CN114574513A

CN114574513A - 多主棒孢菌CcTLS2蛋白与编码基因及其应用

Info

Publication number: CN114574513A
Application number: CN202210357087.2A
Authority: CN
Inventors: 李宝聚; 柴阿丽; 王泉城; 石延霞; 谢学文; 李磊; 范腾飞
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-04-01
Filing date: 2022-04-01
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2042-04-01
Also published as: CN114574513B

Abstract

本发明公开了多主棒孢菌CcTLS2蛋白与编码基因及其应用。本发明公开的多主棒孢菌CcTLS2蛋白来源于多主棒孢菌(Corynesporacassiicola)，为氨基酸序列，是序列1的蛋白质。本发明的实验证明，多主棒孢菌CcTLS2基因被敲除后，所得到的多主棒孢菌敲除突变体相较于野生菌株在黄瓜叶片上不造成病斑；多主棒孢菌敲除突变体的菌丝生长速度明显低于野生型多主棒孢菌。表明多主棒孢菌敲除突变体CcTLS2基因的缺失可导致多主棒孢菌对黄瓜侵染能力的丧失。本发明所提供的CcTLS2基因及其应用在黄瓜棒孢叶斑病的防控方面具有重要意义。

Description

多主棒孢菌CcTLS2蛋白与编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，多主棒孢菌CcTLS2蛋白与编码基因及其应用。

背景技术

多主棒孢菌[Corynesporacassiicola(Berk.&M.A.Curtis)C.T.Wei]作为一种寄主广泛的植物病原菌，该菌不仅能侵染有重要经济价值的作物，如黄瓜、番茄、辣椒、茄子、番木瓜、大豆和橡胶树等，也能侵染园艺花卉植物。多主棒孢菌具有多种生活方式，包括腐生型、内生型和坏死型。近年来棒孢叶斑病在蔬菜生产中成为重要病害。

多主棒孢菌通过菌丝体、分生孢子的形式附着病残体、种子，在土壤中存活，也可以在非寄主植物上存活，成为新的侵染源。多主棒孢菌在病残体上可存活2年。保护地内的病残体经过4个月越夏后，仍有70％的分生孢子萌发，这可成为下茬作物的侵染源。多主棒孢菌的菌丝既能附着种子表层，也能潜入种子内部。从保存6个月的黄瓜种子及砧木用的南瓜种子进行分离培养，均能分离到多主棒孢菌。

近年来，对多主棒孢菌致病机理的研究主要集中在生物学特性、致病力分化、毒力相关基因的克隆等方面。据报道，黄瓜上采集的多主棒孢菌可在10-35℃生长，其最适生长温度约为30℃。在25-30℃的温度范围内，多主棒孢菌孢子从一端或两端萌发，相对湿度>90％，其中以水滴萌发率最高。多主棒孢菌主要通过直接接触或气孔侵入黄瓜叶片。从不同寄主植物中分离到的多种致病菌，证明多种致病菌具有较高的寄主专化性。从日本紫苏、黄瓜、番茄、茄子和甜椒中分离到64株多主棒孢菌，分为7个致病力组(PG1-PG7)。Cassiicolin是一种小型分泌型糖蛋白，是多主棒孢菌的重要致病因子，在不同宿主和地理来源的多主棒孢菌分离株中，Cassiicolin毒素包含Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5和Cas6共6种不同的亚型。各菌株的侵略能力与其亚型有关，其中携带Cas1基因的菌株对橡胶树的侵略能力最强。此外，一些没有Cas基因的菌株在橡胶树叶片上也产生了中等症状，表明多主棒孢菌存在其他的效应因子。

与其他丝状真菌病原体一样，多主棒孢菌需要多种致病因子，如角质酶、细胞壁降解酶、细胞膜和细胞包涵体降解酶，此外还需要毒素(Cassiicolin)侵入宿主植物并引起疾病，这些毒素通过有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Ca²⁺和cAMP信号通路等多种途径转运或调控。迄今为止，除了两个MAPK基因CCk1和CMP1以及Cassiicolin编码的基因Cas之外，其它致病相关基因很少被克隆和功能鉴定，远不能完全代表多主棒孢菌的致病机制。因此，大量的毒力相关基因仍有待于鉴定、克隆和功能表征。因此，研究多主棒孢菌与寄主植物互作的分子机理至关重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何防治多主棒孢菌所致植物病害。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的下述任一应用：

D1)调控多主棒孢菌致病力；

D2)制备调控多主棒孢菌致病力产品；

D3)降低多主棒孢菌致病力；

D4)制备降低多主棒孢菌致病力产品；

D5)调控多主棒孢菌生长；

D6)制备调控多主棒孢菌生长产品；

D7)抑制多主棒孢菌生长；

D8)制备抑制多主棒孢菌生长产品；

D9)防治多主棒孢菌或防治由多主棒孢菌导致的植物病害；

D10)制备防治多主棒孢菌或防治由多主棒孢菌导致的植物病害产品；

所述蛋白质来源于多主棒孢菌(Corynesporacassiicola)，名称为CcTLS2，CcTLS2为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；

A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

上述A2)中的蛋白质，为与序列1所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述应用中，所述调控所述蛋白质活性或含量的物质可为下述B1)至B6)中的任一种：

B1)编码CcTLS2的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)降低CcTLS2含量的核酸分子；

B6)含有B5)所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

上述应用中，B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列2所示的DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码CcTLS2的cDNA分子或基因组DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码CcTLS2的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码CcTLS2蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的CcTLS2蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码CcTLS2蛋白质且具有CcTLS2蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码CcTLS2蛋白质的核酸分子的表达盒(CcTLS2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达CcTLS2蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动CcTLS2基因转录的启动子，还可包括终止CcTLS2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述CcTLS2基因表达盒的重组载体。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pCAMBIA1300载体。

B6)所述重组载体可为敲除CcTLS2基因的载体，如pCAMBIA1300-ΔCcTLS2。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌。

上述应用中，所述植物为黄瓜。

上述应用中，所述植物病害为黄瓜棒孢叶斑病。

本发明还提供了降低多主棒孢菌致病力的方法，包括降低受体多主棒孢菌中CcTLS2的含量或活性，或降低受体多主棒孢菌中CcTLS2的编码基因的表达量，或敲除受体多主棒孢菌中CcTLS2的编码基因，得到与受体多主棒孢菌相比致病力降低的菌株，实现多主棒孢菌致病力的降低；

本发明还提供了防治多主棒孢菌所致植物病害的方法，包括降低受体多主棒孢菌中CcTLS2的含量或活性，或降低受体多主棒孢菌中CcTLS2的编码基因的表达量，或敲除受体多主棒孢菌中CcTLS2的编码基因，得到与受体多主棒孢菌相比致病力降低的菌株，实现多主棒孢菌所致植物病害的防治。

本发明还提供了抑制多主棒孢菌生长的方法，包括降低受体多主棒孢菌中CcTLS2的含量或活性，或降低受体多主棒孢菌中CcTLS2的编码基因的表达量，或敲除受体多主棒孢菌中CcTLS2的编码基因，得到与受体多主棒孢菌相比生长速率下降的菌株，实现多主棒孢菌生长的抑制。

上述方法均可通过导入B6)所述重组载体实现。

本发明还提供了CcTLS2或所述蛋白质的编码基因在作为防治植物病害的靶标中的应用。

本发明还提供了CcTLS2，或所述调控所述蛋白质活性或含量的物质，也属于本发明的保护范围。

本发明的实验证明，多主棒孢菌CcTLS2基因被敲除后，所得到的多主棒孢菌敲除突变体相较于野生菌株在黄瓜叶片上不造成病斑；多主棒孢菌敲除突变体的菌丝生长速度明显低于野生型多主棒孢菌。表明多主棒孢菌敲除突变体CcTLS2基因的缺失可导致多主棒孢菌对黄瓜侵染能力的丧失。本发明所提供的CcTLS2基因及其应用在黄瓜棒孢叶斑病的防控方面具有重要意义。

附图说明

图1为实施例1中PCR鉴定CcTLS2敲除突变体的结果图。其中，HG14102524为野生型多主棒孢菌HG14102524，ΔCcTLS2-71、72、73、74、75、76、77、78、79、710为CcTLS2敲除突变体。

图2为实施例1中PCR鉴定CcTLS2敲除突变体的结果图。其中，HG14102524为野生型多主棒孢菌HG14102524，N为阴性对照(即模板为水)，ΔCcTLS2-71、72、73、74、75、76、77、78、79、710为CcTLS2敲除突变体。

图3为实施例2中十字交叉法测定ΔCcTLS2-71、72、73(敲除株)、HG14102524(野生型)侵染离体黄瓜叶片的病斑直径。

图4为实施例2中十字交叉法测定ΔCcTLS2-71、72、73(敲除株)、HG14102524(野生型)侵染活体体黄瓜叶片的病斑直径。

图5为实施例3中十字交叉法测定ΔCcTLS2-71、72、73(敲除株)、HG14102524(野生型)的生长速率的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

1、菌株与载体

下述实施例中的多主棒孢菌(Corynesporacassiicola)菌株HG14102524，载于非专利文献“朱发娣.黄瓜多主棒孢菌(Corynesporacassiicola)对啶酰菌胺的抗性及其机理研究.中国农业科学院，2018.”，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的农杆菌菌株AGL-1，北京博迈德基因技术有限公司产品，货号为BC302-01。

下述实施例中的pPIC9K-His质粒，北京华越洋生物科技有限公司产品，货号为VECT2430。

下述实施例中的pCAMBIA1300质粒，北京华越洋生物科技有限公司产品，货号为VECT0070。

2、培养基

下述实施例中所用PDA培养基的配制方法为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，溶解于水中，定容至1L，121℃蒸汽灭菌20min。

下述实施例中所用含有抗生素的PDA固体培养基(潮霉素150μg/ml，头孢霉素600μg/ml)为以PDA培养基为基础培养基，向基础培养基中添加潮霉素和头孢霉素得到的培养基，该培养基中潮霉素的浓度为150μg/ml，头孢霉素的浓度为600μg/ml。

下述实施例中所用LB液体培养基的配制方法为：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl5g，溶解于水中，定容至1L，121℃蒸汽灭菌20min。

下述实施例中所用含有抗生素的LB液体培养基(50μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平)为以LB液体培养基为基础培养基，向础培养基中添加卡那霉素和利福平得到的培养基，该培养基中卡那霉素的浓度为50μg/ml，利福平的浓度为50μg/ml。

下述实施例中所用IM培养基的配制方法为：10mL K-bu1er(pH7.0)，20mL M-Nbu11er，1mL 1％(w/v)的CaCl₂·2H₂O，2.5mL 20％(w/v)的NH₄NO₃，1mL 0.1％(w/v)的FeSO₄，5mL甘油，5mL 2mol/L的蔗糖，2mL100mmol/L的乙酰丁香酮，40mL1mol/L的MES(pH5.3)溶解于蒸馏水中，定容至1L。113℃，蒸汽灭菌20min。其中，K-bu1er由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：K₂HPO₄的浓度为200g/L，KH₂PO₄的浓度为145g/L，以H₃PO₃调节其pH值至7.0。M-Nbu11er由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质为：MgSO₄·7H₂O的浓度为30g/L，NaCl的浓度为15g/L。

下述实施例中所用CM共培养培养基为以IM培养基为基础培养基，向基础培养基中添加琼脂粉得到的培养基。该培养基中琼脂粉的含量为1.5％(w/v)。配制后113℃蒸汽灭菌20min。

实施例1、多主棒孢菌CcTLS2敲除突变体的获得

一、pCAMBIA1300-ΔCcTLS2敲除载体的构建

多主棒孢菌中CcTLS2的氨基酸序列见序列表的序列1，编码CcTLS2蛋白的CDS序列见序列表的序列2。

双元载体pCAMBIA1300经限制性内切酶Xho I酶切，以去除潮霉素抗性基因，并用T4连接酶进行自连，得到的质粒命名为pCAMBIA1300-XhoI。

利用CTAB法提取多主棒孢菌HG14102524基因组DNA，以该基因组DNA为模板，利用

Max DNA Polymerase，以引物对1(F1和R1组成的引物对)进行PCR扩增，获得CcTLS2基因5’端片段(含有序列3的第18至1162位)。

F1：5’-ACGAATTCGAGCTCGGTACCTTCGGGCTGAGAATGAGTTC-3’(下划线指示的序列为Kpn I酶识别位点序列)；

R1：5’-GCAGGTCGACTCTAGATTTGGTTCAGAGCTTCTCTTTCCG-3’(下划线指示的序列为Xba I酶识别位点序列)。

以上述基因组DNA为模板，利用

MaxDNAPolymerase，以引物对2(F2和R2组成的引物对)进行PCR扩增，获得CcTLS2基因3’端片段(含有序列3的第2928至3953位)：

F2：5’-CTGAACCAAATCTAGAAATTATAGCATATCAGTAATAAAAG-3’(双下划线指示的序列为Xba I酶识别位点序列)；

R2：5’-CCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCCACAACCTTATGTTCAG-3’(双下划线指示的序列为Sbf I酶识别位点序列)。

利用

质粒小提试剂盒提取pPIC9K-His质粒为模板，利用

Max DNA Polymerase，以引物对3(F3和R3组成的引物对)进行PCR扩增，获得潮霉素抗性基因表达盒片段(含有序列3第1169-2921位)：

F3：5’-CTGAACCAAATCTAGAGGGGAGAGGCGGTTTGCG-3’(下划线指示的序列为Xba I酶识别位点序列)；

R3：5’-TGCTATAATTTCTAGAGGGAGCTGTTGGCTGGCTGG-3’(双下划线指示的序列为XbaI酶识别位点序列)。

用In-Fusion HD Cloning kits(Takara)将三种PCR产物(CcTLS2基因5’端片段、CcTLS2基因3’端片段和潮霉素抗性基因表达盒片段)连接到pCAMBIA1300-XhoI载体上，具体为：1)将pCAMBIA1300-XhoI用限制性内切酶Kpn I和Xba I进行双酶切，通过In-1usion无缝克隆试剂盒(宝日医生物技术(北京)有限公司产品，货号为639648)与PCR扩增得到的CcTLS2基因5’端片段进行连接，获得质粒1；2)将质粒1在CcTLS2基因5’端片段后的多克隆位点以Xba I和Sbf I双酶切进行线性化，用In-1usion无缝克隆试剂盒(宝日医生物技术(北京)有限公司产品，货号为639648)连接PCR扩增得到的CcTLS2基因3’端片段，获得质粒2；3)将质粒2在CcTLS2基因5’端片段与CcTLS2基因3’端片段之间的多克隆位点以Xba I进行单酶切线性化，用In-1usion无缝克隆试剂盒连接PCR扩增得到的潮霉素抗性基因表达盒片段，得到的表达载体为pCAMBIA1300-ΔCcTLS2：以CcTLS2基因5’端片段替换pCAMBIA1300-XhoI载体的限制性核酸内切酶Kpn I和Xba I识别位点间的片段，以CcTLS2基因3’端片段替换pCAMBIA1300-XhoI载体的限制性核酸内切酶Xba I和Sbf I识别位点间的片段，将潮霉素抗性基因表达盒片段插入限制性核酸内切酶Xba I识别位点，保持pCAMBIA1300-XhoI载体的其它序列不变，得到含有CcTLS2基因5’端、潮霉素抗性基因表达盒和CcTLS2基因3’端的重组表达载体，命名为pCAMBIA1300-ΔCcTLS2。经测序验证，pCAMBIA1300-ΔCcTLS2含有如序列表中序列3所示的DNA片段，其中，第1169-2921位为潮霉素抗性基因表达盒片段，第18至1162位为CcTLS2基因5’端片段，第2928至3953位为CcTLS2基因3’端片段。

二、CcTLS2敲除突变体的获得

1、构建CcTLS2敲除突变体

将上述构建的pCAMBIA1300-ΔCcTLS2利用农杆菌介导的转化转进野生型多主棒孢菌HG14102524中，得到CcTLS2敲除突变体。具体步骤如下：

(1)以pCAMBIA1300-ΔCcTLS2转入农杆菌AGL-1(北京博迈德基因技术有限公司产品)，挑取阳性农杆菌(含有pCAMBIA1300-ΔCcTLS2的重组农杆菌)单菌落放入到5ml含有抗生素的LB液体培养基(50μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平)，置于28℃摇床上，200rpm培养60小时。离心机上4000rpm离心10min，收集菌体，菌体用IM培养基洗两次，再用IM培养基重悬，调OD600nm至1.0，获得农杆菌菌液A。

(2)与此同时用ddH₂O及灭菌刷刷取PDA培养基上的野生型多主棒孢菌菌株HG14102524孢子，获得孢悬液，用IM液体培养基重悬孢子，血球计数板计数，调孢子浓度为1.0×106-7个孢子/ml，获得真菌孢子悬浮液A。

(3)将步骤(1)获得的农杆菌菌液A和步骤(2)获得的真菌孢子悬浮液A按1:1体积比例混匀(各取1ml)，按照每培养皿200μ1涂布于CM共培养培养基平板上的硝酸纤维素膜，23℃培养40个小时，获得共培养物A。

(4)裁剪生长有菌丝的硝酸纤维素膜，平铺于含有抗生素的PDA固体培养基(潮霉素150μg/ml，头孢霉素600μg/ml)上培养5-7天，获得CcTLS2敲除突变体。

2、PCR鉴定CcTLS2敲除突变体

CTAB法分别提取步骤1获得的CcTLS2敲除突变体基因组DNA和野生型多主棒孢菌HG14102524基因组DNA。

利用1对引物对，分别对野生型多主棒孢菌HG14102524基因组DNA、CcTLS2敲除突变体基因组DNA进行PCR扩增，结果见图1：

引物对扩增CcTLS2基因5’端上游至潮霉素抗性表达盒基因序列，该引物对由a7taF和FhphL构成：

a7taF：5’-ACCTCCCTCCAGCGAACTAT-3’；

FhphL：5’-TTGTTGGAGCCGAAATCC-3’。

野生型多主棒孢菌HG14102524获得目的序列(2808bp)，而CcTLS2敲除突变体未获得，说明外源片段插入正确位置。

利用1对引物对，分别对野生型多主棒孢菌HG14102524基因组cDNA、CcTLS2敲除突变体基因组cDNA进行PCR扩增，结果见图2：

引物对扩增CcTLS2基因，由a7*F和a7-10R构成：

a7*F：5’-ATGCTCGGTACCAAGATCGC-3’；

a7-10R：5’-CCGTAAGAGTTGTAGGAAGGGT-3’。

CcTLS2敲除突变体基因组DNA以第二对引物对未扩增到目标条带，说明CcTLS2基因敲除成功；

上述结果说明基于多主棒孢菌HG14102524的CcTLS2敲除突变体构建成功，以3个敲除株ΔCcTLS2-71、72、73进行后续实验。

实施例2、突变体的致病力检测

待测突变体为实施例1构建的CcTLS2敲除突变体71、72、73(简称敲除株ΔCcTLS2-71、72、73)，对照为野生型多主棒孢菌HG14102524(简称野生型HG14102524)。

通过离体贴片培养法来鉴定致病力，具体步骤如下：准备好干净的保湿盒，喷适量清水，使其保湿。将采集好的黄瓜叶片叶背朝上分别在保湿盒内摆好(三片一盒)。分别在PDA培养基上活化好的多主棒孢菌(敲除株ΔCcTLS2-71、72、73，和野生型HG14102524共四种)用0.5cm的打孔器在菌落边缘打成菌饼，用灭菌镊子夹将菌饼接种到黄瓜叶片上(菌丝朝下)，每片叶上每种多主棒孢菌贴一个菌饼。菌饼切好后，喷适量清水并保湿，待发病，采用十字交叉法测定病斑直径，结果见图3。

通过活体贴片培养法来鉴定致病力，具体步骤如下：将在PDA培养基上活化多主棒孢菌(敲除株ΔCcTLS2-71、72、73，和野生型HG14102524共四种)用0.5cm的打孔器在菌落边缘打成菌饼，用灭菌镊子夹将菌饼接种到第二片真叶期的黄瓜叶片上(菌丝朝下)，每片叶上贴一个菌饼。于30℃保湿5d，调查拍照记录，采用十字交叉法测定病斑直径，结果见图4。

通过上述方法，验证了CcTLS2敲除突变体ΔCcTLS2-71、72、73对黄瓜表现无致病力。说明CcTLS2基因是多主棒孢菌完全毒力的关键基因。

实施例3、突变体菌丝生长速率的测定

采用5mm打孔器，将PDA平板中等量、相同环境下培养的多主棒孢菌(敲除株ΔCcTLS2-71、72、73，和野生型HG14102524共四种)的菌落边沿分别打取等量菌饼，采用灭菌牙签挑取菌饼，菌丝面朝下贴于PDA平板中央，对于每个菌株，设置3个平板重复，5d后采用十字交叉法测定菌落直径。野生型多主棒孢菌HG14102524为对照。

结果见图5，验证了CcTLS2敲除突变体ΔCcTLS2-71、72、73相较于野生型HG14102524生长显著缓慢，ΔCcTLS2-71、72、73的菌落直径平均为2.6cm、2.6cm、2.7cm，野生型HG14102524的菌落直径平均为5.1cm，说明CcTLS2基因参与多主棒孢菌菌丝的生长。

因此，本发明提供的CcTLS2基因可以用于植物病害防治，特别是由多主棒孢菌所导致的黄瓜棒孢叶斑病。另，本发明提供的基因可以作为用于植物病害防治的药物的靶标。本领域技术人员可以跟进本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是多主棒孢菌的药物。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 多主棒孢菌CcTLS2蛋白与编码基因及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 359

<212> PRT

<213> 多主棒孢菌（Corynesporacassiicola）

<400> 1

Met Leu Gly Thr Lys Ile Ala Val Leu Leu Ser Leu Gly Thr Ala Val

1 5 10 15

Thr Ala Ala Ala Ile Asp Ile Ser Pro Lys Ala Asn Val Asp Leu Ser

20 25 30

Leu Asp Ala Gly Leu Asp Ala Ser Leu Ile Ala Asp Val Asp Ala Asp

35 40 45

Ile Ser Leu Lys Val Asp Val Asn Ala Glu Ala Ser Leu Lys Ala Asp

50 55 60

Leu Asp Val Tyr Ala Ser Leu Lys Ala Asp Leu Glu Thr Tyr Val Ser

65 70 75 80

Leu Lys Ala Asp Ala Tyr Ala Ala Leu Lys Ala Asp Leu Asp Ala Leu

85 90 95

Ala Ser Leu Lys Ile Asn Leu Asp Ala Leu Ala Ser Leu Asn Val Asp

100 105 110

Leu Asp Ala Ser Leu Lys Ala Asp Leu Asp Ala Ser Leu Lys Ala Asp

115 120 125

Val Tyr Ala Ala Leu Lys Ala Asp Leu Asp Ala Tyr Ala Ser Leu Lys

130 135 140

Ala Glu Leu Asp Ala Ser Leu Gln Thr Asp Leu Asp Val Tyr Ala Ser

145 150 155 160

Leu Thr Val Gly Leu Asp Ala Ser Leu Asp Ile Asp Val Asp Ala Ser

165 170 175

Leu Asp Val Asp Val Asp Ile Ser Leu Asp Ala Gly Val Ala Ala Ser

180 185 190

Leu Ser Ala Asp Val Asp Ala Ser Leu Gln Val Asp Ile Asp Ala Leu

195 200 205

Ile Gly Gln Ser Phe Ser Leu Leu Asp Val Val Ala Glu Leu Asn Leu

210 215 220

Ser Ile Ile Asn Thr Glu Phe Lys Gly Thr Ile Val Arg Ser Ile Ile

225 230 235 240

Asp Lys Ile His Thr Ala Phe Pro Ser Leu Glu Leu Thr Cys Ser Ile

245 250 255

Pro Thr Ser Ser Pro Pro Thr Gly Leu Thr Pro Ser Ser Pro Pro Thr

260 265 270

Arg Ser Thr Pro Ser Ser Thr Pro Thr Gly Ser Ile Pro Ser Ser Thr

275 280 285

Pro Thr Gly Ser Ala Pro Ser Ser Thr Pro Thr Gly Ser Thr Pro Ser

290 295 300

Ser Thr Pro Gly Ser Val Ser Ser Ser Thr Pro Thr Gly Ser Thr Pro

305 310 315 320

Thr Gly Ser Thr Ala Thr Gly Ser Thr Pro Thr Gly Ser Thr Pro Ser

325 330 335

Ser Thr Phe Ser Ser Ile Pro Thr Ser Pro Thr Pro Phe Asn Pro Ser

340 345 350

Tyr Asn Ser Tyr Gly Gly Tyr

355

<210> 2

<211> 1080

<212> DNA

<213> 多主棒孢菌（Corynesporacassiicola）

<400> 2

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<212> DNA

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Claims

1.蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的下述任一应用：

D1)调控多主棒孢菌致病力；

D2)制备调控多主棒孢菌致病力产品；

D3)降低多主棒孢菌致病力；

D4)制备降低多主棒孢菌致病力产品；

D5)调控多主棒孢菌生长；

D6)制备调控多主棒孢菌生长产品；

D7)抑制多主棒孢菌生长；

D8)制备抑制多主棒孢菌生长产品；

D9)防治多主棒孢菌或防治由多主棒孢菌导致的植物病害；

所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控所述蛋白质活性或含量的物质为下述B1)至B6)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B5)降低权利要求1中所述蛋白质含量的核酸分子；

B6)含有B5)所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列2所示的DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为黄瓜。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物病害为黄瓜棒孢叶斑病。

6.降低多主棒孢菌致病力的方法，包括降低受体多主棒孢菌中权利要求1中所述蛋白质的含量或活性，或降低受体多主棒孢菌中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量，或敲除受体多主棒孢菌中权利要求1中所述蛋白质的编码基因，得到与受体多主棒孢菌相比致病力降低的菌株，实现多主棒孢菌致病力的降低。

7.防治多主棒孢菌所致植物病害的方法，包括降低受体多主棒孢菌中权利要求1中所述蛋白质的含量或活性，或降低受体多主棒孢菌中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量，或敲除受体多主棒孢菌中权利要求1中所述蛋白质的编码基因，得到与受体多主棒孢菌相比致病力降低的菌株，实现多主棒孢菌所致植物病害的防治。

8.抑制多主棒孢菌生长的方法，包括降低受体多主棒孢菌中权利要求1中所述蛋白质的含量或活性，或降低受体多主棒孢菌中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量，或敲除受体多主棒孢菌中权利要求1中所述蛋白质的编码基因，得到与受体多主棒孢菌相比生长速率下降的菌株，实现多主棒孢菌生长的抑制。

9.权利要求1中所述蛋白质或所述蛋白质的编码基因在作为防治植物病害的靶标中的应用。

10.权利要求1中所述蛋白质，或权利要求2或3中所述调控所述蛋白质活性或含量的物质。