WO2007102467A1

WO2007102467A1 - コノフィリン及び／又はコノフィリジンの水溶液

Info

Publication number: WO2007102467A1
Application number: PCT/JP2007/054195
Authority: WO
Inventors: Kazuo Umezawa; Mikio Fujii
Original assignee: Keio University
Priority date: 2006-03-07
Filing date: 2007-03-05
Publication date: 2007-09-13
Also published as: JP4431713B2; JPWO2007102467A1; US20100286184A1; US8178135B2

Abstract

【課題】コノフィリン及び／又はコノフィリジンの水溶液、前記水溶液からコノフィリン及び／又はコノフィリジンを精製する方法、前記水溶液の製造方法、食品組成物又は医薬組成物に有用なコノフィリン及び／若しくはコノフィリジンを含有する水溶性組成物又はその製造方法、並びに、前記水溶性組成物を含有する食品組成物又は医薬組成物を提供すること。【解決手段】ｐＨ４以下の酸性水溶液でコノフィリン及び／又はコノフィリジンを生産する植物からコノフィリン及び／又はコノフィリジンを効率よく抽出することができることを見出した。このようにして得られた抽出物、すなわち、コノフィリン及び／又はコノフィリジンの水溶液は、例えば、食品組成物や医薬品組成物などの製造に有用である。

Description

明細書

コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶夜

技術分野

[oooi] 本発明は、コノフィリン及び Ζ若しくはコノフイリジンの水溶液又は精製方法、前記水溶液の製造方法、食品組成物又は医薬組成物に有用なコノフィリン及び Ζ若しくはコノフイリジンを含有する水溶性組成物又はその製造方法、前記水溶性組成物を含有する食品組成物又は医薬組成物に関する。

背景技術

[0002] 糖尿病には 1型と 2型があり、 1型は脾 j8細胞の破壊で若年力発病し、 2型は生活習慣病として高年齢層に多い。いずれの場合も糖尿病は一旦発症すると、食事療法、運動療法及び降血糖剤 (経口剤またはインスリン注射)投与等による対症療法を生涯にわたつて続けなければならず、抜本的な治療法が存在しない疾病であり、今後ますますターゲット人口が増加すると考えられて、る。

[0003] 糖尿病の発症前には、インスリンの分泌不全やインスリン作用の低下 (インスリン抵抗性)がしばしば見出され、発症前の段階力適切なインスリン産生能を維持することが疾病の発症抑制に特に重要である。しかしながら、医薬品においては、糖尿病の発症に伴う高血糖を抑制し、合併症の発症原因を除去することに主眼が置かれており、糖尿病の根本原因を取り除くような治療法は確立されていない。また、糖尿病予防やリスク低減を狙った健康食品も多数市場に存在して、るが、有して、る機能は食後の高血糖状態を抑制するものであることから、抜本的な発症原因の除去にはつな力 Sらないものである。

[0004] インスリン産生の β細胞を再生させることは、抜本的な糖尿病の治療及び予防作用となりうるが、 β細胞の再生手段として現在、研究成果が出ているものは、臓器又は細胞の移植、または遺伝子治療を手段として用いるものであり、これらは臓器移植手術や生体内高分子 (蛋白質)の注射等に頼らざるを得ず、患者に対して多大な負担を強いることになり、 QOL (quality of life)を著しく低下させるものであることから、経口投与により臓器、特に脾 )8細胞の再生を活性ィ匕することができる組成物が望まれていた。

[0005] 従来、コノフィリンやコノフイリジンなどの物質 (Anticancer Res. 14: 2413-2418, 199 4； J. Nat. Prod. 56: 1865-1871, 1993)力脾 j8細胞の再生を活性化することが知られている（Biomed. Pharmacol. 57, 341-350, 2003)。また、コノフィリンは新生児糖尿病モデル動物の腹腔内に投与することにより、血糖値の上昇を有意に抑制する作用を有することが知られている（Diabetes 53, 2596-2602, 2004)。

[0006] さらに、コノフィリンは、脾臓由来の非腫瘍細胞のインスリンの生成能や分泌能の増カロ、インスリンの欠乏が関与する疾患の予防 Z治療、血糖値の低下、脾臓由来の非腫瘍細胞からインスリン生成細胞への分ィ匕誘導などに有用であるとされている（国際公開第 04Z099215号パンフレット)。また、コノフィリンを生産する植物の葉やその葉の乾燥物、及び、それらの抽出物などは、 AR42J細胞をインスリン生成細胞へと分化誘導したり、血糖値を低下したりすることから、糖尿病の予防や改善、血糖値の低下などの健康食品として有用であるとされている（国際公開第 05Z099485号パンフレット）。

[0007] し力しながら、これらの物質は水に難溶性であるため有機溶媒で抽出されており、経口投与に適したコノフィリン及び/又はコノフイリジンの水溶液の製造が困難である発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] そこで、本発明は、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液、前記水溶液からコノフィリン及び Z又はコノフイリジンを精製する方法、前記水溶液の製造方法、食品組成物又は医薬組成物に有用なコノフィリン及び z若しくはコノフイリジンを含有する水溶性組成物又はその製造方法、並びに、前記水溶性組成物を含有する食品組成物又は医薬組成物を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者らは、使用形態を変更しやすい、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液を得るために鋭意努力した結果、タベルネモンタナ ·デイヴアリカタ (Tabernae montana divaricata)を酸性水溶液で抽出したり、その抽出物を中和したりすることにより、コノフィリンやコノフイリジンの水溶液を製造できることを見出した。特に、ー且 p H4以下の酸性水溶液で処理することにより、従来では製造できな力つた、 2 /z gZml 以上の濃度で溶解したコノフィリン又はコノフイリジンの水溶液を製造できることを明ら力にした。

[ooio] し力しながら、部分精製されたコノフィリン及び Z又はコノフイリジンは、酸性水溶液には溶解するが、中性に戻すとほとんどが沈殿した。本発明者らは、酸性水溶液で抽出された前記抽出物を中和する前に分子量 10000で分画し、低分子量画分を中和すると、ほとんどのコノフィリン及び Z又はコノフイリジンが沈殿する力上記粉砕物を酸性水溶液で抽出した抽出物を中和した後に分子量 50000以下で分画すると、高分子量画分にほとんどのコノフィリン及び Z又はコノフイリジンが残存することを見出した。このことは、コノフィリンやコノフイリジンの溶解には、タベルネモンタナ'デイヴアリカタの乾燥葉に含まれる高分子物質が関与していることを示唆し、本発明者らは鋭意努力の結果、カルボキシル基を有する陰イオン性水溶性高分子が、その高分子物質の一つであることを明らかにした。

[ooii] また、本発明者らは、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを生産する植物の乾燥葉のエタノール抽出物を乾燥することによって得られた粗抽出物を、親水性溶媒に懸濁して糖尿病モデルラットに経口投与したところ、コノフィリンやコノフイリジンが血中に吸収されること、一定期間血中に安定に保持されること、脾 )8細胞数や血中インスリン値が有意に上昇すること、糖尿病の発症により上昇した血糖値を有意に低下させることを見出した。このようにして、本発明者らは本発明を完成するに至った。

[0012] すなわち、本発明に係る水溶液は、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液である。前記水溶液は、コノフィリン又はコノフイリジンが 2 g/ml以上の濃度で溶解しているものが好ましい。

[0013] 本発明に係る、コノフィリン及び/又はコノフイリジンの水溶液の製造方法は、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを含有する PH4以下の酸性水溶液に、カルボキシル基を有する陰イオン性水溶性高分子を溶解させる工程を含む。

[0014] また、本発明に係る、コノフィリン及び/又はコノフイリジンの水溶液の製造方法は、界面活性剤を含有する親水性溶媒にコノフィリン及び Z又はコノフイリジンを溶解させる工程を含む。

[0015] さらに、本発明に係る、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液の製造方法は、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを生産する植物から PH4以下の酸性水溶液で抽出する工程を含む。

[0016] また、本発明に係る、コノフィリン及び/又はコノフイリジンの水溶液の製造方法は、 pH4以下の酸性水溶液で抽出した、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを生産する植物の抽出物を中和する工程を含む。

[0017] 本発明に係る水溶液は、上述のコノフィリン及び/又はコノフイリジンの水溶液の製造方法により得られたコノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液である。

[0018] 本発明に係る、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの精製方法は、 pH4以下の酸性水溶液で抽出された、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを生産する植物の抽出物を分子量 10000で分画する分画工程と、前記分画工程により得られる低分子量画分を回収する回収工程と、を含む。なお、本発明に係る、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの精製方法においては、前記低分子量画分を中和することによって沈殿した沈殿物を回収することとしてもょ、。

[0019] また、本発明に係る、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの精製方法は、 pH4以下の酸性水溶液で抽出された、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを生産する植物の抽出物を中和する中和工程と、前記中和工程により中和した前記抽出物を分子量 5 0000以下で分画する分画工程と、前記分画工程により得られる高分子量画分を回収する回収工程と、を含む。

[0020] 本発明に係る水溶性組成物は、コノフィリン及び/又はコノフイリジンを含有する水溶性組成物であって、水に混合させたときに 2 gZml以上の濃度のコノフィリン又はコノフイリジンの水溶液を作製し得るものである。また、本発明に係る水溶性組成物は、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンと、カルボキシル基を有する陰イオン性水溶性高分子とを含有する。さら〖こ、本発明に係る水溶性組成物は、コノフィリン及び Z 又はコノフイリジンと、界面活性剤とを含有する。

[0021] 本発明に係る水溶性組成物の製造方法は、例えば、 2 μ gZmUり濃度が高ヽコノフィリン及び Z又はコノフイリジンの酸性水溶液や中性水溶液を調製する工程、前記酸性水溶液や中性水溶液を乾燥させて粉末を得る工程などを含む。また、本発明に係る水溶性組成物の製造方法は、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを含有する P

H4以下の酸性水溶液に、カルボキシル基を有する陰イオン性水溶性高分子を溶解させる工程を含む。さらに、本発明に係る水溶性組成物の製造方法は、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを、界面活性剤を含有する親水性溶媒に混合する工程を含む。

[0022] 本発明に係る食品組成物及び医薬組成物は、上述の水溶性組成物を含有することを特徴とする。本発明に係る食品組成物は、健康食品、機能性食品、特定保健用食品などを構成する。また、本発明に係る医薬組成物は、経口投与用製剤を構成する。

[0023] なお、上述の水溶性組成物は、例えば、 j8細胞の増殖、血糖値の降下、インスリンの上昇、糖尿病の予防又は改善などに有用である。

[0024] また、上述の植物としては、例えば、タベルネモンタナ 'ディヴアリカタ（Tabernaemon tana divaricata)などを用いることができる。

[0025] = =関連文献とのクロスリファレンス = =

本願は、 2006年 3月 7日付けで出願した日本国特願 2006-60533号に基づく優先権を主張する。この文献を本明細書に援用する。

図面の簡単な説明

[0026] [図 1]本発明の一実施例において、粗抽出物 Iを STZラットに継続投与した場合の血糖値の変化を示す図である。なお、図中の「拳」、「△」、及び「◊」は、それぞれ対照群、 50mgZkgZ日投与群、及び 200mgZkgZ日投与群の平均値を示し、縦線は標準誤差を示す。また、図中の「*」は対照群に対して 5%有意であることを示す。各群の動物数は 8匹である。

[図 2]本発明の一実施例において、粗抽出物 Iを STZラットに 15日間継続投与した後の血中インスリン値を示す図である。なお、縦線は標準誤差を示し、図中の「*」及び「 * *」は対照群に対してそれぞれ 5%及び 1%有意であることを示す。

[図 3]本発明の一実施例において、クェン酸により抽出した、コノフィリン及びコノフイリジンを含む水溶性組成物の保存安定性を示す図である。 [図 4]本発明の一実施例において、 GKラットのうち、随時血糖の上昇の変化が大きくない GKラットを用いて粗抽出物 IIの吸収試験を示す図である。

[図 5]本発明の一実施例において、用量を変化させて粗抽出物 IIを GKラットに継続投与した場合の随時血糖値の変化を示す図である。なお、縦線は標準誤差を示し、図中の「 *」はコントロール群に対して有意水準 5%で有意であることを示す。

[図 6]本発明の一実施例において、用量を変化させて粗抽出物 IIを GKラットに継続投与した場合の空腹時血糖値の変化を示す図である。なお、図中の各データは、コントロール群の空腹時血糖値を 100 (%)とした場合の相対値で示す。また、縦線は標準誤差を示し、図中の「 *」はコントロール群に対して有意水準 5%で有意であることを示す。

発明を実施するための最良の形態

[0027] 以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。なお、実施例において市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。

[0028] 本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ま、実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されて、るのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

[0029] = =コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液 = =

コノフィリンやコノフイリジンは、基本的に、中性の水溶液にはほとんど溶解しなかつた。し力ながら、

(1)コノフィリンやコノフイリジンを、ー且、酸性の水溶液に溶解させること、

(2)コノフィリンやコノフイリジンが溶解した酸性水溶液に、カルボキシル基を有する陰イオン性水溶性高分子を溶解させること、

の 2つの条件が満たされるとき、コノフィリンやコノフイリジンは、高濃度に、中性の水溶液に溶解するようになる。

[0030] 例えば、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを生産する植物の生葉又はその乾燥物（乾燥粉末を含む。以下同じ。）からコノフィリン及び Z又はコノフイリジンを主成分として含有する抽出物を得るために水で抽出することとしてもよいが、中性の水溶液ではコノフィリンやコノフイリジンが溶解しにくいため、抽出効率が低く実用的ではない

。し力しながら、上述のように、 pH4以下の酸性水溶液を用いることにより、コノフイリン及び Z又はコノフイリジンを生産する植物の生葉又はその乾燥物力コノフィリンやコノフイリジンを効率よく抽出でき、コノフィリン又はコノフイリジンが 2 gZml以上の濃度で溶解したコノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液を製造できる。例えば、pH4以下の酸性水溶液で抽出したコノフィリン及び Z又はコノフイリジンを生産する植物の抽出物を中和し、遠心分離することにより得られた上清には、ほとんどのコノフィリン及び/又はコノフイリジンが存在する。

[0031] また、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを生産する植物の生葉又はその乾燥物力エタノールで抽出を行い、その後、エタノールを除去した抽出物は、中性の水溶液では溶解できないが、 pH4以下の酸性水溶液には溶解することができ、こうして、コノフィリン及び/又はコノフイリジンの水溶液を製造できる。

[0032] さらに、上述のように製造した、コノフィリンやコノフイリジンを含有する pH4以下の酸性水溶液を中和することにより、中性付近の pHを有するコノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液を製造できる。この水溶液を分子量 50000以下で分画すると、高分子量画分にほとんどのコノフィリン及び Z又はコノフイリジンが存在し、この場合、植物の葉力カルボキシル基を有する陰イオン性水溶性高分子が供給されていると考えられる。

[0033] (部分)精製されたコノフィリンやコノフイリジンの場合、ー且酸性溶液に溶解させた後中和しても、ほとんど溶解しない。例えば、上述の pH4以下の酸性水溶液で抽出した抽出物を中和する前に分子量 10000で分画し、得られた低分子量画分を中和すると、ほとんどのコノフィリン及び Z又はコノフイリジンが沈殿する。従って、分子量 1 0000での分画により得られる低分子量画分のような、（部分)精製コノフィリン及び Z 又は (部分)精製コノフイリジンを含有する PH4以下の酸性水溶液に、カルボキシル基を有する陰イオン性水溶性高分子 (例えば、ぺクチン、ポリアクリル酸、アルギン酸等のポリウロン酸など）を溶解させることにより、中性付近で、高濃度のコノフィリン及び

Z又はコノフイリジンの水溶液を製造できるようになる。

[0034] さらに、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、（ポリ）グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等

)を含有する親水性溶媒にコノフィリン及び Z又はコノフイリジンを溶解することにより

、 pHにかかわらず、高濃度のコノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液を製造できる。

[0035] 上述のように製造されたコノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液は、有機溶媒を含んでヽな、ので安全性の面で優れており、食品用途及び医薬品用途としての利用に期待できる。

[0036] なお、前記親水性溶媒は、例えば、純水、酸性水溶液などである。前記酸性水溶液としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、リン酸、クェン酸などの公知の水溶液を挙げることができる力コノフィリンやコノフイリジンの抽出効率を高めるために pH4 以下の酸性水溶液を用いることが好ましぐ酸性水溶液を用いて抽出した抽出物の風味の点から、塩酸やクェン酸を用いることがより好ましい。なお、塩酸や他の強酸を用いる場合には、規定度として、 0. 01乃至 1規定、好ましくは 0. 02乃至 0. 2規定の酸を用いることが好ましい。また、有機酸 (弱酸)を用いる場合には、 0. 01モル Zリツトル以上のクェン酸溶液又は 0. 03モル Zリットル以上の酢酸等が利用できる。

[0037] また、前記コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを生産する植物としては、例えば、キヨゥチクトウ科の植物であるエルバタミア'ミクロフイラ（Ervatamia microphylla)、タべルネモンタナ ·デイヴアリカタ（Tabernaemontana divaricata)などを用いることができる。なお、エルバタミア'ミクロフイラ（Ervatamia microphylla)は、例えば、タイ国で採取することができ、タべノレネモンタナ 'ディヴアリカタ（Tabernaemontana divaricata)は、例えば、東南アジア諸国、日本等で採取することができる。

[0038] 前記植物の葉の乾燥物 (乾燥粉末を含む。 )は、上述の植物の葉又は粉砕した植物の葉を、自然乾燥、凍結乾燥、温風乾燥などの方法によって乾燥したり、上述の植物の葉を乾燥して粉砕したりすることにより得ることができる。なお、上記粉砕は、例えば、家庭用ミル、ミキサー等の公知の装置を用いて行うことができる。

[0039] なお、上述の pH4以下の酸性水溶液を用いたコノフィリンやコノフイリジンの抽出において、酸性水溶液に少量のエタノールを加えることとしてもよいし、酸性水溶液に熱 (好ましくは 30〜50°C)を加えることとしてもよい。これにより、抽出効率を高めることが可能となる。

[0040] = =コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの精製方法 = =

コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの、以上のような性質を利用して、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを効率よく精製できる。例えば、分画処理 (例えば、限外濾過法、ゲル濾過法などの公知の方法)を行わずに pH4以下の酸性水溶液で抽出した、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを生産する植物の抽出物を分子量 10000で分画した後、得られた低分子量画分を中和して沈殿物を公知の分離方法 (例えば、遠心分離法、濾紙や濾布を用いた濾過法など）により回収したり、上述の抽出物を中和した後、分子量 50000以下で分画して高分子量画分を回収したりすればょ、。

[0041] = =コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶性組成物 = =

上述のコノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液は、経口投与することによって、短時間で血中のコノフィリン及び Z又はコノフイリジンの濃度を上昇させること、 j8細胞の重量を増カロさせる、すなわち β細胞を増殖させること、血糖値を降下させること、及びインスリンを上昇させる。従って、上述のコノフィリン及び Ζ又はコノフイリジンの水溶性組成物は、 β細胞の増殖、血糖値の降下、インスリンの上昇、糖尿病の予防又は改善等に有用な食品組成物 (例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、補助食品など)や医薬組成物 (例えば、経口投与用製剤など)などに用いることができる。また、弱酸性から中性の水溶性組成物は、経口にて摂取することができることから、インスリン産生能が低下した糖尿病患者や、糖尿病リスク保持者のインスリン産生能を、臓器移植や注射等の苦痛を伴う処置を行うことなぐ正常なレベルへと改善'維持することが可能である。

[0042] ここで、コノフィリン及び Ζ又はコノフイリジンの水溶性組成物とは、コノフィリン及び /又はコノフイリジンを含有し、水に混合させたとき、コノフィリン及び/又はコノフイリジンの水溶液を作製できれば限定されない。例えば、この水溶性組成物には、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの酸性水溶液や中性水溶液、これらの水溶液をフリーズドドライさせた粉末などが含まれる。

[0043] なお、本発明に係る水溶性組成物は、溶液の安定性を高めるために、ビタミン A、 C、 Eやポリフエノール等の抗酸ィ匕物質をさらに含有してもよいし、味、風味を調整するために食品添加物や香料等を含有してもよヽ。

[0044] さらに、糖尿病が発症した場合には、生体は常に高血糖の状態にさらされており、高血糖による糖毒性が生体内の酸化ストレスを高める。脾 j8細胞は酸化ストレスに対する感受性が特に高い細胞であり、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの作用で脾 β細胞がー且再生しても、再生した細胞は引き続き酸化ストレスによる影響を受けると考えられることから、血糖値を極力正常な状態に維持しておくことがコノフィリン及び Ζ又はコノフイリジンの効果を高めるために特に重要である。そのために、コノフィリン及び Ζ又はコノフイリジンを単独で投与するよりも、他の血糖降下剤、例えば αダルコシダーゼ阻害剤、ビグアナイド系薬剤、チアゾリジン系薬剤、スルホニル尿素系薬剤や、生体内酸化ストレスを軽減させる薬剤、たとえばビタミン A、 C、又は Eやポリフエノール類などを同時に摂取することが望ましい。他の血糖降下剤ゃ抗酸化剤と併用することにより、さらに少ないコノフィリン及び Z又はコノフイリジンの投与で脾 j8細胞を再生させることが可能となる。

[0045] = =コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの保存 = =

ところで、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンは、保存温度に関係なぐ遮光して保存することにより、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの分解を防止することができる。従って、本発明に係るコノフィリン及び/又はコノフイリジンの水溶液、水溶性組成物、食品組成物、医薬品組成物等は遮光することにより室温で保存可能である。また、上述の水溶液、水溶性組成物、食品組成物、医薬品組成物等の製造は暗所で行うことにより、効率よく製造することが可能である。

実施例

[0046] 以下実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの精製及び分析方法は以下のように実施した。 [0047] 1.コノフィリン及び/又はコノフイリジンの精製

沖縛県宫古島で栽培したタベルネモンタナ ·デイヴアリカタ（Tabernaemontana divar icata)の葉を 60°Cの温風乾燥機により 16時間乾燥させ、得られた乾燥葉約 4kgからエタノール抽出、酸溶解、限外濾過（分画分子量 10000)、逆相オープンカラムによる精製、および逆相 HPLCによる精製プロセスを経て、コノフィリン（500mg)とコノフィリジン（lOOmg)を精製した。このようにして得られた各精製物の純度は LCZMSの分析により 99%以上であったことから、以下の実施例においてこれらの精製物を標準物質として利用した。なお、コノフィリンのエタノール中でのモル吸光計数は、分析の結果、 ε (335nm) = 32, 100であることが明らかになった。また、コノフイリジンのモル吸光計数は、文献（Kam et al.， J Nat Prod, 56, 1865-1871 , 1993)値 ε (335η m) = 12, 300を採用した。

[0048] 2.コノフィリン及びコノフイリジンの分析方法

コノフィリン及びコノフイリジンの分析は逆層 HPLCにより行った。カラムは YMC Pac k ProC18RS (4. 6mm X 250mm ; YMC社製）を用い、移動層として、 A液に 1容量 %酢酸を、 B液にァセトニトリルを用い、高圧グラディエントにより分析を行った。なお、グラディエントプログラムは、流速を lmlZ分とし、 25分間で B液の割合が 10%から 55%にリニアに上昇するように設定した。カラム温度は 40°Cとし、 335nmの UV吸収でモニタリングした。標準コノフィリン及びコノフイリジン溶液は測定の直前に調製し、調製した溶液の 335nmにおける吸光度より濃度を算出した。

[0049] [実施例 1]

糖尿病モデル動物の血糖値及びインスリン値に対する粗抽出物の経口投与による効果を調べるため、以下の実験を実施した。

[0050] (1)飼育条件

5週齢で購入したラット (Crj : CD (SD) IGS、 SPF、雄） 30匹を 1週間馴化した。詳しくは、温度 20乃至 26°C、相対湿度 40乃至 70%、喚起回数 10乃至 20回 Z時間、照明時間 12時間（7 : 00〜19 : 00)に設定した飼育室で飼育し、固形飼料 FR— 2 ( 船橋農場)及び上水道水を自由摂取させた。

[0051] (2)糖尿病の誘発及び群分け馴化が終了したラットを 24時間絶食させ、ストレブトゾトシン (以下「STZ」と略す。 ) 6 OmgZkgを腹腔内投与した。 STZ投与 24時間後の血糖値をフリースタイルキツセィメーター（C— D036— 01014、キツセィ薬品工業）を用いて測定し、血糖値が 250m gZdl以上の動物を糖尿病ラットと見なして実験に使用した。コンピューターを用いた完全無作為抽出方法により、 3群に群分けした（1群 8匹)。

[0052] (3)試験物質の調製と投与

沖縛県宫古島で栽培したタベルネモンタナ ·デイヴアリカタ（Tabernaemontana divar icata)の葉を 60°Cの温風乾燥機により 16時間乾燥させて乾燥葉を得た。乾燥葉 30 Ogを家庭用ミルで粉砕し、 3Lの 60容量％のエタノールをカ卩えてコノフィリン及びコノフィリジンを抽出した。遠心分離により上清を回収し、沈殿に再度 60容量％のェタノールを 3L加えて再度抽出操作を行い、上清を回収した。回収した上清を混合し、ェバポレーターでエタノールの除去と濃縮を行った後に凍結乾燥し、約 50gの乾燥物を得た (粗抽出物 1)。

[0053] 0. 4gの粗抽出物 Iに Tween80を 1滴加え、さらに注射用水 10mlを添カ卩して懸濁させた。この懸濁液を体重 kg当り 5mlとなるように毎日ゾンデを用いて強制経口投与した（200mgZkg投与群)。この場合のコノフィリン及びコノフイリジンの投与量はそれぞれ 0. 46mgZkgZ日及び 0. 32mgZkgZ日となる。また 0. lgの粗抽出物 Iに Tween80を 1滴と 10mlの注射用水をカ卩えた懸濁液も同様に毎日投与した（50mg /kg投与群)。この場合のコノフィリン及びコノフイリジンの投与量はそれぞれ 0. 11m gZkgZ日及び 0. 08mgZkgZ日となる。さらに注射用水 10mlに Tween80を 1滴添加したものをコントロール群に毎日投与した。試験物質は全て毎日投与直前に調製した。

[0054] (4)血糖値及びインスリンの測定

試験物質投与開始日より 5日間隔で血糖値を測定した。血糖値を測定する場合には、動物は前日より血糖値測定までの間 16時間絶食させた。血液は尾静脈より採血し、フリースタイルキツセィメーター（C— D036— 01014、キツセィ薬品工業）を用いて血糖値を測定した。 15日目の血糖値を測定後、腹部大動脈から全血を採血し、遠心分離により血清を分離した。これらにつきレビスインスリン一ラット T (シバヤギ）を用いてインスリンを分析した。

[0055] (5) β細胞重量の測定

投与最終日翌日に脾臓を摘出し、脾臓重量を測定した。重量測定後、脾臓を 10% ホルマリンに^固定し、情報に従って厚さ約 4 /z mのノラフィン切片を作製した。脾臓細胞の標識は、一次抗体として抗インスリン（anti-insulin H-86 Code No.sc9168 Sa nta Cruz Biotechnology Inc., X 100)を、二次抗体として抗ゥサギィムノグロブリン（C ode No.E0353 DakoCytomation X 400)を用いた Labelled Strepto- Avidin Biotin法 (DAKO LSAB+/HRP kit, Code No.K0690 DakoCytomation)による免疫組織化学染色により行った。画像解析は、全例の抗インスリン免疫組織ィ匕学染色標本を、フィルムスキャナー（PrimeFilm 18001 Pacific Image Electronics)を用いてデジタル化した画像について、 NIH Image PPC Ver.1.62 (Wayne Rusband NIH)を用いて脾臓断面積を計測した。さらに各切片上の全ての j8細胞領域を Eclipse E600及び COOLPI X Microsystem (Nikon)を用いて、対物 10倍の倍率でデジタル化した画像について、 NIH Image PPC Ver.1.62を用いて β細胞領域面積を計測した。得られた成績より、下式に従って β細胞重量 (mg)を算出した。 β細胞重量は解析時、ラ氏島内またはラ氏島外 (腺房内、導管上皮又は導管周囲等、ラ氏島構造を有さない領域に弧在性に認められる β細胞）に分類して計測し、両者の合計を総量として表示した (表 1)。

式： β細胞数 (mg) =脾臓重量 (mg) X β細胞領域面積 (mm²) Ζ脾臓断面積（ mm

[0056] (6)統計学的手法

対照群との有意差検定は Studentの t検定を行った。

粗抽出物 Iを 15日間継続して経口投与した場合の血糖値の変化を図 1に、 15日後のインスリン値を図 2に示す。

[0057] (7)結果

[表 1] β細胞重量 (mg)

グループ

ラ氏島外ラ氏島内音

0.0196 ±0.0046 0.2008 ±0.0285 0.2204 ±0.0293 0.0351 ±0.0074 0.2675 ±0.0636 0.3026 ±0.0702 0.0491 ±0.0125 0.2719 ±0.1238 0.3210 ±0.1356 [0058] 表 1に示すように、 13細胞重量は総量、ラ氏島内、ラ氏島外とも容量依存的に増加した。また、図 1及び図 2に示すように、試験物質の投与により、血糖値は容量依存的に低下し、インスリンは容量依存的に増加した。なお、体重はコントロール群との間で差はなかった。

[0059] [実施例 2]

実施例 1で得られた乾燥葉の一部をミルで粉砕した後、粉砕物 10gを 100mlの 60 容量％エタノール水溶液で抽出した。その後、遠心分離を行い、コノフィリン濃度が約 33 μ g/mUコノフイリジン濃度が 27 gZmlの上清を回収した。これを 3mlずつ 5本の遠心チューブに分注後、遠心濃縮により乾固させた。これに、 0. 1Mクェン酸溶液と 0. 1Mクェン酸ナトリウム溶液を適宜混合することにより調製した pH2. 6乃至 PH6. 0の緩衝液 (タエン酸水溶液又はクェン酸ナトリウム緩衝液）を 0. 1mlずつ添加し、 10分間激しく攪拌した後、再度遠心分離を行い、上清を 50%エタノール水溶液で 10倍に希釈した。希釈後、 0. 2 /z mのメンブランフィルターで濾過して不溶物を除去し、 HPLCによりコノフィリン及びコノフイリジンの含量を測定した (表 2)。

[表 2] コノフィリンコノフイリジン

溶液 pH

(mg/ml) (mg/ ml)

クェン酸 2.6 1.072 0.786

クェン酸緩衝液 3 0.886 0.612

クェン酸緩衝液 4 0.093 0.055

クェン酸緩衝液 5 0.0016 0.0017

クェン酸緩衝液 6 0.0009 0.0010

[0060] このように、コノフィリン及びコノフイリジンは pH3. 0以下の水溶液に溶解し、 pH4でも若干量のコノフィリン及びコノフイリジンが溶解した。

[0061] [実施例 3]

次に、各種溶媒を用いて抽出実験を行った。実施例 2と同様の操作で得られた乾燥葉粉砕物を 2mg乃至 lOOmg秤量し、表 3に示す各種溶媒を lml添加して室温又は 50°Cで 10分間攪拌して抽出を行い、抽出物の pHを測定した。溶媒は 0. 1N塩酸、 0. 1Mクェン酸、 0. 1Mクェン酸ナトリウム緩衝液（pH3. 0)、 0. 3M酢酸、 0. 1M クェン酸とエタノールの 90： 10混合液、同 80： 20混合液を用いた。 [0062] その後、抽出物を遠心分離により不要物を除去し、 HPLCを用いてコノフィリン及びコノフイリジンの含量を分析した (表 3)。

[表 3] 溶媒添加量抽出後コノフィリンコノフイリジン溶媒 (倍） pH (mg/g) (ms/g)

0. 1 Mクェン酸 10 0.09 0.05 0. 1 Mクェン酉 25 0.18 0.1 1 0. 1 Mクェン酉 25 0.32 0.1 7 0. 1 Mクェン酸緩衝

g §室室室室室室室室室室室室 10 3.0 0.02 0.01 液（pH3. 0)

0. 1 Mクェン酸緩衝温温温温温温温温温温温j p C。Cc

25 3.0 0.25 0.14 液（pH3. 0)

0. 1 N塩酸 500 1.0 0.18 0.50 0. 1 N塩酸 250 1.1 0.24 0.58 0. 1 N塩酸 100 1.2 0.22 0.54 0. 1 N塩酸 50 1.2 0.24 0.47 0. 1 N塩酸 25 1.4 0.23 0.42 0. 1 N塩酸 10 1.5 0.1 1 0.10 0. 3M酢酸 50 2.7 0.37 0.20 0. 1 Mクェン酸 +

25 2.7 0.34 0.23 1 0%エタノール

0. 1 Mクェン酸 +

25 2. 0.35 0.21 20%エタノール

[0063] 表 3に示すように、コノフィリン及びコノフイリジンは pH3. 0以下の溶液で効率良く抽出され、溶媒の添加倍率を高めること、抽出温度を高めること、少量のエタノールを添加することにより抽出効率が高まった。

[0064] [実施例 4]

実施例 2と同様の操作で得られた乾燥葉の粉砕物を lOmgずつエツペンドルフチューブに採取し、これに蒸留水、 0. 005規定乃至 1規定の塩酸を lmlずつ加えて 50 °Cで 15分間保温攪拌して抽出を行い、抽出物の pHを測定した。その後、遠心分離により残渣を除去し、上清に水酸ィ匕ナトリウム水溶液を加えて中和し、さらに等量のェタノールを加えた後、 HPLCでコノフィリン及びコノフイリジンの含量を測定した（表 4)

[表 4] 塩酸 Ϊ辰度抽出後コノフィリンコノフイリジン

(Ν) Η (mg/g) (mg/ g)

0 5.3 0.015 0.006

0.005 4.7 0.01 1 0.004

0.01 3.5 0.078 0.036

0.02 2.6 0.206 0.130

0.05 1.9 0.234 0.153

0.1 1.5 0.237 0.162

0.2 1.3 0.222 0.150

0.5 1.1 0.151 0.1 10

1 1.0 0.137 0.070

[0065] 表 4に示すように、コノフィリン及びコノフイリジンは塩酸濃度が 0. 01規定以上で効率よく抽出され、抽出効率は塩酸濃度が 0. 02乃至 0. 2規定で特に良好であった。

[0066] [実施例 5]

実施例 2と同様の操作により得られた乾燥葉の粉砕物 4gに 200mlの 0. 1規定塩酸を加えて 50°Cで 30分間抽出を行った。濾紙濾過により残渣を除去し、これを旭化成社製のペンシル型モジュール SLP— 0053 (分画分子量 10, 000)で限外濾過し、 1 65mlの濾液を回収した。濾液に炭酸ナトリウム水溶液を徐々に添カ卩して溶液の pH を 6. 0に調整し、生じた沈殿を遠心分離により回収し、これを真空乾燥することにより、 70mgの乾燥物を得た。この乾燥物 lmg中には 9. 8 gのコノフィリンと 13.

のコノフイリジンが含まれてヽた。

[0067] [実施例 6]

実施例 5と同様に抽出し、濾紙濾過を行って残渣を除去した抽出清澄液 (抽出液） 100mlに水酸化ナトリウム水溶液をカ卩えて pHを 6. 0に調整した。この液 50mlを遠心分離 (1, 500 X g、 5分間)し、上清 (遠心上清)と沈澱物 (遠心沈殿)に分離した。次に、沈殿物を等量の 50%エタノール水溶液で溶解し、抽出液、遠心上清、及び遠心沈殿における有効成分 (コノフィリン及びコノフイリジン)の含量を HPLCにより測定した。なお、タベルネモンタナ 'ディヴアリカタ（Tabernaemontana divaricata)の乾燥葉の粉砕物 4gに 200mlの蒸留水を加えて 50°Cで 30分加熱した後、 1, 500 X g、 5分間で遠心分離することによって得られた上清 (破砕液）についても、 HPLCにより有効成分の含量を測定した。これらの結果を表 5に示す。

[表 5] コノフィリンコノフイリジン

g/ml) ( u gXm\)

0.04 0.02

2.62 2.01

2.22 1.41

0.48 0.30

2.39 2.19

0.00 0.00 ■

[0068] このように、コノフィリン及びコノフイリジンの殆どは遠心上清に存在し、沈殿に含まれるコノフィリン及びコノフ遠遠 u Uィ _¾ί

0^ J F Fリンは僅かであった。

残濾

[0069] また、上述の抽出液 lmlに水 ¾液液」液酸ィ匕ナトリウム水溶液を加えて pHを 6. 0に調整し、ァドバンテック社製限外濾過膜 USY 5 (分画分子量 50, 000)で処理し、膜を通過した濾液 (UF濾液)を回収するとともに、膜上に残存した成分を 50%エタノール lmlを用いて溶解'回収し (UF残渣）、 UF濾液及び UF残渣における有効成分の含量を H PLCにより測定した (表 5)。コノフィリン及びコノフイリジンは濾液中からは全く検出されず、ほぼ全量が限外濾過膜非透過画分に存在していた。

[0070] [実施例 7]

本実施例では、コノフィリン及びコノフイリジンを含む水溶性組成物の安定性を調べた。

[0071] 実施例 2と同様の操作により得られた乾燥葉の粉砕物に 0. 1Mクェン酸を加え、 6 0°Cで 15分間攪拌した。不溶物を濾別した後に 0. 1N水酸ィ匕ナトリウムで pH6. 0に中和し、これを lmlずつ試験管に分注して遠心濃縮乾固させた。

[0072] 先ず、試験管の 1本に lmlの 50容量⁰ /₀エタノールをカ卩えて固形分を溶解し、 0. 2

/z mのメンブランフィルター濾過を行った後 HPLCでコノフィリンとコノフイリジンを分祈した。

[0073] 次に、残りの試験管を 5つのグループに分け、それぞれ 30°C (遮光）、 4°C (遮光 )、 4°C (遮光なし）、 30°C (遮光）、 50°C (遮光)で保存し、一定期間経過後に 50容量 o/oエタノールをカ卩えて溶解し、フィルター濾過後、 HPLC分析を行った。その結果を図 3に示す。図 3に示すように、コノフィリン及びコノフイリジンは遮光保存した場合には保存温度にかかわらず非常に安定であつたが、遮光しない場合には徐々に減少（分解)した。 [0074] [実施例 8]

本実施例においては、コノフィリン及びコノフイリジンを抽出した場合、乾燥'粉砕葉を投与した場合より、血中濃度増加のピークが早くなることを示す。

[0075] タベルネモンタナ ·デイヴアリカタ（Tabernaemontana divaricata)の乾燥葉を家庭用ミルで粉砕し、その lgに 20mlの 0. 3M酢酸溶液をカ卩えてホモゲナイザー処理し、 5 0°Cで 30分間攪拌して有効成分を抽出した。遠心分離により上清を回収し、これを濃縮乾固させて 0. 3gの粉末を回収した (酢酸抽出エキス)。なお、この粉末にはコノフィリン及びコノフイリジンがそれぞれ 1. Omg/g、 0. 8mg/g含有していた。

[0076] また、乾燥粉砕葉 lgに蒸留水を 20ml加えてホモゲナイザー処理後、濃縮乾固したもの lgを得た (乾燥'粉砕葉)。なお、有効成分量はそれぞれ 0. 40mgZg、 0. 35 mg, gで teつ 7こ。

[0077] 次に、酢酸抽出エキス 0. 2g、乾燥'粉砕葉 0. 5gをそれぞれ 5mlの注射用水に懸濁した。これらを、 5週齢の通常ラット（じじ0 0) 103、 SPF、雄）各 2匹に体重 k g当り 5mlとなるようにゾンデを用いて強制経口投与した。経口投与前、投与後 1. 5 時間、 3時間、 6時間、 12時間、 24時間後にそれぞれ眼窩静脈叢より採血し、遠心分離により血清を回収した。血清に 2倍量のァセトニトリルをカ卩えてタンパクを沈殿させ、上清を HPLC分析することにより血中のコノフィリン及びコノフイリジン濃度を測定した (表 6)。

[表 6]

表 6に示すように、酢酸抽出エキスを投与した場合には、投与後 1. 5時間で最大の血中濃度を示し、その後徐々にコノフィリン及びコノフイリジンの血中濃度が低下した。一方、乾燥'粉砕葉を投与した場合には、血中濃度のピークが数時間遅くなる傾向を示した。

[0079] [実施例 9]

本実施例では、コノフィリン及びコノフイリジンの抽出方法は、それらを経口投与したときの血中濃度の変化に影響を及ぼさないことを示す。

[0080] 実施例 1で得られた粗抽出物 I (0. 05g)に Tween80を 1滴加え、 5mlの注射用水に懸濁した。これを、 5週齢のラット（じかじ0 0) 103 SPF、雄）に体重 kg当り 5m 1となるようにゾンデを用いて強制経口投与した (n= 2)。投与後 0. 5時間、 1時間、 2 時間、 4時間、 8時間、 24時間後にそれぞれ眼窩静脈叢より採血し、遠心分離により血清を回収した。その後、実施例 8と同様の操作を行い、血中のコノフィリン及びコノフィリジン濃度を測定した (表 7)。なお、対照として、 T_Ween80を 1滴含む注射用水を体重 kg当り 5mlとなるように経口投与した場合につ!ヽても同様に血中濃度の測定を行った (n= 2)。

[表 7]

[0081] 表 7に示すように、含水アルコールを用いて抽出したコノフィリン及びコノフィリン (粗抽出物 I)を経口で投与した場合の血中濃度の推移は、酢酸抽出エキスを投与した場合と殆ど同じであった。以上のように、アルコールで抽出した抽出物や酸性溶液で抽出した抽出物を投与しても、コノフィリンやコノフイリジンが同程度に血中に移行するため、経口での作用には差がな!ヽと判断できる。

[0082] [実施例 10]

本実施例では、分画により部分精製したコノフィリンやコノフイリジンを含有する酸性水溶液に、陰イオン性水溶性高分子を添加することにより、中和後に水溶液に溶解するコノフィリンやコノフイリジンの量が増加することを示す。ここでは、酸性水溶液として塩酸を、陰イオン性水溶性高分子としてべクチンをそれぞれ用いて実験を行った。

[0083] 実施例 5で得られた乾燥物 lOmgを 0. 1Nの塩酸 5mlに溶解させた。これを 0. 5ml ずつ試験管に分注した。分注後、 0. 25%濃度のぺクチン (ゲニュー社製、 YM- 15 0—LJ)水溶液を 10 ほたは 100 1添カ卩し、さらに蒸留水をカ卩えて 2mlとした。また、分注した試験管に蒸留水のみをカ卩えて 2mlにしたものも準備した。

[0084] 続いて、炭酸ナトリウム水溶液で pH6. 0に調整した後、液量を 2. 5mlとなるようにメスアップし、これらを 5, 000 X gで 10分間遠心分離して上清を回収し、上清中のコノフィリンおよびコノフイリジンの濃度を測定した。尚、コントロールとして、分注した試験管に蒸留水のみをカ卩えて液量が 2. 5mlとなるようにメスアップした溶液におけるコノフィリンおよびコノフイリジンの濃度を測定した。その結果を表 8に示す。

[表 8]

[0085] このように、コノフィリンやコノフイリジンを含有する塩酸にぺクチンを添加することにより、中和後に溶解するコノフィリンやコノフイリジンの量がぺクチンの添カ卩量に応じて増加した。

[0086] [実施例 11]

本実施例では、エタノール抽出により部分精製したコノフィリンやコノフイリジンを用いて、実施例 10と同様の実験を行なった。

[0087] 実施例 1で得られた粗抽出物 I (250mg)を 0. 1N塩酸（5ml)に溶解した後、遠心分離（1, 500 X g, 5分間）により不溶物を除去し、 0. 5mlずつ試験管に分注した。分注後、 0. 2%濃度のぺクチン (ゲニュー社製、 YM— 150— LJ)の水溶液又は 0. 2 %濃度のポリアクリル酸ナトリウム（重合度 30, 000〜40, 000、和光純薬工業社製）の水溶液を 10 /z l、または 100 1添カロし、さらに蒸留水をカ卩えて 1. 9mlとした。また、分注した試験管に蒸留水のみを加えて 1. 9mlにしたものも準備した (添加剤なし)。

[0088] 続いて、炭酸ナトリウム水溶液で pH6. 0に調整した後、液量を 2mlとなるようにメスアップし、これを 5, 000 X gで 10分間遠心分離して上清を回収し、上清中のコノフィリンおよびコノフイリジンの濃度を測定した。尚、コントロールとして、分注した試験管に蒸留水のみをカ卩えて液量が 2mlとなるようにメスアップした溶液におけるコノフィリンおよびコノフイリジンの濃度を測定した。その結果を表 9に示す。

[表 9]

[0089] 実施例 10と同様に、ぺクチンまたはポリアクリル酸ナトリウムを添加することにより、中和後、上清中のコノフィリン及びコノフイリジン濃度が増加した。

[0090] [実施例 12]

本実施例では、逆相カラムにより部分精製したコノフィリンやコノフイリジンを用いて、実施例 10と同様の実験を行なった。

[0091] 実施例 1で得られた粗抽出物 I (250mg)を 5mlのエタノールに溶解し、水を加えて 50mlとした。これを、約 5mlの ODS榭脂（富士シリシァ社製 DM1020T)を充填したガラスカラムに通し、 10mlの蒸留水でカラムを洗浄して非吸着物質を除去した後、 1 Omlのエタノールで吸着成分を溶出した。その後、遠心濃縮により溶媒を除去し、 5 mlの 0. 1N塩酸に溶解して 0. 5mlずつ試験管に分注した。分注後、 0. 2%濃度のぺクチン水溶液又は 0. 2%濃度のポリアクリル酸ナトリウム水溶液を 10 1 100 1 あるいは、 1000 1添加し、実施例 11と同様の操作で処理し、上清中のコノフィリンおよびコノフイリジンの濃度を測定した。その結果を表 10に示す。 [表 10]

[0092] 逆相カラムを用いて部分精製したコノフィリンやコノフイリジンの中性での溶解度は大幅に低下したが、実施例 10や 11と同様に、ぺクチンまたはポリアクリル酸ナトリウムを添加することにより、コノフィリンやコノフイリジンの溶解度は増加した。

[0093] また、陰イオン性水溶性高分子は、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンと単に共存して!/、るのみではコノフィリンやコノフイリジンの溶解性に影響を及ぼさな、が、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを酸性水溶液に溶解した後、中和することにより、コノフィリンやコノフイリジンの溶解性を向上させることができることが確認された。このような作用を示す陰イオン性水溶性高分子の例としては、ぺクチンやポリアクリル酸のほかにアルギン酸等のポリゥロン酸などを挙げることができる力ポリリン酸ナトリウムのように、カルボキシル基を有さな、陰イオン性水溶性高分子には上述の作用はみられなかった。

[0094] [実施例 13]

本実施例では、界面活性剤を親水性溶媒に添加することにより、コノフィリンゃコノフィリジンの溶解度が増加することを示す。

[0095] 実施例 1で得られた粗抽出物 Iを lOmgずつ秤量し、 1mlの蒸留水または lmlの 1 %ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)水溶液を加えて激しく攪拌した。 5, 000 X gで 2分間遠心分離を行い、上清中のコノフィリン及びコノフイリジンの濃度を測定した。その結果を表 11に示す。

[表 11] コノフィリンコノフイリシ 'ン

( U g/ml) ( g/ml)

蒸留水 0.39 0.68

1 % SDS 2.61 2.97

[0096] このように、コノフィリンやコノフイリジンは蒸留水には殆ど溶解しないが、界面活性剤を添加することにより、これらの溶解度が上昇した。

[0097] [実施例 14]

本実施例では、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンが遺伝糖尿病モデルラットの空腹時血糖値に与える効果を調べた。

[0098] (1)動物の飼育条件

遺伝糖尿病モデルラットである GK (Goto- Kakizaki、雄)ラット 60匹（5週齢）を実施例 1と同様の条件で飼育した。実施例 1と同様の方法で随時血糖値をモニタリングしたところ、 11週齢で随時血糖値の上昇が認められたため、 11週齢における血糖値に基づき糖尿病ラットと見なして以下の実験に使用した。

[0099] (2)試験物質の調製

沖縛県宫古島で栽培したタベルネモンタナ ·デイヴアリカタ（Tabernaemontana divar icata)の葉を 60°Cの温風乾燥機により 16時間乾燥させて乾燥葉を得た。 0. 025N 塩酸（250L)を 50°Cに昇温した後、乾燥葉 5kgを加えて 30分間撹拌した。その後、金網を通過させることにより葉の残渣を除去し、さらにバスケット型セントルを用いて濾過し、濾液 (清澄な抽出液)を回収した。

[0100] 20L容のステンレスカラムに合成吸着榭脂アンバーライト XAD16— HP (オルガノ社製)を充填し、充分に水洗した後、上記抽出液全量をカラムに 100LZ時で通液した。その後カラムを 100Lの水、および 100Lの 30%エタノール水溶液で順次洗浄し、さらに純エタノール 100Lを流して榭脂に吸着した成分を溶出させた。得られた溶出液を濃縮、乾燥させることにより、コノフィリン及びコノフイリジンを含む粉末状の組成物を得た。

[0101] 上記ペースト状組成物を 0. 1Mのクェン酸水溶液に溶解した後、 pH6. 0に調整した。生じた沈殿物を遠心分離により回収し、さらに真空乾燥を行うことにより、コノフィリン及びコノフイリジンをそれぞれ 14mgZg及び 15mgZg含む粉末を得た (粗抽出物 Π)。

[0102] (3)粗抽出物 IIの吸収性

試験物質の投与に先立ち、 GKラットのうち、随時血糖の上昇が大きくないラット個体を用ヽて粗抽出物 IIの吸収試験を実施した。 10週齢の GKラット 16匹を 4匹ずつ 4 群に分け、 2群 (絶食群）には 16時間絶食させ、残り 2群 (摂取群）には飼料と水を自由に摂取させた。各飽食群に対して粗抽出物 n (T_Ween80含有)を 4. 3mgZkgまたは 13mgZkg投与し、投与後 1. 5時間、 3時間、 6時間、 12時間、 24時間に採血を行い、血漿中のコノフィリン濃度を測定した。また、各絶食群に対しても同様に粗抽出物 IIを投与し、血漿中のコノフィリン濃度を測定した。その結果を図 4に示す。

[0103] 図 4に示すように、コノフィリンの血中濃度は絶食群で若干高くなるものの、有意差は認められなかった。

[0104] (4)試験物質の投与

実施例 1と同様の手法を用、て、粗抽出物 IIの 12週齢糖尿病ラットへの投与を開始した。投与した試験物質の用量は、 OmgZkgZ日（コントロール群： 10匹）、 1. 3 mgZkgZ日（低用量群： 10匹）、 4. 3mgZkgZ日（中用量群： 10匹）、及び 13mg /kg/日（高用量群： 10匹）とした。投与は毎日午前中に行い、 42日間継続した。

[0105] (5)血糖値の測定

試験物質投与開始日より 1週間隔で随時血糖値を測定した (図 5)。また、試験物質の最終投与が終了した日の夕刻より 16時間絶食させ、翌朝の血糖値 (空腹血糖値）を測定した（図 6)。図 5に示すように、随時血糖値はバラツキはあるものの、粗抽出物 IIを 13mgZkgで投与した群では常に対照群よりも低い値を示し、投与開始 3週間目 (15週齢）においては有意に低下していた。また、図 6に示すように、空腹血糖値は投与した粗抽出物 IIの用量に依存して低下した。

[0106] このように、本願の精製方法を用いて精製したコノフィリンは、実際に生体内に投与したとき食品組成物または医薬組成物として有用あるいは有効であることが示された産業上の利用の可能性

本発明によれば、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液、前記水溶液からコノフィリン及び Z又はコノフイリジンを精製する方法、前記水溶液の製造方法、食品組成物又は医薬組成物に有用なコノフィリン及び z若しくはコノフイリジンを含有する水溶性組成物又はその製造方法、並びに、前記水溶性組成物を含有する食品組成物又は医薬組成物を提供することができる。

Claims

請求の範囲

[1] コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液。

[2] コノフィリン又はコノフイリジンが 2 μ g/ml以上の濃度で溶解して、ることを特徴とする請求項 1に記載の水溶液。

[3] コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液を製造する製造方法であって、

コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを含有する PH4以下の酸性水溶液に、カルボキシル基を有する陰イオン性水溶性高分子を溶解させる工程を包含することを特徴とする製造方法。

[4] コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液を製造する製造方法であって、

界面活性剤を含有する親水性溶媒にコノフィリン及び Z又はコノフイリジンを溶解させることを特徴とする製造方法。

[5] コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液を製造する製造方法であって、

コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを生産する植物から PH4以下の酸性水溶液で抽出する工程を含むことを特徴とする製造方法。

[6] コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液を製造する製造方法であって、

pH4以下の酸性水溶液で抽出した、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを生産する植物の抽出物を中和する工程を含むことを特徴とする製造方法。

[7] 前記植物がタベルネモンタナ ·デイヴアリカタ（Tabernaemontana divaricata)であることを特徴とする請求項 5又は 6に記載の製造方法。

[8] 請求項 3〜7の、ずれかに記載の製造方法により得られたコノフィリン及び Z又はコノフイリジンの水溶液。

[9] コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの精製方法であって、

pH4以下の酸性水溶液で抽出された、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを生産する植物の抽出物を分子量 10000で分画する分画工程と、

前記分画工程により得られる低分子量画分を回収する回収工程と、

を含むことを特徴とする精製方法。

[10] 前記低分子量画分を中和する中和工程と、

前記中和工程により沈殿する沈殿物を回収する回収工程と、を含むことを特徴とする請求項 9に記載の精製方法。

[11] コノフィリン及び Z又はコノフイリジンの精製方法であって、

pH4以下の酸性水溶液で抽出された、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを生産する植物の抽出物を中和する中和工程と、

前記中和工程により中和した前記抽出物を分子量 50000以下で分画する分画工程と、

前記分画工程により得られる高分子量画分を回収する回収工程と、

を含むことを特徴とする精製方法。

[12] 前記植物がタベルネモンタナ ·デイヴアリカタ（Tabernaemontana divaricata)であることを特徴とする請求項 9〜 11の、ずれかに記載の精製方法。

[13] 水に混合させたときに 2 gZml以上の濃度のコノフィリン又はコノフイリジン水溶液を作製し得る、コノフィリン及び Z又はコノフイリジンを含有する水溶性組成物。

[14] コノフィリン及び Z又はコノフイリジンと、カルボキシル基を有する陰イオン性水溶性高分子とを含有する水溶性組成物。

[15] コノフィリン及び Z又はコノフイリジンと、界面活性剤とを含有する水溶性組成物。

[16] β細胞を増殖させることを特徴とする請求項 13〜 15のいずれかに記載の水溶性組成物。

[17] 血糖値を降下させることを特徴とする請求項 13〜 15の、ずれかに記載の水溶性組成物。

[18] インスリンを上昇させることを特徴とする請求項 13〜15のいずれかに記載の水溶性組成物。

[19] 糖尿病を予防又は改善することを特徴とする請求項 13〜15のいずれかに記載の水溶性組成物。

[20] 請求項 13〜 19の、ずれかに記載の水溶性組成物の製造方法。

[21] 請求項 13〜 19のいずれかに記載の水溶性組成物を含有する食品組成物。

[22] 健康食品、機能性食品、または特定保健用食品を構成することを特徴とする請求項 21に記載の食品組成物。

[23] 請求項 13〜 19のヽずれかに記載の水溶性組成物を含有する医薬組成物。 [24] 経口投与用製剤を構成して!/ヽることを特徴とする請求項 23に記載の医薬組成物。