WO2007114217A1 - エリスロ又はスレオ－２－アミノ－３－ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法、新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、ベクター、形質転換体、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 - Google Patents

エリスロ又はスレオ－２－アミノ－３－ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法、新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、ベクター、形質転換体、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 Download PDF

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boc
cyclohexyl
polypeptide
dna
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PCT/JP2007/056798
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Tozo Nishiyama
Yoshihiko Yasohara
Original Assignee
Kaneka Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an Ellis-oral or threo N-Boc-2-amino-1-cyclohexyl 3-hydroxypropionate, a novel carboxylic reductase, and a gene thereof
  • the present invention relates to a vector containing the gene, a transformant transformed with the vector, and a method for producing an optically active alcohol using the same.
  • Optically active N-Boc-2 amino-3 cyclohexyl 3 hydroxypropionic acid ester is a useful compound as a synthetic raw material and intermediate for agricultural chemicals, pharmaceuticals and the like.
  • a method for producing optically active N—Boc—2 amino-3 cyclohexyl 3 hydroxypropionate ester a method of producing it from unsaturated ester via sharpened dihydroxylation reaction is known (non- (See Patent Document 1).
  • N-Boc-2 amino-3-cyclohexyl 3-oxopropionic acid ester is asymmetrically reduced to produce optically active N-Boc-2 amino-3 cyclohexyl 3—
  • a method for producing hydroxypropionic acid esters has been found.
  • Non-Patent Document 1 Momca Alonso et al, Organic Process Research & Development, 9, o 90-693, 2005
  • the present invention is different from the production method disclosed in Non-Patent Document 1 described above, and is a novel method for producing an Ellis mouth or threo N-Boc-2 amino 3 cyclohexyl 3 hydroxypropionic acid ester. It is an object of the present invention to provide a novel carboxylic reductase, its gene, a betater containing the gene, a transformant transformed with the vector, and a method for producing an optically active alcohol using them. Means for solving the problem
  • the present invention has one or more of the following features.
  • One feature of the present invention is that
  • R is a substituted or unsubstituted alkyl group or aryl group
  • N-Boc-2 amino-3-cyclohexyl-3oxopropionic acid ester represented by the following formula (2):
  • R is a substituted or unsubstituted alkyl group or aryl group
  • the Ellis mouth N- Boc-2 amino is produced by allowing an enzyme source having the activity of stereoselective reduction to act on the Eris mouth N-Boc-2 amino-3-cyclohexyl-3 hydroxypropionate represented by the formula This is a method for producing 3 cyclohexyl 3 hydroxypropionic acid ester.
  • N-Boc-2 amino 3 cyclohexyl 3-oxopropionate represented by the above formula (1) is substituted with an Arthrobacter genus, Bacillus Genus, Brevundimonas spp., Corvnebacterium spp., Oerskovia spp., Paenibacillus spp., Rhizobium spp., Candida spp, Debarvomes ), Pichia, Rhodotorula, Saccharomvcopsis, Saturnispora, Trigonopsis, Willopis, Corynespora (Corvn espora) , Encoding a microorganism selected from the group consisting of the genus Plectosphaerella, or a polypeptide obtained from the microbial force Production of N-Boc- 2-amino-3-cyclohexyl-3-hydroxypropionate represented by the above formula (2), characterized by acting a transformant capable of expressing
  • N-Boc-2 amino 3 cyclohexyl 3-oxopropionic acid ester is converted into the following formula (3):
  • R is a substituted or unsubstituted alkyl group or aryl group
  • the threo N- Boc-2 amino-3 is produced by the action of an enzyme source having stereoselective reduction activity on the hydroxypropionate ester. This is a method for producing cyclohexyl 3 hydroxypropionic acid ester.
  • N-Boc-2 amino 3 cyclohexyl 3-oxopropionic acid ester the Enterobacter genus
  • Morganella Mor_g Acts on microorganisms selected from the group consisting of genus anella, genus Pectobacterium, genus Circinella, genus Emericella, genus Eupenicillium, and genus Hormocomis
  • R is a substituted or unsubstituted alkyl group or aryl group
  • a polypeptide having the activity of producing (2R, 3R) —N—Boc—2-amino-1-cyclohexyl-3-hydroxypropionate represented by:
  • Another feature of the present invention is the following DNA (a), (b) or (c).
  • (c) consisting of a base sequence having a sequence identity of 60% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the N-Boc-2 amino-3 cyclohexyl 3-oxopropionate ester is asymmetric Which encodes a polypeptide having an activity to reduce the target to produce (2R, 3R) —N—Boc—2 amino-3 cyclohexoxyl 3-hydroxypropionate.
  • Another feature of the present invention is a vector containing the DNA.
  • Another feature of the present invention is the vector further comprising DNA encoding a polypeptide having reducible coenzyme regeneration ability.
  • Another feature of the present invention is a transformant obtained by transforming a host cell with the vector.
  • Another feature of the present invention is a method for producing an optically active alcohol, which comprises reacting the polypeptide or the transformant with a compound having a carboxy group.
  • a method for producing Ellis Mouth or Threo 1-N-Boc-2-amino 1-cyclohexyl 3-hydroxypropionate, a novel carboxylic reductase, its gene, a vector containing the gene, A transformant transformed with a vector and a method for producing a useful optically active alcohol using them are provided.
  • FIG. 1 shows the construction method and structure of recombinant vector pNBDG
  • N-Boc-2 amino-3-cyclohexyl 3-oxopropionic acid ester [N-Boc-2 amino-1-cyclohexyl 3-oxopropionic acid ester] of the present invention has the following formula: (1)
  • the R group is a substituted or unsubstituted alkyl group or aryl group.
  • alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, and a tertiary butyl group.
  • aryl groups include a full group and a naphthyl group. This compound can be synthesized by combining existing chemical synthesis. For example, it can be synthesized using the method described in J. Org. Chem. 1982, 47, 2663 and J. Am. Chem. Soc, 2003, 125, 5139.
  • the “method for producing Ellis mouth or threo N-Boc-2 amino-3 cyclohexyl 3 hydroxypropionate” of the present invention is based on N-Boc-2 amino-3-cyclohexyl lu 3-oxo.
  • An enzyme source having an activity of stereoselectively reducing the compound is allowed to act on propionate.
  • the enzyme source include a microbial cell, a polypeptide obtained from the microorganism, or a transformant capable of expressing a DNA encoding the polypeptide.
  • the depository organization includes an organization corresponding to a deposit number for identifying each microorganism.
  • the microorganism identified by the NBRC number is Available from the Department of Biogenetic Resources.
  • Microorganisms that can be used in the present production method are not particularly limited.
  • Arthrobacter genus for example, Arthrobacter genus, Bacillus, Brevundimonas, Corvnebacterium, Qerskovia, Paenibacillus, Rhi zobium, Candida, De Noriomyces (Debarvomvces), Pichia, Rhodotorula, Saccharo mvcopsis, Saturnispora, Trigonopsis, Willis opoli (Williopsis)
  • Examples include microorganisms of the genus CorvnesOora and Plectosphaerella. .
  • microorganisms include Arthrobacter paraffineus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Brevandimonas. 'Brevundimonas diminuta, Corvnebacterium ammoniagenes, Qerskovia turbata, Paenibacillus alvei, Ractorium radiobacter ), Candida magnoliae, Pano anomala, Pichia anomala, Phia minuta 'Ba ⁇ ⁇ Minuta (£ hia minuta var. Minuta) , Pichia Minuta noisychi 'Non Huar Nontmentans (Pichia minuta var.
  • Nonfermentans Hi-ya / 'Kin mouth' ⁇ Sa (Picnia xvlosa), Mustache I Saccharomvcopsis fibuligera, Saturnispora saitoi, Trigonop sis variabilis, Williopsis satanus noichi Murakii, Williopsis saaki Examples include Kashkov (Corvnespora cassiicola) and Plectos Dhaerella cucumerina.
  • Pichia xylosa NBRC0950 Rhodotorula glutinis var. Dairenensis NBRC0415, Saccharomvcopsis fibuligera NBRCO 104 , Trigonopsis variabilis NBRC0671. Williopsis saturnus var. Mrakii NBRC0895, Corynespora ‘Corvnespora cassiicola’ NBRC30049 Etc.
  • Microorganisms that can be used in this production method are not particularly limited, but when producing seleonic N—Boc—2-amino-3-cyclohexyl 3-hydroxypropionate, for example, enterobacter genus, Listed are microorganisms of the genus Monoregella (Morganella), Pectobacterium, Circinella, Emeric ella, Eupenicillium, and Hormocomis. It is done.
  • microorganisms are Enterobacter aerogenes (Enterobacter a erogenes), monoleganes, subsp. Emerisella unguis, Eupenicillium baarnense, Honoromocomis resina, and so on.
  • Microorganisms used in the production method of the present invention, and transformants capable of expressing DNA encoding the polypeptide obtained by the microbial ability include not only cultured cells but also processed products thereof.
  • the treated product here refers to, for example, cells treated with a surfactant or an organic solvent, dried cells, disrupted cells, crude cell extracts, etc., and those obtained by immobilizing them by known means. This means that it is included as long as the activity of asymmetric reduction of the above-mentioned N-Boc-2amino-3-cyclohexyl-3-oxopropionic acid ester remains.
  • Culture of the microorganism and transformant used in the production method of the present invention can be carried out using a normal liquid nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, organic nutrients and the like as long as they grow.
  • N-Boc-2 amino-3 cyclohexyl 3-oxopropionic acid ester An embodiment of the method for producing an optically active N-Boc-2-amino-3-cyclohexylpropionate ester characterized in that a microbial cell is allowed to act on the microorganism is described below.
  • Taslevole bunanore is allowed to react with the above Brewaantimo dibruta (Brevundimonas diminuta) N- Boc- 2 Amino 1- 3 cyclohexyl 3 — Examples include a method for producing tertiary butyl hydroxypropionate (see Example 1).
  • An optical activity characterized by allowing a transformant capable of expressing DNA encoding a polypeptide obtained from a microorganism to act on the N-Boc-2 amino-3 cyclohexyl 3oxopropionic acid ester described above.
  • N-Boc-2-amino-3-cyclohexyl-3-hydroxypropionic acid ester N-Boc-2 amino-3 cyclohexyl 3-oxopropionic acid ethyl ester described later is used.
  • polypeptide of the present invention is a polypeptide having an activity to reduce a compound having a carbo group to produce an optically active alcohol, preferably N-Boc-2 amino-3-cyclohexyl 3 oxopropion. It is a polypeptide having the activity of asymmetrically reducing an acid ester to produce (2R, 3R) —N—Boc— 2 amino-3 cyclohexyl 3 hydroxypropionic acid ester. Such a polypeptide can be isolated from organisms such as microorganisms having the activity.
  • polypeptide of the present invention a polypeptide having the amino acid sequence ability shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing can be mentioned. In addition, it has a sequence identity of a certain value or more with the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and N-Boc-2 amino-3 cyclohexyl-3-oxopropionic acid ester is not used.
  • Polypeptides having the activity to be reduced simultaneously to produce (2R, 3R) —N—Boc—2 amino-3 cyclohexyl 3 hydroxypropionate are equivalent to the polypeptides and are included in the present invention. It is.
  • the identity of the sequence is determined by, for example, comparing the two amino acid sequences using the homology search program FASTA (WR Pearson & DJ Lipman PNAS (1988) 85: 2444-2448). Represented by the Identity value for.
  • FASTA WR Pearson & DJ Lipman PNAS (1988) 85: 2444-2448.
  • the sequence identity with the polypeptide is 60% or more, preferably 70% or more. More preferred is a polypeptide that is 80% or more, most preferably 85%.
  • Such a polypeptide is obtained by, for example, ligating DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and DNA that hybridizes under stringent conditions to an appropriate vector. And then introduced into a suitable host cell and expressed.
  • an amino acid is added to a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can also be obtained by causing substitutions, insertions, deletions or additions.
  • the number of amino acids causing substitution, insertion, deletion or addition is not limited as long as the activity of the polypeptide of the embodiment is not lost, but is preferably 50 or less, more preferably 30 or less, more preferably 20 or less, and most preferably 10 or less.
  • the microorganism that is the origin of the polypeptide of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include the microorganisms shown in 2 above, and preferred are bacteria belonging to the genus Eigxmidi mo ⁇ . Particularly preferable examples include Brevundimonas diminuta NBRC12697 strain. Such microorganisms can be handed over from the Biological Resource Department of Biotechnology Headquarters, National Institute of Technology and Evaluation (NBRC: 292-0818 Kisarazu, Kazusa, Kazusa 2-5-8, Chiba Prefecture).
  • a medium for culturing the microorganism that is the source of the polypeptide of the present invention as long as the microorganism grows, a normal liquid nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, organic nutrients, and the like. Can be used.
  • Isolation of the polypeptide having the microbial strength that is the origin of the polypeptide of the present invention can be carried out by appropriately combining known protein purification methods. For example, it can be implemented as follows. First, the microorganism is cultured in an appropriate medium, and the cells are collected from the culture solution by centrifugation or filtration. The obtained cells are disrupted by an ultrasonic crusher or a physical method using glass beads, etc., and the cell residue is removed by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • the polypeptide of the present invention is isolated from the cell-free extract.
  • the “DNA” of the present invention is a DNA encoding the above-described polypeptide of the present invention, and any DNA can be used as long as it can express the polypeptide in a host cell introduced according to the method described below.
  • the untranslated region may be included. If the polypeptide can be obtained, those skilled in the art can obtain the DNA of the present invention from the microorganism that is the origin of the polypeptide by a known method. For example, the DNA of the present invention can be obtained by the method shown below.
  • the isolated polypeptide of the present invention is digested with an appropriate endopeptidase, and the resulting peptide fragment is fractionated by reverse-phase HPLC. Then, for example, a part or all of the amino acid sequences of these peptide fragments are determined by ABI492 type sequencer (Applied Biosystems).
  • a PCR (Polymerase Chain Reaction) primer for amplifying a part of DNA encoding the polypeptide is synthesized.
  • the chromosomal DNA or cDNA of the microorganism that is the origin of the polypeptide is prepared by a conventional DNA isolation method.
  • PCR is performed using the PCR primers described above, a part of the DNA encoding the polypeptide is amplified, and the nucleotide sequence is determined.
  • the base sequence can be determined using, for example, ABI373A type DNA Sequencer (manufactured by Applied Biosystems).
  • a DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing can be mentioned. It also has a sequence identity of a certain value or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and N-Boc-2-amino-3-cycl Encodes a polypeptide with the activity of asymmetric reduction of oral hexyl-3-oxopropionate to produce (2R, 3R) -NB oc- 2 amino-3 cyclohexyl 3 hydroxypropionate DNA is equivalent to the DNA and is included in the present invention.
  • the identity of the base sequences is determined when, for example, two base sequences are compared and prayed using the homology search program FASTA (WR Pearson & DJ Lipman PNAS (1988) 85: 2444-2448). , Expressed as an Identity value for the entire array.
  • FASTA WR Pearson & DJ Lipman PNAS (1988) 85: 2444-2448.
  • the sequence identity with the DNA is 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80 % Or more, and most preferably 85% DNA.
  • a DNA that hybridizes with a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing under stringent conditions, and N-Boc-2-amino-3 cyclohexane Encodes a polypeptide with the activity of asymmetric reduction of xyl-3-oxopropionate to produce (2 R, 3R) —N—Boc— 2 amino-1-cyclohexyl 3 hydroxypropionate ester DNA is also included in the DNA of the present invention.
  • DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a carbonyl group is reduced, and an optically active alcohol is converted.
  • DNA encoding a polypeptide having the activity to be produced is also encompassed by the DNA of the present invention.
  • a DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and a DNA that hybridizes under stringent conditions are expressed as follows.
  • a hybrid that specifically forms a DNA force consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is formed. Say DNA.
  • stringent conditions include, for example, 75 mM trisodium citrate, 750 mM sodium chloride, 0.5% sodium dodecyl sulfate, 0.1% ushi serum albumin, 0.1% polypyrrolidone. And 0.1 mM Ficoll 400 (Amersham Bioscience Co., Ltd.) in an aqueous solution composed of 15 mM citrate after hybridization at 65 ° C.
  • washing is performed at 65 ° C.
  • the cleaning is performed at 65 ° C. using an aqueous solution having a compositional power of 1.5 mM trisodium citrate, 15 mM sodium sodium chloride, and 0.1% sodium dodecyl sulfate.
  • the isolation of the above-described DNA described in this specification, and the preparation of the vector described below, genetic manipulation such as transformation, etc. are performed by Molecular Cloning 2 ⁇ edition (Cold bpnng Harbor Laboratory Press, 1989). It can be carried out by the method described in the document. Further,% used in the description of the present specification means% (wZv) unless otherwise specified.
  • the “vector” of the present invention is not particularly limited as long as it can express the gene encoded by the DNA in a suitable host cell.
  • examples of such vectors include plasmid vectors, phage vectors, cosmid vectors, and shuttle vectors that can exchange genes with other host strains can also be used.
  • Such vectors usually contain regulatory elements such as lacUV5 promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lpp promoter, tufB promoter, recA promoter, pL promoter, etc., and are operable with the DNA of the present invention. It can be suitably used as an expression vector comprising an expression unit linked to the. For example, PUCN18 described later can be used preferably.
  • the regulatory element refers to a base sequence having a functional promoter and any associated transcription element (eg, enhancer, CCAAT box, TATA box, SPI site, etc.).
  • any associated transcription element eg, enhancer, CCAAT box, TATA box, SPI site, etc.
  • operably linked means that the gene is operably linked to various regulatory elements such as a promoter that regulates gene expression, an enhancer, and the like. Say. It is a matter well known to those skilled in the art that the type and kind of regulatory factor can vary depending on the host.
  • examples of the vector of the present invention include the above pUCN18.
  • An example of the plasmid pNBD is a plasmid pNBD described later, into which DNA having a nucleotide sequence in which the 603rd C of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is changed to T is introduced (see Example 6).
  • host cells described in the present specification include bacteria, yeasts, filamentous fungi, plant cells, animal cells, etc., but Escherichia coli, which is preferred by bacteria from the introduction and expression efficiency, is particularly preferred.
  • the vector containing the DNA of the present invention can be introduced into a host cell by a known method. When using E. coli as the host cell, the vector can be introduced into the host cell by using, for example, a commercially available coli HB101 complex cell (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the “transformant” of the present invention can be obtained by incorporating DNA encoding the polypeptide of the present invention into the vector and introducing it into a host cell.
  • the “transformant” of the present invention includes not only cultured cells but also processed products thereof.
  • the treated product here refers to, for example, cells treated with a surfactant or an organic solvent, dried cells, disrupted cells, crude cell extracts, etc., and those obtained by immobilizing them by known means. It is included as long as the activity of asymmetric reduction of the above-mentioned N-Boc-2 amino-3 cyclohexyl 3oxopropionic acid ester remains.
  • Culture of the transformant of the present invention can be carried out using a normal liquid nutrient medium containing a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, organic nutrients and the like as long as it grows.
  • Examples of the transformant of the present invention include coli HB101 (pNBD) described later (see Example 8).
  • a compound comprising a compound having a carbocyclic group serving as a substrate and a polypeptide of the present invention or DNA encoding the polypeptide is introduced in an appropriate solvent. It can carry out by adding the transformed transformant. If necessary, a coenzyme such as NADH may be added.
  • a coenzyme such as NADH may be added.
  • an aqueous solvent may be used, or an aqueous solvent and an organic solvent may be mixed and used. Examples of organic solvents include toluene, ethyl acetate, n-butyl acetate, hexane, isopropanol, diisopropyl.
  • reaction substrate is added at a feed concentration of 0.1% to 70% (w / v), for example.
  • Examples of the "compound having a carbonyl group" serving as a substrate include N-Boc-2 amino
  • Examples thereof include 3-cyclohexyl 3-ethyl oxopropionate and the like, but are not particularly limited as long as they are reduced under the above reaction conditions and converted into “optically active alcohol”.
  • Optically active alcohols generated by the reaction can be purified by a conventional method. For example, a reaction liquid containing optically active alcohols produced in the reaction is extracted with an organic solvent such as ethyl acetate or toluene, and the organic solvent is distilled off under reduced pressure, followed by distillation, recrystallization, chromatography, etc. It can refine
  • an organic solvent such as ethyl acetate or toluene
  • a transformant introduced with the polypeptide of the present invention or a vector containing DNA encoding the polypeptide, a compound having a carbonyl group, and, if necessary, a coenzyme such as NADH are contacted and reacted.
  • an optically active alcohol can be produced by asymmetrically reducing the compound having the carbonyl group.
  • coenzymes such as NADH are converted to oxidized forms.
  • a polypeptide having the ability to convert this oxidized coenzyme into a reduced form hereinafter referred to as coenzyme regeneration ability
  • a compound serving as a substrate for the polypeptide coexist with the polypeptide of the present invention.
  • polypeptides having coenzyme regeneration ability include hydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, glucose 6-phosphate dehydrogenase, and glucose dehydrogenase. it can. Preferably, glucose dehydrogenase is used.
  • Examples of vectors in which both the DNA encoding the polypeptide of the present invention and the DNA encoding a polypeptide having a coenzyme regeneration ability are incorporated include the above-described expression vector pNBD and the glucose dehydration derived from Bacillus megaterium Examples include pNBDG, which will be described later, into which an enzyme gene has been introduced (see Example 7).
  • a transformant containing both the DNA encoding the polypeptide of the present invention and the DNA encoding the polypeptide having the ability to regenerate reduced coenzyme is a DNA that encodes the polypeptide of the present invention and a complement.
  • the culture of the transformant containing both the DNA encoding the polypeptide of the present invention and the DNA encoding the polypeptide having the coenzyme regenerating ability is a normal carbon source as long as it grows. , Using a liquid nutrient medium containing nitrogen sources, inorganic salts, organic nutrients, etc.
  • an optically active alcohol is produced by combining the polypeptide of the present invention and a polypeptide having a coenzyme regeneration ability
  • the above reaction composition contains a polypeptide having a coenzyme regeneration ability (for example, glucose dehydrogenation).
  • Enzyme and its substrate compound (eg, dalcose) are further added.
  • Optically active alcohols can be produced in the same manner using a transformant containing both the DNA encoding the polypeptide of the present invention and the DNA encoding a polypeptide having coenzyme regeneration ability.
  • the above optically active alcohol can be obtained using both of a transformant containing DNA encoding the polypeptide of the present invention and a transformant containing DNA encoding a polypeptide having coenzyme regeneration ability. May be produced.
  • each microorganism described in each example can be obtained by those skilled in the art from various depository institutions.
  • the depository organization includes an organization corresponding to a deposit number for identifying each microorganism.
  • the microorganism identified by the NBRC number is available from the National Institute of Technology and Evaluation Biological Resource Center.
  • a liquid medium having composition power of 10 g of meat extract, 10 g of peptone, 5 g of yeast extract and 13 g of NaC (all per 1 L) was prepared, and steam sterilized at 120 ° C for 20 minutes.
  • NBRC 3168 Oenoskobia, Oerskovia tur bata NBRC15015, Paenibacillus alvei NBRC334 3, Pectopacterum carotobolum subspice Caro NBRC3830, Pectobacterium carotovorum subsp. Caroto vorum NBRC12380, Pectobacterium carrotorum subsp. Carotovorum NBRC3830 carotovorum; NBRC 14082, Rhizobium radiobacter NBRC 13264, each bacterial cell was inoculated with a white gold ear and cultured with shaking at 30 ° C for 24-72 hours.
  • N-Boc-2-amino-3-cyclohexyl 3-hydroxypropionate tert-butyl quantification and its threo-Z erythrocyte ratio were measured using capillary column chromatography (column: InertCAP5 (IDO 25 mm ⁇ 30 m), column temperature: 200 ° C., carrier gas: helium (70 kPa), detection: FID). The results are shown in Table 1.
  • Table 1 Bacteria that asymmetrically reduce tertiary butyl N-Boc-2 amino-3-cyclohexyl-3 oxopropionate
  • glucose 40 g glucose 40 g, yeast extract 3 g, KH PO 7 g, (NH) HPO 13 g,
  • a liquid medium having a composition of O'5H 05 mg and MnSO 4-6 ⁇ OlOmg (each per liter) was prepared and steam sterilized at 120 ° C for 20 minutes.
  • Candida magnoliae NBRCO 705, Debaryomyces polymorphus were cultured in an agar medium (pH 7) consisting of 200 g of malt extract and 20 g of agar (l, each per liter).
  • Each obtained culture solution was centrifuged to collect microbial cells, and suspended in 1 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5).
  • liquid medium ( ⁇ 7) with a composition of 10 g of gnolecose, 10 g of polypeptone, 10 g of meat extract, 5 g of yeast extract, NaCllg, MgSO ⁇ 7 ⁇ ⁇ . 5 g (each per liter) ) 5ml was prepared and steam sterilized at 120 ° C for 20 minutes.
  • Emericella unguis NBRC8087, Eupen icillium baarnense NBRC6090, Hormocomis resina e NBRC6367 cucumerina) NBRC30005 was inoculated with one platinum loop and cultured with shaking at 30 ° C for 24-72 hours.
  • Bacteria were collected from each culture solution obtained by filtration and suspended in 1 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5).
  • Table 3 Molds that asymmetrically reduce tertiary butyl N-Boc-2 amino-3-cyclohexyl 3 oxopropionate
  • N—Boc—2 amino-3 cyclohexenole-3 oxopropionate ethyl is asymmetrically reduced from Brevundimonas dimi miia NBRC 12697 (2R, 3R) — N— Boc— 2 Amino-3 Cyclic Hexylute Polypeptide with activity to form ethyl 3-hydroxypropionate Were separated and purified to a single one. Unless otherwise specified, purification operations were performed at 4 ° C.
  • the reduction activity for N-Boc-2 amino-3 cyclohexyl 3 oxopropionate was calculated as follows. First, add a suitable amount of crude enzyme solution and lOOmM phosphate buffer (PH6.5) to the test tube to make a total volume of 0.5 ml. Further, 0.25 mg of N-Boc-2-amino-1-cyclohexyl-3-oxopropionate and NADHlmg were added and reacted at 30 ° C. for 2 hours with shaking. After the reaction, extraction was performed by adding 1 ml of ethyl acetate.
  • the amount of N—Boc— 2 amino 3 cyclohexyl 3 hydroxypropionate produced was determined by a capillary gas chromatography (column: InertCAP5 (IDO. 25 mm X 30 m) manufactured by GL Science Co., Ltd.), column temperature: 200 ° C, carrier gas: helium (70 kPa), detection: FID). Enzymatic activity was also calculated for the amount of N-Boc-2 amino-3-cyclohexyl 3-hydroxypropionate produced. In this reaction condition, the activity to produce L mol of N-Boc-2 amino-3 cyclohexyl-3-hydroxypropionate in 1 minute was defined as lunit.
  • Bacteria were collected from the culture broth by centrifugation and washed with 0.8% aqueous sodium chloride solution. This cell is suspended in a 10 mM phosphate buffer solution (PH 7.0) containing 5 mM j8-mercaptoethanol, disrupted using a SONIFIER250 ultrasonic crusher (manufactured by BRANSON), and then centrifuged to separate the cells. A cell-free extract was obtained by removing body residues.
  • PH 7.0 10 mM phosphate buffer solution
  • SONIFIER250 ultrasonic crusher manufactured by BRANSON
  • the above cell-free extract was diluted with 10 mM phosphate containing 5 mM j8-mercaptoethanol.
  • the column was applied to a DEAE-TOYOPEARL 650M column (400 ml) that had been equilibrated in advance with an impulse solution (pH 7.0) to adsorb the active fraction. After washing the column with the same buffer, the active fraction was eluted with a NaCl linear gradient (0M force up to 0.3M).
  • the active fraction obtained by Phenyl- TOYOPEARL column chromatography was pre-equilibrated with 10 mM phosphate buffer ( ⁇ 7.0) containing 5 mM ⁇ -mercaptoethanol and 10% glycerin 5′-AMP Sepharose6 4B (Amersham) The product was applied to a column (14 ml) manufactured by Bioscience Co., Ltd. to adsorb the active fraction. After the column was washed with the same buffer, the active fraction was eluted with a NaCl linear gradient (from 0 M to 2 M) to obtain a purified sample of a single polypeptide electrophoretically.
  • the purified polypeptide obtained in Example 4 was denatured in the presence of 8 M urea and then digested with lysyl endopeptidase derived from achromobacter (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the amino acid sequence of the obtained peptide fragment was ABI492 Type protein sequencer (Applied Biosystems).
  • a primer 1 5′—TGGGARATHGAYCTNGGNGA—3 ′ (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) for amplifying a part of the gene encoding the polypeptide by PCR
  • Primer —2 5′— GGNGTRTCDATRTANCCYGG— 3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing) was synthesized.
  • the chromosomal DNA of Brevundimonas diminuta NBRC12697 strain prepared by myself was completely digested with restriction enzyme BamHI, and the resulting DNA fragment mixture was intramolecularly cyclized with T4 ligase.
  • the entire base sequence of the gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 was determined from the iPCR method (Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)). The results are shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • i — PCR was performed using TaKaRa LA Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) as a DNA polymerase, and the reaction conditions were in accordance with the instruction manual.
  • the amino acid sequence encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 2.
  • Primer 3 5 'AGGACAAGCATATGGATCACGACTTCGCAGGC-3' (SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing)
  • Primer 4 5 '-CAGGGTGAATTCTTACTATTGCGCCGTAT ATCCG-3' (SEQ ID NO: 7 in the Sequence Listing)
  • Primer 5 5 'AGTGCGACGATCCCGTC AAATTCCTCCTGGCTGAC-3' SEQ ID NO: 8)
  • primer 6 5'— GTCAG CCAGGAGGAATTTGACGGGATCGTCGCACT-3 '(SEQ ID NO: 9) PCR was carried out using the chromosome DNA of the Brevundimonas diminuta NBRC 12697 strain obtained in Example 5 as a saddle type.
  • the combination of primers 3 and 5 and the combination of primers 4 and 6 yielded about 0.6 kbp and 0.2 kbp double-stranded DNA, respectively.
  • PCR was performed with the combination of primers 3 and 4 using a mixture of these double-stranded DNAs as a saddle.
  • it is a gene that has a base sequence ability that has been modified to the 60th C force of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the EcoRI site has been destroyed. Double-stranded DNA with EcoRI recognition site added immediately after the stop codon was obtained.
  • PCR was performed using Pyrobest DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) as a DNA polymerase, and the reaction conditions were in accordance with the instruction manual.
  • This DNA was digested with Ndel and EcoRI, and the 185th T of the plasmid pUCN18 (PUC18 (manufactured by Takara Bio Inc.) was changed to A by PCR to destroy the Ndel site.
  • the description of the 185th T and the 471st to 472nd GC used here was in accordance with the description of GenBank Accession No. L09136.
  • primer 7 5 '-CAGGAGCTCTAAGGAGGTTAACAATGTATAAAG-3' (SEQ ID NO: 10 in the sequence listing) and primer 8: 3'—CACGGATCCTTATCCGCGTCCTGCTTG G— 5 '(SEQ ID NO: 11 in the sequence listing), plasmid pGDKl (Eur. J.
  • Biochem , 186, 38 9 (1989) can be prepared by PCR, and Bacillus megaterium IAM1030 strain (IAM Culture Collection, Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo 113- 0032 1 1 1)
  • a force-available glucose dehydrogenase (hereinafter referred to as GDH) gene is added with an Escherichia coli ribosome binding sequence 5 bases upstream from the start codon, and a Sacl recognition site is added immediately before and ends. Double-stranded DNA with a BamHI recognition site attached immediately after the codon was obtained.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • Each of the two transformants obtained in Example 8 and coli HB101 (pUCN18) (comparative example), which is a transformant containing the vector plasmid pUCN 18, contains 200 / zg / ml ampicillin.
  • XYT medium tryptone 1.6%, yeast extract 1.0%, NaCl 0.5%, pH 7.0
  • the cells were collected by centrifugation and suspended in 5 ml of lOOmM phosphate buffer (pH 6.5). This was crushed using a UH-50 type ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • Table 4 shows the specific activity of N-Boc-2 amino-3 cyclohexoxyl-3-oxopropionate reducing activity and GDH activity of this cell-free extract.
  • E. coli HB 101 (pUCN 18) N.D.N.D.
  • GDH activity was measured in 1M Tris-HCl buffer (pH 8.0), glucose 0.1M, coenzyme NAD2mM, and The crude enzyme solution was added, the reaction was performed at 25 ° C for 1 minute, and the rate of increase in absorbance at a wavelength of 340 nm was calculated. Under this reaction condition, the enzyme activity that reduces mol NAD to NADH in 1 minute was defined as lunit.
  • N- Boc- 2-amino-3 Measurement of constant volume and threo Z Ellis opening ratio of cyclohexyl 3-hydroxypropionic acid Echiru is Canon bi Larry gas chromatography (column: manufactured by GL Science Co. l ner tCAP5 (IDO 25 mm ⁇ 30 m), column temperature: 200 ° C., carrier gas: helium (70 kPa), detection: FID).
  • the optical purity of N-Boc-2 amino 3-cyclohexyl 3-hydroxypropionate was measured by treatment with trifluoroacetic anhydride, followed by capillary gas chromatography (column: Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.). It was carried out using CHIRALDEX G-TA (ID 0.25 mm ⁇ 20 m) manufactured by company, column temperature: 120 ° C., carrier gas: helium (70 kPa), detection: FID).
  • Transformant coli H B101 pNTOM5Gl expressing DNA encoding a polypeptide obtained from Pichia minuta var. Minuta as an open transformant (International Publication No. WO2006— 013801)
  • This method was carried out in the same manner as in Example 10 except that NADP was used instead of NAD.

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Abstract

エリスロ又はスレオ－２－アミノ－３－ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法等を提供する。微生物菌体を作用させてＮ－２－アミノ－３－オキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元する方法、ブレヴァンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属に属する微生物より単離された、カルボニル化合物を不斉的に還元して光学活性アルコールを生成する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡおよび該ポリペプチドを生産する形質転換体。並びに、該ポリペプチドまたは該形質転換体を利用して、カルボニル化合物を還元し、光学活性アルコールを製造する方法。                                                                       

Description

明 細 書
エリス口又はスレオ一 2 -ァミノ _ 3 _ヒドロキシプロピオン酸エステルの製 造方法、新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、ベクター、形質転換体、および それらを利用した光学活性アルコールの製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、エリス口又はスレオ体の N—Boc— 2 ァミノ一 3 シクロへキシル 3— ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法、新規カルボ-ル還元酵素、その遺伝子
、その遺伝子を含むベクター、そのベクターで形質転換された形質転換体、およびそ れらを利用した光学活性アルコールの製造方法に関する。
背景技術
[0002] 光学活性な N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸 エステルは、農薬、医薬品等の合成原料及び中間体として有用な化合物である。光 学活性な N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸エス テルを製造する方法としては、不飽和エステルからシャープレスジヒドロキシレーショ ン反応を経て製造する方法が知られて ヽる (非特許文献 1参照)。
[0003] し力し、 N— Boc— 2 ァミノ一 3 シクロへキシル 3—ォキソプロピオン酸エステ ルを不斉的に還元して、光学活性な N— Boc— 2 ァミノ 3 シクロへキシル 3— ヒドロキシプロピオン酸エステルを製造する方法は見出されて 、な 、。
非特許文献 1 : Momca Alonso et al、 Organic Process Research & Development, 9, o 90-693, 2005
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は、上述の非特許文献 1に開示された製造法とは異なる、新規なエリス口又 はスレオ体の N— Boc— 2 ァミノ 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸 エステルの製造法、新規カルボ-ル還元酵素、その遺伝子、その遺伝子を含むベタ ター、そのベクターで形質転換された形質転換体、およびそれらを利用した光学活 性アルコールの製造方法を提供することを課題とする。 課題を解決するための手段
[0005] 本発明は、以下の 1または複数の特徴を有する。
(1)本発明の一つの特徴は、
下記式（1) :
[0006] [化 6]
Figure imgf000003_0001
[0007] (Rは、置換または無置換の、アルキル基またはァリール基である）
で表される N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ォキソプロピオン酸エス テルに、該化合物を下記式（2)：
[0008] [化 7]
Figure imgf000003_0002
[0009] (Rは、置換または無置換の、アルキル基またはァリール基である）
で表されるエリス口 N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロ ピオン酸エステルに立体選択的に還元する活性を有する酵素源を作用させること〖こ よる、エリス口 N— Boc— 2 ァミノ 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン 酸エステルの製造方法である。 (2)本発明の別の特徴は、前記式（1)で表される N— Boc— 2 ァミノ 3 シクロへ キシル 3—ォキソプロピオン酸エステルに、アースロバクタ一（Arthrobacter)属、 バシラス（Bacillus)属、ブレヴアンディモナス（Brevundimonas)鼠、コリネバクテリウ ム属 (Corvnebacterium)属、ォエノレスコビア (Oerskovia)属、ノ ェニノシラス (Pa enibacillus)鼠、リゾビゥム（Rhizobium)属、キャンディダ（Candida)属、デバリオ マイセス (Debarvomvces)属、ピキア (Pichia)属、ロドトノレーラ (Rhodotorula)属、 サッカロマイコプシス (Saccharomvcopsis)属、サツル-スポラ (Saturnispora)属、 トリゴノプシス (Trigonopsis)属、ウイリオプシス (Williopsis)属、コリネスポラ（Corvn espora)属、プレクトスファエレラ (Plectosphaerella)属からなる群より選ばれる微生 物、又は該微生物力 得られるポリペプチドをコードする DNAを発現可能な形質転 換体を作用させることを特徴とする、前記式（2)で表されるエリス口一 N— Boc— 2— アミノー 3—シクロへキシル— 3—ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法である。
(3)本発明の別の特徴は、前記 N— Boc— 2 ァミノ 3 シクロへキシル 3—ォキ ソプロピオン酸エステルに、該化合物を下記式（3)：
[0010] [化 8]
Figure imgf000004_0001
[0011] (Rは、置換または無置換の、アルキル基またはァリール基である）
で表されるスレオ N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシノレ 3 ヒドロキシプロピ オン酸エステルに立体選択的に還元する活性を有する酵素源を作用させることによ る、スレオ一 N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸 エステルの製造方法である。
(4)本発明の別の特徴は、前記 N— Boc— 2 ァミノ 3 シクロへキシル 3—ォキ ソプロピオン酸エステルに、ェンテロパクター（Enterobacter)属、モルガネラ（Mor_g anella)属、ぺクトノくクテリゥム (Pectobacterium)属、シノレシネラ (Circinella)属、 ェメリセラ (Emericella)属、ェゥぺニシリウム（Eupenicillium)属、ホルモコミス（Ho rmocomis)属カもなる群より選ばれる微生物を作用させることを特徴とする、前記式 (3)で表されるスレオ N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプ ロピオン酸エステルの製造方法である。
(5)本発明の別の特徴は、以下の（a)、（b)又は (c)のポリペプチドである。
(a)配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド；
(b)配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が 置換、挿入、欠失及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記 N— Boc 2 アミノー 3 シクロへキシルー 3 ォキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元 し、下記式 (4) :
[0012] [化 9]
Figure imgf000005_0001
[0013] (Rは、置換または無置換の、アルキル基またはァリール基である）
で表される（2R, 3R)—N— Boc— 2 ァミノ一 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプ ロピオン酸エステルを生成する活性を有するポリペプチド；
(c)配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列と 60%以上の配列同一性を示すアミノ 酸配列からなり、かつ、前記 N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル—3—ォキソ プロピオン酸エステルを不斉的に還元して、前記（2R, 3R)—N— Boc— 2 ァミノ 3—シクロへキシル 3—ヒドロキシプロピオン酸エステルを生成する活性を有する ポリペプチド。
(6)本発明の別の特徴は、以下の（a)、（b)又は (c)の DNAである。
(a)配列表の配列番号 1に示す塩基配列を含む DNA; (b)配列表の配列番号 1に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含む DNAとストリン ジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、前記 N— Boc— 2 ァミノ 3 シクロへ キシルー 3 ォキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元して、前記（2R, 3R) -N — Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸エステルを生成 する活性を有するポリペプチドをコードする DNA;
(c)配列表の配列番号 1に示す塩基配列と 60%以上の配列同一性を示す塩基配列 からなり、かつ、前記 N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3—ォキソプロピオ ン酸エステルを不斉的に還元して、前記（2R, 3R)—N— Boc— 2 ァミノ 3 シク 口へキシルー 3—ヒドロキシプロピオン酸エステルを生成する活性を有するポリべプチ ドをコードする DNA。
(7)本発明の別の特徴は、前記 DNAを含むベクターである。
(8)本発明の別の特徴は、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードする D NAをさらに含む前記ベクターである。
(9)本発明の別の特徴は、前記ベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形 質転換体である。
(10)本発明の別の特徴は、前記ポリペプチド、又は、前記形質転換体を、カルボ- ル基を有する化合物と反応させることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法 である。
発明の効果
[0014] 本発明により、エリス口又はスレオ一 N— Boc— 2 ァミノ一 3 シクロへキシル 3 ーヒドロキシプロピオン酸エステルの製造法、新規カルボ-ル還元酵素、その遺伝子 、その遺伝子を含むベクター、そのベクターで形質転換された形質転換体、およびそ れらを利用した有用な光学活性アルコールの製造方法が提供される。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]組換えベクター pNBDGの作製法および構造を示す
発明を実施するための最良の形態
[0016] 以下、本発明を、実施形態を用いて詳細に説明する。本発明はこれらにより限定さ れるものではない。 [0017] 1. N— Boc— 2 ァミノ一 3 シクロへキシル 3—ォキソプロピオン酸エステル 本発明の「N— Boc— 2 ァミノ一 3 シクロへキシル 3 ォキソプロピオン酸エス テル」は、下記式（1)
[0018] [化 10]
Figure imgf000007_0001
[0019] で示される化合物であり、 R基は、置換または無置換の、アルキル基またはァリール 基である。アルキル基の例としては、メチル基、ェチル基、イソプロピル基、 n—ブチ ル基、イソブチル基、ターシャルブチル基などが挙げられる。また、ァリール基の例と しては、フ -ル基、ナフチル基などが挙げられる。この化合物は、既存の化学的合 成を組み合わせることにより合成できる。例えば、 J. Org. Chem. 1982, 47, 2663と J. A m. Chem. Soc, 2003, 125, 5139に記載の手法を用いて合成できる。
[0020] 2.エリス口又はスレオ一 N— Boc— 2 ァミノ一 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシ プロピオン酸エステルの製造方法
本発明の「エリス口又はスレオ一 N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒ ドロキシプロピオン酸エステルの製造方法」は、基質となる N— Boc— 2 ァミノ 3— シクロへキシルー 3—ォキソプロピオン酸エステルに、該化合物を立体選択的に還元 する活性を有する酵素源を作用させることを特徴とする。その酵素源としては、微生 物菌体、該微生物より得られるポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードする DNA を発現可能な形質転換体が挙げられる。
[0021] 本明細書で後述する各微生物は、さまざまな寄託機関より当業者が入手可能であ る。寄託機関としては、各微生物を特定する受託番号に対応する機関が挙げられる 。例えば、 NBRC番号で特定される微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機 構生物遺伝資源部門より入手可能である。
[0022] 本製造方法に使用できる微生物は、特に限定されないが、エリスロー N— Boc— 2 ァミノ 3—シクロへキシル 3—ヒドロキシプロピオン酸エステルを製造する場合 は、例えば、アースロバクタ一（Arthrobacter)属、バシラス（Bacillus)属、ブレヴァ ンディモナス (Brevundimonas)属、コリネノ クテリゥム属 (Corvnebacterium)属、 ォエルスコビア (Qerskovia)属、バエ-バシラス (Paenibacillus)属、リゾビゥム (Rhi zobium)属、キャンディダ (Candida)属、デノ リオマイセス（Debarvomvces)属、ピ キア（Pichia)属、ロドトノレーラ（Rhodotorula)属、サッカロマイコプシス (Saccharo mvcopsis)属、サッノレニスポラ（Saturnispora)属、トリゴノプシス (Trigonopsis)属 、ウイリオプシス (Williopsis)属、コリネスポラ（CorvnesOora)属、プレクトスファエレ ラ (Plectosphaerella)属の微生物などが挙げられる。
[0023] さらに好ましい微生物としては、アースロバクタ一'バラフイネウス (Arthrobacter paraffineus)、バシラス ·リチェ-フオルミス (Bacillus licheniformis)、バシラス'ズ ブチリス (Bacillus subtilis)、ノ シラス ·ッリンギェンシス (Bacillus thuringiensis )、ブレヴアンディモナス'ディミヌータ (Brevundimonas diminuta)、コリネノ クテリ ゥム ·アンモニアゲネス (Corvnebacterium ammoniagenes)、才エノレスコビア ·タ 一ノ タ (Qerskovia turbata)、ノェニノ シラス ·ァノレべィ (Paenibacillus alvei)、 リゾビゥム ·ラジオパクター (Rhizobium radiobacter)、キャンディダ ·マグノリアェ（ Candida magnoliae)、ァノ リオマイセス ·ポリモノレファス (Debarvomvces polvm orphus)、ピキア ·ァノマラ (Pichia anomala)、ピキア ·ミヌータ 'バ^ ~ ·ミヌータ（£ hia minuta var. minuta)、ピキア ·ミヌータ ·ノ一'ノンフアーメンタンス (Pichia minuta var. nonfermentans) ,ヒ-や /' ·キン口' ~~サ (Picnia xvlosa)、口卜 I レ ーラ ·グノレティ-ス ·ノ一'タイレネンシス (Rhodotorula glutinis var. dairenen sis)、サッカロマイコプシス ·フイブリゲラ (Saccharomvcopsis fibuligera)、サッノレ ニスポラ ·サイトーィ（Saturnispora saitoi)、トリゴノプシス .ノ リアビリス（Trigonop sis variabilis)、ウイリオプシス ·サターナス ·ノ一 ·ムラキイ（Williopsis saturnus var. mrakii)、コリ不スホフ 'カシィコフ (Corvnespora cassiicola)、プレクトスファ エレラ ·ククメリナ (PlectosDhaerella cucumerina)などが挙げられる。 [0024] 具体的には、当業者が容易に入手可能な以下の、アースロバクタ一 'バラフイネウス (Arthrobacter paraffineus) ATCC21218、バシラス ·リチェニフォルミス（Bacill us licheniformis) NBRC 12195、ノくシラス.ズブチリス（Bacillus subtilis)ATC C14593、バシラス ·ッリンギェンシス (Bacillus thuringiensis) NBRC3951、ブレ ヴアンディモナス ·ディミヌータ（Brevundimonas diminuta) NBRC 12697、コリネ パクテリゥム ·アンモニアゲネス (Corvnebacterium ammoniagenes) NBRC 120
72、ォエノレスコビア ·ターバタ（Oerskovia turbata) NBRC 15015,バエ-バシラ ス ·アルべィ（Paenibacillus alvei) NBRC3343、リゾビゥム ·ラジオパクター（Rhiz obium radiobacter) NBRC 13264,キャンディダ'マグノリアェ（Candida magn oliae) NBRC0705、デバリオマイセス ·ポリモノレファス (Debarvomvces polvmorp hus) ATCC20280,ピキア，ァノマラ（Pichia anomala) NBRC0120,ピキア 'ミヌ ータ 'バー'ミヌータ（pichia minuta var. minuta) NBRC0975.ピキア'ミヌー タ ·バー ·ノンフアーメンタンス (Pichia minuta var. nonfermentans) NBRC 1 4
73、ピキア ·キシローサ（Pichia xylosa) NBRC0950,ロドトルーラ'グルティ-ス' バー .ダイレネンシス (Rhodotorula glutinis var. dairenensis) NBRC0415 , サッカロマイコプシス.フイブリゲラ (Saccharomvcopsis fibuligera) NBRCO 104 , サッノレニスポラ ·サイトーィ（SaturnisOora saitoi) NBRC1134,トリゴノプシス'バリ アビリス（Trigonopsis variabilis) NBRC0671.ウイリオプシス 'サターナス'バー' ムラキイ（Williotisis saturnus var. mrakii) NBRC0895、コリネスポラ '力シィコ ラ (Corvnespora cassiicola) NBRC30049、プレクトスファエレラ ·ククメリナ (Plec tosphaerella cucumerina) NBRC30005などが举げられるハ
[0025] 本製造方法に使用できる微生物は、特に限定されないが、スレオー N— Boc— 2— ァミノ 3—シクロへキシル 3—ヒドロキシプロピオン酸エステルを製造する場合は、 例えば、ェンテロパクター（Enterobacter)属、モノレガネラ（Morganella)属、ぺクト ノ クテリゥム（Pectobacterium)属、シ /レシネラ（Circinella)属、ェメリセラ（Emeric ella)属、ェゥぺニシリウム（Eupenicillium)属、ホルモコミス（Hormocomis)属の微 生物などが挙げられる。
[0026] さらに好ましい微生物としては、ェンテロバクタ一'ァエロゲネス (Enterobacter a erogenes)、モノレガネラ .モノレガニイ ·サブエスピー ·モノレガニイ (Morganella morg anii subsp. morganii)、ぺクトノくクテリゥム ·カロトボラム ·サブエスピー ·力ロトボラ ム (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)、シルシネフ ·アン ベラータ (Circinella umbellata)、ェメリセラ ·アングイス (Emericella unguis)、 ェゥぺニシリウム'バーネンセ（Eupenicillium baarnense)、ホノレモコミス'レシナェ (Hormocomis resinae)など力孕げられる。
[0027] 具体的には、当業者が容易に入手可能な以下の、ェンテロパクター 'ァエロゲネス（ Enterobacter aerogenes) NBRC 13534,モノレガネラ'モノレガニイ'サブエスピー 'モル;! ニイ（Morganella morganii subsp. morganii) NBRC 3168,へクトノ クテリゥム .カロトボラム .サブエスピー 'カロトボラム (Pectobacterium carotovoru m subsp. carotovorum) NBRC3830、ぺクトパクテリゥム ·カロトボラム ·サブェ スピ ~~ ·力ロトホフム (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) N BRC12380、ぺクトバタテリゥム 'カロトボラム ·サブエスピ一'カロトボラム (Pectobac terium carotovorum suosp. carotovorum) NBRC14082.ンノレンネフ · "？ン ベラータ（Circinella umbellata) NBRC4452、ェメリセラ ·アングイス (Emericella unguis) NBRC8087.ェゥぺ-シリウム'バーネンセ（EuOenicillium baarnens e) NBRC6090、ホノレモコミス .レシナェ（Hormocomis resinae) NBRC6367など が挙げられる。
[0028] 本発明の製造方法に使用する微生物、および、該微生物力 得られるポリペプチド をコードする DNAを発現可能な形質転換体は、培養菌体は言うまでもなぐその処 理物も含まれる。ここで言う処理物とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した 細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれ らを固定化したものを意味し、上述の N— Boc— 2 ァミノ 3 シクロへキシル - 3 ォキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元する活性が残存する限りはこれに含 まれる。本発明の製造方法に使用する微生物および形質転換体の培養は、それが 増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄 養培地を用いて実施できる。
[0029] 上述の N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ォキソプロピオン酸エステ ルに微生物菌体を作用させることを特徴とする光学活性 N -Boc- 2-ァミノ 3— シクロへキシルー 3—ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法の実施形態として は、後述して 、る N -Boc- 2-ァミノ 3—シクロへキシル 3—ォキソプロピオン酸 ターシャノレブナノレに、上 のブレワアンティモ "ス.ディミヌータ (Brevundimonas diminuta)を作用させる、エリス口一 N— Boc— 2 ァミノ一 3 シクロへキシル 3— ヒドロキシプロピオン酸ターシャルブチルの製造法などが挙げられる（実施例 1参照）
[0030] 上述の N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ォキソプロピオン酸エステ ルに微生物より得られるポリペプチドをコードする DNAを発現可能な形質転換体を 作用させることを特徴とする光学活性 N -Boc- 2-ァミノ 3—シクロへキシル - 3 —ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法の実施形態としては、後述して ヽる N — Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ォキソプロピオン酸ェチルに、上述の ブレヴアンディモナス ·ディミヌータ (Brevundimonas diminuta)より取得したポリぺ プチドをコードする DNAを発現させた形質転換体を作用させる、 (2R, 3R) N— B oc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸ェチルの製造法（ 実施例 10参照）、 N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ォキソプロピオン 酸ェチルにキャンディダ.マグノリアェ (Candida magnoliae)より取得したポリぺプ チドをコードする DNAを発現させた形質転換体を作用させる、 (2R, 3R) -N-Boc 2 ァミノ 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸ェチルの製造法（実施 例 11参照）、 N— Boc— 2 ァミノ一 3 シクロへキシル 3 ォキソプロピオン酸ェ チルにピキア'ミヌータ 'バ^ ~ ·ミヌータ（Pichia minuta var. minuta)より取得し たポリペプチドをコードする DNAを発現させた形質転換体を作用させる、 (2S, 3S) — N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸ェチルの 製造法 (実施例 12参照)などが挙げられる。
[0031] また、当業者であれば、これら以外の微生物においても、 N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3—ォキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元する活性を有す る微生物より、ポリペプチドの単離、該ポリペプチドをコードする DNAの取得、該活 性を有するポリペプチドをコードする DNAを発現する形質転換体の育種を実施する ことにより、ポリペプチドをコードする DNAを発現する形質転換体を作用させることを 特徴とするエリス口又はスレオ N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒド ロキシプロピオン酸エステルの製造方法を実施することが可能である。
[0032] 3.ポリペプチド
本発明の「ポリペプチド」は、カルボ-ル基を有する化合物を還元し、光学活性アル コールを生成する活性を有するポリペプチド、好ましくは N— Boc— 2 ァミノ 3— シクロへキシルー 3 ォキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元し、 (2R, 3R)—N — Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸エステルを生成 する活性を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドは、当該活性を有する 微生物などの生物から単離することができる。
[0033] 本発明のポリペプチドの実施形態としては、配列表の配列番号 1に示す塩基配列 によってコードされる、配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド を挙げることができる。また、配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるポリべ プチドと一定値以上の配列同一性を有し、かつ、 N— Boc— 2 ァミノ 3 シクロへ キシル—3 ォキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元し、 (2R, 3R)— N— Boc — 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸エステルを生成する活 性を有するポリペプチドは、当該ポリペプチドと同等であり、本発明に含まれる。
[0034] ここで配列の同一性は、例えば、相同性検索プログラム FASTA (W.R. Pearson & D.J. Lipman P.N.A.S. (1988) 85:2444-2448)を用いて 2つのアミノ酸配列を比較解析 した場合に、配列全体に対する Identityの値で表される。配列表の配列番号 2に示 すアミノ酸配列からなるポリペプチドと一定値以上の配列同一性を有するポリべプチ ドとしては、当該ポリペプチドとの配列同一性が 60%以上、好ましくは 70%以上、より 好ましくは 80%以上、最も好ましくは 85%であるポリペプチドを挙げることができる。
[0035] 配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列を、上記の相同性検索プログラム FASTA を用いて相同性検索をしたところ、ストレブトマイセス 'コエリコラ由来の推定酸化還元 酵素と約 56%の配列同一性を示した。このストレブトマイセス 'コエリコラ由来の酵素 の機能はあくまでも推定であり、また、約 56%という低い配列同一性である。したがつ て、当業者の技術常識によれば、上記ストレブトマイセス 'コエリコラ由来の酵素との 相同性検索結果に基づいて、本発明の実施形態のポリペプチドが光学活性アルコ ールを生成する活性を有することは想到できないのが一般的である。
[0036] このようなポリペプチドは、例えば、先述の、配列表の配列番号 1に示す塩基配列と 相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DN Aを適当なベクターに連結した後、適当な宿主細胞に導入して発現させることにより 得りれ 。また、例 ば、し urrent Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Son s, Inc., 1989)等に記載の公知の方法に従い、配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配 列からなるポリペプチドに、アミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を生じさせることに よっても取得できる。置換、挿入、欠失または付加を生じさせるアミノ酸の数は、実施 形態のポリペプチドが備える活性が失われない限り、その個数は制限されないが、好 ましくは 50個以下であり、より好ましくは 30個以下であり、さらに好ましくは 20個以下 であり、最も好ましくは 10個以下である。
[0037] 本発明のポリペプチドの起源となる微生物は、特に限定されないが、例えば上述の 2に示した微生物が挙げられ、好ましいものとしてはブレヴアンディモナス (Eigxmidi mo ^)属に属するバクテリアが挙げられ、特に好ましいものとしてはブレヴアンディ モナス ·ディミヌータ (Brevundimonas diminuta) NBRC12697株を挙げることが できる。当該微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本 部 生物遺伝資源部門（NBRC :干 292-0818 千葉県木更津巿かずさ鎌足 2-5-8)よ り人手することがでさる。
[0038] 本発明のポリペプチドの起源となる微生物を培養するための培地としては、その微 生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む 液体栄養培地を用いることができる。
[0039] 本発明のポリペプチドの起源となる微生物力もの該ポリペプチドの単離は、公知の 蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のよ うに実施できる。まず、当該微生物を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あ るいは、濾過により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラス ビーズ等を用いた物理的手法で破碎した後、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞 抽出液を得る。そして、塩析 (硫酸アンモ-ゥム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶 媒沈殿 (アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過ク 口マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等 の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から本発明 のポリペプチドを単離する。
[0040] 4. DNA
本発明の「DNA」は、上述の本発明のポリペプチドをコードする DNAであり、後述 する方法に従って導入された宿主細胞内で該ポリペプチドを発現し得るものであれ ばいかなるものでもよぐ任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。該ポリペプチドが取 得できれば、該ポリペプチドの起源となる微生物より、当業者であれば公知の方法で 本発明の DNAを取得できる。例えば、以下に示した方法で本発明の DNAを取得で きる。
[0041] まず、単離された本発明のポリペプチドを適当なエンドべプチダーゼを用いて消化 し、生じたペプチド断片を逆相 HPLCにより分取する。そして、例えば、 ABI492型プ 口ティンシークェンサ一（Applied Biosystems社製）により、これらのペプチド断片 のアミノ酸配列の一部または全部を決定する。
[0042] このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードする D NAの一部を増幅するための PCR (Polymerase Chain Reaction)プライマーを合成す る。次に、通常の DNA単離法により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体 D NA、もしくは、 cDNAを調製する。この DNAを铸型として、先述の PCRプライマーを 用いて PCRを行い、該ポリペプチドをコードする DNAの一部を増幅し、その塩基配 列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、 ABI373A型 DNA Sequencer (Ap plied Biosystems社製）等を用いて行うことができる。
[0043] 該ポリペプチドをコードする DNAの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、 i — PCR法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988))によりその全体の配列を決定すること ができる。
[0044] このようにして得られる本発明の DNAの実施形態としては、配列表の配列番号 1に 示す塩基配列を含む DNAを挙げることができる。また、配列表の配列番号 1に示す 塩基配列と一定値以上の配列同一性を有し、かつ、 N— Boc— 2—アミノー 3—シク 口へキシル—3 ォキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元し、 (2R, 3R) -N-B oc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸エステルを生成す る活性を有するポリペプチドをコードする DNAは、当該 DNAと同等であり、本発明 に含まれる。
[0045] ここで塩基配列の同一性は、例えば、相同性検索プログラム FASTA (W.R. Pearso n & D.J. Lipman P.N.A.S. (1988) 85:2444-2448)を用いて 2つの塩基配列を比較解 祈した場合に、配列全体に対する Identityの値で表される。配列表の配列番号 1に 示す塩基配列からなる DNAと一定値以上の配列同一性を有する DNAとしては、当 該 DNAとの配列同一性が 60%以上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上 、最も好ましくは 85%である DNAを挙げることができる。
[0046] さらに、配列表の配列番号 1に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAと ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAであって、かつ、 N— Boc— 2— アミノー 3 シクロへキシル 3 ォキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元し、（ 2 R, 3R)—N— Boc— 2 ァミノ一 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸ェ ステルを生成する活性を有するポリペプチドをコードする DNAも本発明の DNAに包 含される。さらに、配列番号 1に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとス トリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAであって、かつ、カルボ二ル基を有 する化合物を還元し、光学活性アルコールを生成する活性を有するポリペプチドをコ ードする DNAも本発明の DNAに包含される。
[0047] 配列表の配列番号 1に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAと、ストリン ジェントな条件下でハイブリダィズする DNAとは、コ口-一'ハイブリダィゼーシヨン法 、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法、あるいはサザンノヽイブリダィゼーシヨン法等を 実施した際、配列表の配列番号 1に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる DN A力 特異的にハイブリッドを形成する DNAを言う。
[0048] ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、 75mMクェン酸三ナトリウム、 750mM 塩化ナトリウム、 0. 5%ドデシル硫酸ナトリウム、 0. 1%ゥシ血清アルブミン、 0. 1%ポ リビュルピロリドン、および、 0. l%Ficoll 400 (アマシャムバイオサイエンス株式会 社製)の組成からなる水溶液中、 65°Cでハイブリダィズさせた後に、 15mMクェン酸 三ナトリウム、 150mM塩化ナトリウム、および 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウムの組成か らなる水溶液を用いて、 60°Cで洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件で ハイブリダィズさせた後に、 15mMクェン酸三ナトリウム、 150mM塩化ナトリウム、お よび 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウムの組成力もなる水溶液を用いて、 65°Cで洗浄が 行われる条件であり、より好ましくは、 1. 5mMクェン酸三ナトリウム、 15mM塩ィ匕ナト リウム、および 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウムの組成力もなる水溶液を用いて、 65°Cで 洗浄が行われる条件である。本明細書において記述されている、上記 DNAの単離、 および後述するベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り 、 Molecular Cloning 2ηα edition (Cold bpnng Harbor Laboratory Press, 1989)等の成 書に記載されている方法により実施できる。また、本明細書の記述に用いられる％は 、特に断りのない限り、％(wZv)を意味する。
[0049] 5.ベクター
本発明の「ベクター」は、適当な宿主細胞内で前記 DNAがコードする遺伝子を発 現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、ブラ スミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主 株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
[0050] このようなベクターは、通常、 lacUV5プロモーター、 trpプロモーター、 trcプロモー ター、 tacプロモーター、 lppプロモーター、 tufBプロモーター、 recAプロモーター、 p Lプロモーター等の制御因子を含み、本発明の DNAと作動可能に連結された発現 単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、後述する PUCN18が好 適に使用できる。
[0051] 前記制御因子は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばェ ンハンサー、 CCAATボックス、 TATAボックス、 SPI部位など）を有する塩基配列を いう。
[0052] 上記の「作動可能に連結」 t 、う用語は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、 ェンハンサ一等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態 で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類力 宿主に応じて変わり得ること は、当業者に周知の事項である。本発明のベクターの例としては、上記 pUCN18に 配列番号 1に示す塩基配列の 603番目の Cが Tに変更された塩基配列からなる DN Aを導入した、後述するプラスミド pNBDを挙げることができる（実施例 6参照)。
[0053] 6.宿主細胞
本明細書内に記載される宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物 細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率から細菌が好ましぐ大腸菌が特に好 ましい。本発明の DNAを含むベクターは、公知の方法により宿主細胞に導入できる 。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販の coli HB101コンビテン トセル (タカラバイオ社製)を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる
[0054] 7.形質転換体
本発明の「形質転換体」は、本発明のポリペプチドをコードする DNAを、前記べク ターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる。なお、本発明の「形 質転換体」は、培養菌体は言うまでもなぐその処理物も含まれる。ここで言う処理物 とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細 胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定ィ匕したものを意味し、上 述の N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ォキソプロピオン酸エステルを 不斉的に還元する活性が残存する限りはこれに含まれる。本発明の形質転換体の培 養は、それが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを 含む液体栄養培地を用いて実施できる。
[0055] 本発明の形質転換体の例としては、後述する coli HB101 (pNBD)が挙げら れる (実施例 8参照)。
[0056] 8.光学活性アルコールの製造方法
本発明の「光学活性アルコール類の製造」は、適当な溶媒中に、基質となるカルボ -ル基を有する化合物と、本発明のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードする DN Aを含むベクターを導入された形質転換体を添加することにより実施できる。必要に 応じて、 NADH等の補酵素を添加してもよい。反応には水系溶媒を用いてもよいし、 水系の溶媒と有機系の溶媒とを混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば 、トルエン、酢酸ェチル、酢酸 n—ブチル、へキサン、イソプロパノール、ジイソプロピ ルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。反応は例え ば 10°C〜70°Cの温度で行われ、反応液の pHは例えば 4〜10に維持する。反応は 、ノツチ方式あるいは連続方式で実施できる。バッチ方式の場合、反応基質は例え ば 0. 1%から 70% (w/v)の仕込み濃度で添加される。
[0057] 基質となる「カルボ二ル基を有する化合物」としては、例えば、 N— Boc— 2 ァミノ
3—シクロへキシル 3—ォキソプロピオン酸ェチル等が挙げられるが、上述の反 応条件において還元され、「光学活性アルコール」に変換されるものであれば、特に 限定されない。
[0058] 反応で生じた光学活性アルコール類は、常法により精製できる。例えば、反応で生 じた光学活性アルコール類を含む反応液を、酢酸ェチル、トルエン等の有機溶媒で 抽出し、有機溶媒を減圧下で留去した後、蒸留、再結晶、または、クロマトグラフィー 等の処理を行うことにより、精製できる。
[0059] 9.光学活性アルコールの製造方法の変形例
本発明のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードする DNAを含むベクターが導入 された形質転換体、カルボ二ル基を有する化合物、および、必要に応じて NADH等 の補酵素を接触させ、反応させることにより、当該カルボ二ル基を有する化合物を不 斉的に還元し、光学活性アルコール類を製造することができる。この時、当該反応の 進行に伴い、 NADH等の補酵素は酸化型に変換される。この酸化型の補酵素を還 元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ)を有するポリペプチド、および、 当該ポリペプチドの基質となる化合物を、本発明のポリペプチドと共存させて当該反 応を行うことにより、補酵素の使用量を削減できる。補酵素再生能を有するポリぺプ チドとしては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ァ ルデヒド脱水素酵素、グルコース 6—リン酸脱水素酵素およびグルコース脱水素酵 素などを使用できる。好適には、グルコース脱水素酵素が使用される。
[0060] 本発明のポリペプチドをコードする DNA及び補酵素再生能を有するポリペプチド をコードする DNAの両者が組込まれたベクターの例としては、前記発現ベクター pN BDにバシラス.メガテリゥム由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を導入した、後述す る pNBDGが挙げられる（実施例 7参照)。 [0061] 本発明のポリペプチドをコードする DNAおよび還元型補酵素再生能を有するポリ ペプチドをコードする DNAの両者を含む形質転換体は、本発明のポリペプチドをコ ードする DNAおよび、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードする DNAの両者 を、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほ力、 これら 2種の DNAを不和合性グループの異なる 2種のベクターにそれぞれ組み込み 、それら 2種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによつても得られる。本発明 のポリペプチドをコードする DNA、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコ ードする DNAの両者を含む形質転換体の例としては、前記 pNBDGで coli H B101を形質転換して得られる、後述する coli HBlOl (pNBDG)が挙げられ る（実施例 8参照)。
[0062] 本発明のポリペプチドをコードする DNAと補酵素再生能を有するポリペプチドをコ ードする DNAの両者を含む形質転換体の培養は、それが増殖する限り、通常の、炭 素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる
[0063] 本発明のポリペプチドと、補酵素再生能を有するポリペプチドを組み合わせて光学 活性アルコール類を製造する場合は、上記反応組成に、補酵素再生能を有するポリ ペプチド (例えば、グルコース脱水素酵素）と、その基質となる化合物（例えば、ダル コース）をさらに添加する。本発明のポリペプチドをコードする DNA、および、補酵素 再生能を有するポリペプチドをコードする DNAの両者を含む形質転換体を使用して も、同様に光学活性アルコール類を製造することができる。その他、本発明のポリべ プチドをコードする DNAを含む形質転換体、および、補酵素再生能を有するポリべ プチドをコードする DNAを含む形質転換体の両者を利用して上記光学活性アルコ 一ル類を製造してもよい。
[0064] とりわけ、本発明のポリペプチドをコードする DNA、および、補酵素再生能を有す るポリペプチドをコードする DNAの両者を含む形質転換体、または、その処理物を 用いる場合は、補酵素再生能を有するポリペプチド (例えば、グルコース脱水素酵素 )を別途添加する必要がなぐ光学活性アルコール類の製造を効率良く行うことがで きる。 [0065] 上述の反応条件において、本発明の実施形態の一つである E coli HBlOKp NBDG)を添加し、 N— Boc— 2 ァミノ 3 シクロへキシル 3 ォキソプロピオン 酸ェチルを基質とした場合、（2R, 3R)—N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸ェチルが得られる（実施例 10参照)。
[0066] 以上のように、本発明に従えば、本発明のポリペプチドの効率的生産が可能であり 、それを利用することにより、例えば（2R, 3R)—N— Boc— 2 ァミノ 3 シクロへ キシル 3—ヒドロキシプロピオン酸ェチルを始めとする、有用な光学活性アルコ一 ル類の優れた製造法が提供される
実施例
[0067] 以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるもの ではない。なお、以下の実施例において用いた組み換え DNA技術に関する詳細な 操作方法などは、次の成書に記載されている：
Molecularし loning 2nd Edition (し old Spring Harbor Laboratory Press, 1989 J、 Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley— Int erscience) 0
[0068] 各実施例で説明する各微生物は、さまざまな寄託機関より当業者が入手可能であ る。寄託機関としては、各微生物を特定する受託番号に対応する機関が挙げられる 。具体的は、 NBRC番号で特定される微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤 機構生物遺伝資源部門より入手可能である。
[0069] (合成例 1)
ベンゾフエノンィミン 18.1gにグリシンターシャルブチルエステル塩酸塩 20gと塩化メチ レン 100mlを加えた後、室温で 62時間攪拌した。蒸留水 100mlで分液後、有機層を減 圧濃縮乾燥し、グリシン誘導体 28.8gを得た。この化合物の THF溶液（140ml)を、 -70 °Cの KOtBu 10.9gを含む THF溶液（60ml)に滴下した。その後、この溶液を- 78°Cのシ クロへキサンカルボ-ルクロリド 14.2gを含む THF溶液（50ml)に滴下した後、 1時間 攪拌した。これに 1Mクェン酸 150mlをカ卩え、室温で 15時間攪拌した。減圧濃縮により THFを除き、酢酸ェチルで抽出後、得られた水層にエタノール 100ml、 Na CO 61.7g
2 3
、 Boc O 23.3gを加えた後、室温で 2時間攪拌した。ろ過により白色固体を取り除き、 ろ液を酢酸ェチルで抽出後、有機層を減圧濃縮乾燥し、黄色油状物 26.2gを得た。こ れをシリカゲルカラムで精製し、 N-Boc- 2-ァミノ— 3—シクロへキシル— 3—ォキ ソプロピオン酸ターシャルブチルエステル 7.5gを得た。
[0070] (実施例 1)バクテリア菌体を用いたエリス口又はスレオ一 N— Boc— 2 ァミノ一 3 ーシクロへキシルー 3—ヒドロキシプロピオン酸ターシャルブチルの製造
大型試験管に、肉エキス 10g、ペプトン 10g、酵母エキス 5g、 NaC13g (いずれも 1L 当たり）の組成力もなる液体培地 (pH7) 5mlを調製し、 120°Cで 20分間蒸気殺菌を おこなった。この培地に、予め同培地プレートで培養しておいた、アースロバクタ一' パラフイネウス（Arthrobacter paraffineus) ATCC21218、バシラス'リチェニフォ ルミス（Bacillus licheniformis) NBRC 12195、バシラス ·ズブチリス（Bacillus s ubtilis) ATCC14593,バシラス ·ッリンギェンシス (Bacillus thuringiensis) NBR C3951、ブレヴアンディモナス ·ディミヌータ（Brevundimonas diminuta) NBRCl 2697、コリネノ クテリゥム ·アンモニアゲネス（Corvnebacterium ammoniagenes ) NBRC 12072、ェンテロパクター ·ァエロゲネス（Enterobacter aerogenes) NB RC13534、モルガネラ 'モルガニイ'サブエスピ^ ~ ·モルガニイ（Morganella more anii subsp. morganii) NBRC 3168,ォエノレスコビア，ターノ タ（Oerskovia tur bata) NBRC15015,バエ-バシラス ·アルべィ（Paenibacillus alvei) NBRC334 3、ぺクトパクテリゥム ·カロトボラム ·サブエスピー ·カロトボラム（Pectobacterium ca rotovorum subsp. carotovorum) NBRC3830,ぺクトノくクテリウム，力ロトボラ ム.サブエスピ ~~ '力ロトホフム (Pectobacterium carotovorum subsp. caroto vorum) NBRC12380、ぺクトバタテリゥム 'カロトボラム ·サブエスピ一'カロトボラム（ Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum; NBRC 14082,リゾヒ ゥム ·ラジオパクター（Rhizobium radiobacter) NBRC 13264、の各菌体を一白 金耳接種し、 30°Cで 24〜72時間振とう培養を行った。
[0071] 得られた各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH6. 5 ) 1mlに懸濁させた。
[0072] 得られた菌体懸濁液 lmlを試験管に入れ、さらにグルコース 5mg、 N— Boc— 2— アミノー 3—シクロへキシル 3—ォキソプロピオン酸ターシャルブチル 0. 5mgをカロ えて、振とうしながら 30°Cで 24時間反応させた。反応後、酢酸ヱチル lmlを加えて抽 出を行った。 N-Boc- 2-ァミノ 3—シクロへキシル 3—ヒドロキシプロピオン酸 ターシャルブチルの定量、および、そのスレオ Zエリス口比の測定は、キヤピラリーガ スクロマトグラフィー（カラム： GLサイエンス株式会社製 InertCAP5 (IDO. 25mm X 30m)、カラム温度： 200°C、キャリアガス：ヘリウム（70kPa)、検出： FID)を用いて行 つた。その結果を表 1に示した。
[0073] 表 1： N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ォキソプロピオン酸ターシャ ルブチルを不斉的に還元するバクテリア
[0074] [表 1]
Figure imgf000022_0001
[0075] (実施例 2)酵母菌体を用いたエリスロー N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシノレ
3 ヒドロキシプロピオン酸ターシャルブチルの製造
大型試験管に、グルコース 40g、酵母エキス 3g、 KH PO 7g、 (NH ) HPO 13g、
NaCllg、 MgSO - 7H OO. 8g、 ZnSO - 7H O60mg、 FeSO - 7H O90mg、 CuS
O ' 5H 05mg、 MnSO ·4〜6Η OlOmg (いずれも 1L当たり）の組成からなる液体 培地 (pH7) 5mlを調製し、 120°Cで 20分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、モ ルトエキス 200g、寒天 20g (l、ずれも 1L当たり）の組成からなる寒天培地（pH7)で 培養しておいた、キャンディダ 'マグノリアェ（Candida magnoliae) NBRCO 705、 デバリオマイセス ·ポリモルファス (Debarvomvces polvmorphus) ATCC20280、 ピキア，ァノマラ（Pichia anorn k) NBRCO 120,ピキア'ミヌータ 'ノ 一'ミヌータ(£ ichia minuta var. minuta) NBRC0975、ピキア ·ミヌータ ·バー ·ノンフアーメン タンス (Pichia minuta var. nonfermentans) NBRC1473、ピキア 'キシローサ (Pichia xylosa) NBRC0950,ロドトルーラ 'グルティ-ス'バー'ダイレネンシス（β hodotorula glutinis var. dairenensis) NBRC0415、サッカロマイコプシス ·フ イブリゲラ (Saccharomvcopsis fibuligera) NBRC0104、サッノレニスポラ .サイト ーィ（SaturnisOora saitoi) NBRC1134、トリゴノプシス.バリアビリス（Trigonoosi s variabilis) NBRC0671、ウイリオプシス 'サターナス'バ^ ~ ·ムラキイ（Williopsis saturnus var. mmMi) NBRC0895、の各菌体を一白金耳接種し、 30°Cで 24〜 72時間振とう培養を行った。
[0076] 得られた各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH6. 5 ) 1mlに懸濁させた。
[0077] 得られた菌体懸濁液 lmlを試験管に入れ、さらにグルコース 5mg、 N— Boc— 2— アミノー 3 シクロへキシルー 3 ォキソプロピオン酸ターシャルブチル 0. 5mgを加 えて、振とうしながら 30°Cで 24時間反応させた。反応後、酢酸ェチル lmlを加えて抽 出を行った。 N— Boc— 2 ァミノ 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸 ターシャルブチルの定量、および、そのスレオ Zエリス口比の測定は、実施例 1と同様 に行った。その結果を表 2に示した。
[0078] 表 2： N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシノレ 3 ォキソプロピオン酸ターシャ ルブチルを不斉的に還元する酵母
[0079] [表 2]
Figure imgf000023_0001
(実施例 3)力ビ菌体を用!/、たエリス口又はスレ才 N— Boc— 2 アミノー 3 シクロ へキシルー 3—ヒドロキシプロピオン酸ターシャルブチルの製诰
大型試験管に、グノレコース 10g、ポリペプトン 10g、肉エキス 10g、酵母エキス 5g、 NaCllg、 MgSO · 7Η ΟΟ. 5g (いずれも 1L当たり）の組成力 なる液体培地（ρΗ7 ) 5mlを調製し、 120°Cで 20分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、モルトエキス 6 0g、寒天 20g (いずれも 1L当たり）の組成からなる寒天培地（pH6. 2)で培養してお Vヽたシノレシネラ ·アンべラータ (Circinella umbellata) NBRC4452、ェメリセラ ·ァ ングイス（Emericella unguis) NBRC8087,ェゥぺニシリウム 'バーネンセ（Eupen icillium baarnense) NBRC6090、ホノレモコ^ス ·レシナェ (Hormocomis resina e) NBRC6367,コリネスポラ .カシィコラ（Corvnesnora cassiicola) NBRC3004 9、プレクトスファエレラ ·ククメリナ (Plectosphaerella cucumerina) NBRC30005 、の各菌体を一白金耳接種し、 30°Cで 24〜72時間振とう培養を行った。
[0081] 得られた各培養液からろ過により菌体を集め、 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH6. 5) lml に懸濁させた。
[0082] 得られた菌体懸濁液 lmlを試験管に入れ、さらにグルコース 5mg、 N— Boc— 2— アミノー 3—シクロへキシル 3—ォキソプロピオン酸ターシャルブチル 0. 5mgをカロ えて、振とうしながら 30°Cで 24時間反応させた。反応後、酢酸ヱチル lmlを加えて抽 出を行った。 N— Boc— 2 ァミノ 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸 ターシャルブチルの定量、および、そのスレオ Zエリス口比の測定は、実施例 1と同様 に行った。その結果を表 3に示した。
[0083] 表 3 :N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ォキソプロピオン酸ターシャ ルブチルを不斉的に還元するカビ
[0084] [表 3]
Figure imgf000024_0001
Hormocomis resinae NBRC 6367 30 threo
Corynespora cassiicola NBRC 30049 33 erythro
Emericella unguis NBRC 8087 48 threo
Eupenicif um baarnense NBRC 6090 90 threo
Plec tosphaerella cucumerina NBRC 30005 39 erythro
[0085]
Figure imgf000024_0002
以下の方法に従って、ブレヴアンディモナス ·ディミヌータ（Brevundimonas dimi miia) NBRC 12697株より、 N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシノレ一 3 ォキソ プロピオン酸ェチルを不斉的に還元し、 (2R, 3R)— N— Boc— 2 アミノー 3 シク 口へキシルー 3—ヒドロキシプロピオン酸ェチルを生成する活性を有するポリペプチド を分離し、単一に精製した。特に断りのない限り、精製操作は 4°Cで行った。
[0086] N—Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ォキソプロピオン酸ェチルに対す る還元活性は、以下のように算出した。まず、試験管に適量の粗酵素液と lOOmMリ ン酸緩衝液 (PH6. 5)を加えて、総量で 0. 5mlにする。さらに N— Boc— 2 ァミノ一 3 シクロへキシル 3—ォキソプロピオン酸ェチル 0. 25mg、 NADHlmgを加えて 、振とうしながら 30°Cで 2時間反応させた。反応後、酢酸ェチル lmlを加えて抽出を 行った。生成した N— Boc— 2 ァミノ 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオ ン酸ェチルの定量は、キヤビラリーガスクロマトグラフィー（カラム： GLサイエンス株式 会社製 InertCAP5 (IDO. 25mm X 30m)、カラム温度： 200°C、キャリアガス：へリウ ム（70kPa)、検出： FID)を用いて行った。生成した N— Boc— 2 ァミノ一 3 シクロ へキシル 3—ヒドロキシプロピオン酸ェチルの量力も酵素活性を算出した。なお、 本反応条件において 1分間に: L molの N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル — 3—ヒドロキシプロピオン酸ェチルを生成する活性を、 lunitと定義した。
[0087] (微生物の培養）
5Lジャーフアーメンター（丸菱バイオェンジ社製）に、肉エキス 10g、ペプトン 10g、 酵母エキス 5g、塩ィ匕ナトリウム 3g、アデ力ノール LG— 109 (日本油脂製) 0. lg (いず れも 1L当たり）の組成カゝらなる液体培地 (pH7) 3Lを調製し、 120°Cで 20分間蒸気 殺菌をおこなった。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたブレヴアンディモ ナス ·ディミヌータ（Brevundimonas diminuta) NBRC12697株の培着液を 15ml 接種し、攪拌回転数 450rpm、通気量 0. 9NL/min, 30°Cで 16時間培養を行った
[0088] (無細胞抽出液の調製）
上記の培養液から遠心分離により菌体を集め、 0. 8%塩ィ匕ナトリウム水溶液を用い て菌体を洗浄した。この菌体を、 5mMの j8—メルカプトエタノールを含む 10mMリン 酸緩衝液 (PH7. 0)に懸濁し、 SONIFIER250型超音波破砕機（BRANSON社製 )を用いて破砕した後、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得た。
[0089] (DEAE— TO YOPEARLカラムクロマトグラフィー）
上記の無細胞抽出液を、 5mMの j8—メルカプトエタノールを含む 10mMリン酸緩 衝液（pH7. 0)で予め平衡化した DEAE—TOYOPEARL 650M (東ソ一株式会 社製)カラム (400ml)に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄し た後、 NaClのリニアグラジェント (0M力も 0. 3Mまで）により活性画分を溶出させた。
[0090] (Phenyl— TOYOPEARLカラムクロマトグラフィー）
DEAE—TOYOPEARLカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分に終濃 度 1.0Mとなるよう硫酸アンモ-ゥム及び終濃度 10%となるようにグリセリンを溶解し、 1.0Mの硫酸アンモ-ゥム及び 5mMの 13—メルカプトエタノール及び 10%のグリセリ ンを含む 10mMリン酸緩衝液 (pH7. 0)で予め平衡化した Phenyl—TOYOPEAR L 650M (東ソ一株式会社製)カラム（50ml)に供し、活性画分を吸着させた。同一 緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモ-ゥムのリニアグラジェント（1.0M力も 0M まで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、 5mMの /3 メルカプトエタノ ール及び 10%グリセリンを含む 10mMリン酸緩衝液 (pH7. 0)にて 1夜透析を行つ た。
[0091] (5' -AMP Sepharoseカラムクロマトグラフィー）
Phenyl— TOYOPEARLカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、 5m Mの β メルカプトエタノール及び 10%グリセリンを含む 10mMリン酸緩衝液（ρΗ7 . 0)で予め平衡化した 5'— AMP Sepharose6 4B (アマシャムバイオサイエンス株 式会社製)カラム（14ml)に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗 浄した後、 NaClのリニアグラジェント (0Mから 2Mまで）により活性画分を溶出させ、 電気泳動的に単一なポリペプチドの精製標品を得た。
[0092] (実施例 5) 遣伝子のクローニング
(PCRプライマーの作製）
実施例 4で得られた精製ポリペプチドを 8M尿素存在下で変性した後、ァクロモバク ター由来のリシルエンドべプチダーゼ (和光純薬工業株式会社製)で消化し、得られ たペプチド断片のアミノ酸配列を ABI492型プロテインシーケンサー（Applied Bio systems社製）により決定した。このアミノ酸配列から予想される DNA配列に基づき 、該ポリペプチドをコードする遺伝子の一部を PCRにより増幅するためのプライマー 1 : 5'—TGGGARATHGAYCTNGGNGA—3' (配列表の配列番号 3)、および、プライマ —2： 5'— GGNGTRTCDATRTANCCYGG— 3' (配列表の配列番号 4)を合成した。
[0093] (PCRによる遺伝子の増幅）
実施例 4と同様に培養したブレヴアンディモナス ·ディミヌータ (Brevundimonas d imimi^) NBRC12697株の菌体から G NOMER DNA KIT (B- BIO gene社製）を用 い、取り扱い説明書に従って染色体 DNAを抽出した。次に、上記で調製した DNA プライマー 1および 2を用い、得られた染色体 DNAを铸型として PCRを行ったところ 、 目的遺伝子の一部と考えられる約 0. 4kbpの DNA断片が増幅された。 PCRは、 D NAポリメラ一ゼとして TaKaRa Ex Taq (タカラノィォ社製）を用いて行い、反応条 件はその取り扱い説明書に従った。この DNA断片を、 ABI PRISM Dye Termi nator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer社製)およ び ABI 373A DNA Sequencer (Perkin Elmer社製）を用いてダイレクトシ一 ケンスを行い、その塩基配列を解析した。その結果判明した塩基配列を、配列表の 配列番号 5に示した。
[0094] (i—PCR法による目的遺伝子の全長配列の決定）
上己で調 したブレヴアンアイモナス ·ティミヌータ ( Brevundimona s diminuta) NBRC12697株の染色体 DNAを、制限酵素 BamHIで完全消化し、得られた DNA 断片の混合物を T4リガーゼにより分子内環化させた。これを铸型として用い、 i PC R法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988))〖こより、上述の配列番号 5に示す塩基配列 を含む遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果を配列表の配列番号 1に示した。 i — PCRは、 DNAポリメラ一ゼとして TaKaRa LA Taq (タカラバイオ社製）を用いて 行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。また、配列番号 1に示した塩基配 列がコードするアミノ酸配列を配列番号 2に示した。
[0095] (実施例 6) 発現ベクターの構築
プライマー 3： 5' AGGACAAGCATATGGATCACGACTTCGCAGGC - 3' (配列 表の配列番号 6)、プライマー 4： 5' - CAGGGTGAATTCTTACTATTGCGCCGTAT ATCCG- 3' (配列表の配列番号 7)、プライマー 5： 5' AGTGCGACGATCCCGTC AAATTCCTCCTGGCTGAC - 3' (配列表の配列番号 8)プライマー 6： 5'— GTCAG CCAGGAGGAATTTGACGGGATCGTCGCACT- 3' (配列表の配列番号 9)を用い 、実施例 5で得たブレヴアンディモナス ·ディミヌータ（Brevundimonas diminuta) NBRC 12697株の染色体 DN Aを铸型として PCRを行つた。プライマー 3と 5の組合 せ、及び、プライマー 4と 6の組合せで、それぞれ約 0. 6kbp、 0. 2kbpの二本鎖 DN Aが得られた。次に、これらの二本鎖 DNAを混合したものを铸型として、プライマー 3 と 4の組合せで PCRを行った。その結果、配列表の配列番号 1に示す塩基配列の 60 3番目の C力 に改変され EcoRIサイトが破壊された塩基配列力もなる遺伝子で、そ の開始コドン部分に Ndel認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後に EcoRI認 識部位が付加された二本鎖 DNAを得た。 PCRは、 DNAポリメラーゼとして Pyrobes t DNA Polymerase (タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い 説明書に従った。この DNAを Ndel及び EcoRIで消化し、プラスミド pUCN 18 (PCR 法により PUC18 (タカラバイオ社製）の 185番目の Tを Aに改変して Ndelサイトを破 壊し、更に 471— 472番目の GCを TGに改変することにより新たに Ndelサイトを導入 したプラスミド）の lacプロモーターの下流の Ndel認識部位と EcoRI認識部位の間に 挿入し、組換えベクター pNBDを構築した。なお、ここで用いた 185番目の T、及び、 471— 472番目の GCの記載は、 GenBank Accession No. L09136の記載に従った。
Figure imgf000028_0001
プライマー 7 : 5' - CAGGAGCTCTAAGGAGGTTAACAATGTATAAAG - 3' (配列 表の配列番号 10)と、プライマー 8： 3'— CACGGATCCTTATCCGCGTCCTGCTTG G— 5' (配列表の配列番号 11)を用い、プラスミド pGDKl (Eur. J. Biochem., 186, 38 9 (1989)に記載の方法で調製可能）を铸型として PCRを行い、バシラス'メガテリゥム（ Bacillus megaterium) IAM1030株（IAMカルチャーコレクション（〒 113- 0032 東 京都文京区弥生 1 1 1)力 入手できる）由来のグルコース脱水素酵素（以後、 G DHと呼ぶ)遺伝子の開始コドンから 5塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、 さらにその直前に Sacl認識部位が付加され、かつ、終止コドンの直後に BamHI認識 部位が付カ卩された、二本鎖 DNAを取得した。得られた DNA断片を Saclおよび Bam HIで消化し、実施例 6記載のプラスミド pNBDの lacプロモーターの下流の Sacl認識 部位と BamHI認識部位の間に挿入し、組換えベクター pNBDGを構築した。 pNBD Gの作製法および構造を図 1に示す。 [0097] (実施例 8) 形皙転椽体の作製
実施例 6で構築した組換えベクター pNBDを用いて、 coH HB101コンビテン トセル (タカラバイオ社製)を形質転換し、 coli HB101 (pNBD)を得た。
[0098] また、同様に、実施例 7で構築した組換えベクター pNBDGを用いて、 coli H
B101コンビテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、 £ coli HBlOKpNB
DG)を得た。
[0099] (実施例 9) 形皙転椽体における遣伝早の 現
実施例 8で得た 2種の形質転換体、および、ベクタープラスミド pUCN 18を含む形 質転換体である coli HB101 (pUCN18) (比較例）のそれぞれを、 200 /z g/ mlのアンピシリンを含む 2 XYT培地（トリプトン 1. 6%、イーストエキス 1. 0%、 NaCl 0. 5%、 pH7. 0) 5mlに接種し、 37°Cで 24時間振盪培養した。遠心分離により菌体 を集め、 5mlの lOOmMリン酸緩衝液 (pH6. 5)に懸濁した。これを、 UH— 50型超 音波ホモゲナイザー（SMT社製)を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を 除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液の N— Boc— 2 アミノー 3 シク 口へキシルー 3—ォキソプロピオン酸ェチル還元活性、および、 GDH活性を測定し、 比活性として表したものを、表 4に示した。
[0100] 表 4 :無細胞抽出液の比活性
[0101] [表 4] strain reductase activity (U/mg) GDH activity (U/mg)
E. coli HB 101 (pUCN 18) N.D. N.D.
E. coli HB 101 (pNBD) 0.003 N.D.
E. coli HB 101 (pNBDG) 0.003 1 1 9
N.D.； not detectable
[0102] 表 4に示すように実施例 8で得られた 2種の形質転換体のいずれにおいても、 N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ォキソプロピオン酸ェチル還元活性の発 現が認められた。また、 GDH遺伝子を含む E coH HBlOl (pNBDG)では、 GD H活性の発現も認められた。 N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ォキソ プロピオン酸ェチル還元活性は、実施例 4に記載の方法で測定した。 GDH活性は、 1Mトリス塩酸緩衝液（pH8. 0)に、グルコース 0. 1M、補酵素 NAD2mM、および 粗酵素液を添加して 25°Cで 1分間反応を行 、、波長 340nmにおける吸光度の増加 速度より算出した。この反応条件において、 1分間に: molの NADを NADHに還 元する酵素活性を lunitと定義した。
[0103] (実施例 10) 形質転換体を用いた（2R. 3R)— N— Boc— 2 アミノー 3 シクロ へキシルー 3—ヒドロキシプロピオン酸ェチルの製造
実施例 9と同様に培養した coli HBlOl (pNBDG)の培養液 5mlに、ダルコ ース 25mg、 NADlmg、 N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシノレ 3 ォキソプロ ピオン酸ェチル 10mgを添加し、 30°Cで 40時間攪拌した。反応 8、 28時間経過後に NAD lmgを追添カ卩した。 40時間目の変換率は 97%であった。
[0104] 反応終了後、反応液を酢酸ェチルで抽出し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウム で乾燥した。遠心によって硫酸ナトリウムを除去し、減圧下有機溶媒を留去して、 (2R , 3R)—N— Boc— 2 ァミノ一 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸ェチ ルを得た。このものの光学純度は、スレオ：エリス口比 = 1. 5 : 98. 5、 99%ee以上で めつに。
[0105] N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸ェチルの定 量およびスレオ Zエリス口比の測定は、キヤビラリーガスクロマトグラフィー（カラム： GL サイエンス株式会社製 lnertCAP5 (IDO. 25mm X 30m)、カラム温度： 200°C、キ ャリアガス：ヘリウム（70kPa)、検出： FID)を用いて行った。また、 N— Boc— 2 アミ ノー 3—シクロへキシル 3—ヒドロキシプロピオン酸ェチルの光学純度の測定は、ト リフルォロ酢酸無水物で処理した後、キヤビラリーガスクロマトグラフィー (カラム:東京 化成工業株式会社製 CHIRALDEX G—TA(ID0. 25mm X 20m)、カラム温度： 120°C、キャリアガス：ヘリウム（70kPa)、検出： FID)を用いて行った。
(実施例 11) 形質転換体を用いた（2R. 3R)—N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへ キシルー 3—ヒドロキシプロピオン酸ェチルの製造
形質転換体としてキャンディダ ·マグノリアェ (Candida magnoliae)力も取得した ポリペプチドをコードする DNAを発現させた形質転換体 £ coH HB101 (pNTC RG) (国際公開第 WO01Z040450号公報記載の方法で調製可能)を用いること、 および NADの代わりに NADPを用いること以外は実施例 10と同様に実施した。そ の結果、 40時間目の変換率は 55%であり、得られた（2R, 3R)— N— Boc— 2 アミ ノー 3—シクロへキシル 3—ヒドロキシプロピオン酸ェチルの光学純度は、スレオ：ェ リス口比 = 15 : 85、 99%ee以上であった。
(実施例 12) 形質転換体を用いた（2S. 3S)—N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへ キシルー 3—ヒドロキシプロピオン酸ェチルの製造
开質転換体としてピキア'ミヌータ 'バ^ ~ .ミヌータ（Pichia minuta var. minuta )から取得したポリペプチドをコードする DNAを発現させた形質転換体 coli H B101 (pNTOM5Gl) (国際公開第 WO2006— 013801号公報記載の方法で調 製可能）を用いること、および NADの代わりに NADPを用いること以外は実施例 10 と同様に実施した。その結果、 40時間目の変換率は 97%であり、得られた（2S, 3S )— N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸ェチルの 光学純度は、スレオ：エリス口比 =0 : 100、 99%ee以上であった。
( mis) ポリペプチドの
0. 4% (vZv)のジメチルスルホキシドを含む lOOmMリン酸緩衝液（pH6. 5)に、 基質となるカルボ-ルイ匕合物を終濃度 2mM、補酵素 NADHを終濃度 0. 167mM となるようそれぞれ溶解した。これに、実施例 4で調製した精製ポリペプチドを適当量 添加し、 30°Cで 3分間反応を行った。当該反応液の波長 340nmにおける吸光度の 減少速度から、各カルボ-ルイ匕合物に対する還元活性を算出し、これを N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシルー 3 ォキソプロピオン酸ェチルに対する活性を 100% とした場合の相対値で表し、表 5に示した。表 5から明らかなように本発明の実施形態 としてのポリペプチドは、広範なカルボ-ルイ匕合物に対して還元活性を示した。
表 5：カルボニル化合物に対する還元活性
[表 5] relative activity sub strate ( % )
Ethyl N - Boc - 2- amino - 3 - cyclohexyト 3 - oxopropionate 100
Ethyl 2-chloroacetoacetate 7264
Ethyl 2-methylacetoacetate 42o
Ethyl 2 - chloro— 3 - oxo - 3 - phenylpropionate 1 139
Ethyl 4-chloroacetoacetate 533470
Methyl acetoacetate 1095
Ethyl 2-oxocyclopentanecarboxylate 199
Methyl pyruvate 5o25
Ethyl 2-oxopentanoate 6046
Ethyl benzoylformate 12198
2-hexanone 1540 chloroacetone 4655
3 - chloro - hydroxyacetone 484 o-chloroacetophenone
m-chloroacetophenone 43b8 p-chloroacetophenone 534
2,3'-dichloroacetophenone 12719
2-chloroacetophenone 12789
2,2,2-trifluoroacetophenone 42277
4-acetylpyrridine 1 149
2-acetylfuran 164 tetrahydrothiophen - 3 - one 156 acetylacetone 273 diacetyl 4830 camphorquinone 4737 n-hexylaldehyde 2160 methylglyoxal 248
2-phenylpropionaldehyde 621 o-chlorobenzaldehyde 1219 m-chlorobenzaldehyde 2138 p-chlorobenzaldehyde 445

Claims

請求の範囲
下記式（1)
Figure imgf000033_0001
(Rは、置換または無置換の、アルキル基またはァリール基である）
で表される N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ォキソプロピオン酸エス テルに、該化合物を下記式（2)：
[化 2]
erythro
Figure imgf000033_0002
(Rは、置換または無置換の、アルキル基またはァリール基である）
で表されるエリス口 N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロ ピオン酸エステルに立体選択的に還元する活性を有する酵素源を作用させること〖こ よる、エリス口 N— Boc— 2 ァミノ 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン 酸エステルの製造方法。
[2] 前記酵素源がアースロバクタ一 (Arthrobacter)属、バシラス (Bacillus)属、ブレ ヴアンディモナス（Brevundimonas)属、コリネノ クテリゥム属 (Corvnebacterium) 属、ォエルスコビア（Oerskovia.)属、バエ-バシラス（Paenibacillus)属、リゾビゥム (Rhizobium)属、キャンディダ (Candida)属、デノ リオマイセス（Debarvomvces) 属、ピキア（Pichia)属、ロドトルーラ（Rhodotorula)鼠、サッカロマイコプシス (Sacc haromvcopsis)禺、サッノレニスホフ (Saturnispora)禺、トリコノプシス (Trigonopsi 属、ウイリオプシス (Williopsis)属、コリネスポラ（Corvnesnora)属、プレクトスファ エレラ (Plectosphaerella)属カ なる群より選ばれる微生物、または該微生物から 得られるポリペプチドをコードする DNAを発現可能な形質転換体である、請求項 1記 載のエリス口 N— Boc— 2 ァミノ一 3 シクロへキシノレ 3 ヒドロキシプロピオン 酸エステルの製造方法。
前記式（ 1 )で表される N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ォキソプロピ オン酸エステルに、該化合物を下記式（3)：
[化 3]
Figure imgf000034_0001
(Rは、置換または無置換の、アルキル基またはァリール基である）
で表されるスレオ N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシノレ 3 ヒドロキシプロピ オン酸エステルに立体選択的に還元する活性を有する酵素源を作用させることによ る、スレオ一 N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸 エステルの製造方法。
[4] 前記酵素源がェンテロパクター (Enterobacter)属、モルガネラ (Moreanella)属
、ぺクトパクテリゥム（Pectobacterium)属、シノレシネラ（Circinella)属、ェメリセラ（E mericella)腐、ェゥぺ-シリウム (Eupenicillium)腐、ホルモコ ス（Hormocomis) 属からなる群より選ばれる微生物、または該微生物力 得られるポリペプチドをコード する DN Aを発現可能な形質転換体である、請求項 3記載のスレオ N— Boc— 2— アミノー 3—シクロへキシル 3—ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法。
[5] 前記微生物がアースロバクタ^ ~ ·パラフイネウス（Arthrobacter paraffineus)、バ シラス .リチェ-フオルミス (Bacillus licheniformis)、バシラス'ズブチリス (Bacillu s subtilis)、ノ シラス ·ッリンギェンシス (Bacillus thuringiensis)、ブレヴアンディ モナス ·ディミヌータ（Brevundimonas diminuta) ,コリネパクテリゥム'アンモニア グ不ス (Corvnebacterium ammoniagenes)、ォエノレスコヒ ·ターノヽタ (Oersko via turbata)、バエ-バシラス ·アルべィ (Paenibacillus alvei)、リゾビゥム ·ラジ 才ノクタ一 (Rhizobium radiobacter)、キャンァイダ，マグノリアェ（Candida mag noliae)、ァノ リオマイセス ·ポリモノレファス (Debarvomvces polvmorphus)、ピ3 r Τ ·ァノマラ（Pichia anomala)、ピキア ·ミヌータ ·ノ一'ミヌータ (Pichia minuta var. minuta)、ピキア ·ミヌータ ·ノ一'ノンフアーメンタンス (Pichia minuta var . nonfermentans)、ピキア ·キシローサ (Pichia xvlosa)、ロドトノレーラ ·グノレティ ニス 'ノヽ一'ダイレネンシス (Rhodotorula glutinis var. dairenensis .サッカロ マイコプシス .フイブリゲラ (Saccharomvcopsis fibuligera)、サッノレ-スポラ .サイ ト ~~ィ (Saturnispora saitoi .トリゴノプンス ·ノ リアビリス、 frigonopsis variabili s)、ウイリオプシス ·サターナス ·ノ一'ムラキイ（Williopsis saturnus var. mrakii コリネスポラ '力シィコラ（CorvnesOora cassiicola) .プレクトスファエレラ ·ククメリ ナ (Plectosphaerella cucumerina)からなる群より選ばれた微生物である請求項 2記載の製造方法。
前記微生物がェンテロパクター ·ァエロゲネス (Enterobacter aeroeenes)、モル ガネラ ·モノレガニイ ·サブエスピー ·モノレガニイ（Morganella morganii subsp. m organii)、ぺクトバタテリゥム 'カロトボラム ·サブエスピー 'カロトボラム (Pectobacteri um carotovorum subsp. carotovorum)、ンノレン不フ ·アンへフ' ~~夕 (じ lrcmell a umbellata)、ェメリセラ ·アングイス (Emericella unguis)、ェゥぺニシリウム'バ ~~ネンセ (Eupenicillium baarnense)、ホルモコ^ス ·レンナェ (Hormocomis re ^Q^)カゝらなる群より選ばれた微生物である請求項 4記載の製造方法。
以下の（a)、（b)又は（c)のポリペプチド：
(a)配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド；
(b)配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が 置換、挿入、欠失及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記式 (1)で表 される N— Boc— 2 ァミノ 3 シクロへキシル 3 ォキソプロピオン酸エステルを 不斉的に還元して、下記式 (4) :
[化 4]
Figure imgf000036_0001
(Rは、置換または無置換の、アルキル基またはァリール基である）
で表される（2R, 3R)—N— Boc— 2 ァミノ一 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプ ロピオン酸エステルを生成する活性を有するポリペプチド；
(c)配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列と 60%以上の配列同一性を示すアミノ 酸配列からなり、かつ、前記式 (1)で表される N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシ ルー 3 ォキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元して、前記式 (4)で表される (2R , 3R)—N— Boc— 2 ァミノ一 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸エス テルを生成する活性を有するポリペプチド。
[8] 請求項 7に記載のポリペプチドをコードする DNA。
[9] 以下の（a)、（b)又は（c)の DNA:
(a)配列表の配列番号 1に示す塩基配列を含む DNA;
(b)配列表の配列番号 1に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含む DNAとストリン ジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、前記式 (1)で表される N— Boc— 2—アミ ノー 3—シクロへキシル 3—ォキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元して、下記 式 (4) :
[化 5]
Figure imgf000037_0001
(Rは、置換または無置換の、アルキル基またはァリール基である）
で表される（2R, 3R)—N— Boc— 2 ァミノ一 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプ ロピオン酸エステルを生成する活性を有するポリペプチドをコードする DNA;
(c)配列表の配列番号 1に示す塩基配列と 60%以上の配列同一性を示す塩基配列 からなり、かつ、前記式 (1)で表される N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシルー 3 ォキソプロピオン酸エステルを不斉的に還元して、前記式 (4)で表される（2R, 3R) — N— Boc— 2 アミノー 3 シクロへキシル 3 ヒドロキシプロピオン酸エステルを 生成する活性を有するポリペプチドをコードする DNA。
[10] 請求項 8又は 9に記載の DNAを含むベクター。
[11] 還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードする DNAをさらに含む、請求 項 1
0に記載のベクター。
[12] 請求項 10又は 11に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質 転換体。
[13] 前記宿主細胞が大腸菌である請求項 12記載の形質転換体。
[14] カルボ二ル基を有する化合物に、請求項 7に記載のポリペプチド、又は、請求項 12 又は 13に記載の形質転換体を作用させることを特徴とする光学活性アルコ一ルの製 造方法。
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