WO2007105547A1

WO2007105547A1 - ミリセチンの体内吸収性の向上方法

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Publication number: WO2007105547A1
Application number: PCT/JP2007/054355
Authority: WO
Inventors: Ryosuke Shimizu; Tomoko Kai; Masamitsu Moriwaki; Rie Tanaka; Mikio Nakamura
Original assignee: San-Ei Gen F.F.I., Inc.
Priority date: 2006-03-06
Filing date: 2007-03-06
Publication date: 2007-09-20
Also published as: JPWO2007105547A1

Abstract

　本発明はミリセチンの体内吸収性および体内抗酸化能を向上させる方法を提供する。これらの方法は、いずれもミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基を１又は複数個結合させることによって実施することができる。また本発明は、体内吸収性に優れ、体内において抗酸化作用を有効に発揮する体内抗酸化剤、ならびに当該体内抗酸化剤を有効成分とする経口組成物を提供する。当該体内抗酸化剤は、ミリセチンの３位または３’位の酸素原子にグルコシル基を１又は複数個結合してなるグルコシルミリセチンを有効成分として含有することを特徴とする。

Description

明細書

ミリセチンの体内吸収性の向上方法

技術分野

[0001] 本発明は、ミリセチンの体内吸収性を向上させる方法に関する。また本発明は、ミリセチンの体内吸収性を向上させることによって、その体内での抗酸化能を向上させる方法に関する。さらに本発明は、体内吸収性を高めたミリセチン配糖体の体内抗酸化剤としての用途、特に経口組成物としての用途に関する。本発明の方法によって体内吸収性が高められたミリセチン配糖体は体内で有効な抗酸化作用を発揮するため、体内抗酸化剤として、特に食品や医薬品などの経口組成物の成分として有用である。

背景技術

[0002] 酸化は生命活動において重要である一方、酸化反応、それも生体による制御が効力ない酸化反応は生体に大きなダメージを与える。特に、脂質などが酸化されて生じる過酸化物は生体に大きな傷害をもたらすこと、また過酸化物は光老化の大きな要因でなることが指摘されている。また、酸化は炎症にも大きく関わっており、慢性的な炎症は発ガンの重要な因子となると考えられていることから、酸化は発ガンとも深い関係にあるといえる。さらに、近年、生活習慣病に分類されている血栓症や脳循環関連の病気にも、酸化ストレス、とりわけ血管内皮細胞の酸化ストレスが関与していることも指摘されている。このように、生体において酸化反応を適切に制御することは、生体の維持と健康の維持に大変有用なことであり、このためにも酸化ストレスを軽減する方法が求められている。

[0003] この目的で、従来より種々の抗酸化剤が使用されている。例えばルチン、ケルセチン、モリン、カテキン、ヘスペリジン、イソフラボン類及びミリセチンなどの各種のフラボノイド；ビタミン C (ァスコルビン酸）、ビタミン E (トコフエロール）などのビタミン類； -力口テン、ァスタキサンチン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、リコピン、ノレティンなどのカロテノイド；セレンなどのミネラル；コェンザィム Q10、 α _リポ酸などの補酵素；クノレクミン、クロロゲン酸、タンニンなどのポリフエノール類などは、抗酸化作用を有していることが知られている。

[0004] なかでもミリセチンにっレ、ては、上述した生体内脂質の酸化防止作用（抗酸化作用 )の他、発癌抑制作用、抗ウィルス作用、抗血栓作用、抗動脈硬化作用、および抗糖尿病作用などを有しているとの報告がある（非特許文献 1参照）。

[0005] し力ながら、ミリセチンなどのフラボノイドは常温の水に難溶であるため、食品等の特に水溶性組成物に対して使用しにくいという問題がある。また、これらは体内吸収性が低ぐこのため体内において抗酸化作用を有効に発揮することできないという問題がある。

[0006] 水難溶性のフラボノイドを易溶化する方法としては、ルチンにナリンギナーゼ処理させて得たケルセチン 3 - 0 -モノダルコシドに澱粉質とシクロデキストリン一グルカノトランスフェラーゼを作用させることによって水易溶性のフラボノイド配糖体を調製する方法 (特許文献 1参照）；水難溶性フラボノイドをケルセチン— 3 _ O _配糖体と共存させることによって当該水難溶性フラボノイドを溶解する方法 (特許文献 2参照）；水難溶性フラボノイドにケノレセチン 3— O 配糖体を配合した水溶液を乾燥させることによって、水難溶性フラボノイドを改質する方法 (特許文献 3参照）；並びに、ャマモモ科植物抽出物にガラクトースを転移させることによって、ャマモモ科植物抽出物を水易溶化する方法 (特許文献 4参照）が知られてレ、る。

[0007] しかし、これらのフラボノイド、とくにミリセチンについて体内吸収性を向上させる方法については知られていなレ、。また、水への溶解性を向上させることによって直ちに体内吸収性が向上するというわけではない（例えば、後述する実験例 4と 6参照）。特 3午文献 1 :「Biologicai Effects of Myricetm」 Kian C.Ong, Hoon_Eng Khoo. uen. Phamac. Vol.29, No.2, 121—126, 1997

特許文献 1：特開平 01— 213293号公報

特許文献 2 :特開平 03 077880号公報

特許文献 3 :特開平 07— 010898号公報

特許文献 4 :特開平 09— 095672号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題 [0008] 本発明は、ミリセチンについて体内吸収性を高める方法を提供することを目的とする。特に本発明は、ミリセチンについて水溶性を高めると同時に、経口による体内吸収性を向上する方法を提供することを目的とする。また本発明は、ミリセチンについて体内吸収性を高め、体内での抗酸化能を向上させる方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、これらの方法によって体内吸収性および体内抗酸化能が向上したミリセチン配糖体について、体内抗酸化剤としての用途、特に体内で優れた抗酸化作用を発揮する食品や医薬品などの経口組成物の成分としての用途を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者らは、上記課題の解決を目指して、日夜検討を重ねていたところ、ミリセチンをダルコシル化、具体的にはミリセチンの 3位または 3 '位の酸素原子にダルコシル基を 1個以上結合させることにより、経口投与した場合の体内吸収性が、ミリセチンをそのまま経口投与した場合に比して顕著に向上することを見出した。し力も、ミリセチンの 3位または 3 '位の酸素原子にダルコシノレ基を 1個以上結合させることにより、生体内での抗酸化作用も、ミリセチンをそのまま経口投与する場合に比して向上することを確認した。さらに、当該ミリセチンのグノレコシルイ匕体は、ミリセチンに比して水溶性も格段に向上しており、水中での安定性も向上していることを確認した。

[0010] 本発明は係る知見に基づいて完成されたものであり、下記の態様を包含するものである：

I.ミリセチンの {本 P 収'卜牛の卜. ¾

(ト 1)ミリセチンをグノレコシノレ化することを特徴とする、ミリセチンの体内吸収性の向上方法。

[0011] (1-2)ミリセチンのダルコシル化力ミリセチンの 3位または 3'位の酸素原子にダルコシノレ基を 1またはそれ以上、好ましくは 1または 2以上 5以下結合させることからなるものである、（1-1)記載の方法。

[0012] (1-3)ミリセチンをダルコシル化して、ミリセチンの 3位または 3'位の酸素原子にダルコシル基が 1以上、好ましくは 1以上 5以下結合してなる複数のグノレコシルミリセチンの混合物とする、 (1-1)または（1-2)に記載する方法。 [0013] (1-4)ミリセチンをダルコシル化して、ミリセチンの 3'位の酸素原子にダルコシル基力以上、好ましくは 1以上 5以下結合してなる複数のダルコシルミリセチンの混合物とする、（1-1)または (1-2)に記載する方法。

[0014] (1-5)ダルコシルミリセチンの混合物力ミリセチンの 3位または 3'位の酸素原子にグノレコシル基が 1以上結合してなる複数のダルコシルミリセチンの混合物であって、当該混合物 100重量％中のモノダルコシド体、ジダルコシド体およびトリダルコシド体の総量が 30重量％以上である、（1-3)または (1-4)に記載する方法。

[0015] (1-6)モノダルコシド体、ジダルコシド体およびトリダルコシド体の総量が 30〜80重量％である、（1-5)に記載する方法。

[0016] II.ミリセチンの体内杭酸化能の向卜.方法

(Π-1)ミリセチンをダルコシノレ化することを特徴とする、ミリセチンの体内抗酸化能の向上方法。

[0017] (Π-2)ミリセチンのダルコシル化力ミリセチンの 3位または 3 '位の酸素原子にダルコシル基を 1またはそれ以上、好ましくは 1または 2以上 5以下結合させることからなるものである、（Π-1)記載の方法。

[0018] (Π-3)ミリセチンをダルコシノレ化して、ミリセチンの 3位または 3 '位の酸素原子にグルコシル基が 1以上、好ましくは 1以上 5以下結合してなる複数のグノレコシルミリセチンの混合物とする、 (II-1)または (Π-2)に記載する方法。

[0019] (Π-4)ミリセチンをダルコシル化して、ミリセチンの 3 '位の酸素原子にダルコシル基力以上、好ましくは 1以上 5以下結合してなる複数のダルコシルミリセチンの混合物とする、（Π-1)または（1ト2)に記載する方法。

[0020] (Π-5)ダルコシルミリセチンの混合物力ミリセチンの 3位または 3 '位の酸素原子にグノレコシル基が 1以上結合してなる複数のダルコシルミリセチンの混合物であって、当該混合物 100重量％中のモノダルコシド体、ジダルコシド体およびトリダルコシド体の総量が 30重量％以上である、（Π-3)または（II-4)に記載する方法。

[0021] (II-6)モノダルコシド体、ジダルコシド体およびトリダルコシド体の総量が 30〜80重量％である、（Π-5)に記載する方法。

[0022] III. {本ィ吝 II (m-i)ミリセチンの 3位または 3 '位の酸素原子にダルコシノレ基が 1またはそれ以上、好ましくは 1または 2以上 5以下結合してなるダルコシルミリセチンを有効成分とする、体内抗酸化剤。

[0023] (ΙΠ-2)ダルコシルミリセチン力ミリセチンの 3 '位の酸素原子にダルコシル基が 1またはそれ以上、好ましくは 1または 2以上 5以下結合してなるものである、（ΙΠ-1)に記載する体内抗酸化剤。

[0024] (ΙΠ-3)ダルコシルミリセチン力ミリセチンの 3位または 3 '位の酸素原子にダルコシル基が 1以上、好ましくは 1以上 5以下結合してなる複数のダルコシノレミリセチンの混合物である、（ΠΙ-1)または (ΠΙ-2)に記載する体内抗酸化剤。

[0025] (ΙΠ-4)ダルコシルミリセチン力ミリセチンの 3 '位の酸素原子にダルコシル基が 1以上、好ましくは 1以上 5以下結合してなる複数のグノレコシルミリセチンの混合物である

、（ΠΙ-1)または（ΙΠ-2)に記載する体内抗酸化剤。

[0026] (ΠΙ-5)ダルコシルミリセチンの混合物力ミリセチンの 3位または 3'位の酸素原子にグノレコシル基が 1以上結合してなる複数のダルコシルミリセチンの混合物であって、当該混合物 100重量％中のモノダルコシド体、ジダルコシド体およびトリダルコシド体の総量が 30重量％以上である、（ΠΙ-3)または (ΠΙ-4)に記載する体内抗酸化剤。

[0027] (III-6)モノダルコシド体、ジダルコシド体およびトリダルコシド体の総量が 30〜80重量％である、（ΠΙ-5)に記載する体内抗酸化剤。

[0028] IV.経口組成物

(IV- 1) (m-i)〜（m-6)のいずれかに記載する体内抗酸化剤を、体内で抗酸化作用を発揮する有効量含有する経口組成物。

[0029] (IV-2)飲食物、経口医薬品、飼料または餌料である（IV-1)に記載する経口組成物 [0030] V.使用

(V-1)ミリセチンの 3位または 3 '位の酸素原子にダルコシル基が 1またはそれ以上、好ましくは 1または 2以上 5以下結合してなるダルコシノレミリセチンの、体内抗酸化剤の製造のための使用。

[0031] (V-2)ダルコシルミリセチン力ミリセチンの 3 '位の酸素原子にダルコシル基が 1またはそれ以上、好ましくは 1または 2以上 5以下結合してなるものである、 (V-1)に記載する使用。

[0032] (V-3)ダルコシルミリセチン力ミリセチンの 3位または 3 '位の酸素原子にダルコシル基が 1以上、好ましくは 1以上 5以下結合してなる複数のダルコシノレミリセチンの混合物である、（V-1)または (V-2)に記載する使用。

[0033] (V-4)ダルコシルミリセチンが、ミリセチンの 3 '位の酸素原子にダルコシル基が 1以上、好ましくは 1以上 5以下結合してなる複数のグノレコシルミリセチンの混合物である

、（V-1)または (V-2)に記載する使用。

[0034] (V-5)ダルコシルミリセチンの混合物力ミリセチンの 3位または 3'位の酸素原子にグノレコシル基が 1以上結合してなる複数のダルコシルミリセチンの混合物であって、当該混合物 100重量％中のモノダルコシド体、ジダルコシド体およびトリダルコシド体の総量が 30重量％以上である、（V-3)または (V-4)に記載する使用。

[0035] (V-6)モノダルコシド体、ジダルコシド体およびトリダルコシド体の総量が 30〜80重量％である、（V-5)に記載する使用。

発明の効果

[0036] 本発明によれば、ミリセチンをダルコシルイ匕することによって、ミリセチンの体内吸収性を向上させることができる。斯くして当該ダルコシルミリセチンは、ミリセチンの体内吸収性が向上することによって、体内においてミリセチンの抗酸化能をより有効に発揮すること力 Sできる。またダルコシルミリセチンは、上記特徴に加えて、水に対する溶解性および水中での安定性が高レ、とレ、う特徴を有してレ、る。このためダルコシルミリセチンは水相溶性に優れており、食品、経口用医薬品、飼料または餌料などの素材として有効に利用することができる。

[0037] これらのこと力、本発明が提供するグノレコシノレミリセチンは、生体に対する酸化防止剤 (体内抗酸化剤）として、また体内の抗酸化を効果とする食品、経口用医薬品、飼料または餌料などの有効成分として、有効に利用することができる。

発明を実施するための最良の形態

[0038] mミリセチンの体内吸卜牛の向卜. 法

本発明の方法は、ミリセチンの体内吸収性を高める方法、具体的には経口投与によるミリセチンの体内吸収性を向上する方法である。

[0039] 当該方法はミリセチンをグノレコシルイ匕することによって実施することができる。

[0040] グノレコシノレ化するミリセチンの部位は特に制限されないが、具体的にはミリセチンの 3位または 3'位の酸素原子いずれか少なくとも一方である。好ましくはミリセチンの 3 位または 3'位の酸素原子いずれか一方であり、より好ましくはミリセチンの 3 '位の酸素原子である。結合させるダルコシル基の数は、 1またはそれ以上であれば特に制限されなレ、。好ましくは:!〜 5、より好ましくは 1〜3である。

[0041] ミリセチンをダルコシルイ匕する方法は、特に制限されなレ、。例えばミリセチンの 3位の酸素原子にダルコシル基が一つ結合してなるミリセチン— 3 _〇—モノダルコシドを調製する方法としては、まずミリセチンの 7位と 4'位の水酸基をべンジノレ基などの保護基で修飾した後、ァセトブロモグルコース（テトラ _〇—ァセチル—ひ _D_ダルコピラノシルブ口ミド）を作用させる方法を挙げることができる（実施例 1参照）。また、ミリセチンの 3位の酸素原子にグノレコシノレ基が複数個結合してなるミリセチンー3—〇一ポリダルコシドを調製する方法としては、例えば上記の方法で得られるミリセチン 3 O モノダルコシドに、糖転移酵素を作用させる方法を挙げることができる（実施例 2参照）。

[0042] 一方、ミリセチンの 3 '位の酸素原子をダルコシルイ匕する場合は、ミリセチンと α -グルコシル糖化合物を含有する溶液に糖転移酵素を作用させる方法を挙げることができる（実施例 3参照）。ここで、 α—グノレコシル糖ィ匕合物としては、例えば、マルトース、アミロース、アミロぺクチン、デキストリン、でんぷん、でんぷん液化物、シクロデキストリンなどを挙げることができる。また糖転移酵素としては、 α—ダルコシダーゼ（EC 3 • 2.1.20)、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（EC 2.4.1.19)またはひ —アミラーゼ（EC 3.2.1.1)を挙げること力 Sできる。

[0043] なお、ミリセチンをダルコシル化すると、単一組成からなるダルコシルミリセチンのほか、異なる組成を有する 2種以上のグノレコシルミリセチンの混合物を得ることもできる。本発明でいうダルコシルミリセチンは、特に言及しないかぎり、単一組成からなるグルコシルミリセチンならびに異なる組成を有する 2種以上のダルコシルミリセチンの混合物を区別なく意味するものとする。 [0044] 例えば、ダルコシルミリセチンの混合物には、下式（1)に示す、ミリセチンの 3位の酸素原子に 1以上、好ましくは 1〜5のダルコシル基を有するミリセチンー3—〇ーグノレコシド、具体的にはミリセチン—₃—〇—モノダルコシド、ミリセチン—₃—〇—ジグルコシド、ミリセチン _₃_o_トリダルコシド、ミリセチン _ 3 _〇—テトラダルコシドぉよびミリセチン一 3— 0—ペンタグノレコシドからなる群から選択される 2種以上のダルコシルミリセチンの混合物が含まれる。

[0045] [化 1]

1以上、好ましくは 1〜5

[0046] 制限されなレ、ものの、力かるダルコシルミリセチン混合物として好ましくは、混合物 1 00重量％中にモノダルコシド体、ジダルコシド体及びトリダルコシド体を合計 30重量 %以上の割合、好ましくは 40重量％以上、より好ましくは 50重量％以上、さらに好ましくは 60重量％以上の割合で含むものである。なお、上限は 100重量％であるが、好ましくは 80重量％である。この限りにおいてグノレコシルミリセチン混合物中に含まれるモノダルコシド体、ジダルコシド体、トリダルコシド体、テトラダルコシド体、およびペンタグルコシド体の割合は制限されないが、実施例 2の結果から、例えば下記の割合を例示することができる；（1)モノグノレコシド体： 27〜37重量部、好ましくは 29〜35 重量部、（2)ジダルコシド体： 15〜21重量部、好ましくは 17〜23重量部、（3)トリダルコシド体： 10〜20重量部、好ましくは 12〜： 18重量部、（4)テトラグノレコシド体： 6〜： 16重量部、好ましくは 8〜： 14重量部、（5)ペンタグノレコシド体: 4〜： 10重量部、好ましくは 6 〜 12重量部。

[0047] なお、前述する方法（ミリセチンにァセトブロモグノレコースを作用させる方法にてミリセチン— 3—モノダルコシドを得た後、糖転移酵素を作用させる方法）によって調製されるミリセチン _ 3 _〇—ポリダルコシドは、ミリセチンの 3位の酸素原子にダルコシル基が 1、 2、 3、 4および 5個それぞれ結合した複数のダルコシルミリセチンの混合物である（実施例 2)。単一組成からなるミリセチン一 3—〇一ダルコシドは、上記混合物から、ゲルろ過または逆相クロマトグラフィーなどの各種方法により単離取得することができる。

[0048] また、本発明が対象とするグノレコシルミリセチンの混合物には、下式（2)に示す、ミリセチンの 3 '位の酸素原子に 1以上、好ましくは 1〜5のダルコシル基を有するミリセチン—3 ' _〇_ダルコシド、具体的にはミリセチン—3 ' _〇_モノダルコシド、ミリセチン—3 ' _〇—ジダルコシド、ミリセチン—3 ' _〇_トリダルコシド、ミリセチン—3 ' - O—テトラダルコシドおよびミリセチン一3 ' _〇 ^ンタダルコシドからなる群から選択される 2種以上のグノレコシルミリセチンの混合物が含まれる。

[0049] [化 2]

η = 1以上、好ましくは 1〜5

[0050] 制限されなレ、ものの、力かるダルコシルミリセチン混合物として好ましくは、混合物 1 00重量％中にモノダルコシド体、ジダルコシド体及びトリダルコシド体を合計 30重量 %以上の割合、好ましくは 40重量％以上、より好ましくは 50重量％以上、さらに好ましくは 60重量％以上の割合で含むものである。なお、上限は 100重量％であるが、好ましくは 80重量％である。この限りにおいてグノレコシルミリセチン混合物中に含まれるモノダルコシド体、ジダルコシド体、トリダルコシド体、テトラダルコシド体、およびペンタグルコシド体の割合は制限されないが、実施例 3の結果から、例えば下記の割合を例示することができる； (a)モノグノレコシド体： 10〜： 16重量部、好ましくは 12〜18 重量部、（b)ジダルコシド体： 29〜35重量部、好ましくは 31〜37重量部、（c)トリダルコシド体： 16〜22重量部、好ましくは 18〜24重量部、（d)テトラグノレコシド体： 3〜9重量部、好ましくは 5〜： 11重量部、（e)ペンタグルコシド体： 0〜9重量部、好ましくは 1〜 7重量部。

[0051] 前述する方法 (ミリセチンと α -ダルコシル糖化合物を含有する溶液に糖転移酵素を作用させる方法）によって調製されるグノレコシルミリセチンは、ミリセチンの 3'位の酸素原子にダルコシル基が 1、 2、 3、 4および 5個それぞれ結合した複数のダルコシルミリセチンの混合物である（実施例 3)。単一組成からなるミリセチン— 3'— O グルコシドは、上記混合物から、ゲルろ過または逆相クロマトグラフィーなどの各種方法により単離取得することができる。

[0052] ミリセチンをダルコシル化することによって得られるダルコシルミリセチンは、後記実験例 3および 6に示すように、ミリセチンそのものを経口投与した場合よりも体内吸収性が高ぐさらに加えて水溶性および水中での安定性が高いという特徴を備えている (実験例 4および 5)。中でも、上記式（1)で示されるミリセチンの 3位の酸素原子に 1、または 1〜5のダルコシル基を有するミリセチン—3— 0—ダルコシド、ならびに上記式（2)で示されるミリセチンの 3 '位に 1、または 1〜5のダルコシル基を有するミリセチン— 3，—0—ダルコシドは、力かる特徴を顕著に備えている。特に好ましくは、ミリセチンの 3 '位に 1、または 1〜5のダルコシル基を有するミリセチン 3 '—〇一ダルコシドである（実験例 6参照）。

[0053] (II)ミリセチンの体内杭酸化能の向上方法

本発明の方法は、ミリセチンの体内における抗酸化能を高める方法である。

[0054] 当該方法は、前述する体内吸収性の向上方法と同様に、ミリセチンをダルコシルイ匕することによって実施すること力 Sできる。

[0055] ここでダルコシノレ化するミリセチンの部位は、前述する体内吸収性の向上方法と同様に、ミリセチンの 3位または 3 '位の酸素原子いずれか少なくとも一方を挙げることができる。好ましくはミリセチンの 3位または 3'位の酸素原子いずれか一方であり、より好ましくはミリセチンの 3 '位の酸素原子である。結合させるダルコシル基の数は、 1またはそれ以上であれば特に制限されなレ、。好ましくは 1〜5、より好ましくは:!〜 3である。また、本発明が対象とするダルコシルミリセチンもまた、前述するように、単一組成力なるグノレコシルミリセチンであってもよいし、また異なる組成を有する 2種以上のグルコシルミリセチンの混合物であってもよい。具体的には、前述の（I)体内吸収性の向上方法に記載するグノレコシルミリセチンを同様に用いることができる。

[0056] ミリセチンをダルコシル化することによって得られるダルコシルミリセチンは、後記実験例に示すように、ミリセチンそのものよりも体内での抗酸化能が高く（実験例 2)、中でも、上記式（1)で示されるミリセチンの 3位の酸素原子に 1のグノレコシノレ基を有するミリセチンー3—〇一モノダルコシド、ならびに上記式（2)で示されるミリセチンの 3'位に:!〜 5のダルコシル基を有するミリセチン—3 ' _〇—ポリダルコシドは、かかる特徴を有意に備えている。さらに前述するように、ミリセチンをダルコシルイ匕することによつて、ミリセチンそのものを経口投与する場合よりも、ミリセチンの体内吸収性が顕著に増加する（実験例 3および 6)。このこと力、ら、ダルコシルミリセチンを経口的に用いることによって、体内でのミリセチンの抗酸化作用をより有効に発揮させることが可能になること力 Sわ力る。

[0057] (III) {本 ^^ィ吝 II

本発明が提供する体内抗酸化剤は、上記方法によってミリセチンの体内吸収性が高められ、その結果、体内において有効に抗酸化能を発揮するグノレコシルミリセチンを有効成分とするものである。

[0058] ここでダルコシルミリセチンは、前述する（1)体内吸収性の向上方法、および（2)体内抗酸化能の向上方法に記載するダルコシノレミリセチンを同様に用いることができる

[0059] 力かるダルコシルミリセチンは、ミリセチンそのものを経口投与する場合に比べて体内吸収性に優れ、またミリセチンに比して体内における抗酸化能、特に体内における脂質の酸化を抑制する効果に優れている。このため、グノレコシルミリセチンは、体内抗酸化剤、特に体内における脂質の酸化を予防する抗酸化剤として有効に用いることができる。

[0060] この目的のため、ダルコシルミリセチンは、水、アルコール（例えば、エタノール）、その他の溶媒に溶解または分散した液体状態（乳液、溶液、懸濁液、シロップ）、または公知の方法により調製、成形した固体状態 (散剤状、粉末状、顆粒状、錠剤状、丸剤状、カプセル剤状)を有する経口的に服用または摂取される各種の製剤形態とすることができる。

[0061] これらの製剤は、前述するグノレコシルミリセチンにカ卩えて、その製剤形態に応じて、薬学的または食品として許容される担体や添加剤が配合されていてもよい。例えば、固体状態の製剤を調製する場合の賦形剤としては、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ゼラチン、澱粉、デキストリン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、合成ならびに天然のケィ酸アルミニウム、酸化マグネシウム、乾燥水酸化アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、重炭酸ナトリウム、乾燥酵母が例示される。また、液体状態の製剤を調製する場合の賦形剤としては、水、グリセリン、プロピレングリコール、単シロップ、エタノール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール等が例示される。また、これらの製剤は、所望によりクェン酸、リン酸、リンゴ酸又はその塩類などの安定化剤;スクラロース、アセスルファムカリウムなどの高甘味度甘味料やショ糖、果糖などの甘味剤;アルコール類、グリセリンなどの防腐剤;粘滑剤、希釈剤、緩衝剤、着香剤及び着色剤のような通常の添加剤と混合されていてもよぐ常法又はその他の適切な方法で、散剤、粉剤、錠剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、チユアブル、液剤、シロップ剤等の経口投与用形態に製造することができる。

[0062] 本発明の体内抗酸化剤中に含まれるグノレコシルミリセチンの量は、当該抗酸化剤を摂取した場合に、生体内において抗酸化作用を発揮する有効量であればよぐ特に制限されるものではない。具体的には、体内抗酸化剤の 1日投与用量中に含まれるダルコシルミリセチンの量として、ミリセチンの量に換算して lmg〜： 10g、好ましくは 10mg〜：! g、より好ましくは 100mg〜500mgの割合を挙げることができる。この範囲で使用されるものであれば、体内抗酸化剤 100重量％中に含まれるダルコシルミリセチンの割合は特に制限されず、 0. 05〜： 100重量％、好ましくは 0. 5〜80重量％の範囲から、適宜選択することができる。

[0063] 本発明の体内抗酸化剤は、有効成分とするグノレコシルミリセチンによって得られる、ミリセチンの高い体内吸収性に基づいて、生体内で抗酸化作用を有効に発揮することができる。このため本発明の体内抗酸化剤は、体内における酸化、特に脂質の酸化を防止し、酸化によって生じる種々の疾患や不都合な生理現象を予防または改善すること力 S可能となる。具体的には、本発明の体内抗酸化剤は、その経口摂取により生体内で有効に抗酸化作用を発揮するため、例えば細胞の老化、炎症および発癌等の原因となる過酸化物から生体を防御する効果を得ることができる。

[0064] (IV)経口組成物本発明が提供する経口組成物は、前述する体内抗酸化剤を有効成分として含有するものである。

[0065] 本発明の経口組成物は、前述する体内抗酸化剤に含まれるダルコシルミリセチンが備える、ミリセチンの高い体内吸収性に基づいて、生体内で抗酸化作用を有効に発揮すること力 Sできる。このため本発明の経口組成物は、生体の酸化、特に体内における脂質の酸化を防止し、酸化によって生じる種々の疾患や不都合な生体現象を予防または改善することが可能となる。具体的には、本発明の経口組成物は、その経口摂取により、生体内で有効に抗酸化作用を発揮するため、例えば細胞の老化、炎症および発癌等の原因となる過酸化物から生体を防御する効果を奏することができる。

[0066] かかる目的で使用される経口組成物としては、経口用の医薬品（錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤、液剤、エキス剤等）、飲食物、飼料、および餌料 (ドッグフードやキャットフード等の各種ペットフードを含む）を挙げることができる。

[0067] なお、本発明で対象とする飲食物には、体内における酸化を予防し、過酸化物によつて生じる不都合な状態、例えば細胞の老化、炎症または発癌等を予防または解消することを目的とした食品、特に健康食品が含まれる。

[0068] ここで健康食品とは、通常の食品より積極的な意味での保健、健康維持'増進等の目的をもった食品をいう。本発明の経口組成物は、食品として許容される担体や添加剤を用いて前述するような製剤形態〔散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、乳剤、カプセル剤、チユアブル剤、液剤、シロップ剤等の経口投与用形態〕に調製して、体内酸化の予防を目的とするサプリメントとして提供することができる。また、一般の食品に添加することにより（言い換えれば、食品の原材料の一つとして使用することにより）、体内酸化の予防を目的 ·機能とする食品、特に健康食品（例えば、機能性食品、特定保健用食品）の調製に用いることができる。なお、特定保健用食品（条件付き特定保健用食品を含む）は、その包装容器などに、例えば体内酸化を予防または解消することを意味する表示を付するなど、食品の機能 ·効果を示すことが可能な食品であり、他の食品との差別ィ匕を図ることができる点で好適な態様である。

[0069] 食品の種類としては、特に制限されないが、（1)乳飲料、乳酸菌飲料、果汁入り清涼飲料、清涼飲料、炭酸飲料、果汁飲料、野菜飲料、野菜 ·果実飲料、粉末飲料、コーヒー飲料、紅茶飲料、茶飲料、乳飲料、豆乳飲料、ココア、スポーツ飲料、サブリメント飲料、青汁などの飲料； (2)カスタードプリン、ミルクプリン、スフレプリン、果汁入りプリン等のプリン類、ゼリー、及びババロア等のデザート類； (3)アイスクリーム、アイスミノレク、ラクトアイス、ミルクアイスクリーム、果汁入りアイスクリーム及びソフトクリーム、アイスキャンディー、シャーベット、氷菓等の冷菓類; (4)チューインガムや風船ガム等のガム類（板ガム、糖衣状粒ガム）；(5)板チョコ、マーブルチョコレート等のコーティングチョコレートの他、イチゴチョコレート、ブノレーべリーチョコレート及びメロンチョコレート等の風味を付加したチョコレート等のチョコレート類；（6)ハードキャンディー（ボンボン、バターボール、マーブル等を含む）、ソフトキャンディー（キャラメル、ヌガー、グミキヤンディー、マシュマロ等を含む）、ドロップ、タフィ等の飴類； (7)ハードビスケット、クッキ一、おかき、煎餅等の焼き菓子類 (以上、（2)〜(7)を総合して菓子という）； (8)ケチヤップ、ソース、醤油、ドレッシング、みそ、砂糖、塩、マヨネーズ、酢、黒酢等の調味料； ( 9)ハム、ソーセージ、ベーコン、冷凍ハンバーグ等の畜肉製品類；（10)マウススプレ一等の口内薬剤、トローチ、嚥下補助食品、ドリンク剤、顆粒剤、散剤、錠剤等の医薬部外品、健康補助食品類；（11)マーマレード、ジャム、マーガリン、バター、フラヮ一ペースト、ピーナツペーストなどのペースト類；（12)魚肉ハム、魚肉ソーセージ、蒲鋅、ちくわ、はんぺん、てんぷら等の魚介類練り製品類；（13)レトルトカレー、レトルトスープ、レトルトシチュー等のレトルト製品類；（14)うどん、そば、中華そば、スパゲッティ、マカロニ、乾麵、そうめん、インスタントラーメン等の各種麵類；（15)赤ワイン等の果実酒、リキュール、チュウハイ、炭酸アルコール飲料等のアルコール類；（16)豆腐、油揚げ等の大豆加工食品；（17)漬物、チーズ、ヨーグルト、テンペ、納豆等の各種発酵食品；を挙げることができる。

[0070] 中でも、継続的に服用するという観点から、各種の製剤形態を有するサプリメント；清涼飲料や栄養飲料などの飲料を好適に例示することができる。

[0071] 本発明の経口組成物に含まれる体内抗酸化剤の配合量は、当該経口組成物を摂取した場合に生体内において抗酸化作用を発揮する有効量であればよぐ特に制限されるものではなレ、。具体的には、経口組成物の 1日投与用量中に、ミリセチンの量に換算して lmg〜： 10g、好ましくは 10mg〜： lg、より好ましくは 100mg〜500mgを挙げること力 Sできる。この範囲で使用されるものであれば、経口組成物中に含まれるグノレコシルミリセチンの割合は特に制限されず、 0. 05〜100重量⁰ /₀、好ましくは 0. 5 〜80重量％の範囲から、適宜選択することができる。

[0072] 本発明の経口組成物は、上記グノレコシルミリセチンに加えて、他の抗酸化剤、例えばトコフエロール、 L ァスコルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、 BHA、 BHTなどを含んでいてもよい。また、ミリセチンダルコシル化物に加えて、他の生体抗酸化剤、例えばルチン、ケルセチン、酵素処理イソクエルシトリン、モリン、ミリセチンなどのフラボノイド；ビタミン C (ァスコルビン酸）、ビタミン E (トコフエロール）などのビタミン類； j3 -力口テン、ァスタキサンチン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、リコピン、ノレティンなどのカロテノイド；セレンなどのミネラル；コェンザィム Q10、ひ-リポ酸などの補酵素；クノレクミン、クロロゲン酸、タンニンなどのポリフエノール類；ローズマリー抽出物、ラフマ抽出物などの天然抽出物などを含んでいてもよい。

実施例

[0073] 以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、特に記載のない限り「部」とは「重量部」を、「％」とは「重量％」を意味するものとする。

[0074] 実施例 1 ミリセチン一 3— 0 モノダルコシドの合成

図 1に示すスキームに従って、ミリセチンの 3位の酸素原子にダルコシル基が 1個結合したミリセチン一 3— 0 モノダルコシド（ィ匕合物 5)を合成した。

[0075] (1)ァセトブロモグルコースの合成

ピリジン 7mL中で、グルコース 1.5gと無水酢酸 5mLを反応させ、全ての水酸基をァセチル化した。次いで再結晶により精製した主生成物 3. lgのうち 400mgを、ジクロロメタン 4mL中で 30%臭化水素/酢酸 4mLと反応させ、グルコース 1位をブロム化し、ァセトブロモグルコース（2, 3，4，6 テトラー O ァセチルー a D ダルコピラノシノレブ口ミド）（ィ匕合物 1)を 443mg得た。なお、当該化合物 1は、例えばヮコーケミカル社から市販の試薬として購入も可能である。

[0076] (2)ミリセチン 3 モノダルコシド（ィ匕合物 5)の合成ピリジン 20mL中で、ミリセチン (ィ匕合物 2) 3. lgと無水酢酸 10mLを反応させ、全ての水酸基をァセチル化した。晶出した結晶（乾燥物として 4.2g)を濾取し、アセトン 10 OmL中にてべンジルクロライド 6.6mL、炭酸カリウム 16.5g、ヨウィ匕カリウム 680mgと還流し、 7位と 4'位にベンジノレ化した。シリカゲルカラムにて精製した主生成物 2.0g を、テトラヒドロフラン 25mL/メタノール 25mL中で、 10%苛性ソーダ水溶液 18.6m Lを加えて反応させ、脱ァセチルイ匕した (ィ匕合物 3)。

[0077] シリカゲルカラムにて精製した主生成物（ィ匕合物 3) 1.2gのうち 361.5mgを、 0.15 M炭酸カリウム 50mL/クロ口ホルム 50mL中にて TBAB (テトラブチルアンモニゥムブロマイド) 361.5mg存在下で、 443.0mgのィ匕合物 1と 50°Cにて反応させ、ダルコシル化した (化合物 4)。これをシリカゲルカラムにて精製し、主生成物（化合物 4) 181. 9mgを得た。

[0078] 得られた主生成物（ィ匕合物 4) 181.9mgを、メタノール 6. OmL中にて 0.5Mナトリウムメトキシドと反応させ、脱ァセチル化した。シリカゲルカラムにて精製した主生成物 1 81.8mgを、エタノール 18mL中にて 10%パラジウムカーボン（ミクロスパーテル 4杯分）を触媒として水素接触還元し、脱べンジル化した。ノジウムカーボンをろ過除去し、ろ液を減圧濃縮後、濃縮液をゲル濾過にて精製し、首題のミリセチン— 3— O— モノグノレコシド（化合物 5) 72. lmgを取得した。

[0079] (3)同定

化合物 4の二次元 NMRを測定したところ、 HMBCスペクトルにおレ、てグルコースのァノマープロトンよりァグリコン部の 3位炭素へ相関があることが確認された。また¹ H -NMRにおけるァノマープロトンのスピン結合定数が 7.6Hzであることから糖は β体であることがわかった。さらに脱保護を行なって得られた化合物 5は、 NMRにおいてァセチル基およびベンジル基由来のシグナルの消失が確認された。化合物 5について、さらに各種二次元 NMRスペクトルを測定して¹ Η, ¹³C_NMRの帰属を行なったところ (Methanol-d使用）、表 1に示す結果を得た。この結果は、ミリセチン _ 3 _〇—モノ

4

ダルコシド（myricetin 3_〇_monoglucoside)の文献値とほぼ一致していた。斯くして上記化合物 5がミリセチン一 3_0_モノダルコシドであることを確認した。

[0080] [表 1] NMR spectral data of myricetin

3-0-j3lucoside in Methanol - position ¹³C ( δ ) ^XH ((5)

2 158.9 -

3 135.8 -

4 179,4 -

4a 105.5 -

5 163,0 -

5 78.3

6 62.4 3.61, 3.72

[0081] 実施例 2 ミリセチン一 3—〇一ポリダルコシド（η=1 5の混合物）の製造

• 製造

実施例 1で調製したミリセチン一 3— Ο—モノダルコシドを原料として、ミリセチンの 3 位の酸素原子にダルコシル基が 1 5個結合してなる、下式のミリセチン一 3— Ο—ポリグルコシドを製造した。

[0082] [化 3]

[0083] 具体的には、まずデキストリン（DE6〜8) 20gを 55°Cの水 600mLに溶解後、ミリセチン一 3—〇一モノダルコシド lOOmgを添加した。 NaOHにて pH9とし、溶解後すぐに硫酸水溶液にて PH7とした。糖転移酵素であるシクロデキストリングノレカノトランスフェラーゼ（コンチザィム（天野ェンザィム株式会社製） ) 8000Unit相当を加え、 55 °Cにて 6時間攪拌反応した。反応液を加熱して酵素を失活させ、ろ過した。ろ液を、合成吸着樹脂 SP207 (三菱化学株式会社製)を充填したカラムに通液して溶液中のグノレコシルミリセチンを吸着させ、次いで水洗浄して糖類、酵素、塩類などを除去した。次いで、エタノール水溶液を通液し、ダルコシルミリセチン画分を採取し、減圧濃縮し、ミリセチン _ 3 _〇—ポリグノレコシドの乾燥物約 lgを得た。上記反応を何回か繰り返して得られた乾燥物約 1.5g (原料ミリセチン— 3 _モノダルコシド 150mg由来) を S印 hadex LH-20を充填したカラムによってゲルろ過することにより、除去しきれていなかった糖類などを除き、ミリセチン— 3— 0—ポリダルコシドの乾燥物 80.7mgを得

[0084] (2) LC/MS分析

上記で得られた乾燥物にっレ、て、下記 LC条件にて LC/MS分析を行なった。 < LC/MS分析時の LC条件 >

カラム：XBridge ShieldRP18 2.1 X 150mm

移動相： 1%ギ酸/ァセトニトリル/水（10/12/78)

UV測定波長：351nm

流速：0.2mL min。

[0085] その結果得られたピーク（低極性側から G2、 Gl、 G3〜5とした）について、 ESI— MS (イオン化モードはポジティブ）により検出された分子量関連イオンピークを以下に示す。

<分子量関連イオンピーク >

Gl m/z 481.4 [M+H]⁺

G2 m/z 643.5 [M+H]⁺

G3 m/z 805.6 [M+H]⁺

G4 m/z 967.9 [M+H]⁺ G5 m/z 1129.9 [M+H]+。

[0086] (3) HPLC分析

また得られたミリセチン— 3— O ポリグノレコシドの乾燥物を、下記条件の HPLCに供した。そのクロマトグラムを、図 2に示す。

ぐ HPLC条件 >

カラム： YMC-Pack ODS-AQ (4.6 X 250mm)

移動相：0.1%リン酸水溶液/ァセトニトリル (85Z15)

UV測定波長：351nm

流速： 1.0mL/min

カラムオーブン：30°C。

[0087] 得られた分子量関連イオンピーク及び HPLCの結果（図 2)から、上記で得られたミリセチン— 3_0_ポリダルコシドは、表 2に示すように、ミリセチンの 3位の酸素原子にダルコシル基が脱水縮合により:!〜 5分子付加した G1〜G5の混合物であることが確認された。表 2に、ミリセチン一 3 〇一ポリダルコシドに含まれる G1〜G5の組成比（重量％)を併せて示す。

[0088] [表 2]

[0089] なお、上記 G1〜G5として示される個々のミリセチン 3— 0 グノレコシドは、前記で得られたミリセチン— 3—〇—ポリダルコシド（Gl〜G5の混合物）を、例えば上記条件の HPLCに供し、該当するピーク画分を分取することによって、単離取得することができる。ただし、この方法に限らず、各ミリセチンー3 _〇一グノレコシドは、各種ク口マトグラフィ一により分取することが可能である。

[0090] 実施例 3 ミリセチン一 3，—0—ポリグノレコシド（n= l〜5の混合物）の製造

ミリセチンを原料として、ミリセチンの 3 '位の酸素原子にグノレコシル基が 1〜5個結合してなる、下式のミリセチン一 3'— O—ポリグノレコシド (n= l〜5)を製造した。

[0091] [化 4]

[0092] (1)ミリセチンとダルコシルミリセチン混合物の製造

まず、デキストリン（DE6〜8) 30gを 60。Cの水 900mLに溶解後、 1 %ミリセチン/メタノール溶液 lOOmLを滴下した。直ちに糖転移酵素であるひ—アミラーゼ製剤〔アミラーゼ AD「ァマノ」 1 (天野ェンザィム株式会社製）〕 5000Unitカ卩え、 60°Cを維持し攪拌しつつ嫌気下で 15時間反応させた。反応液を加熱して酵素を失活させ、ろ過した。ろ液を、合成吸着樹脂 SP207 (三菱化学株式会社製）を充填したカラムに通液して溶液中のダルコシルミリセチンと未反応ミリセチンとを吸着させ、次いで水洗浄して糖類、酵素、塩類などを除去した。次いで、エタノール水溶液を通液し、未反応ミリセチンとダルコシノレミリセチンの混合画分を採取し、減圧濃縮し、ミリセチンとグノレコシルミリセチンの混合物（乾燥物） 1.5gを得た（乾燥物 1とする）。

[0093] (2) LC/MS分析

この乾燥物 1について、下記 LC条件にて LC/MS分析を行なった。

[0094] < LC/MS分析時の LC条件 >

カラム： L— column ODS-L 2.1 X 150mm

移動相：0.05%TFA/ァセトニトリル（85/15)

UV測定波長：351nm

流速：0.15mL/ min。

[0095] その結果、ミリセチン以外のピーク（低極性側から Gl〜5とした）において、 ESI- MS (イオン化モードはポジティブ）により検出された分子量関連イオンピークは以下の通りであった。

[0096] <分子量関連イオンピーク > Gl m/ ,z 480.9 [M+H]⁺

G2 m/ ,z 642.9 [M+H]⁺

G3 m/ ,z 804.9 [M+H]⁺

G4 m/ ,z 967.2 [M+H]⁺

G5 m/ ,z 1128.8 [M+H]⁺

[0097] (3) HPLC分析

上記で得られたミリセチンとダルコシルミリセチンの混合物（乾燥物 1)を下記条件の HPLC分析に供した。そのクロマトグラムを、図 3に示す。

ぐ HPLC条件 >

カラム： YMC-Pack ODS-AQ (4.6 X 250mm)

移動相： 0.1%リン酸水溶液/ァセトニトリル (80/20)

UV測定波長：368nm

流速： l.OmL/min

カラムオーブン：30°C。

[0098] これらの結果から、（1)で得られた乾燥物 1は、ミリセチンとミリセチンの 3 '位の酸素原子にダルコシノレ基が脱水縮合により:!〜 5分子付加したミリセチン— 3'— O ポリグノレコシド（G1〜G5)の混合物であることが確認された。

[0099] (4)ミリセチン 3，—O ポリダルコシド（G1〜G5の混合物）の製造と同定

この乾燥物 1 (1.5g)を Sephadex LH20を充填したオープンカラムを用いてゲルろ過することによりミリセチンを除去し、ミリセチン一 3，一 O ポリダルコシド（G1〜G5の混合物）の画分を減圧濃縮し、ミリセチン 3'—O ポリグノレコシド (G1〜G5の混合物 )の乾燥物 0.5gを得た (これを「乾燥物 2」とする）。この乾燥物 2についてさらにゲルろ過を繰り返し、 5成分（G1〜G5)のミリセチン _ 3，—0—ダルコシドをおのおの単離した。

[0100] これらのうち、極性の低い順から 2成分（Gl， G2)についてプロトン核磁気共鳴スぺタトル ( - NMR)、カーボン核磁気共鳴スペクトル (¹³C- NMR)、 H-H COSY,インバース異種核相関（HMQC、 HMBC)を測定して、構造決定を行ったところ、 G1と G2の両成分ともに、 HMBCスペクトルにおいてグルコースのァノマープロトンよりァグリコン部の 3'位炭素へ相関があることが確認された。さらに G2においては、オリゴグノレコシド部の一方のダルコシル基のァノマープロトンより他方のダルコシル基 4位炭素へ相関があることが確認された。また¹ H-NMRにおけるァノマープロトンのスピン結合定数力 ¾ .4Hz (Gl )、 3.4Hz (G2、ァグリコン部結合ダルコシル基）、 4.1Hz (G2、末端ダルコシル基）であること力糖はひ体であった。 G1および G2の¹ H-NMRと¹³ C- NMRの同定データをそれぞれ表 3及び表 4に示す。

[0101] 以上のことから、 G1はミリセチン 3，一 O—モノダルコシド（myricetin- 3 ' - 0-ひ- mono glucoside)であり、 G2はミリセチン 3， _〇一ジダルコシド（myricetin- 3，- 0- a -glucos yl-(l→4)- a -glucoside)であることが判明した。

[0102] [表 3]

NMR spectral data of myricetin

'-O- lucoside in Methanol-^ _ position ¹³C (S) '議

2 147.5

3 137.4 -

4 177.2 -

4a 104.5 -

5 162.4 -

6 99.3 6.15

7 165.6 -

8 94.5 6.37

8a 158.1 -

1' 123.2 -

2' 111.8 7.49

3' 147.0 -

4' 139.2 -

5' 146.8 -

6' 110.9 7.72

glucose

1 101.8 5.39

2 73.5 3.63

3 74.9 3.91

4 71.1 3.51

5 74.5 3.81

6 62.2 3.79, 3.84

[0103] [表 4] NMR spectral data of m ricetin

'-Q-glucoside in Methanol-^ position ¹³C (δ)

2 147.4 -

3 137.5 -

4 177.2 -

4a 104.4 -

5 162.4 -

6 99.3 6.16

7 165.8 -

8 94.5 6.37

8a 158.2 -

1' 123.2 -

2' 111.7 7.50

3' 146.7 -

4' 139.1 -

5， 147.0 -

6' 110.6 7.72

glucose

1 101.4 5.40

2 73.1 3.68

3 74.7 4.16

4 80.8 3.74

5 74.8 3.72

6 61.6 3.85, 3.94

glucose

1 102.9 5.23

2 74.3 3.47

3 75.1 3.67

4 71.6 3.27

5 73.1 3.88

6 62.8 3.66, 3.84

[0104] ミリセチン _ 3，一 Ο—ポリグノレコシド（乾燥物 2)に含まれる G1〜G5の組成比（

%)を表 5に示す。

[0105] [表 5] ミリセチン— 3 ' - 0—ホ° !) ルコシド (G卜 G5) 結合グルコース数（_n ) 組成比（％)

G 1 ミリセチン- 3' -0-モノク"ルコシ 1 14. 9

G 2 ミリセチン- 3 ' - 0 -シ"ク"ルコシド' 2 33. 5

G 3 ミリセチン- 3' -0-トリク" ;レコシド 3 21. 1

G 4 ミリセチン- 3' -0 -テ卜ラク"ルコシド 4 8. 4

G 5 ミリセチン- 3' -0-ペンタク" ;レコシド' 5 3. 9

[0106] なお、上記 G1〜G5として示される個々のミリセチン一3'— 0—ダルコシドは、前記で得られたミリセチン—3 ' _〇—ポリダルコシド（G1〜G5の混合物）（乾燥物 2)を、例えば上記条件の HPLCに供し、該当するピーク画分を分取することによって、単離取得すること力 Sできる。ただし、この方法に限られず、各ミリセチン一3'—0—ダルコシドは、その他の各種クロマトグラフィーにより分取することが可能である。

[0107] 実施例 4 ミリセチン一3' _ 〇一モノダルコシドの製造

実施例 3と同様の方法で得たミリセチン _ 3， - O _ポリダルコシド (Gl〜G5の混合物）（乾燥物 2)を、 Sephadex LH-20を充填したカラムを用いてゲルろ過することにより、ミリセチン _ 3， - 0—モノダルコシドを単離した。

[0108] 比較例 1 ミリシトリンの製造

ャマモモ乾燥葉を原料としてミリシトリンを調製した。なお、ミリシトリンは、下式に示すように、ミリセチンの 3位の酸素原子にラムノシノレ基が結合してなる、ラムノシノレミリセチン（ミリセチン一 3—〇一ラムノシド）である。

[0109] [化 5]

Rha : ラムノシル基具体的には、ャマモモ乾燥葉（小枝を少し含む） 2000gを粉碎し、メタノール 10Lを加えて 60°Cに維持しながら 4時間攪拌して抽出した。この混合物を室温まで冷却後、吸引濾過した。残渣にメタノール 1500mLを加えて洗浄し、濾過液と洗浄液を合わせた。この溶液を、ロータリーエバポレーターを用いて lOOOmLまで減圧濃縮した。黒緑色を呈した濃縮液を分液ロートに移し、水 1500mLをカ卩えた後ェチルエーテルで 3回洗浄した。水層を減圧濃縮し、濃縮物にメタノールを加えて晶析し、黄褐色の析出物を得た。これをメタノールから再結晶を行うことにより、ミリシトリン 25gを得た。

[0111] 比較例 2 ミリシトリンガラクトシドの製造

比較例 1で調製したミリシトリンを原料として、ミリシトリンガラクトシドを調製した。なお、当該ミリシトリンガラクトシドは、下式に示すように、ミリシトリンとミリシトリンのラムノシル基にさらにガラクトシノレ基が 1〜3個結合してなるガラクトシルミリシトリン (n= l〜3) の混合物である。

[0112] [化 6]

Gal : ガラクトシル基

n = 0〜3 の混合物

[0113] 具体的には、 0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0) lOOmLに乳糖 250gを加えて 60°Cに加熱して溶解し、この溶液に、ミリシトリン 20gを含有するジメチルスルホキシド液 100m Lとバチルス 'サーキュランス由来のガラクトシダーゼ（大和化成株式会社製）（酵素力価 20, OOOUnit/g) lgを加えて 60°Cで 4時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、得られた反応液に水 1Lを添加して希釈し、これをスチレン—ジビニールべンゼン共重合体からなるポーラスポリマー 700mLを充填したカラムに 1時間かけて通液し、次いでイオン交換水 5Lを 1.5時間かけて通液した。次いで、 40容量％メタノール水溶液 2Lを 1時間かけて通液してカラム吸着物を溶出した。溶出したメタノール液を回収して濃縮し、黄色の固形物 25gを取得した。当該固形物はミリシトリンとガラタトシノレミリシトリン (n= 1〜3)を 50： 50 (モル比）の割合で含む混合物であることを、下記条件の HPLC分析により確認した。

[0114] < HPLC分析条件 >

カラム： YMC-Pack ODS-AQ 4.5 X 250mm

カラムオーブン温度：40。C

移動相： 0.1%リン酸水溶液/ァセトニトリノレ (85/15)

UV測定波長：351nm

流速：1.0mL min。

[0115] なお、各ガラクトシルミリシトリン (n= l〜3)の同定は、下記条件の LCZMS分析にて行った。

[0116] < LC/MS分析時の LC条件 >

カラム： L— column ODS-L 2.1 X 150mm

移動相：0.05%TFA/ァセトニトリル（85/15)

UV測定波長：351nm

流速：0.15mL/ min。

[0117] UV351nmにて検出されたピークの保持時間と、各ピークにおいて ESI-MSにより検出された分子量関連イオンピークを以下に示す (イオンィ匕モードはポジティブ）。

(a) G3 9.55min m/z 951.01 [M+H]⁺

(b) G2 10.87min m/z 788.95 [M+H]⁺

(c) Gl 11.68min m/z 626.94 [M+H]⁺ ₀

[0118] 比較例 3 ミリシトリングルコシドの製造

比較例 1で調製したミリシトリンを原料として、ミリシトリングルコシドを調製した。なお、ここでミリシトリングルコシドは、下式に示すように、ミリシトリンとミリシトリンのラムノシル基にさらにダルコシル基が 1〜5個結合してなるダルコシルミリシトリン（n= l〜3) の混合物である。

[0119] [化 7]

Glc : グルコシル基

n = 0~3の混合物

[0120] 具体的には、水 1L (温度 60°C)にミリシトリン 5gを分散し、苛性ソーダ水溶液を滴下することにより溶解した後、希硫酸にて pH7とした液に、デキストリン lOOgをカ卩えて溶解した。これに Bacillus属菌株（受託番号 FERM P-13199)由来のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（酵素力価 lOOOUnit相当量）を添カ卩し、 60°Cにて 24時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、得られた反応液をスチレン—ジビニールベンゼン共重合体からなるポーラスポリマー lOOmLを充填したカラムに 2時間かけて通液し、次いで当該カラムにイオン交換水 1Lを 2時間かけて通液した。さらに、このカラムに 60容量％メタノール水溶液 2Lを 1時間かけて通液して、カラム吸着物を溶出した。溶出したメタノール水溶液を回収して濃縮し、黄色の固形物 7gを得た。次いで、この固形物を少量の水に溶解し、 S印 hadex LH-20 (pharmacia社製） 200mLを充填したカラムに通液した。次いでこのカラムに 50容量％メタノール水溶液を溶出溶媒として用いて通液し、ミリシトリン画分とグノレコシルミリシトリン画分とに分画した。比較例 2で使用した同一条件の HPLC分析により、グノレコシルミリシトリン画分は、ミリシトリンとグノレコシノレミリシトリンを 12： 88 (モル比）の割合で含む混合物であることを確認した。得られたグノレコシルミリシトリン画分を減圧濃縮し、 2.4gを得た。

[0121] なお、各ダルコシルミリシトリンの同定は、比較例 2で使用した同一条件の LC/MS 分析にて行った。

[0122] UV351nmにて検出されたピークの保持時間と、各ピークにおいて ESI-MSにより検出された分子量関連イオンピークを以下に示す (イオンィ匕モードはポジティブ）。 (a) G3 9.38min m/z 950.99 [M+H]⁺

(b) G2 10.75min m/z 788.96 [M+H]⁺

(c) Gl 11.80min m/z 626.91 [M+H]+。

[0123] 実験例 1 抗酸化作用の評価

本発明のダルコシルミリセチンについて、下記の方法により DPPHラジカル捕捉活性を測定して抗酸化作用を評価した。

く DPPHラジカル捕捉活性の測定 >

DPPH (1 , l-diphenyl-2-picrylhydrazyl)は 517nmに極大吸収を持つ紫色の安定ラジカルであり、水素を得ることにより無色のヒドラジンになる。この呈色反応を利用して実施例 1で調製したミリセチン _ 3_0—モノダルコシドぉよび実施例 23で調製したミリセチン _ 3'—0—ポリグノレコシドの DPPHラジカル捕捉活性を測定した。

[0124] 具体的には、ミリセチン、ミリセチン _ 3 _〇—モノダルコシド（実施例 1)、およびミリセチン 3 ' 〇一ポリダルコシド（G1〜G5の混合物）（実施例 3)のそれぞれについて、各濃度（0 /i M、 0.6 μ M、 3 /i M、 6 /i M、 12 μ M)のメタノーノレ溶 ί夜を調製し、試料溶液とした。 300 μ Μの DPPH (l,l_dipheny卜 2-picrylhydrazyl)メタノール溶液 2mLに各試料溶液 2mLを加え、攪拌混合後、 30分間、 37°C、遮光下にて静置した。 DPPHラジカルの退色度をラジカル捕捉の指標とし、分光光度計にて波長 517nm における吸光度を測定し、次式により DPPHラジカル捕捉活性（％)を求めた。試料濃度 0 μ Μのメタノール溶液と DPPHメタノール溶液を混合したものをコントロールとした。

[0125] [数 1]

D P P Hラジカル捕捉活性 (%)

= (コントロールの吸光度一試料溶液の吸光度） Zコントロールの吸光度 X 1 0 0

[0126] 結果を図 4に示す。図 4に示すように、ミリセチン一 3 _〇一モノグノレコシドはミリセチンと同等の抗酸化作用を有していたが、ミリセチン一3 ' _〇一ポリダルコシド (n= l 〜5)はミリセチンよりも抗酸化作用が若干低下する傾向が見られた。しかし、 DPPH ラジカル捕捉活性は、被験試料の単なる抗酸化能を評価するものであり、生体における抗酸化作用を正当に評価するものではなレ、。そこでミリセチンのダルコシル化体の、生体における抗酸化作用を評価するために、実験例 2 (LDLの酸化抑制効果の評価）を行った。

[0127] 実験例 2 生体に対する抗酸化作用の評価

実施例 1および実施例 3でそれぞれ調製したミリセチン _ 3 - O _モノダルコシドぉよびミリセチン—3' _〇_ポリダルコシド（G1〜G5の混合物）について、チォバルビツール酸法 (TBA法）に従って LDL (低密度リポ蛋白）の酸化抑制効果を評価した。

[0128] なお、 TBA法は生体組織中の過酸化脂質を高感度に測定するのに適した方法であり、酸性条件下で試料をチォバルビツール酸 (TBA)と加熱することで、試料から遊離する TBA反応性物質 (TBARS)と TBAの反応で生じる赤色色素を定量することにより脂質過酸化度を測定するものである。すなわち、 TBARSの数値が高いほど過酸化脂質の生成が多ぐ逆に TBARSの数値が低いほど過酸化脂質の生成が少ないことを示す。 TBA法によって測定される TBARSは、脂質ヒドロペルォキシド、マロンジアルデヒド、アルデヒドとタンパク質などとの反応物であり、 TBA法はこれらを包括的に測定するものである。

[0129] < LDL酸化抑制効果の測定 >

ミリセチン、ミリセチン— 3—〇—モノダルコシド（実施例 1)、およびミリセチン— 3 ' - O—ポリグノレコシド（G1〜G5の混合物）（実施例 3)を、それぞれ試験管に ΙΟ μ Μとなるように調製し、ヒト由来 LDL (SIGMA社製、終濃度 100 μ g protein/mL)を添加してよく混合した。次いで、 CuSO (終濃度 12 μ Μ)を上記試料液に添カ卩して 3

4

7°Cで酸化を誘導し、 180分間インキュベート後の脂質過酸化度 (TBARS)を TBA 法により測定した。

[0130] 上記酸化誘導後の反応液を 0.5mL採取し、これに 35%TCA(trichloro aceticacid )溶液を 0.5mL、 0.5%TBA溶液を 1.0mL、 0.2%BHT (butylated hydroxytoluene) 溶液 0.05mL、 0.5%SDS (sodium dodecyl sulfate)溶液を 0.05mL加えた後、 100 °Cで 30分加熱した。冷却後、酢酸 0.5mL、クロ口ホルム l.OmLをカ卩えて攪拌後、遠心分離（3，000rpm X 10分）を行レ、、上層の吸光度を 532nmで測定して、過酸化脂質量を求めた。結果は試料無添加（リン酸緩衝液）のものを Blankと称し、過酸化度（ TBARS) 100%として表した。 [0131] 結果を図 5に示す。図 5に示すように、実施例 1で調製したミリセチン 3 〇一モノグノレコシド、および実施例 3で調製したミリセチン 3 '—〇一ポリダルコシド（G1〜G 5)はミリセチンよりも高レ、 LDL酸化抑制作用、すなわち生体抗酸化作用（生体内過酸化脂質に対する抗酸化作用）を有することが確認された。

[0132] 実験例 3 体内吸収性の評価

ミリセチン、並びにミリセチンの各種配糖体、具体的にはミリセチンの各種配糖体として、ミリセチン一 3— 0—モノダルコシド（実施例 1)、ミリセチン一3 ' _〇一ポリダルコシド (G1〜G5の混合物）（実施例 3)、ミリシトリン (ミリセチン _ 3 _〇—ラムノシド） ( 比較例 1)、ミリシトリンガラクトシド（比較例 2)、およびミリシトリングルコシド（比較例 3) について体内吸収性を対比評価した。なお、ミリセチン配糖体を摂取すると、血中への吸収前後でミリセチンに結合している糖がはずれてミリセチンになる。その後、あるいは同時にミリセチンは硫酸抱合ゃグルクロン酸抱合などを受けてミリセチン抱合体となる。そこで、ここで体内吸収性の評価は、上記の被験物質を、おのおの日を変えて、同一人に絶食時に経口投与し、一定時間経過後に血液中に存在する各種ミリセチン抱合体の総濃度を測定することにより行った。

[0133] <血漿中のミリセチン抱合体濃度の測定 >

前日の 21時以降絶食とし、翌日朝 9時に絶食条件にて上記被験物質をオブラートに包み、水と共に経口摂取した。なお、 1回あたり 1種類の被験物質を摂取した。摂取量はモル数をそろえ、 0.21mmolとした。ミリセチン 3 '—〇一ポリダルコシド（G1 〜G5の混合物）（実施例 3)、ミリシトリンガラクトシド（比較例 2)、およびミリシトリングルコシド（比較例 3)は、いずれも混合物である。このため、ミリシトリンガラクトシドおよびミリシトリングノレコシドは、純度既知のミリシトリンを標準物質とし、ミリシトリンと各ガラクトシドまたは各ガラクトシドの分子量と HPLCにおける各ピーク面積値と比率から平均分子量を設定した。またミリセチン— 3' _〇_ポリダルコシドについては、純度既知のミリセチン _ 3，-モノダルコシドを標準物質とし、各ダルコシドの分子量と HPLC における各ピーク面積値と比率から、平均分子量を設定した（モル数は、重量 Z分子量にて算出した)。

[0134] 各被験物質について、摂取直前、摂取後 1時間および 3時間後に、それぞれ血液を採取して、これを HPLC分析にかけて各種ミリセチン抱合体の総濃度を測定した。

[0135] <摂取被験物質とその摂取量 >

(1)ミリセチン 3— 0 モノダルコシド 100mg (0.21mmol)

(2)ミリセチン _ 3，_0_ポリダルコシド（G1〜G5) 135mg (0.21mmol)

(3)ミリセチン 67mg (0.21mmol)

(4)ミリシトリン 97mg (0.21mmol)

(5)ミリシトリンガラクトシド 120mg (0.21mmol)

(6)ミリシトリングルコシド 122mg (0.21mmol)。

[0136] <血液の前処理 >

採取した血液を 4°C、 1000 X gにて 10分間遠心分離後、上清を回収し、 2mMァスコルビン酸 /0.5Mリン酸溶液を血漿に対し等容量を添加、混合した（血漿希釈液)。

[0137] 固相 (Varian SPEC C8 30mg)をメタノール ImLで洗浄し、 0.1%リン酸水溶液 ImL を通液した後、上記で調製した血漿希釈液 2mLを通液した。次いで、 0.5Mリン酸水溶液 ImLにて共洗いし、イオン交換水 ImLにて洗浄後、 ImMァスコルビン酸/メタノール溶液 ImL X 3にて溶出した。溶出液をエバポレータにて濃縮乾固した後、 lm Mァスコルビン酸 /0.1 %リン酸水溶液 ImLにて希釈し、 HPLC用サンプルとした。

[0138] これを下記条件の HPLCにかけて、血液中のミリセチン抱合体を定量した。

[0139] < HPLC分析条件 >

カラム： Cadenza CD-18 (4.6 X 150mm)

カラム温度：40°C

流速： 1.2mL/min

検出： UV351nm

移動相： A液（0.1%リン酸水溶液）、 B液（ァセトニトリル）

グラジェント： B液 15%→20%(0- 10min)， B液 20%_50%(10- 25min)， B液 100%(25- 30min)， B液 15%(30-45min)

インジェクト量：50 z L。

[0140] 検出されたピークがミリセチン抱合体であることの判定は、 photodiode arrayによるスぺクトルがミリセチン一 3— 0 モノダルコシドのスペクトルと一致または相似することを確認することにより行なった。各ミリセチン抱合体の定量は、標準品の代用としてミリセチン一 3—〇一モノダルコシドにより検量線を作成し、絶対検量線法により概算値を求めることによって行った。なお、ここでは被験物質に由来する各種ミリセチン抱合体の混合物の総量を、ミリセチン抱合体の含量とした。

[0141] 結果を図 6に示す。図 6に示すように、ミリセチンをダルコシノレ化することによって、ミリセチン一 3— O—モノグノレコシド（一♦_)及びミリセチン一 3，一 O—ポリグノレコシド（ G1〜G5の混合物）（一謹一)の体内吸収性が顕著に向上することが確認された。

[0142] 実験例 4 水溶性の評価

ミリセチン、ミリシトリン (比較例 1)、ミリセチン _ 3— O—モノダルコシド（実施例 1)、およびミリセチン _ 3，_〇—ポリグノレコシド（G1〜G5の混合物）（実施例 3) (被験物質）について、下記の方法により、水溶性を評価した。

[0143] <水溶性の評価 >

イオン交換水に過剰量の各被験物質を懸濁し、遠心分離（12000rpm, 10分間）し、上清に溶解している被験物質の量を、 HPLCにより測定した。

[0144] 結果を表 6、ならびに図 7 (A)及び (B)に示す。

[0145] [表 6]

[0146] これらの結果からわかるように、ミリセチンをグノレコシルイ匕することによって水溶性が顕著に向上することが確認された（実施例 1と 3)。特にミリセチンの 3 '位の酸素原子をダルコシル化することによって水溶性が顕著に向上した（実施例 3)。

[0147] 実験例 5 水溶液中での安定性評価

ミリセチン、ミリセチン _ 3—〇一モノダルコシド（実施例 1 )、ミリセチン一 3， _〇一ポリグルコシド（G1〜G5の混合物）（実施例 3) (被験物質）について、下記の方法により、水溶液中での安定性を評価した。 [0148] <水溶液中での安定性評価 >

PH7.2のリン酸緩衝液に、 100 /i Mとなるように各被験物質 (ミリセチン、ミリセチン — 3— O モノダルコシド、またはミリセチン一 3 ' 〇一ポリダルコシド（G1〜G5の混合物））を配合し、 37°Cで 6時間放置した。経時的にリン酸緩衝液中のミリセチン、ミリセチン一 3 -〇_モノダルコシドまたはミリセチン _ 3， - O _ポリダルコシド（Gl〜G5 の混合物）の各濃度を、実施例 3に示す HPLC分析法で測定することによって、水中での残存率（％)を求め、その残存率から水溶液中の安定性を評価した。

[0149] 結果を図 8に示す。図 8に示すように、ミリセチンをダルコシル化することによって水中での残存率の低下が抑えられており、水中における安定性が顕著に向上することが確認された。

[0150] 実験例 6 ミリセチン配糖体のラットにおける体内動態試験

被験物質として、ミリセチン— 3— O ポリグリコシド（実施例 2)、ミリセチン— 3 '—〇ポリダルコシド（G1〜G5の混合物）（実施例 3)、ミリセチンー3，ー0 モノダルコシド（実施例 4)、ミリセチン、およびミリシトリン (ミリセチン— 3—〇—ラムノシド）（比較例 1)を用いて、ラットにおける体内吸収性を対比評価した。なお、前述するように、ミリセチン配糖体を摂取すると、血中でミリセチンに結合している糖が外れ、ミリセチンとなる。その後、ミリセチンは硫酸抱合ゃグルクロン酸抱合などを受けて、各種のミリセチン抱合体となる。ここでは、血液中に存在する各種ミリセチン抱合体に酵素を作用させてミリセチンとし、そのミリセチン量からミリセチンの体内吸収性を評価した。

[0151] くラットの体内吸収性試験 >

実験動物として、雄性ラット（系統： Crl： CD (SD)、体重 270〜360g、投与時齢： 9 週齢、各被験物質に対して 5匹ずつ使用）を用いた。各被験物質を 0.5%メチルセルロース水溶液に懸濁させて投与液を調製した。これをスターラーで充分に攪拌しながら適当な大きさのポリプロピレン製注射筒に吸引し、ラット用ゾンデを用いて速やかに且つ強制的に上記実験動物に経口投与した (投与回数： 1回)。

[0152] <投与被験物質及び投与量 >

(1)投与被験物質

(a)ミリセチン—3— 0—ポリグノレコシド（G1〜G5の混合物）（実施例 2)、 (b)ミリセチン 3'— O ポリダルコシド（G1〜G5の混合物）（実施例 3)、

(c)ミリセチン一 3 '—〇一モノダルコシド（実施例 4)、

(d)ミリセチン、

(e)ミリシトリン (比較例 1)。

[0153] (2)投与量

上記の投与被験物質はいずれも、投与液中の濃度を 25 z mol/kg (ミリセチン換算、ラット体重当たり）に調整して投与する。

[0154] 投与から 0.5、 1、 4、 8、 12、 16及び 24時間め（7ポイント）に、頸静脈から血液を採取した（採血量：約 0.5mL/ポイント、血漿として 0.2mL)。採血は、無麻酔下で、へパリンナトリウム（へパリン 1000単位 ZmL、血液 ImLに対して 10 μ L)を添加したポリプロピレン製注射筒及び 25ゲージの注射針を用いて行った。なお、コントローノレとして上記投与被験物質に代えて 0. 5%メチルセルロース水溶液を投与した対照群（ η= 5)を設定し、当該対照群は投与から 1時間後に同様の方法で採血を行った。

[0155] <血液の前処理及び血漿中ミリセチン濃度の測定 >

グノレクロン酸抱合化や硫酸抱合化を受けた血漿中のミリセチン代謝物（ミリセチン抱合体）を、酵素で加水分解してミリセチンとし、血漿中のミリセチン濃度を測定した。

[0156] 具体的には、まず上記で採取した血液を採血容器に入れ、直ちに氷冷下で保存し、採血後 30分以内に遠心分離 (約 1600 X g、 10分、 4°C)して血漿を得た。得られた血漿 90 μ L(l% L-AsA/0.01%メタリン酸ナトリウムを含む）に、 0.58M酢酸緩衝液 (p H 4.9) 10 /i Lと -Glucronidase (SIGMA G-0876) 5 μ Lを加え、 37°Cで 30分間反応させた。これに、 50 μ g/mLDiosmetin (内部標準) 10 μ Lと MeOH/200mM HC1 250 z Lをカロえ、よく撹拌し、室温で 30分間静置した。 15,000rpm、 4°Cにて 10分間遠心した。得られた上清 150 μ Lに 0.1%リン酸水溶液 150 μ Lを加えて、 HPLC用サンプノレとした。

[0157] これを下記条件の HPLCに供し、ミリセチン濃度を測定した。結果を表 7及び図 9に示す。

[0158] < HPLC分析条件 >

カラム： Cadenza CD— C18 ( φ 4.6 X 150mm) 移動相： 0.1%リン酸水溶液/ァセトニトリル

グラジェント：ァセトニトリル 20%→40%(0- 10min)、 40%(10_13min)、 100%(13- 18min)、 20%

(18- 25min)

流速： 1.0mL/min

温度： 30°C

検出： UV 371nm。

[表 7]

※N D：不検出（not detected)

[0160] また、表 7の結果力も AUC (血中濃度時間曲線下面積） ( g-hr/mL)を求めた。なお、表 7に示すように対照群の血漿中にミリセチンは検出されな力たことから、被験物質投与前の血漿中ミリセチン濃度はゼロ（0)であるとして、 AUCを算出した。結果を表 8に示す。

[0161] [表 8]

[0162] 表 7、表 8及び図 9に示すように、ミリセチンをグノレコシノレ化することによって、血漿中のミリセチン (正確にはミリセチン抱合体)含量が増加することが確認された。このことから、ミリセチンをグノレコシノレ化することによって、ミリセチンの体内吸収性が格段に向上することが確認された。特に表 8の結果から、ミリセチンの 3'位の酸素原子にグルコシル基を 1個以上結合させることによって、ミリセチンの 3位の酸素原子にダルコシル基を結合させる場合に増して、ミリセチンの体内吸収性が顕著に向上することが確認された。

[0163] なお、実験例 2でミリセチンをグノレコシルイ匕することによつても、ミリセチンが有する体内抗酸化作用自体に悪影響を及ぼさないことを示したが、さらに上記の結果から、ミリセチンをダルコシノレ化してミリセチンの体内吸収性を高めることによって、体内においてミリセチンの抗酸化作用をより有効に発揮させることが可能になることがわかる。一方、ミリセチンの配糖体であるミリシトリン (ラムノシルミリセチン）は、実験例 4に示すようにミリセチンよりも高い水溶性を示すにも関わらず、上記表 8および図 9で示すように、ほとんど体内で吸収されない。この結果から、ミリセチンの配糖化による水溶性向上と体内吸収性との間に相関関係はないこと、すなわちミリセチンの配糖化による水溶性向上がただちに体内吸収性の向上に結びつくわけではないことがわかる。図面の簡単な説明

[0164] [図 1]ミリセチン _ 3_0_モノダルコシドの合成スキームを示す（実施例 1)。

[図 2]実施例 2で調製したミリセチン—3— 0—ポリグノレコシド乾燥物（G1〜G5の混合物）の HPLCクロマトグラムを示す。図中、 G1はミリセチン _ 3 _〇一モノダルコシド、 G2はミリセチン—3— 0—ジダルコシド、 G3はミリセチン _ 3 _〇—トリダルコシド、 G 4はミリセチン一3— 0—テトラダルコシド、 G5はミリセチン一 3— 0—ペンタグルコシドを意味する。

[図 3]ミリセチン— 3，_0_ポリダルコシド乾燥物（G1〜G5の混合物）の HPLCクロマトグラムを示す。図中、 G1はミリセチン一3 ' _〇一モノダルコシド、 G2はミリセチン _ 3' _0—ジグノレコシド、 G3はミリセチン一 3' _0—トリグノレコシド、 G4はミリセチン一 3，一O テトラダルコシド、 G5はミリセチン一 3，一O ペンタグルコシドを意味する。

[図 4]ミリセチン、およびミリセチンのダルコシル化物（ミリセチン 3— 0 モノダルコシド、ミリセチン— 3 ' 〇—ポリダルコシド（G1〜G5の混合物））の DPPHラジカル捕捉活性を示す (実験例 1)。

[図 5]ミリセチン、およびダルコシルミリセチン（ミリセチンー3—〇一モノダルコシド、ミリセチン 3 ' 〇一ポリダルコシド（G1〜G5の混合物））の LDL酸化抑制能（％)を示す (実験例 2)。

[図 6]ミリセチン、およびダルコシドミリセチン（ミリセチン— 3— 0 モノダルコシド、ミリセチン— 3 ' _〇—ポリダルコシド（G1〜G5の混合物））、ミリシトリン、ミリシトリンガラクトシド、ミリシトリングノレコシドを投与した後の、血漿中のミリセチン抱合体の総濃度（μ Μ)を示す。

[図 7] (Α)ミリセチンとミリセチン— 3' _0_ポリダルコシド（G1〜G5の混合物）の水への溶解度（w/v%)、（B)ミリセチンとミリセチン— 3 _〇—モノダルコシドの水への溶解度 (w/v%)を示す (実験例 4)。

[図 8]ミリセチン、ダルコシルミリセチン（ミリセチン— 3— 0 モノダルコシド、ミリセチン — 3'— O ポリダルコシド（G1〜G5の混合物））の水中安定性（37°C、 pH7.2)を示す (実験例 5)。

[図 9]ミリセチン、ダルコシルミリセチン（ミリセチン 3，一O モノダルコシド、ミリセチン— 3，— O ポリダルコシド（G 1〜G5の混合物）、ミリセチン— 3— O ポリダルコシド（G1〜G5の混合物））、ミリシトリンを投与した後の、血漿中のミリセチン濃度を示す (平均値土 SEM) (実験例 6)。なお、ミリセチン濃度は、血漿中に存在するミリセチン抱合体を酵素処理してミリセチンとすることによって求めた。

Claims

請求の範囲

[I] ミリセチンをダルコシルイ匕することを特徴とする、ミリセチンの体内吸収性の向上方法。

[2] 上記ミリセチンのダルコシル化力ミリセチンの 3位または 3 '位の酸素原子にダルコシノレ基を 1またはそれ以上結合させるものである、請求項 1記載の方法。

[3] ミリセチンをダルコシル化して、ミリセチンの 3位または 3 '位の酸素原子にダルコシル基カ S1個以上結合してなる複数のダルコシノレミリセチンの混合物とする、請求項 1 に記載する方法。

[4] ミリセチンをダルコシル化して、ミリセチンの 3 '位の酸素原子にダルコシル基が 1個以上結合してなる複数のグノレコシノレミリセチンの混合物とする、請求項 1に記載する方法。

[5] ミリセチンをダルコシルイ匕することを特徴とする、ミリセチンの体内抗酸化能の向上方法。

[6] 上記ミリセチンのダルコシル化が、ミリセチンの 3位または 3，位の酸素原子にダルコシノレ基を 1またはそれ以上結合させるものである、請求項 5記載の方法。

[7] ミリセチンをダルコシル化して、ミリセチンの 3位または 3 '位の酸素原子にダルコシル基カ個以上結合してなる複数のダルコシノレミリセチンの混合物とする、請求項 5 に記載する方法。

[8] ミリセチンをダルコシル化して、ミリセチンの 3 '位の酸素原子にダルコシル基が 1個以上結合してなる複数のグノレコシノレミリセチンの混合物とする、請求項 5に記載する方法。

[9] ミリセチンの 3位または 3'位の酸素原子にグノレコシノレ基が 1またはそれ以上結合してなるダルコシルミリセチンを有効成分とする体内抗酸化剤。

[10] ダルコシルミリセチン力ミリセチンの 3 '位の酸素原子にダルコシル基が 1またはそれ以上に結合してなるものである、請求項 9に記載する体内抗酸化剤。

[II] ダルコシルミリセチン力ミリセチンの 3位または 3 '位の酸素原子にダルコシル基が 1個以上結合してなる複数のグノレコシノレミリセチンの混合物である、請求項 9に記載する体内抗酸化剤。

[12] グノレコシルミリセチン力ミリセチンの 3 '位の酸素原子にダルコシノレ基が 1個以上結合してなる複数のグノレコシノレミリセチンの混合物である、請求項 9に記載する体内抗酸化剤。

[13] ダルコシルミリセチンの混合物力ミリセチンの 3位または 3 '位の酸素原子にダルコシノレ基力 ^個以上結合してなる複数のダルコシルミリセチンの混合物であって、当該混合物に含まれるモノダルコシド体、ジダルコシド体及びトリダルコシド体の合計重量割合が 30重量％以上である、請求項 11に記載する体内抗酸化剤。

[14] 請求項 9乃至 13のいずれかに記載する体内抗酸化剤を、体内で抗酸化作用を発揮する有効量含有する経口組成物。

[15] 飲食物、経口医薬品、飼料または餌料である請求項 14に記載する経口組成物。

[16] ミリセチンの 3位または 3'位の酸素原子にグノレコシノレ基が 1またはそれ以上結合してなるダルコシルミリセチンの、体内抗酸化剤の製造のための使用。