WO2007119515A1 - 新規腫瘍抗原ペプチド - Google Patents

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WO2007119515A1
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amino acid
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Noriyuki Sato
Toshihiko Torigoe
Yoshihiko Hirohashi
Kenji Harada
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Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a novel tumor antigen protein and tumor antigen peptide, and utilization of these substances in the field of cancer immunity.
  • Non-Patent Document 1 cytotoxic T cells that recognize their own cancer cells from melanoma
  • CTL cytotoxic T cells that recognize their own cancer cells from melanoma
  • CTL uses the T cell receptor (TCR) to recognize a complex between a peptide called a cancer antigen peptide and a major histocompatibility complex class I antigen (also called MHC class homogen, HLA antigen). By doing so, it became clear that they attacked their own cancer cells.
  • TCR T cell receptor
  • a cancer antigen peptide is produced by synthesizing a protein unique to cancer, that is, a cancer antigen protein, in a cell and then being degraded in the cell by a proteasome.
  • the produced cancer antigen peptide binds to MHC class I antigen (HLA antigen) in the endoplasmic reticulum to form a complex, which is transported to the cell surface and presented as an antigen.
  • HLA antigen MHC class I antigen
  • This antigen-presented complex is recognized by antigen-specific CTL and exhibits anticancer activity through cytotoxicity and lymphokine production.
  • T. Boon et al. First identified a protein named MAGE in 1991 and also identified human melanoma cell power (see Non-Patent Document 6). Then some Tumor antigen proteins have been identified mainly by melanoma cells.
  • Lengsin Glutamate—ammonia ligase (glutamine synthase) domain containing 1 (LU LD1) UniGene Hs.149585) has been identified as a novel gene that is highly expressed in human lenses, and its amino acid sequence similarity is also a family of glutamine synthetases. The possibility of belonging to is reported. However, the physiological function is unclear (see Non-Patent Document 7).
  • BJ-TSA-9 (Hypothetical protein MGC14128) (UniGene Hs. 379821) is a novel gene cloned by the Nationala 1 Institutes of Health Mammalian Gene Collection (MGC) Program. Its physiological function is unclear (see Non-Patent Document 8).
  • C20orf42 (or URP1, Kindlerin) is cloned as a gene highly expressed in lung cancer and colon cancer (see Non-Patent Document 9) and has high similarity to C. elegans UNC-112. It has been shown that it interacts with Integrin like U NC-112 and is induced to induce expression with TGF- (see Non-Patent Document 10). On the other hand, C20orf42 has been identified as a Kindlerin gene that is mutated in Kindler syndrome, a rare autosomal recessive dermatosis (see Non-Patent Documents 11 and 12).
  • BUB1 is a Serine / threonine Kinase molecule that acts as a spindle formation checkpoint in the M phase of the cell cycle. Abnormality in chromosome segregation occurs due to loss of BUB1 function. BUB1 also phosphorylates Cdc20 and suppresses the ubiquitin ligase activity of APC / Cede2Q , thereby preventing abnormal distribution of chromosomes (see Non-Patent Document 13). A decrease in expression or a change has been reported in cancer tissues (see Non-Patent Documents 14 and 15).
  • HIFPH3 egl nine homolog3, EGLN3
  • HIFl Hypoxia— indudble factorl
  • Non-Patent Document l Arch.Surg., 126: 200 (1990)
  • Non-Patent Document 2 Immunol. Today, 8: 385 (1987)
  • Non-Patent Document 3 J. Immunol., 138: 989 (1987)
  • Non-Patent Document 4 Int. J. Cancer, 52:52 (1992)
  • Non-Patent Document 5 J. Natl. Cancer. Inst., 86: 1159 (1994)
  • Non-Patent Document 6 Science, 254, 1643-1647 (1991)
  • Non-Patent Document 7 Mol. Vis. Jun. 15; 8: 185-95 (2002)
  • Non-Patent Document 8 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 99 (26): 16899-903 (2002)
  • Non-Patent Document 9 Biochim. Biophys. Acta 1637: 207-216 (2003)
  • Non-Patent Document 10 J. Biol. Chem., Feb 20; 279 (8): 6824-33 (2004)
  • Non-Patent Document ll Hum. Molec. Genet., 12: 925-935 (2003)
  • Non-Patent Document 12 Am. J. Hum. Genet., 73: 174-187 (2003)
  • Non-Patent Document 13 Mol. Cell, Nov 5; 16 (3): 387-97 (2004)
  • Non-Patent Document 14 Oncogene Jul ll; 21 (30): 4673-9 (2002)
  • Non-Patent Document 15 Leuk. Lymphoma. Feb; 43 (2): 385-91 (2002)
  • Non-patent document 16 Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Dec 24; 99 (26): 16899-903 (2002)
  • Non-patent document 17 Cell 107: 43-54 (2001)
  • An object of the present invention is to provide a novel tumor antigen protein and tumor antigen peptide, and uses of these substances in the field of cancer immunity.
  • these Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, C10orf3, HIFPH 3, and peptides derived therefrom are useful as cancer vaccines against various cancers in which expression of these factors (particularly increased expression) is observed. It is believed that there is.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • the present invention relates to
  • a pharmaceutical composition comprising the peptide according to any one of (1) to (6) above and a pharmaceutically acceptable carrier,
  • a pharmaceutical composition comprising the nucleic acid according to (8) and a pharmaceutically acceptable carrier,
  • a pharmaceutical composition comprising Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOoriB or HIFPH3 and a pharmaceutically acceptable carrier,
  • BJ-TSA-9 is a protein containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid comprising a polynucleotide encoding Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOoriB or HIFPH3, and a pharmaceutically acceptable carrier,
  • the polynucleotide encoding BJ-TSA-9 is a polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4: )
  • polynucleotide encoding C20orf42 is a polynucleotide containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
  • the polynucleotide encoding the BUB1 is a polynucleotide containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. )
  • polynucleotide encoding ClOoriB is a polynucleotide containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9 or a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10.
  • polynucleotide encoding HIFPH3 is a polynucleotide containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12.
  • a method for producing an antigen-presenting cell characterized in that any one of the above and a cell having antigen-presenting ability are contacted in vitro.
  • a pharmaceutical composition comprising the antigen-presenting cell according to (25) above and a pharmaceutically acceptable carrier,
  • a pharmaceutical composition comprising the CTL of (28) above and a pharmaceutically acceptable carrier,
  • HLA monomer HLA dimer, HLA tetramer or HLA pentamer containing the peptide according to any one of (1) to (5) above and an HLA antigen
  • a polynucleotide having at least 15 contiguous bases in the base sequence of Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOoriB gene or HIFPH3 gene and Z or complementary to the polynucleotide A disease marker for cancer diseases comprising a typical polynucleotide,
  • Disease markers for BJ-TSA-9 gene are leukemia, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, The disease marker according to (35) or (36), which is for small cell lung cancer, oral cancer, gastric cancer, spleen cancer or lymphoma,
  • the disease marker for the C20orf42 gene is for lung squamous cell carcinoma, lung adenocarcinoma, liver cancer, stomach cancer, leukemia, malignant lymphoma tissue, rectal cancer, colon cancer or spleen cancer, (35) or (36 ) Disease marker according to
  • (40) Disease markers for BUB1 gene are breast cancer, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, ovarian cancer, oral squamous cell carcinoma, kidney cancer, colon cancer (colon cancer, rectal cancer), stomach cancer, spleen cancer, liver cancer, white blood disease, is for lymphoma or melanoma, said (35) or (36) a disease Ma 1 ⁇ force according to ' ⁇
  • ClOoriB gene is a marker for breast cancer, colon cancer, rectal cancer, kidney cancer, gastric cancer, ovarian cancer, liver cancer, spleen cancer, lung squamous cell carcinoma, lung adenocarcinoma, small cell lung cancer or melanoma
  • the disease marker for HIFPH3 gene is for breast cancer, colon cancer, stomach cancer, kidney cancer, spleen cancer, liver cancer, lung adenocarcinoma or lung squamous cell carcinoma, as described in (35) or (36) above Disease markers,
  • a method for detecting a cancer disease comprising the following steps (a), (b) and (c):
  • step (c) The determination of the onset of the cancer disease in step (c) has increased the amount of binding to the disease marker as compared to the measurement result obtained for the normal subject with the measurement result obtained for the subject.
  • a disease marker for cancer diseases comprising an antibody that specifically recognizes Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOoriB or HIFPH3,
  • step (48) The determination of the onset of cancer disease in step (c) has increased the amount of binding to the disease marker as compared to the measurement result obtained for the normal subject with the measurement result obtained for the subject.
  • novel tumor antigen peptides of the present invention or nucleic acids encoding them can be used effectively as cancer vaccines.
  • the tumor antigen peptide can also be used effectively as a component such as an HLA tetramer for detecting CTL.
  • the proteins of the present invention are Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOorlS, and HIFPH3.
  • the protein Lengsin of the present invention contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence similar thereto.
  • the Lengsin of the present invention may be a protein derived from a natural product (for example, lung adenocarcinoma cell line 1-87) or may be a recombinant protein.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is a human Lengsin (Glutamate registered as Accession No. NM_016571, Accession No. NP_057655 in the GenBank database.
  • the human Lengsin is known from Non-Patent Document 7 (Mol. Vis. Jun. 15; 8: 185-95 (2002)).
  • the protein BJ-TSA-9 of the present invention contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence similar thereto.
  • BJ-TSA-9 of the present invention may be a protein derived from a natural product (for example, lung adenocarcinoma cell line 1-87) or a recombinant protein.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of human BJ-TSA-9 (Hypothetical protein MGC14128) registered as Accession No. NM_032899 and Accession No. NP_116288 in the GenBank database.
  • the human BJ-TSA-9 is known from Non-Patent Document 8 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99 (26): 16899-903 (2002).
  • the protein C20orf42 of the present invention contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence similar thereto.
  • C20orf42 of the present invention may be a protein derived from a natural product (for example, colon cancer cell line SW480) or a recombinant protein.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6 is the amino acid sequence of human C20orf42 (also referred to as URP1, Kindlerin) registered as Accession No. NM_017671, Accession No. NP_060141 in the GenBank database.
  • the human C20orf42 is known from Non-Patent Document 9 (Biochim. Biophys. Acta 1637: 207-216 (2003).
  • the protein BUB1 of the present invention contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence similar thereto.
  • BUB1 of the present invention may be a protein derived from a natural product (for example, spleen cancer cell line PUN) or may be a recombinant protein.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8 is the amino acid sequence of human BUB1 registered as Accession N 0. NM_004336 and Accession No. NP_004327 in the GenBank database.
  • the human BUB1 is known from the literature (Genomics 46: 379-388 (1997)).
  • the protein ClOoriB of the present invention contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or an amino acid sequence similar thereto.
  • ClOoriB of the present invention may be a protein derived from a natural product (for example, lung adenocarcinoma cell line 1-87) or may be a recombinant protein.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence of human ClOoriB registered as Accession No. NM_018131 and Accession No. NP_060601 in the GenBank database. No acid sequence.
  • the human ClOoriB is known from Non-Patent Document 16 (Proc. Natl. Acad. Sci. US A., Dec 24; 99 (26): 16899-903 (2002).
  • the protein HIFPH3 of the present invention contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 or an amino acid sequence similar thereto.
  • HIFPH3 of the present invention may be a protein derived from a natural product (eg, renal cancer cell line SMKTR-1) or a recombinant protein.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 12 is the amino acid sequence of human HIFPH3 (also referred to as egl nine homolog3, EGLN3) registered as Accession No. NM_022073 and Accession No. NP_071356 in the GenBank database.
  • the human HIFPH3 is known from Non-Patent Document 17 (Cell 107: 43-54 (2001)).
  • Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOorlS, and HIFPH3 shown above may be referred to as "the protein of the present invention”.
  • the protein containing the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 or 12 specifically refers to SEQ ID NO: 2, 4, 6,
  • a protein having an amino acid sequence with the added amino acid sequence can also be mentioned.
  • the “other amino acid sequence” may be an amino acid sequence of a structural gene other than the protein of the present invention.
  • a protein containing an amino acid sequence similar to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, or 12 specifically refers to the following (a) to (The proteins listed in c) are:
  • a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, or 12, and the protein is a tumor antigen protein A protein having quality activity,
  • a protein comprising an amino acid sequence similar to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, or 12 can be mentioned.
  • Examples of the protein consisting of an amino acid sequence similar to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, or 12 include the following proteins (a ′) to (:
  • a protein having an activity as a tumor antigen protein is provided.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 or 12 is an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and Z or added.
  • “Contained protein” means a so-called modified protein produced artificially, or a protein such as an allelic variant present in vivo.
  • the number of amino acid mutations and mutation sites in the protein are not limited as long as the activity of the protein of the present invention is maintained.
  • indicators that determine how many amino acid residues need to be deleted, substituted and Z or added without loss of activity are computer programs well known to those skilled in the art, such as DNA Star. can be found using software.
  • the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids.
  • the amino acid to be substituted should be an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution, such as residue polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and amphiphilicity. preferable.
  • Ala, Val, Leu, lie , Pro, Met, Phe, and Trp are amino acids that are classified as nonpolar amino acids, and Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, and Gin are amino acids that are classified as uncharged amino acids.
  • Asp and Glu are amino acids that are classified as acidic amino acids, and Lys, Arg, and His are amino acids that are classified as basic amino acids. Therefore, amino acids belonging to the same group can be appropriately selected using these as indices.
  • the "protein containing an amino acid sequence showing 70% or more sequence identity with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, or 12" in (b) is, for example, a sequence Number: 2, 4, 6, 8, 10 or 12 and the sequence of about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more.
  • proteins containing amino acid sequences that exhibit identity Specifically, a protein having a partial sequence ability of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 or 12 can be mentioned.
  • sequence identity refers to sequence identity and homology between two proteins.
  • sequence identity is determined by comparing two sequences that are optimally aligned over the region of the sequence to be compared.
  • the protein to be compared may have an addition or a deletion (for example, a gap) in the optimal alignment of the two sequences.
  • sequence identity is calculated, for example, by creating an alignment using the ClustalW algorithm (Nucleic Acid Res., 22 (22): 4673-4680 (1994)) using Vector NTI. can do.
  • Sequence identity is measured using sequence analysis software, specifically Vector NTI, GENETYX-MAC and analysis tools provided by public databases. The public database is generally available at, for example, a homepage address http: ⁇ www.ddbj.nig.ac.jp!
  • a polynucleotide that is hybridized under stringent conditions with respect to a complementary strand of a polynucleotide that encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, or 12 in (c) above ⁇ Is for example, about 40% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or less with a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, or 12.
  • a polynucleotide containing a base sequence having a sequence identity of about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is more preferable.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, or 11 and about 40% or more preferably A polynucleotide containing a nucleotide sequence having a sequence identity of about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • a polynucleotide comprising a partial sequence of the base sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 or 11 can be mentioned.
  • Hybridization can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, Molecular, loning, 2nd Edt. And old Spring Harbor Laboratory Press (1989). . When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • “stringent conditions” refer to Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) and ij i Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory As taught by Press (1989), it can be determined based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid to which the complex or probe is bound.
  • Hybridization conditions include, for example, 6 X SSC (20 X SSC indicates 333 mM Sodium citrate, 333 mM NaCl), 42 ° C in a solution containing 0.5% SDS and 50% formamide. And hybridization conditions at 65 ° C in a solution containing 6 X SSC (without 50% formamide! /).
  • the conditions of about “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” can be mentioned.
  • the complementary strand is preferably one that maintains the target positive strand and the hybridized state even when washed under strong conditions.
  • cleaning conditions such as “0.5 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C” are given as stricter hybridization conditions, and “0.1 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C” are given as stricter hybridization conditions. be able to.
  • the protein of the present invention has activity as a tumor antigen protein.
  • activity as a tumor antigen protein means showing activity by an existing assay method for tumor antigen protein.
  • CTL cells expressing Lengsin, BJ-TSA-9, C20 orf42, BUB1, ClOoriB or HIFPH3 are recognized by CTL, that is, the cells are reactive to CTL, in other words The protein of the present invention or the It exhibits the property that an antigenic peptide derived from a protein activates or induces CTL.
  • the cell is a cell that expresses an HLA antigen. Therefore, more specifically, the activity as the tumor antigen protein is more specifically expressed by expressing the protein of the present invention in a cell that expresses an HLA antigen such as HLA-A24 or HLA-A2.
  • an HLA antigen such as HLA-A24 or HLA-A2.
  • an expression vector containing a DNA encoding the protein of the present invention and an expression vector containing a DNA encoding an HLA antigen are transferred to a host cell such as a 293-EBNA cell (Invitrogen). FEETATE.
  • a host cell such as a 293-EBNA cell (Invitrogen). FEETATE.
  • the DNA encoding the HLA antigen used here include DNA encoding the HLA-A24 antigen or DNA encoding the HLA-A2 antigen.
  • Examples of the DNA encoding HLA-A24 antigen include HLA-A2402 cDNA (Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995), Genbank Accession No. M64740).
  • HLA-A0201 cDNA GenBank Acc. No. M84379) can be mentioned.
  • the transfectate can be performed, for example, by a lipofectin method using a lipofectamine reagent (GIBCO BRL).
  • restrictive CTL is added to the used HLA antigen and allowed to act, and the amount of various cytodynamic ins produced by reaction (activation) of the CTL, such as IFN- ⁇ , is measured by, for example, ELISA.
  • CTL CTL prepared by stimulating human peripheral blood lymphocytes with the protein of the present invention, Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N. Eng. J. Med, CTL established by the method described in 333, 1038-1044, 1 995, etc. can be used.
  • the protein of the present invention is, for example, an assembly using a human model animal (WO 02/47474). Int J. Cancer: 100,565-570 (2002)), the in vivo CTL-inducing activity can be examined.
  • the protein of the present invention can be produced from a natural product (such as various cancer cell lines) by a known protein purification method. Further, it can be produced by culturing a transformant containing a nucleic acid containing a polynucleotide encoding the protein of the present invention described later.
  • the peptide of the present invention is a tumor antigen peptide containing a partial peptide derived from Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOoriB or HIF PH3 and recognized by CTL by binding to HLA antigen (
  • the peptide of the present invention or “the tumor antigen peptide of the present invention”.
  • the protein of the present invention is a peptide containing a part of the amino acid sequence of the protein of the present invention described above and a peptide in which the binding complex between the peptide and the HLA antigen is recognized by CTL. It may contain a peptide of any length at any position in the amino acid sequence.
  • Such a peptide of the present invention is synthesized, for example, by synthesizing a candidate peptide consisting of a part of Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, CIO orfi or HIFPH3 and combining the candidate peptide with an HLA antigen. It can be identified by assessing whether the body is recognized by CTL, that is, whether the candidate peptide has activity as a tumor antigen peptide.
  • peptide synthesis can be carried out in accordance with a method used in ordinary peptide chemistry.
  • regularity motif
  • the second amino acid of a peptide consisting of 8 to 11 amino acids is tyrosine, phenylalanine, methionine or tryptophan, and the C-terminal amino acid is phenolan, leucine, It is known to be isoleucine, tryptophan or methionine (J. Immunol., 152, p3913, 1994, Immunogenetics, 41: pl78, 1995, J. Immunol., 155: p4307, 1994).
  • the motif of HLA-A2 the motifs shown in Table 1 below are known (Immunogenetics, 41, pl78, 1995, J. Immunol., 155: p4749, 1995).
  • peptide sequences predicted to be capable of binding to HLA antigens can be searched on the Internet by using NIH's BIMAS software (http: ⁇ bimas.dcrt.ni h.gov/ molbio / hla_bind /).
  • the length of the peptide is usually about 8 to 14 amino acids by analysis of antigen peptides bound to various HLA molecules (Immunogenetics, 41: 178, 1995) (however, HLA-DR As for, -DP and -DQ, antigen peptides longer than 14 amino acids are also observed).
  • a sequence expected to be able to bind to an HLA antigen can be easily selected by searching with the BIMAS software.
  • the selected candidate peptide is synthesized by the method described above, and whether the candidate peptide binds to the HLA antigen and is recognized by CTL, that is, whether the candidate peptide has activity as a tumor antigen peptide. By measuring whether or not, the peptide of the present invention can be identified.
  • Specific examples of the method for identifying the tumor antigen peptide of the present invention include the method described in J. Immunol., 154, p2 257, 1995.
  • the HLA pulsed with the candidate peptide When CTLs that specifically recognize antigen-positive cells are induced, it indicates that the candidate peptide can be a tumor antigen peptide.
  • the presence or absence of CTL induction is examined, for example, by measuring the amount of various cytodynamic ins (for example, IFN- ⁇ ) produced by CTL in response to antigen peptide-presenting cells by, for example, ELISA. Can do. It can also be examined by a method of measuring CTL toxicity to 51 Cr-labeled antigen peptide-presenting cells ( 51 Cr Release Atsey, IntJCancer, 58: p317,1994).
  • an expression plasmid expressing cDNA encoding a type of HLA antigen that is supposed to present a candidate peptide is pulsed against the cell into which, for example, a 293-EBNA cell (Invitrogen) has been introduced.
  • This cell is allowed to react with a restricted CTL to the type of HLA antigen that is supposed to present the candidate peptide, and the amount of various cytodynamic ins (for example, IFN- ⁇ ) produced by the CTL is determined. It can also be examined by measuring (J. Exp. Med., 187: 277, 1998).
  • examples of the HLA antigen include HLA-A24 antigen and HLA-A2 antigen.
  • the cDNA encoding the HLA antigen is HLA-A2402 cDNA (Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995), Genbank Accession No. M64740) can be used.
  • HLA-A2-restricted tumor antigen peptide is selected, HLA-A0201 cDNA (GenBank Acc. No. M84379) can be used as the cDNA encoding the HLA antigen.
  • the peptide of the present invention can be examined for in vivo activity by, for example, subjecting it to Atsey (WO 02/47474, Int J. Cancer: 100,565-570 (2002)) using a human model animal. Can do.
  • the regularity (motif) of the sequence of the tumor antigen peptide is found as described above, for example, when the motif of the peptide is not clear, such as HLA-B55 and HLA-A26.
  • the tumor antigen peptide of the present invention can be identified according to the method described in, for example, W097 / 46676. it can.
  • Specific examples of the peptide of the present invention as described above include Lengsin consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, BJ-TSA-9 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: : C20orf42 consisting of the amino acid sequence described in 6; BUB1 capable of amino acid sequencing described in SEQ ID NO: 8; C10orf3 consisting of the amino acid sequencing capability described in SEQ ID NO: 10; or consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 12.
  • the peptide of the present invention that binds to the HLA-A24 antigen or the HLA-A2 antigen can be exemplified.
  • the length of the peptide is preferably 8 to 14 amino acids, more preferably 8 to 11 amino acids.
  • a peptide containing the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 13 to 201 and binding to HLA antigen and recognized by CTL can be mentioned.
  • the length of the peptide is preferably 9 to 14 amino acids, more preferably 9 to 11 amino acids.
  • HLA-A24-binding tumor antigen peptide SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 42 to SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59 to SEQ ID NO: 78, sequence SEQ ID NO: 89 to SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 158 to SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 176 to SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 195 to SEQ ID NO: 201
  • CTL CTL
  • the peptide which consists of an amino acid sequence of sequence number: 158,22,23,26,27,198,200,201,177,178,179,183 is mentioned.
  • HLA-A2-binding tumor antigen peptides SEQ ID NO: 32 to SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 50 to SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 79 to SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 118 to SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 166 to SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 184 to SEQ ID NO: 194, a peptide having an amino acid sequence ability, which binds to HLA-A2 antigen And peptides recognized by CTL (Tables 6, 8, 10, 12, 14, 16 described later).
  • the amino acid sequence of Lengsin, BJ-TSA-9, C 20orf42, BUB1, ClOoriB or HIFPH3 of the present invention more specifically, described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 or 12
  • modification of an amino acid residue means substitution, deletion, and Z or addition of an amino acid residue (including addition of an amino acid to the N-terminus and C-terminus of a peptide), preferably May include substitution of amino acid residues.
  • the number and position of amino acid residues to be substituted are arbitrary as long as the activity as a tumor antigen peptide is maintained. Since the length is about 8 to 14 amino acids, the range of one to several is preferable.
  • the length of the modified peptide of the present invention is preferably about 8 to 14 amino acids (however, HLA-DR, -DP, -DQ may have a length of 14 amino acids or more).
  • peptide sequences that are expected to be able to bind to the HLA antigen can be searched on the Internet (http: ⁇ bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/) 0 Based on this, it is possible to produce the modified peptide is there.
  • the antigen peptide motif that is displayed by binding to HLA-A24 is that the second amino acid of the peptide consisting of 8 to 11 amino acids is tyrosine, ferrolanine, or methionine.
  • tryptophan and the C-terminal amino acid is known to be ferulanine, leucine, isoleucine, tryptophan or methionine (J. Im munol, 152: p3913,1994, Immunogenetics, 41: pl78,1995, J .Immunol., 155: p4307,199 4).
  • the second amino acid force of the peptide consisting of 8 to 11 amino acids is icine, methionine, parin, isoleucine or glutamine, and the C-terminal amino acid force is S-parin or leucine.
  • peptide sequences that are expected to be able to bind to HLA antigens are shown on the Internet (http: ⁇ bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/). For example, properties similar to the amino acids that can be taken on the motif Amino acids with are acceptable.
  • amino acids at positions where substitution of amino acids on these motifs can be performed (in the HLA-A24 and HLA-A2 positions 2 and C of the peptide) can be combined with other amino acids (preferably via the Internet etc.).
  • a modified peptide having an activity when it binds to an HLA antigen and is recognized by CTL can be performed (in the HLA-A24 and HLA-A2 positions 2 and C of the peptide) can be combined with other amino acids (preferably via the Internet etc.).
  • a modified peptide having an amino acid sequence substituted with any of the amino acid residues known on the motif at the position, and having activity as a tumor antigen peptide . That is, SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 42 to SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59 to SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 89 to SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 158 to SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 176 to SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 195 to HLA-A24-binding peptide as shown in SEQ ID NO: 201, the second amino acid is tyrosine, ferulanine, A peptide containing an amino acid sequence substituted with methionine or tryptophan and / or C-terminal amino acid substituted with phenylalanin, leucine, isoleucine, tryptophan or methion
  • peptides in which the second amino acid is substituted with tyrosine are more preferred.
  • amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 158, 22, 23, 26, 27, 19 8, 200, 201, 177, 178, 179, and 183 is subjected to the above substitution, and is recognized by CTL by binding to the HLA-A24 antigen.
  • Peptides that can be used are preferably used.
  • the second amino acid in the amino acid sequence is leucine, methionine, norin, isoleucine or glutamine.
  • a peptide that contains an amino acid sequence in which the C-terminal amino acid is replaced with palin or leucine and is recognized by CTL by binding to the HLA-A2 antigen is a peptide that contains an amino acid sequence in which the C-terminal amino acid is replaced with palin or leucine and is recognized by CTL by binding to the HLA-A2 antigen.
  • the peptide of the present invention further includes an epitope peptide containing the tumor antigen peptide of the present invention.
  • helper epitope refers to a peptide having an action of activating CD4 positive T cells (Immunity., 1: 751, 1994).
  • CD4 positive T cells HBVcl28-140 derived from hepatitis B virus and tetanus TT947-967 derived from toxins is known.
  • helper epitope Activated by the helper epitope
  • a peptide in which such a helper epitope and a CTL epitope are arranged for example, Journal of Immunology 1999, 162: 3915-3925 includes 6 types of HLA-A2 restricted antigen peptides, HLA- It is described that DNAs (minigenes) encoding peptides composed of three types of A11-restricted antigen peptides and helper epitopes were effectively induced to induce CTLs against the respective epitopes in vivo.
  • CTL epitope tumor antigen peptide with 280 to 288 position of melanoma antigen gplOO
  • helper epitope T helper epitope derived from tetanus toxin
  • a peptide (epeptope peptide) obtained by linking a plurality of epitopes containing the tumor antigen peptide of the present invention and having a CTL inducing activity is also exemplified as a specific example of the peptide of the present invention. Can do.
  • the epitope peptide is (1) a peptide in which a plurality of CTL epitopes (tumor antigen peptides) are linked, or (2) a peptide in which a CTL epitope is linked to a helper epitope.
  • the epitope to be linked to the peptide of the present invention is a CTL epitope
  • the CTL epitope used is Lengsin represented by SEQ ID NO: 2, BJ-TSA-9 represented by SEQ ID NO: 4, HLA-A1 derived from the amino acid sequence of C20orf42 represented by SEQ ID NO: 6, BUB1 represented by SEQ ID NO: 8, C10orfi represented by SEQ ID NO: 10, or HIFPH3 represented by SEQ ID NO: 12.
  • CTL epitopes are CTL epitopes derived from other tumor antigen proteins. A plurality of these CTL epitopes can be linked. The length of one CT epitope is determined by analysis of antigen peptides bound to various HLA molecules (Immunogenetics, 41: 178, 1995), 8 About 14 amino acids can be mentioned.
  • the helper epitope used includes HBVcl28-140 derived from hepatitis B virus as described above, TT947-967 derived from tetanus toxin, and the like. Can be mentioned.
  • the length of the helper epitope is about 13 to 30 amino acids, preferably about 13 to 17 amino acids.
  • a peptide in which such a plurality of epitopes are linked can be produced by a general peptide synthesis method as described above. Further, based on the sequence information of a polynucleotide encoding an epitope peptide obtained by linking a plurality of these epitopes, it can also be produced using ordinary DNA synthesis and genetic engineering techniques. That is, the polynucleotide is inserted into a well-known expression vector, a transformant prepared by transforming a host cell with the obtained recombinant expression vector is cultured, and a plurality of target epitopes are ligated from the culture. It can be produced by collecting the epitope peptide. These methods can be performed according to the methods described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al.'CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985), as described above. it can.
  • An epitope peptide obtained by linking a plurality of epitopes produced as described above can be obtained by using the in vitro assay described above and the human described in WO 02/47474 and Int J. Cancer: 100,565-570 (2002).
  • CTL-inducing activity can be measured, for example, by subjecting it to an in vivo assay using a model animal.
  • amino group of the N-terminal amino acid or the carboxyl group of the C-terminal amino acid of the tumor antigen peptide of the present invention can be modified, and the peptide related to such modification is also a peptide of the present invention. Included in the category.
  • Examples of the modifying group for the amino group of the N-terminal amino acid include an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms having 1 to 6 carbon atoms, a full group, a cycloalkyl group, and an acyl group.
  • Specific examples of the acyl group include Is an alkanoyl group having 1 to 6 carbon atoms, a alkanol group having 1 to 6 carbon atoms substituted with a full group, a carbo group group substituted with a cycloalkyl group having 5 to 7 carbon atoms, or 1 to 6 carbon atoms.
  • Examples of the peptide in which the carboxyl group of the C-terminal amino acid is modified include an ester form and an amide form.
  • Specific examples of the ester form include an alkyl ester having 1 to 6 carbon atoms and a carbon group substituted with a phenyl group. Examples thereof include alkyl esters having 0 to 6 carbon atoms, cycloalkyl esters having 5 to 7 carbon atoms, etc.
  • amides are amides, substituted with one or two alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms Amides substituted with one or two carbon atoms with 0 to 6 carbon atoms substituted with amides or phenyl groups, forming 5- to 7-membered azacycloalkanes containing nitrogen atoms of amide groups Amides and the like.
  • nucleic acid of the present invention includes
  • nucleic acid containing a polynucleotide encoding Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOoriB or HIFPH3,
  • Polynucleotides encoding Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOoriB, or HIFPH3 can be used for cDNAs, mRNAs, cRNAs, genomic DNAs of various cells and tissues such as cells and tissues derived from prostate cancer, etc. Any of synthetic DNA may be used. Further, it may be either single-stranded or double-stranded. In particular,
  • polynucleotide containing a base sequence similar to the polynucleotide (a) or (b) is exemplified.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 1 is the base sequence of the human Lengsin gene registered as Accession No. NM_016571 in the GenBank database.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of human Lengsin registered as Accession N 0. NM_016571 and Accession No. NP_057655 in the GenBank database.
  • the human Lengsin gene is known from Non-Patent Document 7 (Mol. Vis. Jun. 15; 8: 185-95 (200 2)).
  • nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 is Accession in GenBank database.
  • nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5 is Accession in the GenBank database.
  • nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 is Accession in the GenBank database.
  • nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9 is Accession in GenBank database.
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11 is the Accessio in GenBank database. n No. The base sequence of the human HIFPH3 gene registered as NM_022073.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 12 is the amino acid sequence of human HIFPH3 registered as Accession No. NM_022073 and Accession No. NP_071356 in the GenBank database.
  • the human HIFPH3 gene is known from Non-Patent Document 17 (Cell 107: 43-54 (2001)).
  • SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12 More specifically, the polynucleotide containing the base sequence encoding the amino acid sequence described in is a polynucleotide comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, or a sequence Examples include polynucleotides consisting of nucleotide sequences encoding the amino acid sequences described in Nos. 2, 4, 6, 8, 10, and 12.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 or the base sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 Examples include a polynucleotide comprising a base sequence to which another base sequence is added on the 5 ′ end side and / or the 3 ′ end side.
  • the “other base sequence” may be a base sequence encoding a structural gene other than, for example, Leng sin ⁇ BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, C10orf3, and HIFPH3.
  • any of these polynucleotides encoding Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOoriB or HIFPH3 may be used as long as they have activity as a protein-force tumor antigen protein encoded by the polynucleotide.
  • the activity and the measuring method thereof are as described in “1) Protein of the present invention”.
  • polynucleotide containing the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 is disclosed in the nucleotide sequence disclosed in GenBank Accession No. NM_016571 or SEQ ID NO: 1 in the sequence listing of the present specification. Cloning, for example, by screening a cDNA library derived from a lung adenocarcinoma cell line (for example, 1-87) using an appropriate part of the nucleotide sequence as a hybridization probe or PCR primer Can do.
  • polynucleotide containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 is disclosed in GenBank Accession No. NM_032899 or the nucleotide sequence disclosed in SEQ ID NO: 3 in this specification.
  • a hybridization probe or PCR primer for example, derived from a lung adenocarcinoma cell line (eg 1-87) Cloning can be performed by screening a cDNA library.
  • polynucleotide containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5 is disclosed in GenBank Accession No. NM_017671, or disclosed in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing in this specification.
  • polynucleotide containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 is disclosed in GenBank Accession No. NM_004336, or disclosed in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing of the present specification. Cloning can be performed, for example, by screening a cDNA library derived from a spleen cancer cell line (eg, PUN) using an appropriate portion of the nucleotide sequence as a hybridization probe or PCR primer.
  • a cDNA library derived from a spleen cancer cell line eg, PUN
  • polynucleotide containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9 is disclosed in GenBank Accession No. NM_018131, or disclosed in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing in this specification. Cloning by screening a cDNA library derived from a lung adenocarcinoma cell line (for example, 1-87) using an appropriate part of the nucleotide sequence as a hybridization probe or PCR primer, for example. Can do.
  • polynucleotide containing the base sequence described in SEQ ID NO: 11 is disclosed in the base sequence disclosed in GenBank Accession No. NM_022073 or SEQ ID NO: 11 in the sequence listing of the present specification!
  • Cloning is performed by screening a cDNA library derived from a renal cancer cell line (for example, SMKTR-1) using an appropriate part of the nucleotide sequence as a hybridization probe or PCR primer, for example. be able to.
  • polynucleotide containing a base sequence similar to the polynucleotide (a) or (b) is specifically,
  • a polynucleotide that hybridizes and the protein encoded by the polynucleotide has an activity as a tumor antigen protein
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence showing 70% or more sequence identity with the polynucleotide of (a) or (b), and the protein encoded by the polynucleotide is a tumor antigen.
  • a polynucleotide having a nucleotide sequence similar to that of the polynucleotide (a) or (b) is used.
  • the polynucleotide having the same base sequence ability as the polynucleotide (a) or (b) include the following polynucleotides (c ′) to (e ′): (c ′) (a ) Or (b) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the polynucleotide, and the polynucleotide encoded by the polynucleotide has activity as a tumor antigen protein, (d ')
  • polynucleotide hybridizing under stringent conditions to the complementary strand of the polynucleotide of (a) or (b) refers to, for example, the above (a) or (b) About 40% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more. And a polynucleotide containing a base sequence having the same sequence identity. Ingredients Specifically, a polynucleotide comprising a partial sequence of the polynucleotide (a) or (b) is exemplified.
  • Hybridization can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, eg, Molecular, loning 2nd Edt. And Old Spring Harbor Laboratory Press (1989). . When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • “stringent conditions” refer to Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) and ij i Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory As taught by Press (1989), it can be determined based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid to which the complex or probe is bound.
  • Hybridization conditions include, for example, 6 X SSC (20 X SSC represents 333 mM Sodium citrate, 333 mM NaCl), 42 ° C in a solution containing 0.5% SDS and 50% formamide. And hybridization conditions at 65 ° C in a solution containing 6 X SSC (without 50% formamide! /).
  • the conditions of about “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” can be mentioned.
  • the complementary strand is preferably one that maintains the target positive strand and the hybridized state even when washed under strong conditions.
  • cleaning conditions such as “0.5 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C” are given as stricter hybridization conditions, and “0.1 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C” are given as stricter hybridization conditions. be able to.
  • polynucleotide containing a base sequence showing 70% or more sequence identity with the polynucleotide (a) or (b) is, for example, the above (a) or (b ) Polynucleotide sequence comprising about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. Chido is mentioned. Specific examples include a polynucleotide comprising a partial sequence of the polynucleotide (a) or (b).
  • sequence identity means sequence identity and homology between two polynucleotides.
  • sequence identity is determined by comparing two sequences that are optimally aligned over the region of the sequence to be compared.
  • the polynucleotide to be compared may have an addition or a deletion (for example, a gap) in the optimal alignment of the two sequences.
  • sequence identity can be calculated, for example, by creating an alignment using the ClustalW algorithm (Nucleic Acid Res., 22 (22): 4673-4680 (1994)) using Vector NTI.
  • Sequence identity is measured using sequence analysis software, specifically Vector NTI, GENETYX-MAC, and analysis tools provided by public databases, such as the home page. The address http: ⁇ www.ddbj.nig.a jp! / Is generally available.
  • a polynucleotide having such sequence identity is prepared by the above-described hybridization reaction by a normal PCR reaction or by a polynucleotide modification (deletion, addition, substitution) reaction described later. can do.
  • a protein containing an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are deleted, substituted and Z or added to the protein encoded by the polynucleotide of (a) or (b) refers to a nucleic acid encoding a so-called modified protein or a protein such as an allelic variant present in a living body.
  • the number of amino acid mutations and mutation sites in the protein are not limited as long as the activity of the protein of the present invention is maintained.
  • indicators that determine how many amino acid residues need to be deleted, substituted and Z or added without loss of activity are computer programs well known to those skilled in the art, such as DNA Star. can be found using software.
  • the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids.
  • the amino acid to be substituted should be an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution, such as residue polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and amphiphilicity. preferable.
  • Ala, Val, Leu, lie, Pro, Met, Phe and Trp are amino acids classified as non-polar amino acids, and Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn and Gin are non-charged amino acids.
  • Asp and Glu are amino acids that are classified as acidic amino acids, and Lys, Arg, and His are amino acids that are classified as basic amino acids. Therefore, using these as indicators Amino acids belonging to the same group can be appropriately selected.
  • polynucleotide encoding this modified protein is, for example, Molecular Cloning 2nd
  • the protein encoded by the polynucleotide has activity as a tumor antigen protein.
  • activity as a tumor antigen protein means showing activity by an existing method for measuring the activity of a tumor antigen protein.
  • a cell expressing a polynucleotide encoding the protein of the present invention is recognized by CTL, that is, the cell is reactive with CTL, in other words, the protein of the present invention or an antigen derived therefrom.
  • CTL a cell expressing a polynucleotide encoding the protein of the present invention
  • CTL that is, the cell is reactive with CTL, in other words, the protein of the present invention or an antigen derived therefrom.
  • a peptide activates or induces CTLs, it exhibits properties.
  • the activity and its measuring method are as described in “1) Protein of the present invention”.
  • the nucleic acid containing the polynucleotide of the present invention can take either a single-stranded or double-stranded form. It can be in either DNA or RNA form.
  • a recombinant expression vector for expressing the protein of the present invention can be prepared by inserting the polynucleotide of the present invention into an expression vector. That is, the category of the nucleic acid of the present invention includes a recombinant expression vector prepared by inserting the double-stranded polynucleotide of the present invention into an expression vector.
  • the expression vector used here can be appropriately selected depending on the host to be used, the purpose and the like, and includes plasmids, phage vectors, virus vectors and the like.
  • examples of the vector include plasmid vectors such as pUC118, pUC119, pBR322, and pCR3, and phage vectors such as ⁇ and gtll.
  • vectors include pYES2 and pYEUra3.
  • pAcSGHisNT-A can be mentioned.
  • Plasmids such as pCEP4, pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc / RSV, pRc / CMV Examples include vectors, and viral vectors such as retrovirus vectors, adenovirus vectors, and adeno-associated virus vectors.
  • the vector may appropriately have factors such as a promoter capable of inducing expression, a gene encoding a signal sequence, a selection marker gene, and a terminator.
  • a sequence expressed as a fusion protein with thioredoxin, His tag, or GST may be added to facilitate isolation and purification.
  • a GST fusion protein vector such as pGEX4T
  • an appropriate promoter such as lac, tac, trc, tr p, CMV, or SV40 early promoter
  • a tag sequence such as Myc or His Vectors (such as pcDNA3.1 / Myc-His) and vectors that express fusion proteins with thioredoxin and His tags (pET32a) can be used.
  • a transformed cell containing the expression vector By transforming a host with the expression vector prepared above, a transformed cell containing the expression vector can be prepared.
  • Examples of the host used here include Escherichia coli, yeast, insect cells, and animal cells.
  • Examples of E. coli include E. coli K-12 strains HB101 strain, C600 strain, JM109 strain, DH5 ⁇ strain, AD494 (DE3) strain, and the like.
  • Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae.
  • Examples of animal cells include L929 cells, BALB / c3T3 cells, C127 cells, CHO cells, COS cells, Vero cells, Hela cells, and 293-EBNA cells. Insect cells include sl9.
  • a normal method suitable for the host cell may be used. Specific examples include a calcium phosphate method, a DEAE-dextran method, an electo-poration method, and a method using a lipid for gene transfer (Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL).
  • transformed cells into which the expression vector has been introduced into the host cells can be selected by culturing in a normal medium containing a selection marker.
  • the protein of the present invention can be produced by continuing to culture the transformed cells obtained as described above under suitable conditions.
  • the resulting protein can be further isolated and purified by general biochemical purification means.
  • a purification means salting out , Ion exchange chromatography, adsorption chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography and the like.
  • the protein of the present invention is expressed as a fusion protein with the aforementioned thioredoxin, His tag, GST or the like, it can be isolated and purified by a purification method utilizing the properties of these fusion protein and tag.
  • the category of the nucleic acid of the present invention includes a nucleic acid containing a polynucleotide encoding the peptide of the present invention.
  • the polynucleotide encoding the peptide of the present invention may be in the form of DNA or RNA. Further, it may be either single-stranded or double-stranded. These polynucleotides encoding the peptide of the present invention can be easily produced based on the amino acid sequence information of the peptide of the present invention and the sequence information of the DNA encoded thereby. Specifically, it can be produced by normal DNA synthesis or PCR amplification.
  • polynucleotide encoding the peptide of the present invention include a polynucleotide encoding the above-mentioned epitope peptide.
  • the nucleic acid containing the polynucleotide encoding the peptide of the present invention can take either a single-stranded or double-stranded form. It can be in either DNA or RNA form.
  • a recombinant expression vector for expressing the peptide of the present invention is prepared by inserting the polynucleotide of the present invention into an expression vector. Can do.
  • the expression vector, host cell, host cell transformation method and the like used here are the same as in (1) above.
  • An antigen-presenting cell can be prepared by contacting in vitro one of the above-described proteins, peptides and nucleic acids of the present invention and a cell having an antigen-presenting ability.
  • the present invention comprises in vitro contact of an isolated antigen-presenting cell derived from a tumor patient with any of the protein, peptide and nucleic acid of the present invention.
  • the present invention provides a method for producing an antigen-presenting cell, and an antigen-presenting cell produced by the production method.
  • the “cell having antigen-presenting ability” is not particularly limited as long as it is a cell that expresses on the cell surface the HLA antigen capable of presenting the peptide of the present invention. I prefer the rod-shaped cells to be high!
  • the substance added to prepare the antigen-presenting cell of the present invention from the cells having the antigen-presenting ability may be any of the protein, peptide and nucleic acid of the present invention.
  • the antigen-presenting cell of the present invention is obtained by isolating a cell having an antigen-presenting ability from a tumor patient, pulsing the cell with the protein or peptide of the present invention in vitro, and the HLA antigen and the present invention. It is obtained by presenting a complex with a peptide (Cancer Immunol. Immunother., 46:82, 1998, J. Immunol., 158, pl796, 1997, Cancer Res., 59, pll84, 1999).
  • rod-shaped cells for example, peripheral blood of tumor patients can also be isolated from lymphocytes by the Ficoll method, then non-adherent cells are removed, and adherent cells are cultured in the presence of GM-CSF and IL-4.
  • the antigen-presenting cells of the present invention can be prepared by inducing dendritic cells and culturing the rod-shaped cells with the protein or peptide of the present invention to perform nors.
  • the antigen-presenting cell of the present invention when the antigen-presenting cell of the present invention is prepared by introducing the nucleic acid of the present invention into a cell having the antigen-presenting ability, the nucleic acid may be in the form of RNA or in the form of RNA. Also good. Specifically, it can be performed with reference to Cancer Res., 56: p5672,1996 and J.Immunol., 161: p5607, 1998 for DNA, and J.Exp.Me for RNA. d., 184: p465, 1996 can be used as a reference.
  • the antigen-presenting cell of the present invention may be any antigen-presenting cell in which a complex of the peptide of the present invention and an HLA antigen is presented.
  • the antigen-presenting cell is isolated from, for example, a prostate cancer patient whose HLA type is HLA-A24, and the cell having the antigen-presenting ability is isolated from the cell, and SEQ ID NOs: 42, 43, 44, 45, 46, 47 , 49,59,60,61,62,6 3,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159,160,161,15,16,21, A peptide comprising the amino acid sequence described in 22,23,2 4,25,26,27,30,195, 197,198,199,200,201, 177,178,179 or 183 (preferably an amino acid described in SEQ ID NO: 158,22,23,26,27,198,200,201,177,178,179 or 183) The peptide consisting of the sequence) is pulsed in vitro, and the complex of HLA-A2 4 antigen and the peptide is presented.
  • CTL can be induced by contacting any of the proteins, peptides and nucleic acids of the present invention with peripheral blood lymphocytes in vitro.
  • the present invention relates to a method for inducing CTL characterized by bringing a peripheral blood lymphocyte derived from a tumor patient into contact with any one of the protein, peptide and nucleic acid of the present invention in vitro, And CTL induced by the method.
  • melanoma a therapeutic effect has been observed in adoptive immunotherapy in which the patient's own tumor-infiltrating T cells are cultured in large amounts outside the body and then returned to the patient (J. Natl. Cancer. , 86: 1159, 1994) o
  • mouse melanoma splenocytes were stimulated in vitro with the tumor antigen peptide TRP-2 to proliferate CTL specific for the tumor antigen peptide, and the CT L was transplanted into the melanoma. Inhibition of metastasis has been observed when administered to mice (J. Exp. Med., 185: 453, 1997).
  • CTLs used in adoptive immunotherapy are produced by isolating a patient's peripheral blood lymphocytes and stimulating them in vitro with the protein, peptide, or nucleic acid of the present invention (Journal of Experimental Medicine). 1999, 190: 1669).
  • the CTL of the present invention may be any single CT as long as it is derived by contacting any of the protein, peptide and nucleic acid of the present invention with peripheral blood lymphocytes in vitro. It can be an L clone or a CTL mixture (population) that can produce various types of clones.
  • CT L that specifically recognizes a complex of a peptide having the amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 158, 22, 23, 26, 27, 198, 200, 201, 177, 178, 179 or 183 and the HLA-A24 antigen is mentioned. I'll do it.
  • the protein, peptide, nucleic acid, antigen-presenting cell, and CTL of the present invention described above can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition by taking an appropriate form according to each substance.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as an CTL inducer, that is, as an active ingredient of a cancer vaccine. This will be specifically described below.
  • CTL inducer comprising the protein of the present invention as an active ingredient
  • the protein of the present invention (Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, C10orf3, HIFPH3) has an inducing action of CTL, it can be used as an active ingredient of a medicine (cancer vaccine) for treating or preventing tumors. it can. That is, the CTL inducer containing the protein of the present invention as an active ingredient can treat or prevent tumors.
  • the protein is administered to a tumor patient, it is taken up into antigen-presenting cells, and then the tumor antigen peptide produced by intracellular degradation binds to the HLA antigen to form a complex, which is then presented as an antigen.
  • CTLs that are presented on the cell surface and specific for this complex grow efficiently in the body and destroy tumor cells. As described above, treatment or prevention of a tumor is achieved.
  • the CTL inducer comprising the protein of the present invention as an active ingredient can be used for any tumor patient positive for Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOoriB or HIFPH3. .
  • a CTL inducer containing Lengsin as an active ingredient can be used for the prevention or treatment of cancer (tumor) such as lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma or gastric cancer.
  • cancer such as lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma or gastric cancer.
  • CTL inducers containing BJ-TSA-9 as active ingredients are leukemia, lung adenocarcinoma, and squamous cell carcinoma of the lung. It can be used for prevention or treatment of cancer (tumor) such as small cell lung cancer, oral cancer, stomach cancer, spleen cancer or lymphoma.
  • the CTL inducer containing C20orf42 as an active ingredient is a cancer (tumor) such as lung squamous cell carcinoma, lung adenocarcinoma, liver cancer, stomach cancer, leukemia, malignant lymphoma tissue, rectal cancer, colon cancer or spleen cancer Can be used for the prevention or treatment of.
  • a cancer tumor
  • lung squamous cell carcinoma such as lung squamous cell carcinoma, lung adenocarcinoma, liver cancer, stomach cancer, leukemia, malignant lymphoma tissue, rectal cancer, colon cancer or spleen cancer
  • lung squamous cell carcinoma such as lung squamous cell carcinoma, lung adenocarcinoma, liver cancer, stomach cancer, leukemia, malignant lymphoma tissue, rectal cancer, colon cancer or spleen cancer
  • lung squamous cell carcinoma such as lung squamous cell carcinoma, lung adenocarcinoma, liver cancer, stomach cancer, leukemia
  • CTL inducers containing BUB1 as active ingredients are breast cancer, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, ovarian cancer, oral squamous cell carcinoma, kidney cancer, colon cancer (colon cancer, rectal cancer), stomach cancer, spleen cancer, It can be used for the prevention or treatment of cancer (tumor) such as liver cancer, leukemia, lymphoma or melanoma.
  • CTL inducers containing ClOoriB as active ingredients are breast cancer, colon cancer, rectal cancer, kidney cancer, gastric cancer, ovarian cancer, liver cancer, spleen cancer, lung squamous cell carcinoma, lung adenocarcinoma, small cell lung cancer Or it can be used for prevention or treatment of cancer (tumor) such as melanoma.
  • CTL inducers containing HIFPH3 as an active ingredient are used to prevent or treat cancers (tumors) such as breast cancer, colon cancer, stomach cancer, kidney cancer, spleen cancer, liver cancer, lung adenocarcinoma or lung squamous cell carcinoma.
  • cancers tumors
  • the CTL inducer containing the protein of the present invention as an active ingredient is administered in a mixture with a pharmaceutically acceptable carrier, for example, an appropriate adjuvant, so that cellular immunity is effectively established, or Can be administered in combination.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, an appropriate adjuvant
  • the adjuvant those described in the literature (Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994) can be applied.
  • mineral gel such as aluminum hydroxide, lysolecithin
  • surfactant such as pull mouth nick polyol, polyanion, peptide, or oil
  • An emulsion emulsion preparation
  • ribosome preparations, particulate preparations bound to beads having a diameter of several meters, preparations combined with lipids, microsphere preparations, microcapsule preparations and the like are also conceivable.
  • the cell-derived component or derivative thereof specifically includes, for example, (1) dead bacteria, (2) cell wall skeleton derived from bacteria (abbreviated as Cell Wall Skeleton, CWS), (3 ) It is classified into specific components derived from bacterial cells or their derivatives.
  • bacteria killed Examples include streptococcal powder (for example, Pishibanil; Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.), killed bacteria suspension cocktail (for example, Broncasma Berna; Sanwa Chemical Research Laboratories), and killed bacteria of Mycobacterium tuberculosis.
  • CWS derived from bacteria As CWS derived from bacteria, CWS derived from Mycobacterium (for example, CWS of BCG strain Mycobacterium genus Mycobacterium), CWS derived from Nocardia (for example, CWS of Nocardia 'Nobra') Or CWS derived from Corynebacterium.
  • Mycobacterium for example, CWS of BCG strain Mycobacterium genus Mycobacterium
  • Nocardia for example, CWS of Nocardia 'Nobra'
  • Corynebacterium As CWS derived from bacteria, CWS derived from Mycobacterium (for example, CWS of BCG strain Mycobacterium genus Mycobacterium), CWS derived from Nocardia (for example, CWS of Nocardia 'Nobra') Or CWS derived from Corynebacterium.
  • Specific components derived from bacterial cells or derivatives thereof include, for example, polysaccharides derived from Mycobacterium tuberculosis that are polysaccharides derived from bacterial cells (for example, Answer; Zeria Shinyaku Kogyo Co., Ltd.) and basidiomycetes derived Polysaccharides (eg, lentinan; Ajinomoto, Krestin; Sankyo Co., Ltd., Basidiomycete Kawaratake), muramyl dipeptide (MDP) related compounds, lipopolysaccharide (LPS), lipid A related compounds (MPL), glycolipid trehalose dimyco Rate (TDM), bacterial DNA (for example, CpG oligonucleotide), or derivatives thereof.
  • polysaccharides derived from Mycobacterium tuberculosis that are polysaccharides derived from bacterial cells (for example, Answer; Zeria Shinyaku Kogyo Co., Ltd.) and basidiomycetes
  • site force in includes, for example, IFN- ⁇ , IL-12, GM-CSF, IL-2, IFN- ⁇ , IL-18, or IL-15. These site force ins may be natural products or genetically modified products. These site power ins can be obtained and used if they are already on the market.
  • a genetically modified product for example, based on each nucleotide sequence registered in a database such as GenBank, EMBL, or DDBJ, a desired gene is cloned by a conventional method and ligated to an appropriate expression vector. Expression can be produced by transforming host cells with the recombinant expression vector thus prepared.
  • plant-derived component or derivative thereof is a saponin-derived component such as aooQuil A (Accurate Chemical & Scientific orp), Q3 ⁇ 4-21 (Aquila Biopharmaceutical s inc.), Or glycyrrhizin (SIGMA-ALDRICH, etc.) Is mentioned.
  • a marine organism-derived component or a derivative thereof includes, for example, a sponge-derived saccharide (X-galatatosylceramide).
  • oil emulsions include, for example, water-in-oil (w / o) emulsion formulations, oil-in-water (o / w) emulsion formulations, and water-in-oil-in-water (w / o) formulations. / w) Emulsion formulation.
  • the water-in-oil (w / o) emulsion preparation takes a form in which an active ingredient is dispersed in a water dispersed phase.
  • the oil-in-water (o / w) emulsion formulation takes the form in which the active ingredient is dispersed in a water dispersion medium.
  • the water-in-oil-in-water (w / o / w) emulsion formulation takes the form in which the active ingredient is dispersed in the innermost water dispersion phase.
  • Such an emulsion preparation can be prepared with reference to, for example, JP-A-8-985 and JP-A-9-122476.
  • the ribosome preparation is a fine particle in which an active ingredient is encapsulated in a water phase or in a membrane with a lipid bilayer ribosome.
  • Major lipids for making ribosomes include phosphatidylcholine, sphingomyelin, etc., which contain dicetyl phosphate, phosphatidic acid, phosphatidylserine, etc. to charge the ribosome and stabilize it.
  • Examples of the ribosome preparation method include an ultrasonic method, an ethanol injection method, an ether injection method, a reverse phase evaporation method, and a French press extraction method.
  • the microsphere preparation is a fine particle having a homogeneous polymer matrix force and in which an active ingredient is dispersed in the matrix.
  • the matrix material include biodegradable polymers such as albumin, gelatin, chitin, chitosan, starch, polylactic acid, and polyalkylcyano acrylate.
  • known methods Eur. J. Pharm. Biopharm. 50: 129-146, 2000, Dev. Biol. Stand. 92: 63-78, 1998, Pharm. Biotechnol. 10: 1 -43, 1997) etc., and not particularly limited.
  • the microcapsule preparation is a fine particle having an active ingredient as a core substance and covered with a coating substance.
  • Coating materials used for the coating materials include carboxymethylenosenorose, senorelose acetate phthalate, ethinoresenololose, gelatin, gelatin 'gum arabic, nitrocellulose, polybulal alcohol, hydroxypropyl cell. Examples thereof include film-forming polymers such as loin.
  • Examples of the method for preparing the microcapsule preparation include a coacervation method and an interfacial polymerization method.
  • Examples of the administration method include intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration and the like.
  • the dosage of the protein of the present invention in the preparation can be adjusted as appropriate depending on the disease to be treated, the age of the patient, the body weight, etc. Usually 0.0001 mg to 1000 mg, preferably 0.001 mg to 100 mg, more preferably 0.01 mg -10 mg, preferably administered once every few days or months.
  • the peptide of the present invention has CTL-inducing activity. Induced CTLs can exert antitumor effects through cytotoxicity and lymphokine production. Therefore, the peptide of the present invention can be used as an active ingredient of a medicament (cancer vaccine) for treating or preventing tumors.
  • a CTL inducer containing the peptide of the present invention as an active ingredient is administered to a tumor patient, the peptide of the present invention is presented to the HLA antigen of the antigen-presenting cell, and the binding complex-specificity of the presented HLA antigen and the peptide is specific. CTL can proliferate and destroy tumor cells, thus treating or preventing the patient's tumor.
  • the CTL inducer comprising the peptide of the present invention as an active ingredient can be used for any tumor patient positive for the protein of the present invention. Specifically, for example, it can be used for the prevention or treatment of cancer (tumor) shown in 6)-(1) above.
  • the CTL inducer comprising the peptide of the present invention as an active ingredient may be a single CTL epitope (the peptide of the present invention) as an active ingredient, or other peptides (CTL epitopes or helpers). Epitope peptide linked to epitope) may be used as an active ingredient.
  • CTL epitopes or helpers peptides linked to epitope
  • the tumor antigen protein PSA-derived HLA-A2, -A3, -All, B53-restricted CTL epitope is linked to about 30mer epitope peptide force S, It is described that CTL specific for each CTL epitope was induced in vivo. It has also been shown that CTL is efficiently induced by an epitope peptide in which a CTL epitope and a helper epitope are linked.
  • Such an epic When administered in the form of a tope peptide, it is taken up into antigen-presenting cells, and then the individual antigen peptides generated by intracellular degradation bind to HLA antigens to form complexes, which are then CTLs specific to this complex that are presented at high density on the surface of the presenting cells grow efficiently in the body and destroy tumor cells. In this way, treatment or prevention of the tumor is achieved.
  • CTL inducer comprising the peptide of the present invention as an active ingredient
  • a tumor antigen peptide consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 201 is used.
  • Examples include CTL inducers as active ingredients.
  • Examples include CTL inducers.
  • a CTL inducer comprising, as an active ingredient, a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 158, 22, 23, 26, 27, 198, 200, 201, 177, 178, 179 or 183 is mentioned.
  • the CTL inducer comprising the peptide of the present invention as an active ingredient is administered in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, for example, an appropriate adjuvant, or used in combination so that cellular immunity can be effectively established. Can be administered.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, an appropriate adjuvant, or used in combination so that cellular immunity can be effectively established. Can be administered.
  • the adjuvant those described in the literature (Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994) and the like can be applied.
  • surfactant such as lysolecithin
  • pull mouth nick polyol polyanion
  • peptide or oil emulsion
  • ribosome preparations, particulate preparations bound to beads having a diameter of several meters, preparations combined with lipids, microsphere preparations, microcapsule preparations and the like are also conceivable.
  • these adjuvants see the section “6)-(1) CTL inducer comprising the protein of the present invention as an active ingredient”! ,.
  • Examples of the administration method include intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration and the like.
  • the dosage of the peptide of the present invention in the preparation depends on the disease to be treated, the age of the patient, the body weight Power that can be adjusted as appropriate, etc. Normally 0.0001 mg to 1000 mg, preferably O.OOlmg to 1000 mg, more preferably O.lmg to 10 mg, preferably administered once every few days or months. .
  • CTL inducer comprising nucleic acid of the present invention as an active ingredient
  • the nucleic acid of the present invention Since the nucleic acid of the present invention has a CTL-inducing action, it can be used as an active ingredient of a medicine (cancer vaccine) for treating or preventing tumors.
  • the CTL inducer containing the nucleic acid of the present invention as an active ingredient is capable of treating or preventing a tumor, for example, by administering and expressing the nucleic acid of the present invention to a tumor patient.
  • the tumor antigen protein is highly expressed in the antigen-presenting cells.
  • the tumor antigen peptide produced by intracellular degradation binds to the HLA antigen to form a complex, and the complex is presented at a high density on the surface of the antigen-presenting cell. It grows efficiently within and destroys tumor cells. In this way, tumor treatment or prevention is achieved.
  • the CTL inducer comprising the nucleic acid of the present invention as an active ingredient can be used for any tumor patient positive for the protein of the present invention. Specifically, for example, it can be used for the prevention or treatment of cancer (tumor) shown in 6) _ (1) above.
  • the DNA of the present invention is assembled into a DNA virus or RNA virus such as a retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, box virus, poliovirus, or symbis virus.
  • a retrovirus such as a retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, box virus, poliovirus, or symbis virus.
  • retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses, etc. are particularly preferred.
  • Other methods include direct administration of the expression plasmid intramuscularly (DNA digestion method), ribosome method, lipofectin method, microinjection method, calcium phosphate Method, electoral position method, etc., and DNA vaccine method and ribosome method are particularly preferred.
  • nucleic acid of the present invention In order for the nucleic acid of the present invention to actually act as a medicine, an in vivo method in which the nucleic acid is directly introduced into the body, and certain cells from human beings are collected and the nucleic acid is introduced into the cells outside the body, and the cells are introduced into the body.
  • an ex vivo method Nikkei Science, April 1994, pages 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), Experimental Medicine Extra Number, 12 (15), (1994), And references cited therein). In vivo methods are more preferred.
  • an in vivo method When administered by an in vivo method, it can be administered by an appropriate administration route according to the disease or symptom to be treated. For example, it can be administered intravenously, artery, subcutaneously, intradermally, intramuscularly. When administered by the in vivo method, for example, it can take a pharmaceutical form such as a liquid, but is generally an injection containing the nucleic acid of the present invention which is an active ingredient, and if necessary, pharmaceutical An acceptable carrier may be added.
  • the ribosome or membrane fusion ribosome containing the nucleic acid of the present invention is in the form of a ribosome preparation such as a suspension, a freezing agent, or a centrifugal concentrated freezing agent. be able to.
  • the content of the nucleic acid of the present invention in the preparation can be adjusted appropriately depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient.
  • the content of the polynucleotide in the nucleic acid is O.OOlmg to 100 mg, preferably It is preferable to administer 0.001 mg to 10 mg of the nucleic acid of the present invention once every several days to several months.
  • one or more polynucleotides encoding the peptide of the present invention are linked.
  • a polynucleotide prepared by ligating a polynucleotide encoding another peptide into an appropriate expression vector can be used as an active ingredient of a CTL inducer.
  • Such an inducer of CTL can take the same administration method and administration form as described above.
  • the antigen-presenting cell of the present invention Since the antigen-presenting cell of the present invention has a CTL inducing action, it can be used as an active ingredient of a medicine (cancer vaccine) for treating or preventing tumors.
  • the inducer of CTL containing the antigen-presenting cell of the present invention as an active ingredient is capable of treating or preventing a tumor by administering the antigen-presenting cell of the present invention to a tumor patient.
  • the CTL inducer comprising the antigen-presenting cell of the present invention as an active ingredient can be used for any tumor patient who is positive for the protein of the present invention. Specifically, for example, it can be used for the prevention or treatment of cancer (tumor) shown in 6)-(1) above.
  • the CTL inducer containing an antigen-presenting cell as an active ingredient preferably contains physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), a medium, or the like in order to stably maintain the antigen-presenting cell.
  • the administration method include intravenous administration, subcutaneous administration, and intradermal administration.
  • the dosage include those described in the above literature.
  • the CTL of the present invention has a tumor cytotoxicity, it can be used as an active ingredient of a medicament (cancer vaccine) for treating or preventing tumors.
  • the therapeutic or prophylactic agent for tumors comprising the CTL of the present invention as an active ingredient can be used for any tumor patient who is protein positive of the present invention. Specifically, for example, it can be used for the prevention or treatment of cancer (tumor) shown in 6)-(1) above.
  • the therapeutic or prophylactic agent for tumors containing CTL as an active ingredient preferably contains physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), medium and the like in order to maintain CTL stably.
  • the administration method include intravenous administration, subcutaneous administration, and intradermal administration. CT like this
  • the present invention provides antibodies that specifically bind to the peptides of the present invention.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody using the peptide of the present invention as an immunizing antigen with no particular restriction on its form!
  • the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it specifically binds to the peptide of the present invention as described above, and specifically, a peptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13 to 201 And an antibody that specifically binds to.
  • Examples include antibodies that specifically bind. More preferably, an antibody that specifically binds to a peptide having an amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 158, 22, 23, 26, 27, 198, 200, 201, 177, 178, 179 or 183 can be mentioned.
  • the peptide of the present invention (for example, SEQ ID NO: 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158, 159,160,161,15, 16,21,22, 23, 24,25,26,27,30,195, 197,198, 199,200,201, 177,178, 179
  • a peptide having an amino acid sequence described in any of 183 can be used as an immunogen to immunize a non-human animal such as a rabbit and obtain it from the sera of the immunized animal according to a conventional method.
  • the peptide of the present invention for example, SEQ ID NOs: 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66.
  • spleen cells obtained by immunizing non-human animals such as mice It can be obtained from hyperidoma cells prepared by cell fusion with myeloma cells; 0 urrent protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Pu Wish. John Wiley and Sons. Section 11.4: ⁇ 11.11).
  • the production of an antibody against the peptide of the present invention can also be carried out by enhancing the immunological reaction using various adjuvants depending on the host.
  • adjuvants include Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surfaces such as lysolecithin, pull-mouth polyol, polyone, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol.
  • Active substances human adjuvants such as BCG (Bacille Calmette Guerin) and Corynebaterum-Parvum.
  • an antibody that recognizes the peptide and an antibody that neutralizes the activity can be easily prepared.
  • Applications of antibodies include affinity chromatography, immunological diagnosis, and the like.
  • the immunological diagnosis can be appropriately selected from immunoblotting, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (E LISA), fluorescence or luminescence assay. Such an immunological diagnosis is effective in diagnosing cancer in which a gene encoding the protein of the present invention is expressed.
  • the present invention also provides an HLA monomer, HLA dimer, HLA tetramer or HLA pentamer containing the tumor antigen peptide of the present invention and an HLA antigen.
  • HLA monomer, HLA dimer, HLA tetramer and HLA pentamer containing tumor antigen peptide and HLA antigen are reagents for detecting antigen (antigen peptide) -specific CTL, that is, measuring the frequency and quantity of the CTL.
  • the HLA tetramer is a four-quantity product by piotination of a complex (HLA monomer) in which the ⁇ chain of HLA antigen and j82 microglobulin are associated with a peptide (antigen peptide) and bound to avidin. It refers to the materialized form (Science 279: 2103-2106 (1998), Science 274: 94-96 (1996).
  • the HLA monomer refers to a monomer (monomer) used in the production of the above-mentioned HLA tetramer, which is an assembly of HLA antigen ⁇ chain, ⁇ 2 microglobulin, and antigen peptide.
  • HLA dimer is a fusion of an HLA antigen oc chain and Ig (immunoglobulin, eg, IgGl) and 132 microglobulin and an antigen peptide bound thereto (Pro Natl. Acad. Sci USA 90: 6671-6675 (1993)).
  • Antigen peptide-specific CTL bound to the HLA dimer can be detected, for example, by binding a labeled anti-IgGl antibody to IgGl.
  • HLA pentamer is a recently developed technology and refers to a pentamer in which five molecules of a complex of an HLA antigen and an antigen peptide are polymerized via a Coiled-Coil domain.
  • HLA antigen Since the antigen peptide complex can be labeled with a fluorescent dye etc., it can be analyzed with a flow cytometer, etc. (see http://www.proimmune.co.uk/). )
  • HLA monomers, dimers, tetramers and pentamers described above can be commissioned and synthesized, for example, by outsourcing to Prolmmune or BD Biosciences.
  • HLA tetramers containing various antigen peptides are also commercially available (Medical and Biological Laboratories, etc.).
  • HLA monomer, dimer, tetramer and pentamer of the present invention it is necessary to avoid the following: S ⁇ U number: 42,43,44,45,46,47,49,59,60,61 , 62,63,64,65, 66,67,68,69,70,71, 72, 73,74,75,76,77,78, 158, 159, 160, 161, 15, 16,21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 30, 195, 197, 198, 19 9,200, 201, 177, 178, 179 or 183, and an HLA monomer or dimer containing the HLA-A24 antigen , Tetramers and pentamers.
  • an HLA monomer, dimer, tetramer and pentamer containing a peptide having the amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 158,22,23,26,27, 198,200,201, 177, 178, 179 or 183 and the HLA-A24 antigen One is mentioned.
  • HLA is used for CTL detection.
  • the HLA monomer, HLA tetramer, and HLA pentamer are preferably fluorescently labeled so that CTLs bound thereto can be easily selected or detected by known detection means such as flow cytometry and fluorescence microscope.
  • detection means such as flow cytometry and fluorescence microscope.
  • HLA-A24 antigen (alpha chain of HLA-A24 antigen) is disclosed in Genbank Accession No. M64 740 Based on the information of the known nucleotide sequence of HLA-A2402, etc., it can be easily cloned by a conventional method such as PCR.
  • HLA-A2 antigen (alpha chain of HLA-A2 antigen) is based on the information of known nucleotide sequence of GenBank (1 ⁇ [1 ⁇ -0201 gene disclosed in ⁇ 0. ⁇ 184379). It can be easily crawled by conventional methods such as law.
  • the 13 2 microglobulin which is a component of the HLA monomer, dimer, tetramer and pentamer of the present invention is preferably human-derived ⁇ 2 microglobulin.
  • the human 132 microglobulin can be easily cloned by conventional methods such as PCR based on the known nucleotide sequence information of human j82 microglobulin disclosed in GenBank Acc. No. AB021288.
  • HLA monomer, dimer, tetramer, and pentamer production method is a force well known from the above-mentioned documents. Specifically, the production method of HLA tetramer using HLA-A24 is briefly described below. become that way.
  • the HLA-A24 a chain expression vector and the j82 microglobulin expression vector are introduced into E. coli or mammalian cells capable of expressing the protein and expressed.
  • E. coli eg BL21
  • the obtained monomer HLA-A24 complex and the peptide of the present invention are mixed to form a soluble HLA-peptide complex.
  • the sequence of the C-terminal part of the HLA-A24 a chain in the HLA-peptide complex is piotinylated with the BirA enzyme.
  • This PIO-tinylated HLA-peptide complex and fluorescently labeled avidin were combined in a 4: 1 molar ratio.
  • HLA tetramers can be prepared by mixing at a ratio. In each step, protein purification by gel filtration or the like is preferably performed.
  • the HLA monomer, dimer, tetramer and pentamer of the present invention are effectively used as a reagent for detecting CTL specific for the tumor antigen peptide derived from the protein of the present invention.
  • the CTL detection reagent of the present invention can be used, for example, for the following purposes:
  • the frequency and amount of CTL progenitor cells against the tumor antigenic peptide of the present invention are examined. Thereby, the patient's responsiveness to the tumor antigen peptide can be determined.
  • a biological sample eg, PBMC
  • the HLA tetramer of the present invention is brought into contact with the biological sample, and the HLA tetramer is contacted.
  • the presence frequency or amount of the CTL specific for the peptide of the present invention bound to the peptide or the like is measured with a flow cytometer or the like.
  • the present invention also provides a cancer (tumor) disease marker using the Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOoriB gene or HIFPH3 gene, or their expression products.
  • the Lengsin gene, the BJ-TSA-9 gene, the C20orf42 gene, the BUB 1 gene, the ClOoriB gene, and the HIFPH3 gene are compared with the expression level and Z or the expression frequency in normal tissues, It was found that the expression level and Z or expression frequency in cancer yarns and tissues were significantly increased. Therefore, antibodies that recognize these genes or their expression products (proteins) can be effectively used as a disease marker for cancers in which these genes are expressed.
  • the human-derived Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BU B1 gene, ClOoriB gene, and HIFPH3 gene are known genes.
  • Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOrfi gene, HIFPH3 gene are compared with normal tissue.
  • the amount of expression and epilepsy or the frequency of expression increase specifically, the discovery of the presence or absence of the above-mentioned cancer diseases by detecting the presence or degree of expression of these genes, starting from the knowledge, This is based on the idea that the degree, the degree of recovery, etc. can be specifically detected, and the disease can be diagnosed accurately.
  • the present invention is a polynucleotide useful as a tool (disease marker) capable of diagnosing the presence / absence or degree of morbidity of a cancer disease in a subject by detecting the presence / absence or degree of expression of the gene in the subject. Is to provide.
  • polynucleotide includes both RNA and DNA, and may be either single-stranded or double-stranded.
  • DNA includes any of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA.
  • RNA also includes total RNA, mRNA and synthetic RNA!
  • the disease marker of the present invention includes a polynucleotide having at least 15 consecutive nucleotides in the base sequence of the Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOorlB gene or HIFPH3 gene and Z or the polynucleotide It is characterized by comprising a complementary polynucleotide.
  • the disease marker of the present invention includes a base sequence of the Lengsin gene described in SEQ ID NO: 1, a base sequence of the BJ-TSA-9 gene described in SEQ ID NO: 3, and a sequence described in SEQ ID NO: 5.
  • the C20orf42 gene base sequence, the BUB1 gene base sequence set forth in SEQ ID NO: 7, the ClOorfi gene base sequence set forth in SEQ ID NO: 9, or the HIFPH3 gene base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 are contiguous.
  • Polynucleotides having at least 15 bases and Z there may be mentioned those consisting of a complementary polynucleotide.
  • the complementary polynucleotide (complementary strand, reverse strand) is a full-length sequence of a polynucleotide consisting of the base sequence shown in each of the above SEQ ID NOs, or at least a continuous 15 of the base sequence.
  • a base complementary sequence based on base pair relationships such as A: T and G: C with respect to the partial sequence having a base sequence of base length (for convenience, these are also referred to as “normal strands”).
  • normal strands Means the polynucleotide in
  • such a complementary strand is not limited to the case where it forms a completely complementary sequence with the base sequence of the target positive strand, but has a complementary relationship that allows it to hybridize with the target positive strand under stringent conditions.
  • the cleaning conditions after no and ibridization usually include conditions of about “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.”. It is preferable that the complementary strand maintain a hybridized state with the target positive strand even if it is washed under conditions to cover.
  • the severer nobledization conditions are about “0.5 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C”, and the more severe hybridization conditions are about “0.1 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C”.
  • the cleaning conditions can be mentioned.
  • a complementary strand a strand having a base sequence ability that is completely complementary to the base sequence of the target positive strand, and at least 90%, preferably 95% homology with the strand.
  • a chain consisting of a nucleotide sequence having the sequence can be displayed.
  • polynucleotide having the base sequence of the Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20 orf42 gene, BUB1 gene, ClOoriB gene or HIFPH3 gene or a partial sequence thereof is included in the polynucleotide on the positive strand side.
  • a strand having a base sequence ability that is in a complementary relationship with the base sequence of the complementary strand can be included.
  • the normal polynucleotide and the complementary strand may be used as a disease marker in a single-stranded form, or may be used as a disease marker in a double-stranded form.
  • the disease markers for cancer diseases of the present invention are specifically Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene It may be a polynucleotide comprising the nucleotide sequence (full-length sequence) of the pup, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOoriB gene or HIFPH3 gene, or may be a polynucleotide having a complementary sequence ability.
  • the Lengsin gene or a polynucleotide derived from the gene, the BJ-TSA-9 gene or a polynucleotide derived from the gene, the C20orf42 gene or a polynucleotide derived from the gene, the BUB1 gene or a polynucleotide derived from the gene As long as it selectively recognizes (specifically) the ClOoriB gene or a polynucleotide derived from the gene, or a HIFPH3 gene or a polynucleotide derived from the gene, the partial sequence force of the full-length sequence or its complementary sequence is also present. May be a polynucleotide. In this case, examples of the partial sequence include a polynucleotide having at least 15 consecutive base lengths arbitrarily selected from the base sequence of the full-length sequence or its complementary sequence.
  • “selectively (specifically)” means, for example, in the Northern plot method, Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOoriB gene, HIFPH3 Genes or polynucleotides derived from these genes can be specifically detected, and in RT-PCR, Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C 20orf42 gene, BUB1 gene, ClOoriB gene, HIFPH3 gene or these This means that the derived polynucleotide is specifically produced, but is not limited thereto, as long as those skilled in the art can determine that the above-mentioned detection product or product is derived from these genes. Good.
  • the disease marker of the present invention includes, for example, the base sequence of the Lengsin gene described in SEQ ID NO: 1, the base sequence of the BJ-TSA-9 gene described in SEQ ID NO: 3, and the C20orf42 gene described in SEQ ID NO: 5. nucleotide sequence, SEQ ID NO: 7 BUBl gene nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9 nucleotide sequence of ClOoriB gene described in, or SEQ ID NO: Me ⁇ 1 J of HIFPH3 gene according to the b to 11, I The sequence can be designed using primer 3 (http://www.genome.wi.mit.edu/cgi—bin/primer/primer3.cgi) or the vector NTKlnfomax.
  • candidate sequences of primers or probes obtained by applying the base sequence of the Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOorB gene or HIFPH3 gene to the software of primer 3 or vector NTI can be used specifically as long as it has a length of at least 15 consecutive bases as described above. Depending on the purpose of the marker, its length can be selected and set as appropriate.
  • detection (diagnosis) of a cancer disease is the presence or absence of the expression of at least one of Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOoriB gene and HIF PH3 gene in the biological tissue of the subject. This is done by evaluating the expression level (expression level).
  • the disease marker of the present invention is used as a primer for specifically recognizing and amplifying the RNA produced by the expression of each gene or a polynucleotide derived therefrom, or the RNA or a polynucleotide derived therefrom. It can be used as a probe for special detection.
  • the above disease marker is used as a primer in detection of cancer disease (genetic diagnosis)
  • those having a base length of usually 15bp-100bp, preferably 15bp-50bp, more preferably 15bp-35bp can be exemplified.
  • those having a base length of usually 15 bp-total sequence, preferably 15 bp-lkb, more preferably 100 bp-lkb can be exemplified.
  • the disease marker of the present invention is used as a primer or probe according to a conventional method in a known method for specifically detecting a specific gene, such as Northern blotting, RT-PCR, in situ hybridization, etc. be able to. Based on this, it is possible to evaluate the presence or expression level (expression level) of Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOorB gene or HIFPH3 gene related to cancer diseases. .
  • the sample to be measured may be, for example, a total RNA prepared according to a conventional method from a part of the subject tissue of a subject collected with a biopsy or the like. Various polynucleotides prepared in this manner may be used.
  • the expression level of the UB1 gene, ClOorB gene or HIFPH3 gene can be detected or quantified using a DNA chip.
  • the disease marker of the present invention can be used as a probe of the DNA chip (for example, in the case of Aifymetrix's Gene Chip Human Genome U95 A, B, C, D, E, a 25 bp long polynucleotide) Used as a probe).
  • the disease marker (probe) of the present invention and the labeled DNA or RNA are hybridized with the labeled DNA or RNA prepared based on the RNA collected from the living tissue with the DNA chip using the disease marker of the present invention as a probe. And a complex is formed.
  • the presence or absence of expression of the genes, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOorB gene or HIFPH3 gene The expression level (expression level) can be evaluated.
  • the above DNA chip contains one or more markers of the present invention that can bind to the Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOoriB gene or HIFPH3 gene. I'll do it.
  • a DNA chip containing a plurality of disease markers it is possible to evaluate the presence / absence or expression level of a plurality of genes in one biological sample at the same time.
  • the disease marker of the present invention is useful for diagnosis and detection of cancer diseases (diagnosis of presence or absence of disease, degree of disease). Specifically, the diagnosis of cancer disease using the disease marker is carried out by analyzing the Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf 42 gene, BUB1 gene, ClOorlB gene or HIFPH3 in the body tissue of the subject and the body tissue of a normal subject. This can be done by determining the difference in gene expression level of the gene.
  • the difference in gene expression level is the difference in the expression level between the subject's living tissue and the normal subject's living tissue, which is expressed only by the difference in the expression of Z.
  • the case of 1.5 times or more, preferably 2 times or more, more preferably 3 times or more is included.
  • the polynucleotide derived from the Lengsin gene is particularly useful as a disease marker for lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma or gastric cancer.
  • Polynucleotide derived from BJ-TSA-9 gene is particularly useful as a disease marker for leukemia, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, oral cancer, stomach cancer, spleen cancer or lymphoma It is for.
  • the polynucleotide derived from the C20orf42 gene is particularly useful as a disease marker for lung squamous cell carcinoma, lung adenocarcinoma, liver cancer, gastric cancer, leukemia, malignant lymphoma tissue, rectal cancer, colon cancer or spleen cancer.
  • Polynucleotides derived from the BUB1 gene are in particular breast cancer, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, ovarian cancer, oral squamous cell carcinoma, kidney cancer, colon cancer (colon cancer, rectal cancer), gastric cancer, spleen cancer, liver It is useful as a disease marker for cancer, leukemia, lymphoma or melanoma.
  • Polynucleotides derived from the ClOoriB gene are particularly useful as disease markers for breast cancer, colon cancer, rectal cancer, kidney cancer, stomach cancer, ovarian cancer, liver cancer, spleen cancer, lung squamous cell carcinoma, lung adenocarcinoma, small cell lung cancer or melanoma. Useful.
  • the polynucleotide derived from the HIFPH3 gene is particularly useful as a disease marker for breast cancer, colon cancer, stomach cancer, kidney cancer, spleen cancer, liver cancer, lung adenocarcinoma or lung squamous cell carcinoma.
  • the present invention relates to Lengsin gene expression product (Lengsin), BJ-TSA-9 gene expression product (BJ-TSA-9), C20orf42 gene expression product (C20orf42), BUB1 gene
  • An antibody capable of specifically recognizing an expression product (BUB1), an expression product of ClOoriB gene (C10orf3), or an expression product of HIFP H3 gene (HIFPH3) is provided.
  • the antibody includes a Lengsin protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, BJ-TSA-9 protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and set forth in SEQ ID NO: 6.
  • C20orf42 protein having the amino acid sequence: BUB1 protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, ClOor protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, or HIFPH3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12.
  • An antibody capable of specifically recognizing a protein can be mentioned.
  • the present invention in cancer tissues of cancer patients, compared to normal cells and tissues, Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOrfi gene
  • Lengsin gene a gene that is specifically increased
  • C20orf42 gene a gene that is specifically increased
  • BUB1 gene a gene that is specifically increased
  • ClOrfi gene a gene that is specifically increased
  • the expression level and Z or the expression frequency of the HIFPH3 gene is specifically increased, the presence or absence of the above-mentioned cancer disease is detected by detecting the presence or the degree of expression of these proteins, starting from the knowledge.
  • the degree of morbidity can be specifically detected, and the disease This is based on the idea that the diagnosis can be performed accurately.
  • the antibody can diagnose whether the subject is suffering from a cancer disease or the degree of the disease by detecting the presence or absence of the expression of the protein in the subject or the degree thereof.
  • Useful as a tool (disease marker).
  • Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOorB and HIFP H3 derived from human are known proteins.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and it may be a polyclonal antibody having Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOoriB or HIFPH3 as an immunogen, or a monoclonal antibody thereof.
  • an antibody having an antigen binding property to a polypeptide consisting of at least continuous amino acids, usually 15 amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids, among the amino acid sequences constituting the protein is also an antibody of the present invention. include.
  • oligopeptides having a partial amino acid sequence of TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOorB or HIFPH3 immunize non-human animals such as rabbits, and obtain them from the sera of the immunized animals according to conventional methods. is there.
  • Monoclonal antibodies can be expressed in Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOoriB or HIFPH3 expressed in E. coli, etc. according to a conventional method, or oligopeptides having partial amino acid sequences of these proteins can be used in mice, etc.
  • the Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOorfi or HIFPH3 protein used as an immunizing antigen for the production of an antibody is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 provided by the present invention. , 11 Based on any one of the gene sequence information, DNA cloning, construction of each plasmid, transfection into a host, culture of a transformant, and recovery of a protein such as culture force can be obtained. These procedures are carried out according to methods known to those skilled in the art and methods described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al, CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985), etc. It can be carried out.
  • a recombinant DNA capable of expressing a gene encoding Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOoriB, or HIFPH3 in a desired host cell is prepared and used as a host. It is possible to obtain a protein as an immunogen for the production of the antibody of the present invention by introducing it into a cell, transforming it, culturing the transformant, and recovering the target protein from the obtained culture. it can.
  • Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOorlB or HIFPH3 partial peptides have the amino acid sequence information provided by the present invention (SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, According to 12), it can also be produced by a general chemical synthesis method (peptide synthesis).
  • Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOorB or HIFPH3 of the present invention relates to each amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12. This includes not only proteins but also their homologs.
  • the homologue also includes amino acid sequence ability in which one or more (usually several) amino acids have been deleted, replaced or added in the amino acid sequence of the protein encoded by the above gene, and each protein is publicly known. And a protein having an immunological activity equivalent to the above function.
  • a specific immune response is induced in an appropriate animal or its cells, and against Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BU Bl, ClOoriB or HIFPH3. Mention may be made of proteins having the ability to specifically bind to antibodies.
  • the number of amino acid mutations and mutation sites in the protein are not limited as long as the immunological activity is maintained. Indicators that determine how many amino acid residues need to be substituted, inserted or deleted without loss of immunological activity are well known to those skilled in the art computer programs such as DNA Star software. Can be found.
  • the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably of all amino acids. It is within 5%, more preferably within 1% of all amino acids.
  • the amino acid to be substituted is not particularly limited as long as the protein obtained after substitution retains immunological activity equivalent to Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOoriB or HIFPH3.
  • This amino acid to be substituted is an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution in terms of amino acid polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, amphiphilicity, etc. from the viewpoint of maintaining the structure of the protein.
  • Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, and Trp are amino acids classified as nonpolar amino acids
  • Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, and Gin are mutually uncharged amino acids.
  • Asp and Glu are amino acids that are classified as acidic amino acids
  • Lys, Arg, and His are amino acids that are classified as basic amino acids. Therefore, amino acids belonging to the same group can be appropriately selected using these as indices.
  • the antibody of the present invention may also be prepared using an oligopeptide having a partial amino acid sequence of Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOorB or HIF PH3.
  • the oligopeptide used for the induction of a strong antibody does not need to have a functional biological activity, it preferably has the same immunogenic properties as the corresponding protein.
  • the peptide can be shown in column f.
  • the production of an antibody against a strong oligopeptide can also be carried out by enhancing the immunological reaction using various adjuvants depending on the host.
  • adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and lysolecithin, pull nick polyol, polyion, peptides, oil emulsions, keyhole limpet mocyanine and dinitrophenol.
  • surface active substances such as BCG (Bacille Calmette-Guerin) and human adjuvants such as Corynebaterum parvum.
  • anti-Bubl antibody Upstate
  • anti-ClOorfi antibody Abnova
  • anti-C20orf42 antibody Imgenex
  • anti-HIFPH3 antibody Bethyl
  • the antibody of the present invention has a property of specifically binding to Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOorB or HIFPH3, it was expressed in the tissues of subjects by using the antibody.
  • the protein (including homologues thereof) can be specifically detected. That is, the antibody is useful as a probe for detecting the presence or absence of Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOorlB or HIFPH3 in the subject's tissue and the degree of expression.
  • a part of a patient's biological tissue is collected with a biopsy and the like using a tissue extract or protein prepared according to a conventional method, for example, a Western plot method or an ELISA method.
  • a conventional method for example, a Western plot method or an ELISA method.
  • Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOoriB or HI FPH3 can be detected by using the antibody of the present invention as a probe according to a conventional method.
  • the difference in the amount of protein includes the case where there is no protein Z and the difference in the amount of protein ⁇ times or more, preferably 3 times or more.
  • the antibody specifically recognizing Lengsin is particularly useful as a disease marker for lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma or gastric cancer.
  • Antibodies that specifically recognize BJ-TSA-9 are particularly useful as disease markers for leukemia, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, oral cancer, stomach cancer, spleen cancer or lymphoma.
  • An antibody that specifically recognizes C20orf42 is particularly useful as a disease marker for lung squamous cell carcinoma, lung adenocarcinoma, liver cancer, gastric cancer, leukemia, malignant lymphoma tissue, rectal cancer, colon cancer or spleen cancer.
  • Antibodies specifically recognizing BUB1 are in particular breast cancer, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, ovarian cancer, oral squamous cell carcinoma, kidney cancer, colon cancer (colon cancer, rectal cancer), gastric cancer, spleen It is useful as a disease marker for cancer, liver cancer, leukemia, lymphoma or melanoma.
  • Antibodies specifically recognizing ClOoriB are especially diseases for breast cancer, colon cancer, rectal cancer, kidney cancer, stomach cancer, ovarian cancer, liver cancer, spleen cancer, lung squamous cell carcinoma, lung adenocarcinoma, small cell lung cancer or melanoma Useful as a marker.
  • Antibodies that specifically recognize HIFPH3 are particularly useful as disease markers for breast cancer, colon cancer, stomach cancer, kidney cancer, spleen cancer, liver cancer, lung adenocarcinoma or lung squamous cell carcinoma.
  • the present invention provides a cancer disease detection method (diagnostic method) using the aforementioned disease marker of the present invention.
  • a part of a subject's biological tissue is collected by biopsy or the like, and the Lengsin gene and BJ-TSA-9 gene related to cancer diseases contained therein are collected.
  • C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOoriB gene or HIFPH3 gene expression level (expression level), or Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOoriB or HIFPH3 protein level (amount) ) Is detected and measured to detect (diagnose) the presence or absence of cancer disease or its extent.
  • the detection (diagnostic) method of the present invention is to detect (diagnose), for example, whether or not an improvement in the disease occurs when a therapeutic agent or the like is administered to improve the disease in a cancer disease patient. You can
  • the detection method of the present invention includes the following steps (a), (b) and (c):
  • the biological sample used here may include a target sample prepared from a biological tissue of a subject.
  • a target sample prepared from a biological tissue of a subject Specifically, an RNA-containing sample prepared from the tissue force, a sample containing a polynucleotide further prepared from the force, or a sample containing the protein prepared from the tissue force can be mentioned.
  • RNA, polynucleotide or protein The sample containing the quality can be prepared according to a conventional method after, for example, collecting a part of the biological tissue of the subject with a biopsy or the like.
  • the diagnostic method of the present invention is specifically performed as follows according to the type of biological sample used as a measurement target.
  • RNA When RNA is used as a measurement object, detection of a cancer disease can be carried out by a method specifically comprising the following steps (a), (b) and (c):
  • RNA or their force Complementary polynucleotides transcribed and the disease marker of the present invention Loengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUBl gene, ClOorfS gene
  • the detection method (diagnostic method) of the present invention comprises the Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOorfS gene or HIFPH3 gene in the RNA. This is done by detecting and measuring the expression level.
  • the disease marker of the present invention comprising the aforementioned polynucleotide (Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOorfS gene or HIFPH3 gene, at least 15 consecutive nucleotide sequences).
  • Polynucleotide having base and Z or its complementary polynucleotide as primers or probes, such as Northern blotting, RT-PCR, DNA chip analysis, in situ hybridization analysis, etc. It can implement by performing a well-known method.
  • the disease marker of the present invention is used as a probe, so that the Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, C 1 OoriB gene or HIFPH3 gene in RNA It is possible to detect and measure the presence and level of expression. Specifically, first, the disease marker of the present invention Label with potential elements (32P, 33P, etc .: RI), fluorescent substances, etc. Subsequently, the resulting labeled disease marker is hybridized with RNA derived from the biological tissue of the subject transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method.
  • potential elements 32P, 33P, etc .: RI
  • fluorescent substances etc.
  • the resulting labeled disease marker is hybridized with RNA derived from the biological tissue of the subject transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method.
  • the formed double-stranded marker of labeled disease marker (DNA) and RNA is used to detect the signal derived from the labeled disease marker (RI, fluorescent substance, etc.) as a radiation detector (BAS-1800II, Fuji Film And a method of detecting and measuring with a fluorescence detector or the like.
  • a disease marker probe DNA
  • a multi-bioimager S TORM860 manufactured by Amersham Pharmacia Biotech.
  • the presence or absence of expression of Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOoriB gene or HIFPH3 gene in RNA using the disease marker of the present invention as a primer It can detect and measure the expression level.
  • cDNA is prepared from RNA derived from the biological tissue of a subject according to a conventional method, and this is used as a saddle type to target Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOorfi gene or
  • a pair of primers (a normal strand that binds to the cDNA (-strand) and a reverse strand that binds to the + strand) prepared from the disease marker of the present invention are hybridized therewith.
  • PCR is performed according to a conventional method, and the resulting amplified double-stranded DNA is detected.
  • a method of detecting the labeled double-stranded DNA produced by performing the PCR using the primers previously labeled with RI, a fluorescent substance, etc. A method can be used in which the produced double-stranded DNA is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and a labeled disease marker is used as a probe and hybridized therewith to detect it.
  • the produced labeled double-stranded DNA product can be measured with an Agilent 2100 Bioanalyzer (manufactured by Yokogawa Analytical Systems). Prepare RT-PCR reaction solution using SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems) according to the protocol and use ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). The reaction product can also be detected by reaction.
  • a DNA chip on which the disease marker of the present invention is attached as a DNA probe is prepared.
  • Examples include a method in which a cRNA prepared by the method is hybridized, and a double-stranded DNA and cRNA formed are bound to a labeled probe prepared from the disease marker of the present invention and detected.
  • a DNA chip capable of detecting and measuring the gene expression level of the Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOoriB gene or HIFPH3 gene can also be used as the DNA chip.
  • BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOorfi gene or HIFPH3 gene for example, Aifymetrix's Gene Chip Human Genome U95 A, B, C, D, E can be mentioned.
  • BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOoriB gene or HIFPH3 gene in subject RNA using such a DNA chip see Examples. Detailed description.
  • the detection (diagnostic) method of the present invention detects Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUBl, ClOoriB or HIFPH3 in a biological sample and measures the amount (level). Is implemented. Specifically, it can be carried out by a method comprising the following steps (a), (b) and (c).
  • an antibody an antibody that specifically recognizes Lengsin, BJ-TS A-9, C20orf42, BUBl, ClOoriB, or HIFPH3
  • an antibody an antibody that specifically recognizes Lengsin, BJ-TS A-9, C20orf42, BUBl, ClOoriB, or HIFPH3
  • a method for detecting and quantifying orfi or HIFPH3 can be mentioned.
  • the Western plot method uses a labeled antibody (labeled antibody that binds to the primary antibody) labeled with a radioisotope such as 125 I as a secondary antibody, a fluorescent substance, etc. ), The signal derived from the radioisotope and fluorescent substance of the obtained labeled conjugate is detected with a radiation measuring instrument (BAS-1800II: manufactured by Fuji Film Co., Ltd.), a fluorescence detector, etc. it can.
  • a radiation measuring instrument BAS-1800II: manufactured by Fuji Film Co., Ltd.
  • a fluorescence detector etc. it can.
  • Diagnosis of cancer disease is based on Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOoriB gene or HIFPH3 gene expression level in the subject's living tissue, or Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUBl, This can be done by comparing the amount (level) of ClOoriB or HIFPH3 protein with the gene expression level or protein level in the corresponding normal tissue and determining the difference between the two
  • RNA or protein RNA or protein
  • a biological sample collected and prepared from a normal tissue or the like is necessary, but this is affected by cancer diseases, such as human tissues or cancer diseases. It is also possible to collect normal tissue of a non-cancerous part of a person who is living with a biopsy, etc., or to obtain tissue power collected based on the consent of the person after death.
  • a person who does not have a cancer disease is preferably diagnosed as having no cancer disease as a result of an examination using at least other examination methods, such as an X-ray examination, at least having no subjective symptoms of the cancer disease.
  • the “person who does not suffer from a cancer disease” may be simply referred to as a normal person.
  • Lengsin gene BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, C1 OorB obtained by measurement under uniform measurement conditions using normal biological yarn and weaving of 3 or more, more preferably 5 or more) Comparison of gene expression level of gene or HIFPH3 gene, or average or statistical intermediate value of protein level of Lengsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOoriB or HIFPH3 as normal gene expression level or amount of protein Can be used for
  • the determination of whether or not a subject has a cancer disease is based on the expression level of Lengsin gene, BJ-TSA-9 gene, C20orf42 gene, BUB1 gene, ClOoriB gene or HIFP H3 gene in the subject's tissue, or Lngsin, BJ-TSA-9, C20orf42, BUB1, ClOoriB or HIFPH3 protein levels of the expression products are 2 times or more, preferably 3 times more than those of normal subjects. it can. If the subject's gene expression level or protein level is higher than those of normal subjects, the ability to determine that the subject has a cancer disease is suspected of having the disease.
  • a cancer disease is suspected when the gene expression level of the Lengsin gene or the amount of protein in the lung or stomach tissue of a subject is higher than that of a normal corresponding tissue.
  • the expression level of BJ-TSA-9 gene or the amount of protein in the test subject's leukocyte, lung, oral cavity, stomach, spleen, or lymph node tissue is higher than the normal corresponding tissue, and in some cases cancer disease Suspected.
  • C20orf42 gene or the amount of protein.
  • lung, liver, stomach, leukocytes, lymph nodes, rectum, colon, or spleen tissue cancer disease is suspected in many cases compared to normal corresponding tissues. Is called.
  • the gene expression level of BUB1 gene or the amount of protein in the subject's mammary gland, lung, ovary, oral cavity, kidney, large intestine (colon, rectum), stomach, spleen, liver, leukocytes, lymph nodes or skin tissue In many cases, cancer diseases are suspected compared to normal corresponding tissues.
  • the expression level of ClOoriB gene or the amount of protein in the subject's mammary gland, colon, rectum, kidney, stomach, ovary, liver, spleen, lung, or skin tissue which is often more cancerous than the normal counterpart Is suspected.
  • HIFPH3 gene expression level or protein capacity In subjects' mammary gland, colon, stomach, kidney, spleen, liver, and lung tissues, cancer disease is suspected if they are higher than normal counterparts.
  • lung adenocarcinoma tissue 57 samples lung normal tissue (from lung adenocarcinoma patients) 46 samples, lung squamous cell carcinoma tissue 48 samples, lung normal tissue (lung squamous cell carcinoma) 18 patients, colon cancer tissue 108 samples, colon normal tissue (colon cancer patient origin) 114 samples, rectal cancer tissue 43 samples, rectal normal tissue (direct colorectal cancer patient origin) 31 samples, stomach cancer tissue 38 samples, stomach Normal tissue (from stomach cancer patients) 13 samples, breast cancer tissue 237 samples, normal breast tissue (from breast cancer patients) 39 samples, ovarian cancer tissue 37 samples, normal ovarian tissue (from ovarian cancer patients) 5 samples, liver cancer tissue 19 samples, Normal liver tissue (derived from liver cancer patients) 8 samples, renal cancer tissue 89 samples, normal kidney tissues (derived from renal cancer patients) 64 samples, splenic cancer tissue 55 samples, normal splenic tissue (derived from splenic cancer patients) 16 samples, Chibyo tissue 6
  • DNA chip analysis was performed using total RNA prepared from the sample shown in Example 1.
  • DNA chip analysis was performed using Gene Chip Human Genome U133 set from Aflfymetrix. Specifically, analysis includes (1) preparation of cDNA from total RNA, (2) preparation of labeled cRNA from the cDNA, (3) fragmentation of labeled cRNA, (4) fragmentation of cRNA and probe array (5) staining of the probe array, (6) scanning of the probe array, and (7) gene expression analysis.
  • DEPC-treated water Nacalai Testa
  • the Human genome U133 probe array (Aflfymetrix) filled with 1 X MES hybridization buffer was rotated at 45 ° C and 60rpm for 10 minutes in an Ivry oven.
  • the probe array was prepared by removing the 1 X MES hybridization buffer. 200 L of the high pre-cocktail supernatant obtained above was added to the probe array and rotated in a hybrid oven at 45 ° C and 60 rpm for 16 hours to obtain a probe array hybridized with fragmented cRNA. .
  • Non-Stringent Wash Buffer (6 X SSPE (diluted 20 X SSPE (Nacalai Testa)), 0.01% Tween20, 0.005% Filled with AntifoamO-30 (manufactured by Sigma), and then the prescribed GeneChip Fluidics Station 400 (manufactured by AfiVmetrix) with Non-Stringent Wash Buffer and Stringent Wash Buffer (100 mM MES ⁇ 0.1 M NaCl, 0.01% Tween20) set.
  • a probe array hybridized with the fragmented cRNA was mounted at the position, and the staining probe was According to Rotocol EuKGE-WS2, primary staining solution (10 g / mL Streptavidin Phycoerythrin (SAPE) (Molec ⁇ Lar Probe), 2 mg / mL Acetylated BSA ⁇ lOOmM MES ⁇ 1M NaCl (Ambion), 0.05% Tween20, 0.005% AntifoamO-30), secondary staining solution (100 ⁇ g / mL Goat IgG (Sigma), 3 ⁇ g / mL Biotinylated Anti—Streptavidin antibody (Vector Laboratories), 2 mg / mL Acetylated BSA ⁇ lOOmM Stained with MES 1 M NaCl, 0.05% Tween 20, 0.00 5% Antifoam O-30).
  • SAPE Streptavidin Phycoerythrin
  • Each stained probe array was subjected to HP GeneArray Scanner (Aifymetrix) to read the staining pattern. Based on the staining pattern, gene expression on the probe array was analyzed by GeneChip Workstation System (Affymetrix). Next, after normalization was performed according to the analysis protocol, the expression level (average difference) of each probe (each gene) and the presence or absence of expression in each sample were calculated. Using the same probe, the average value of the gene expression level was determined for each sample type, and the expression level and the rate of change in the expression frequency were determined for each sample type.
  • cancer tissues Compared with normal tissues derived from various major organs (lung, colon, rectum, stomach, milk, liver, kidney, ovary, knee), the genes whose expression level and expression frequency are increased in cancer tissues are as follows. Selected
  • BUB1 gene, ClOorB gene, C20orf42 gene, Lengsin gene, HIFP H3 gene, and BJ-TSA-9 gene were selected in total.
  • Table 2 shows the variability in the expression variation of these 6 genes, and Table 3 shows the expression frequency.
  • the numerical values in Table 2 show the variability of expression of various cancers in the corresponding normal tissues, and the cancer expression tissues derived from the same tissues when the gene expression level of various normal tissues analyzed by Human Genome U133 Chip is 1. The gene expression level was shown.
  • the numerical values in Table 3 show the expression frequency (%) of each gene in various cancers and normal tissues.
  • BUB1 gene was increased in all cancer tissues examined compared to normal tissues, and was particularly prominent in lung squamous cell carcinoma and ovarian cancer. The frequency of occurrence was also increasing, particularly in lung squamous cell carcinoma, ovarian cancer and melano-and-weaving.
  • the expression level of ClOoriB gene is increased in breast cancer, colon cancer, kidney cancer, liver cancer, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, spleen cancer, stomach cancer, ovarian cancer, rectal cancer and melano tissue compared to normal tissue. In particular, it was prominent in ovarian cancer, liver cancer, and lung squamous cell carcinoma.
  • the expression frequency was also increased in all cancer types except for hematological tumors, as was the case with the above expression level, particularly in lung squamous cell carcinoma, spleen cancer, and ovarian cancer.
  • C20orf42 gene is increased in colon cancer, liver cancer, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, spleen cancer, gastric cancer, straight bowel cancer, leukemia and malignant lymphoma tissues compared to normal tissues. In particular, it was remarkable in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. The frequency of occurrence also increased It was particularly prominent in lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma and spleen cancer.
  • the expression level of Lengsin gene was increased in lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, and gastric cancer compared to normal tissues, and was particularly prominent in lung adenocarcinoma.
  • the expression frequency was also increased in lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, and gastric cancer in the same manner as the above-mentioned expression level, particularly in lung adenocarcinoma.
  • HIFPH3 gene The expression level of HIFPH3 gene is increased in breast cancer, colon cancer, kidney cancer, liver cancer, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, spleen cancer, and gastric cancer tissue compared to normal tissue. This was prominent in cancer and lung squamous cell carcinoma.
  • the expression frequency was also increased in the breast cancer, colon cancer, kidney cancer, liver cancer, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, spleen cancer and gastric cancer tissues, especially the kidney cancer, lung squamous cell carcinoma and It was prominent in spleen cancer.
  • the expression level of BJ-TSA-9 gene is increased in lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, and leukemia compared to normal tissues, and is particularly prominent in leukemia, lung adenocarcinoma, and lung squamous cell carcinoma .
  • the expression frequency was also increased in lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, and leukemia, similar to the above expression level, particularly in lung adenocarcinoma and lung squamous cell carcinoma.
  • the selected 6 genes were genes whose expression level and expression frequency were specifically increased in the corresponding cancer tissue as compared with the normal tissue. Therefore, it became clear that these six genes and their expression products (proteins) are useful as disease markers for cancer (particularly those listed above).
  • RNA extracted from various cancer cell lines and cancer tissues using Isogen reagent (Nippon Gene), or RNA derived from commercial normal tissues (clontech)
  • cDNA was prepared using oligo dT primers.
  • the BUBl gene was not detected or expressed at low levels in many major normal tissues, whereas the tumor was dilated squamous cell carcinoma, kidney cancer, colon cancer, stomach cancer, spleen cancer, and liver cancer. Expression was detected in lymphomas and melanoma cell lines.
  • the ClOoriB gene was not detected or expressed at low levels in many major normal tissues except testis, whereas in lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, and small cell lung cancer cell lines, High expression was detected.
  • the C20orf42 gene was found to be highly expressed in colon cancer and spleen cancer cell lines, whereas expression was not detected in many major normal tissues.
  • the Lengsin gene was found to be highly expressed in lung adenocarcinoma and lung squamous cell carcinoma cell lines, whereas expression was not detected in many major normal yarns and tissues.
  • HIFPH3 gene was detected in many major normal tissues, but higher expression was detected in renal cancer cell lines. Furthermore, high expression was detected in many cancer tissues derived from renal cancer patients compared to normal tissues.
  • the BJ-TSA-9 gene was found to be undetectable in many major normal tissues, whereas lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, oral cancer, gastric cancer, spleen cancer, lymphoma cell line The expression was detected. [0232] As described above, the expression of the six genes is not detected in various normal tissues, or the expression level is lower than that in cancer cells / tissues. However, high expression was detected in various cancer cell lines and cancer tissues. Therefore, in addition to the results of DNA chip analysis, these 6 genes and their expression products (proteins) were more strongly shown to be useful as disease markers for cancer (particularly those listed above).
  • amino acid sequence of Lengsin (SEQ ID NO: 2), a peptide comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13 to 31 and SEQ ID NO: 195 to 201 as a peptide that may bind to the HLA-A24 molecule, A peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32 to 41 was selected as a peptide that could bind to the HLA-A2 molecule.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 59 to 78 as a peptide that may bind to the HLA-A24 molecule, and also to bind to the HLA-A2 molecule A peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 79 to 88 was selected as a peptidic peptide.
  • a peptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 158 to 165 as a peptide that may bind to the HLA-A24 molecule is also bound to the HLA-A2 molecule.
  • Peptides having the amino acid sequence ability described in SEQ ID NOs: 166 to 175 were selected as possible peptides.
  • a peptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 176 183 as a peptide that may bind to the HLA-A24 molecule can also bind to the HLA-A2 molecule.
  • a peptide having the amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 184 194 was selected as a peptide having sex.
  • the position on the amino acid sequence, the number of amino acids and the amino acid sequence of each peptide are shown in Table 5 to Table 16 below.
  • the binding ability can be confirmed by the same method as described above using HLA-A * 0201, a cell line derived from human lymphoma, and T2 cells. Similarly, BUB1 and HIFPH3 can be confirmed to bind to HLA.
  • the proteins BUB1, C10orf3, C20orf42, Lengsin, HIFPH3, and BJ-TSA-9 It is a tumor antigen protein, and it can be confirmed that the partial peptide is a tumor antigen peptide.
  • a method for inducing CTLs with peptides and evaluating the activity of the CTLs can be performed according to a known assay method using human model animals for human peripheral blood mononuclear cells (J. Immunol. 169: 1611, 2002, WO 02/47474, Int J.
  • Non-adherent cells are cultured together with antigen-presenting cells pulsed with the above peptides.
  • the activity of CTL is the target cell labeled with a radioactive substance such as 51 Cr, or other non-radioactive substance (expressing HLA to which the administration peptide binds, and further cancer antigen encoding the administration peptide) , Or cells expressing the administration peptide or cells pre-added with peptide), and the destruction of the target cells by CTL is measured by the amount of radioactive or non-radioactive substance in the culture supernatant.
  • CTL Assess the activity of The activity of CTL can also be evaluated by measuring IFN y produced in the culture supernatant as a result of the reaction of CTL cells with target cells by ELISA or ELISPOT.
  • a peptide derived from a cancer antigen is administered to a transgenic mouse expressing human HLA using an appropriate dosage form, and about 1 week later, spleen cells, Alternatively, other lymphoid tissues are obtained.
  • the obtained cells are subjected to antigen stimulation in vitro with the same peptides as those administered, and further cultured for about 5 days.
  • the obtained cells are used as a CTL fraction, and CTL activity can be evaluated by the same method as described above.
  • FIG. 12 shows the results of CTL activity obtained using the cell line (Strain), HLA-A * 2402-positive and ClOorfi-positive cancer cell line Sw480 as target cells.
  • the induced CTL clone showed peptide-specific cytotoxic activity.
  • the induced CTL clone did not react with HLA-negative K562 cells, and showed cytotoxic activity against HLA-A * 2402-positive and ClOorfi-positive cancer cell lines. This confirms that the peptide of C1 0orfi_193 (10) (SEQ ID NO: 158, 162) is a tumor antigen peptide. did it. It was also confirmed that ClOorfi is a tumor antigen protein.
  • FIG. 14 shows the result of inducing CTL by stimulating PBMC of a cancer patient with the peptide of SEQ ID NO: 22, and detecting the CTL inducing activity by cytotoxic activity. Specific cytotoxic activity against target cells pulsed with the peptide used for stimulation was detected.
  • FIG. 15 shows the results of measuring the cytotoxic activity against various renal cancer cell lines after induction.
  • Peptide-stimulated lymphocytes show the ability to react to SMKT R-1 cells positive for both HLA-A24 and HIFPH3 and to show cytotoxicity HLA-A24 negative, HIFPH3 positive SMKT R4 cells, HL A-A24-positive, HIFPH3-negative Caki-1 cells, HLA-A24 and HIFPH3-negative ACHN cells, and HLA-negative K562 cells showed no cytotoxicity. This indicates that HLA-A24-restricted CTL against HIFPH3 was induced by peptide stimulation.
  • HIFPH3_27 (9) SEQ ID NO: 177) and HIFPH3_92 (10) (SEQ ID NO: 178)
  • HIFPH3_112 (10) SEQ ID NO: 179)
  • HIFPH3_295 (9) SEQ ID NO: 183
  • HIFPH3 is a tumor antigen protein.
  • PBMCs of HLA-A * 2402-positive cancer patients were seeded in 96-well plates, and according to the method described in Example 7, stimulation with each group of peptides was attempted to induce CTL.
  • Each group was stimulated with 384 wells of PBMC and examined for cytotoxicity against the stimulated peptide. Specific cytotoxic activity against the stimulating peptide was detected in 8 to 14 wells. This confirmed that these C20orf42-derived peptides were tumor antigen peptides. It was also confirmed that C20orf42 is a tumor antigen protein.
  • the present invention provides novel tumor antigen proteins and tumor antigen peptides, and uses of these substances in the field of cancer immunity.
  • the tumor antigen protein of the present invention and the tumor antigen peptide derived therefrom can treat a patient suffering from cancer in which the tumor antigen protein is expressed.
  • FIG. 1 is a graph showing the expression level of mRNA in various major normal tissues and lung cancer cell lines of Lengsin gene using RT-PCR.
  • the arrows of Lengsin and G3PDH indicate the positions of bands indicating the respective mRNA amounts.
  • FIG. 2 is a graph showing the analysis of mRNA expression level of various major normal tissues of BJ-TSA-9 gene and lung cancer, oral cancer and other cancer cell lines using RT-PCR method.
  • the arrows of BJ-TSA-9 and G3PDH (positive control) indicate the positions of bands indicating the respective mRNA amounts.
  • FIG. 3 shows the analysis of the mRNA expression level of various major normal tissues of C20orf42 gene and colon cancer and spleen cancer cell lines using the RT-PCR method.
  • the arrows of C20orf42 and G3PDH (positive control) indicate the positions of bands indicating the respective mRNA amounts.
  • Heart, Brain, Placenta, Lung, Liver, Skeleton Muscle, Kidney, Pancreas, Spleen, Thymus ( Thymus), Prostate (prostate), T estis (testis), Ovary (ovary), Small Intestine (colon), leukocyte (white blood cell), colon cancer (colon cancer), pancreatic cancer (spleen cancer) are normal And cancer tissue types.
  • SW480, SW620, colo205, WiDR, CFPAC, PK8, SuSu86, PUN indicate colon cancer and spleen cancer cell line names.
  • Figure 4 shows the mRNA expression levels of BUB1 gene in various major normal tissues and oral squamous cell carcinoma, kidney cancer, large intestine cancer, stomach cancer, spleen cancer, liver cancer, lymphoma, and melanoma cell lines. It is the figure analyzed using RT-PCR method.
  • the arrows for BUB1 and G3PDH (positive control) indicate the positions of bands indicating the respective mRNA levels.
  • OSC19, HSC2, Cakil, R3, SW450, S STW, HS776T, PUN, CHC20, CHC32, C1R, T2, 888mel, and LG2MEL indicate the names of various organ cancer cell lines.
  • FIG. 5 shows the analysis of mRNA expression level of ClOorfi gene in various major normal tissues and various lung cancer cell lines using RT-PCR.
  • the arrows of ClOoriB and G3PDH indicate the positions of bands indicating the respective mRNA amounts.
  • FIG. 6 shows the analysis of mRNA expression level of HIFPH3 gene in various major normal tissues, renal cancer cell lines, and renal cancer tumor tissues using RT-PCR.
  • HIFPH3, G3 PDH, and jS-actin (positive control) indicate the positions of bands indicating the respective mRNA levels.
  • Heart, Brain, Placenta, Lung, Liver, Skeleton Muscle, Kidney, Pancreas, Spleen, Thymus Thymus), Prostate (prostate), Testis (testis), Ovary (ovary), Small Intestine (colon), leukoc yte (leukocyte), RCC (renal cell carcinoma) indicate normal and cancer tissue types.
  • T indicates tumor tissue and N indicates normal tissue.
  • SMKTR-1, SMKTR-2, SMKTR-3, SMKTR-4, Caki-1, and ACHN indicate kidney cancer cell line names.
  • Fig. 7 shows 8 types of peptides derived from BJ-TSA-9 and positive controls EB virus-derived peptides (EBV in the figure), HIV virus-derived peptides (HIV in the figure), and negative controls. It is a graph showing the binding affinity of Ovalbumin derived peptide (SL8) to HLA-A * 2402. In the figure, the horizontal axis shows the mean fluorescence intensity (MFI, binding affinity). The vertical axis shows the peptide name. (-) Indicates the result of no addition of peptide.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • FIG. 8 shows 20 peptides derived from C20orf42 and positive control EB virus-derived peptide (EBV in the figure), HIV virus-derived peptide (HIV in the figure), and negative control Ovalbumin.
  • This graph shows the binding affinity of the derived peptide (SL8) to HLA-A * 2402.
  • the horizontal axis shows the mean fluorescence intensity (MFI, binding affinity).
  • the vertical axis represents the peptide name. (-) Indicates the result of no addition of peptide.
  • Fig. 9 shows four kinds of peptides derived from ClOorfi and positive control EB virus-derived peptide (EBV in the figure), HIV virus-derived peptide (HIV in the figure), and negative control Ovalbumin.
  • This graph shows the binding affinity of the derived peptide (SL8) to HLA-A * 2402.
  • the horizontal axis shows the mean fluorescence intensity (MFI, binding affinity).
  • the vertical axis represents the peptide name. (-) Indicates the result of no addition of peptide.
  • Fig. 10 shows 16 types of peptides derived from Lengsin and a positive control HIV virus-derived peptide (HIV in the figure), a negative control Ovalbumin-derived peptide, ( It is the graph which showed the binding affinity to HLA-A * 2402 of SL8).
  • the horizontal axis shows the mean fluorescence intensity (MFI, binding affinity).
  • the vertical axis indicates the peptide name. (-) Indicates the result of un-peptide added caro.
  • Fig. 11 shows HLA-A of seven peptides derived from Lengsin, EB virus-derived peptide (EBV in the figure) as a positive control, and Ovalbumin peptide (SL 8) as a negative control. * It is a graph showing the binding affinity to 2402. In the figure, the horizontal axis shows the mean fluorescence intensity (MFI, binding affinity). The vertical axis indicates the peptide name. (-) Indicates the results when no peptide was added.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • FIG. 12 is a graph showing the cytotoxic activity of CTL induced by stimulating PBMC of HLA-A * 2402-positive cancer patients with C10orB_193 (10) peptide.
  • “p-marked tid e2j” represents the result of using T2-A24 cells pulsed with the peptide
  • “Sw480” represents the result of using HLA-A * 2402-positive and ClOor-positive cancer cell line Sw480 as target cells.
  • ⁇ 562] shows the results of using HLA-negative K562 cells as target cells
  • (1) shows the results of using peptide-free T2-A24 cells as target cells.
  • Fig. 13 shows the responsiveness of CTL induced by stimulation of PBMC of HLA-A * 2402-positive cancer patients with Lengsin-derived peptide by the ELISPOT method, which measures the amount of IFN- ⁇ . It is the figure which showed the result.
  • FIG. 14 is a graph showing the cytotoxic activity of CTL induced by stimulating PBMC of a cancer patient with Lengsin_142 (9) peptide.
  • T2A24 + p mark tide indicates the result of using T2-A24 cells pulsed with the peptide
  • T2A24 indicates the result of using T2-A24 cells not pulsed with the peptide as target cells.
  • T2A24 + HIV shows the results of using T2-A24 cells pulsed with HIV-derived peptides
  • K562 shows the results of using HLA-negative ⁇ 562 cells as target cells.
  • Fig. 15 shows the results of inducing CTL by stimulating PBMC of HLA-A * 2402-positive cancer patients with a mixture of HIFPH3-derived peptides (SEQ ID NOs: 177, 178, 179 and 183). It is a graph to show. The vertical axis shows the cytotoxic activity.
  • E: TlCr%, E: T3Cr%, and E: T10Cr% indicate that the mixed specific forces of peptide-stimulated PBMC and cancer cells are 3 and 10, respectively.
  • Sequence listing free text The amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 13 to 201 are synthetic peptides.
  • the base sequences described in SEQ ID NOs: 202 to 213 are primers.

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Abstract

新規な腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチド、ならびにこれらの物質の癌免疫分野における利用に関する。具体的には、Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3に由来する部分ペプチドを含有し、かつＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド、当該ペプチドと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物等に関する。

Description

明 細 書
新規腫瘍抗原ペプチド
技術分野
[0001] 本発明は、新規な腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチド、ならびにこれらの 物質の癌免疫分野における利用に関する。
背景技術
[0002] 生体による癌 (腫瘍)の排除には、免疫系、特に T細胞が重要な役割を果たしてい ることが知られている。実際、ヒトの癌局所には癌細胞に対して傷害活性を示すリン パ球の浸潤が認められ (非特許文献 1を参照）、メラノーマからは自己の癌細胞を認 識する細胞傷害性 T細胞 (以下 CTL)が比較的容易に分離されて ヽる（非特許文献 2 、 3および 4を参照)。また、該 CTLの移入によるメラノーマ治療の臨床結果力もも、癌 排除における T細胞の重要性が示唆されて 、る (非特許文献 5を参照)。
[0003] 自己の癌細胞を攻撃する CTLが標的とする分子については長い間不明であつたが 、最近の免疫学および分子生物学の進歩により次第に明らかになつてきた。すなわ ち CTLは、 T細胞受容体 (TCR)を用いて、癌抗原ペプチドと呼ばれるペプチドと主要 組織適合遺伝子複合体クラス I抗原 (MHCクラス航原、 HLA抗原とも呼ばれる）との 複合体を認識することにより、自己の癌細胞を攻撃していることが明らかとなった。
[0004] 癌抗原ペプチドは、癌に特有のタンパク質、すなわち癌抗原タンパク質が細胞内で 合成された後、プロテアソームにより細胞内で分解されることによって生成される。生 成された癌抗原ペプチドは、小胞体内で MHCクラス I抗原 (HLA抗原）と結合して複 合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示された複合体を 抗原特異的な CTLが認識し、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗癌作 用を示す。このような一連の作用の解明に伴い、癌抗原タンパク質または癌抗原べ プチドをいわゆる癌ワクチンとして利用することにより、癌患者の体内の癌特異的 CTL を増強させる治療法が可能となった。
[0005] 腫瘍抗原タンパク質としては、 1991年に T.Boonらが初めて MAGEと名付けたタン ノ ク質をヒトメラノーマ細胞力も同定した (非特許文献 6を参照)。その後、いくつかの 腫瘍抗原タンパク質が、主にメラノーマ細胞カゝら同定されている。
[0006] 腫瘍抗原タンパク質や腫瘍抗原ペプチドを腫瘍の治療や診断に応用するために、 メラノーマに比べて発生頻度が圧倒的に高い腺癌 (肺癌等)などに幅広く適応可能 な、新たな腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチドの同定が望まれている。
[0007] Lengsin(Glutamate— ammonia ligase (glutamine synthase) domain containing 1 ( LU LD1) UniGene Hs.149585)は、ヒトレンズで多く発現する新規遺伝子として同定され、 そのアミノ酸配列の類似性力もグルタミン合成酵素のファミリーに属する可能性が報 告されている。しかし、生理的機能については不明である（非特許文献 7を参照)。
[0008] BJ-TSA-9(Hypothetical protein MGC14128)(UniGene Hs.379821)は、 The Nationa 1 Institutes of Health Mammalian Gene Collection (MGC) Programにお ヽてクロ ~~二 ングされた新規遺伝子であるが、その生理的機能については不明である（非特許文 献 8を参照)。
[0009] C20orf42(あるいは URP1, Kindlerin)は肺癌、結腸癌で高発現する遺伝子としてクロ 一ユングされ (非特許文献 9を参照）、 C. elegans UNC-112と高い類似性を有する。 U NC-112と同様 Integrinと相互作用し、また TGF- で発現誘導されることが示されて いる (非特許文献 10を参照)。一方、 C20orf42は稀な常染色体性劣性遺伝性皮膚症 である Kindler syndromeで変異の認められる Kindlerin遺伝子として同定されている（ 非特許文献 11、 12を参照)。
[0010] BUB1は細胞周期 M期の紡錘体形成チェックポイントで働く Serine/threonine Kinas e分子であり、 BUB1機能欠失により染色体分離に異常を生じる。また BUB1は Cdc20 をリン酸化し、 APC/Cede2Qの ubiquitin ligase活性を抑制し、その結果染色体の異常な 分配が阻止される (非特許文献 13を参照)。癌組織にぉ ヽては発現低下あるいは変 異が報告されている (非特許文献 14、 15を参照)。
[0011] ClOorlBi^ The National Institutes of Health Mammalian Gene Collection (MuC Pr ogramにおいてクローユングされた新規遺伝子である力 その生理的機能について は不明である（非特許文献 16を参照)。
[0012] HIFPH3(egl nine homolog3,EGLN3)は C.elegansで Hypoxia— indudble factorl(HIFl) の活性を制御する dioxygenase分子として同定された egl9と同様な活性を担う 3種の分 子の 1種としてクローユングされた (非特許文献 17を参照)。 HIF1を介して低酸素状 態での活性を制御していると考えられているが 3種の egl nine homologの違いについ ては明らかではない。
[0013] 非特許文献 l:Arch.Surg.， 126:200 (1990)
非特許文献 2:Immunol.Today, 8:385 (1987)
非特許文献 3:J.Immunol.， 138:989 (1987)
非特許文献 4:Int.J.Cancer, 52:52 (1992)
非特許文献 5:J.Natl.Cancer.Inst.， 86:1159 (1994)
非特許文献 6: Science, 254, 1643-1647 (1991)
非特許文献 7:Mol. Vis. Jun.15;8:185- 95 (2002)
非特許文献 8:Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 99(26): 16899- 903 (2002)
非特許文献 9:Biochim. Biophys. Acta 1637: 207-216 (2003)
非特許文献 10: J. Biol. Chem., Feb 20; 279(8):6824-33 (2004)
非特許文献 ll:Hum. Molec. Genet., 12: 925-935 (2003)
非特許文献 12: Am. J. Hum. Genet., 73: 174-187 (2003)
非特許文献 13:Mol. Cell, Nov 5;16(3):387- 97 (2004)
非特許文献 14: Oncogene Jul ll;21(30):4673-9 (2002)
非特許文献 15:Leuk. Lymphoma. Feb;43(2):385- 91 (2002)
非特許文献 16:Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Dec 24;99(26): 16899- 903 (2002) 非特許文献 17: Cell 107: 43-54 (2001)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0014] 本発明の目的は、新規な腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチド、ならびにこ れらの物質の癌免疫分野における用途を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0015] 本発明者らは、各種癌組織にぉ 、て、正常組織に比して発現頻度および Zまたは 発現量が上昇している遺伝子につき鋭意検討した結果、 Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9 遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOoriB遺伝子および HIFPH3遺伝子の計 6遺伝子が選択され、これらの遺伝子およびその発現産物 (タンパク質)は、癌に対す る疾患マーカーとして有用であることが明ら力となった。
[0016] さらに、これら Lengsin遺伝子、 BJ- TSA- 9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOorB遺伝子および HIFPH3遺伝子がコードするタンパク質（Lengsin、 BJ-TSA-9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBおよび HIFPH3)のアミノ酸配列より HLA分子に結合する可 能性のあるペプチド部分を選択し、 HLA分子への結合親和性や CTL誘導活性等を 解析した結果、これら 6種類のタンパク質（特に BJ-TSA- 9、 C20orf42および ClOoriB) は腫瘍抗原タンパク質であり、その部分ペプチドは腫瘍抗原ペプチドであることが明 らカとなった。従って、これら Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 C10orf3、 HIFPH 3、およびこれらに由来するペプチドは、これら因子の発現 (特に発現上昇）が認めら れる種々の癌に対する癌ワクチンとして有用であると考えられる。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
[0017] すなわち本発明は、
(1) Lengsin, BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3に由来する部分 ペプチドを含有し、かつ HLA抗原と結合して CTLにより認識されるペプチド、
(2) HLA抗原が HLA— A24抗原または HLA— A2抗原である、前記 (1)記載のぺ プチド、
(3) 配列番号： 13〜配列番号： 201のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、 前記 (2)記載のペプチド、
(4) 配列番号： 13〜配列番号： 31、配列番号： 42〜配列番号： 49、配列番号： 59〜 配列番号： 78、配列番号： 89〜配列番号： 117、配列番号： 158〜配列番号： 165、 配列番号： 176〜配列番号： 183、配列番号： 195〜201のいずれかに記載のァミノ 酸配列の第 2位のアミノ酸がチロシン、フエ-ルァラニン、メチォニンまたはトリプトファ ンに置換され、及び/又は C末端のアミノ酸がフエ-ルァラニン、ロイシン、イソ口イシ ン、トリプトファンまたはメチォニンに置換されたアミノ酸配列を含有し、かつ HLA— A 24抗原と結合して CTLにより認識されるペプチド、
(5) 配列番号： 32〜配列番号： 41、配列番号： 50〜配列番号： 58、配列番号： 79〜 配列番号： 88、配列番号： 118〜配列番号： 157、配列番号： 166〜配列番号： 175 、配列番号： 184〜配列番号： 194のいずれかに記載のアミノ酸配列の第 2位のアミ ノ酸がロイシン、メチォニン、パリン、イソロイシンまたはグルタミンに置換され、及び/ 又は C末端のアミノ酸力パリンまたはロイシンに置換されたアミノ酸配列を含有し、か つ HLA— A2抗原と結合して CTLにより認識されるペプチド、
[0018] (6) 前記 (1)〜(5)のいずれかに記載のペプチドを含有するェピトープペプチド、
(7) 前記 (1)〜(6)のいずれかに記載のペプチドと薬学的に許容される担体とを含有 する医薬組成物、
(8) 前記 (1)〜(6)のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有す る核酸、
(9) 前記 (8)記載の核酸と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(10) Lengsin, BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3と薬学的に許容 される担体とを含有する医薬組成物、
[0019] (11) Lengsinが配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前記 (10)記載の医薬組成物、
(12) BJ-TSA-9が配列番号: 4に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、 前記 (10)記載の医薬組成物、
(13) C20orf42が配列番号： 6に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前 記 (10)記載の医薬組成物、
(14) BUB1が配列番号: 8に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前記（ 10)記載の医薬組成物、
(15) ClOoriBが配列番号： 10に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前 記 (10)記載の医薬組成物、
[0020] (16) HIFPH3が配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前 記 (10)記載の医薬組成物、
(17) Lengsin, BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3をコードするポリ ヌクレオチドを含有する核酸と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(18) Lengsinをコードするポリヌクレオチドが配列番号： 1に記載の塩基配列を含有す るポリヌクレオチド、または配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ チドである、前記 (17)記載の医薬組成物、
(19) BJ-TSA-9をコードするポリヌクレオチドが配列番号： 3に記載の塩基配列を含 有するポリヌクレオチド、または配列番号: 4に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌ クレオチドである、前記 (17)記載の医薬組成物、
(20) C20orf42をコードするポリヌクレオチドが配列番号： 5に記載の塩基配列を含有 するポリヌクレオチド、または配列番号: 6に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレ ォチドである、前記 (17)記載の医薬組成物、
[0021] (21) BUB1をコードするポリヌクレオチドが配列番号： 7に記載の塩基配列を含有す るポリヌクレオチド、または配列番号: 8に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ チドである、前記 (17)記載の医薬組成物、
(22) ClOoriBをコードするポリヌクレオチドが配列番号： 9に記載の塩基配列を含有 するポリヌクレオチド、または配列番号： 10に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌク レオチドである、前記 (17)記載の医薬組成物、
(23) HIFPH3をコードするポリヌクレオチドが配列番号： 11に記載の塩基配列を含有 するポリヌクレオチド、または配列番号： 12に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌク レオチドである、前記 (17)記載の医薬組成物、
(24) 以下の（a)〜（d) :
(a)前記 (1)〜(6)の 、ずれかに記載のペプチド、
(b)前記 (8)記載の核酸、
(c) Lengsinゝ BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3、および
(d) Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3をコードするポリヌ クレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、抗原提示能を有する細胞とをイン'ビトロで接触させることを特徴とす る、抗原提示細胞の製造方法、
(25) 前記 (24)記載の製造方法により製造される抗原提示細胞、
[0022] (26) 前記 (25)記載の抗原提示細胞と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組 成物、
(27) 以下の (a)〜(d) : (a)前記 (1)〜(6)の 、ずれかに記載のペプチド、
(b)前記 (8)記載の核酸、
(c) Lengsinゝ BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3、および
(d) Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3をコードするポリヌ クレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、末梢血リンパ球とをイン'ビトロで接触させることを特徴とする、 CTLの 誘導方法、
(28) 前記 (27)記載の誘導方法により誘導される CTL、
(29) 前記 (28)記載の CTLと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(30) CTLの誘導剤として使用される、前記 (7)、（9)〜(23)、（26)または (29)のいずれか に記載の医薬組成物、
[0023] (31) 癌ワクチンとして使用される、前記 (7)、（9)〜(23)、（26)または (29)のいずれかに 記載の医薬組成物、
(32) 前記 (1)〜(5)のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体、
(33) 前記 (1)〜(5)の!、ずれかに記載のペプチドと HLA抗原とを含有する HLAモノ マー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一、
(34) 前記 (33)記載の HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAぺ ンタマーを成分として含有する、 Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまた は HIFPH3に由来する腫瘍抗原ペプチド特異的な CTLの検出用試薬、
(35) Lengsin遺伝子、 BJ- TSA- 9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOoriB 遺伝子または HIFPH3遺伝子の塩基配列にお ヽて、連続する少なくとも 15塩基を有 するポリヌクレオチドおよび Zまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドか らなる癌疾患の疾患マーカー、
[0024] (36) 癌疾患の検出においてプローブまたはプライマーとして使用される前記 (35)に 記載の疾患マーカー、
(37) Lengsin遺伝子に関する疾患マーカーが肺腺癌、肺扁平上皮癌または胃癌に 対するものである、前記 (35)または (36)に記載の疾患マーカー、
(38) BJ-TSA-9遺伝子に関する疾患マーカーが白血病、肺腺癌、肺扁平上皮癌、 小細胞肺癌、口腔癌、胃癌、脾臓癌またはリンパ腫に対するものである、前記 (35)ま たは (36)に記載の疾患マーカー、
(39) C20orf42遺伝子に関する疾患マーカーが肺扁平上皮癌、肺腺癌、肝臓癌、胃 癌、白血病、悪性リンパ腫組織、直腸癌、結腸癌または脾臓癌に対するものである、 前記 (35)または (36)に記載の疾患マーカー、
(40) BUB1遺伝子に関する疾患マーカーが乳癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、 口腔扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌 (結腸癌、直腸癌)、胃癌、脾臓癌、肝臓癌、白血 病、リンパ腫またはメラノーマに対するものである、前記 (35)または (36)に記載の疾患 マ1 ~~力' ~~ゝ
[0025] (41) ClOoriB遺伝子に関する疾患マーカーが乳癌、結腸癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌 、卵巣癌、肝臓癌、脾臓癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌、小細胞肺癌またはメラノーマに 対するものである、前記 (35)または (36)に記載の疾患マーカー、
(42) HIFPH3遺伝子に関する疾患マーカーが乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、脾臓癌 、肝臓癌、肺腺癌または肺扁平上皮癌に対するものである、前記 (35)または (36)に記 載の疾患マーカー、
(43) 下記の工程 (a)、（b)および (c)を含む癌疾患の検出方法：
(a)被験者の生体試料カゝら調製された RNAまたは該 RNAから転写された相補的ポリヌ クレオチドと前記 (35)〜(42)のいずれかに記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
(b)該疾患マーカーに結合した生体試料由来の RNAまたは該 RNAから転写された相 補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づ 、て、癌疾患の罹患を判断する工程、
(44) 工程 (c)における癌疾患の罹患の判断が、被験者について得られる測定結果を 正常者につ 、て得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大して いることを指標として行われるものである前記 (43)に記載の癌疾患の検出方法、
(45) Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3を特異的に認識 する抗体を含有する、癌疾患の疾患マーカー、
[0026] (46) 癌疾患の検出においてプローブとして使用される前記 (45)に記載の疾患マーカ (47) 下記の工程 (a)、（b)および (c)を含む癌疾患の検出方法：
(a)被験者の生体試料力も調製されたタンパク質と前記 (45)または (46)に記載の疾患 マーカーとを結合させる工程、
(b)該疾患マーカーに結合した生体試料由来の蛋白質またはその部分ペプチドを、 上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づいて、癌疾患の罹患を判断する工程、ならびに
(48) 工程 (c)における癌疾患の罹患の判断が、被験者について得られる測定結果を 正常者につ 、て得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大して いることを指標として行われるものである前記 (47)に記載の癌疾患の検出方法、に関 する。
発明の効果
[0027] 本発明の新規な腫瘍抗原ペプチドまたはこれらをコードする核酸等は、癌ワクチン として有効に用いることができる。また当該腫瘍抗原ペプチドは、 CTLを検出するた めの HLAテトラマー等の成分としても有効に用いることができる。
発明を実施するための最良の形態
[0028] 以下、本明細書にぉ 、て、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号 による表示は、 IUPAC- IUBの規定〔IUPAC- IUB Communication on Biological Nome nclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細 書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣 用記号に従う。
[0029] 1)本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、 Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOorlS, HIFPH3 の各タンパク質である。
本発明のタンパク質 Lengsinは、配列番号: 2に記載のアミノ酸配列またはそれに類 似するアミノ酸配列を含有する。本発明の Lengsinは、天然物（例えば肺腺癌細胞株 1-87)に由来するタンパク質であってもよぐまた組換えタンパク質であっても良い。こ こで配列番号： 2に記載のアミノ酸配列は、 GenBankデータベースにおいて Accessio n No. NM_016571、 Accession No. NP_057655として登録されたヒト Lengsin(Glutamate -ammonia ligase (glutamine synthase) domain containing 1、 GLULD1とも称する)のァ ミノ酸配列である。当該ヒト Lengsinは非特許文献 7(Mol. Vis. Jun. 15;8: 185- 95 (2002 》により公知である。
[0030] 本発明のタンパク質 BJ-TSA-9は、配列番号: 4に記載のアミノ酸配列またはそれに 類似するアミノ酸配列を含有する。本発明の BJ-TSA-9は、天然物（例えば肺腺癌細 胞株 1-87)に由来するタンパク質であってもよぐまた組換えタンパク質であっても良 い。ここで配列番号： 4に記載のアミノ酸配列は、 GenBankデータベースにおいて Ac cession No. NM_032899、 Accession No. NP_116288として登録されたヒト BJ-TSA-9(H ypothetical protein MGC14128)のアミノ酸配列である。当該ヒト BJ- TSA- 9は非特許 文献 8(Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 99(26): 16899-903 (2002》により公知である。
[0031] 本発明のタンパク質 C20orf42は、配列番号: 6に記載のアミノ酸配列またはそれに 類似するアミノ酸配列を含有する。本発明の C20orf42は、天然物 (例えば結腸癌細 胞株 SW480)に由来するタンパク質であってもよぐまた組換えタンパク質であっても 良い。ここで配列番号: 6に記載のアミノ酸配列は、 GenBankデータベースにおいて Accession No. NM_017671, Accession No. NP_060141として登録されたヒト C20orf42( URP1、 Kindlerinとも称する)のアミノ酸配列である。当該ヒト C20orf42は非特許文献 9( Biochim. Biophys. Acta 1637: 207-216 (2003》により公知である。
[0032] 本発明のタンパク質 BUB1は、配列番号: 8に記載のアミノ酸配列またはそれに類似 するアミノ酸配列を含有する。本発明の BUB1は、天然物（例えば脾臓癌細胞株 PUN )に由来するタンパク質であってもよぐまた組換えタンパク質であっても良い。ここで 配列番号： 8に記載のアミノ酸配列は、 GenBankデータベースにおいて Accession N 0. NM_004336、 Accession No. NP_004327として登録されたヒト BUB1のアミノ酸配列 である。当該ヒト BUB1は文献（Genomics 46:379- 388(1997)により公知である。
[0033] 本発明のタンパク質 ClOoriBは、配列番号： 10に記載のアミノ酸配列またはそれに 類似するアミノ酸配列を含有する。本発明の ClOoriBは、天然物（例えば肺腺癌細胞 株 1-87)に由来するタンパク質であってもよぐまた組換えタンパク質であっても良い 。ここで配列番号： 10に記載のアミノ酸配列は、 GenBankデータベースにおいて Acc ession No. NM_018131、 Accession No. NP_060601として登録されたヒト ClOoriBのアミ ノ酸配列である。当該ヒト ClOoriBは非特許文献 16(Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., De c 24;99(26): 16899-903 (2002》により公知である。
[0034] 本発明のタンパク質 HIFPH3は、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列またはそれに 類似するアミノ酸配列を含有する。本発明の HIFPH3は、天然物 (例えば腎癌細胞株 SMKTR-1)に由来するタンパク質であってもよぐまた組換えタンパク質であっても良 い。ここで配列番号： 12に記載のアミノ酸配列は、 GenBankデータベースにおいて A ccession No. NM_022073、 Accession No. NP_071356として登録されたヒト HIFPH3(egl nine homolog3、 EGLN3とも称する)のアミノ酸配列である。当該ヒト HIFPH3は非特許 文献 17(Cell 107: 43-54 (2001》により公知である。
[0035] 以上に示した Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOorlS, HIFPH3を「本発明 タンパク質」と称する場合がある。
[0036] 前記において「配列番号: 2,4,6,8,10または 12に記載のアミノ酸配列を含有するタン ノ ク質」とは、具体的には、配列番号: 2,4,6,8,10または 12に記載のアミノ酸配列から なるタンパク質、若しくは配列番号: 2,4,6,8, 10または 12に記載のアミノ酸配列を含有 し、その N末端側及び/又は C末端側に他のアミノ酸配列の付加されたアミノ酸配列 力もなるタンパク質が挙げられる。ここで「他のアミノ酸配列」とは本発明タンパク質以 外の構造遺伝子のアミノ酸配列であっても良 、。
[0037] また前記において「配列番号: 2,4,6,8,10または 12に記載のアミノ酸配列に類似する アミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、具体的には以下の (a)〜(c)に挙げるタンパ ク質が挙げられる：
(a)配列番号: 2,4,6,8,10または 12に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァ ミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質であつ て、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するタンパク質、
(b)配列番号: 2,4,6,8, 10または 12に記載のアミノ酸配列と 70%以上の配列同一性を 示すアミノ酸配列を含有するタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タ ンパク質としての活性を有するタンパク質、
(c)配列番号: 2,4,6,8,10または 12に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドによ りコードされるタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質として の活性を有するタンパク質。
[0038] 好ましくは、配列番号: 2,4,6,8, 10または 12に記載のアミノ酸配列に類似するァミノ 酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号: 2,4,6,8, 10または 12に記載のアミ ノ酸配列に類似するアミノ酸配列からなるタンパク質としては、以下の (a')〜( に挙 げるタンパク質が挙げられる：
(a')配列番号: 2,4,6,8,10または 12に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァ ミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されたアミノ酸配列力もなるタンパク質であって、 かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するタンパク質、 (b')配列番号: 2,4,6,8, 10または 12に記載のアミノ酸配列と 70%以上の配列同一性 を示すアミノ酸配列カゝらなるタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タ ンパク質としての活性を有するタンパク質、
(c')配列番号: 2,4,6,8, 10または 12に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドによ りコードされるタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質として の活性を有するタンパク質。
[0039] 前記 (a)における「配列番号: 2,4,6,8, 10または 12に記載のアミノ酸配列において 1若 しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されたアミノ酸配列を含有するタ ンパク質」とは、人為的に作製したいわゆる改変タンパク質や、生体内に存在するァ レル変異体等のタンパク質を意味する。
ここでタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、本発明タンパク質の活 性が保持される限り制限はない。このように活性を喪失することなくアミノ酸残基が、 どのように、何個欠失、置換及び Z又は付加されればよいかを決定する指標は、当 業者に周知のコンピュータプログラム、例えば DNA Star softwareを用いて見出すこと ができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の 10%以内であり、好ましくは全 アミノ酸の 5%以内である。また置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点 から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前の アミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、 Ala, Val、 Leu、 lie 、 Pro、 Met, Phe及び Trpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、 Gly、 S er、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn及び Ginは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であ り、 Asp及び Gluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、また Lys、 Arg及び Hisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として 同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
[0040] 前記 (b)における「配列番号: 2,4,6,8,10または 12に記載のアミノ酸配列と 70%以上 の配列同一性を示すアミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、例えば配列番号: 2,4, 6,8,10または 12に記載のアミノ酸配列と約 70%以上、より好ましくは約 80%以上、さら に好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約 95%以上の配列同一性を示すアミノ酸配 列を含有するタンパク質が挙げられる。具体的には、配列番号: 2,4,6,8,10または 12 に記載のアミノ酸配列の部分配列力 なるタンパク質などが挙げられる。
[0041] ここで「配列同一性」とは、 2つのタンパク質間の、配列の同一性及び相同性をいう 。当該「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にァライン メントされた 2つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のタンパク 質は、 2つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失 (例えばギャップ等 )を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、 Vector NTIを用い て、 ClustalWアルゴリズム (Nucleic Acid Res. ,22(22):4673- 4680(1994))を利用してァラ インメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソ フト、具体的には Vector NTI、 GENETYX- MACや公共のデータベースで提供される 解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページ アドレス http：〃 www. ddbj.nig.ac.jpにお!/、て、一般的に利用可能である。
[0042] 前記 (c)における「配列番号: 2,4,6,8,10または 12に記載のアミノ酸配列をコードする ポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズするポリ ヌクレオチド」とは、例えば配列番号: 2,4,6,8,10または 12に記載のアミノ酸配列をコー ドするポリヌクレオチドと約 40%以上、好ましくは約 60%以上、より好ましくは約 70%以 上、より好ましくは約 80%以上、さらに好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約 95% 以上の配列同一性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。具体 的には、配列番号： 1,3,5,7,9または 11に記載の塩基配列と、約 40%以上、好ましくは 約 60%以上、より好ましくは約 70%以上、より好ましくは約 80%以上、さらに好ましくは 約 90%以上、最も好ましくは約 95%以上の配列同一性を有する塩基配列を含有する ポリヌクレオチドが挙げられる。より具体的には、配列番号： 1,3,5,7,9または 11に記載 の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチドなどが挙げられる。
[0043] ハイブリダィゼーシヨンは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば Mol ecularし loning 2nd Edt. し old Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の ¾本 【こ 記載の方法に従って行うことができる。また市販のライブラリーを使用する場合、添付 の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、 Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego C A)や目 ij 己 Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度 (Tm)に基づ いて決定することができる。
[0044] ハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば、 6 X SSC(20 X SSCは、 333mM Sodiu m citrate, 333mM NaClを示す)、 0.5%SDSおよび 50%ホルムアミドを含む溶液中で 42 °Cにてハイブリダィズさせる条件、または 6 X SSCを含む (50%ホルムアミドは含まな!/、） 溶液中で 65°Cにてハイブリダィズさせる条件などが挙げられる。
またハイブリダィゼーシヨン後の洗浄の条件としては、「1 X SSC、 0.1%SDS、 37°C」程 度の条件を挙げることができる。相補鎖は力かる条件で洗浄しても対象とする正鎖と ノ、イブリダィズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より 厳しいハイブリダィズ条件として「0.5 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」程度、さらに厳しいハイ ブリダィズ条件として「0.1 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」程度の洗浄条件を挙げることがで きる。
[0045] 前記のように本発明タンパク質は、腫瘍抗原タンパク質としての活性を有する。ここ で「腫瘍抗原タンパク質としての活性」とは、既存の腫瘍抗原タンパク質の活性測定 法により活性を示すことを意味する。具体的には、例えば、 Lengsin、 BJ-TSA-9, C20 orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3を発現させた細胞が CTLにより認識される、す なわち当該細胞が CTLに反応性を示す、換言すれば本発明のタンパク質若しくは該 タンパク質に由来する抗原ペプチドが CTLを活性ィ匕する若しくは CTLを誘導するとい う性質を示す。
[0046] 前記にお!、て細胞とは、 HLA抗原を発現する細胞であることが好ま 、。従って前 記腫瘍抗原タンパク質としての活性とは、より具体的には、例えば HLA-A24や HLA- A2等の HLA抗原を発現する細胞において本発明のタンパク質を発現させることによ り、本発明タンパク質由来の抗原ペプチドと HLA抗原との複合体が細胞表面に提示 され、その結果、当該細胞が CTLに認識される、すなわち CTLが活性ィ匕される（CTL が誘導される)と ヽぅ性質を指す。
[0047] このような本発明タンパク質の性質は、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法
(例えば51 Crリリースアツセィ (J.Immunol., 159:4753, 1997)、 LDHリリースアツセィ（LDH Cytotoxicity Detection Kit (タカラバイオ))、サイト力イン量の測定等）により容易に測 定することができる。以下に具体的なアツセィ法を例示する。
[0048] まず、 293-EBNA細胞（Invitrogen社）等の宿主細胞に対し、本発明タンパク質をコ ードする DNAを含有する発現ベクターと、 HLA抗原をコードする DNAを含有する発現 ベクターとをトランスフエタトする。ここで用いる HLA抗原をコードする DNAとしては、例 えば HLA-A24抗原をコードする DNA若しくは HLA-A2抗原をコードする DNAが挙げ られる。 HLA- A24抗原をコードする DNAとしては HLA- A2402の cDNA(Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995)、 Genbank Accession No.M64740)が挙げられる。また HLA- A2 抗原をコードする DNAとしては HLA- A0201の cDNA(GenBank Acc.No.M84379)が挙 げられる。
[0049] 前記トランスフエタトは、例えばリポフエクトァミン試薬 (GIBCO BRL社製)を用いたリ ポフエクチン法などにより行うことができる。その後、用いた HLA抗原に拘束性の CTL を加えて作用させ、該 CTLが反応 (活性化）して産生する種々のサイト力イン、例えば IFN- γの量を、例えば ELISA法などで測定することにより調べることができる。ここで CTLとしては、ヒトの末梢血リンパ球を本発明タンパク質で刺激することにより調製さ れた CTLや、 Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N. Eng. J. Med, 333, 1038-1044, 1 995等に記載の方法により樹立した CTLを用いることができる。
[0050] また本発明タンパク質は、例えばヒトモデル動物を用いたアツセィ（WO 02/47474 号公報、 Int J. Cancer: 100,565-570 (2002))に供することにより、 in vivoでの CTL誘導 活性を調べることができる。
本発明のタンパク質は、天然物 (種々の癌細胞株など)から自体公知のタンパク質 の精製方法によって製造することができる。また後述する本発明のタンパク質をコー ドするポリヌクレオチドを含有する核酸を含有する形質転換体を培養することによって ち製造することがでさる。
[0051] 2)本発明タンパク質由来のペプチド
本発明のペプチドとは、 Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIF PH3に由来する部分ペプチドを含有し、かつ HLA抗原と結合して CTLにより認識され る腫瘍抗原ペプチドである（以下「本発明ペプチド」または「本発明の腫瘍抗原ぺプ チド」と称する場合もある)。すなわち、前記した本発明タンパク質のアミノ酸配列の一 部を含有するペプチドであって、かつ、該ペプチドと HLA抗原との結合複合体が CT Lにより認識されるようなペプチドであれば、本発明タンパク質のアミノ酸配列中の如 何なる位置に存する如何なる長さのペプチドを含有するものであっても良い。
[0052] このような本発明ペプチドは、例えば、 Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 CIO orfiまたは HIFPH3の一部よりなる候補ペプチドを合成し、該候補ペプチドと HLA抗 原との複合体が CTLにより認識されるか否か、すなわち候補ペプチドが腫瘍抗原べ プチドとしての活性を有するか否かをアツセィすることにより、同定することができる。 ここで、ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法 に準じて行うことができる。該公知方法としては文献 (ぺプタイド'シンセシス (Peptide Synthesis) , Interscience, New York, 1966 ;ザ'プロテインズ（The Proteins) , Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976 ;ペプチド合成，丸善（株）， 1975 ;ペプチド合 成の基礎と実験、丸善 (株)， 1985 ;医薬品の開発 続 第 14卷 'ペプチド合成，広川 書店， 1991)などに記載されている方法が挙げられる。
[0053] 次に、本発明の腫瘍抗原ペプチドの同定方法につき記述する。
HLA-A1, -A0201, -A0204, - A0205, - A0206, -A0207, -All, -A24, - A31, - A680 1, -B7, -B8, -B2705, - B37, - Cw0401, - Cw0602などの HLAの型については、該 H LAに結合して提示される抗原ペプチドの配列の規則性 (モチーフ）が判明して 、る ( 例えば Immunogenetics,41:pl78,1995などを参照のこと）。例えば HLA-A24のモチー フとしては、 8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちの第 2位のアミノ酸がチロシン、フエ 二ルァラニン、メチォニンまたはトリプトファンであり、 C末端のアミノ酸がフエ-ルァラ ニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチォニンとなることが知られている（ J.Immunol.,152,p3913,1994、 Immunogenetics,41:pl78,1995、 J.Immunol.,155:p4307, 1994)。また HLA-A2のモチーフについては、以下の表 1に示したモチーフが知られ ている（Immunogenetics,41,pl78,1995、 J.Immunol.,155:p4749, 1995)。
[表 1]
HLA-A2のタイプ N末端から 2番目のアミノ酸 C末端のァミノ酸
HLA-A0201 L , M V , L
HLA-A0204 L し
HLA-A0205 V, L , I , M し
HLA-A0206 V, Q V , L
HLA-A0207 L し
(ぺプチドの長さは 8〜11アミノ酸)
[0055] さらに近年、 HLA抗原に結合可能と予想されるペプチド配列を、インターネット上、 NIHの BIMASのソフトを使用することにより検索することができる（http：〃 bimas.dcrt.ni h.gov/ molbio/hla_bind/ )。
ペプチドの長さとしては、各種 HLA分子に結合している抗原ペプチドの解析により（ Immunogenetics, 41:178, 1995)、通常 8から 14アミノ酸程度であることが明らかにされ ている（ただし HLA-DR、 -DP、 -DQについては、 14アミノ酸以上の長さの抗原べプチ ドも認められる)。
[0056] これらのモチーフに関わるペプチド部分を本発明タンパク質のアミノ酸配列中から 選び出すのは容易である。例えば、前記 BIMASソフトでの検索により、 HLA抗原に 結合可能と予想される配列を容易に選び出すことができる。選び出された候補ぺプ チドを前述の方法にて合成し、該候補ペプチドが HLA抗原と結合して CTLにより認 識されるか否か、すなわち候補ペプチドが腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するか 否かを測定することにより、本発明のペプチドを同定することができる。 本発明の腫瘍抗原ペプチドの具体的な同定法としては、例えば J.Immunol.,154,p2 257,1995に記載の方法が挙げられる。すなわち、候補ペプチドを提示すると考えられ るタイプの HLA抗原が陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、 in vitroで該候補べ プチドを添加して刺激した場合に、該候補ペプチドをパルスした HLA抗原陽性細胞 を特異的に認識する CTLが誘導された場合は、該候補ペプチドが腫瘍抗原ペプチド に成り得ることが示される。ここで CTLの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示 細胞に反応して CTLが産生する種々のサイト力イン (例えば IFN- γ )の量を、例えば ELISA法などによって測定することにより、調べることができる。また51 Crで標識した抗 原ペプチド提示細胞に対する CTLの傷害性を測定する方法 (51Crリリースアツセィ、 In t.J.Cancer,58:p317,1994)によっても調べることができる。
[0057] さらに、候補ペプチドを提示すると考えられるタイプの HLA抗原をコードする cDN Aを発現する発現プラスミドを、例えば 293-EBNA細胞（Invitrogen社）に導入した細 胞に対して候補ペプチドをパルスし、この細胞に対して、前記候補ペプチドを提示す ると考えられるタイプの HLA抗原に拘束性の CTLを反応させ、該 CTLが産生する種 々のサイト力イン (例えば IFN- γ )の量を測定することによつても、調べることができる（ J.Exp.Med.,187: 277,1998)。
ここで HLA抗原としては、 HLA-A24抗原若しくは HLA-A2抗原が挙げられる。 HLA- A24拘束性の腫瘍抗原ペプチドを選択する場合には、前記 HLA抗原をコードする cD NAとしては HLA- A2402の cDNA(Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995)、 Genbank Acc ession No.M64740)を用いることができる。また HLA-A2拘束性の腫瘍抗原ペプチド を選択する場合は、前記 HLA抗原をコードする cDNAとしては HLA-A0201の cDNA( GenBank Acc.No.M84379)を用いることができる。
[0058] また前記 CTLとしては、ヒトの末梢血リンパ球のペプチド刺激により調製される場合 の他、 Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N. Eng. J. Med, 333, 1038-1044, 1995等 に記載の方法により樹立した CTLを用いることができる。
また本発明のペプチドは、例えばヒトモデル動物を用いたアツセィ（WO 02/47474 号公報、 Int J. Cancer: 100,565-570 (2002))に供することにより、 in vivoでの活性を調 ベることができる。 [0059] 前記のように腫瘍抗原ペプチドの配列の規則性 (モチーフ）が判明して 、る場合と 異なり、例えば HLA-B55や HLA-A26のようにそのペプチドのモチーフが明らかでな V、場合は、これらの HLA抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を認識する CTL株が存 在する場合には、例えば W097/46676等に記載の方法に準じて本発明の腫瘍抗原 ペプチドを同定することができる。
[0060] 以上のような本発明のペプチドの具体例としては、配列番号: 2に記載のアミノ酸配 列からなる Lengsin、配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなる BJ-TSA- 9、配列番号 : 6に記載のアミノ酸配列からなる C20orf42、配列番号: 8に記載のアミノ酸配列力 な る BUB1、配列番号： 10に記載のアミノ酸配列力 なる C10orf3、または配列番号： 12 に記載のアミノ酸配列からなる HIFPH3の部分ペプチドであって、かつ HLA抗原と結 合して CTLにより認識されるペプチドが挙げられる。また、本発明のペプチドが結合 する HLA抗原の観点からは、 HLA-A24抗原または HLA-A2抗原に結合する本発明 のペプチドを挙げることができる。ペプチドの長さとして、好ましくは 8〜14アミノ酸が、 より好ましくは 8〜11アミノ酸が挙げられる。
[0061] 具体的には、配列番号： 13〜201のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有し、かつ HLA抗原と結合して CTLにより認識されるペプチドが挙げられる。ペプチドの長さとし て、好ましくは 9〜14アミノ酸力 より好ましくは 9〜11アミノ酸が挙げられる。より具体 的には、例えば HLA-A24結合性の腫瘍抗原ペプチドとしては、配列番号： 13〜配列 番号： 31、配列番号： 42〜配列番号： 49、配列番号： 59〜配列番号： 78、配列番号： 8 9〜配列番号： 117、配列番号： 158〜配列番号： 165、配列番号： 176〜配列番号： 183 、配列番号： 195〜配列番号： 201のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド であって、 HLA-A24抗原に結合して CTLに認識されるペプチドが挙げられる（後述の 表 5, 7,9,11, 13, 15)。好ましくは、配列番号： 42,43,44,45,46,47,49,59,60,61,62,63, 64, 65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159,160,161,15,16,21,22,23,24,25, 26,27,30,195, 197,198,199,200,201, 177,178,179,183に記載のアミノ酸配列からなる ペプチドが挙げられる。
より好ましくは、配列番号： 158,22,23, 26,27,198,200,201, 177,178,179,183に記載の アミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。 [0062] また、 HLA-A2結合性の腫瘍抗原ペプチドとしては、配列番号: 32〜配列番号: 41、 配列番号： 50〜配列番号： 58、配列番号： 79〜配列番号： 88、配列番号： 118〜配列 番号： 157、配列番号： 166〜配列番号： 175、配列番号： 184〜配列番号： 194のいず れかに記載のアミノ酸配列力 なるペプチドであって、 HLA-A2抗原に結合して CTL に認識されるペプチドが挙げられる（後述の表 6,8, 10, 12, 14, 16)。
[0063] 本発明においては、前記の如き配列番号: 2,4,6,8,10または 12に記載のアミノ酸配 列の一部を含有するペプチドのみならず、当該ペプチドの一部を改変した改変ぺプ チドであっても、 HLA抗原と結合して CTLにより認識されるという性質を有する限り、 本発明のペプチドの範疇に含まれる。具体的には、本発明の Lengsin、 BJ-TSA-9、 C 20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3のアミノ酸配列、より具体的には配列番号： 2, 4,6,8,10または 12に記載のアミノ酸配列の一部からなる本発明のペプチドのアミノ酸 配列に対して、 1又はそれ以上のアミノ酸残基の改変を施したアミノ酸配列を含有す る改変ペプチドであって、かつ HLA抗原と結合して CTLにより認識されるという腫瘍 抗原ペプチドとしての活性を有するものは、本発明のペプチドの範疇に含まれる。
[0064] ここで、アミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、及び Z又は付加 ( ペプチドの N末端、 C末端へのアミノ酸の付加も含む）を意味し、好ましくはアミノ酸残 基の置換が挙げられる。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸 残基の数および位置は、腫瘍抗原ペプチドとしての活性が維持される限り、任意であ るが、前記したように通常、腫瘍抗原ペプチドの長さが 8〜14アミノ酸程度であること から、 1個力 数個の範囲が好ましい。
[0065] 本発明の改変ペプチドの長さとしては、 8〜 14アミノ酸程度が好ましい（ただし HLA - DR、 -DP, - DQについては、 14アミノ酸以上の長さの場合もある。 )
先に記載したように、 HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -All, -A24, -A31, -A6801, -B7, - B8, -B2705, -B37, - Cw0401, - Cw0602などの HLAの 型につ 、ては、該 HLAに結合して提示される抗原ペプチドの配列の規則性 (モチ一 フ）が判明している。また前記したように、 HLA抗原に結合可能と予想されるペプチド 配列をインターネット上検索することができる（http：〃 bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_ bind/ ) 0従って、該モチーフ等に基づき、前記改変ペプチドを作製することが可能で ある。
[0066] 例えば HLA-A24に結合して提示される抗原ペプチドのモチーフとしては、前記した ように、 8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちの第 2位のアミノ酸がチロシン、フエ-ル ァラニン、メチォニンまたはトリプトファンであり、 C末端のアミノ酸がフエ-ルァラニン、 ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチォニンであることが知られている（J.Im munol, 152:p3913,1994、 Immunogenetics,41:pl78,1995、 J.Immunol.,155:p4307,199 4)。また HLA-A2の場合は、 8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちの第 2位のアミノ酸 力 イシン、メチォニン、パリン、イソロイシンまたはグルタミンであり、 C末端のアミノ酸 力 Sパリンまたはロイシンであることが知られている（Immunogenetics,41,pl78,1995、 J.I mmunol.,155:p4749,1995)。またインターネット上で HLA抗原に結合可能と予想され るペプチド配列が示されており（http：〃 bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)、例え ば前記モチーフ上とり得るアミノ酸に類似の性質を持つアミノ酸が許容される。従って 、これらモチーフ上アミノ酸の置換が可能な位置（HLA-A24、 HLA-A2においてはぺ プチドの第 2位と C末端）にあるアミノ酸を他のアミノ酸 (好ましくは前記インターネット 等で結合可能と予想されて 、るアミノ酸）に置換したアミノ酸配列を含むものであって 、かつ HLA抗原と結合して CTLにより認識されると ヽぅ活性を持つ改変ペプチドを 挙げることができる。
[0067] より好ましくは、該位置において、前記モチーフ上知られたアミノ酸残基のいずれか に置換したアミノ酸配列を含有するペプチドであって、かつ腫瘍抗原ペプチドとして の活性を有する改変ペプチドが挙げられる。すなわち配列番号： 13〜配列番号: 31、 配列番号： 42〜配列番号： 49、配列番号： 59〜配列番号： 78、配列番号： 89〜配列番 号： 117、配列番号： 158〜配列番号： 165、配列番号： 176〜配列番号： 183、配列番 号： 195〜配列番号： 201に示されるような HLA-A24結合性のペプチドの場合、その 第 2位のアミノ酸をチロシン、フエ-ルァラニン、メチォニンまたはトリプトファンに置換 し、及び/又は C末端のアミノ酸をフエ二ルァラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトフ アンまたはメチォニンに置換したアミノ酸配列を含有するペプチドであって、かつ HLA -A24抗原と結合して CTLにより認識される改変ペプチドが挙げられる。このうち第 2 位のアミノ酸をチロシンに置換したペプチドがより好ましい。 [0068] さらに好ましくは、配列番号： 42,43,44,45,46,47,49,59,60,61,62, 63,64,65,66,67,68, 69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159,160,161,15,16,21,22,23,24,25,26,27,30,195 ,197,198,199,200,201, 177,178,179,183のいずれかに記載のアミノ酸配列の第 2位の アミノ酸をチロシン、フエ-ルァラニン、メチォニンまたはトリプトファンに置換し、及び /又は C末端のアミノ酸をフエ二ルァラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまた はメチォニンに置換したアミノ酸配列からなり、かつ HLA-A24抗原と結合して CTLに より認識されるペプチドが挙げられる。より好ましくは、配列番号： 158,22,23,26,27,19 8,200,201, 177,178,179,183のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して前記の置換を 施し、かつ HLA-A24抗原と結合して CTLにより認識されるペプチドが挙げられる。
[0069] また配列番号： 32〜配列番号： 41、配列番号： 50〜配列番号： 58、配列番号： 79〜 配列番号： 88、配列番号： 118〜配列番号： 157、配列番号： 166〜配列番号： 175、配 列番号： 184〜配列番号： 194に示されるような HLA-A2結合性のペプチドの場合、そ のアミノ酸配列の第 2位のアミノ酸をロイシン、メチォニン、ノ リン、イソロイシンまたは グルタミンに置換し、及び/又は C末端のアミノ酸をパリンまたはロイシンに置換した アミノ酸配列を含有し、かつ HLA-A2抗原と結合して CTLにより認識されるペプチド が好ましい。
[0070] 本発明のペプチドには、さらに、前記本発明の腫瘍抗原ペプチドを含有するェピト ープペプチドも含まれる。
近年、複数の CTLェピトープ (抗原ペプチド）を連結したペプチド (ェピトープぺプ チド）力 効率的に CTL誘導活性を有することが示されている。例えば Journal of lmm unology 1998, 161: 3186-3194には、腫瘍抗原タンパク質 PSA由来の HLA-A2, -A3, -All, B53拘束性 CTLェピトープを連結した約 30merのペプチド力 イン'ビボでそれ ぞれの CTLェピトープに特異的な CTLを誘導したことが記載されている。
[0071] また CTLェピトープとヘルパーェピトープとを連結させたペプチド（ェピトープぺプ チド）により、効率的に CTLが誘導されることも示されている。ここでヘルパーェピトー プとは CD4陽性 T細胞を活性ィ匕させる作用を有するペプチドを指すものであり（Immu nity., 1:751, 1994)、例えば B型肝炎ウィルス由来の HBVcl28— 140や破傷風毒 素由来の TT947— 967などが知られている。当該ヘルパーェピトープにより活性化 された CD4陽性 T細胞は、 CTLの分化の誘導や維持、およびマクロファージなどの エフェクター活性ィ匕などの作用を発揮するため、抗腫瘍免疫応答に重要であると考 えられて!/、る。このようなヘルパーェピトープと CTLェピトープとを連列したペプチド の具体例として、例えば Journal of Immunology 1999, 162: 3915- 3925には、 HBV由 来 HLA-A2拘束性抗原ペプチド 6種類、 HLA-A11拘束性抗原ペプチド 3種類、およ びヘルパーェピトープより構成されるペプチドをコードする DNA (ミニジーン）力 イン 'ビボでそれぞれのェピトープに対する CTLを効果的に誘導したことが記載されてい る。また実際に、 CTLェピトープ (メラノーマ抗原 gplOOの第 280位〜 288位力もなる腫 瘍抗原ペプチド）とヘルパーェピトープ (破傷風毒素由来 Tヘルパーェピトープ）とを 連結したペプチドが臨床試験に供されている（Clinical Cancer Res., 2001,7:3012-30 24)。
従って、前記本発明の腫瘍抗原ペプチドを含む複数のェピトープを連結したぺプ チド (ェピトープペプチド)であって、 CTL誘導活性を有するペプチドも、本発明のぺ プチドの具体例として例示することができる。
[0072] ここに、ェピトープペプチドとは、（1)複数の CTLェピトープ (腫瘍抗原ペプチド）を連 結したペプチド、若しくは (2)CTLェピトープとヘルパーェピトープとを連結したぺプチ ドであって、抗原提示細胞内にてプロセッシングを受け、生じた腫瘍抗原ペプチドが 抗原提示細胞に提示され、 CTL誘導活性を導くペプチドとして定義される。
[0073] ここで、本発明のペプチドに連結させるェピトープが CTLェピトープの場合、用いる CTLェピトープとしては、配列番号: 2に代表される Lengsin、配列番号: 4に代表され る BJ-TSA-9、配列番号： 6に代表される C20orf42、配列番号： 8に代表される BUB1、 配列番号： 10に代表される C10orfi、または配列番号： 12に代表される HIFPH3のアミ ノ酸配列由来の HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -All, -A24 , -A31, -A6801, -B7, - B8, -B2705, - B37,- B55, - Cw0401, - Cw0602などに拘束性 の CTLェピトープが挙げられる。また、他の腫瘍抗原タンパク質由来の CTLェピトー プも挙げられる。これら CTLェピトープは複数個連結することが可能であり、 1つの CT Lェピトープの長さとしては、各種 HLA分子に結合して 、る抗原ペプチドの解析により (Immunogenetics, 41:178, 1995)、 8〜14アミノ酸程度を挙げることができる。 また本発明のペプチドに連結させるェピトープがヘルパーェピトープの場合、用い るヘルパーェピトープとしては、前述のような B型肝炎ウィルス由来の HBVcl28— 1 40や破傷風毒素由来の TT947— 967などが挙げられる。また当該ヘルパーェピト ープの長さとしては、 13〜30アミノ酸程度、好ましくは 13〜17アミノ酸程度を挙げるこ とがでさる。
[0074] このような複数のェピトープを連結させたペプチド（ェピトープペプチド）は、前述の ように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またこれら複数のェピ トープを連結させたェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基 づ 、て、通常の DNA合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。 すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発 現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より 目的の複数のェピトープを連結させたェピトープペプチドを回収することにより製造 することができる。これらの手法は、前述のように文献 (Molecular Cloning, T.Maniatis et al.'CSH Laboratory(1983)、 DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS(1985》に記載 の方法などに準じて行うことができる。
以上のようにして製造された複数のェピトープを連結させたェピトープペプチドを、 前述の in vitroアツセィや、 WO 02/47474号公報および Int J. Cancer: 100,565- 570 ( 2002)に記述のヒトモデル動物を用いた in vivoアツセィに供すること等により CTL誘導 活性を測定することができる。
[0075] さらに、前記本発明の腫瘍抗原ペプチドの N末端アミノ酸のアミノ基、または C末端 アミノ酸のカルボキシル基を修飾することも可能であり、このような修飾に係るぺプチ ドも本発明のペプチドの範疇に含まれる。
ここで N末端アミノ酸のァミノ基の修飾基としては、例えば 1〜3個の炭素数 1から 6 のアルキル基、フ -ル基、シクロアルキル基、ァシル基が挙げられ、ァシル基の具 体例としては炭素数 1から 6のアルカノィル基、フ -ル基で置換された炭素数 1から 6のアルカノィル基、炭素数 5から 7のシクロアルキル基で置換されたカルボ-ル基、 炭素数 1から 6のアルキルスルホ-ル基、フエ-ルスルホ-ル基、炭素数 2から 6のァ ルコキシカルボ-ル基、フエ-ル基で置換されたアルコキシカルボ-ル基、炭素数 5 力 7のシクロアルコキシで置換されたカルボ-ル基、フエノキシカルボ-ル基等が挙 げられる。
C末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したペプチドとしては、例えばエステル体お よびアミド体が挙げられ、エステル体の具体例としては、炭素数 1から 6のアルキルェ ステル、フエ-ル基で置換された炭素数 0から 6のアルキルエステル、炭素数 5から 7 のシクロアルキルエステル等が挙げられ、アミド体の具体例としては、アミド、炭素数 1 力 6のアルキル基の 1つまたは 2つで置換されたアミド、フエ-ル基で置換された炭 素数 0から 6のアルキル基の 1つまたは 2つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子 を含んで 5から 7員環のァザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。
[0076] 3)本発明の核酸
本発明の核酸とは、具体的には、
(1) Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3をコードするポリヌ クレオチドを含有する核酸、
(2)本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
を指す。
[0077] (l)Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3をコードするポリヌ クレオチド及びそれを含有する核酸
Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3をコードするポリヌク レオチドは、種々の細胞や組織、例えば前立腺癌等に由来する細胞や組織の cDN Aや mRNA、 cRNA、ゲノム DNA、または合成 DNAのいずれであっても良い。また 1本 鎖、 2本鎖のいずれの形態であっても良い。具体的には、
(a)配列番号： 1,3,5,7,9または 11に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号: 2,4,6,8, 10または 12に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有 するポリヌクレオチド、
また前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドに類似の塩基配列を含有するポリヌクレオチ ド、が例示される。
[0078] ここで配列番号： 1に記載の塩基配列は、 GenBankデータベースにおいて Accessi on No. NM_016571として登録されているヒト Lengsin遺伝子の塩基配列である。また 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列は、 GenBankデータベースにおいて Accession N 0. NM_016571、 Accession No. NP_057655として登録されているヒト Lengsinのアミノ酸 配列である。当該ヒト Lengsin遺伝子は非特許文献 7(Mol. Vis. Jun. 15;8:185-95 (200 2》により公知である。
[0079] また配列番号： 3に記載の塩基配列は、 GenBankデータベースにおいて Accession
No. NM_032899として登録されているヒト BJ-TSA-9遺伝子の塩基配列である。また 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列は、 GenBankデータベースにおいて Accession N 0. NM_032899、 Accession No. NP_116288として登録されているヒト BJ- TSA- 9のァミノ 酸配列である。当該ヒト BJ- TSA- 9遺伝子は非特許文献 8(Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 99(26): 16899-903 (2002》により公知である。
[0080] また配列番号： 5に記載の塩基配列は、 GenBankデータベースにおいて Accession
No. NM_017671として登録されているヒト C20orf42遺伝子の塩基配列である。また配 列番号： 6に記載のアミノ酸配列は、 GenBankデータベースにおいて Accession No. NM_017671, Accession No. NP_060141として登録されているヒト C20orf42のアミノ酸 配列である。当該ヒト C20orf42遺伝子は非特許文献 9(Biochim. Biophys. Acta 1637: 207-216 (2003》により公知である。
[0081] また配列番号： 7に記載の塩基配列は、 GenBankデータベースにおいて Accession
No. NM_004336として登録されているヒト BUB1遺伝子の塩基配列である。また配列 番号： 8に記載のアミノ酸配列は、 GenBankデータベースにおいて Accession No. N M_004336、 Accession No. NP_004327として登録されているヒト BUB1のアミノ酸配列 である。当該ヒト BUB1遺伝子は文献 (Genomics 46:379-388(1997))により公知である。
[0082] また配列番号： 9に記載の塩基配列は、 GenBankデータベースにおいて Accession
No. NM_018131として登録されているヒト ClOorlB遺伝子の塩基配列である。また配 列番号： 10に記載のアミノ酸配列は、 GenBankデータベースにおいて Accession No. NM_018131、 Accession No. NP_060601として登録されているヒト ClOorBのアミノ酸配 列である。当該ヒト ClOoriB遺伝子は非特許文献 16(Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., D ec 24;99(26): 16899-903 (2002》により公知である。
[0083] また配列番号： 11に記載の塩基配列は、 GenBankデータベースにお 、て Accessio n No. NM_022073として登録されているヒト HIFPH3遺伝子の塩基配列である。また配 列番号： 12に記載のアミノ酸配列は、 GenBankデータベースにおいて Accession No. NM_022073、 Accession No. NP_071356として登録されているヒト HIFPH3のアミノ酸 配列である。当該ヒト HIFPH3遺伝子は非特許文献 17(Cell 107: 43-54 (2001》により 公知である。
[0084] 前記において（a)配列番号： 1,3,5,7,9, 11に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオ チド、 (b)配列番号: 2,4,6,8, 10, 12に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有 するポリヌクレオチドとは、より具体的には、配列番号： 1,3,5,7,9,11に記載の塩基配 列からなるポリヌクレオチド、配列番号: 2,4,6,8,10,12に記載のアミノ酸配列をコード する塩基配列からなるポリヌクレオチドが例示される。さらに、当該配列番号： 1,3,5,7, 9, 11に記載の塩基配列、または配列番号: 2,4,6,8, 10, 12に記載のアミノ酸配列をコー ドする塩基配列の 5'末端側及び/又は 3'末端側に他の塩基配列の付加された塩基 配列からなるポリヌクレオチドが例示される。ここで「他の塩基配列」とは、例えば Leng sinゝ BJ— TSA— 9、 C20orf42、 BUB1、 C10orf3、 HIFPH3以外の構造遺伝子をコードする 塩基配列であっても良い。
これら Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3をコードする ポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質力 腫瘍抗原タ ンパク質としての活性を有すものであれば良 、。当該活性およびその測定法にっ ヽ ては、前記「1)本発明のタンパク質」において記載したとおりである。
[0085] 配列番号： 1に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、 GenBank Accession No. NM_016571において開示されている塩基配列、あるいは本明細書の配列表の配 列番号： 1に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダィゼーシヨンのプロ ーブあるいは PCRのプライマーに用いて、例えば肺腺癌細胞株 (例えば 1-87)由来 の cDNAライブラリーをスクリーニングすることなどによりクローユングすることができる。
[0086] 配列番号： 3に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、 GenBank Accession No. NM_032899において開示されている塩基配列、あるいは本明細書の配列表の配 列番号: 3に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダィゼーシヨンのプロ ーブあるいは PCRのプライマーに用いて、例えば肺腺癌細胞株 (例えば 1-87)由来 の cDNAライブラリーをスクリーニングすることなどによりクローユングすることができる。
[0087] 配列番号： 5に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、 GenBank Accession No. NM_017671において開示されている塩基配列、あるいは本明細書の配列表の配 列番号: 5に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダィゼーシヨンのプロ ーブあるいは PCRのプライマーに用いて、例えば結腸癌細胞株（例えば SW480(ATC C Number:CCL- 228》由来の cDNAライブラリーをスクリーニングすることなどによりク ローニングすることができる。
[0088] 配列番号： 7に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、 GenBank Accession No. NM_004336において開示されている塩基配列、あるいは本明細書の配列表の配 列番号: 7に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダィゼーシヨンのプロ ーブあるいは PCRのプライマーに用いて、例えば脾臓癌細胞株 (例えば PUN)由来の cDNAライブラリーをスクリーニングすることなどによりクローユングすることができる。
[0089] 配列番号： 9に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、 GenBank Accession No. NM_018131において開示されている塩基配列、あるいは本明細書の配列表の配 列番号: 9に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダィゼーシヨンのプロ ーブあるいは PCRのプライマーに用いて、例えば肺腺癌細胞株 (例えば 1-87)由来の cDNAライブラリーをスクリーニングすることなどによりクローユングすることができる。
[0090] 配列番号： 11に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、 GenBank Accessio n No. NM_022073において開示されている塩基配列、あるいは本明細書の配列表の 配列番号： 11に開示されて!、る塩基配列の適当な部分をハイブリダィゼーシヨンのプ ローブあるいは PCRのプライマーに用いて、例えば腎癌細胞株（例えば SMKTR-1)由 来の cDNAライブラリーをスクリーニングすることなどによりクローユングすることができ る。
[0091] 該クローニングは、例えば Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laborat ory Press (1989)等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。
[0092] また、前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドに類似の塩基配列を含有するポリヌクレ ォチドとは、具体的には、
(c)前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下で ハイブリダィズするポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードさ れるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、
(d)前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドと 70%以上の配列同一性を示す塩基配列を 含有するポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされるタン ノ ク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、
(e)前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質において 1若しく は複数のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパ ク質をコードするポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされ るタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、 が挙げられる。
[0093] 好ましくは、前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドに類似の塩基配列力 なるポリヌク レオチドが挙げられる。前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドに類似の塩基配列力 な るポリヌクレオチドとしては、以下の (c')〜(e')に挙げるポリヌクレオチドが挙げられる： (c')前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジヱントな条件下で ハイブリダィズするポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードさ れるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、 (d')前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドと 70%以上の配列同一性を示す塩基配列か らなるポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク 質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、
(e')前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質において 1若しく は複数のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク 質をコードするポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされる タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド。
[0094] 前記にお!、て「前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェント な条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチド」とは、例えば前記 (a)または (b)のポリヌ クレオチドの塩基配列と約 40%以上、好ましくは約 60%以上、より好ましくは約 70% 以上、より好ましくは約 80%以上、さらに好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約 95 %以上の配列同一性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。具 体的には、前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドな どが挙げられる。
[0095] ハイブリダィゼーシヨンは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば Mol ecularし loning 2nd Edt. し old Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の ¾本 【こ 記載の方法に従って行うことができる。また市販のライブラリーを使用する場合、添付 の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、 Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego C A)や目 ij 己 Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度 (Tm)に基づ いて決定することができる。
[0096] ハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば、 6 X SSC(20 X SSCは、 333mM Sodiu m citrate, 333mM NaClを示す)、 0.5%SDSおよび 50%ホルムアミドを含む溶液中で 42 °Cにてハイブリダィズさせる条件、または 6 X SSCを含む (50%ホルムアミドは含まな!/、） 溶液中で 65°Cにてハイブリダィズさせる条件などが挙げられる。
またハイブリダィゼーシヨン後の洗浄の条件としては、「1 X SSC、 0.1%SDS、 37°C」程 度の条件を挙げることができる。相補鎖は力かる条件で洗浄しても対象とする正鎖と ノ、イブリダィズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より 厳しいハイブリダィズ条件として「0.5 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」程度、さらに厳しいハイ ブリダィズ条件として「0.1 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」程度の洗浄条件を挙げることがで きる。
[0097] 前記にお!、て「前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドと 70%以上の配列同一性を示す 塩基配列を含有するポリヌクレオチド」とは、例えば前記 (a)または (b)のポリヌクレオチ ドの塩基配列と約 70%以上、より好ましくは約 80%以上、さらに好ましくは約 90%以 上、最も好ましくは約 95%以上の配列同一性を示す塩基配列を含有するポリヌクレオ チドが挙げられる。具体的には、前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドの部分配列から なるポリヌクレオチドなどが挙げられる。
[0098] ここで「配列同一性」とは、 2つのポリヌクレオチド間の、配列の同一性及び相同性を いう。当該「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にァラ インメントされた 2つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のポリ ヌクレオチドは、 2つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失 (例えば ギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、 Vector NTIを用いて、 ClustalWアルゴリズム (Nucleic Acid Res., 22(22):4673- 4680(1994》を利 用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、 配列解析ソフト、具体的には Vector NTI、 GENETYX- MACや公共のデータベースで 提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホー ムページアドレス http：〃 www.ddbj.nig.a jpにお!/、て、一般的に利用可能である。
[0099] このような配列同一性を有するポリヌクレオチドは、前述のハイブリダィゼーシヨン反 応ゃ通常の PCR反応により、または後述するポリヌクレオチドの改変 (欠失、付加、置 換)反応により作製することができる。
[0100] 前記において「前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質に お!、て 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されたアミノ酸配列を 含有するタンパク質」とは、人為的に作製したいわゆる改変タンパク質や、生体内に 存在するアレル変異体等のタンパク質をコードする核酸を意味する。
ここでタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、本発明タンパク質の活 性が保持される限り制限はない。このように活性を喪失することなくアミノ酸残基が、 どのように、何個欠失、置換及び Z又は付加されればよいかを決定する指標は、当 業者に周知のコンピュータプログラム、例えば DNA Star softwareを用いて見出すこと ができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の 10%以内であり、好ましくは全 アミノ酸の 5%以内である。また置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点 から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前の アミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、 Ala, Val、 Leu、 lie 、 Pro、 Met, Phe及び Trpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、 Gly、 S er、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn及び Ginは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であ り、 Asp及び Gluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、また Lys、 Arg及び Hisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として 同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
[0101] この改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、 Molecular Cloning 2nd
Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に記載の種々の方法 、例えば部位特異的変異誘発や PCR法等によって製造することができる。また市販 のキットを用いて、 Gapped duplex法や Kunkel法などの公知の方法に従って製造する ことちでさる。
[0102] 以上のような本発明タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチ ドによりコードされるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有する。ここで「 腫瘍抗原タンパク質としての活性」とは、既存の腫瘍抗原タンパク質の活性測定法に より活性を示すことを意味する。具体的には、例えば、本発明タンパク質をコードする ポリヌクレオチドを発現させた細胞が CTLにより認識される、すなわち当該細胞が CT Lに反応性を示す、換言すれば本発明タンパク質若しくはそれに由来する抗原ぺプ チドが CTLを活性ィ匕する若しくは CTLを誘導すると ヽぅ性質を示す。当該活性および その測定法については、前記「1)本発明のタンパク質」において記載したとおりであ る。
[0103] 前記本発明のポリヌクレオチドを含有する核酸は、 1本鎖および 2本鎖のいずれの 形態もとることができる。また DNA、 RNAのいずれの形態もとることができる。本発明の ポリヌクレオチドが 2本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿 入することにより、本発明のタンパク質を発現するための組換え発現ベクターを作製 することができる。すなわち本発明の核酸の範疇には、本発明の 2本鎖型ポリヌクレ ォチドを発現ベクターに挿入して作製された組換え発現ベクターも含まれる。
[0104] ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択するこ とができ、プラスミド、ファージベクター、ウィルスベクター等が挙げられる。
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、 pUC118、 pUC119、 pBR322、 pC R3等のプラスミドベクター、 λ ΖΑΡΠ、 gtllなどのファージベクターが挙げられる。宿 主が酵母の場合、ベクターとしては、 pYES2、 pYEUra3などが挙げられる。宿主が昆 虫細胞の場合には、 pAcSGHisNT-Aなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には 、 pCEP4、 pKCR、 pCDM8、 pGL2、 pcDNA3.1、 pRc/RSV、 pRc/CMVなどのプラスミド ベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウィルスべク ターなどのウィルスベクターが挙げられる。
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子 、選択用マーカー遺伝子、ターミネータ一などの因子を適宜有していても良い。
[0105] また、単離精製が容易になるように、チォレドキシン、 Hisタグ、あるいは GST (ダルタ チオン S-トランスフェラーゼ)等との融合タンパク質として発現する配列が付加されて いても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（lac、 tac、 trc、 tr p、 CMV、 SV40初期プロモーターなど）を有する GST融合タンパクベクター（pGEX4T など）や、 Myc、 Hisなどのタグ配列を有するベクター（pcDNA3.1/Myc-Hisなど）、さら にはチォレドキシンおよび Hisタグとの融合タンパク質を発現するベクター（pET32a) などを用いることができる。
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現べクタ 一を含有する形質転換細胞を作製することができる。
[0106] ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げら れる。大腸菌としては、 E.coli K- 12系統の HB101株、 C600株、 JM109株、 DH5 α株、 AD494(DE3)株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス'セルビジェなど が挙げられる。動物細胞としては、 L929細胞、 BALB/c3T3細胞、 C127細胞、 CHO細 胞、 COS細胞、 Vero細胞、 Hela細胞、 293-EBNA細胞などが挙げられる。昆虫細胞と しては sl9などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の 導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、 DEAE-デキストラン法、 エレクト口ポレーシヨン法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、 Lipofectin; Gibco- B RL社)を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地に て培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞 を選択することができる。
[0107] 以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより 、本発明タンパク質を製造することができる。得られたタンパク質は、一般的な生化学 的精製手段により、さらに単離'精製することができる。ここで精製手段としては、塩析 、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ァフィユティークロマトグラフ ィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のタンパク質を、前述 のチォレドキシンや Hisタグ、 GST等との融合タンパク質として発現させた場合は、こ れら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離'精製することができる
[0108] (2)本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド及びそれを含有する核酸
前述のように本発明の核酸の範疇には、本発明のペプチドをコードするポリヌクレ ォチドを含有する核酸も含まれる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、 DNAの形態であっても RNAの形 態であっても良い。また 1本鎖、 2本鎖のいずれの形態であっても良い。これら本発明 のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報お よびそれによりコードされる DNAの配列情報に基づき容易に製造することができる。 具体的には、通常の DNA合成や PCRによる増幅などによって、製造することができる
[0109] 本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、具体的には、前記ェピトープぺ プチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸は、 1本鎖および 2 本鎖のいずれの形態もとることができる。また DNA、 RNAのいずれの形態もとることが できる。本発明のポリヌクレオチドが 2本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを 発現ベクターに挿入することにより、本発明のペプチド (ェピトープペプチド)を発現 するための組換え発現ベクターを作製することができる。
ここで用いる発現ベクターや宿主細胞、宿主細胞の形質転換方法等については、 前述の (1)と同様である。
[0110] 4)本発明の抗原提示細胞
前記した本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸の ヽずれかと抗原提示能を有 する細胞とをイン'ビトロで接触させることにより、抗原提示細胞を作製することができ る。具体的には本発明は、腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞と、 本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれかとをイン'ビトロで接触させるこ とを特徴とする抗原提示細胞の製造方法、および当該製造方法により製造される抗 原提示細胞を提供するものである。
[0111] ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示することの可能な HLA抗原を細胞表面に発現する細胞であれば特に限定されな ヽが、特に抗原提示 能が高!、とされる榭状細胞が好ま 、。
また、前記抗原提示能を有する細胞から本発明の抗原提示細胞を調製するために 添加される物質としては、本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれであつ ても良い。
[0112] 本発明の抗原提示細胞は、腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細 胞に本発明のタンパク質またはペプチドをイン'ビトロでパルスして、 HLA抗原と本発 明のペプチドとの複合体を提示させることにより得られる (Cancer Immunol. Immunothe r.,46:82,1998、 J.Immunol.,158,pl796,1997、 Cancer Res.,59,pll84,1999)。榭状細胞 を用いる場合は、例えば、腫瘍患者の末梢血カもフイコール法によりリンパ球を分離 し、その後非付着細胞を除き、付着細胞を GM-CSFおよび IL-4存在下で培養して榭 状細胞を誘導し、当該榭状細胞を本発明のタンパク質またはペプチドと共に培養し てノルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明の核酸を導入することにより本発明 の抗原提示細胞を調製する場合は、当該核酸は、 DNAの形態であっても、 RNAの形 態であっても良い。具体的には、 DNAの場合は Cancer Res.,56:p5672,1996や J.Imm unol.,161: p5607, 1998などを参考にして行うことができ、また RNAの場合は J.Exp.Me d.， 184: p465,1996などを参考にして行うことができる。
[0113] 本発明の抗原提示細胞は、本発明のペプチドと HLA抗原との複合体の提示された 抗原提示細胞であれば良ぐ具体的には、例えば配列番号: 42,43,44,45,46,47,49,5 9,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159,160,161,15,1 6,21,22,23,24,25,26,27,30,195, 197,198,199,200,201, 177,178,179または 183に記載 のアミノ酸配列からなるペプチド（好ましくは配列番号： 158,22,23,26,27, 198,200,201, 177,178,179または 183に記載のアミノ酸配列力 なるペプチド）と HLA-A24抗原との 複合体が榭状細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞を挙げることができる。当 該抗原提示細胞は、例えば HLAの型が HLA-A24である前立腺癌患者カゝら抗原提示 能を有する細胞を単離し、該細胞に、配列番号： 42,43,44,45,46,47,49,59,60,61,62,6 3,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159,160,161,15,16,21,22,23,2 4,25,26,27,30,195, 197,198,199,200,201, 177,178,179または 183に記載のアミノ酸配 列からなるペプチド（好ましくは配列番号： 158,22,23,26,27,198,200,201,177,178,179 または 183に記載のアミノ酸配列からなるペプチド）をイン'ビトロでパルスし、 HLA-A2 4抗原と前記ペプチドとの複合体を提示させることにより得られる。
[0114] 5)本発明の CTL
本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれかと末梢血リンパ球とをイン'ビ トロで接触させることにより、 CTLを誘導することができる。具体的には本発明は、腫 瘍患者由来の末梢血リンパ球と、本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいず れカとをイン'ビトロで接触させることを特徴とする CTLの誘導方法、および当該方法 により誘導される CTLを提供するものである。
[0115] 例えばメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤 T細胞を体外で大量に培養 し、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている (J.Natl.Cancer.Ins t.,86:1159 、 1994) oまたマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をイン'ビトロで腫瘍 抗原ペプチド TRP-2で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的な CTLを増殖させ、該 CT Lをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J.Exp.Me d., 185:453,1997 ) 0これは、抗原提示細胞上の HLA抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複 合体を特異的に認識する CTLを、イン'ビトロで増殖させた結果に基づくものである。 従って、本発明のタンパク質、ペプチドまたは核酸を用いて、イン'ビトロで患者末梢 血リンパ球を刺激して腫瘍特異的 CTLを増やした後、この CTLを患者に戻す治療法 は有用であると考えられる。
[0116] 養子免疫療法において用いられる CTLは、患者の末梢血リンパ球を単離し、これを 本発明のタンパク質、ペプチド、あるいは核酸でイン'ビトロで刺激することにより作製 される (Journal of Experimental Medicine 1999, 190:1669)。
[0117] 本発明の CTLは、本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれかと末梢血リ ンパ球とをイン'ビトロで接触させることにより誘導されたものであれば良ぐ単一の CT Lクローンであっても、様々な種類のクローン力もなる CTL混合物 (集団)であっても良 い。具体的には、例えば配列番号： 42,43,44,45,46,47,49,59,60,61, 62,63,64,65, 66,6 7,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159,160,161,15,16,21,22,23,24,25,26,27,3 0,195, 197,198,199,200,201, 177,178,179または 183に記載のアミノ酸配列からなるぺ プチドと HLA-A24抗原との複合体を特異的に認識する CTLを挙げることができる。よ り好ましくは、配列番号： 158,22,23,26,27,198,200,201, 177,178,179または 183に記載 のアミノ酸配列力 なるペプチドと HLA-A24抗原との複合体を特異的に認識する CT Lを挙げることがでさる。
[0118] 6)本発明の医薬組成物
以上に記載した本発明のタンパク質、ペプチド、核酸、抗原提示細胞および CTLは 、それぞれの物質に応じた適切な形態とすることにより、医薬組成物の有効成分とす ることができる。本発明の医薬組成物は、 CTLの誘導剤、すなわち癌ワクチンの有効 成分として使用することができる。以下具体的に説明する。
[0119] (1)本発明タンパク質を有効成分とする CTLの誘導剤
本発明のタンパク質 (Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 C10orf3、 HIFPH3)は CTLの誘導作用を有するため、腫瘍の治療または予防のための医薬 (癌ワクチン)の 有効成分とすることができる。すなわち本発明のタンパク質を有効成分として含有す る CTLの誘導剤は、腫瘍を治療または予防し得るものである。当該タンパク質を腫瘍 患者に投与すると、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生 じた腫瘍抗原ペプチドが HLA抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示 細胞表面に提示され、この複合体に特異的な CTLが体内で効率的に増殖し、腫瘍 細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療又は予防が達成される。
[0120] 本発明のタンパク質を有効成分とする CTLの誘導剤は、 Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20o rf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3陽性の如何なる腫瘍患者に対しても使用するこ とがでさる。
具体的には、例えば Lengsinを有効成分とする CTLの誘導剤は、肺腺癌、肺扁平上 皮癌または胃癌などの癌 (腫瘍)の予防または治療のために使用することができる。 また BJ-TSA-9を有効成分とする CTLの誘導剤は、白血病、肺腺癌、肺扁平上皮癌 、小細胞肺癌、口腔癌、胃癌、脾臓癌またはリンパ腫などの癌 (腫瘍)の予防または 治療のために使用することができる。
[0121] また C20orf42を有効成分とする CTLの誘導剤は、肺扁平上皮癌、肺腺癌、肝臓癌 、胃癌、白血病、悪性リンパ腫組織、直腸癌、結腸癌または脾臓癌などの癌 (腫瘍） の予防または治療のために使用することができる。
また BUB1を有効成分とする CTLの誘導剤は、乳癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣 癌、口腔扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌 (結腸癌、直腸癌)、胃癌、脾臓癌、肝臓癌、 白血病、リンパ腫またはメラノーマなどの癌 (腫瘍)の予防または治療のために使用 することができる。
[0122] また ClOoriBを有効成分とする CTLの誘導剤は、乳癌、結腸癌、直腸癌、腎臓癌、 胃癌、卵巣癌、肝臓癌、脾臓癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌、小細胞肺癌またはメラノ一 マなどの癌 (腫瘍)の予防または治療のために使用することができる。
また HIFPH3を有効成分とする CTLの誘導剤は、乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、脾 臓癌、肝臓癌、肺腺癌または肺扁平上皮癌などの癌 (腫瘍)の予防または治療のた めに使用することができる。
[0123] 本発明のタンパク質を有効成分として含有する CTLの誘導剤は、細胞性免疫が効 果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバント と混合して投与、又は併用して投与することができる。
[0124] アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev., 7:277-289, 1994)に記載のものな どが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分又はその誘導体、サイト力イン、植 物由来成分又はその誘導体、海洋生物由来成分又はその誘導体、水酸化アルミ二 ゥムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プル口ニックポリオールの如き界面活性剤、ポリア 二オン、ペプチド、または油乳濁液 (エマルシヨン製剤）などを挙げることができる。ま た、リボソーム製剤、直径数 mのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結 合させた製剤、マイクロスフェアー製剤、マイクロカプセル製剤なども考えられる。
[0125] 前記において菌体由来成分又はその誘導体とは、具体的には、例えば (1)細菌の 死菌、（2)細菌由来の細胞壁骨格 (Cell Wall Skeleton, CWSと略する）、（3)菌体由来 の特定の成分又はその誘導体等に分類される。ここで (1)細菌の死菌としては、例え ば溶連菌粉末 (例えばピシバニール；中外製薬株式会社)、死菌浮遊物カクテル (例 えばブロンカスマ ·ベルナ；三和化学研究所）、あるいはヒト型結核菌の死菌等が挙げ られる。
(2)細菌由来の CWSとしては、マイクバクテリア属由来の CWS (例えばマイコバクテリ ァ属ゥシ型結核菌である BCG株の CWS)、ノカルディア属由来の CWS (例えばノカル ディア'ノブラの CWS)、あるいはコリネバクテリア属由来の CWS等が挙げられる。
[0126] (3)菌体由来の特定の成分又はその誘導体としては、例えば菌体由来多糖類であ るヒト型結核菌由来多糖類成分 (例えばアンサー；ゼリア新薬工業株式会社)や担子 菌由来多糖類 (例えばレンチナン;味の素、クレスチン;三共株式会社、担子菌カワラ タケ）、またムラミルジペプチド (MDP)関連化合物、リポ多糖 (LPS)、リピド A関連化合 物（MPL)、糖脂質トレハロースジマイコレート（TDM)、細菌由来の DNA (例えば CpG オリゴヌクレオチド）、あるいはこれらの誘導体などが挙げられる。
これら菌体由来成分及びその誘導体は、既に市販されているものであればそれを 入手するか、又は公知文献（例えば Cancer Res.,33,2187- 2195(1973)、 J.Natl.Cancer Inst.,48,831- 835(1972)、 J.Bacteriol.,94,1736- 1745(1967)、 Gann,69,619- 626(1978) 、 J.Bacteriol.,92, 869- 879(1966)、 J.Natl.Cancer Inst.,52,95- 101(1974))等に基づき 単離又は製造することが可能である。
[0127] 前記において「サイト力イン」とは、例えば IFN- α、 IL- 12、 GM- CSF、 IL- 2、 IFN- γ 、 IL-18、あるいは IL-15などが挙げられる。これらのサイト力インは、天然品であっても 遺伝子組換え品であっても良い。これらのサイト力インは、既に市販されていればそ れを入手して使用することができる。また遺伝子組換え品であれば、例えば GenBank 、 EMBL、あるいは DDBJ等のデータベースにおいて登録されている各塩基配列に基 き、常法により所望の遺伝子をクローニングし、適当な発現ベクターに連結して作製 された組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、発現 '生産すること ができる。
[0128] 前記において「植物由来成分又はその誘導体」とは、例えばサポニン由来成分で aooQuil A (Accurate Chemical&Scientificし orp)、 Q¾-21 (Aquila Biopharmaceutical s inc.)、あるいはグリチルリチン（SIGMA-ALDRICHなど）などが挙げられる。 前記において「海洋生物由来成分又はその誘導体」とは、例えば海綿由来の糖脂 質である (X -ガラタトシルセラミドなどが挙げられる。
前記にぉ 、て油乳濁液 (エマルシヨン製剤）とは、例えば油中水型 (w/o)エマルショ ン製剤、水中油型 (o/w)エマルシヨン製剤、水中油中水型 (w/o/w)エマルシヨン製剤 などが挙げられる。
[0129] ここで油中水型 (w/o)エマルシヨン製剤は、有効成分を水の分散相に分散させた 形態をとる。水中油型 (o/w)エマルシヨン製剤は、有効成分を水の分散媒に分散さ せた形態をとる。また水中油中水型 (w/o/w)エマルシヨン製剤は、有効成分を最内 相の水の分散相に分散させた形態をとる。このようなエマルシヨン製剤の調製は、例 えば、特開平 8— 985号公報、特開平 9— 122476号公報等を参考にして行うことが できる。
[0130] 前記においてリボソーム製剤とは、有効成分を脂質二重膜構造のリボソームで水相 内または膜内に包み込んだ形の微粒子である。リボソームを作るための主要な脂質 としては、ホスファチジルコリン、スフインゴミエリン等が挙げられ、これにジセチルホス フェート、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン等をカ卩えてリボソームに荷電を与え て安定ィ匕させる。リボソームの調製方法としては、超音波法、エタノール注入法、エー テル注入法、逆相蒸発法、フレンチプレスェクストラクシヨン法等が挙げられる。
[0131] 前記においてマイクロスフェアー製剤は、均質な高分子マトリックス力も構成され、 該マトリックス中に有効成分が分散された形の微粒子である。マトリックスの材料として は、アルブミン、ゼラチン、キチン、キトサン、デンプン、ポリ乳酸、ポリアルキルシアノ アタリレート等の生分解性高分子が挙げられる。マイクロスフェアー製剤の調製方法 としては公知の方法（Eur. J. Pharm. Biopharm. 50:129-146, 2000、 Dev. Biol. Stand. 92:63-78, 1998、 Pharm. Biotechnol. 10:1-43, 1997)等に従えばよく特に限定されな い。
[0132] 前記にお!ヽてマイクロカプセル製剤は、有効成分を芯物質として被膜物質で覆つ た形の微粒子である。被膜物質に用いられるコーティング材料としては、カルボキシメ チノレセノレロース、セノレロースアセテートフタレート、ェチノレセノレロース、ゼラチン、ゼラ チン'アラビアゴム、ニトロセルロース、ポリビュルアルコール、ヒドロキシプロピルセル ロース等の膜形成性高分子が挙げられる。マイクロカプセル製剤の調製方法は、コア セルべーシヨン法、界面重合法等が挙げられる。
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げら れる。製剤中の本発明のタンパク質の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体 重等により適宜調整することができる力 通常 0.0001mg〜1000mg、好ましくは 0.001 mg〜100mg、より好ましくは 0.01mg〜10mgであり、これを数日ないし数月に 1回投与 するのが好ましい。
[0133] (2)本発明のペプチドを有効成分とする CTLの誘導剤
本発明のペプチドは CTL誘導活性を有する。誘導された CTLは、細胞傷害作用や リンフォカインの産生を介して抗腫瘍作用を発揮することができる。従って本発明の ペプチドは、腫瘍の治療または予防のための医薬 (癌ワクチン)の有効成分とすること ができる。本発明のペプチドを有効成分として含有する CTLの誘導剤を腫瘍患者に 投与すると、抗原提示細胞の HLA抗原に本発明のペプチドが提示され、提示された HLA抗原とペプチドとの結合複合体特異的 CTLが増殖して腫瘍細胞を破壊すること ができ、従って、患者の腫瘍を治療又は予防することができる。
本発明のペプチドを有効成分とする CTLの誘導剤は、本発明タンパク質陽性の如 何なる腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前記 6)-(1)に 示した癌 (腫瘍)の予防または治療のために使用することができる。
[0134] 本発明のペプチドを有効成分とする CTLの誘導剤は、単一の CTLェピトープ (本発 明のペプチド）を有効成分とするものであっても、また他のペプチド（CTLェピトープ やヘルパーェピトープ）と連結したェピトープペプチドを有効成分とするものであって も良い。近年、複数の CTLェピトープ (抗原ペプチド)を連結したェピトープペプチド 力 イン'ビボで効率的に CTL誘導活性を有することが示されている。例えば Journal of Immunology 1998, 161: 3186- 3194には、腫瘍抗原タンパク質 PSA由来の HLA- A2 , -A3, -All, B53拘束性 CTLェピトープ（抗原ペプチド）を連結した約 30merのェピト ープペプチド力 S、イン.ビボでそれぞれの CTLェピトープに特異的な CTLを誘導した ことが記載されて 、る。また CTLェピトープとヘルパーェピトープとを連結させたェピ トープペプチドにより、効率的に CTLが誘導されることも示されている。このようなェピ トープペプチドの形態で投与した場合、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細 胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドが HLA抗原と結合して複合体を形成し 、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的な CTL が体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。このようにして腫瘍の治療または 予防が達成される。
[0135] 本発明のペプチドを有効成分とする CTLの誘導剤として、より具体的には、例えば 配列番号： 13〜配列番号： 201の 、ずれかに記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原べ プチドを有効成分とする CTLの誘導剤が挙げられる。好ましくは配列番号： 42,43,44, 45,46,47,49,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159, 160,161, 15, 16,21, 22,23,24,25, 26,27,30,195, 197,198,199,200,201, 177,178,179また は 183に記載のアミノ酸配列力 なるペプチドを有効成分とする CTLの誘導剤が挙げ られる。より好ましくは、配列番号： 158,22,23, 26,27,198,200,201, 177,178,179または 1 83に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする CTLの誘導剤が挙げら れる。
[0136] 本発明のペプチドを有効成分とする CTLの誘導剤は、細胞性免疫が効果的に成 立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントと混合して 投与、又は併用して投与することができる。
アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev., 7:277-289, 1994)に記載のものな どが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分又はその誘導体、サイト力イン、植 物由来成分又はその誘導体、海洋生物由来成分又はその誘導体、水酸化アルミ二 ゥムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プル口ニックポリオールの如き界面活性剤、ポリア 二オン、ペプチド、または油乳濁液 (エマルシヨン製剤）などを挙げることができる。ま た、リボソーム製剤、直径数 mのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結 合させた製剤、マイクロスフェアー製剤、マイクロカプセル製剤なども考えられる。これ らアジュバントの具体例については、前記「6)-(1)本発明タンパク質を有効成分とする CTLの誘導剤」の項を参照された！、。
[0137] 投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げら れる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重 等により適宜調整することができる力 通常 0.0001mg〜1000mg、好ましくは O.OOlmg 〜1000mg、より好ましくは O.lmg〜10mgであり、これを数日ないし数月に 1回投与す るのが好ましい。
[0138] (3)本発明の核酸を有効成分とする CTLの誘導剤
本発明の核酸は CTLの誘導作用を有するため、腫瘍の治療または予防のための 医薬 (癌ワクチン)の有効成分とすることができる。本発明の核酸を有効成分として含 有する CTLの誘導剤は、例えば、本発明の核酸を腫瘍患者に投与し発現させること で、腫瘍を治療または予防し得るものである。
[0139] 例えば発現ベクターに組み込まれた本発明の核酸を以下の方法により腫瘍患者に 投与すると、抗原提示細胞内で腫瘍抗原タンパク質が高発現する。その後、細胞内 分解を受けて生じた腫瘍抗原ペプチドが HLA抗原と結合して複合体を形成し、該複 合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示されることにより、腫瘍特異的 CTLが体 内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療または予 防が達成される。
本発明の核酸を有効成分とする CTLの誘導剤は、本発明タンパク質陽性の如何な る腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前記 6)_(1)に示し た癌 (腫瘍)の予防または治療のために使用することができる。
[0140] 本発明の核酸を投与し細胞内に導入する方法としては、ウィルスベクターによる方 法およびその他の方法（日経サイエンス， 1994年 4月号， 20-45頁、月刊薬事， 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊， 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等）のいずれ の方法も適用することができる。
ウィルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ 関連ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルス、ポリオウィル ス、シンビスウィルス等の DNAウィルス又は RNAウィルスに本発明の DNAを組み 込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ 関連ウィルス、ワクシニアウィルス等を用いた方法が特に好ま 、。
[0141] その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法 (DNAヮクチ ン法）、リボソーム法、リポフエクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム 法、エレクト口ポレーシヨン法等が挙げられ、特に DNAワクチン法、リボソーム法が好 ましい。
本発明の核酸を実際に医薬として作用させるには、当該核酸を直接体内に導入す る in vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外で核酸を該細胞に導入しその 細胞を体内に戻す ex vivo法がある（日経サイエンス， 1994年 4月号， 20-45頁、月刊 薬事， 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊， 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献 等)。 in vivo法がより好ましい。
[0142] in vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経 路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することが できる。 in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一 般的には有効成分である本発明の核酸を含有する注射剤等とされ、必要に応じて、 医薬上許容されるキャリアー (担体)を加えてもよい。また、本発明の核酸を含有する リボソームまたは膜融合リボソーム（センダイウィルス（HJV)-リボソーム等）にお ヽては 、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリボソーム製剤の形態とすることができ る。
製剤中の本発明の核酸の含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適 宜調整することができる力 通常、核酸中のポリヌクレオチドの含量として、 O.OOOlmg 〜100mg、好ましくは 0.001mg〜10mgの本発明の核酸を、数日ないし数月に 1回投与 するのが好ましい。
[0143] また近年、複数の CTLェピトープ (腫瘍抗原ペプチド)を連結したェピトープぺプチ ドをコードするポリヌクレオチド、ある 、は CTLェピトープとヘルパーェピトープとを連 結させたェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド力 in vivoで効率的に CTL 誘導活性を有することが示されている。例えば Journal of Immunology 1999, 162: 391 5-3925には、 HBV由来 HLA-A2拘束性抗原ペプチド 6種類、 HLA-A11拘束性抗原 ペプチド 3種類、およびヘルパーェピトープを連結したェピトープペプチドをコードす る DNA (ミニジーン）力 イン'ビボでそれぞれのェピトープに対する CTLを効果的に 誘導したことが記載されて 、る。
従って、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを 1種または 2種以上連結さ せることにより、また場合によっては他のペプチドをコードするポリヌクレオチドも連結 させることにより作製されたポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込むことに より、 CTLの誘導剤の有効成分とすることができる。このような CTLの誘導剤も、前記 と同様の投与方法および投与形態をとることができる。
[0144] (4)本発明の抗原提示細胞を有効成分とする CTLの誘導剤
本発明の抗原提示細胞は CTLの誘導作用を有するため、腫瘍の治療または予防 のための医薬 (癌ワクチン)の有効成分とすることができる。本発明の抗原提示細胞を 有効成分として含有する CTLの誘導剤は、本発明の抗原提示細胞を腫瘍患者に投 与することで、腫瘍を治療または予防し得るものである。
本発明の抗原提示細胞を有効成分とする CTLの誘導剤は、本発明タンパク質陽性 の如何なる腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前記 6)-（ 1)に示した癌 (腫瘍)の予防または治療のために使用することができる。
[0145] 抗原提示細胞を有効成分として含有する CTLの誘導剤は、抗原提示細胞を安定 に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS)、培地等を含むことが 好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また 投与量は、前記文献記載の投与量が例示される。このような抗原提示細胞を有効成 分として含有してなる CTLの誘導剤を患者の体内に戻すことにより、本発明タンパク 質陽性の患者の体内で効率良く特異的な CTLが誘導され、腫瘍を治療することがで きる。
[0146] (5)本発明の CTLを有効成分とする癌ワクチン
本発明の CTLは腫瘍細胞傷害作用を有するため、腫瘍の治療または予防のため の医薬 (癌ワクチン)の有効成分とすることができる。
本発明の CTLを有効成分とする腫瘍の治療または予防薬は、本発明タンパク質陽 性の如何なる腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前記 6) -(1)に示した癌 (腫瘍)の予防または治療のために使用することができる。
CTLを有効成分として含有する腫瘍の治療または予防薬は、 CTLを安定に維持す るために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS)、培地等を含むことが好ましい 。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。このような CT Lを有効成分として含有してなる腫瘍の治療または予防剤を患者の体内に戻すこと により、本発明タンパク質陽性の患者の体内で CTLによる腫瘍細胞の傷害作用が促 進され、腫瘍細胞を破壊することにより、腫瘍を治療することができる。
[0147] 7)本発明のペプチドに対する抗体
本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体 は、その形態に特に制限はなぐ本発明のペプチドを免疫抗原とするポリクローナル 抗体であっても、またモノクローナル抗体であっても良!、。
本発明の抗体は前記のように本発明のペプチドに特異的に結合するものであれば 特に制限されないが、具体的には、配列番号： 13〜201のいずれかに記載のアミノ酸 配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体が挙げられる。好ましくは、配列番号 : 42,43,44,45,46,47,49,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,7 8, 158,159,160,161, 15,16,21,22,23,24,25,26,27,30,195,197,198, 199,200,201,177, 17 8, 179または 183に記載のアミノ酸配列力 なるペプチドに特異的に結合する抗体が 挙げられる。より好ましくは、配列番号： 158,22, 23,26,27,198,200,201, 177,178,179ま たは 183に記載のアミノ酸配列力 なるペプチドに特異的に結合する抗体が挙げられ る。
[0148] これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従 つて製造すること; 0できる (し urrent protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et a 1. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜丄丄 .13、 Antibodies; A Labora tory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press出版 New York 1989)。
[0149] 具体的には、本発明のペプチド（例えば配列番号： 42,43,44,45,46,47,49,59,60,61, 62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158, 159,160,161,15, 16,21,22, 23, 24,25,26,27,30,195, 197,198, 199,200,201, 177,178, 179または 183のいずれかに記 載のアミノ酸配列力 なるペプチド)を免疫原として用い、家兎等の非ヒト動物を免疫 し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナ ル抗体の場合には、本発明のペプチド（例えば配列番号： 42,43,44,45,46,47,49,59,6 0,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159,160, 161,15,16,2 1,22,23,24,25,26,27,30,195, 197,198,199,200,201, 177,178,179または 183のいずれか に記載のアミノ酸配列からなるペプチド)をマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた 脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイプリドーマ細胞の中から得 ること; 0できる (し urrent protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Pu Wish. John Wiley and Sons. Section 11.4：〜 11.11)。
[0150] 本発明のペプチドに対する抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用い て免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。そのようなアジュバントには、 フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン 、プル口-ックポリオル、ポリア-オン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットへモ シァニンおよびジニトロフエノールのような表面活性物質、 BCG (カルメット ゲラン 桿菌）やコリネバタテリゥム-パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
[0151] 以上のように本発明のペプチドを用いて常法により適宜動物を免疫することにより、 ペプチドを認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。 抗体の用途としては、ァフィユティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられ る。免疫学的診断は、ィムノブロット法、放射免疫測定法 (RIA)、酵素免疫測定法 (E LISA)、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学的診断は 、本発明タンパク質をコードする遺伝子が発現して ヽる癌の診断にぉ 、て有効である
[0152] 8)本発明の HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーおよび HLAペンタマ一
本発明はまた、本発明の腫瘍抗原ペプチドと HLA抗原とを含有する HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一を提供する。
癌免疫療法において、治療前に腫瘍抗原 (腫瘍抗原ペプチド）に対する CTL前駆 細胞の頻度や量を予め調べることや、腫瘍抗原 (腫瘍抗原ペプチド）による治療実施 中の患者における CTLの頻度や量を調べることは、当該腫瘍抗原 (腫瘍抗原べプチ ド）に対する応答性が高い患者の選択や、治療効果のモニタリング、治療の適合性 の判定などにお!ヽて重要な指標となる。腫瘍抗原ペプチドと HLA抗原とを含有する H LAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーおよび HLAペンタマ一は、抗原（抗原べ プチド)特異的 CTLの検出、すなわち当該 CTLの頻度や量を測定するための試薬と して有用である。
[0153] ここで HLAテトラマーとは、 HLA抗原の α鎖と j8 2ミクログロブリンをペプチド（抗原べ プチド）と会合させた複合体 (HLAモノマー）をピオチン化し、アビジンに結合させるこ とにより 4量体化したものを指す（Science 279: 2103-2106(1998)、 Science 274: 94-96 (1996》。
HLAモノマーとは前記 HLAテトラマーの製造において用いられる、 HLA抗原 α鎖、 β 2ミクログロブリン、抗原ペプチドの会合体をピオチンィ匕したもの（単量体)を指す。
[0154] HLAダイマーとは HLA抗原 oc鎖と Ig (ィムノグロブリン、例えば IgGl)とを融合させ、こ れに 13 2ミクログロブリン、抗原ペプチドを結合させたものを指す (Pro Natl.Acad.Sci. USA 90:6671-6675(1993))。 HLAダイマーに結合した抗原ペプチド特異的 CTLは、例 えば標識抗 IgGl抗体を IgGlに結合させることなどにより、検出することができる。
HLAペンタマ一とは近年開発された技術であり、 HLA抗原と抗原ペプチドとの複合 体 5分子が Coiled-Coilドメインを介して重合した 5量体を指す。 HLA抗原 抗原ぺプ チドの複合体を蛍光色素等で標識することができるため、 HLAテトラマー法と同様に フローサイトメーター等で解析することができる（http：〃 www.proimmune.co.uk/参照）
[0155] 以上に述べた HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一はいずれも受 託合成可能であり、例えば Prolmmune社や BD Biosciences社などに委託することによ り合成することができる。また現在では種々の抗原ペプチドを含有する HLAテトラマ 一なども市販されて ヽる ((株)医学生物学研究所等)。
[0156] 本発明の HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一として具体的には、 ί列免ば酉 S歹 U番号： 42,43,44,45,46,47,49,59,60,61 , 62,63,64,65, 66,67,68,69,70,71 , 72, 73,74,75,76,77,78, 158, 159, 160, 161 , 15, 16,21 ,22,23,24,25,26,27,30, 195, 197, 198, 19 9,200,201 , 177, 178, 179または 183に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと HLA-A24 抗原とを含有する HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一が挙げられる 。好ましくは配列番号： 158,22,23,26,27, 198,200,201 , 177, 178, 179または 183に記載 のアミノ酸配列力 なるペプチドと HLA-A24抗原とを含有する HLAモノマー、ダイマ 一、テトラマーおよびペンタマ一が挙げられる。このうち CTLの検出においては HLA テトラマーまたは HLAペンタマ一を用いることが好まし!/、。
[0157] HLAモノマー、 HLAテトラマーおよび HLAペンタマ一は、フローサイトメトリー、蛍光 顕微鏡等の公知の検出手段により結合した CTLを容易に選別または検出することが 出来るように蛍光標識されていることが好ましい。具体的には、例えばフィコエリスリン (PE)、フルォレセインイソチオシァネート（FITC)、ベリジ-ンクロロフィルプロテイン（ PerCP)、ァロフィコシァニン (APC)などにより標識された HLAモノマー、 HLAテトラマ 一および HLAペンタマ一が挙げられる。
[0158] 本発明の HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一の成分である HLA 抗原のうち、 HLA- A24抗原（HLA- A24抗原の α鎖）は、 Genbank Accession No.M64 740に開示されている HLA-A2402の公知の塩基配列の情報等に基づき、 PCR法等 の常法により容易にクローユングすることができる。また HLA-A2抗原（HLA-A2抗原 の α鎖）は、 GenBank (^^0.\184379に開示されてぃる1"[1^- 0201遺伝子の公知 の塩基配列の情報等に基づき、 PCR法等の常法により容易にクローユングすることが できる。
[0159] 本発明の HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一の成分である 13 2ミ クログロブリンは、ヒト由来の β 2ミクログロブリンが好ましい。当該ヒト 13 2ミクログロブリ ンは GenBank Acc.No.AB021288に開示されているヒト j8 2ミクログロブリンの公知の 塩基配列情報に基づき、 PCR法等の常法により容易にクローユングすることができる
[0160] HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一作製法にっ 、ては、前記各 文献により周知である力 具体的に HLA-A24を用いた HLAテトラマーの作製法につ き簡単に述べると以下のようになる。
まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、 HLA-A24 a鎖発現べクタ 一および j8 2ミクログロブリン発現ベクターを導入し発現させる。ここでは大腸菌（例え ば BL21)を用いることが好ま ヽ。得られた単量体 HLA-A24複合体と本発明べプチ ドとを混合し、可溶性の HLA-ペプチド複合体を形成させる。次に HLA-ペプチド複合 体における HLA-A24 a鎖の C末端部位の配列を BirA酵素によりピオチンィ匕する。こ のピオチンィ匕された HLA-ペプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを 4： 1のモル 比で混合することにより、 HLAテトラマーを調製することができる。なお、前記各ステツ プにおいて、ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。
[0161] 前記で本発明の HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一は、本発明 タンパク質由来の腫瘍抗原ペプチド特異的な CTLの検出用試薬として有効に用いら れる。
本発明の CTL検出用試薬は、例えば以下の目的に使用することができる：
1)本発明のタンパク質、ペプチドまたは核酸による治療開始前に、本発明の腫瘍抗 原ペプチドに対する CTL前駆細胞の頻度や量を調べる。これにより、当該腫瘍抗原 ペプチドに対する患者の応答性を判断することができる。
2)本発明のタンパク質、ペプチドまたは核酸による治療実施中の患者における CTL の頻度や量を調べる。これにより治療効果のモニタリング、治療の適合性の判定、治 療が順調に進んでいることの確認などを行うことができる。
[0162] CTLの検出法としては、具体的には、被験患者より CTLを含む生体試料 (例えば PB MC)を単離し、本発明の HLAテトラマー等と前記生体試料とを接触させ、 HLAテトラ マー等に結合した本発明ペプチド特異的な CTLの存在頻度または量を、フローサイ トメータ一等で測定する。
[0163] 9)本発明の疾患マーカー
本発明はまた、 Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子 、 ClOoriB遺伝子または HIFPH3遺伝子、あるいはこれらの発現産物を利用した、癌（ 腫瘍)の疾患マーカーを提供する。
[0164] 前記のように本発明は、 Lengsin遺伝子、 BJ- TSA- 9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB 1遺伝子、 ClOoriB遺伝子および HIFPH3遺伝子が、正常組織における発現量および Zまたは発現頻度に比して、癌糸且織における発現量および Zまたは発現頻度が有 意に上昇していることを見出した。従って、これらの遺伝子、またはその発現産物（タ ンパク質)を認識する抗体は、これらの遺伝子が発現している癌に対する疾患マーカ 一として有効に利用することができる。
以下、これら Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 C lOorfi遺伝子または HIFPH3遺伝子のポリヌクレオチド、並びにこれらの発現産物 (タ ンパク質)を認識する抗体の、疾患マーカーとしての用途を説明する。
[0165] (1)癌疾患の疾患マーカーおよびその応用
(1-1)ポリヌクレオチド
前述のように、ヒト由来の Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BU B1遺伝子、 ClOoriB遺伝子、 HIFPH3遺伝子は公知の遺伝子である。
本発明は前述するように、癌疾患に罹患した患者の組織においては、正常な組織 に比して、 Lengsin遺伝子、 BJ- TSA- 9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOo rfi遺伝子、 HIFPH3遺伝子の発現量および Ζまたは発現頻度が特異的に増大する と ヽぅ知見を発端に、これら遺伝子の発現の有無や発現の程度を検出することによつ て、上記癌疾患の罹患の有無、罹患の程度、回復の程度などが特異的に検出でき、 該疾患の診断を正確に行うことができるという発想に基づくものである。
すなわち本発明は、被験者における上記遺伝子の発現の有無またはその程度を 検出することによって、被験者について癌疾患の罹患の有無又は罹患の程度を診断 することのできるツール (疾患マーカー）として有用なポリヌクレオチドを提供するもの である。
[0166] ここで「ポリヌクレオチド」とは、 RNAおよび DNAのいずれをも包含するものであり、 1 本鎖、 2本鎖のいずれの形態であっても良い。ここで「DNA」には、 cDNA、ゲノム DNA および合成 DNAのいずれもが含まれる。また「RNA」には、 total RNA、 mRNAおよび 合成の RNAの!、ずれもが含まれる。
本発明の疾患マーカーは、前記 Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20orf42遺伝 子、 BUB1遺伝子、 ClOorlB遺伝子または HIFPH3遺伝子の塩基配列において、連続 する少なくとも 15塩基を有するポリヌクレオチドおよび Zまたは該ポリヌクレオチドに相 補的なポリヌクレオチドからなることを特徴とするものである。
[0167] 具体的には、本発明の疾患マーカーは、配列番号 1に記載の Lengsin遺伝子の塩 基配列、配列番号 3に記載の BJ-TSA-9遺伝子の塩基配列、配列番号 5に記載の C2 0orf42遺伝子の塩基配列、配列番号 7に記載の BUB1遺伝子の塩基配列、配列番号 9に記載の ClOorfi遺伝子の塩基配列、または配列番号 11に記載の HIFPH3遺伝子 の塩基配列にぉ 、て、連続する少なくとも 15塩基を有するポリヌクレオチド及び Zま たはそれに相補的なポリヌクレオチドからなるものを挙げることができる。
[0168] ここで相補的なポリヌクレオチド湘補鎖、逆鎖)とは、上記各配列番号に示される塩 基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列にお 、て少なくとも 連続した 15塩基長の塩基配列を有するその部分配列 (ここでは便宜上、これらを「正 鎖」ともいう)に対して、 A ： Tおよび G ： Cといった塩基対関係に基づき、塩基的に相 補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、 対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする 正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイスすることができる程度の相補関係を有す るものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、 Berger and Kimmel (198 7, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Acaae mic Press, San Diego CA)に示されるように、複合体或いはプローブと結合する核酸 の融解温度 (Tm)に基づいて決定することができる。例えば、ノ、イブリダィズ後の洗浄 条件として、通常「1 X SSC、 0.1%SDS、 37°C」程度の条件を挙げることができる。相補 鎖はカゝかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダィズ状態を維持するもので あることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいノヽイブリダィズ条件としては「0.5 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」程度、さらに厳しいハイブリダィズ条件としては「0.1 X SSC、 0 .1%SDS、 65°C」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖 として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列力 なる鎖並 びに該鎖と少なくとも 90%、好ましくは 95%の相同性を有する塩基配列からなる鎖を ί列示することができる。
[0169] また、正鎖側のポリヌクレオチドには、前記 Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20 orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOoriB遺伝子または HIFPH3遺伝子の塩基配列、また はその部分配列を有するものだけでなぐ上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相 補的な関係にある塩基配列力もなる鎖を含めることができる。
上記正鎖のポリヌクレオチドおよび相補鎖 (逆鎖)のポリヌクレオチドは、各々一本鎖 の形態で疾患マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で疾患マーカーとして 使用されてもよい。
[0170] 本発明の癌疾患の疾患マーカーは、具体的には Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝 子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOoriB遺伝子または HIFPH3遺伝子の塩基配 列 (全長配列)からなるポリヌクレオチドであってもよ 、し、その相補配列力もなるポリヌ クレオチドであってもよい。また Lengsin遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレ ォチド、 BJ-TSA-9遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチド、 C20orf42遺 伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチド、 BUB1遺伝子もしくは該遺伝子に 由来するポリヌクレオチド、 ClOoriB遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオ チド、または HIFPH3遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に ( 特異的に)認識するものであれば、上記全長配列もしくはその相補配列の部分配列 力もなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、部分配列としては、上記全長配 列もしくはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも 15個の連続した 塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
[0171] なお、ここで「選択的に (特異的に)認識する」とは、例えばノーザンプロット法におい ては、 Lengsin遺伝子、 BJ- TSA- 9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOoriB 遺伝子、 HIFPH3遺伝子またはこれらの遺伝子に由来するポリヌクレオチドが特異的 に検出できること、また RT-PCR法においては、 Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C 20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOoriB遺伝子、 HIFPH3遺伝子またはこれらに由来 するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それらに限定されず、 当業者が上記検出物または生成物がこれらの遺伝子に由来するものであると判断で きるものであればよい。
[0172] 本発明疾患マーカーは、例えば配列番号: 1に記載の Lengsin遺伝子の塩基配列、 配列番号: 3に記載の BJ-TSA-9遺伝子の塩基配列、配列番号: 5に記載の C20orf42 遺伝子の塩基配列、配列番号: 7に記載の BUB1遺伝子の塩基配列、配列番号: 9に 記載の ClOoriB遺伝子の塩基配列、または配列番号: 11に記載の HIFPH3遺伝子の 目歹1 Jを bとに、 ί列 は primer 3 (http://www.genome.wi.mit.edu/cgi— bin/ primer/ primer3.cgi)あるいはベクター NTKlnfomax社製)を利用して設計することができる。具 体的には前記 Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOorB遺伝子または HIFPH3遺伝子の塩基配列を primer 3またはベクター NTIのソ フトウェアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、もしくは少なくと も該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる 本発明で用いる疾患マーカーは、上述するように連続する少なくとも 15塩基の長さ を有するものであればよぐ具体的にはマーカーの用途に応じて、その長さを適宜選 択し設定することができる。
[0173] (1-2)プローブまたはプライマーとしてのポリヌクレオチド
本発明において癌疾患の検出（診断）は、被験者の生体組織における、 Lengsin遺 伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOoriB遺伝子および HIF PH3遺伝子の少なくとも 1つの発現の有無または発現レベル (発現量)を評価すること によって行われる。この場合、上記本発明の疾患マーカーは、上記各遺伝子の発現 によって生じた RNAまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅す るためのプライマーとして、または該 RNAまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特 異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
[0174] 上記疾患マーカーを癌疾患の検出 (遺伝子診断)においてプライマーとして用いる 場合には、通常 15bp-100bp、好ましくは 15bp-50bp、より好ましくは 15bp-35bpの塩基 長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常 15bp- 全配列の塩基数、好ましくは 15bp-lkb、より好ましくは 100bp-lkbの塩基長を有する ものが例示できる。
本発明疾患マーカーは、ノーザンブロット法、 RT- PCR法、 in situハイブリダーゼー シヨン法などの、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従つ てプライマーまたはプローブとして利用することができる。これによつて癌疾患に関連 する、 Lengsin遺伝子、 BJ- TSA- 9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOorB 遺伝子または HIFPH3遺伝子の発現の有無または発現レベル (発現量)を評価するこ とがでさる。
[0175] なお、測定対象とする試料は、例えば、被験者の対象組織の一部をバイオプシなど で採取し、そこから常法に従って調製した total RNAであってもよいし、該 RNAをもと にして調製される各種のポリヌクレオチドであってもよい。
また、生体組織における、 Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 B UB1遺伝子、 ClOorB遺伝子または HIFPH3遺伝子の発現レベルは、 DNAチップを利 用して検出あるいは定量することができる。この場合、本発明疾患マーカーは当該 D NAチップのプローブとして使用することができる (例えば、 Aifymetrix社の Gene Chip Human Genome U95 A,B,C,D,Eの場合、 25bpの長さのポリヌクレオチドプローブとし て用いられる)。本発明の疾患マーカーをプローブとする DNAチップを、生体組織か ら採取した RNAをもとに調製される標識 DNAまたは RNAとハイブリダィズさせることに より、本発明疾患マーカー（プローブ）と標識 DNAまたは RNAとの複合体が形成され る。該複合体を、該標識 DNAまたは RNAの標識を指標として検出することにより、、 Le ngsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOorB遺伝子ま たは HIFPH3遺伝子の発現の有無または発現レベル (発現量)が評価できる。
[0176] 上記 DNAチップは、 Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺 伝子、 ClOoriB遺伝子または HIFPH3遺伝子と結合し得る 1種または 2種以上の本発 明疾患マーカーを含んで 、ればよ 、。複数の疾患マーカーを含む DNAチップの利 用によれば、ひとつの生体試料について、同時に複数の遺伝子の発現の有無また は発現レベルの評価が可能である。
[0177] 本発明の疾患マーカーは、癌疾患の診断、検出 (罹患の有無、罹患の程度の診断) に有用である。具体的には、該疾患マーカーを利用した癌疾患の診断は、被験者の 生体組織と正常者の生体組織における、 Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20orf 42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOorlB遺伝子または HIFPH3遺伝子の遺伝子発現レベル の違いを判定することによって行うことができる。
この場合、遺伝子発現レベルの違いには、発現のある Zなしの違いだけでなぐ被 験者の生体組織と正常者の生体組織の両者ともに発現がある場合でも、両者間の発 現量の格差が 1.5倍以上、好ましくは 2倍以上、更に好ましくは 3倍以上の場合が含ま れる。
[0178] Lengsin遺伝子由来のポリヌクレオチドは特に、肺腺癌、肺扁平上皮癌または胃癌 に対する疾患マーカーとして有用である。
BJ-TSA-9遺伝子由来のポリヌクレオチドは特に、白血病、肺腺癌、肺扁平上皮癌 、小細胞肺癌、口腔癌、胃癌、脾臓癌またはリンパ腫に対する疾患マーカーとして有 用である。
C20orf42遺伝子由来のポリヌクレオチドは特に、肺扁平上皮癌、肺腺癌、肝臓癌、 胃癌、白血病、悪性リンパ腫組織、直腸癌、結腸癌または脾臓癌に対する疾患マー カーとして有用である。
[0179] BUB1遺伝子由来のポリヌクレオチドは特に、乳癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣 癌、口腔扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌 (結腸癌、直腸癌)、胃癌、脾臓癌、肝臓癌、 白血病、リンパ腫またはメラノーマに対する疾患マーカーとして有用である。
ClOoriB遺伝子由来のポリヌクレオチドは特に、乳癌、結腸癌、直腸癌、腎臓癌、胃 癌、卵巣癌、肝臓癌、脾臓癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌、小細胞肺癌またはメラノーマ に対する疾患マーカーとして有用である。
HIFPH3遺伝子由来のポリヌクレオチドは特に、乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、脾臓 癌、肝臓癌、肺腺癌または肺扁平上皮癌に対する疾患マーカーとして有用である。
[0180] (1-3)抗体
本発明は、癌疾患の疾患マーカーとしての、 Lengsin遺伝子の発現産物 (Lengsin)、 BJ-TSA-9遺伝子の発現産物 (BJ-TSA-9)、 C20orf42遺伝子の発現産物 (C20orf42)、 BUB1遺伝子の発現産物 (BUB1)、 ClOoriB遺伝子の発現産物 (C10orf3)、または HIFP H3遺伝子の発現産物 (HIFPH3)を特異的に認識することができる抗体を提供する。 当該抗体として、具体的には、配列番号: 2に記載のアミノ酸配列を有する Lengsinタ ンパク質、配列番号: 4に記載のアミノ酸配列を有する BJ-TSA-9タンパク質、配列番 号: 6に記載のアミノ酸配列を有する C20orf42タンパク質、配列番号: 8に記載のァミノ 酸配列を有する BUB1タンパク質、配列番号: 10に記載のアミノ酸配列を有する ClOor タンパク質、または配列番号: 12に記載のアミノ酸配列を有する HIFPH3タンパク質 を特異的に認識することのできる抗体を挙げることができる。
[0181] 本発明は、前述するように、癌疾患の患者の癌組織において、正常な細胞や組織 に比して、 Lengsin遺伝子、 BJ- TSA- 9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOo rfi遺伝子および HIFPH3遺伝子が特異的に発現量および Zまたは発現頻度が上昇 して 、ると 、う知見を発端に、これらのタンパク発現の有無や発現の程度を検出する ことによって上記癌疾患の罹患の有無や罹患の程度が特異的に検出でき、該疾患 の診断を正確に行うことができるという発想に基づくものである。
上記抗体は、従って、被験者における上記タンパク質の発現の有無またはその程 度を検出することによって、該被験者が癌疾患に罹患している力否力、またはその疾 患の程度を診断することのできるツール (疾患マーカー）として有用である。
[0182] 前述のようにヒト由来の Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOorBおよび HIFP H3は公知のタンパク質である。
本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく Lengsin、 BJ-TSA- 9、 C20orf42、 BUB 1、 ClOoriBまたは HIFPH3を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またその モノクローナル抗体であってもよぐ更には当該タンパク質を構成するアミノ酸配列の うち少なくとも連続する、通常 8アミノ酸、好ましくは 15アミノ酸、更に好ましくは 20ァミノ 酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれ る。
[0183] これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明抗体も、これらの常法に従 つて製造すること; 0できる (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al . (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12-11.13)。具体的には、ポリクロ ーナル抗体は、常法に従って大腸菌などで発現し精製した Lengsin、 BJ-TSA-9, C20 orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3タンパク質を用いて、あるいは常法に従って当 該 Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOorBまたは HIFPH3の部分アミノ酸配列 を有するオリゴペプチドを合成して、家兎などの非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の 血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体は、常法に 従って大腸菌などで発現し精製した Lengsin、 BJ-TSA-9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriB または HIFPH3、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴぺプチ ドをマウスなどの非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合 させて調製したハイプリドーマ細胞の中力 得ることができる (Current protocols in M olecular Biology edit. Ausuoei et al. (1987J Publish. John Wiley and Sons, section 1
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[0184] 抗体の作製に免疫抗原として使用される Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 C lOorfiまたは HIFPH3タンパク質は、本発明により提供される配列番号： 1,3,5,7,9,11 のいずれかの遺伝子配列情報に基づいて、 DNAクローニング、各プラスミドの構築、 宿主へのトランスフエクシヨン、形質転換体の培養および培養物力ゝらのタンパク質の 回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、文献記 載の方法 (Molecular Cloning, T.Maniatis et al, CSH Laboratory (1983), DNA Cloni ng, DM. Glover, IRL PRESS (1985》などに準じて行うことができる。
[0185] 具体的には、 Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3をコー ドする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換え DNA (発現ベクター)を作製 し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養 物から、 目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗 原としてのタンパク質を得ることができる。また、これらの Lengsin、 BJ-TSA-9、 C20orf4 2、 BUB1、 ClOorlBまたは HIFPH3の部分ペプチドは、本発明により提供されるァミノ 酸配列の情報 (配列番号: 2,4,6,8, 10, 12)に従って、一般的な化学合成法 (ペプチド 合成)によって製造することもできる。
[0186] なお、本発明の Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOorBまたは HIFPH3には 、配列番号: 2,4,6,8, 10, 12のいずれかに示す各アミノ酸配列に関わるタンパク質のみ ならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記遺伝子によってコードされ るタンパク質のアミノ酸配列において、 1もしくは複数 (通常数個)のアミノ酸が欠失、置 換または付加されたアミノ酸配列力もなり、且つ、それぞれのタンパク質の公知の機 能と同等の免疫学的活性を有するタンパク質を挙げることができる。
ここで、同等の免疫学的活性を有するタンパク質としては、適当な動物あるいはそ の細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつ Lengsin、 BJ-TSA-9、 C20orf42、 BU Bl、 C lOoriBまたは HIFPH3に対する抗体と特異的に結合する能力を有するタンパク 質を挙げることができる。
[0187] なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数および変異部位は、その免疫学的活性 が保持される限り制限はない。免疫学的活性を消失することなくアミノ酸残基が、どの ように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周 知のコンピュータプログラム、例えば DNA Star softwareを用いて見出すことができる。 例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の 10%以内であり、好ましくは全アミノ酸の 5%以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の 1%以内である。また置換されるアミノ酸 は、置換後に得られるタンパク質が、 Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriB または HIFPH3と同等の免疫学的活性を保持している限り、特に制限されない。この 置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、アミノ酸の極性、電荷、可 溶性、疎水性、親水性、両親媒性などにおいて置換前のアミノ酸と似た性質を有する アミノ酸であることが好ましい。例えば、 Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro, Met, Pheおよび Trp は互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、 Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn および Ginは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、 Aspおよび Gluは互 いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、また Lys、 Argおよび Hisは互いに塩基 性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミ ノ酸を適宜選択することができる。
[0188] 本発明の抗体は、また、 Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOorBまたは HIF PH3の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってもよ い。力かる抗体誘導のために用いられるオリゴペプチドは、機能的な生物活性を有 することは要しないが、各々対応する上記タンパク質と同様の免疫原特性を有するも のであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つ Lengsin、 BJ-TSA-9 、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3のアミノ酸配列において、少なくとも連続 する 8アミノ酸、好ましくは 15アミノ酸、より好ましくは 20アミノ酸力 なるオリゴペプチド を f列示することができる。
[0189] 力かるオリゴペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを 用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、その ようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲ ル、並びにリゾレシチン、プル口ニックポリオル、ポリア-オン、ペプチド、油乳剤、キ 一ホールリンペットへモシァニンおよびジニトロフエノールのような表面活性物質、 BC G (カルメット一ゲラン桿菌)やコリネバタテリゥム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含ま れる。
また、既に市販されている抗体である、抗 Bubl抗体（Upstate社）、抗 ClOorfi抗体（ Abnova社）、抗 C20orf42抗体（Imgenex社）、抗 HIFPH3抗体（Bethyl社）などを、本発 明の抗体として用いることもできる。
[0190] 本発明抗体は、 Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOorBまたは HIFPH3に 特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、被験者の 組織内に発現した上記タンパク質 (その相同物を含む)を特異的に検出することがで きる。すなわち、当該抗体は被験者の組織内における Lengsin、 BJ-TSA-9、 C20orf42 、 BUB1、 ClOorlBまたは HIFPH3の発現の有無およびその発現の程度を検出するた めのプローブとして有用である。
[0191] 具体的には、患者の生体組織 (対象組織)の一部をバイオプシなどで採取し、そこか ら常法に従って調製した組織抽出物やタンパク質を用いて、例えばウェスタンプロット 法、 ELISA法など公知の検出方法において、本発明抗体を常法に従ってプローブと して使用することによって、 Lengsin、 BJ-TSA-9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HI FPH3を検出することができる。
癌疾患の診断に際しては、被験者の組織などに存在する Lengsiiu BJ-TSA-9、 C20 orf42、 BUB1、 ClOoriBおよび HIFPH3のいずれか少なくとも 1つの量と、正常者の糸且 織に存在する当該タンパク質の量と対比して、その違いを判定すればよい。この場合 、タンパク質の量の違いには、タンパク質のある Zなしと共に、タンパク質の量の違い 力 ^倍以上、好ましくは 3倍以上の場合が含まれる。
[0192] Lengsinを特異的に認識する抗体は特に、肺腺癌、肺扁平上皮癌または胃癌に対 する疾患マーカーとして有用である。
BJ-TSA-9を特異的に認識する抗体は特に、白血病、肺腺癌、肺扁平上皮癌、小 細胞肺癌、口腔癌、胃癌、脾臓癌またはリンパ腫に対する疾患マーカーとして有用 である。
C20orf42を特異的に認識する抗体は特に、肺扁平上皮癌、肺腺癌、肝臓癌、胃癌 、白血病、悪性リンパ腫組織、直腸癌、結腸癌または脾臓癌に対する疾患マーカー として有用である。
[0193] BUB1を特異的に認識する抗体は特に、乳癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、口 腔扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌 (結腸癌、直腸癌)、胃癌、脾臓癌、肝臓癌、白血病 、リンパ腫またはメラノーマに対する疾患マーカーとして有用である。 ClOoriBを特異的に認識する抗体は特に、乳癌、結腸癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、 卵巣癌、肝臓癌、脾臓癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌、小細胞肺癌またはメラノーマに 対する疾患マーカーとして有用である。
HIFPH3を特異的に認識する抗体は特に、乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、脾臓癌、 肝臓癌、肺腺癌または肺扁平上皮癌に対する疾患マーカーとして有用である。
[0194] (2)癌疾患の検出方法 (診断方法）
本発明は、前述した本発明疾患マーカーを利用した癌疾患の検出方法 (診断方法) を提供する。
具体的には、本発明の検出方法は、被験者の生体組織 (対象組織)の一部を、バイ ォプシなどで採取し、そこに含まれる癌疾患に関連する Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9 遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOoriB遺伝子または HIFPH3遺伝子の発 現レベル (発現量)、または該遺伝子に由来するタンパク質である Lengsin、 BJ-TSA-9 、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3のタンパク質レベル (量)を検出、測定する ことにより、癌疾患の罹患の有無またはその程度を検出 (診断)するものである。また、 本発明の検出 (診断)方法は、例えば癌疾患患者において、該疾患の改善のために 治療薬などを投与した場合における、該疾患の改善の有無またはその程度を検出（ 診断)することちできる。
[0195] 本発明の検出方法は、次の (a)、（b)および (c)の工程を含むものである：
(a)被験者の生体試料と本発明疾患マーカーを接触させる工程、
(b)生体試料中の Lengsin遺伝子、 BJ- TSA- 9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝 子、 ClOoriB遺伝子または HIFPH3遺伝子の遺伝子発現レベル、あるいは Lengsin、 BJ - TSA-9、 C20orf42、 BUB1、 ClOorBまたは HIFPH3のタンパク質の量を、上記疾患マ 一力一を指標として測定する工程、
(c)上記 (b)の結果をもとに、癌疾患の罹患を判断する工程。
[0196] ここで用いられる生体試料は、被験者の生体組織から調製される対象試料を挙げ ることができる。具体的には、該組織力ゝら調製される RNA含有試料、もしくはそれら力 ら更に調製されるポリヌクレオチドを含む試料、または上記組織力 調製されるタンパ ク質を含む試料を挙げることができる。これらの RNA、ポリヌクレオチドまたはタンパク 質を含む試料は、例えば被験者の生体組織の一部をバイオプシなどで採取後、常 法に従って調製することができる。
本発明の診断方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて、具体的に は下記のようにして実施される。
[0197] (2-1)測定対象の生体試料として RNAを利用する場合
測定対象物として RNAを利用する場合、癌疾患の検出は、具体的に下記の工程 (a) 、 (b)及び (c)を含む方法によって実施することができる：
(a)被験者の生体試料力 調製された RNAまたはそれら力 転写された相補的ポリヌ クレオチドと、前記本発明の疾患マーカー（Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20o rf42遺伝子、 BUBl遺伝子、 ClOorfS遺伝子または HIFPH3遺伝子の塩基配列におい て連続する少なくとも 15塩基を有するポリヌクレオチド及び Z又は該ポリヌクレオチド に相補的なポリヌクレオチド）とを結合させる工程、
(b)該疾患マーカーに結合した生体試料由来の RNAまたは該 RNAから転写された相 補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づ 、て、癌疾患の罹患を判断する工程。
[0198] 測定対象物として RNAを利用する場合、本発明検出方法 (診断方法)は、該 RNA中 の Lengsin遺伝子、 BJ- TSA- 9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOorfS遺伝 子または HIFPH3遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。 具体的には、前述のポリヌクレオチドからなる本発明疾患マーカー (Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOorfS遺伝子または HIFPH3遺 伝子の塩基配列にお 、て連続する少なくとも 15塩基を有するポリヌクレオチドおよび Zまたはその相補的なポリヌクレオチド)をプライマーまたはプローブとして用いて、ノ 一ザンブロット法、 RT- PCR法、 DNAチップ解析法、 in situハイブリダィゼーシヨン解 析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
[0199] ノーザンブロット法を利用する場合、本発明疾患マーカーをプローブとして用いるこ とによって、 RNA中の、 Lengsin遺伝子、 BJ- TSA- 9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1 遺伝子、 C 1 OoriB遺伝子または HIFPH3遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、 測定することができる。具体的には、まず本発明疾患マーカー湘補鎖)を放射性同 位元素 (32P、 33Pなど: RI)、蛍光物質などで標識する。次いで、得られる標識疾患マ 一力一を常法に従ってナイロンメンブレンなどにトランスファーした被験者の生体組 織由来の RNAとハイブリダィズさせる。その後、形成された標識疾患マーカー (DNA) と RNAとの二重鎖を、該標識疾患マーカーの標識物 (RI、蛍光物質など)に由来する シグナルを放射線検出器 (BAS-1800II、富士フィルム社製)、蛍光検出器などで検出 、測定する方法を例示することができる。また、 AlkPhos Direct Labelling and Detecti on System (Amersham Pharamcia Biotech社製)を用いて、該プロトコ一ノレに従って疾 患マーカー (プローブ DNA)を標識し、被験者の生体組織由来の RNAとハイブリダィズ させた後、疾患マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージヤー S TORM860 (Amersham Pharmacia Biotech社製)で検出、測定する方法を採用すること ちでさる。
RT-PCR法を利用する場合、本発明疾患マーカーをプライマーとして用いて、 RNA 中の Lengsin遺伝子、 BJ- TSA- 9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOoriB遺 伝子または HIFPH3遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができ る。具体的には、まず被験者の生体組織由来の RNAから常法に従って cDNAを調製 し、これを铸型として標的の、 Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 B UB1遺伝子、 ClOorfi遺伝子または HIFPH3遺伝子の領域が増幅できるように、本発 明の疾患マーカーから調製した一対のプライマー (上記 cDNA (—鎖)に結合する正鎖 、 +鎖に結合する逆鎖)をこれとハイブリダィズさせる。その後、常法に従って PCR法 を行い、得られた増幅二本鎖 DNAを検出する。増幅された二本鎖 DNAの検出には、 予め RI、蛍光物質などで標識してぉ 、たプライマーを用いて上記 PCRを行うことによ つて産生される標識二本鎖 DNAを検出する方法、産生された二本鎖 DNAを常法に 従ってナイロンメンブレンなどにトランスファーさせて、標識した疾患マーカーをプロ ーブとして使用してこれとハイブリダィズさせて検出する方法などを用いることができ る。なお、生成された標識二本鎖 DNA産物はアジレント 2100バイオアナライザ (横河 アナリティカルシステムズ社製)などで測定することができる。また、 SYBR Green RT-P CR Reagents (Applied Biosystems社製)で該プロトコールに従って RT- PCR反応液を 調製し、 ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems社製)で 反応させて、該反応物を検出することもできる。
[0201] DNAチップ解析を利用する場合、本発明疾患マーカーを DNAプローブ (1本鎖また は 2本鎖)として貼り付けた DNAチップを用意し、これに被験者の生体組織由来の RN Aから常法によって調製された cRNAをハイブリダィズさせ、形成された DNAと cRNAと の二本鎖を、本発明疾患マーカーから調製される標識プローブと結合させて検出す る方法を挙げることができる。また、上記 DNAチップとして、 Lengsin遺伝子、 BJ-TSA- 9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOoriB遺伝子または HIFPH3遺伝子の 遺伝子発現レベルを検出、測定可能な DNAチップを用いることもできる。かかる、 Len gsin遺伝子、 BJ- TSA- 9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOorfi遺伝子また は HIFPH3遺伝子の発現レベルを検出、測定することができる DNAチップとしては、 例えば Aifymetrix社の Gene Chip Human Genome U95 A, B, C, D, Eを挙げることが できる。かかる DNAチップを用いた、被験者 RNA中の、 Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺 伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOoriB遺伝子または HIFPH3遺伝子の遺伝 子発現レベルの検出、測定については、実施例に詳述する。
[0202] (2-2)測定対象の生体試料としてタンパク質を用いる場合
測定対象としてタンパク質を用いる場合、本発明検出 (診断)方法は、生体試料中の 、 Lengsin, BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUBl, ClOoriBまたは HIFPH3を検出し、その量 (レ ベル)を測定することによって実施される。具体的には、下記の工程 (a)、（b)及び (c)を 含む方法によって実施することができる。
(a)被験者の生体試料力も調製されたタンパク質と抗体に関する本発明の疾患マーカ ― (Lengsin, BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUBl, ClOorBまたは HIFPH3を認識する抗体） とを結合させる工程、
(b)該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質またはその部分ペプチドを 、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づ 、て、癌疾患の罹患を判断する工程。
[0203] より具体的には、抗体に関する本発明の疾患マーカーとして抗体 (Lengsin、 BJ-TS A- 9、 C20orf42、 BUBl, ClOoriBまたは HIFPH3を特異的に認識する抗体）を用いて、 ウェスタンブロット法などの公知方法で、 Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUBl, CIO orfiまたは HIFPH3を検出、定量する方法を挙げることができる。
ウェスタンプロット法は、一次抗体として本発明疾患マーカーである上記抗体を用 いた後、二次抗体として125ιなどの放射性同位元素、蛍光物質などで標識した標識抗 体 (一次抗体に結合する標識抗体)を用い、得られる標識結合物の放射性同位元素 、蛍光物質などに由来するシグナルを放射線測定器 (BAS-1800II :富士フィルム社製 など)、蛍光検出器などで検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体と して本発明疾患マーカーを用いた後、 ECL Plus Western Blotting Detction System ( Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いて、該プロトコールに従って検出し、マル チバイオイメージヤー STORM860 (Amersham Pharmacia Biotech社製)で測定するこ とちでさる。
[0204] (2-3)癌疾患の診断
癌疾患の診断は、被験者の生体組織における Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOoriB遺伝子または HIFPH3遺伝子の遺伝子発現 レベル、もしくは Lengsin、 BJ-TSA-9, C20orf42、 BUBl, ClOoriBまたは HIFPH3タン ノ ク質の量 (レベル)を、対応する正常な組織における当該遺伝子発現レベルまたは 当該タンパク質レベルと比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる
[0205] この場合、正常な組織などカゝら採取、調製した生体試料 (RNAまたはタンパク質)が 必要であるが、これは癌疾患に罹患して 、な 、人の組織あるいは癌疾患に罹患して いる人の非癌部正常組織などをバイオプシなどで採取したり、死後に本人の同意に 基づいて採取された組織力も得ることができる。なお、ここで「癌疾患に罹患していな い人」とは、少なくとも癌疾患の自覚症状がなぐ好ましくは他の検査方法、例えば X 線検査などによる検査の結果、癌疾患でないと診断された人をいう。なお、当該「癌 疾患に罹患していない人」を、以下、本明細書では単に正常者という場合もある。
[0206] 被験者の生体組織と正常な生体組織 (癌疾患に罹患して 、な 、人の生体組織ある いは癌疾患に罹患して ヽる人の非癌部正常組織)との遺伝子発現レベルまたはタン ノ ク質レベルの比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を 並行して行うことで実施できる。また、並行して行わなくても、複数^^なくとも 2、好まし くは 3以上、より好ましくは 5以上)の正常な生体糸且織を用いて均一な測定条件で測定 して得られた Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 C1 OorB遺伝子または HIFPH3遺伝子の遺伝子発現レベル、もしくは Lengsin、 BJ-TSA-9 、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3のタンパク質レベルの平均値または統計 的中間値を、正常者の遺伝子発現レベルもしくはタンパク質の量として比較に用いる ことができる。
[0207] 被験者が、癌疾患であるかどうかの判断は、該被験者の組織における Lengsin遺伝 子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOoriB遺伝子または HIFP H3遺伝子の遺伝子発現レベル、またはその発現産物である Lengsin、 BJ-TSA-9, C2 0orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3のタンパク質レベル力 正常者のそれらと比較 して 2倍以上、好ましくは 3倍以上多いことを指標として行うことができる。被験者の遺 伝子発現レベルまたはタンパク質レベルが正常者のそれらのレベルに比べて多けれ ば、該被験者は癌疾患であると判断できる力 該疾患の罹患が疑われる。
[0208] より具体的には、被験者の肺または胃の組織において、上記遺伝子のうち Lengsin 遺伝子の遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量力 正常な対応する組織に比べて 多い場合、癌疾患が疑われる。
また BJ-TSA-9遺伝子の遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量力 被験者の白 血球、肺、口腔、胃、脾臓またはリンパ節の組織において、正常な対応する組織に比 ベて多 、場合は癌疾患が疑われる。
また C20orf42遺伝子の遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量力 被験者の肺、 肝臓、胃、白血球、リンパ節、直腸、結腸または脾臓の組織において、正常な対応す る組織に比べて多 ヽ場合は癌疾患が疑われる。
[0209] また BUB1遺伝子の遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量力 被験者の乳腺、肺 、卵巣、口腔、腎臓、大腸 (結腸、直腸)、胃、脾臓、肝臓、白血球、リンパ節または皮 膚の組織にお!、て、正常な対応する組織に比べて多 、場合は癌疾患が疑われる。 また ClOoriB遺伝子の遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量力 被験者の乳腺、 結腸、直腸、腎臓、胃、卵巣、肝臓、脾臓、肺または皮膚の組織において、正常な対 応する組織に比べて多い場合は癌疾患が疑われる。 また HIFPH3遺伝子の遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量力 被験者の乳腺、 結腸、胃、腎臓、脾臓、肝臓、肺の組織において、正常な対応する組織に比べて多 Vヽ場合は癌疾患が疑われる。
[0210] 以下、実施例により本発明を具体的に説明する力 本発明はこれらの実施例により なんら限定されるものではな 、。
実施例 1
[0211] ヒト組織サンプル及び、ヒト癌細胞株からのトータル RNAの調製
ヒトの主要臓器由来の癌および正常組織サンプル、すなわち肺腺癌組織 57サンプ ル、肺正常組織 (肺腺癌患者由来) 46サンプル、肺扁平上皮癌組織 48サンプル、肺 正常組織 (肺扁平上皮癌患者由来） 18サンプル、結腸癌組織 108サンプル、結腸正 常組織 (結腸癌患者由来） 114サンプル、直腸癌組織 43サンプル、直腸正常組織 (直 腸癌患者由来) 31サンプル、胃癌組織 38サンプル、胃正常組織（胃癌患者由来） 13 サンプル、乳癌組織 237サンプル、乳正常組織 (乳癌患者由来) 39サンプル、卵巣癌 組織 37サンプル、卵巣正常組織 (卵巣癌患者由来） 5サンプル、肝癌組織 19サンプ ル、肝正常組織 (肝癌患者由来) 8サンプル、腎癌組織 89サンプル、腎正常組織 (腎 癌患者由来) 64サンプル、脾癌組織 55サンプル、脾正常組織 (脾癌患者由来） 16サ ンプル、白血病組織 6サンプル、リンパ腫組織 90サンプル、骨髄正常組織 2サンプル 、メラノーマ組織 10サンプル、皮膚正常組織 72サンプルから、それぞれ常法に従いト 一タル RNAを調製した。
実施例 2
[0212] DNAチップ解析
実施例 1に示したサンプルより調製した total RNAを用いて、 DNAチップ解析を行つ た。なお、 DNAチップ解析は Aflfymetrix社 Gene Chip Human Genome U133セットを用 いて行った。具体的には、解析は、 (1) total RNAから cDNAの調製、（2)該 cDNAから ラベル化 cRNAの調製、（3)ラベル化 cRNAのフラグメント化、 (4)フラグメント化 cRNAと プローブアレイとのハイブリダィズ、 (5)プローブアレイの染色、 (6)プローブアレイのス キャン、及び (7)遺伝子発現解析、の手順で行った。
[0213] (1) total RNAから cDNAの調製 実施例 1で得られた各 total RNA 10 gと T7- (dT)24プライマー (Amersham社製) 100 pmolを含む 11 Lの混合液を、 70°C、 10分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、 buperbcnpt Choice system for cDNA Synthesis(Gibco— BRL社製)【こ '·3;れる 5 X First
Strand cDNA Buffer 4 μ 該キットに含まれる 0.1M DTT (dithiothreitol) 2 L、該 キットに含まれる lOmM dNTP Mix 1 μ Lを添加し、 42°Cで 2分間加熱した。更に、該キ ットに含まれる Super Scriptll ΚΤ 2 μ L(400U)を添カ卩し、 42°Cで 1時間加熱した後、氷 上で冷却した。冷却後、 DEPC処理水（ナカライテスタ社製)滅菌蒸留水 91 μ L、該キ ットに含まれる 5 X Second Strand Reaction Buffer 30 μ L、 lOmM dNTP Mix 3 L、該 キットに含まれる E. coli DNA Ligase 1 μ L(10U)、該キットに含まれる E. coli DNA Poly merase I 4 μ L(40U),該キットに含まれる E. coli RNaseH 1 μ L(2U)を添カ卩し、 16°Cで 2 時間反応させた。次いで、該キットに含まれる T4 DNA Polymerase 2 μ L(10U)をカロえ 、 16°Cで 5分間反応させた後、 0.5M EDTA 10 Lを添加した。次いで、フエノール/ク ロロホルム/イソァミルアルコール溶液（二ツボンジーン社製） 162 μ Lを添加し、混合し た。該混合液を、予め室温、 14,000rpm、 30秒間遠心分離しておいた Phase Lock Gel
Light (エツペンドルフ社製)に移し、室温で 14,000rpm、 2分間遠心分離した後、 145 Lの水層をエツペンドルフチューブに移した。得られた溶液に、 7.5M酢酸アンモ-ゥ ム溶液 72.5 μ L、エタノール 362.5 μ Lを加えて混合した後、 4°Cで 14,000rpm、 20分間 遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、作製した cDNAを含むペレットを得た。その 後、該ペレットに 80%エタノール 0.5mLを添カ卩し、 4°Cで 14,000rpm、 5分間遠心分離し た後、上清を捨てた。再度同様の操作を行った後、該ペレットを乾燥させ、 DEPC処 理水 12 Lに溶解した。以上の操作により実施例 1で調製した各トータル RNAから、 各 cDNAを取得した。
(2) cDNAからラベル化 cRNAの調製
各 cDNA溶液 5 μ Lに、 DEPC処理水 17 μ L、 BioArray High Yield RNA Transcript L abeling Kit(ENZO社製)に含まれる 10 X HY Reaction Buffer 4 L、該キットに含まれ る 10 X Biotin Labeled Ribonucleotides 4 L、該キットに含まれる 10 X DTT 4 L、該 キットに含まれる 10 X RNase Inhibitor Mix 4 L、該キットに含まれる 20 X T7 RNA Pol ymerase Lを混合し、 37°Cで 5時間反応させて、ラベル化 cRNAを調製した。反応 後、該反応液に DEPC処理水 60 μ Lをカ卩えたのち、 RNeasy Mini Kit (GIAGEN社製） を用いて添付プロトコールに従 、、調製したラベル化 cRNAを精製した。
[0215] (3)ラベル化 cRNAのフラグメントィ匕
各ラベル化 cRNA 20 gを含む溶液に、 5 X Fragmentation Buffer (200mMトリスー酢 酸 pH8.1(Sigma社製)、 500mM酢酸カリウム (Sigma社製)、 150mM酢酸マグネシウム（ Sigma社製 )）8 Lを加えた反応液 40 Lを、 94°Cで 35分間加熱した後、氷中に置い た。これによつて、ラベルイ匕 cRNAをフラグメント化した。
[0216] (4)フラグメント化 cRNAとプローブアレイとのハイブリダィズ
各フラグメント化 cRNA 40 μ Lに、 5nM Control Oligo B2 (Amersham社製） 4 L、 100 X Control cRNA Cocktail 4 L、 Herring sperm DNA (Promega社製) 40 μ g、 Acetyla ted BSA(Gibco- BRL社製） g、 2 X MES Hybridization Buffer(200mM MESゝ 2M [ Na+], 40mM EDTA、 0.02% Tween20 (Pierce社製)、 pH6.5〜6.7) 200 μ Lゝ及び DEPC 処理水 144 Lを混合し、 400 Lのハイブリカクテルを得た。得られた各ハイブリカク テルを 99°Cで 5分間加熱し、更に 45°Cで 5分間加熱した。加熱後、室温で 14,000rpm 、 5分間遠心分離し、ハイプリカクテル上清を得た。
[0217] 一方、 1 X MESハイブリダィゼーシヨンバッファーで満たした Human genome U133プ ローブアレイ（Aflfymetrix社製）を、ノ、イブリオーブン内で、 45°C、 60rpmで 10分間回転 させた後、 1 X MESハイブリダィゼーシヨンバッファーを除去してプローブアレイを調製 した。上記で得られたハイプリカクテル上清 200 Lを該プローブアレイにそれぞれ添 加し、ノ、イブリオーブン内で 45°C、 60rpmで 16時間回転させ、フラグメント化 cRNAとハ イブリダィズしたプローブアレイを得た。
[0218] (5)プローブアレイの染色
上記で得られたノ、イブリダィズ済みプローブアレイそれぞれからハイブリカクテルを 回収除去した後、 Non-Stringent Wash Buffer(6 X SSPE(20 X SSPE (ナカライテスタ社 製)を希釈)、 0.01%Tween20、 0.005%AntifoamO- 30(Sigma社製》で満たした。次に Non- Stringent Wash Bufferおよび Stringent Wash Buffer(100mM MESゝ 0.1M NaCl、 0.01% Tween20)をセットした GeneChip Fluidics Station 400(AfiVmetrix社製)の所定の位置 にフラグメント化 cRNAとハイブリダィズしたプローブアレイを装着した。その後染色プ ロトコール EuKGE- WS2に従って、 1次染色液 (10 g/mL Streptavidin Phycoerythrin (SAPE)(Molec μ Lar Probe社製)、 2mg/mL Acetylated BSAゝ lOOmM MESゝ 1M NaCl( Ambion社製)、 0.05%Tween20、 0.005%AntifoamO- 30)、 2次染色液（100 μ g/mL Goat IgG (Sigma社製)、 3 μ g/mL Biotinylated Anti— Streptavidin antibody (Vector Laborat ories社製)、 2mg/mL Acetylated BSAゝ lOOmM MESゝ 1M NaCl、 0.05%Tween20、 0.00 5%AntifoamO-30)により染色した。
[0219] (6)プローブアレイのスキャン、及び（7)遺伝子発現量解析
染色した各プローブアレイを HP GeneArray Scanner(Aifymetrix社製)に供し、染色 パターンを読み取った。染色パターンをもとに GeneChip Workstation System(Affymet rix社製)によってプローブアレイ上の遺伝子の発現を解析した。次に、解析プロトコ一 ルに従って Normalizationを行ったのち、各サンプルにおける各プローブ（各遺伝子） の発現量（average difference)及び発現の有無を算出した。同一のプローブにっき、 サンプルの種類ごとに遺伝子発現量の平均値を求め、さらに各サンプル種類間にお ける発現量、発現頻度の変化率を求めた。
実施例 3
[0220] 発現栾動解析
各種主要臓器 (肺、結腸、直腸、胃、乳、肝、腎、卵巣、膝)由来の正常組織に比較 し、癌組織で発現量 ·発現頻度が増加している遺伝子を、以下のようにして選択した
[0221] すなわち DNAチップ解析による遺伝子発現の解析結果から、各種正常組織に比べ て対応する癌組織で発現量 ·発現頻度が増加しているプローブセットのうち、多くの 癌組織で特異的発現量'発現頻度の上昇の認められたプローブを選択した。次に、 これら選択されたプローブの対応遺伝子を調べ選別した。
その結果、 BUB1遺伝子、 ClOorB遺伝子、 C20orf42遺伝子、 Lengsin遺伝子、 HIFP H3遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子の計 6遺伝子が選択された。これら 6遺伝子の発現変動 倍率を表 2に、また発現頻度を表 3に示す。
[0222] [表 2] 遺伝子名 乳癌 結腸癌 賢臓癌 肝臓癌 肺腺癌 肺扁平上皮癌 脾臓癌 ΐΐη 卵巣癌 直腸癌 白血病 悪性リンパ腫 メラ
BUB1 2.1 2.0 2.6 3.1 2.0 4.0 2.0 2.4 4.2 2.3 1.4 1.3 3.1
〇1 C f3 2.5 2.3 2.9 6.7 3.0 6.2 2.4 2.4 9.0 2.9 0.9 0.9 3.9
C2Cbrf42 0.5 2.8 0.4 2.0 6.0 15.4 4.2 2.4 0.3 2.4 2.0 1.3 0.4
Lengsin 1.0 1.0 0.4 0.7 8.5 2.9 2.1 2.3 1.9 1.2 1.3 1.8 0.9
HIFFH3 2 3 1 3 15.5 2 6 23 15.9 44 1 2 09 0.9 06 06 02
BJ-TSA-9 1 0 08 1.0 1 5 94 8.1 26 36 43 0.9 149 2 3 05
[0223] [表 3]
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000072_0002
[0224] 表 2の数値は各種癌の対応する正常組織に対する発現変動倍率を示し、 Human G enome U133 Chipで解析した各種正常組織の遺伝子発現量を 1とした場合における 同組織由来の癌組織での遺伝子発現量を示した。また表 3の数値は各種癌 ·正常組 織での、各遺伝子の発現頻度（％)を示した。
[0225] BUB1遺伝子は、調べた全ての癌組織で、正常組織に比して発現量が上昇してお り、特に肺扁平上皮癌および卵巣癌において顕著であった。また発現頻度も上昇し ており、特に肺扁平上皮癌、卵巣癌およびメラノ 糸且織において顕著であった。
ClOoriB遺伝子は、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、脾臓 癌、胃癌、卵巣癌、直腸癌およびメラノ 組織において、正常組織に比して発現量 が上昇しており、特に卵巣癌、肝臓癌、肺扁平上皮癌において顕著であった。また 発現頻度も上記発現量と同様血液腫瘍を除く全ての癌種で上昇しており、特に肺扁 平上皮癌、脾臓癌、卵巣癌において顕著であった。
[0226] C20orf42遺伝子は、結腸癌、肝臓癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、脾臓癌、胃癌、直 腸癌、白血病および悪性リンパ腫組織において、正常組織に比して発現量が上昇し ており、特に肺扁平上皮癌、肺腺癌において顕著であった。また発現頻度も上昇し ており、特に肺腺癌、肺扁平上皮癌および脾臓癌において顕著であった。
Lengsin遺伝子は、肺腺癌、肺扁平上皮癌、胃癌、において、正常組織に比して発 現量が上昇しており、特に肺腺癌において顕著であった。また発現頻度も上記の発 現量と同様肺腺癌、肺扁平上皮癌、胃癌で上昇しており、特に肺腺癌において顕著 であった。
[0227] HIFPH3遺伝子は、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、脾臓 癌および胃癌組織において、正常組織に比して発現量が上昇しており、特に腎臓癌 および肺扁平上皮癌において顕著であった。また発現頻度も上記の発現量と同様 乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、脾臓癌および胃癌組織で 上昇しており、特に腎臓癌、肺扁平上皮癌および脾臓癌において顕著であった。
BJ-TSA-9遺伝子は、肺腺癌、肺扁平上皮癌、白血病において、正常組織に比し て発現量が上昇しており、特に白血病、肺腺癌、肺扁平上皮癌において顕著であつ た。また発現頻度も上記の発現量と同様肺腺癌、肺扁平上皮癌、白血病で上昇して おり、特に肺腺癌および肺扁平上皮癌において顕著であった。
[0228] 以上のように、選別された前記 6個の遺伝子は、正常組織と比較して、対応する癌 組織で特異的に発現量及び発現頻度が上昇する遺伝子であった。従ってこれら 6遺 伝子およびその発現産物 (タンパク質）は、癌 (特に上記に列挙した癌）に対する疾患 マーカーとして有用であることが明ら力となった。
実施例 4
[0229] RT— PCR法を用いた各糠細胞や組織での腈瘍杭原遺伝子の発現解析
先の 6種類の遺伝子の各種癌細胞株、癌組織、および正常組織での発現を、 RT-P CR法により解析した。各種癌細胞株、癌組織から Isogen reagent (Nippon Gene)を用 いて抽出した RNA、あるいは巿販正常組織（clontech)由来 RNAをもとに、オリゴ dTプ ライマーを用いて cDNAを調製し、表 4に示すプライマーの組み合わせ (BUB1遺伝子 のプライマー 1:配列番号: 208、プライマー 2 :配列番号： 209、 ClOoriB遺伝子のプライ マー 1:配列番号: 210、プライマー 2 :配列番号： 211、 C20orf42遺伝子のプライマー 1: 配列番号: 206、プライマー 2 :配列番号： 207、 Lengsin遺伝子のプライマー 1:配列番 号: 202、プライマー 2 :配列番号： 203、 HIFPH3遺伝子のプライマー 1:配列番号: 212、 プライマー 2 :配列番号： 213、 BJ-TSA-9遺伝子のプライマー 1:配列番号: 204、プライ マー 2 :配列番号： 205)を用いて PCR反応（40サイクル）を行い、 cDNAを増幅した。そ の後、この増幅遺伝子を電気泳動で分離し、解析した。陽性コントロールとして G3PD H遺伝子の発現を、前記と同様に RT-PCR法を行い確認した。なお、癌組織及び正 常組織の一部はインフォームドコンセントを得て、主として手術材料より準備'使用し た。結果を図 1〜図 6に示した。
[0230] [表 4]
Figure imgf000074_0001
[0231] BUBl遺伝子は、多くの主要な正常組織で発現が検出されない、あるいは低い発現 量であったのに対して、日腔扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌、胃癌、脾臓癌、肝臓癌、 リンパ腫、メラノーマ細胞株にぉ 、ては高!、発現が検出された。
ClOoriB遺伝子は、精巣を除く多くの主要な正常組織で発現が検出されない、ある いは低い発現量であったのに対して、肺腺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌細胞株 にお 、て高 、発現が検出された。
C20orf42遺伝子は、多くの主要な正常組織で発現が検出されな力つたのに対して 、結腸癌、脾臓癌細胞株では高い発現が検出された。
Lengsin遺伝子は、多くの主要な正常糸且織で発現が検出されな力つたのに対して、 肺腺癌、肺扁平上皮癌細胞株では高 、発現が検出された。
HIFPH3遺伝子は、多くの主要な正常組織で発現が検出されたが、腎癌細胞株で はより高い発現が検出された。更に、腎癌患者由来の多くの癌組織において、正常 組織に比較して高い発現が検出された。
BJ-TSA-9遺伝子は、多くの主要な正常組織で発現が検出されな力つたのに対して 、肺腺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌、口腔癌、胃癌、脾臓癌、リンパ腫細胞株に お!、て高 、発現が検出された。 [0232] 以上のように 6種の遺伝子の発現は各種正常組織では発現が検出されな 、、ある いは癌細胞 ·組織に比較し低い発現レベルであるのに対し、遺伝子により癌種は異 なるが、各種癌細胞株、癌組織で高い発現が検出された。従ってこれら 6遺伝子およ びその発現産物（タンパク質）は、癌 (特に上記に列挙した癌）に対する疾患マーカー として有用であることが DNAチップ解析の結果に加え更に強く示された。
実施例 5
[0233] 候補ペプチドの撰択および合成
(1)候補ペプチドの選択
Lengsin (配列番号: 2)のアミノ酸配列中、 HLA-A24分子に結合する可能性のあるべ プチドとして配列番号： 13〜31および配列番号： 195〜201に記載のアミノ酸配列から なるペプチドを、また HLA-A2分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号 ： 32〜41に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを選択した。
BJ-TSA-9配列番号： 4)のアミノ酸配列中、 HLA-A24分子に結合する可能性のある ペプチドとして配列番号： 42〜49に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを、また HLA -A2分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号: 50〜58に記載のアミノ酸 配列からなるペプチドを選択した。
C20orf42(配列番号: 6)のアミノ酸配列中、 HLA-A24分子に結合する可能性のある ペプチドとして配列番号: 59〜78に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを、また HLA -A2分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号: 79〜88に記載のアミノ酸 配列からなるペプチドを選択した。
[0234] BUB1 (配列番号: 8)のアミノ酸配列中、 HLA-A24分子に結合する可能性のあるぺプ チドとして配列番号: 89〜117に記載のアミノ酸配列力 なるペプチドを、また HLA-A 2分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号： 118〜157に記載のアミノ酸 配列からなるペプチドを選択した。
C10orf3(配列番号： 10)のアミノ酸配列中、 HLA-A24分子に結合する可能性のある ペプチドとして配列番号： 158〜165に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを、また H LA-A2分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号： 166〜175に記載のァ ミノ酸配列力もなるペプチドを選択した。 HIFPH3(配列番号： 12)のアミノ酸配列中、 HLA-A24分子に結合する可能性のある ペプチドとして配列番号： 176 183に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを、また H LA-A2分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号： 184 194に記載のァ ミノ酸配列力 なるペプチドを選択した。各ペプチドのアミノ酸配列上の位置、ァミノ 酸数およびアミノ酸配列を、以下の表 5〜表 16に示す。
[表 5]
Figure imgf000076_0001
[表 6]
[e [6S20]
Figure imgf000077_0001
[8挲] [8S20]
Figure imgf000077_0002
Figure imgf000077_0003
LZ9^0/L00Zdr/LDd 9Z 動 OAV C20orf42 A24 pe tides
Figure imgf000078_0001
[0240] [表 10]
C20orf42 A2 peptides
Figure imgf000078_0002
[0241] [表 11]
Bubl A24 peptic es
ペプチド名 アミノ酸配列 酉己歹
Bub 1—43(10) EYUTし lEHL 89
Bubl— 61(9) KYHNDPRFI 90
Bub 1—89(9) LYNHGIGTL 91
Bubl 101(9) LYIAWAGHL 92
Bubl 139(9) QYRLFQTRL 93
Bubl 670(9) MYSASLLRL 94
Bubl 801(9) VYEATQGDL 95
Bubl 870(9) SYGTLLNAI 96
BubU 061(9) HYTNKIRAL 97
Bubl一 29(10) RYIQWVEENF 98
Bubl— 77(10) EYNSDLHQFF 99
Bub 1一 206(9) MERRVITI 100
Bubl一 235(9) VMYCKEKLI 101
Bubl一 292(9) KMDEIHKKし 102
Bubl— 353(9) TYQQTPVNM 103
Bub 1—414(10) EFKPQSGAEI 104
Bubl— 474(10) MFQAPTLPDI 105
Bubl一 552(10) TFGERSVSRL 106
Bubl— 574(9) EFLDDST W 107
Bubl一 581(10) VWGIRCNKTL 108
Bubl— 741(10) PWDDKLIFKL 109
Bubl一 837(9) し MERLKPSM 110
Bub^ 880(10) LYKNTPEKVM 111
Bubl— 922(9) NRLGNGFL 112
Bubl一 952(10) DMKLFPKGTI 113
Bubl— 995(10) VYCMLFGTYM 114
Bubl— 1018(10) LFRRLPHLDM 115
Bubl— 1037(10) MWNEFFHVML 116
Bub1_1057(10) VFQQHYTNKI 117 表 12]
[ε ο]
Figure imgf000080_0001
L∑9S0/L00rdf/I3d 6Z 動 OAV C10orf3 A24 peptides
Figure imgf000081_0001
[表 16]
Figure imgf000082_0001
[0247] (2)ペプチド合成
前記のペプチド（配列番号： 13〜配列番号： 201)のうち、 Lengsin由来のペプチド 26 種類 (表 5)、 BJ-TSA-9由来のペプチド 7種類 (表 7)、 C20orf42由来のペプチド 20種類 ( 表 9)、 ClOoriB由来のペプチド 4種類 (表 13)を、 Fmoc法で合成した。
実施例 6
[0248] 各種抗原由来ペプチドの HLA-A*2402、 HLA-*A0201への結合親和性の検討
実施例 1で合成したペプチドの HLA-*A2402への結合親和性の測定は、文献 (J. I mmunol. 164:2565, 2000)に記載の方法と同様に実施した。 MHCクラス I分子を発現 して 、な 、マウスリンパ腫由来の細胞株 RMA-Sに HLA-*A2402と H-2Kbのキメラ MH Cの遺伝子を安定的に導入した細胞株 RMA-S-A*2402細胞を 26°Cで 18時間培養し た。 RMA- S- A*2402を PBS溶液で洗浄後、 3 μ L/mLのヒト β -ミクログロブリンと 100 μ
2
L/mLの各種ペプチドを含有する培養液 OPTI-MEM(Invitrogen社)に懸濁して 26°C で 3時間、 37°Cで 3時間培養した。この細胞を PBS溶液で洗浄後、抗 HLA-A24抗体に より 4°Cで 30分間処理した。さらに細胞を PBS溶液で洗浄後、 PE標識した抗マウス IgG 抗体により 4°Cで 30分間処理した。細胞を洗浄後、 1%ホルマリンを含む PBS溶液 lmL に懸濁して固定した。細胞はフローサイトメーター装置 FACScan (BDバイオサイェン ス社)で測定し、平均蛍光強度によりペプチドの結合親和性を求めた。検討した 31種 類のペプチドの結合親和性を測定した結果を図 7〜9に示す。
[0249] 陽性対照として、文献 0. Immunol. 158:3325, 1997)で HLA-A*2402に結合すること が報告されている EBウィルス由来のペプチド及び文献 (J. Immunol. 164:2565, 2000) で報告されている HIVウィルス由来のペプチド (HIV)は、強い結合能を示した。陰性 対照として用いた文献 (Eur J Immunol. 21:2891, 1991)で H2-Kbに結合することが報 告されて!/ヽる Ovalbumin由来のペプチド (SL8)は低 、活性を示した。試験した 31種類 の全てのペプチドは HLA-A*2402に良好に結合することが示された。従ってこれら 31 種類のペプチドは腫瘍抗原ペプチドであり、その由来である BJ-TSA-9、 C20orf42お よび ClOoriBは腫瘍抗原タンパク質であることが明ら力となった。
[0250] 同様にして、 Lengsin由来の 23種類ペプチドについて HLA-A*2402への結合能を調 ベた結果を図 10、 11に示す。配列番号： 15,16,21,22,23,24,25,26,27,30,195,197,198 ,199,200,201に記載のペプチドについて、 HLA-A*2402への有意な結合親和性が 示された。従ってこれらのペプチドは腫瘍抗原ペプチドであり、その由来である Lengs inは腫瘍抗原タンパク質であることが明らかとなつた。
なお、 HLA-A*0201につ!/、てはヒトリンパ腫由来の細胞株 T2細胞を用いて上記と同 様な方法で結合能を確認することができる。また BUB1および HIFPH3についても同 様にして HLAへの結合能を確認することができる。
実施例 7
[0251] 腈瘍杭原由来ペプチドによる CTL誘導
実施例 6で HLAへの結合能が認められたペプチドで CTLを誘導し、その CTLの活 性を評価することにより、 BUB1、 C10orf3、 C20orf42、 Lengsin, HIFPH3、 BJ- TSA- 9の 各タンパク質が腫瘍抗原タンパクであり、その部分ペプチドが腫瘍抗原ペプチドであ ることを確認することができる。ペプチドで CTLを誘導し、その CTLの活性を評価す る方法は、ヒト末梢血単核球ある ヽはヒトモデル動物を用いた既知のアツセィ方法等 に準じて行うことが出来る（J. Immunol. 169:1611, 2002、 WO 02/47474号公報、 Int J . Cancer: 100,565-570 (2002)) 0例えば、ヒト末梢血単核球を用いたアツセィ方法の 場合には、健常者あるいは癌患者からインフォームドコンセントを得て末梢血を採血 し、比重遠心法により単核球を分離し、 AIM-V培養液 (Invitrogen社)等の培地を用い て培養する。約 24時間後、非接着性の細胞を回収して、 lOOU/mLの IL-2を含んだ AI M-Vを用いて培養する。抗原提示用細胞調製のため、接着性の細胞は、 1000U/mL の IL-4と lOOOU/mLの GM- CSFを含む AIM-V培養液で 5日間培養後、各種癌抗原由 来ペプチドを添加して 1日間培養し、さらに lOng/mLの TNFと lOOOU/mLの IFN- αを 加えて培養する。非接着性の細胞を上記のペプチドをパルスした抗原提示用細胞と ともに培養する。ペプチド刺激をした CTLを含む非接着性細胞に対しては、 1回目の ペプチド刺激から 7日後と 14日後に、ペプチドパルスした抗原提示細胞を用いて 2回 目、 3回目のペプチド刺激を行う。 3回目の刺激から 1週間後の CTLの活性は51 Cr等 の放射性物質、あるいはその他の非放射性物質で標識した標的細胞 (投与ペプチド が結合する HLAを発現し、更に投与ペプチドをコードする癌抗原、あるいは投与ぺプ チドを発現する細胞、あるいはペプチドを事前に添加した細胞）と共培養し、 CTLに よる標的細胞の破壊を培養上清中の放射性物質、非放射性物質の量で測定、 CTL の活性を評価する。なお、 CTLの活性については、 CTL細胞が標的細胞と反応した 結果、培養上清中に産生する IFN yを ELISA法あるいは ELISPOT法にて測定するこ とで評価することも可能である。
[0252] またヒトモデル動物を用いたアツセィ方法の場合には癌抗原由来のペプチドを適当 な剤形を用いて、ヒト HLAを発現したトランスジエニックマウスに投与し、約 1週間後に 脾臓細胞、あるいはその他のリンパ系組織を得る。得られた細胞を、投与したものと 同様のペプチドで in vitroで抗原刺激を行い、更に約 5日間培養する。得られた細胞 を CTL画分とし、上記と同様な方法にて CTLの活性を評価することができる。
実施例 8
[0253] ClOorlB由来ペプチドによる CTL誘導
実施例 7に記載の方法に従い、 ClOoriB由来の C10orfi_193(10)のペプチドで HLA- A*2402陽性の癌患者末梢血単核球 (PBMC)を刺激して CTLを誘導した。ペプチドを パルスした T2-A24細胞（T2-A24細胞： HLA-A*2402遺伝子を有さな!/ヽ T2細胞（ATC C番号 CRL-1992)に HLA-A*2402遺伝子を導入し発現させた細胞株）、 HLA-A*240 2陽性及び ClOorfi陽性の癌細胞株 Sw480を標的細胞として CTL活性を求めた結果 を図 12に示す。誘導した CTLクローンは、ペプチド特異的な細胞傷害活性を示した。 また、誘導した CTLクローンは、 HLA陰性の K562細胞には反応せず、 HLA-A*2402 陽性及び ClOorfi陽性の癌細胞株に対して細胞傷害活性を示した。このことより、 C1 0orfi_193(10)のペプチド（配列番号： 158、 162)は腫瘍抗原ペプチドであることが確認 できた。また ClOorfiが腫瘍抗原タンパク質であることも確認された。
実施例 9
[0254] Lenssin由来ペプチドによる CTL誘導
合成した HLA-A*2402に結合する可能性のあるペプチドを何種類か混合し、実施 例 7に記載の方法に従って、 HLA-A*2402陽性の癌患者の PBMCを刺激して CTLの 誘導を試みた。誘導後、各ペプチドに対する反応性を IFN- γの ELISPOT法で検出し た結果を図 13に示す。その結果、配列番号： 22、 23、 26、 27、 198、 200、 201のぺプチ ドに対して特異的な CTLの誘導が認められた。このことより、配列番号: 22、 23、 26、 2 7、 198、 200、 201のペプチドは腫瘍抗原ペプチドであることが確認できた。また Lengsi nが腫瘍抗原タンパク質であることも確認された。
次に、配列番号: 22のペプチドで癌患者 PBMCを刺激して CTLを誘導し、 CTL誘導 活性を細胞傷害活性で検出した結果を図 14に示す。刺激に用いたペプチドをパル スした標的細胞に対して特異的な細胞傷害活性が検出された。
実施例 10
[0255] HIFPH3由来ペプチドによる CTL誘導
配列番号： 177、 178、 179及び 183のペプチドを混合し、実施例 7に記載の方法に従 つて、 HLA-A*2402陽性の癌患者の PBMCを刺激して CTLの誘導を試みた。誘導後 、各種腎癌細胞株に対する細胞傷害活性を測定した結果を図 15に示す。ペプチド 刺激して得られたリンパ球は、 HLA-A24と HIFPH3が共に陽性の SMKT R-1細胞には 反応して細胞傷害性を示した力 HLA-A24陰性、 HIFPH3陽性の SMKT R4細胞、 HL A- A24陽性、 HIFPH3陰性の Caki- 1細胞、 HLA- A24と HIFPH3が共に陰性の ACHN 細胞、及び HLA陰性の K562細胞に対しては、細胞傷害性を示さな力つた。このことよ り、ペプチド刺激により HIFPH3に対する HLA-A24拘束性の CTLが誘導されているこ とが示され、これら HIFPH3_27(9) (配列番号： 177)、 HIFPH3_92(10) (配列番号： 178)、 H IFPH3_112(10) (配列番号： 179)および HIFPH3_295(9) (配列番号： 183)のペプチドは腫 瘍抗原ペプチドであることが確認できた。また HIFPH3が腫瘍抗原タンパク質であるこ とも確認された。
実施例 11 [0256] C20orf42由来ペプチドによる CTL誘導
合成した HLA-A*2402に結合する可能性のあるペプチド 20種類を 4種類ずつ 5ダル ープに分けた。 HLA-A*2402陽性の癌患者の PBMCを 96穴プレートに播種し、実施 例 7に記載の方法に従 、、各グループのペプチドで刺激して CTLの誘導を試みた。 各グループ 384穴の PBMCを刺激し、刺激したペプチドに対する細胞傷害性を調べ たところ、 8から 14穴で、刺激ペプチドに対して特異的な細胞傷害活性が検出された 。このことより、これら C20orf42由来のペプチドは腫瘍抗原ペプチドであることが確認 された。また C20orf42が腫瘍抗原タンパク質であることも確認された。
産業上の利用可能性
[0257] 本発明により新規な腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチド、ならびにこれら の物質の癌免疫分野における用途が提供される。本発明の腫瘍抗原タンパク質およ びそれに由来する腫瘍抗原ペプチドは、当該腫瘍抗原タンパク質の発現している癌 に罹患した患者を処置することができる。
図面の簡単な説明
[0258] [図 1]図 1は、 Lengsin遺伝子の各種主要正常組織、肺癌細胞株での mRNA発現量を RT-PCR法を用いて解析した図である。図中、 Lengsin及び G3PDH (陽性対照）の矢 印はそれぞれの mRNA量を示すバンドの位置を示す。 Heart (心臓）、 Brain (脳）、 Plac enta (胎盤）、 Lung (肺）、 Liver (肝臓）、 Skeleton Muscle (骨格筋）、 Kidney (腎臓）、 Pa ncreas (脾臓）、 Spleen (脾臓）、 Thymus (胸腺）、 Prostate (前立腺）、 Testis (精巣）、 O vary (卵巣）、 Small Intestine (小腸）、 Large Intestine (大腸）、 PBMC (末梢血単核球） 、 Adenocarcinoma (腺癌)、 Squamous cell carcinoma (扁平上皮癌)、 Small cell carcin oma (小細胞癌）は正常及び癌組織種を示す。 LNY-1、 A549、 LHK2、 1-87, LK79、 S q-l、 LC817、 Lu65は各種肺癌細胞株名を示す。
[0259] [図 2]図 2は、 BJ-TSA-9遺伝子の各種主要正常組織及び肺癌、口腔癌その他癌種 細胞株での mRNA発現量を RT-PCR法を用いて解析した図である。図中、 BJ-TSA-9 及び G3PDH (陽性対照）の矢印はそれぞれの mRNA量を示すバンドの位置を示す。 Heart (心臓）、 Brain (脳）、 Placenta (胎盤）、 Lung (肺）、 Liver (肝臓）、 Skeleton Muscl e (骨格筋）、 Kidney (腎臓）、 Pancreas (脾臓）、 Spleen (脾臓）、 Thymus (胸腺）、 Prosta te (前立腺）、 Testis (精巣）、 Ovary (卵巣）、 Small Intestine (小腸）、 Large Intestine ( 大腸)、 PBMC (末梢血単核球)、 Adenocarcinoma (腺癌)、 Squamous cell carcinoma ( 扁平上皮癌）、 Small cell carcinoma (小細胞癌）は正常及び癌組織種を示す。 LNY- 1 、 A549、 LHK2、 1—87、 LK79、 Sq— 1、 LC817、 Lu65、 OSC19、 OSC20、 OSC30、 OSC40 、 OSC70、 HSC2、 HSC3、 HSC4、 KOSC3、 HO— 1— N— 1、 R3、 SW450、 SSTW、 HS776, CHC20、 CHC32、 C1R、 T2、 888mel、 LG2melは各種臓器癌細胞株名を示す。
[0260] [図 3]図 3は、 C20orf42遺伝子の各種主要正常組織及び結腸癌、脾臓癌細胞株での mRNA発現量を RT-PCR法を用いて解析した図である。図中、 C20orf42及び G3PDH ( 陽性対照）の矢印はそれぞれの mRNA量を示すバンドの位置を示す。 Heart (心臓）、 Brain (脳）、 Placenta (胎盤）、 Lung (肺）、 Liver (肝臓）、 Skeleton Muscle (骨格筋）、 Ki dney (腎臓）、 Pancreas (脾臓）、 Spleen (脾臓）、 Thymus (胸腺）、 Prostate (前立腺）、 T estis (精巣）、 Ovary (卵巣）、 Small Intestine (小腸）、 colon (結腸）、 leukocyte (白血球 )、 colon cancer (結腸癌）、 pancreatic cancer (脾臓癌）は正常及び癌組織種を示す。 SW480、 SW620、 colo205、 WiDR、 CFPAC、 PK8、 SuSu86、 PUNは結腸癌、脾臓癌細 胞株名を示す。
[0261] [図 4]図 4は、 BUB1遺伝子の各種主要正常組織及び口腔扁平上皮癌、腎臓癌、大 腸癌、胃癌、脾臓癌、肝臓癌、リンパ腫、メラノーマ細胞株での mRNA発現量を RT-P CR法を用いて解析した図である。図中、 BUB1及び G3PDH (陽性対照）の矢印はそ れぞれの mRNA量を示すバンドの位置を示す。 OSC19、 HSC2、 Cakil、 R3、 SW450、 S STW、 HS776T, PUN, CHC20、 CHC32、 C1R、 T2、 888mel、 LG2MELは各種臓器癌 細胞株名を示す。
[0262] [図 5]図 5は、 ClOorfi遺伝子の各種主要正常組織及び各種肺癌細胞株での mRNA 発現量を RT- PCR法を用いて解析した図である。図中、 ClOoriB及び G3PDH (陽性対 照）の矢印はそれぞれの mRNA量を示すバンドの位置を示す。 Heart (心臓）、 Brain ( 月 )、 Placenta (胎盤）、 Lung (肺）、 Liver (肝臓）、 Skeleton Muscle (骨格筋）、 Kidney ( 腎臓）、 Pancreas (脾臓）、 Spleen (脾臓）、 Thymus (胸腺）、 Prostate (前立腺）、 Testis ( 精巣）、 Ovary (卵巣）、 Small Intestine (小腸）、 Large Intestine (大腸）、 PBMC (末梢 血単核球)、 Adenocarcinoma (腺 J、 Squamous cell carcinoma ( 平上皮癌)、 Small cell carcinoma (小細胞癌）は正常及び癌組織種を示す。 LNY- 1、 A549、 LHK2、 1-8 7、 LK79、 Sq- 1、 LC817、 Lu65は各種臓器癌細胞株名を示す。
[0263] [図 6]図 6は、 HIFPH3遺伝子の各種主要正常組織、腎癌細胞株、及び腎癌腫瘍組 織での mRNA発現量を RT-PCR法を用いて解析した図である。図中、 HIFPH3及び G3 PDH、 jS -actin (陽性対照）はそれぞれの mRNA量を示すバンドの位置を示す。 Heart (心臓）、 Brain (脳）、 Placenta (胎盤）、 Lung (肺）、 Liver (肝臓）、 Skeleton Muscle (骨 格筋）、 Kidney (腎臓）、 Pancreas (脾臓）、 Spleen (脾臓）、 Thymus (胸腺）、 Prostate ( 前立腺）、 Testis (精巣）、 Ovary (卵巣）、 Small Intestine (小腸）、 colon (結腸）、 leukoc yte (白血球）、 RCC (腎細胞癌）は正常及び癌組織種を示す。 Tは腫瘍組織、 Nは正 常組織を示す。 SMKTR- 1、 SMKTR- 2、 SMKTR- 3、 SMKTR- 4、 Caki- 1、 ACHNは腎 癌細胞株名を示す。
[0264] [図 7]図 7は、 BJ-TSA-9由来の 8種類のペプチドおよび陽性コントロールである EBゥ ィルス由来ペプチド (図中 EBV)、 HIVウィルス由来ペプチド (図中 HIV)、陰性コント口 ールである Ovalbumin由来のペプチド (SL8)の HLA-A*2402への結合親和性を示した グラフである。図中、横軸は平均蛍光強度 (MFI,結合親和性)を示す。縦軸はべプチ ド名を示す。（-)はペプチド未添加の結果を示す。
[0265] [図 8]図 8は、 C20orf42由来の 20種類のペプチドおよび陽性コントロールである EBウイ ルス由来ペプチド (図中 EBV)、 HIVウィルス由来ペプチド (図中 HIV)、陰性コントロー ルである Ovalbumin由来のペプチド (SL8)の HLA-A*2402への結合親和性を示したグ ラフである。図中、横軸は平均蛍光強度 (MFI,結合親和性)を示す。縦軸はペプチド 名を示す。（-)はペプチド未添加の結果を示す。
[0266] [図 9]図 9は、 ClOorfi由来の 4種類のペプチドおよび陽性コントロールである EBウイ ルス由来ペプチド (図中 EBV)、 HIVウィルス由来ペプチド (図中 HIV)、陰性コントロー ルである Ovalbumin由来のペプチド (SL8)の HLA-A*2402への結合親和性を示したグ ラフである。図中、横軸は平均蛍光強度 (MFI,結合親和性)を示す。縦軸はペプチド 名を示す。（-)はペプチド未添加の結果を示す。
[0267] [図 10]図 10は、 Lengsin由来の 16種類のペプチドおよび陽性コントロールである HIV ウィルス由来ペプチド (図中 HIV)、陰性コントロールである Ovalbumin由来のペプチド、（ SL8)の HLA-A*2402への結合親和性を示したグラフである。図中、横軸は平均蛍光 強度 (MFI,結合親和性)を示す。縦軸はペプチド名を示す。（-)はペプチド未添カロ の結果を示す。
[0268] [図 11]図 11は、 Lengsin由来の 7種類のペプチドおよび陽性コントロールである EBウイ ルス由来ペプチド (図中 EBV)、陰性コントロールである Ovalbumin由来のペプチド (SL 8)の HLA-A*2402への結合親和性を示したグラフである。図中、横軸は平均蛍光強 度 (MFI,結合親和性)を示す。縦軸はペプチド名を示す。（-)はペプチド未添加の 結果を示す。
[0269] [図 12]図 12は、 C10orB_193(10)ペプチドで HLA- A*2402陽性の癌患者 PBMCを刺激 することにより誘導された CTLの、細胞傷害活性を示したグラフである。図中、「p印 tid e2jはペプチドをパルスした T2-A24細胞を、「Sw480」は HLA-A*2402陽性及び ClOor 陽性の癌細胞株 Sw480を、それぞれ標的細胞として用いた結果を示す。また図中、 ΓΚ562]は HLA陰性の K562細胞を標的細胞として用いた結果を、（一）はペプチド未 添加の T2-A24細胞を標的細胞として用いた結果を示す。
[0270] [図 13]図 13は、 Lengsin由来ペプチドにより HLA-A*2402陽性の癌患者 PBMCを刺激 して誘導された CTLの反応性を、 IFN- γ量を測定する ELISPOT法で検出した結果を 示した図である。
[0271] [図 14]図 14は、 Lengsin_142(9)ペプチドで癌患者 PBMCを刺激して誘導された CTLの 、細胞傷害活性を示したグラフである。図中「T2A24+p印 tide」は、前記ペプチドをパ ルスした T2-A24細胞を、「T2A24」は前記ペプチドをパルスしていない T2-A24細胞を 、それぞれ標的細胞として用いた結果を示す。また図中、「T2A24 + HIV」は HIV由来 のペプチドをパルスした T2-A24細胞を、「K562」は HLA陰性の Κ562細胞を、それぞ れ標的細胞として用いた結果を示す。
[0272] [図 15]図 15は、 HIFPH3由来ペプチド（配列番号： 177、 178、 179及び 183)混合物で 、 HLA-A*2402陽性の癌患者の PBMCを刺激して CTLを誘導した結果を示すグラフ である。縦軸は細胞傷害活性を示す。図中、 E:TlCr%、 E:T3Cr%、 E:T10Cr%は、 ペプチド刺激した PBMCと癌細胞との混合比力 それぞれ 3、 10であることを示す。 配列表フリーテキスト 配列番号： 13〜201に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。 配列番号： 202〜 213に記載の塩基配列はプライマーである。

Claims

請求の範囲
[1] Lengsin(Glutamate— ammonia ligase (glutamine synthase) domain containing 1、 LU
LDlとも称する)、 BJ-TSA-9(Hypothetical protein MGC14128), C20orf42(URPl、 Kin dlerinとも称する)、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3(egl nine homolog3、 EGLN3とも称す る)に由来する部分ペプチドを含有し、かつ HLA抗原と結合して CTLにより認識され るペプチド。
[2] HLA抗原が HLA— A24抗原または HLA— A2抗原である、請求項 1記載のぺプ チド。
[3] 配列番号： 13〜配列番号： 201のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、請 求項 2記載のペプチド。
[4] 配列番号： 13〜配列番号： 31、配列番号： 42〜配列番号： 49、配列番号： 59〜配 列番号： 78、配列番号： 89〜配列番号： 117、配列番号： 158〜配列番号： 165、配 列番号： 176〜配列番号： 183、配列番号： 195〜201のいずれかに記載のアミノ酸 配列の第 2位のアミノ酸がチロシン、フエ-ルァラニン、メチォニンまたはトリプトファン に置換され、及び/又は C末端のアミノ酸がフエ-ルァラニン、ロイシン、イソロイシン 、トリプトファンまたはメチォニンに置換されたアミノ酸配列を含有し、かつ HLA— A2 4抗原と結合して CTLにより認識されるペプチド。
[5] 配列番号： 32〜配列番号： 41、配列番号： 50〜配列番号： 58、配列番号： 79〜配 列番号： 88、配列番号： 118〜配列番号： 157、配列番号： 166〜配列番号： 175、 配列番号： 184〜配列番号： 194のいずれかに記載のアミノ酸配列の第 2位のアミノ 酸がロイシン、メチォニン、パリン、イソロイシンまたはグルタミンに置換され、及び/ 又は C末端のアミノ酸力パリンまたはロイシンに置換されたアミノ酸配列を含有し、力 つ HLA— A2抗原と結合して CTLにより認識されるペプチド。
[6] 請求項 1〜5の 、ずれかに記載のペプチドを含有するェピトープペプチド。
[7] 請求項 1〜6のいずれかに記載のペプチドと薬学的に許容される担体とを含有する 医薬組成物。
[8] 請求項 1〜6のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する 核酸。
[9] 請求項 8記載の核酸と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
[10] Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3と薬学的に許容され る担体とを含有する医薬組成物。
[11] Lengsinが配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求項 1
0記載の医薬組成物。
[12] BJ-TSA-9が配列番号: 4に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求 項 10記載の医薬組成物。
[13] C20orf42が配列番号： 6に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求項
10記載の医薬組成物。
[14] BUB1が配列番号: 8に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求項 10 記載の医薬組成物。
[15] ClOoriBが配列番号： 10に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求 項 10記載の医薬組成物。
[16] HIFPH3が配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求 項 10記載の医薬組成物。
[17] Lengsin, BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3をコードするポリヌク レオチドを含有する核酸と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
[18] Lengsinをコードするポリヌクレオチドが配列番号： 1に記載の塩基配列を含有する ポリヌクレオチド、または配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ チドである、請求項 17記載の医薬組成物。
[19] BJ-TSA-9をコードするポリヌクレオチドが配列番号： 3に記載の塩基配列を含有す るポリヌクレオチド、または配列番号: 4に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ チドである、請求項 17記載の医薬組成物。
[20] C20orf42をコードするポリヌクレオチドが配列番号： 5に記載の塩基配列を含有する ポリヌクレオチド、または配列番号: 6に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ チドである、請求項 17記載の医薬組成物。
[21] BUB1をコードするポリヌクレオチドが配列番号： 7に記載の塩基配列を含有するポリ ヌクレオチド、または配列番号: 8に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド である、請求項 17記載の医薬組成物。
[22] ClOoriBをコードするポリヌクレオチドが配列番号： 9に記載の塩基配列を含有する ポリヌクレオチド、または配列番号： 10に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ チドである、請求項 17記載の医薬組成物。
[23] HIFPH3をコードするポリヌクレオチドが配列番号： 11に記載の塩基配列を含有す るポリヌクレオチド、または配列番号： 12に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレ ォチドである、請求項 17記載の医薬組成物。
[24] 以下の（a)〜（d) :
(a)請求項 1〜6のいずれかに記載のペプチド、
(b)請求項 8記載の核酸、
(c) Lengsinゝ BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3、および
(d) Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3をコードするポリヌ クレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、抗原提示能を有する細胞とをイン'ビトロで接触させることを特徴とす る、抗原提示細胞の製造方法。
[25] 請求項 24記載の製造方法により製造される抗原提示細胞。
[26] 請求項 25記載の抗原提示細胞と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成 物。
[27] 以下の (a)〜(d) :
(a)請求項 1〜6のいずれかに記載のペプチド、
(b)請求項 8記載の核酸、
(c) Lengsinゝ BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3、および
(d) Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3をコードするポリヌ クレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、末梢血リンパ球とをイン'ビトロで接触させることを特徴とする、 CTLの 誘導方法。
[28] 請求項 27記載の誘導方法により誘導される CTL。
[29] 請求項 28記載の CTLと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
[30] CTLの誘導剤として使用される、請求項 7、 9〜23、 26または 29のいずれかに記 載の医薬組成物。
[31] 癌ワクチンとして使用される、請求項 7、 9〜23、 26または 29のいずれかに記載の 医薬組成物。
[32] 請求項 1〜5のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
[33] 請求項 1〜5の!、ずれかに記載のペプチドと HLA抗原とを含有する HLAモノマー
、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一。
[34] 請求項 33記載の HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAペン タマ一を成分として含有する、 Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは
HIFPH3に由来する腫瘍抗原ペプチド特異的な CTLの検出用試薬。
[35] Lengsin遺伝子、 BJ-TSA-9遺伝子、 C20orf42遺伝子、 BUB1遺伝子、 ClOoriB遺伝 子または HIFPH3遺伝子の塩基配列にお ヽて、連続する少なくとも 15塩基を有するポ リヌクレオチドおよび Zまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなる 癌疾患の疾患マーカー。
[36] 癌疾患の検出においてプローブまたはプライマーとして使用される請求項 35に記 載の疾患マーカー。
[37] Lengsin遺伝子に関する疾患マーカーが肺腺癌、肺扁平上皮癌または胃癌に対す るものである、請求項 35または 36に記載の疾患マーカー。
[38] BJ-TSA-9遺伝子に関する疾患マーカーが白血病、肺腺癌、肺扁平上皮癌、小細 胞肺癌、口腔癌、胃癌、脾臓癌またはリンパ腫に対するものである、請求項 35または
36に記載の疾患マーカー。
[39] C20orf42遺伝子に関する疾患マーカーが肺扁平上皮癌、肺腺癌、肝臓癌、胃癌、 白血病、悪性リンパ腫組織、直腸癌、結腸癌または脾臓癌に対するものである、請求 項 35または 36に記載の疾患マーカー。
[40] BUB1遺伝子に関する疾患マーカーが乳癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、口 腔扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌 (結腸癌、直腸癌)、胃癌、脾臓癌、肝臓癌、白血病
、リンパ腫またはメラノーマに対するものである、請求項 35または 36に記載の疾患マ 一力一
[41] ClOoriB遺伝子に関する疾患マーカーが乳癌、結腸癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、卵 巣癌、肝臓癌、脾臓癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌、小細胞肺癌またはメラノーマに対 するものである、請求項 35または 36に記載の疾患マーカー。
[42] HIFPH3遺伝子に関する疾患マーカーが乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、脾臓癌、肝 臓癌、肺腺癌または肺扁平上皮癌に対するものである、請求項 35または 36に記載 の疾患マーカー。
[43] 下記の工程 (a)、（b)および (c)を含む癌疾患の検出方法：
(a)被験者の生体試料カゝら調製された RNAまたは該 RNAから転写された相補的ポリヌ クレオチドと請求項 35〜42のいずれかに記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
(b)該疾患マーカーに結合した生体試料由来の RNAまたは該 RNAから転写された相 補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づ 、て、癌疾患の罹患を判断する工程。
[44] 工程 (c)における癌疾患の罹患の判断が、被験者について得られる測定結果を正 常者につ 、て得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大して ヽ ることを指標として行われるものである請求項 43に記載の癌疾患の検出方法。
[45] Lengsin、 BJ- TSA- 9、 C20orf42、 BUB1、 ClOoriBまたは HIFPH3を特異的に認識す る抗体を含有する、癌疾患の疾患マーカー。
[46] 癌疾患の検出においてプローブとして使用される請求項 45に記載の疾患マーカー
[47] 下記の工程 (a)、（b)および (c)を含む癌疾患の検出方法：
(a)被験者の生体試料力も調製されたタンパク質と請求項 45または 46に記載の疾患 マーカーとを結合させる工程、
(b)該疾患マーカーに結合した生体試料由来の蛋白質またはその部分ペプチドを、 上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づ 、て、癌疾患の罹患を判断する工程。
[48] 工程 (c)における癌疾患の罹患の判断が、被験者について得られる測定結果を正 常者につ 、て得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大して ヽ ることを指標として行われるものである請求項 47に記載の癌疾患の検出方法。
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