本 鎖、 2本鎖は問わない。また、これらの塩基配列は、テンサイのゲノム DNAに存在し 、その塩基配列座は Acrl遺伝子座と強く連鎖している。さらに、当該塩基配列は、 交雑によって他の Beta属のゲノム上に Acrlと共に置換することができる。
[0036] 配列番号 6から 8の!、ずれか一で表される塩基配列力 なるポリヌクレオチドにつ!/、 て、以下で具体的に説明する。
[0037] 配列番号 6で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、 135塩基で構成されて いる。当該ポリヌクレオチドは、前記第 1プライマーペアを用いた本実施形態のテンサ ィ黒根病抵抗性品種選抜方法の開発過程で、テンサイ黒根病抵抗性品種で特異的 に増幅された増幅断片の一部である。当該ポリヌクレオチドの末端には Mselの切断 末端配列（5 ' -TAA- 3 '：以下同じ。）と EcoRIの切断末端配列（5 '— AATTC— 3 '：以下同じ。）を有する。
[0038] 配列番号 7で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、 172塩基で構成されて いる。当該ポリヌクレオチドは、前記第 2プライマーペアを用いた本実施形態のテンサ ィ黒根病抵抗性品種選抜方法の開発過程で、テンサイ黒根病抵抗性品種で特異的 に増幅された増幅断片の一部である。当該ポリヌクレオチドの末端には配列番号 6で 表されるポリヌクレオチドと同様に Mselと EcoRIの切断末端配列を有する。なお、当 該配列中で nで表される塩基は、未決定の塩基配列である。
[0039] 配列番号 8で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、 307塩基で構成されて いる。当該ポリヌクレオチドは、前記第 3プライマーペアを用いた本実施形態のテンサ ィ黒根病抵抗性品種選抜方法の開発過程で、テンサイ黒根病抵抗性品種で特異的 に増幅された増幅断片の一部である。当該ポリヌクレオチドの末端には配列番号 6で 表されるポリヌクレオチドと同様に Mselと EcoRIの切断末端配列を有する。
[0040] 「配列番号 6から 8の 、ずれか一で表される塩基配列と 90%以上の相同性を有する 塩基配列」とは、前記配列番号 6から 8のいずれか一で表される塩基配列に欠失、置 換、又は付加等の変異が生じた結果、配列番号 6から 8のいずれか一で表される塩 基配列と 90%以上の同一性を有することとなった塩基配列をいう。ここでいう欠失と は、配列番号 7から 9のいずれか一で表される塩基配列において、一または二以上 の塩基が失われたものをいう。また、置換とは、配列番号 6から 8のいずれか一で表さ れる塩基配列において、一または二以上の連続した塩基が他の異なる塩基と置き換 えられたものをいう。例えば、点突然変異、逆位、又は欠失を伴う重複や挿入若しく は転座が該当する。さらに、付加とは、配列番号 6から 8のいずれか一で表される塩 基配列にぉ 、て全部でな 、一または二以上の連続した塩基が新たに追加されて!ヽ るものをいう。例えば、欠失を伴わない挿入、重複、又は転座が該当する。
[0041] 当該ポリヌクレオチドとその塩基配列の全部又は一部は、テンサイ黒根病抵抗性品 種選抜方法にぉ ヽてテンサイ黒根病抵抗性品種を検出するための指標、プライマー 、若しくはプローブとして用いることができる。テンサイ黒根病抵抗性品種を検出する ための指標としては、例えば、 AFLP法においてその塩基長を利用する方法が挙げ られる。これについては、以下のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法の検出工程で 詳述する。
[0042] また、テンサイ黒根病抵抗性品種を検出するためのプライマーとしては、例えば、 当該ポリヌクレオチドの末端制限部位にある SNPにおいて、 Acrl1に連鎖する SNP の塩基配列を LNA (Locked Nucleic Acid)に置き換えたものが挙げられる。 LN Aの相補的核酸に対する高い結合親和性と熱安定性を利用して、当該プライマーが 铸型 DNAへハイブリダィズする温度差によって、 Beta属のゲノム DNAから Acrl1に 連鎖する塩基配列座を選択的に増幅させる。その増幅産物の有無力 テンサイ黒根 病抵抗性品種判別する方法等が挙げられる。
[0043] さらに、テンサイ黒根病抵抗性品種を検出するためのプローブとしては、当該ポリヌ クレオチドの末端制限部位にある SNPにおいて、 Acrl1に連鎖する SNPの塩基配列 を PNA (Peptide Nucleic Acid)に置き換えたものが挙げられる。 PNAの相補的 核酸に対する熱安定性と塩基配列の高い選択性性と利用して、 Acrl1に連鎖する S NPを含むプローブを、 Beta属のゲノム DNA断片に対して温度差によって特異的に ノ、イブリダィズさせてテンサイ黒根病抵抗性品種判別する方法等が挙げられる。また 、当該プローブを利用した PCR— clamping法によって、 Beta属のゲノム DNAから Acrl1に連鎖する塩基配列座を選択的に増幅させる方法等も挙げられる。
[0044] テンサイ黒根病抵抗性を有する種子及び/又はテンサイ黒根病抵抗性品種後代と は、配列番号 6から 8及び配列番号 6から 8の!、ずれか一で表される塩基配列と 90% 以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドのうち一又は二以上のポリ ヌクレオチドを有するテンサイ黒根病抵抗性品種を用いて、交配またはクローユング により作製される種子及び Z又は後代であって、 Acrl1を有する種子及び Z又は後 代をいう。「クローユングにより作製される種子及び Z又は後代」とは、前記テンサイ 黒根病抵抗性品種の一部組織を培養して得られる同一の遺伝情報を有するクロー ン種子及び Z又は後代を意味する。例えば、テンサイ黒根病抵抗性品種の根部力 得た組織に公知の脱分ィ匕処理を行ってカルス誘導させた後に、当該カルスを培養す ることで得られるクローン種子及び Z又はクローン後代等が該当する。
[0045] (テンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法の構成要件）
[0046] テンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法は、 AFLP法に基づ 、た選択的核酸増幅方 法であって、「DNA抽出工程」、「DNA切断工程」、「核酸増幅工程」、そして「検出 工程」から構成される。以下、それぞれに工程について具体的に説明をする。
[0047] 「DNA抽出工程」は、 Beta属の細胞から DNAを抽出する工程である。 DNA抽出 工程で抽出される DNAは、ゲノム DNAを含んでいればよぐミトコンドリア DNA若し くは葉緑体 DNA等が混在していても、あるいは全 DNAであっても構わない。これは 、ゲノム DNAが以降の工程で铸型として必要となる力もである。「Beta属の細胞」は 、 Beta属の植物体を構成する細胞であれば、葉部、茎部、根部等、いずれの細胞で あってもよい。铸型とするゲノム DNAは全ての細胞に含まれている力 である。好ま しくは緑葉部である。これは、細胞中のゲノム DNAが自己の DNA分解酵素等による 断片化をほとんど受けていないこと、採取が容易なこと、また採取の際に植物体に与 えるダメージを最小限にできる等の理由による。また、 Beta属の細胞は、植物体を採 取後、速やかに凍結させたものを使用してもよい。凍結処理によれば、細胞中のゲノ ム DNAが酵素による分解の影響をほとんど受けないからである。
[0048] 「DNA切断工程」は、抽出した DNAを制限酵素で切断する工程である。本実施形 態で言う「制限酵素」は、非特許文献 3に記載の AFLP法に従って、 EcoRI若しくは E coRIアイソシゾマー、及び Msel若しくは Mselアイソシゾマーとの組み合わせを指す 。本実施形態のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法は、これらの異なる 2種類の制 限酵素を用いて Beta属のゲノム DNAを切断することによって生じるテンサイ黒根病 抵抗性品種とテンサイ黒根病感受性品種との制限酵素切断パターンの違いを利用 する。すなわち、本実施形態のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法は、 Beta属の ゲノム DNAにおいて Acrlと連鎖した SNP (—塩基多型）であって、それ力 ¾coRI、 及び Z又は Mselの制限部位内にあり、かつ Acrl1と Acrlsとの間で異なるものを利 用した方法である。
[0049] 「核酸増幅工程」は、前記 DNA切断工程で得られるゲノム DNA断片を铸型に、前 述のプライマーペアを用いて核酸増幅を行う工程である。本実施形態のテンサイ黒 根病抵抗性品種選抜方法は、前述のように AFLP法に基づいている。ゆえに、当該 核酸増幅工程は、数段階の工程によって構成される。これについては本実施形態の 方法の項で詳述する。
[0050] 「ゲノム DNA断片」とは、前記 DNA切断工程後に得られる様々な長さのゲノム DN Aの断片をいう。当該ゲノム DNA断片の末端部は、使用した制限酵素によって切断 された末端となる。すなわち、 5'末端と 3'末端は、 EcoRI若しくは EcoRIアイソシゾ マーによる切断末端、及び Z又は Msel若しくは Mselアイソシゾマーによる切断末端 となる。当該ゲノム DNA断片は、当該核酸増幅工程における铸型として機能する。 [0051] 「核酸増幅」とは、 DNA等を铸型とし、酵素反応によって二つのプライマーに挟ま れた特定の領域を増幅することをいう。核酸増幅を行う方法を「核酸増幅法」といい、 その具体例としては PCR法、 ICAN法、 LAMP法、又は NASBA法等が挙げられる 。本実施形態のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法は、铸型、プライマー、ァダプ ターとして、それぞれ前記 DNA切断工程で得られるゲノム DNA断片、前記テンサイ 黒根病抵抗性品種選抜プライマーのペア、そして後述する AFLP法用のアダプター を用いる。
[0052] 「検出工程」は、前記核酸増幅工程で増幅された核酸中から、請求項 6から 8のい ずれか一で記載されたポリヌクレオチドの塩基配列を含むポリヌクレオチド (以下「増 幅ポリヌクレオチド」とする。）を検出する工程である。具体的には、第 1プライマーべ ァを用いた場合には配列番号 6で表される塩基配列又は配列番号 6で表される塩基 配列と 90%以上の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドを、第 2プライマ 一ペアを用いた場合には配列番号 7で表される塩基配列又は配列番号 7で表される 塩基配列と 90%以上の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドを、そして 第 3プライマーペアを用いた場合には配列番号 8で表される塩基配列又は配列番号 8で表される塩基配列と 90%以上の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチ ドを、それぞれ検出する工程である。
[0053] 「増幅ポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドの構成要件の項に記載の!/、ずれか一 のポリヌクレオチドの塩基配列、すなわち請求項 6から 8の 、ずれか一で記載された ポリヌクレオチドの塩基配列と、さらに、その 5'、 3'の両末端部に前記核酸増幅工程 で使用したテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマーのアダプター配列が付加され た塩基配列と、力もなるポリヌクレオチドである。ゆえに、当該増幅ポリペプチドの塩 基長は、アダプター配列が付加された分だけ長い。当該増幅ポリヌクレオチドは、 Ac rl1をホモ又はへテロで有する株由来のゲノム DNAで特異的に増幅されるものであ つて、通常 Acrlsホモ個体由来のゲノム DNAからは増幅されない。つまり、これらの 増幅ポリヌクレオチドを検出できる力否かで、検査対象である株がテンサイ黒根病抵 抗性品種であるか否かを判定することができる。
[0054] ただし、本実施形態のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法は、 Acrlに強く連鎖し 、かつ Acrl1と Acrlsの間で異なる SNPを利用して、間接的に Acrl1の有無を判断す る方法である。それ故、 Acrlと当該 SNPとの間で交叉が生じた場合には、 Acrlsホ モ個体、すなわちテンサイ黒根病感受性品種由来のゲノム DNAにお 、ても増幅ポリ ヌクレオチドが検出され得る。このような、いわゆる誤検出が生じる頻度は、 Acrlと前 記 SNPとの組換え価（RV: Recombination Value)に対応する。すなわち、当該 誤検出が生じる頻度は、第 1プライマーペアを用いた場合の Acrl-SNP間で約 2. 2 %、第 2プライマーペアを用いた場合の Acrl- SNP間で約 4. 3%、第 3プライマーべ ァを用いた場合の Acrl-SNP間で約 4. 3%である。これらの頻度は、従来の表現型 に依存するテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法の誤検出頻度 (約 50%)に比べれ ば、極めて低い。また、実際にテンサイ黒根病の抵抗性について検出する場合は、 一の個体に関して 1組のプライマーペアのみを用いて調べるよりも、 2組、若しくは 3 組のプライマーペアを用いて検出することとなる。したがって、例えば、 3組のプライマ 一ペアを用いた場合であれば、本実施形態の選抜方法による誤検出頻度は、約 0. 004% (0. 022 X 0. 043 X 0. 043)となり、これはもはや無視できる値である。した がって、 Acrlとそれに連鎖する SNPの交叉によって生じる誤検出の頻度は、本実施 形態のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法の効果を何ら減じるものではない。
[0055] (本実施形態の選抜方法で得られるテンサイ黒根病抵抗性品種等としての構成要 件）
[0056] 「テンサイ黒根病抵抗性品種等」とは、前記テンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法に よって同定される、 Beta属のテンサイ黒根病抵抗性品種と Beta属のテンサイ黒根病 抵抗性品種後代と Beta属のテンサイ黒根病抵抗性を有する種子を言う。
[0057] 「交配、又はクローユングにより Beta属のテンサイ黒根病抵抗性を有する種子及び Z又は Beta属のテンサイ黒根病抵抗性品種後代を生産する方法」とは、種子及び Z又は後代を生産できる交配、又はクローニング方法であれば特に限定しな 、。
[0058] く実施形態 1 :方法〉
[0059] 図 3は、実施形態 1のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法における工程の流れの 一例を示したものである。まず、 Beta属の細胞から DNAを抽出する（S0301 DNA 抽出工程)。次に、抽出した DNAを制限酵素で断片化する（S0302 DNA断片化 工程)。続いて、前記 DNA断片化工程で得られるゲノム DNA断片を铸型として、前 記二つのテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマーをペアとする核酸増幅を行う（S 0303 核酸増幅工程)。最後に、前記核酸増幅工程で増幅された核酸中から請求 項 1から 8に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドを検出する（S0304 検出工程） 。以上の工程を経て、目的とするテンサイ黒根病抵抗性品種等を選抜することができ る。
[0060] 実施形態 1のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法は、 AFLP法を基本としている。
すなわち、テンサイ黒根病抵抗性遺伝子と連鎖する SNPの有無を検出する方法で ある。当該 SNPは、 Acrl1と Acrlsとの間で異なる。実施形態 1のテンサイ黒根病抵 抗性品種選抜方法の基本的な技術や方法は、公知の AFLP法に準ずればよい。以 下、各工程における方法を具体的に説明する。
[0061] (l) DNA抽出工程（S0301)
[0062] DNA抽出の方法は、 Beta属の細胞からゲノム DNAを取り出すことができる方法で あれば、特に限定はしない。具体例としては、 CTAB (臭化セシルトリメチルアンモ- ゥム)法が挙げられる。当該方法は、実施例 1でその具体的な方法の一例を詳述する 。 DNA抽出は、この他、 ISOPLANT (二ツボンジーン）等の市販の DNA調製キット 等を利用してもよい。
[0063] (2) DNA切断工程（S0302)
[0064] DNAの切断は、 2種類の制限酵素、すなわち、 EcoRIと Msel、若しくはそれらのァ イソシゾマーとの組み合わせで行う。これらの制限酵素は、市販のものを使用すれば 足りる。また、各制限酵素のノッファ組成、塩濃度、 pH等については一般に使用さ れる反応条件に準じて行えばよい。反応に用いる制限酵素量は、反応に用いる DN A量に応じて、それが十分に切断される酵素量を適宜定める。例えば、 l iu gのDNA 量であれば、 EcoRIと Mselをそれぞれ 2から 3ユニット程度用いればよい。制限酵素 の切断する順序に関しては特に問わない。例えば、 EcoRIと Mselで同時に切断して もよいし、一方の制限酵素で切断した後、他方の制限酵素で切断してもよい。反応温 度や反応時間は、ゲノム DNAが十分に断片化される条件を、反応に用いる DNA量 に応じて適宜選択する。例えば、： gの DNA量に対して制限酵素を 2ユニット使用 する場合であれば、反応温度を 37°C、反応時間を 1時間〜 2時間にすればよい。切 断反応後は、切断末端部どうしの再結合等を防ぐために、反応液をー且 70°Cから 8 0°C程度に加熱した後、 4°C以下に急冷させるとより好ま 、。
[0065] (3)核酸増幅工程（S0303)
[0066] 本実施形態のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法は、 AFLP法を基本とすること から、当該核酸増幅工程は複数段階の工程によって構成されている。通常は図 4で 示す 3段階で行うことが好ましいが、目的のポリヌクレオチドを効率よく増幅できれば 段階数は特に限定しない。例えば、第 1段階のアダプター結合工程と第 3段階の選 抜工程の 2段階カゝら構成されていてもよい。以下、一般的な 3段階カゝら構成される場 合にっ 、て、本実施形態の場合にっ 、て説明をする。
[0067] (第 1段階:アダプター結合工程）
[0068] 第 1段階は、アダプター結合工程 (S0401)である。この工程は、制限酵素によって 断片化されたゲノム DNAの末端部にアダプターを結合させることを特徴とする。結合 は、 T4 DNAリガーゼを用いた DNA結合反応方法が一般的で便利である。この場 合、 T4 DNAリガーゼのバッファー組成、塩濃度、 pH等については一般に使用さ れる反応条件に準じて行えばよい。アダプタ一は、 EcoRIアダプター、 Mselアダプタ 一の二つを用いる。また、添加するアダプター量は等量であることが好ましい。結合 反応温度は 8°Cから 30°Cの範囲内であればよいが、 15°Cから 20°Cの範囲であれば なおよい。反応時間は結合反応温度が低いほど長くする。例えば、 20°Cであれば 2 時間程度でよいが、 10°Cであれば約 12時間反応させると言う具合である。アダプタ 一の結合は、もちろん、この方法に限られるものではなぐ断片化されたゲノム DNA の末端部にアダプターを結合できる方法であれば特に限定はしない。また、最近で は様々な酵素等を用いた DNA結合反応キットが市販されており、それらも利用でき る。この場合、反応条件等については添付のプロトコルに従って行えばよい。
[0069] (第 2段階:予備増幅工程）
[0070] 第 2段階は、予備増幅工程 (S0402)である。この工程では、テンサイ黒根病抵抗 性品種予備増幅プライマーのペアを用いて予備的な核酸増幅を行い、目的の増幅 ポリヌクレオチドを絞り込むことを目的として!/、る。 [0071] 「テンサイ黒根病抵抗性品種予備増幅プライマー」は、前記二種類のアダプターの それぞれに対して相補的な塩基配列と 3'末端側に配置される特定の塩基とから構 成される。ここで、アダプターに対して相補的な塩基配列は、 EcoRI若しくは Mselの 制限部位の全部又は一部及びそれに隣接するコア配列の全部又は一部の塩基配 列と、相補的な塩基配列から構成される。アダプターに対して相補的な塩基配列の 塩基数は、 13塩基以上あれば、特に限定はしない。また、特定の塩基は、 1塩基若 しくは 2塩基力 構成される力 通常は 1塩基でよい。この特定の塩基が ATGCのい ずれであるかは、次の第 3段階で使用するテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマ 一のペアによって決定される。すなわち、当該特定の塩基は、使用するテンサイ黒根 病抵抗性品種選抜プライマーに含まれる EcoRI若しくは Mselの制限部位の全部又 は一部の塩基配列の 3'末端側 (伸長方向側）に隣接する塩基となる。例えば、第 3 段階で使用するテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマーのペアが配列番号 1と 2 のそれぞれを含むプライマーペアである場合、配列番号 1を含む当該品種選抜ブラ イマ一は、 EcoRIの制限部位の一部である AATTCを含んでいる。ゆえに、配列番 号 1の塩基配列力 当該制限部位の 3'末端 Cに隣接する塩基は Gとなる。同様に、 配列番号 2を含む当該品種選抜プライマーは、 Mselの制限部位の一部である TAA を含んでいる。ゆえに、配列番号 2の塩基配列力 当該制限部位の 3'末端 Aに隣接 する塩基は Cとなる。
[0072] 当該核酸増幅工程で用いる核酸増幅法は、目的とするポリヌクレオチドを増幅でき る方法であれば、特に限定はされない。例えば、 PCR法、 ICAN法、 LAMP法等が 挙げられる。中でも PCR法は様々な方法が確立されており、便利である。核酸増幅 法の、反応温度、サイクル数等の反応条件については、前記で挙げたそれぞれの方 法で公知の技術に応じて最適の条件を適宜定めて行えばよい。本明細書において は、後述の実施例 1にお!ヽて PCR法を用いた場合の反応条件を一例として示すが、 もちろんそれに限定されるものではない。
[0073] (第 3段階:選抜工程）
[0074] 第 3段階は、選抜工程 (S0403)である。この工程では、テンサイ黒根病抵抗性品 種選抜プライマーのペアを用いて前記予備増幅工程で増幅された核酸断片を铸型 として、さらに核酸増幅を行い、目的の増幅ポリヌクレオチドを増幅することを特徴と する。
[0075] 当該選抜工程において使用する核酸増幅法やその反応条件は、前記第 2段階の 核酸増幅法に準じて行うと便利である。また、ここで使用する核酸増幅法は、必ずし も前記第 2段階の核酸増幅法と同一の方法である必要はない。例えば、第一段階の 予備増幅工程では PCR法を使用し、第 3段階の選抜工程では ICAN法を使用する 等のように異なる核酸増幅法を組み合わせて使用する場合等が該当する。それぞれ の各方法の具体的な手順や反応条件等にっ 、ては、公知の技術に準じて行えばよ い。本明細書においては、後述の実施例 1において PCR法を用いた場合の反応条 件を一例として示す力 もちろんそれに限定されるものではない。
[0076] このようにして、当該核酸増幅工程で得られた最終増幅産物の溶液は、次の検出 工程で使用する。
[0077] (4)検出工程（S0304)
[0078] 増幅ポリヌクレオチドの検出は、ゲル電気泳動法が便利である。本実施形態のテン サイ黒根病抵抗性品種選抜プライマーのプライマーペアを用いた場合には、 、ずれ のペアを用いた場合も、テンサイ黒根病感受性品種では増幅ポリヌクレオチドに近似 する塩基長のポリヌクレオチドが検出されない (Acrlとそれに連鎖する SNPの交叉 が生じた場合を除く。以下同じ。 ) oしたがって、ゲル電気泳動法は、増幅ポリヌクレオ チドの塩基長の有無によってテンサイ黒根病抵抗性品種を容易に判別できる力もで ある。また、ゲル電気泳動法が分子生物学分野に従事する者であれば特段の技術 習得を必要とせずに実施できる理由にもよる。
[0079] 前述のように増幅ポリヌクレオチドの塩基長は、請求項 6から 8のいずれか一に記載 のポリヌクレオチドの塩基配列の両末端に、核酸増幅工程で用いたプライマーのァダ プター配列が付加されて ヽる。その付加される塩基長は両端のアダプター配列を合 わせた 20塩基から 36塩基の範囲内である。具体的な一例としては、第 1プライマー ペアを用いて配列番号 7で表されるポリヌクレオチドの塩基配列を含む増幅ポリヌクレ ォチドを検出する場合、当該検出する増幅ポリヌクレオチドの塩基長は 155塩基から 171塩基が該当する。ただし、これらは铸型となるゲノム DNAの塩基配列内に欠失、 置換、付加等の変異が存在する場合には、それに応じて変動する。
[0080] ゲル電気泳動法を用いて、増幅ポリヌクレオチドを検出する場合には、検出するポ リヌクレオチドが 500塩基以下であれば、 PAGE法を用いることが望ましい。この場合 、ランニングゲルのアクリルアミド（アクリルアミド Zビス アクリルアミドの重量比 = 30 /0. 8)の濃度は、検出する増幅ポリヌクレオチドの塩基長に応じて 10%以上 15% 以内の範囲内で適宜設定する。スタツキングゲルの使用は任意である力 使用の場 合には 5%のアクリルアミド（アクリルアミド/ビス—アクリルアミドの重量比 = 30/0. 8)の濃度にすればよい。
[0081] ゲルにアプライするサンプル量は、検出すべき増幅ポリヌクレオチドの量に応じて 適宜定めればよぐ特に限定するものではないが、一般には前記核酸増幅工程の選 抜工程で得られた増幅産物の溶液 5 1Zゥエルで足りる。必要に応じて、ローデイン グバッファを増幅産物の溶液 5 μ 1に対して 1 μ 1程度カ卩えてもよい。
[0082] 泳動は泳動バッファー（1 ΧΤΒΕ等）中で 280Vで 3時間程度泳動する。この時、サ ィズマーカーを同時に泳動する。サイズマーカーは、市販のサイズマーカー、例えば 、 lOObpDNAラダーマーカー（TaKaRa社)等を利用すると便利である。
[0083] なお、当該検出工程を行う上で、増幅ポリヌクレオチドを判別するために、遺伝型が 判明しているゲノム DNAを、ネガティブコントロール (Acr Isホモ）、及びポジティブコ ントロール（又は Acrl1ホモ若しくは Acrl1ヘテロ）として用いることが好まし ヽ。
[0084] ゲル電気泳動後のポリヌクレオチドを視認する方法としては、前述のようにテンサイ 黒根病抵抗性品種選抜プライマーペアのうち少なくとも一方を予め蛍光物質や RIで 直接標識したものを核酸増幅工程で使用する方法や、ピオチンや DIGのように蛍光 物質で標識したアビジンタンパク質や抗体等をそれぞれ使用して間接的に蛍光物質 標識を行う方法、又は電気泳動後のゲル中に存在するポリヌクレオチドをインター力 レーシヨン可能な蛍光物質、例えばェチジゥムブロマイド（Ethidium bromide)、ビ ストラグリーン（VistraGreen:アマシャム社）、サイバーグリーン（SYBER Green; 登録商標：ロッシュ社)等で染色する方法等が挙げられる。蛍光物質で標識若しくは 染色した場合には、使用した蛍光物質の励起波長光を泳動後のゲルに照射すること で発生するケミカルルミネッセンスにより、ゲル中のポリヌクレオチドを視認できる。ケミ カルルミネッセンスの視認は目視可能な発光強度であれば目視で行ってもょ 、。また 、発光強度が微弱等の場合には生物化学発光撮影装置 (ライトキヤプチヤー）によつ て視認すればよい。 RIで標識した場合には、泳動後のゲルを適当に処理した後、 X 線フィルム、あるいはイメージングプレート（富士フィルム）等に感光させることでゲル 中のポリヌクレオチドを視認することができる。これらの基本的な操作等についてはい ずれも公知の技術であり、詳細はそれらの各種プロトコル等に準じて行えばよい。
[0085] 通常は、前述したように本実施形態のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマー ペアによれば、テンサイ黒根病感受性品種で増幅ポリヌクレオチドに近似する塩基 長のポリヌクレオチドは検出されな 、ことから、ゲル電気泳動法で判別は可能である 。しかし、当該品種選抜プライマーペアで検出するゲノム DNAの領域内で、 40塩基 を超えるような欠失、付加等の変異が生じた場合には、当該増幅ポリヌクレオチドの 塩基長が、テンサイ黒根病感受性品種においても増幅される他の非特異的なポリヌ クレオチドの塩基長と近似する可能性がある。このような場合には、前記ポリヌクレオ チドの構成要件で述べた、請求項 6から 8に記載の 、ずれか一のポリヌクレオチドの 全部、又は一部をプローブとして、ハイブリダィゼーシヨン法を行うことで、増幅ポリヌ クレオチドを選択的に検出することができる。
[0086] ここで使用するハイブリダィゼーシヨン法は、サザンハイブリダィゼーシヨン法、若し くはそれを原理とする公知の方法が便利である。一般的なサザンハイブリダィゼーシ ヨン法は、電気泳動後のゲル中で分画されたポリヌクレオチドをメンブレンに転写し、 標識されたプローブを当該メンブレン上の目的のポリペプチドにハイブリダィズさせて 検出することを基礎とするものである。この方法は分子生物学分野にぉ 、て極めて一 般的な技術であり、本実施形態においてもそれに準じて行えばよいことから、詳細な 説明については省略する。
[0087] プローブとしてのポリペプチドの塩基配列は、第 1プライマーペアを使用した場合に は、請求項 6で表されるポリヌクレオチドの塩基配列の全部、または一部を用いる。第 2プライマーペアを使用した場合には、請求項 7で表されるポリヌクレオチドの塩基配 列の全部、または一部を用いる。そして第 3プライマーペアを使用した場合には、請 求項 8で表されるポリヌクレオチドの塩基配列の全部、または一部を用いる。プローブ の標識は、前記テンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマーにおいて、蛍光物質ゃ標 識物質、あるいは RIで当該プライマーを直接標識した方法に準じて行えばよい。また 、ノ、イブリダィズしたプローブの検出は、そのプローブの標識に応じて適宜決定する 。これについても、前記標識されたテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマーを検 出する方法に準じて行えばょ 、。
[0088] 本実施形態のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法において、プライマーペアを単 独で用いた際、増幅ポリヌクレオチドが検出できた場合には、その個体は 95%以上 の確率でテンサイ黒根病抵抗性品種と判断できる。また、 3組のプライマーペアを独 立で用いた際に、いずれのプライマーペアにおいても、所定の塩基長のポリヌクレオ チドが検出できた場合には、その個体は限りなく 100%に近い確率でテンサイ黒根 病抵抗性品種と判断できる。
[0089] く実施形態 1 :効果〉
[0090] 本実施形態のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマーと当該選抜プライマーを 用いたテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法によれば、病徴の現れる前の幼植物体 時であっても、その植物体の一部を採取するだけで、表現型に依存することなぐテ ンサイ黒根病に対して優性の抵抗性を示す品種を高い精度で間接的に選抜するこ とがでさる。
[0091] また、本発明のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法を、選抜されたテンサイ黒根 病抵抗性品種カゝら得られるテンサイ黒根病抵抗性後代の選抜に対しても使用するこ とで、多大な労力や時間、そしてコストを必要とすることなぐ効率的にテンサイ黒根 病抵抗性のテンサイ等の品種改良が可能となる。それによつて当該病気によって糖 収量が大きく縮減することもなくなり、製糖市場に安定してテンサイを供給する事がで きる。すなわち、本実施形態によれば、製糖産業における波及効果は極めて大きい。
[0092] く実施形態 2〉
[0093] く実施形態 2 :概要〉
[0094] 実施形態 2は、テンサイ黒根病抵抗性遺伝子 Acrlの同定方法に関する。前記実 施形態 1のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法は、 AFLP法により Acrlと連鎖する SNPに基づいて、増幅ポリヌクレオチドを検出する方法であった。ところで、当該テン サイ黒根病抵抗性品種選抜方法を開発する過程で、テンサイの表現型とそのテンサ ィからの増幅ポリヌクレオチドとの分離比から、 Beta属のゲノム DNAにお!/、て Acrl 遺伝子座と、請求項 6から 8の 、ずれか一に記載の塩基配列を有する塩基配列座と の間の組換え価を算出することができる。さらに、当該組換え価とコサンビ (Kosambi )の地図関数と、力 両者の遺伝学的距離を算出することができる。本実施形態は、 請求項 6から 8の 、ずれか一に記載のポリヌクレオチドの塩基配列を有する塩基配列 座と、当該算出された遺伝学的距離とから、ゲノム上の Acrl遺伝子を同定する方法 である。
[0095] く実施形態 2 :構成〉
[0096] 実施形態 2は、 Beta属のゲノム DNAにおいて、請求項 6から 8のいずれか一に記 載の塩基配列を有する塩基配列座及び、前記請求項 6から 8の 、ずれか一に記載の 塩基配列座と Acrl遺伝子座との遺伝学的距離を利用して Acrlを同定するテンサイ 黒根病抵抗性遺伝子同定方法によって構成される。以下で本実施形態の構成につ いて具体的に説明をする。
[0097] 本実施形態の「塩基配列座」とは、 Beta属のゲノム上、また、テンサイの場合には 第 3染色体上にあって、配列番号 6で表される塩基配列、又は配列番号 6で表される 塩基配列と 90%以上の相同性を有する塩基配列（以下「請求項 6に記載の塩基配 列」とする。）、
配列番号 7で表される塩基配列、又は配列番号 7で表される塩基配列と 90%以上の 相同性を有する塩基配列（以下「請求項 7に記載の塩基配列」とする。）、または配列 番号 8で表される塩基配列、又は配列番号 8で表される塩基配列と 90%以上の相同 性を有する塩基配列（以下「請求項 8に記載の塩基配列」とする。）、のいずれかを有 する領域である。
[0098] また、各塩基配列座と Acrlの遺伝子座との遺伝学的距離は、表 1から請求項 6に 記載の塩基配列を有する遺伝子座の場合は約 2. 2cM、請求項 7に記載の塩基配 列を有する遺伝子座の場合は約 4. 3cM、そして請求項 8に記載の塩基配列を有す る遺伝子座の場合は、約 4. 3cMである。ここで、表 1は、 Acrl遺伝子座と前記各塩 基配列座との連載分析結果を示したものである。表中で、 C1. 6、 C1. 7、 C1. 8は、請 求項 6、請求項 7、請求項 8にそれぞれ記載の塩基配列を有する塩基配列座を、また A、 Bは遺伝子座又は塩基配列座を示す。ここで、各塩基配列座の検出は、本実施 形態の方法による増幅ポリヌクレオチドの有無によって、 Acrl遺伝子座の検出は、 表現型によって、それぞれ行った。表中、 +は増幅ポリヌクレオチドが検出された場 合若しくはテンサイ黒根病に対する抵抗性の表現型が確認された場合を、一は増幅 ポリヌクレオチドが検出されな力つた場合若しくはテンサイ黒根病に対する感受性の 表現型が確認された場合を示す。例えば、 1を例に挙げて説明すると、 A: Bの + + の値は 73であることから、 C1. 6に記載の塩基配列を有する増幅ポリヌクレオチド (A) が検出（ + )され、かつテンサイ黒根病に対する抵抗性の表現型 (B)が確認され（ + ) た株が 73株であったことを意味する。さらに、 RVは組換え価を、 cMはセンチモルガ ンを、 S. E.は標準誤差をそれぞれ示す。この表の結果に基づいて、 Acrlと各塩基 配列座との遺伝学的な連鎖地図は、図 7のように表すことができる。
[表 1]
Figure imgf000024_0001
[0099] く実施形態 2 :方法〉
[0100] Beta属のゲノム DNA上で、前記請求項 6に記載の塩基配列、請求項 7に記載の 塩基配列、そして請求項 8に記載の塩基配列を有する塩基配列座、及び当該塩基 配列座と Acrlの遺伝子座との遺伝学的距離を利用して Acrlを同定することができ る。すなわち、通常 lcMで表される遺伝学的距離が、物理的距離にして約 1Mb (メ ガベース = 1 X 106塩基）に相当することを利用すればよい。例えば、ゲノム上で請求 項 6に記載の塩基配列を有する塩基配列座と Acrlの遺伝子座との遺伝学的距離が 約 2. 2cMであることから、当該塩基配列座を基点として約 2. 2Mb離れた左右いず れかの位置に Acrlが存在することになる。
[0101] 当該遺伝学的距離を利用して Acrlを同定する方法の一例を、以下で説明する。ま ず、 Beta属の 、ずれかの種の全ゲノム塩基配列データベース力 前記請求項 6に 記載の塩基配列に相同的な領域を検索する。植物種がテンサイである場合には、第
3染色体のみを検索すればよい。続いて、検索によって得られた相同的な領域を塩 基配列座として、それを基点に物理的距離にして左右 2. 2Mb離れた位置周辺にあ る複数の遺伝子を候補遺伝子として選択する。テンサイ黒根病抵抗性品種とテンサ ィ黒根病感受性品種にお!ヽて候補遺伝子の全塩基配列決定を行う。候補遺伝子数 が 50を超える場合には、既知遺伝子若しくは、その機能が予測された遺伝子を選択 し、さらにその中でテンサイ黒根病に対して関連性が予想される遺伝子を優先的に 調べればょ 、。テンサイ黒根病抵抗性品種とテンサイ黒根病感受性品種との間で相 違が見られる遺伝子、特にテンサイ黒根病抵抗性品種では、その塩基配列がパプ口 タイプで異なる場合が見られる遺伝子がある場合には、当該遺伝子を有力候補遺伝 子として選択する。その後有力候補遺伝子において、テンサイ黒根病感受性品種で は見られない塩基配列を Acrl1ァリル候補として、ベクターに連結する。テンサイ黒 根病感受性品種の組織から得た組織に公知の脱分化処理を行ってカルス誘導させ た後に、そのカルスに当該遺伝子を連結したベクターを公知技術によって導入する。 カルスを培養することで得られる植物体がテンサイ黒根病抵抗性品種の表現型を示 せば、 Acrl1ァリル候補力 目的の Acrl遺伝子であり、テンサイ黒根病に対して抵抗 性を有するァリル遺伝子となる。
複数の塩基配列座、及び当該複数の塩基配列座と Acrlの遺伝子座との遺伝学的 距離を組み合わせた方法は、テンサイ黒根病抵抗性遺伝子同定方法において、より 好ましい。なぜなら、 2点若しくは 3点の塩基配列座によれば、 Acrlの遺伝子座を 1 点に特定することができる力もである。すなわち、図 6で示す連鎖地図のように、 Beta 属のゲノム DNA上で、前記請求項 6に記載の塩基配列を有する塩基配列座と Acrl 遺伝子座、請求項 7に記載の塩基配列を有する塩基配列座と Acrl遺伝子座は、ぞ れぞれ逆方向に 2. 2cM, 4. 3cMであること力も Acrlの遺伝子座が特定される。ま た、請求項 6に記載の塩基配列を有する塩基配列座と、請求項 7に記載の塩基配列 を有する塩基配列座とは、 6. 5cMの距離にあり、この遺伝学的距離とゲノム塩基配 列における物理学的な実際の距離との比較によって補正された各塩基配列座と Acr 1遺伝子座との物理学的距離を算出することもできるからである。なお、遺伝子の同 定方法については、前記方法と同様に行えばよい。
[0103] く実施形態 2 :効果〉
[0104] 本実施形態のテンサイ黒根病抵抗性遺伝子同定方法によれば、ゲノム上でテンサ ィ黒根病抵抗性遺伝子をコードする領域を限定し、当該遺伝子を同定することがで きる。また、テンサイ黒根病抵抗性品種と、テンサイ黒根病感受性品種との当該遺伝 子の塩基配列の比較から、 Acrl すなわちテンサイ黒根病抵抗性遺伝子のテンサ ィ黒根病抵抗性ァリルを同定することできる。当該遺伝子を同定できれば、テンサイ 黒根病抵抗性品種の選抜において、直接的に検出が可能となるだけでなぐテンサ ィ黒根病抵抗性遺伝子ァリルをテンサイ黒根病感受性品種に導入する遺伝子組み 換え体を作製することで、容易にテンサイ黒根病抵抗性品種を得ることができるような る。
実施例 1
[0105] 以下の実施例をもって本発明を具体的に説明する。なお、当該実施例は単に例示 するのみであり、本発明はこの実施例によって何ら限定されるものではない。
[0106] くテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法〉
[0107] ここでは、表現型カゝらテンサイ黒根病に対して抵抗性を有することが判明している 品種 4株 (al〜a4)と、感受性を示すことが判明している品種 4株 (bl〜b4)とについ て、それぞれより得た植物組織 (緑葉)を用いて実施形態 1のテンサイ黒根病抵抗性 品種選抜方法を行った具体例を示す。
[0108] ( (方法)）
[0109] (A) DN A抽出工程
[0110] ここでは CTAB法を用いた方法を例に挙げて説明する。
[0111] (試薬組成）
[0112] - 2 X CTAB : CTAB (ICN Biomedicals. Inc. ：以下同じ。） 10g/lM Tri s -HCl (pH8. 0) 50ml/0. 5M EDTA (pH8. 0) 20ml/ポリビュルピロリドン (WAKO社） 5gZNaCl 40. 9gを混合後、滅菌水で 500mlにフィルアップしたも の。
[0113] - 10% CTAB : CTAB 50g/NaCl 20. 45gを混合後、滅菌水で 500mlにフ ィルアップしたもの。
[0114] -CTAB沈殿緩衝液： CTAB 5g/lM Tris— HCl (pH8. 0) 25ml/0. 5M
EDTA(pH8. 0) 10mlを混合後、滅菌水で 500mlにフィルアップしたもの。
[0115] -High Salt TEバッファー： NaCl 58. 4g/lM Tris— HCl (pH8. 0) 10m
1/0. 5M EDTA(pH8. 0) 2mlを混合後、滅菌水で 1000mlにフィルアップした もの。
[0116] -TE-RNase : 10mg RNase A (WAKO社） ZTE lml
[0117] (CTAB法）
[0118] (1)テンサイの生葉 (緑葉）を 0. 3gから 0. 5g用意し、それに液体窒素を加えて凍 結させた後、乳鉢と乳棒等を用いて粉砕した。
[0119] (2)粉砕した組織を 2. 2ml^クリューキャップチューブに移した後、当該チューブに
750 μ 1の 2 X CTABにメルカプトエタノールを 20 μ 1カ卩えてウォーターバスで 56°Cに プレヒートしたものを添カ卩し、混和した。
[0120] (3)時々、転倒させながら 30分間、室温（おおよそ 15°C〜25°Cの範囲内。以下同 じ。）で混和した。
[0121] (4)クロ口ホルム イソアミルアルコール（24 : 1)を 800 1カ卩え、 15〜20分間、室 温で緩やかに転倒混和した。
[0122] (5)室温にて 12000rpmで 15分間、遠心した。
[0123] (6)遠心後、上清を回収し、予め 70 μ 1の 10%CTABを加えた 2. 2mlスクリューキ ヤップチューブに当該上清を移した。
[0124] (7)前記（6)後のチューブ内溶液の 1. 5倍量 (約 1200 1)の CTAB沈殿緩衝液 を加えて転倒混和した。この段階で不溶物が析出した。
[0125] (8)室温にて 12000rpmで 15分間遠心して不溶物を沈殿させた。
[0126] (9)遠心後、上清をデカンテーシヨンによって除去し、沈殿した不溶物を沈殿物とし て回収した。このとき、チューブをキムワイプ (クレシァ社:登録商標）上で転倒静置す る等して、残液を十分に除くようにした。
[0127] (10) 500 1の High— salt TE緩衝液に 5 1の TE— RNase混合した溶液を前 記（9)のチューブに加え、沈殿物を十分に懸濁した。 [0128] (11)前記（10)のチューブを 55°Cで 2時間以上インキュベートし、沈殿物内の RN Aを分解した。
[0129] ( 12)前記（11)のチューブにイソプロパノールを 500 1加え、転倒混和した。
[0130] (13)前記（12)のチューブを室温にて 12000rpmで 15分間遠心して析出した全 D NAを沈殿させた。
[0131] (14)遠心後、上清を除去し、 70%エタノール 1000 1を静かにカ卩えて沈殿物を洗 浄した。
[0132] (15)室温にて 12000rpmで 2分間遠心した。
[0133] (16) 70%エタノールを十分に除去した後、風乾、若しくはバキュームによって沈殿 物を乾燥させた。
[0134] (17)乾燥沈殿物である全 DNAを TE 100 1に懸濁したものを、テンサイ全 DNA 溶液とした。
[0135] 次の DNA切断工程以降は、 AFLP法に基づくものである。ここでは AFLP Core
Raegent Kit (インビトロジェン社）を用いて、当該キットに添付のマニュアルに従 つて、以下のように行った。
[0136] (B) DNA切断工程
[0137] (1) 1. 5mlチューブに入れた 6. 2 μ 1の Η Οに、 DNA抽出工程で調製されたテン
2
サイ全 DNA溶液 Ι ΐ、前記キットに添付の 5 X Reaction Buffer (50mM Tris— Hcl (pH7. 5) 50mM Mg- acetate 250mM K— acetate)を 2 1、同じくキッ ト添付の EcoRlZMsel (各 1. 25ユニット）混合液を 0. 8 1、加えて十分に混和した 後、 37°Cで 2時間 DNA切断反応を行った。
[0138] (2) DNA切断反応後、反応液を 70°Cに移して 15分間保温した。
[0139] (3)前記（2)の保温処理後、 4°Cで急冷させ、当該温度で保温した。
[0140] 以上の工程をもって、テンサイより抽出した全 DNAを EcoRIと Mselによって断片 化した。
[0141] (C)核酸増幅工程
[0142] (第 1段階:アダプター結合工程）
[0143] (1) DNA切断工程で得られた切断反応後の全溶液 10 μ 1に、前記キットに添付の EcoRIアダプターと Mselアダプターが添カ卩されたアダプター Zライゲーシヨン溶液を 9. 6 1と、前記キットに添付の T4 DNA Ligase (10ユニット Z 1) 0. 4 1カ卩えて 、十分に混合した。なお、ここで用いたアダプターのコア配列部位の塩基配列及び塩 基数は、非特許文献 3に記載のアダプターと同一である。
[0144] (2)前記（1)の反応液 20 μ 1を 20°Cで 2時間インキュベートし、ライゲーシヨン反応 によって、各 DNA断片の切断末端部に EcoRIアダプター及び/又は Mselアダプタ 一を結合させた。
[0145] (3)ライゲーシヨン反応後は、反応液を 4°Cに保温した。
[0146] 以上の工程をもって、テンサイ由来の DNA断片の末端部にアダプターを結合させ た。
[0147] (第 2段階:予備増幅工程）
[0148] ここでは PCRを用いた。熱而性 DNAポリメラーゼには、 Ex— Taq (TAKARA社）を 用いた。
[0149] (1)前記第 1段階後に得られる結合反応産物を含む反応液を TEで 10倍に希釈し
、「1Z10希釈テンプレート」とした。
[0150] (2)サーマルサイクラ一 GP384プレート（TAKARA社、以下同じ。 )に、 10. 2 1 の H Oと 2 1の 1Z10希釈テンプレートを入れ、前記 Ex—Taqに添付の 10 X Buff e
2
rを 2 1、同じく Ex— Taqに添付の dNTPミックス溶液（dATP、 dGTP、 dCTP、 dTT
P、各 2. 5mM混合液）を 2 1、 AFLP Core Raegent Kitに添付の 2. 4 M E
-N primerと 2. 4 M M—N primerをそれぞれ 2 1、 Ex— Taqを 0. 2 1カロえ た後、十分に混和した。
[0151] ここで Ε— N primerと Μ— N primerは、次の第 3段階で使用するテンサイ黒根 病抵抗性品種選抜プライマーのペアに応じて、以下のものを用いた。
[0152] a)第 3段階で配列番号 1、及び 2で表されるテンサイ黒根病抵抗性品種選抜ブラ イマ一のペアを使用する場合、
E-N primer: 配列番号 9で表される E— G primer
M—N primer: 配列番号 10で表される M— G primer
を使用した。 [0153] b)第 3段階で配列番号 3、及び 4で表されるテンサイ黒根病抵抗性品種選抜ブラ イマ一のペア、又は配列番号 5、及び 6で表されるテンサイ黒根病抵抗性品種選抜 プライマーのペアを使用する場合、いずれも
E -N primer : 配列番号 11で表される E— A primer
M -N primer : 配列番号 12で表される M— C primer
を使用した。
[0154] (3)本工程の前記（2)の反応液をサーマルサイクラ一 (機種:メーカー名、以下同じ 。）で、以下のプログラムに従って PCR反応を行った。
PCR反応プログラム： 94°C5分間処理、続いて、 94°C30秒間→56°C 1分間→7 2°C 1分間のサイクルを 20サイクル行う。その後、 72°C 10分間処理、最後に 4°Cに冷 却後保温する。
[0155] 以上の工程をもって、目的の増幅ポリペプチドを予備的に増幅させた。
[0156] (第 3段階:選抜工程）
[0157] ここでは PCR法を用いた。熱耐性 DNAポリメラーゼには、前記第 2段階と同様に Ex
-Taq (TAKARA社）を用いた。
[0158] ( 1)前記第 2段階後に得られる予備増幅反応産物を含む反応液を TEで 50倍に希 釈し、「1Z50希釈テンプレート」とした。
[0159] (2)サー レサイクラ一 GP384プレートに、 3. 6 μ 1の Η Οと 2. 5 μ 1の 1Ζ50希釈
2
テンプレートを入れ、前記 Ex— Taqに添付の 10 X Bufferを 1 1、同じく Ex— Taqに 添付の dNTPミックス溶液（dATP dGTP dCTP dTTP、各 2. 5mM混合液）を 0 . 8 1、各 2. 4 Mのテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライ をペアでそれぞれ 1 1 Ex— Taqを 0. 1 μ 1カロえた後、十分に混禾口した。
[0160] ここでテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライ は以下のペアで使用した。
a)配列番号 1に基づ!/、た配列番号 13、及び 2に基づ 、た配列番号 14で表される テンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマーのペア
b)配列番号 3に基づ 、た配列番号 15、及び 4に基づ 、た配列番号 16で表される テンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマーのペア
c)配列番号 3に基づ 、た配列番号 15、及び 5に基づ 、た配列番号 17で表される テンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマーのペア
[0161] (3)本工程の前記（2)の反応液をサーマルサイクラ一で、以下のプログラムに従つ て PCR反応を行った。
PCR反応プログラム： （第 1増幅反応） 94°C5分間処理し、次に 94°C30秒間→6 5°C30秒間→72°C1分間のサイクルを 13サイクル行う。このとき、アニーリング温度で ある 65°Cは、 1サイクルごとに 0. 7°Cずつ低下するタツチダウンで行う。（第 2増幅反 応)第 1増幅反応に引き続き、 94°C30秒間→65°C30秒間→72°C1分間のサイクル を 20サイクル行う。その後、 72°C10分間処理、最後に 4°Cに冷却後保温する。
[0162] 以上の工程をもって、 目的の増幅ポリペプチドを増幅させた。得られた PCR増幅産 物を含む反応液 10 1に、 2 1のマーカー dye (0. 25% BPB/0. 25% XC/1 mM EDTA(pH8. 0) Z30%グリセロール）を加えて次の検出工程の泳動サンプ ルとした.
[0163] (D)検出工程
[0164] 増幅ポリヌクレオチドの検出は、ここではアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて行 つた o
[0165] (試薬組成）
[0166] ·ランニングゲル（13%アクリルアミド) Z枚： 30%アクリルアミド (WAKO社:以下 同じ。）&0. 8%ビス—アクリルアミド (WAKO社：以下同じ。）混合液 10. 8ml/ 1. 5M Tris— HCl (pH8. 8) 6. 3mlを混合後、滅菌水で 23mlにフィルアップしたも の。なお、ゲルの作製は氷上で行った。
[0167] 'スタツキングゲル（5%アクリルアミド） Z枚： 30%アクリルアミド& 0. 8%ビスーァ クリルアミド混合液 lml/0. 5M Tris-HCl(pH8. 8) 1. 6mlを混合後、滅菌 水で 5. 3mlにフィルアップしたもの。なお、ゲルの作製は氷上で行った。
[0168] · 10 ΧΤΒΕバッファー： Tris base 108gZホウ酸 55g/EDTA- 2Na (2H O
2
) 3. 7gを混合後、滅菌水で 1Lにフィルアップしたもの。泳動バッファ一として使用 する場合には、滅菌水で 10倍希釈した 1 XTBEを用いた。
[0169] (検出方法）
[0170] (1)ポリアクリルアミドゲルの作製 [0171] ランニングゲル 23mlに 1. 5%APSと 2%TEMEDをカ卩えて攪拌した後、シールチ ユーブを挟んだ 18cm X 18cmのガラス製ゲル板間に、液面の上方を 2. 5〜3cm程 度空ける程度の液量で当該ランニングゲルを静かに流し込む。続いて、ランニングゲ ルの液上に滅菌水を lcm程度の厚さで重層し、そのまま 30分程度放置してゲルを 固める。重層した水を除去し、キムワイプで水分を十分に除いた後、スタツキングゲル 5. 3mlに 1. 5%APSと 2%TEMEDをカ卩えて攪拌したものを固化したランニングゲ ル上に重層する。次に、気泡が入らぬようにしてコームをスタツキングゲル中に配置し 、 30分間放置してゲルを固める。最後にシールチューブを外して、泳動用ポリアタリ ノレアミドゲノレとした。
[0172] (2)ポリアクリルアミドゲル電気泳動
[0173] 前記ポリアクリルアミドゲルを泳動槽 (NA—1214A:日本エイド一）に設置し、泳動 バッファー（1 XTBE)約 2. 5Lを泳動層に注いだ。泳動バッファー内でコームを外し てゥエルを泳動バッファーで洗浄後、当該ゥエル内に前記核酸増幅工程の第 3段階 で得られた泳動サンプルを 5 1ずつ 2ゥエルにアプライした。泳動サンプルとともに別 のゥエルにサイズラダーマーカー（100bpDNALadder:TaKaRa社）を 2 μ 1アプライ した。続いて、 280V—定電圧で約 3時間 30分電気泳動した。
[0174] (3)検出
[0175] 前記電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルをゲル板カゝら剥がし、ビストラグリーン (Vist ragreen:アマシャム社)を TBEで lZlO—4に希釈した溶液に当該ゲルを浸漬させ、 約 15分間緩やかに振動しながらゲル中の核酸を染色した。最後に染色したゲルに 2 74nmの紫外線ランプを照射しポリヌクレオチドバンドのパターンを記録した。
[0176] ( (結果)）
[0177] 図 6に本実施例のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法によるゲル電気泳動後の ポリヌクレオチドのバンデイングパターンを示す。この図において、 Mで示すサイズマ 一力一の左 4レーンには al〜a4のテンサイ黒根病抵抗性品種より得たサンプルを、 また、右 4レーンには bl〜b4のテンサイ黒根病感受性品種より得たサンプルをそれ ぞれアプライした。 Iは第 1プライマーペア、 IIは第 2プライマーペア、 IIIは第 3プライマ 一ペアをそれぞれ用いたものである。 [0178] 図 6で示すように、 I、 II、 ΙΠのいずれにおいても al〜a4の 4レーンでは矢印で示す 位置にポリヌクレオチドバンドが検出されたのに対して、 bl〜b4の 4レーンでは検出 されなかった。このように実施形態 1のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法によれば 、テンサイ黒根病抵抗性品種において、特異的なポリヌクレオチド (増幅ポリヌクレオ チド）を増幅させることができる。したがって、当該増幅ポリヌクレオチドのバンドの有 無から、検査対象株がテンサイ黒根病に対する抵抗性品種であるカゝ、若しくは感受 性品種であるかを容易に判別することができる。
図面の簡単な説明
[0179] [図 1]テンサイ黒根病の病徴である根腐症状を説明する図。 Aは病徴の認められない 発病指数 0に相当する株 (正常株）、 Bは内部腐敗を伴う黒色の病斑が認められる発 病指数 3に相当する株、 Cは内部腐敗を伴う病徴が株全体に及ぶ、若しくは枯死した 発病指数 5に相当する株を示す。
[図 2]アダプターの構造と、それに結合するテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマ 一の構造を説明する図。 Aは EcoRIアダプターを、 Bはゲノム DNA断片の EcoRI切 断末端を、 Cはテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマー (請求項 1に相当するもの )を、 Dはアダプターが結合した铸型ゲノム DNAを示している。なお、 n，は nに相補 的な塩基を、 Nはゲノム DNA上の塩基配列を意味する。
[図 3]実施形態 1のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法における工程の流れを説明 する図。
[図 4]実施形態 1のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法において核酸増幅工程を構 成する段階の流れを説明する図。
[図 5]Aは、テンサイ F2世代における個体別のテンサイ黒根病発病指数に関する QT L解析の結果を示す図。また、 Bは、テンサイ F2個体別 F3系統群におけるテンサイ 黒根病発病指数に関する QTL解析の結果を示す図。 、ずれも横軸の chrは染色体 を、また数字は染色体番号を示す。縦軸は QTLの位置の存在可能性であるォッズ 対数を示す。
[図 6]実施形態 1のテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方法によるテンサイ黒根病抵抗 性品種選抜の結果を示す図。 [図 7]テンサイ黒根病抵抗性遺伝子 Acrlと請求項 6から 8に記載の塩基配列を有す るそれぞれの塩基配列座との連鎖地図。図中 C1. 6、 C1. 7、 C1. 8は、請求項 6、請 求項 7、請求項 8に記載の塩基配列を有する塩基配列座をそれぞれ示す。

Claims

請求の範囲
[I] 配列番号 1で表される塩基配列からなるテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマ [2] 配列番号 2で表される塩基配列からなるテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマ [3] 配列番号 3で表される塩基配列からなるテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマ [4] 配列番号 4で表される塩基配列からなるテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマ [5] 配列番号 5で表される塩基配列からなるテンサイ黒根病抵抗性品種選抜プライマ
[6] 配列番号 6で表される塩基配列、又は配列番号 6で表される塩基配列と 90%以上の 相同性を有する塩基配列力 なるポリヌクレオチド。
[7] 配列番号 7で表される塩基配列、又は配列番号 7で表される塩基配列と 90%以上の 相同性を有する塩基配列力 なるポリヌクレオチド。
[8] 配列番号 8で表される塩基配列、又は配列番号 8で表される塩基配列と 90%以上の 相同性を有する塩基配列力 なるポリヌクレオチド。
[9] 請求項 6から請求項 8のいづれか一又は二以上に記載のポリヌクレオチドを有する Be ta属テンサイ黒根病抵抗性品種を用いて、交配、又はクローニングにより作製される
Beta属テンサイ黒根病抵抗性品種後代。
[10] 請求項 6から請求項 8のいづれか一又は二以上に記載のポリヌクレオチドを有する Be ta属テンサイ黒根病抵抗性品種を用いて、交配、又はクローニングにより作製される
Beta属のテンサイ黒根病抵抗性を有する種子。
[II] Beta属の細胞から DNAを抽出する DNA抽出工程と、
AFLP法に基づいて、
抽出した DNAを制限酵素で切断する DNA切断工程と、
前記 DNA切断工程で得られるゲノム DNA断片を铸型に、請求項 1及び 2に記載 のプライマーをペアとして核酸増幅を行う核酸増幅工程と、 前記核酸増幅工程で増幅された核酸中から請求項 6に記載の塩基配列を含むポリ ヌクレオチドを検出する検出工程と、
によってテンサイ黒根病抵抗性品種の選抜を行うテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方 法。
[12] Beta属の細胞から DNAを抽出する DNA抽出工程と、
AFLP法に基づいて、
抽出した DNAを制限酵素で切断する DNA切断工程と、
前記 DNA切断工程で得られるゲノム DNA断片を铸型に、請求項 3及び 4に記載 のプライマーをペアとして核酸増幅を行う核酸増幅工程と、
前記核酸増幅工程で増幅された核酸中から請求項 7に記載の塩基配列を含むポリ ヌクレオチドを検出する検出工程と、
によってテンサイ黒根病抵抗性品種の選抜を行うテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方 法。
[13] Beta属の細胞から DNAを抽出する DNA抽出工程と、
AFLP法に基づいて、
抽出した DNAを制限酵素で切断する DNA切断工程と、
前記 DNA切断工程で得られるゲノム DNA断片を铸型に、請求項 3及び 5に記載 のプライマーをペアとして核酸増幅を行う核酸増幅工程と、
前記核酸増幅工程で増幅された核酸中から請求項 8に記載の塩基配列を含むポリ ヌクレオチドを検出する検出工程と、
によってテンサイ黒根病抵抗性品種の選抜を行うテンサイ黒根病抵抗性品種選抜方 法。
[14] 前記 Beta属は、テンサイである請求項 11から 13のいずれか一に記載のテンサイ 黒根病抵抗性品種選抜方法。
[15] 請求項 11から 13のいずれか一又は二以上に記載のテンサイ黒根病抵抗性品種 選抜方法を用いて選抜される Beta属のテンサイ黒根病抵抗性品種。
[16] 請求項 15に記載のテンサイ黒根病抵抗性品種を用いて、交配、又はクローユング により作製される Beta属のテンサイ黒根病抵抗性品種後代。 [17] 請求項 15に記載のテンサイ黒根病抵抗性品種を用いて、交配、又はクローユング により作製される Beta属のテンサイ黒根病抵抗性を有する種子。
[18] 請求項 15に記載のテンサイ黒根病抵抗性品種を用いて、交配、又はクローユング により Beta属のテンサイ黒根病抵抗性を有する種子及び Z又は Beta属のテンサイ 黒根病抵抗性品種後代を生産する方法。
[19] Beta属のゲノム DNAにおいて、請求項 6に記載の塩基配列を有する塩基配列座 及び、前記請求項 6に記載の塩基配列座とテンサイ黒根病抵抗性遺伝子の遺伝子 座との遺伝学的距離が約 2. 2cMであることと、を利用して当該テンサイ黒根病抵抗 性遺伝子を同定するテンサイ黒根病抵抗性遺伝子同定方法。
[20] Beta属のゲノム DNAにおいて、請求項 7に記載の塩基配列を有する塩基配列座 及び、前記請求項 7に記載の塩基配列座とテンサイ黒根病抵抗性遺伝子の遺伝子 座との遺伝学的距離が約 4. 3cMであることと、を利用して当該テンサイ黒根病抵抗 性遺伝子を同定するテンサイ黒根病抵抗性遺伝子同定方法。
[21] Beta属のゲノム DNAにおいて、請求項 8に記載の塩基配列を有する塩基配列座 及び、前記請求項 8に記載の塩基配列座とテンサイ黒根病抵抗性遺伝子の遺伝子 座との遺伝学的距離が約 4. 3cMであることと、を利用して当該テンサイ黒根病抵抗 性遺伝子を同定するテンサイ黒根病抵抗性遺伝子同定方法。
[22] 請求項 19から 21に記載のテンサイ黒根病抵抗性遺伝子同定方法のうち、いずれ か二以上を組み合わせて利用することで、テンサイ黒根病抵抗性遺伝子を同定する テンサイ黒根病抵抗性遺伝子同定方法。
[23] 前記 Beta属のゲノム DNAは、テンサイでは第 3染色体の DNAである請求項 19か ら 22のいずれか一に記載のテンサイ黒根病抵抗性遺伝子同定方法。
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