WO2007104422A2 - Wirkstoffbeladene nanopartikel auf basis hydrophiler proteine - Google Patents

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Klaus Langer
Kerstin Michaelis
Telli Hekmatara
Sebastian Dreis
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    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the present invention relates to active ingredient-loaded nanoparticles based on a hydrophilic protein or a combination of hydrophilic proteins in which functional proteins or peptide fragments are bound to the nanoparticles via polyethylene glycol- ⁇ -maleimide-.omega.-NHS ester.
  • the invention relates to active ingredient-loaded nanoparticles based on at least one hydrophilic protein, in which functional proteins or peptide fragments, preferably an apolipoprotein, are bound to the nanoparticles via polyethylene glycol- ⁇ -maleimide-.omega.-NHS ester to form the pharmaceutically or biologically active substance to transport the blood-brain barrier.
  • nanoparticles particles having a size between 10 nm and 1000 nm of artificial or natural macromolecular substances to which drugs or other biologically active material may be covalently, ionically or adsorptively bound or in which these substances may be incorporated.
  • hydrophilic drugs which themselves can not cross the blood-brain barrier, across this barrier, so that these hydrophilic drugs can be therapeutically effective in the central nervous system (CNS).
  • CNS central nervous system
  • a number of drugs by means of polybutylcyanoacrylate nanoparticles 80 (Tween ® 80) were coated or other surfactants with polysorbate be transported across the blood-brain barrier and a significant pharmacological effect cause by their action in the central nervous system.
  • Dalargin, an endorphin hexapeptide, loperamide and tubocuarine, the two NMDA receptor antagonists MRZ 2/576 and MRZ 2/596 from Merz, Frankfurt, as well as the antineoplastic active substance can be examples of drugs administered with such polybutyl cyanoacrylate nanoparticles Called doxorubicin.
  • the mechanism of transport of these nanoparticles across the blood-brain barrier may be due to the fact that
  • Apolipoprotein E is adsorbed by the coating of polysorbate 80 from the nanoparticles. As a result, these particles are likely to fool lipoprotein particles, which are recognized and bound by receptors of the brain capillary endothelial cells, which provide the lipid supply to the brain.
  • Nanoparticles proposed to the biotinylated apolipoprotein E via an avidin-biotin system or a
  • HSA nanoparticles can transport adsorptively or covalently bound drugs incorporated into the albumin particle matrix after intravenous injection across the blood-brain barrier (BBB). In this way, drugs that otherwise do not overcome this barrier for biochemical, chemical or physicochemical reasons, a pharmacological and therapeutic use in the CNS are supplied.
  • BBB blood-brain barrier
  • particulate systems comprising an avidin-biotin system tend to agglomerate upon prolonged storage, thereby increasing the average particle size and adversely affecting the efficiency of the particles.
  • the present invention therefore an object of the invention to provide nanoparticles with which drugs that can not overcome the blood-brain barrier for biochemical, chemical or physicochemical reasons, the CNS can be supplied without these nanoparticles have the disadvantages of the polybutyl cyanoacrylate nanoparticles known from the prior art and of the HSA nanoparticles comprising an avidin-biotin system.
  • Nanopartik ⁇ l based on a hydrophilic protein or a combination of hydrophilic proteins having at least one pharmacologically acceptable and / or biologically active ingredient and to which an apolipoprotein as a functional protein on polyethylene glycol- ⁇ -maleimide- ⁇ -NHS ester is bound.
  • the hydrophilic protein or at least one of the hydrophilic proteins on which the nanoparticles of the invention are based preferably comes from the group of proteins comprising serum albumins, gelatin A, gelatin B and casein. Particularly preferred are hydrophilic proteins of human origin. Very particularly preferred nanoparticles are based on human serum albumin.
  • the bifunctional polyethylene glycol- ⁇ -maleimide- ⁇ -NHS esters have a maleimide group and an N-hydroxy-succinimide ester, between which there is a polyethylene glycol chain of defined length.
  • the functional protein or peptide fragment is coupled to the hydrophilic protein via polyethylene glycol- ⁇ -maleimide- ⁇ -NHS ester having a polyethylene glycol chain having an average molecular weight of 3400 Da or 5000 Da.
  • the apolipoprotein bound via the polyethylene glycol- ⁇ -maleimide- ⁇ -NHS ester to the hydrophilic protein is preferably selected from the group consisting of Apolipoprotein E, apolipoprotein B (ApoB) and apolipoprotein Al (ApoAl) exists.
  • the functional protein is not an apolipoprotein but is selected from the group of proteins consisting of antibodies, enzymes and peptide hormones.
  • the present invention therefore relates to active substance-loaded nanoparticles based on a hydrophilic protein or a combination of hydrophilic proteins, which are distinguished by the fact that the nanoparticles comprise at least one functional protein or peptide fragment which comprises polyethylene glycol- ⁇ -maleimide-.omega.-NHS ester is bound to the hydrophilic protein or hydrophilic proteins.
  • the loading of the nanoparticles with the substance to be transported can be achieved by adsorption of the active substance to the nanoparticles, incorporation of the active substance into the nanoparticles
  • Nanoparticles or by covalent or complexing bond via reactive groups.
  • the nanoparticles according to the invention can be loaded with virtually any desired active substance / pharmaceutical substance.
  • the nanoparticles are loaded with drugs that can not overcome the blood-brain barrier itself.
  • Particularly preferred active ingredients come from the groups of cytostatics, antibiotics, antiviral agents and drugs acting against neurological disorders, for example from the group comprising analgesics, nootropics, antiepileptics, sedatives, psychotropic drugs, pituitary hormones, hypothalamic hormones, other regulatory peptides and their inhibitors, this list being by no means exhaustive.
  • the active ingredient is selected from the group comprising dalargin, loperamide, tubocuarine and doxorubicin.
  • the nanoparticles according to the invention have the advantage that it is possible to dispense with the potentially side-effecting avidin-biotin system in order to couple the functional proteins or their peptide fragments to the hydrophilic protein of the particles.
  • the nanoparticles according to the invention are preferably prepared by first converting an aqueous solution of the hydrophilic protein or the hydrophilic proteins into nanoparticles by a desolvation process and subsequently stabilizing these by cross-linking.
  • the desolvation from the aqueous solvent is preferably carried out by the addition of ethanol.
  • desolvation is also possible by the addition of other water-miscible non-solvents for hydrophilic proteins such as acetone, isopropanol or methanol.
  • gelatin as starting protein was desolvated successfully by addition of acetone.
  • structure-forming salts such as magnesium sulfate or ammonium sulfate is possible.
  • Suitable crosslinkers for stabilizing the nanoparticles are bifunctional aldehydes, preferably glutaraldehyde, and also formaldehyde.
  • crosslinking of the nanoparticle matrix by thermal processes is possible. Stable nanoparticle systems were obtained at 60 0 C for periods of more than 25 hours or 7O 0 C for periods of more than 2 hours.
  • the functional groups (amino groups, carboxyl groups, hydroxyl groups) located on the surface of the stabilized nanoparticles can be used for the direct covalent conjugation of apolipoproteins. These functional groups can be compared via heterobifunctional "spacers" that have a reactivity towards both
  • Amino groups as well as free thiol groups have to be connected to an apolipoprotein in the previously free thiol groups have been introduced.
  • the amino groups of the particle surface are reacted with the heterobifunctional polyethylene glycol (PEG) -based crosslinker polyethylene glycol- ⁇ -maleimide-.omega.-NHS ester.
  • PEG polyethylene glycol
  • the succinimidyl groups of the polyethylene glycol- ⁇ -maleimide- ⁇ -NHS ester react with the
  • PEG groups can be introduced on the particle surface, which in turn have maleimide groups on the other chain end, which can react with a thiolated substance to form a thioether.
  • the polyethylene glycol chain of the polyethylene preferred for the preparation of the nanoparticles according to the invention Glycol- ⁇ -maleimide- ⁇ -NHS ester, the polyethylene glycol chain has an average molecular weight of 3400 Da (NHS PEG3400 times).
  • polyethylene glycol- ⁇ -maleimide- ⁇ -NHS ester with shorter or longer polyethylene glycol chains, for example with a polyethylene glycol chain having an average molecular weight of 5000 daltons.
  • the apolipoprotein, the functional protein or the peptide fragment to be coupled are thiolated by reaction with 2-iminothiolane.
  • the free amino groups of the proteins or peptide fragments are used.
  • the particle systems are cleaned after each reaction step by repeated centrifuging and redispersing in aqueous solution.
  • the protein dissolved in each case is separated after conversion in principle by size exclusion chromatography of low molecular weight reaction products.
  • the preferred method for preparing the drug-loaded, functional proteins or peptide fragments-modified nanoparticles based on a hydrophilic protein or a combination of hydrophilic proteins is characterized in that it comprises the following steps:
  • pharmaceutically or biologically active substances can be incorporated into the particles.
  • the binding of the active ingredient can be both covalent and complexing or adsorptive.
  • the PEG-modified nanoparticles are adsorbed with the drug.
  • the hydrophilic protein or at least one of the hydrophilic proteins is selected from the group of proteins, the serum albumins, gelatin A, gelatin B, casein and similar proteins, or a combination thereof
  • Proteins includes. Most preferably, hydrophilic proteins of human origin are used for the preparation.
  • nanoparticles of the invention of a hydrophilic protein or a combination of hydrophilic proteins that have bound apolipoprotein are pharmaceutically or biologically active agents that would otherwise not cross the blood-brain barrier, particularly hydrophilic drugs, across the blood-brain barrier to transport and to produce pharmacological effects.
  • Preferred active ingredients come from the groups of cytostatics, antibiotics and drugs acting against neurological disorders, for example from the group, the analgesics, nootropics, antiepileptics, sedatives,
  • Psychieuticals pituitary hormones, hypothalamic hormones, other regulatory peptides and their inhibitors.
  • examples of such agents are dalargin, loperamide, tubocuarine, doxorubicin or the like.
  • FIG. 1 Graphical representation of the analgesic effect
  • MPE maximum possible effect
  • the described, drug-loaded and apolipoprotein-modified nanoparticles are suitable for the treatment of a variety of cerebral diseases.
  • the active substances bound to the carrier system are selected according to the respective therapeutic target.
  • the carrier system is particularly suitable for the active ingredients, which have no or no sufficient transition across the blood-brain barrier.
  • active ingredients cytostatics for the treatment of cerebral tumors into consideration, drugs for the therapy of viral infections in the cerebral area, such as HIV infections, but also drugs for the treatment of dementia diseases, to enumerate only a few applications.
  • the invention therefore also relates to the use of the nanoparticles according to the invention for the production of medicaments, in particular the use of Nanoparticles according to the invention, in which the functional protein is an apolipoprotein, for the production of a medicament for the treatment of cerebral diseases or for the treatment of cerebral diseases, since these nanoparticles can be used for the transport of pharmaceutically or biologically active substances across the blood-brain barrier.
  • Desolvation was achieved by dissolving 200 mg of human serum albumin in 2.0 ml of a 10 mM NaCl solution and adjusting the pH of this solution to 8.0. While stirring, 8.0 ml of ethanol were added dropwise to this solution
  • the nanoparticles were stabilized by adding 235 ⁇ l of an 8% glutaraldehyde solution. After an incubation time of 12 h, the nanoparticles were purified by triple centrifugation and redispersion first in purified water and then in PBS buffer (pH 8.0).
  • apolipoprotein For covalent attachment of an apolipoprotein, free thiol groups were first introduced into its structure. For this, 500 ⁇ g of the apolipoprotein were dissolved in 1.0 ml of TEA buffer (pH 8.0), and 2-iminothiolane (Traut's reagent) was added in a 50-fold molar excess. After a reaction time of 12 h at room temperature, the thiolated apolipoprotein was purified by size exclusion chromatography on a dextran desalting column (D-Salt ® Column) and thereby separated low molecular weight reaction products.
  • D-Salt ® Column dextran desalting column
  • thiolated apolipoprotein For the covalent conjugation of the thiolated apolipoprotein to HSA nanoparticles, 25 mg of the PEG-modified HSA nanoparticles were mixed with 500 ⁇ g of the thiolated apolipoprotein and this mixture was incubated for 12 hours at room temperature. Unreacted apolipoprotein was removed after this reaction time by centrifuging and redispersing the nanoparticles. In the final purification step, the apolipoprotein-modified HSA nanoparticles were taken up in 2.6 vol% ethanol.
  • apolipoprotein E In separate reactions, apolipoprotein E, apolipoprotein B and apolipoprotein Al were thiolated and coupled to HSA nanoparticles.
  • Loperamide as an opioid which in dissolved form can not cross the blood-brain barrier (BBB), is a particularly suitable model drug for a corresponding carrier system for overcoming the BBB.
  • a 5 analgesic effect after application of a loperamide-containing preparation provides direct evidence of an accumulation of the substance in the central nervous system and thus for overcoming the BBB.
  • a typical nanoparticulate preparation used in animal studies contained 10.0 mg / ml nanoparticles, 0.7 mg / ml loperamide, and 190 ⁇ g / ml ApoE.
  • compositions of the ready-to-use 5 nanoparticulate preparations (total volume 2.0 ml) for the animal experiments were:
  • analgesic effects shown in FIG. 1 were achieved after intravenous injection using the abovementioned active ingredient loperamide.
  • a loperamide solution was used 0, 7 mg / ml in 2.6 vol .-% ethanol.
  • the free substance loperamide itself shows no analgesic effect due to lack of transport across the blood-brain barrier.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft wirkstof fbeladene Nanopartikel auf Basis eines hydrophilen Proteins oder einer Kombination hydrophiler Proteine, bei denen funktionelle Proteine oder Peptidfragmente über Polyethylenglykol-α-maleimid-ω-NHS-ester an die Nanopartikel gebunden sind, Verfahren zur ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

Description

Wirkstoffbeladene Nanopartikβl auf Basis hydrophiler Proteine
Die vorliegende Erfindung betrifft wirkstoffbeladene Nanopartikel auf Basis eines hydrophilen Proteins oder einer Kombination hydrophiler Proteine, bei denen funktionelle Proteine oder Peptidfragmente über Polyethylenglykol-α-maleimid-ω-NHS-ester an die Nanopartikel gebunden sind. Insbesondere betrifft die Erfindung wirkstoffbeladene Nanopartikel auf Basis mindestens eines hydrophilen Proteins, bei denen funktionelle Proteine oder Peptidfragmente, vorzugsweise ein Apolipoprotein, über Polyethylenglykol-α-maleimid-ω- NHS-ester an die Nanopartikel gebunden sind, um den pharmazeutisch oder biologisch aktiven Wirkstoff über die Blut-Hirn-Schranke zu transportieren.
Unter „Nanopartikel" werden Partikel mit einer Größe zwischen 10 nm und 1000 nm aus künstlichen oder natürlichen makromolekularen Substanzen verstanden, an die Arzneistoffe oder anderes biologisch aktives Material kovalent, ionisch oder adsorptiv gebunden oder in die diese Substanzen inkorporiert sein können.
Mit Hilfe von bestimmten Nanopartikeln ist es möglich, hydrophile Arzneistoffe, die selbst die Blut-Hirn-Schranke nicht überwinden können, über diese Schranke zu transportieren, so daß diese hydrophilen Arzneistoffe im Zentralen Nervensystem (ZNS) therapeutisch wirksam werden können. Beispielsweise konnten eine Reihe von Arzneistoffen mittels Polybutylcyanoacrylat-Nanopartikeln, die mit Polysorbat 80 (Tween® 80) oder anderen Tensiden überzogen waren, über die Blut-Hirn-Schranke transportiert werden und einen signifikanten pharmakologischen Effekt durch ihre Wirkung im zentralen Nervensystem hervorrufen. Als Beispiele für mit derartigen Polybutylcyanoacrylat-Nanopartikeln verabreichte Arzneimittel können Dalargin, ein Endorphin- Hexapeptid, Loperamid und Tubocuarin, die beiden NMDA- Rezeptor-Antagonisten MRZ 2/576 bzw. MRZ 2/596 der Fa. Merz, Frankfurt, sowie der antineoplastische Wirkstoff Doxorubicin genannt werden.
Der Mechanismus des Transports dieser Nanopartikel über die Blut-Hirn-Schranke beruht möglicherweise darauf, daß
Apolipoprotein E (ApoE) durch den Überzug aus Polysorbat 80 von den Nanopartikeln adsorbiert wird. Dadurch täuschen diese Partikel vermutlich Lipoprotein-Partikel vor, die von Rezeptoren der Gehirnkapillar-Endothelzellen, welche die Lipidversorgung des Gehirns gewährleisten, erkannt und gebunden werden.
Die bekannten Polybutylcyanoacrylat-Nanopartikel zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke weisen jedoch die Nachteile auf, daß Polysorbat 80 nicht physiologischen
Ursprungs ist und der Transport der Nanopartikel über die Blut-Hirn-Schranke möglicherweise auf einem toxischen Effekt des Polysorbat 80 beruhen könnte. Darüber hinaus haben die bekannten Polybutylcyanoacrylat-Nanopartikel auch den Nachteil, daß die Bindung des ApoE nur adsorptiv erfolgt. Dadurch liegt das an die Nanopartikel gebundene ApoE im Gleichgewicht mit freiem ApoE vor, und es kann nach Injektion in den Organismus eine schnelle Desorption des ApoE von den Partikeln erfolgen. Außerdem werden viele Arzneistoffe nicht in ausreichendem Maß an Polybutylcyano- acrylat-Nanopartikel gebunden, um mit Hilfe dieses Trägersystems über die Blut-Hirn-Schranke transportiert werden zu können.
Zur Überwindung dieser Nachteile werden mit der
WO 02/089776 Al Nanopartikel aus humanem Serumalbumin (HSA-
Nanopartikel) vorgeschlagen, an die biotinyliertes Apolipoprotein E über ein Avidin-Biotin-System oder ein
Avidin-Derivat gebunden ist. Diese HSA-Nanopartikel können adsorptiv oder kovalent gebundene sowie in die Albumin- Partikel-Matrix inkorporierte Arzneistoffe nach intravenöser Injektion über die Blut-Hirn-Schranke (BHS) transportieren. Auf diese Weise können Wirkstoffe, die sonst aus biochemischen, chemischen oder physikochemischen Gründen diese Schranke nicht überwinden, einer pharmakologischen und therapeutischen Anwendung im ZNS zugeführt werden.
Das Avidin-Biotin-System hat jedoch verschiedene Nachteile.
So ist sein Einsatz aufwendig in Bezug auf die Herstellung der Nanopartikel und kann außerdem zu immunologischen oder anderen Nebenwirkungen führen. Weiterhin neigen Partikel- Systeme, die ein Avidin-Biotin-System umfassen, bei längerfristiger Lagerung zur Agglomeration, wodurch die mittlere Partikelgröße zunimmt und die Effizienz der Partikel beeinträchtigt wird.
Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, Nanopartikel bereitzustellen, mit denen Arzneistoffe, die aus biochemischen, chemischen oder physikochemischen Gründen die Blut-Hirn-Schranke nicht überwinden können, dem ZNS zugeführt werden können, ohne daß diese Nanopartikel die Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Polybutylcyanoacrylat-Nanopartikel und der ein Avidin- Biotin-System umfassenden HSA-Nanopartikel aufweisen.
Die Aufgabe wird durch Nanopartikθl gelöst, die auf einem hydrophilen Protein oder einer Kombination hydrophiler Proteine basieren, mindestens einen pharmakologisch akzeptablen und/oder biologisch aktiven Wirkstoff aufweisen und an die ein Apolipoprotein als funktionelles Protein über Polyethylenglykol-α-maleimid-ω-NHS-ester gebunden ist.
Das hydrophile Protein oder mindestens eines der hydrophilen Proteine, auf dem die erfindungsgemäßen Nanopartikel basieren, stammt vorzugsweise aus der Gruppe von Proteinen, die Serumalbumine, Gelatine A, Gelatine B und Casein umfaßt. Besonders bevorzugt sind hydrophile Proteine humanen Ursprungs. Ganz besonders bevorzugte Nanopartikel basieren auf humanem Serumalbumin.
Die bifunktionalen Polyethylenglykol-α-maleimid-ω-NHS-ester weisen eine Maleimid-Gruppe und einen N-Hydroxy-succinimid- ester auf, zwischen denen sich eine Polyethylenglykol-Kette definierter Länge befindet. Vorzugsweise ist das funktionelle Protein oder Peptid-Fragment über Polyethylen- glykol-α-maleimid-ω-NHS-ester an das hydrophile Protein gekoppelt, die eine Polyethylenglykol-Kette mit einem mittleren Molekulargewicht von 3400 Da oder 5000 Da aufweisen .
Das über den Polyethylenglykol-α-maleimid-ω-NHS-ester an das hydrophile Protein gebundene Apolipoprotein ist vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Apolipoprotein E, Apolipoprotein B (ApoB) und Apolipoprotein Al (ApoAl) besteht.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen der erfindungs- gemäßen Nanopartikel ist das funktionelle Protein kein Apolipoprotein, sondern aus der Gruppe von Proteinen ausgewählt, die aus Antikörpern, Enzymen und Peptidhormonen besteht. Es ist aber auch möglich, nahezu jedes beliebige Peptidfragment, vorzugsweise aus der Gruppe der funktionell aktiven Fragmente der vorgenannten funktionellen Proteine, über Polyethylenglykol-α-maleimid-ω-NHS-ester an die Nanopartikel zu koppeln.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher wirkstoff- beladene Nanopartikel auf Basis eines hydrophilen Proteins oder einer Kombination hydrophiler Proteine, die sich dadurch auszeichnen, daß die Nanopartikel mindestens ein funktionelles Protein oder Peptidfragment umfassen, welches über Polyethylenglykol-α-maleimid-ω-NHS-ester an das hydrophile Protein oder die hydrophilen Proteine gebunden ist.
Die Beladung der Nanopartikel mit dem zu transportierenden Wirkstoff kann durch Adsorption des Wirkstoffs an die Nanopartikel, Inkorporation des Wirkstoffs in die
Nanopartikel, oder durch kovalente oder komplexierende Bindung über reaktive Gruppen erfolgen.
Prinzipiell können die erfindungsgemäßen Nanopartikel mit nahezu jedem beliebigen Wirkstoff/Arzneistoff beladen werden. Vorzugsweise werden die Nanopartikel jedoch mit Wirkstoffen beladen, welche die Blut-Hirn-Schranke selbst nicht überwinden können. Besonders bevorzugte Wirkstoffe stammen aus den Gruppen der Zytostatika, Antibiotika, antivirale Substanzen und gegen neurologische Erkrankungen wirkende Arzneistoffe, beispielsweise aus der Gruppe, die Analgetika, Nootropika, Antiepileptika, Sedativa, Psychopharmaka, Hypophysenhormone, Hypothalamushormone , andere regulatorische Peptide und deren Hemmstoffe umfaßt, wobei diese Aufzählung keinesfalls abschließend ist. Ganz besonders bevorzugt ist der Wirkstoff aus Gruppe ausgewählt, die Dalargin, Loperamid, Tubocuarin und Doxorubicin umfaßt.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel haben den Vorteil, daß auf das möglicherweise Nebenwirkungen hervorrufende Avidin- Biotin-System verzichtet werden kann, um die funktionellen Proteine bzw. deren Peptidfragmente an das hydrophile Protein der Partikel zu koppeln.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel werden vorzugsweise hergestellt, indem zunächst eine wäßrige Lösung des hydrophilen Proteins oder der hydrophilen Proteine durch einen Desolvatationsprozeß zu Nanopartikeln umgesetzt und diese anschließend durch Quervernetzung stabilisiert werden .
Die Desolvatation aus dem wäßrigen Lösungsmittel erfolgt vorzugsweise durch den Zusatz von Ethanol. Prinzipiell ist eine Desolvatation auch durch den Zusatz anderer wassermischbarer Nichtlösungsmittel für hydrophile Proteine wie Aceton, Isopropanol oder Methanol möglich. So wurde Gelatine als Ausgangsprotein erfolgreich durch Zugabe von Aceton desolvatisiert. Gleichfalls ist eine Desolvatation von in wäßriger Phase gelösten Proteinen durch Zugabe von strukturbildenden Salzen wie Magnesiumsulfat oder Ammoniumsulfat möglich. In diesem Fall spricht man von Aussalzen. Als Quervernetzer zur Stabilisierung der Nanopartikel kommen bifunktionale Aldehyde, vorzugsweise Glutaraldehyd, sowie Formaldehyd in Frage. Ferner ist eine QuerVernetzung der Nanopartikelmatrix durch thermische Prozesse möglich. Stabile Nanopartikelsysteme wurden bei 600C über Zeiträume von mehr als 25 Stunden oder 7O0C über Zeiträume von mehr als 2 Stunden erhalten.
Die auf der Oberfläche der stabilisierten Nanopartikel befindlichen funktionellen Gruppen (Aminogruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen) können zur direkten kovalenten Konjugation von Apolipoproteinen genutzt werden. Diese funktionellen Gruppen können über heterobifunktionale „Spacer", die eine Reaktivität sowohl gegenüber
Aminogruppen als auch freien Thiolgruppen aufweisen, mit einem Apolipoprotein verbunden werden, in das zuvor freie Thiolgruppen eingeführt wurden.
Für die erfindungsgemäßen Nanopartikel werden die Aminogruppen der Partikeloberfläche mit dem heterobifunktionalen Polyethylenglykol (PEG) -basierten Crosslinker Polyethylenglykol-α-maleimid-ω-NHS-ester umgesetzt. Hierbei reagieren die Succinimidyl-Gruppen des Polyethylenglykol-α-maleimid-ω-NHS-esters mit den
Aminogruppen der Partikeloberfläche unter Freisetzung von N-Hydroxysuccinimid. Durch diese Reaktion können auf der Partikeloberfläche PEG-Gruppen eingeführt werden, die am anderen Kettenende wiederum Maleinimid-Gruppen aufweisen, welche mit einer thiolierten Substanz unter Ausbildung eines Thioethers abreagieren können.
Die Polyethylenglykol-Kette des für die Herstellung der erfindungsgemäßen Nanopartikel bevorzugten Polyethylen- glykol-α-maleimid-ω-NHS-esters weist die Polyethylenglykol- Kette ein mittleres Molekulargewicht von 3400 Da auf (NHS- PEG3400-Mal) . Es ist aber prinzipiell auch möglich, Polyethylenglykol-α-maleimid-ω-NHS-ester mit kürzeren oder längeren Polyethylenglykol-Ketten zu verwenden, beispielsweise mit einer Polyethylenglykol-Kette, die ein mittleres Molekulargewicht von 5000 Dalton aufweist.
Für die erfindungsgemäßen Nanopartikel werden das Apolipoprotein, das funktionelle Protein oder das zu koppelnde Peptidfragment durch Umsetzung mit 2-Iminothiolan thioliert. Für diese Umsetzung werden die freien Aminogruppen der Proteine bzw. Peptidfragmente genutzt.
Die Partikelsysteme werden nach jedem Reaktionsschritt durch wiederholtes Abzentrifugieren und Redispergieren in wäßriger Lösung aufgereinigt. Das jeweils gelöste Protein wird nach Umsetzung prinzipiell über Größenausschluß- chromatographie von niedermolekularen Reaktionsprodukten abgetrennt.
Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der wirkstoffbeladenen, mit funktionellen Proteinen oder Peptidfragmenten modifizierten Nanopartikel auf Basis eines hydrophilen Proteins oder einer Kombination hydrophiler Proteine zeichnet sich dadurch aus, daß es die folgenden Schritte umfaßt:
- Desolvatieren einer wäßrigen Lösung eines hydrophilen Proteins oder einer Kombination hydrophiler Proteine, - Stabilisieren der durch Desolvatation entstandenen Nanopartikel durch Quervernetzung, - Umsetzen der Aminogruppen auf der Oberfläche der stabilisierten Nanopartikel mit Polyethylenglykol-α- maleimid-ω-NHS-ester ,
- Thiolierung des funktionellen Proteins oder Peptidfragments ; und
- kovalentes Binden der thiolierten Proteine oder
Peptidfragmente mit den mit Polyethylenglykol-α-maleimid- ω-NHS-ester umgesetzten Nanopartikeln.
Um pharmakologische Effekte zu vermitteln, können pharmazeutisch oder biologisch aktive Substanzen (Wirkstoffe) in die Partikel eingearbeitet werden. Dabei kann die Bindung des Wirkstoffes sowohl kovalent als auch komplexierend oder adsorptiv erfolgen.
Vorzugsweise werden die PEG-modifizierten Nanopartikel nach kovalenter Bindung des thiolierten Apolipoproteins oder eines anderen thiolierten funktionellen Proteins bzw. Peptidfragments mit dem Arzneistoff adsorptiv beladen.
Bei einem besonders bevorzugten Verfahren wird das hydrophile Protein oder mindestens eines der hydrophilen Proteine aus der Gruppe von Proteinen ausgewählt, die Serumalbumine, Gelatine A, Gelatine B, Casein und vergleichbare Proteine, oder eine Kombination dieser
Proteine umfaßt. Ganz besonders bevorzugt werden hydrophile Proteine humanen Ursprungs für die Herstellung verwendet.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel aus einem hydrophilen Protein oder einer Kombination hydrophiler Proteine, die Apolipoprotein gebunden haben, eignen sich, pharmazeutisch oder biologisch aktive Wirkstoffe, die sonst die Blut-Hirn- Schranke nicht passieren würden, insbesondere hydrophile Wirkstoffe, über die Blut-Hirn-Schranke zu transportieren und pharmakologische Effekte hervorzurufen. Bevorzugte Wirkstoffe stammen aus den Gruppen der Zytostatika, Antibiotika und gegen neurologische Erkrankungen wirkenden Arzneistoffe, beispielsweise aus der Gruppe, die Analgetika, Nootropika, Antiepileptika, Sedativa,
Psychopharmaka, Hypophysenhormone, Hypothalamushormone , andere regulatorische Peptide und deren Hemmstoffe umfaßt. Beispiele für derartige Wirkstoffe sind Dalargin, Loperamid, Tubocuarin, Doxorubicin oder dergleichen.
Figur 1: Graphische Darstellung des analgetischen Effekts
(maximal possible effect, MPE) nach intravenöser Applikation von Loperamid-beladenen , über Polyethylenglykol-α-maleimid-ω-NHS-ester mit Apolipoprotein modifizierten HSA-Nanopartikeln .
Somit sind die beschriebenen, wirkstoffbeladenen und mit Apolipoprotein modifizierten Nanopartikel zur Behandlung einer Vielzahl cerebraler Erkrankungen geeignet. Dabei werden die an das TrägerSystem gebundenen Wirkstoffe nach dem jeweiligen Therapieziel ausgewählt. Das Trägersystem bietet sich vor allem für die Wirkstoffe an, die keinen oder keinen ausreichendem Übergang über die Blut-Hirn- Schranke aufweisen. Als Wirkstoffe kommen Zytostatika zur Therapie von cerebralen Tumoren in Betracht, Wirkstoffe zur Therapie viraler Infektionen im Cerebralbereich, beispielsweise HIV-Infektionen, aber auch Wirkstoffe zur Therapie von Demenz-Erkrankungen, um nur einige Anwendungsgebiete aufzuzählen .
Gegenstand der Erfindung ist daher auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel zur Herstellung von Medikamenten, insbesondere die Verwendung von erfindungsgemäßen Nanopartikeln, bei denen das funktionelle Protein ein Apolipoprotein ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung cerebraler Erkrankungen bzw. zur Behandlung cerebraler Erkrankungen, da diese Nanopartikel zum Transport von pharmazeutisch oder biologisch aktiven Wirkstoffen über die Blut-Hirn-Schranke verwendet werden können .
Beispiel :
Für die Herstellung von HSA-Nanopartikeln durch
Desolvatation wurden 200 mg humanes Serumalbumin in 2,0 ml einer 10 mM NaCl-Lösung gelöst und der pH dieser Lösung auf einen Wert von 8,0 eingestellt. Unter Rühren wurden dieser Lösung 8 , 0 ml Ethanol tropfenweise mit einer
Geschwindigkeit von 1,0 ml/min zugesetzt. Dieser Desolvatationsschritt führte zur Ausbildung von HSA- Nanopartikeln mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 200 nm.
Die Nanopartikel wurden durch Zugabe von 235 μl einer 8%- igen Glutaraldehyd-Lösung stabilisiert. Nach einer Inkubationszeit von 12 h wurden die Nanopartikel durch dreifaches Abzentrifugieren und Redispergieren zunächst in gereinigtem Wasser und anschließend in PBS-Puffer (pH 8,0) aufgereinigt.
Zur Aktivierung der Nanopartikel wurden 2 , 0 ml der Nanopartikel-Suspension (20 mg/ml in PBS-Puffer) mit 500 μl einer Lösung des Crosslinkers NHS-PEG3400-Mal (60 mg/ml in PBS-Puffer 8,0) versetzt und unter Schütteln über 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die PEG-modifizierten Nanopartikel, wie bereits beschrieben, mit gereinigtem Wasser aufgereinigt . Durch diese Arbeitsschritte wurden PEGylierte HSA-Nanopartikel erhalten, die über Maleinimid-Gruppen des auf der Oberfläche aufgebrachten PEG-Derivats eine Reaktivität für freie Thiolgruppen aufweisen.
Zur kovalenten Bindung eines Apolipoproteins wurden zunächst freie Thiolgruppen in dessen Struktur eingeführt. Hierzu wurden 500 μg des Apolipoproteins in 1,0 ml TEA- Puffer (pH 8,0) gelöst, und 2-Iminothiolan (Traut's Reagenz) wurde in einem 50fachen molaren Überschuß zugesetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 h bei Raumtemperatur wurde das thiolierte Apolipoprotein mittels GrößenausSchlußchromatographie über eine Dextran-Desalting- Column (D-Salt® Column) aufgereinigt und dabei niedermolekulare Reaktionsprodukte abgetrennt.
Für die kovalente Konjugation des thiolierten Apolipoproteins an HSA-Nanopartikel wurden 25 mg der PEG- modifizierten HSA-Nanopartikel mit 500 μg des thiolierten Apolipoproteins versetzt und diese Mischung über 12 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nicht abreagiertes Apolipoprotein wurde nach dieser Reaktionszeit durch Zentrifugieren und Redispergieren der Nanopartikel entfernt. Im letzten Aufreinigungsschritt wurden die Apolipoprotein- modifizierten HSA-Nanopartikel in Ethanol 2,6 Vol.-% aufgenommen.
In separaten Ansätzen wurden Apolipoprotein E, Apolipoprotein B und Apolipoprotein Al thioliert und an HSA- Nanopartikel gekoppelt.
Für die Beladung der Nanopartikel mit dem Modellarzneistoff Loperamid wurden 20 mg der ApoE-modifizierten Nanopartikel mit 6,6 mg Loperamid in Ethanol 2,6 Vol.-% versetzt und über 2 h inkubiert. Nach dieser Zeit wurde nicht gebundener Arzneistoff mittels Zentrifugieren und Redispergieren abgetrennt, die resultierenden Loperaxnid-beladenen Apolipoprotein-modifizierten HSA-Nanopartikel in Wasser für S Injektionszwecke aufgenommen und der Partikelgehalt durch Verdünnen mit Wasser auf 10 mg/ml eingestellt. Die Nanopartikel wurden für Tierversuche verwendet, um deren Eignung für den Transport von Wirkstoffen über die Blut- Hirn-Schranke zu untersuchen. 0
Loperamid als Opioid, welches in gelöster Form die Blut- Hirn-Schranke (BHS) nicht überwinden kann, ist ein besonders geeigneter Modellarzneistoff für ein entsprechendes Trägersystem zur Überwindung der BHS . Ein 5 analgetischer Effekt nach Applikation einer Loperamid- haltigen Zubereitung liefert einen direkten Beleg für eine Anreicherung der Substanz im zentralen Nervensystem und damit für eine Überwindung der BHS.
0 Eine typische nanopartikuläre Zubereitung, die im Tierversuch eingesetzt wurde, enthielt 10,0 mg/ml Nanopartikel, 0,7 mg/ml Loperamid und 190 μg/ml ApoE.
Die Zusammensetzungen der applikationsfertigen 5 nanopartikulären Zubereitungen (Gesamtvolumen 2,0 ml) für die Tierversuche waren:
1. 10,0 mg/ml Apolipoprotein-modifizierte HSA-
Nanopartikel
2. 190,0 μg/ml Apolipoptotein, kovalent gebunden 0 3. 0,7 mg/ml Loperamid (adsorptiv an die Nanopartikel gebunden) 4. Wasser für Injektionszwecke. Die Zubereitungen wurden Mäusen intravenös in einer Dosierung von 7,0 mg/kg Loperamid appliziert. Ausgehend von einem durchschnittlichen Körpergewicht einer Maus von 20 g erhielten die Tiere eine Applikationsmenge von 200 μl der oben aufgeführten Zubereitung.
Mit Hilfe dieses Systems wurden nach intravenöser Injektion unter Verwendung des oben erwähnten Wirkstoffs Loperamid die in Figur 1 dargestellten analgetischen Effekte erzielt. Die Analgesie (Nociceptive Response) wurde mit Hilfe des Tail-Flick-Tests ermittelt, bei dem ein heißer Lichtstrahl auf den Schwanz der Maus projiziert und die Zeit gemessen wird, bis die Maus den Schwanz wegzieht. Nach zehn Sekunden (= 100% MPE) wird das Experiment abgebrochen, um der Maus keinen Schaden zuzufügen. Negative MPE-Werte treten dann auf, wenn die Maus den Schwanz nach Gabe der Präparation früher wegzieht als vor der Behandlung.
Als Vergleich wurde eine Loperamid-Lösung 0 , 7 mg/ml in 2,6 Vol.-% Ethanol eingesetzt. Die freie Substanz Loperamid selbst zeigt aufgrund mangelnden Transports über die Blut- Hirn-Schranke keinen analgetischen Effekt.

Claims

Ansprüche
1. Wirkstoffbeladene Nanopartikel auf Basis eines hydrophilen Proteins oder einer Kombination hydrophiler Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß die Nanopartikel mindestens ein funktionelles Protein oder Peptidfragment umfassen, welches über Polyethylenglykol-α-maleimid-ω-NHS- ester an das hydrophile Protein oder die hydrophilen Proteine gebunden ist.
2. Nanopartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile Protein oder mindestens eines der hydrophilen Proteine aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Serumalbuminen, Gelatine A, Gelatine B und Casein besteht.
3. Nanopartikel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile Protein oder mindestens eines der hydrophilen Proteine humanen Ursprungs ist.
4. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche , dadurch gekennzeichnet, daß das funktionelle Protein oder Peptidfragment aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Apolipoproteinen, Antikörpern, Enzymen, Hormonen, Zytostatika, Antibiotika, und deren Fragmenten besteht.
5. Nanopartikel nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das funktionelle Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Apolipoprotein Al, Apolipoprotein B und Apolipoprotein E besteht.
6. Nanopartikel nach einem der vorangehenden Ansprüche , dadurch gekennzeichnet, daß der Polyethylenglykol-α- maleimid-ω-NHS-ester aus der Gruppe der Polyethylenglykol- α-malθimid-ω-NHS-ester ausgewählt ist, die eine Polyethylenglykol-Kette mit einem mittleren Molekulargewicht von 3400 Da oder 5000 Da aufweisen.
7. Nanopartikel nach einem der vorangehenden Ansprüche , dadurch gekennzeichnet, daß die Nanopartikel durch Adsorption, Inkorporation, oder durch kovalente Bindung oder komplexierende Bindung über reaktive Gruppen mit Wirkstoff beladen sind.
8. Nanopartikel nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die Zytostatika, Antibiotika, antivirale Substanzen, Analgetika, Nootropika, Antiepileptika, Sedativa, Psychopharmaka, Hypophysenhormone, Hypothalamushormone, andere regulatorische Peptide und deren Hemmstoffe umfaßt.
9. Nanopartikel nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die Dalargin, Loperamid, Tubocuarin und Doxorubicin umfaßt.
10. Verfahren zur Herstellung von wirkstoffbeladenen, mit funktionellen Proteinen oder Peptidfragmenten modifizierten Nanopartikeln auf Basis eines hydrophilen Proteins oder einer Kombination hydrophiler Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt: - Desolvatieren einer wäßrigen Lösung eines hydrophilen Proteins oder einer Kombination hydrophiler Proteine, - Stabilisieren der durch Desolvatation entstandenen Nanopartikel durch Quervernetzung,
- Umsetzen der Aminogruppen auf der Oberfläche der stabilisierten Nanopartikel mit Polyethylenglykol-α- maleimid-ω-NHS-ester,
- Thiolierung des funktionellen Proteins oder Peptidfragments , und
- kovalentes Binden der thiolierten Proteine oder Peptidfragmente mit den mit Polyethylenglykol-α-maleimid- ω-NHS-ester umgesetzten Nanopartikeln .
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Nanopartikel nach Bindung des thiolierten Proteins oder Peptidfragments adsorptiv mit Wirkstoff beladen werden.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die Serumalbumine, Gelatine A, Gelatine B, Casein und vergleichbare Proteine, oder eine Kombination dieser Proteine umfaßt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile Protein humanen Ursprungs ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Desolvatieren durch Rühren und Zugabe eines wassermischbaren Nichtlösungsmittels für hydrophile Proteine oder durch Aussalzen erfolgt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das wassermischbare Nichtlösungmittel für hydrophile Proteine aus der Gruppe ausgewählt wird, die Ethanol, Methanol, Isopropanol, und Aceton umfaßt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß zum Stabilisieren der Nanopartikel thermische Prozesse, bifunktionale Aldehyde oder Formaldehyd verwendet werden.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß als bifunktionaler Aldehyd Glutaraldehyd verwendet wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Polyethylenglykol-α-maleimid-ω-NHS- ester aus der Gruppe der Polyethylenglykol-α-maleimid-ω- NHS-ester ausgewählt wird, die eine Polyethylenglykol-Kette mit einem mittleren Molekulargewicht von 3400 Da oder 5000 Da aufweisen.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß als Thiolgruppen modifizierendes Agens 2-Iminothiolan verwendet wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirkstoffe aus der Gruppe ausgewählt werden, die Zytostatika, Antibiotika, antivirale Substanzen, Analgetika, Nootropika, Antiepileptika, Sedativa, Psychopharmaka, Hypophysenhormone,
Hypothalamushormone , andere regulatorische Peptide und deren Hemmstoffe umfaßt.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirkstoffe aus der Gruppe ausgewählt werden, die Dalargin, Loperamid, Tubocuarin und Doxorubicin umfaßt.
22. Verwendung von wirkstoffbeladenen Nanopartikeln, welche über Polyethylenglykol-α-maleimid-ω-NHS-ester an hydrophile Proteine gebundenes Apolipoprotein umfassen, zum Transport pharmazeutisch oder biologisch aktiver Wirkstoffe über die Blut-Hirn-Schranke.
23. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die Serumalbumine, Gelatine A, Gelatine B, Casein und vergleichbare Proteine, oder eine Kombination dieser Proteine umfaßt.
24. Verwendung nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der hydrophilen Proteine humanen Ursprungs ist.
25. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 24 , dadurch gekennzeichnet, daß die Wirkstoffe aus der Gruppe ausgewählt sind, die Zytostatika, Antibiotika, antivirale Substanzen, Analgetika, Nootropika, Antiepileptika, Sedativa, Psychopharmaka, Hypophysenhormone, Hypothalamushormone , andere regulatorische Peptide und deren Hemmstoffe umfaßt.
26. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirkstoffe aus der Gruppe ausgewählt sind, die Dalargin, Loperamid, Tubocuarin und Doxorubicin umfaßt.
27. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß Nanopartikel zur Behandlung cerebraler
Erkrankungen eingesetzt werden.
28. Verwendung von Nanopartikeln nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Medikaments .
29. Verwendung von Nanopartikeln nach einem der Ansprüche 1 bis 9 , bei denen das funktionelle Protein ein Apolipoprotein ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung cerebraler Erkrankungen.
30. Verwendung von Nanopartikeln nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei denen das funktionelle Protein ein Apolipoprotein ist, zur Behandlung cerebraler Erkrankungen.
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