WO2007101925A1 - Utilisation de derives du 3,5-seco-4-nor-cholestane pour l'obtention d'un medicament cytoprotecteur - Google Patents

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medicament
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Bruno Buisson
Thierry Bordet
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    • C07C251/44—Oximes with oxygen atoms of oxyimino groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with the carbon atom of at least one of the oxyimino groups being part of a ring other than a six-membered aromatic ring

Definitions

  • the present invention relates to the use of 3,5-seco-4-norcholestane derivatives for obtaining a cytoprotective drug, with the exception of a neuroprotective drug.
  • Cellular degenerative processes are characterized by cell dysfunction often resulting in unwanted cell activities and cell death.
  • cytoprotective refers to the ability of agents, natural or not, to protect a cell against cell death, particularly pathological cell death, and / or against cellular dysfunctions leading to cell death. These cellular dysfunctions can for example be of mitochondrial origin, such as a reduction in the capacity to generate ATP, an inability to capture and / or retain calcium, or the generation of free radicals.
  • necrosis apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis .
  • Necrosis is a so-called "accidental" cell death that occurs during tissue damage. It is the plasma membrane of the cell that is most affected, causing a change in the homeostasis of the cell. The cells will soak up water to the point that it will cause the lysis of their plasma membrane. This cell lysis leads to the release into the surrounding medium of the cytoplasmic content. Necrosis is at the origin of the inflammatory process. The necrosis can affect a set of cells or a tissue while the other neighboring parts remain alive. The resulting transformation is a mortification of cells or tissues.
  • necrosis is defined by morphological changes occurring when a cell reaches the end of life following events such as a major trauma such as a stop or a decrease in blood circulation in an organ, hyperthermia (significant rise in temperature), poisoning by a chemical product, physical shock, etc.
  • a major trauma such as a stop or a decrease in blood circulation in an organ
  • hyperthermia significant rise in temperature
  • poisoning by a chemical product poisoning by a chemical product
  • physical shock etc.
  • necroses is that of the myocardium during infarction (arrest of circulatory supply to the muscle heart) due to obliteration (obstruction) of a coronary artery.
  • Apoptosis is an integral part of the normal physiology of an organism. It is a highly regulated physiological form of cell death and is necessary for the survival of multicellular organisms. Apoptosis is a process that plays a key role during embryogenesis.
  • Apoptotic or apoptotic cells will isolate themselves from the other cells.
  • Apoptosis usually involves individual cells in a tissue and does not cause inflammation.
  • One of the characteristic morphological points of apoptosis is the significant condensation of both the nucleus and the cytoplasm, which induces a significant decrease in cell volume.
  • the nucleus then fragments, each fragment is surrounded by a double envelope.
  • Apoptotic bodies cytoplasmic and nuclear elements
  • Apoptosis can be induced in different ways. For example, radiation, the presence of a chemical compound or a hormone are stimuli capable of inducing a cascade of apoptotic events in the cell. Intracellular signals such as incomplete mitosis or damage to I 1 DNA can also induce apoptosis.
  • Apoptosis also occurs after the action of a genotoxic agent or during an illness. Certain pathologies are characterized by an abnormal apoptosis, causing the loss of certain cell populations, such as for example hepatotoxicity, retinopathies, cardiotoxicity. A distinction is therefore made between physiological apoptosis and pathological apoptosis.
  • the invention relates essentially to pathological apoptosis.
  • necroptosis which has characteristics of necrosis and apoptosis.
  • a cell dying from necroptosis has characteristics similar to those of a cell dying from necrosis, but the biochemical stages of this mechanism are more similar to those of apoptosis.
  • This cell death mechanism is involved, for example, in ischemia.
  • Cellular degenerative processes can result from, among other things, pathological situations grouped under the term of degenerative diseases or conditions, trauma, or exposure to various factors.
  • These traumas and factors can include, for example, exposure to radiation (UV, gamma), hypoxia or deprivation of oxygen, deprivation of nutrients, deprivation of growth factors, poisons, cellular toxins, waste, environmental toxins, free radicals, reactive oxygen or even certain medical events and / or procedures such as surgical trauma including transplants of cells, tissues and organs. Mention may also be made of chemical or biological agents used as therapeutic agents in the context of medical treatments such as, for example, cytostatic agents or anti-inflammatory agents.
  • the invention is not intended to treat the extracellular causes of pathologies or degenerative processes which can lead to cell death, but rather the consequences at the cellular level of said pathological processes or of said pathologies and in particular to protect the cell against said consequences. .
  • diseases of the bones, joints, connective tissue and cartilage such as osteoporosis, osteomyelitis, arthritis including for example osteoarthritis, rheumatoid arthritis and psoriatic arthritis, avascular necrosis, progressive ossifying fibrodysplasia, rickets, Cushing's syndrome
  • muscle diseases such as muscular dystrophy, such as for example Duchenne muscular dystrophy, myotonic dystrophies, myopathies and myasthenia gravis
  • skin diseases such as dermatitis, eczema, psoriasis, aging, or even scarring impairments
  • cardiovascular diseases such as cardiac and / or vascular ischemia, myocardial infarction, ischemic heart disease, chronic or acute heart failure, cardiac dysrhythmia, atrial fibrillation, ventricular fibrillation, paroxysmal t
  • the present invention responds to this demand for cytoprotective compounds. Indeed, the Applicant has discovered that the derivatives of 3,5-seco-4-norcholestane and in particular 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol and one of its esters are endowed with remarkable cytoprotective properties.
  • - B represents a hydroxyl radical and C and D, identical or different, represent a hydrogen atom, or an alkyl radical, linear or branched, comprising from 1 to 4 carbon atoms, or B and C taken together represent a keto function and D a methyl, hydroxyl or methylamine radical, or B and C represent a hydrogen atom and D a methylamine radical, or B and C taken together represent an oxime group and D a methyl radical, and R represents an alkyl radical, linear or branched, comprising from 1 to 10 carbon atoms, or one of its addition salts with pharmaceutically acceptable acids, or one of its esters or one of the addition salts with pharmaceutically acceptable acids of said esters, for the preparation of a cytoprotective medicament, with except for a neuroprotective drug.
  • the addition salts with pharmaceutically acceptable acids can be, for example, salts formed with hydrochloric, hydrobromic, nitric, sulfuric, phosphoric, acetic, formic, propionic, benzoic, maleic, fumaric, succinic, tartaric acids. , citric, oxalic, glyoxylic, aspartic, alkane sulfonic such as methane or ethane sulfonic, arylsulfonic, such as benzene or paratoluene sulfonic, or carboxylic acids.
  • the radical R of the compounds of formula I which can be used is preferably the cholestane radical of formula II
  • the compounds of formula I for which X and Y taken together represent a keto function or represent an oxime group are preferably used.
  • the compounds of formula I for which B represents a hydroxyl radical and C and D, identical or different, represent a hydrogen atom or an alkyl radical, linear or branched, comprising 1 to 4 carbon atoms, or for which B and C taken together represent a keto function and D represents a methyl radical, are preferably used.
  • At least one compound of formula I chosen from 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol is used according to the invention, 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-methyl alcohol, or 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-dimethyl alcohol, or one of its addition salts with pharmaceutically acceptable acids, or one of its esters or one of the addition salts with pharmaceutically acceptable acids of said esters.
  • the interesting cytoprotective properties of the compounds of formula I justify their use for the preparation of a cytoprotective drug, particularly intended for the treatment or prevention of necrosis and / or apoptosis and / or necroptosis (antinecrotic drugs and / or antiapoptotics and / or antinecroptotics) or diseases such as bone, joint, connective tissue and cartilage diseases, muscle diseases, skin diseases, cardiovascular diseases, circulatory diseases, hematological and vascular diseases , lung disease, gastrointestinal tract disease, liver disease, pancreatic disease, metabolic disease, kidney disease, viral and bacterial infections, severe poisoning, degenerative conditions associated with Immuno Syndrome Acquired deficit (AIDS), disorders associated with aging, inflammatory diseases, autoimmune diseases, dental disorders, ophthalmic diseases or disorders, diseases of the auditory tract, diseases associated with mitochondria (mitochondrial pathologies).
  • the invention also relates to the protection of cells, tissues or transplanted organs, whether before, during (removal, transport and / or reimplantation
  • the compounds of formula I can be used in the preparation of a medicament intended for the protection of cardiac cells (cardioprotective medicament), in the protection of hepatic cells (hepatoprotective medicament) or of a medicament intended for the treatment or prevention of diseases associated with mitochondria.
  • the compound of formula I is advantageously present in the cytoprotective medicament at physiologically effective doses; said drugs contain in particular an effective cytoprotective dose of at least one of the compounds of formula I.
  • the compounds corresponding to formula I, their esters, their addition salts with pharmaceutically acceptable acids as well as the addition salts with pharmaceutically acceptable acids of said esters can be formulated for the digestive or parenteral route.
  • the medicaments according to the invention may also comprise at least one other therapeutically active ingredient, whether it is active on the same pathology or on a different pathology, for simultaneous, separate or spread over time use, in particular during a treatment in a subject suffering from one of the pathologies previously mentioned.
  • the compound of formula I can be used in the medicament, in mixture with one or more excipients or inert vehicles, ie pharmaceutically inactive and non-toxic. Mention may be made, for example, of saline, physiological, isotonic, buffered solutions, etc., compatible with pharmaceutical use and known to those skilled in the art.
  • the compositions may contain one or more agents or vehicles chosen from dispersants, solubilizers, stabilizers, preservatives, etc.
  • Agents or vehicles usable in formulations are in particular methylcellulose, hydroxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, cyclodextrins, polysorbate 80, mannitol, gelatin, lactose, vegetable oils or animal, acacia, etc.
  • the compositions can be formulated in the form of an injectable suspension, gels, oils, tablets, suppositories, powders, capsules, capsules, etc., optionally by means of dosage forms or devices ensuring prolonged and / or delayed release.
  • an agent such as cellulose, carbonates or starches is advantageously used.
  • the administration can be carried out by any method known to a person skilled in the art, preferably by oral route or by injection, typically by intraperitoneal, intra-cerebral, intra-thecal, intravenous, intra-arterial or intra route. -muscular. Oral administration is preferred. For long-term treatment, the preferred route of administration will be sublingual, oral or transcutaneous.
  • the compounds are generally packaged in the form of liquid suspensions, which can be injected using syringes or infusions, for example. It is understood that the flow rate and / or the dose injected, or in general the dose to be administered, can be adapted by a person skilled in the art according to the patient, the pathology, the mode of administration, etc. it is understood that repeated administrations can be carried out, optionally in combination with other active ingredients and / or any pharmaceutically acceptable vehicle (buffers, saline, isotonic solutions, in the presence of stabilizing agents, etc.).
  • active ingredients buffers, saline, isotonic solutions, in the presence of stabilizing agents, etc.
  • the invention can be used in mammals, in particular in humans.
  • the daily dose of the compound will be the minimum dose to obtain the desired therapeutic effect.
  • the doses of the compounds described above and for example 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol will generally be between 0.001 to 100 mg per kilo per day for humans.
  • the daily dose can be administered in two, three, four, five, six or more, taken per day or in multiple sub-doses administered at appropriate intervals during the day.
  • the amount chosen will depend on multiple factors, in particular the route of administration, the duration of administration, the time of administration, the rate of elimination of the compound, or the different product (s) used in combination with the compound, age, weight and physical condition of the patient, as well as his medical history, and any other information known in medicine.
  • the doctor's prescription may start at doses lower than those generally used, then these doses will be gradually increased in order to better control the appearance of possible side effects.
  • compositions according to the invention in particular the pharmaceutical or medicinal compositions, can comprise at least one compound of formula I as described above, or one of its addition salts with pharmaceutically acceptable acids, or one of its esters or one of the addition salts with pharmaceutically acceptable acids of said esters,
  • compositions according to the invention may also comprise at least one other therapeutically active ingredient, for simultaneous, separate or spread over time use, in particular during treatment in a subject suffering from one of the pathologies mentioned above.
  • compositions according to the invention can advantageously comprise one or more inert excipients or vehicles, that is to say pharmaceutically inactive and non-toxic.
  • the compounds of formula I used according to the invention can be synthesized by reacting a compound of formula III
  • R has the meanings previously indicated
  • B represents a hydroxyl group
  • C and D represent a hydrogen atom
  • the reaction of the compound of formula III with methylamine is carried out in the presence of a coupling agent activating the acid function such as BOP (Benzotriazole-i-yl-oxy-tris- (dimethylamino) -phosphonium hexafluorophosphate) or TBTU ( 2- (1H-benzotriazole-1-yl) -1, 1, 3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate) advantageously in the presence of a base such as N-methylmorpholine, in particular in a suitable solvent such as dichloromethane or dimethylformamide.
  • a coupling agent activating the acid function such as BOP (Benzotriazole-i-yl-oxy-tris- (dimethylamino) -phosphonium hexafluorophosphate) or TBTU ( 2- (1H-benzotriazole-1-yl) -1, 1, 3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate) advantageously in
  • EDCI 1-Ethyl-3- (3'-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • 4-dimethylaminopyridine in dichloromethane, the mixture being stirred at room temperature for 24 h.
  • the product is then preferably dissolved in pyridine, then 5 to 7 and in particular 6 equivalents of hydroxylamine hydrochloride are added.
  • the methylation of the compound of formula III is carried out by reaction with methanol in the presence of thionyl chloride, preferably by solubilizing the acid of formula II in a suitable volume of a mixture of 70% methanol and 30% dichloromethane.
  • the mixture is cooled to 0 ° C. and 3 equivalents of thionyl chloride are added dropwise. Then stirred for 2 hours at room temperature.
  • the protection of the ketone function is preferably carried out by dissolving the product in an excess, for example 10 equivalents of trimethylorthoformate and a sufficient volume of ethylene glycol, then addition of anhydrous p-toluenesulfonic acid.
  • the reaction of the compound of formula V with methyl lithium is preferably carried out in anhydrous THF then after cooling to about - 45 0 C, dropwise addition of an excess of methyl lithium.
  • Deprotection of the dioxolane which blocks the ketone function in position 5, is carried out in acetone in the presence of sulfuric acid. Preferably it is carried out in dioxane, in the presence of a water / acetic acid 1/1 mixture.
  • the ketone oxime is advantageously carried out as above.
  • the saponification of the compound of formula V is carried out with sodium hydroxide, preferably in dioxane. About 2 equivalents of an aqueous sodium hydroxide solution are added in particular.
  • This product is reacted with a compound of formula H 3 C-NH-OCH 3 for example in the presence of a coupling agent activating the acid function such as BOP or TBTU in the presence of a base such as N-methylmorpholine in a suitable solvent such as dichloromethane or dimethylformamide.
  • a coupling agent activating the acid function such as BOP or TBTU
  • a base such as N-methylmorpholine
  • a suitable solvent such as dichloromethane or dimethylformamide.
  • it is carried out in the presence of EDCI associated with hydroxybenzotriazole with triethylamine added dropwise in the solvent.
  • the ionization conditions for the mass spectrometer are:
  • Step A Firstly, 250 mg of 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one, oxime-3-oic acid, 38 mg of methylamine hydrochloride, 250 mg of EDCI, 100 mg of DMAP and 2.5 mL of dichloromethane. The solution is stirred for 24 hours at room temperature then the reaction medium is diluted by adding dichloromethane and washed with a 10% sodium bicarbonate solution. The organic phase is dried over sulphate magnesium then concentrated under reduced pressure. The residue obtained is purified by flash chromatography (CH 2 CI 2 / MeOH 95/5). 176 mg of 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one-3-methylamide are recovered with a yield of 68%.
  • Step B Next, 50 mg of 3,5-seco-4-norcholestane-5-one-3-methylamide, 50 mg of hydroxylamine hydrochloride in 1 ml of pyridine are introduced into a flask. The mixture is stirred for 16 hours at ambient temperature then the reaction medium is concentrated under reduced pressure. The residue obtained is taken up in a CH2Cl2 / H 2 O mixture; the organic phase is separated, washed with water, dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure. 40.6 mg of 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one, oxime-3-methylamide are recovered with a yield of 78%.
  • Step A In a flask, 10.5 g of 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one-3-oic acid are dissolved in 378 ml of methanol and 146 ml of dichloromethane. It is cooled to 0 ° C. and 5.7 ml of thionyl chloride are added dropwise. Then stirred for 2 hours at room temperature. The reaction medium is concentrated under reduced pressure, co-evaporated with toluene and then with dichloromethane. 10.3 g of 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one-3-methyl ester are obtained with a yield of 94%. The product is used as is without purification.
  • Step B In a flask, 9.62 g of 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one-3-methyl ester are dissolved in 25 ml of trimethylorthoformate and 53 ml ethylene glycol. 400 mg (2.3 mmol) of anhydrous p-toluenesulfonic acid are then added and the mixture is then stirred overnight at room temperature. Ethyl acetate is added to the reaction medium; washing is carried out with a 10% solution of sodium hydrogencarbonate. The organic phase is separated, dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated under reduced pressure. 9.95 g of 3,5-seco-4-nor-cholestane-5,5 (ethylene dioxy) -3-methyl ester are obtained with a yield of 93%. The product is used as is without purification.
  • Step D 6 ml of a 1/1 water / acetic acid mixture and 295 mg of 3,5-seco-4-nor-cholestane-5,5 (ethylene dioxy) -3-dimethyl alcohol are added to a flask ; heated at reflux for 1 hour 30 minutes. After cooling, the reaction medium is diluted with ethyl acetate, washed with a saturated solution of sodium chloride, then with a saturated solution of sodium bicarbonate. Finally, the organic phase is dried over magnesium sulfate and concentrated under reduced pressure. The crude product obtained is purified by flash chromatography (petroleum ether / ethyl acetate 8/2). 180 mg of 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one-3-dimethyl alcohol are obtained with a yield of 68%. 1 H NMR (CDCI 3 ): compliant Retention time: 5 min 08 hundredths
  • Step B In a flask, 1.9 g of 3,5-seco-4-nor-cholestane-5,5 (ethylene dioxy) -3-oic acid are placed in 30 ml of dichloromethane. 1.06 g of EDCI, 743 mg of HOBT, 537 mg of N 1 O-dimethylhydroxylamine hydrochloride and then 1.37 ml of triethylamine are added dropwise to this solution. We shake at room temperature for 16 hours. A CH 2 CI 2 ZH 2 O mixture is added to the reaction medium and it is extracted 3 times with dichloromethane. The organic phases are combined, dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated under reduced pressure.
  • Step C 1.4 g of 3,5-seco-4-nor-cholestane-5,5 (ethylene dioxy) -3- (N, N-methoxy-methyl) amide are introduced into a balloon under argon. mL of anhydrous tetrahydrofuran and the mixture is cooled to 0 ° C. 3.38 mL of a 1.6M solution of methyllithium in ether is then added dropwise. The reaction medium is stirred for 3 hours 40 minutes at 0 ° C. and then a solution of 0.72 ml of concentrated hydrochloric acid in 7.28 ml of water is added dropwise.
  • Step D In a flask, 119 mg of 3,5-seco-4-nor-cholestane-5,5 (ethylene dioxy) -3-methyl ketone from step C are placed in 1.5 ml of methanol. Cool to 0 ° C and add 10 mg of sodium borohydride. The reaction medium is stirred at 0 ° C. for 1 h and then concentrated under reduced pressure. The residue is taken up in water and extracted with dichloromethane. The organic phase is dried over magnesium sulfate and concentrated under reduced pressure. We recovers 94 mg 3,5-seco-4-nor-cholestane-5,5 (ethylene dioxy) -3-methylalcohol with a yield of 78%, this product is used as it is.
  • Step F 121 mg of 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one-3-methyl alcohol, 1.5 ml of pyridine and 121 mg of hydroxylamine hydrochloride are introduced into a flask. The solution is stirred for two days at room temperature. The reaction medium is concentrated under reduced pressure, taken up in water and extracted with dichloromethane. The organic phase is then washed with water, then dried over magnesium sulfate and concentrated under reduced pressure. The product thus obtained is purified by flash chromatography (petroleum ether / ethyl acetate 9/1). 66 mg of 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one, oxime-3-methyl alcohol are obtained with a yield of 53%.
  • Step A In a balloon, 615 mg of LiAIH4 is placed in suspension in 57 ml of THF. It is cooled to 0 ° C. and a solution of 3.0 g of 3,5-seco-4-nor-cholestane-5,5 (ethylene dioxy) -3-methyl ester is added dropwise. 57 mL of tetrahydrofuran. Then stirred at 0 ° C. for 5 h. It is carefully hydrolyzed by adding a solution of sodium sulfate; the white solution obtained is stirred for 30 minutes, then filtered. The filtrate is concentrated under reduced pressure and taken up in water, extracted with ethyl acetate.
  • Step B In an argon flask, 476 mg of 3,5-seco-4-nor-cholestane-5.5 (ethylene dioxy) -3-ol are dissolved in 7 ml of dichloromethane, then 189 mg of d neutral alumina and 399 mg of pyridinium chlorochromate; stirred at room temperature for 3:30.
  • the reaction medium is filtered through Celite®; the filtrate is concentrated under reduced pressure.
  • the residue obtained is purified by flash chromatography (toluene / ethyl acetate 9/1 then 8/2). 328 mg of 3,5-seco-4-nor-cholestane-5,5 (ethylene dioxy) -3-al are obtained with a yield of 69%.
  • Step D 50 mg of 3,5-seco- are introduced into a flask 4-nor-cholestane- 5,5 (ethylene dioxy) -3-methylamine and 976 ⁇ L of a water / acetic acid 1/1 mixture. The mixture is brought to reflux for 6 hours. After cooling, the reaction medium is diluted with ethyl acetate and washed with a saturated sodium chloride solution and then with a 5% sodium bicarbonate solution. The organic phase is dried over magnesium sulfate and concentrated under reduced pressure.
  • the product is then salified in the presence of an ether solution acidified with an aqueous hydrochloric acid solution, to obtain the product in the form of di-hydrochloride.
  • the final concentration of DMSO was the same for all the experimental points, independently of the concentrations of molecules used.
  • 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol was tested at concentrations of 0.1 and 0.3 ⁇ M, diluted in a solution of Tyrode (composition in mmol / L: NaC1 135, KCL 5.4, NaH 2 PO 4 0.33, CaCI 2 1.2, MgCI 2 1.0, Hepes 10; pH adjusted to 7.4 with NaOH).
  • Isolated ventricular cells are obtained from hearts of New Zealand maize rabbits as described in A. d'Anglemont de Tassigny et al., Fund Clin Pharmacol, 18: 531-38, 2004. In short, rabbits (2, 0-2.5 kg) are anesthetized with a solution of pentobarbital (50 mg / kg) and then receive heparin (200 lU / kg).
  • the hearts are excised and immediately perfused, for 10 to 15 minutes using a Langendorff apparatus without recirculation with an isotonic solution of oxygenated tyrode (without calcium) (95%, 2-5% CO 2 ) (in mM: NaCI 135, KCI 5.4, Na 2 PO 4 0.33, MgCI 2 1.0, HEPES 10, pH adjusted to 7.4 with 1 N NaOH at 37 ° C, 280-300 mOsmol / kgH 2 O).
  • the isolated myocytes are maintained in a serum-free medium containing (in mM) NaCI 110, KCI 5.4, Na 2 PO 4 0.33, NaHCO 3 25, Glucose 5, MgCI 2 0.8, CaCI 2 1, pH adjusted at 7.4 until 1.5 hours before the experiment. All of the cells are baguette-shaped, have clear cross striation and do not have a vesicle on their surface under an optical microscope.
  • the annexin V labeling of phosphatidylserine was used as a quantitative method of measuring apoptosis using the MiniMacs cell isolation kit (Miltenyi Biotec, Bergisch, Gladbach, Germany).
  • the cells exhibiting phosphatidylserine are magnetically labeled with annexin V microbeads, then passed through a column placed in a field magnetic. Labeled cells (which have magnetically labeled phosphatidylserine) are retained in the column while unlabeled cells (necrotic and non-apoptotic cells) are not retained.
  • the column is removed from the magnetic field, the cells exposing magnetically retained phosphatidylserine are eluted as a positive fraction and counted with a Mallassez cell. The percentage of apoptotic cells is then related to the initial number of cells. Measuring caspase-3 activity
  • the caspase-3 activity is used as a quantitative method for measuring apoptosis. Briefly, the cells are lysed and the supernatant is used for the measurement of caspase-3 activity using the kit AK-005 (Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, PA, USA).
  • the fluorogenic substrate for measuring caspase-3 activity (DEVD) is labeled with the fluorochrome 7-amino-4-methyl coumarin (AMC) which produces a yellow-green fluorescence detectable in UV light at 360/460 nm for 210 min .
  • AMC is released from the substrate by cleavage by caspase-3, the expression of the enzyme is expressed in fmol / min.
  • the myocytes are transferred to a chamber at 37 ° C continuously perfused and positioned on the stage of an inverted microscope.
  • Myocyte contraction is induced once per second (1 Hz) with platinum field electrodes placed in the chamber and connected to a stimulator.
  • the images are continuously captured with a 20x objective and transmitted to a CCD camera at the rate of 240 samples / s.
  • the CCD camera images are projected onto a video screen.
  • the myocytes were selected for the study according to the following criterion: a baguette-like appearance with very visible striations and no intracellular vacuole, no spontaneous contraction when stimulated with 1 mM Ca 2+ , and with a length constant rest and amplitude of contraction.
  • the length of the sarcomeres was measured using a video image analysis program and the data was captured at a rate of 240 samples / s. Camera images have been converted to length of sarcomere. The percentage of contraction is calculated from these data over the length of the sarcomere.
  • Apoptosis is induced in isolated cardiomyocytes by exposure for 3 to 8 hours to 1 ⁇ M of doxorubicin added in an isotonic solution containing (in mM) NaCI 110, KCI 5.4, Na 2 PO 4 0.33, NaHCO 3 25, Glucose 5, MgCl 2 0.8, CaCl 2 1, pH adjusted to 7.4.
  • the labeling with annexin V was carried out 3 hours after the start of exposure to doxorubicin since this phenomenon appears very early in the apoptotic cascade.
  • Measurements of caspase-3 activity are carried out 8 h after exposure to doxorubicin since this phenomenon takes place later in the phenomenon of apoptosis. Cardiomyocyte contractility was measured every hour during the 8 hours of exposure to doxorubicin. After all the treatments, the cells were compared to the control cardiomyocytes not exposed to doxorubicin.
  • the cardiomyocytes were pretreated with the compound 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol for 15 min before exposure to doxorubicin. Two concentrations of this compound were tested during this study: 0.1 and 0.3 ⁇ M.
  • Apoptosis evaluated as a% change in labeling with annexin V 3 hours after doxorubicin gives the following results: control: 100%; doxorubicin: 320% ⁇ 48.7; doxorubicin + 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime- 3-ol 0.1 ⁇ M: 116.3% ⁇ 15.1; doxorubicin + 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime- 3-ol 0.3 ⁇ M: 137.3% ⁇ 19.3.
  • the compound 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol shows a cardioprotective effect on the contractility dysfunction induced by doxorubicin and on apoptosis on isolated rabbit cardiomyocytes.
  • the molecule when used in appropriate doses can effectively protect against doxorubicin-induced cardiotoxicity which is known to be the limiting factor in the treatment of cancer patients with this anthracycline.
  • the compound 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol could be used to limit the cardiotoxicity of doxorubicin in these patients.
  • Example 13 Effect of the compounds 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol and 3,5-seco-4-nor-choIestan-5-one oxime-3-N, N- dimethylglycine ester in an in vivo model of myocardial infarction in mice
  • the aim of this experiment is to study in vivo in a model of coronary occlusion-reperfusion in mice, the cardioprotective properties of the 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol compounds and 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-N, N-dimethylglycine ester.
  • test compounds are administered intravenously to mice 5 minutes before reperfusion of the previously ischemic myocardium.
  • the vehicles of the compounds respectively beta-cyclodextrin (hereinafter called DCD) and water, are administered under the same conditions as the compounds.
  • the size of the infarction is measured after a 24 hour reperfusion.
  • mice Male C57BL6 mice aged 6 to 8 weeks are anesthetized with sodium pentobarbital (50 mg / kg ip) and are ventilated after intubation with a mixture of O2 / CO 2 (95% / 5%) throughout the experiment .
  • the surface electrocardiogram (ECG) is recorded and viewed on an oscilloscope for the duration of the surgery.
  • ECG surface electrocardiogram
  • the jugular vein is catheterized for intravenous administration of the compounds.
  • a left lateral thoracotomy is performed and after pericardiotomy, a major branch of the left coronary artery is located in the latero-posterior region of the left ventricle.
  • a prolene wire number 8 is positioned around this artery so as to form a mobile loop for the realization of a temporary coronary occlusion.
  • mice underwent temporary coronary occlusion for 30 minutes. Ischemia of the myocardial region is confirmed by the presence of cyanosis of the myocardial surface and by a deviation of the ST segment of the EKG.
  • 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol is administered at a dose of 1 mg / kg.
  • the same volume of vehicle is administered in the corresponding control groups.
  • the reperfusion was confirmed by the appearance of the QRS segment of the EKG.
  • mice After closing the chest plane by plane and evacuating the pneumothorax by aspiration using a drain, the mice are then gradually awakened and weaned from their ventilatory assistance until resumption of normal spontaneous ventilation. If necessary, buprenorphine (1 mg / kg) is administered intraperitoneally to provide effective pain relief coverage.
  • mice Twenty-four hours after the end of the coronary occlusion, the mice are re-anesthetized with sodium pentobarbital (50 mg / kg i.p.) and heparin is administered intravenously (heparin Choay ⁇ 1000IU / kg).
  • heparin Choay ⁇ 1000IU / kg A ligation of the coronary artery is performed in the same place as that which was the subject of the first occlusion 24 hours previously.
  • the mice are then euthanized by a lethal dose of saturated potassium chloride and their heart is rapidly excised and then mounted by the aortic artery on a retrograde perfusion system of the Langendorf type.
  • a 5% Evans blue solution is retrograde perfused so that the healthy myocardium is colored blue; the area made ischemic during coronary occlusion, or "area at risk AR" remaining uncolored by default.
  • the left ventricle is then cut into 5 slices of equal thickness (1 mm) using a slicer specially designed for mouse hearts (Les Isolants de Paris, Palaiseau) which are then weighed.
  • TTC triphenyltetrazolium chloride
  • the quantification of the infarction and the area at risk is carried out by planimetry (Scion Image, Scion, Frederick MD, USA) and related to the weight of each slice.
  • the risk area (non-blue zone) is expressed as a percentage of the weight of the left ventricle.
  • Heart attack sizes are expressed as a percentage of the weight of the area at risk.
  • infarction size and risk area are expressed as mean ⁇ SEM.
  • a one-factor ANOVA followed by a non-even Student's t-test with Bonferonni correction is used to compare the areas at risk and the sizes of infarction between the experimental groups, the significance level being fixed at p ⁇ 0.05 .
  • the infarction sizes of the mice treated with the compounds differ significantly from those of the mice treated with the vehicle.
  • Example 14 Effect of the compound 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one ox oute-3-ol in an in vivo model of acute hepatotoxicity.
  • Hepatocytes like many other cells, carry the Fas / CD95 receptor on their cytoplasmic membrane. Stimulation of this Fas pathway induces cell death by activating the caspase cascade.
  • liver damage can be induced by a single injection of the anti-Fas Jo2 antibody (Ogasawara et al., Nature, August 1993), producing severe liver damage and resembling viral, autoimmune or hepatitis-induced hepatitis. drugs.
  • Alanine Aminotransferase also called Serum Glutamic Pyruvic Transaminase (SGPT) is an enzyme found in hepatocytes. Its activity increases significantly in plasma after hepatic lysis and is therefore a good marker for assessing liver damage.
  • Animal Materials and Methods are described below.
  • the installations were maintained on a controlled light cycle (7:00 - 19:00), and at temperatures of 20 ⁇ 2 0 C and humidity of 50 ⁇ 20%.
  • a stock solution of hamster monoclonal antibody CD95 (Fas), called Jo2, from Pharmingen (BD Biosciences, ref. 554254 batch 32699) is prepared at a concentration of 1 mg / ml in water. The dilutions used are made in 0.9% sodium chloride in water.
  • the desired amount of 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol is weighed and ground into a fine powder, then mixed with Cremophore EL (Sigma C5135) and absolute ethanol ( Carlo Erba RPE 41571) (respectively 5% and 10% of the final volume). After complete dissolution, 0.9% sodium chloride in water is added immediately (85% of the final volume).
  • a pretreatment with 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol is carried out at doses of 10 and 30 mg / kg by intraperitoneal administration 1 hour before the administration of the antibody Jo2.
  • the Jo2 antibody is administered by intraperitoneal injection at a dose of 125 ⁇ g / kg in a volume of 5 mL / kg of body weight.
  • a control is carried out on animals receiving a pretreatment by intraperitoneal administration 1 hour before the administration of the antibody of an identical volume of solution having been used for the preparation of the test compound, without compound.
  • ALT is carried out using a kit (Roche Diagnostics) with a spectrophotometer (Hitachi Modular), according to the method standardized by NFCC (International Federation of Clinical Chemistry).
  • the ALAT activity is significantly reduced by the compound 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol at 10 and 30 mg / kg.
  • the ALAT 1 activity, biomarker of hepatic cytolysis in plasma, is significantly lower in mice treated with 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol than in non-control mice processed. Lethal poisoning by the Jo2 antibody
  • the Jo2 antibody is administered by intraperitoneal injection at a dose of 200 or 250 ⁇ g / kg in a volume of 5 mL / kg of body weight. 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol is tested at 10 and 30 mg / kg, as a pretreatment, 1 hour before the administration of Jo2 or in post-treatment, 1 hour after l administration of Jo2.
  • a control is carried out on animals receiving a pretreatment by intraperitoneal administration 1 hour before or 1 hour after the administration of the antibody of an identical volume of solution having been used for the preparation of the test compound, without compound.
  • the Jo2 antibody induces significant mortality within 24 hours (70 to 100% of the animals) in the control group.
  • Pre-treatment and / or post-treatment with 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol at the doses administered induces an increase in the survival of the animals.
  • the acute hepatotoxicity model induced in mice by an anti Fas antibody made it possible to demonstrate the hepatoprotective properties of 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation de dérivés du 3,5-seco-4-nor-cholestane pour l'obtention d'un médicament cytoprotecteur, à l'exception d'un médicament neuroprotecteur, notamment un médicament cardioprotecteur ou hépatoprotecteur.

Description

Utilisation de dérivés du 3,5-seco-4-nor-cholestane pour l'obtention d'un médicament cytoprotecteur
La présente invention concerne l'utilisation de dérivés du 3,5-seco-4-nor- cholestane pour l'obtention d'un médicament cytoprotecteur, à l'exception d'un médicament neuroprotecteur.
Les processus dégénératifs cellulaires sont caractérisés par le dysfonctionnement des cellules entraînant souvent des activités cellulaires indésirables et la mort cellulaire.
Les cellules ont développé des mécanismes d'adaptation, en réponse au stress, qui allongent leur durée de vie ou retardent ou empêchent la mort cellulaire (mécanismes cytoprotecteurs).
Cependant, ces mécanismes cytoprotecteurs sont parfois insuffisants, inadéquats, ou induits trop tard pour être efficaces et les cellules meurent. Il peut donc s'avérer intéressant de disposer de nouveaux médicaments, cytoprotecteurs, qui favoriseraient la cytoprotection. C'est un des buts de la présente invention.
Le terme « cytoprotecteur» fait référence à la capacité d'agents, naturels ou non, à protéger une cellule contre la mort cellulaire, particulièrement la mort cellulaire pathologique, et/ou contre les dysfonctionnements cellulaires conduisant à la mort cellulaire. Ces dysfonctionnements cellulaires peuvent être par exemple d'origine mitochondriale, comme une réduction de la capacité à générer de l'ATP, une incapacité à capter et/ou retenir le calcium, ou la génération de radicaux libres.
Parmi les mécanismes principaux de mort cellulaire, on distingue essentiellement la nécrose, l'apoptose et la nécroptose.
La nécrose est une mort cellulaire dite "accidentelle" qui survient lors d'un dommage tissulaire. C'est la membrane plasmique de la cellule qui est la plus touchée, entraînant une modification de l'homéostasie de la cellule. Les cellules vont se gorger d'eau au point que cela va entraîner la lyse de leur membrane plasmique. Cette lyse cellulaire conduit au largage dans le milieu environnant du contenu cytoplasmique. La nécrose est à l'origine du processus inflammatoire. La nécrose peut toucher un ensemble de cellules ou un tissu alors que les autres parties de voisinage restent vivantes. La transformation qui en résulte est une mortification des cellules ou des tissus.
Autrement dit, la nécrose se définit par des modifications morphologiques survenant lorsqu'une cellule arrive en fin de vie à la suite d'événements tels qu'un traumatisme important comme un arrêt ou une diminution de la circulation sanguine au niveau d'un organe, l'hyperthermie (élévation importante de la température), une intoxication par un produit chimique, un choc physique, etc.. Une des nécroses les plus connues est celle du myocarde lors de l'infarctus (arrêt d'apport circulatoire au niveau du muscle cardiaque) due à une oblitération (obstruction) d'une artère coronaire.
L'apoptose fait partie intégrante de la physiologie normale d'un organisme. C'est une forme physiologique de mort cellulaire hautement régulée et elle est nécessaire à la survie des organismes multicellulaires. L'apoptose est un processus qui joue un rôle primordial au cours de l'embryogenèse.
Les cellules en apoptose ou apoptotiques vont s'isoler des autres cellules. L'apoptose implique habituellement des cellules individuelles dans un tissu et ne provoque pas l'inflammation. L'un des points morphologiques caractéristiques de l'apoptose est l'importante condensation à la fois du noyau et du cytoplasme ce qui induit une diminution significative du volume cellulaire. Le noyau se fragmente ensuite, chaque fragment est entouré d'une double enveloppe. Des corps apoptotiques (éléments cytoplasmiques et nucléaires) sont ensuite libérés et vont être absorbés par phagocytose par les cellules voisines.
L'apoptose peut être induite de différentes façons. Par exemple, une radiation, la présence d'un composé chimique ou d'une hormone sont des stimuli susceptibles d'induire une cascade d'événements apoptotiques dans la cellule. Des signaux intracellulaires comme une mitose incomplète ou un dommage à I1ADN peuvent aussi induire l'apoptose.
L'apoptose intervient aussi après l'action d'un génotoxique ou au cours d'une maladie. Certaines pathologies sont caractérisées par une apoptose anormale, entraînant la perte de certaines populations cellulaires, comme par exemple l'hépatotoxicité, les rétinopathies, la cardiotoxicité. On distingue donc l'apoptose physiologique et l'apoptose pathologique. L'invention s'adresse essentiellement à l'apoptose pathologique.
Il existe d'autres mécanismes de mort cellulaire, comme par exemple la nécroptose, qui présente des caractéristiques de la nécrose et de l'apoptose. Une cellule mourrant par nécroptose présente des caractéristiques similaires à celles d'une cellule mourrant par nécrose, mais les étapes biochimiques de ce mécanisme s'assimilent plus à celles de l'apoptose. Ce mécanisme de mort cellulaire intervient par exemple dans l'ischémie.
C'est donc aussi un des buts de la présente invention que de disposer de nouveaux médicaments qui pourraient permettre de prévenir et/ou traiter la nécrose et/ou l'apoptose pathologique et/ou la nécroptose (médicaments antinécrotiques et/ou antiapoptotiques et/ou antinécroptotiques).
Les processus dégénératifs cellulaires peuvent résulter, entre autres, de situations pathologiques regroupées sous le terme de maladies ou affections dégénératives, de traumatismes, ou d'exposition à divers facteurs.
Ces traumatismes et facteurs peuvent inclure, par exemple, l'exposition aux radiations (UV, gamma), l'hypoxie ou la privation d'oxygène, la privation de nutriments, la privation de facteurs de croissance, des poisons, des toxines cellulaires, des déchets, des toxines environnementales, des radicaux libres, des oxygènes réactifs ou encore certains événements et/ou procédures médicaux comme par exemple les traumatismes chirurgicaux incluant les transplantations de cellules, de tissus et d'organes. On peut citer également des agents chimiques ou biologiques utilisés comme agents thérapeutiques dans le contexte de traitements médicaux comme par exemple des agents cytostatiques ou des agents anti-inflammatoires.
L'invention n'a pas pour but de traiter les causes extracellulaires des pathologies ou des processus dégénératifs pouvant aboutir à la mort cellulaire, mais bien les conséquences au niveau cellulaire desdits processus pathologiques ou des dites pathologies et particulièrement de protéger la cellule contre lesdites conséquences.
Parmi les situations pathologiques caractérisées par un processus dégénératif les plus importantes, autres que les affections neurologiques ou neurodégénératives auxquelles la présente invention ne s'adresse pas, on trouve : les maladies des os, des articulations, du tissu conjonctif et du cartilage, telles que l'ostéoporose, l'ostéomyélite, les arthrites dont par exemple l'ostéoarthrite, l'arthrite rhumatoïde et l'arthrite psoriatique, la nécrose avasculaire, la fibrodysplasie ossifiante progressive, le rachitisme, le syndrome de Cushing ; les maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, comme par exemple la dystrophie musculaire de Duchenne, les dystrophies myotoniques, les myopathies et les myasthénies ; les maladies de la peau, telles que les dermatites, l'eczéma, le psoriasis, le vieillissement, ou encore les altérations de la cicatrisation ; les maladies cardiovasculaires telles que l'ischémie cardiaque et/ou vasculaire, l'infarctus du myocarde, la cardiopathie ischémique, l'insuffisance cardiaque chronique ou aiguë, la dysrythmie cardiaque, la fibrillation auriculaire, la fibrillation ventriculaire, la tachycardie paroxystique, l'insuffisance cardiaque, l'anoxie, l'hypoxie, les effets secondaires dus à des thérapies avec des agents anticancéreux ; les maladies circulatoires telles que l'athérosclérose, les scléroses artérielles, et les maladies vasculaires périphériques, les accidents vasculaires cérébraux, les anévrismes ; les maladies hématologiques et vasculaires telles que : l'anémie, l'amyloïdose vasculaire, les hémorragies, la drépanocytose, le syndrome de la fragmentation des globules rouges, la neutropénie, la leucopénie, l'aplasie médullaire, la pancytopénie, la thrombocytopénie, l'hémophilie ; les maladies du poumon incluant la pneumonie, l'asthme ; les maladies chroniques obstructives des poumons comme par exemple les bronchites chroniques et l'emphysème ; les maladies du tractus gastro-intestinal, telles que les ulcères ; les maladies du foie comme par exemple les hépatites particulièrement les hépatites d'origine virale ou ayant pour agent causal d'autres agents infectieux, les hépatites autoimmunes, les hépatites fulminantes, certains désordres métaboliques héréditaires, la maladie de Wilson, les cirrhoses, la stéatose hépatique non alcoolique, les maladies du foie dues à des toxines ou des médicaments ; les maladies du pancréas comme par exemple les pancréatites aiguës ou chroniques ; les maladies métaboliques telles que les diabètes mellitus et insipide, les thyroïdites ; les maladies des reins telles que par exemple les désordres rénaux aigus ou la glomérulonéphrite ; les infections virales et bactériennes telle que la septicémie ; les intoxications sévères par des agents chimiques, des toxines ou des médicaments ; les affections dégénératives associées au Syndrome Immuno Déficitaire Acquis (SIDA) ; les désordres associés au vieillissement, tel que le syndrome du vieillissement accéléré ; les maladies inflammatoires, telles que la maladie de Crohn, la polyarthrite rhumatoïde ; les maladies auto-immunes telles que le lupus érythémateux ; les désordres dentaires tels que ceux aboutissant à la dégradation des tissus comme par exemple les périodontites ; les maladies ou désordres ophtalmiques incluant les rétinopathies diabétiques, le glaucome, les dégénérescences maculaires, la dégénérescence rétinienne, la rétinite pigmentaire, les trous ou déchirures rétiniennes, le décollement rétinien, l'ischémie rétinienne, les rétinopathies aiguës associées à un traumatisme, les dégénérescences inflammatoires, les complications post chirurgicales, les rétinopathies médicamenteuses, la cataracte ; les désordres des voies auditives, tels que l'otosclérose et la surdité induite par des antibiotiques ; les maladies associées aux mitochondries (pathologies mitochondriales), telles que l'ataxie de Friedrich, la dystrophie musculaire congénitale avec anomalie mitochondriale structurelle, certaines myopathies (syndrome des MELAS, syndrome de MERFF, syndrome de Pearson), le syndrome de MIDD (diabètes mitochondriaux et surdité), le syndrome de Wolfram, la dystonie. L'invention s'intéresse également à la protection des cellules, des tissus et/ou des organes transplantés, que ce soit avant, pendant (prélèvement, transport et/ou réimplantation) ou après la transplantation.
On recherche toujours des composés pharmacologiquement actifs pour lutter contre les processus dégénératifs évoqués ci-dessus.
La présente invention répond à cette demande de composés cytoprotecteurs. En effet, la demanderesse a découvert que les dérivés du 3,5- seco-4-norcholestane et notamment le 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3- ol et l'un de ses esters sont doués de remarquables propriétés cytoprotectrices.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet l'utilisation d'au moins un composé répondant à la formule I
Figure imgf000007_0001
dans laquelle
- X et Y pris ensemble représentent une fonction céto (=0), un groupement oxime (=NOH) ou un groupement méthyloxime (≈NHOMe) ou X représente un hydroxyle et Y un atome d'hydrogène,
- B représente un radical hydroxyle et C et D, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, ou un radical alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 4 atomes de carbone, ou B et C pris ensemble représentent une fonction céto et D un radical méthyle, hydroxyle, ou méthylamine, ou B et C représentent un atome d'hydrogène et D un radical méthylamine, ou B et C pris ensemble représentent un groupement oxime et D un radical méthyle, et R représente un radical alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, ou l'un de ses sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables, ou l'un de ses esters ou l'un des sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables desdits esters, pour la préparation d'un médicament cytoprotecteur, à l'exception d'un médicament neuroprotecteur.
Selon l'invention, les sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables peuvent être par exemple des sels formés avec les acides chlorhydrique, bromhydrique, nitrique, sulfurique, phosphorique, acétique, formique, propionique, benzoïque, maléique, fumarique, succinique, tartrique, citrique, oxalique, glyoxylique, aspartique, alcane sulfoniques tels que les acides méthane ou éthane sulfoniques, arylsulfoniques, tels que les acides benzène ou paratoluène sulfoniques, ou carboxyliques.
Selon l'invention le groupement oxime représente les isomères syn et anti purs ou en mélange associés à l'orientation de la liaison N-O par rapport à la double liaison C=N.
Selon une forme particulière de l'invention, le radical R des composés de formule I utilisables est préférentiellement le radical du cholestane de formule II
Figure imgf000008_0001
Selon d'autres formes particulières de l'invention, les composés de formule I pour lesquels X et Y pris ensemble représentent une fonction céto ou représentent un groupement oxime, sont préférentiellement utilisés.
Selon encore d'autres formes particulières de l'invention, les composés de formule I pour lesquels B représente un radical hydroxyle et C et D, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 4 atomes de carbone, ou encore pour lesquels B et C pris ensemble représentent une fonction céto et D représente un radical méthyle, sont préférentiellement utilisés.
Très préférentiellement, on utilise selon l'invention au moins un composé de formule I choisi parmi le 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol, le 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-méthyl alcool, ou le 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-diméthyl alcool, ou l'un de ses sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables, ou l'un de ses esters ou l'un des sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables desdits esters.
Les intéressantes propriétés cytoprotectrices des composés de formule I justifient leur utilisation pour la préparation d'un médicament cytoprotecteur, particulièrement destiné au traitement ou à la prévention de la nécrose et/ou de l'apoptose et/ou de la nécroptose (médicaments antinécrotiques et/ou antiapoptotiques et/ou antinécroptotiques) ou encore des affections comme les maladies des os, des articulations, du tissu conjonctif et du cartilage, les maladies musculaires, les maladies de la peau, les maladies cardiovasculaires, les maladies circulatoires, les maladies hématologiques et vasculaires, les maladies du poumon, les maladies du tractus gastro-intestinal, les maladies du foie, les maladies du pancréas, les maladies métaboliques, les maladies des reins, les infections virales et bactériennes, les intoxications sévères, les affections dégénératives associées au Syndrome Immuno Déficitaire Acquis (SIDA), les désordres associés au vieillissement, les maladies inflammatoires, les maladies auto-immunes, les désordres dentaires, les maladies ou désordres ophtalmiques, les maladies des voies auditives, les maladies associées aux mitochondries (pathologies mitochondriales). L'invention s'intéresse également à la protection des cellules, des tissus ou des organes transplantés, que ce soit avant, pendant (prélèvement, transport et/ou réimplantation) ou après la transplantation.
Avantageusement, les composés de formule I peuvent être utilisés dans la préparation d'un médicament destiné à la protection des cellules cardiaques (médicament cardioprotecteur), à la protection des cellules hépatiques (médicament hépatoprotecteur) ou d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des maladies associées aux mitochondries.
Selon l'invention le composé de formule I est avantageusement présent dans le médicament cytoprotecteur à des doses physiologiquement efficaces ; lesdits médicaments renferment notamment une dose cytoprotectrice efficace d'au moins un des composés de formule I.
A titre de médicaments, les composés répondant à la formule I, leurs esters, leurs sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables ainsi que les sels d'additions avec les acides pharmaceutiquement acceptables desdits esters peuvent être formulés pour la voie digestive ou parentérale.
Les médicaments selon l'invention peuvent comprendre en outre au moins un autre ingrédient thérapeutiquement actif, qu'il soit actif sur la même pathologie ou sur une pathologie différente, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, notamment lors d'un traitement chez un sujet atteint de l'une des pathologies précédemment citées.
Selon l'invention, le composé de formule I peut être utilisé dans le médicament, en mélange avec un ou plusieurs excipients ou véhicules inertes, c'est à dire pharmaceutiquement inactifs et non toxiques. On peut citer par exemple des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations (liquides et/ou injectables et/ou solides) sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, les cyclodextrines, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales ou animales, l'acacia, etc. Les compositions peuvent être formulées sous forme de suspension injectable, de gels, huiles, comprimés, suppositoires, poudres, gélules, capsules, etc., éventuellement au moyen de formes galéniques ou de dispositifs assurant une libération prolongée et/ou retardée. Pour ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel que la cellulose, des carbonates ou des amidons.
L'administration peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, de préférence par voie orale ou par injection, typiquement par voie intra-péritonéale, intra-cérébrale, intra-thécale, intra-veineuse, intra-artérielle ou intra-musculaire. L'administration par voie orale est préférée. S'agissant d'un traitement à long terme, la voie d'administration préférée sera sublinguale, orale ou transcutanée.
Pour les injections, les composés sont généralement conditionnés sous forme de suspensions liquides, qui peuvent être injectées au moyen de seringues ou de perfusions, par exemple. Il est entendu que le débit et/ou la dose injectée, ou de manière générale la dose à administrer, peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du patient, de la pathologie, du mode d'administration, etc.. Il est entendu que des administrations répétées peuvent être réalisées, éventuellement en combinaison avec d'autres ingrédients actifs et/ou tout véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique (tampons, solutions saline, isotonique, en présence d'agents stabilisants, etc.).
L'invention est utilisable chez les mammifères, notamment chez l'être humain.
En général la dose journalière du composé sera la dose minimale pour obtenir l'effet thérapeutique souhaité. Les doses des composés ci-dessus décrits et par exemple du 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime- 3-ol seront en général comprises entre 0,001 à 100 mg par kilo par jour pour l'homme.
Si nécessaire, la dose journalière peut être administrée en deux, trois, quatre, cinq, six ou plus, prises par jour ou par sous-doses multiples administrées par intervalles appropriés pendant la journée.
La quantité choisie dépendra de multiples facteurs, en particulier de la voie d'administration, de la durée d'administration, du moment de l'administration, de la vitesse d'élimination du composé, du ou des différents produits utilisés en combinaison avec le composé, de l'âge, du poids et de la condition physique du patient, ainsi que de son histoire médicale, et de toutes autres informations connues en médecine.
La prescription du médecin traitant pourra commencer à des doses inférieures à celles généralement utilisées, puis ces doses seront progressivement augmentées afin de mieux maîtriser l'apparition d'éventuels effets secondaires.
Les compositions selon l'invention, notamment les compositions pharmaceutiques ou médicaments, peuvent comprendre au moins un composé de formule I tels que décrits précédemment, ou l'un de ses sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables, ou l'un de ses esters ou l'un des sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables desdits esters,
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent comprendre en outre au moins un autre ingrédient thérapeutiquement actif, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, notamment lors d'un traitement chez un sujet atteint de l'une des pathologies précédemment citées.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent avantageusement comprendre un ou plusieurs excipients ou véhicules inertes, c'est à dire pharmaceutiquement inactifs et non toxiques.
Les composés de formule I utilisés selon l'invention peuvent être synthétisés en faisant réagir un composé de formule III
Figure imgf000012_0001
dans laquelle R a les significations précédemment indiquées que l'on soumet - soit à l'action de la méthylamine puis de l'hydroxylamine pour obtenir un composé de formule I dans laquelle R à les significations précédemment indiquées, X et Y représentent ensemble un groupement oxime, B représente ensemble avec C une fonction céto et D un groupement méthyl aminé - soit à une méthylation pour obtenir un composé de formule IV
Figure imgf000013_0001
dans laquelle R à les significations précédemment indiquées, que l'on soumet à l'action d'un agent de protection de la fonction cétone en position 5 pour obtenir un composé de formule V
Figure imgf000013_0002
dans laquelle R à les significations précédemment indiquées, que
- ou bien l'on fait réagir avec le méthyl lithium puis l'on soumet à l'action d'un agent de déprotection de la fonction cétone en position 5 puis l'on fait réagir avec l'hydroxylamine pour obtenir un composé de formule I dans laquelle R a les significations précédemment indiquées, X et Y représentent ensemble un groupement oxime, B représente un groupement hydroxyle et C et D représentent des radicaux alkyles linéaires ou ramifiés de 1 à 4 atomes de carbone,
- ou bien l'on saponifie, puis fait réagir avec un composé de formule H3C-NH-OCH3, puis fait réagir avec le méthyl lithium, pour obtenir un composé de formule Vl
Figure imgf000014_0001
que l'on soumet à une réduction de la fonction cétone puis l'on soumet à l'action d'un agent de déprotection de la fonction cétone en position 5 puis l'on fait réagir avec l'hydroxylamine pour obtenir un composé de formule I dans laquelle R a les significations précédemment indiquées, X et Y représentent ensemble un groupement oxime, B représente un groupement hydroxyle, et C représente un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué et D représente un atome d'hydrogène,
- ou bien l'on réduit pour obtenir un composé de formule VII
Figure imgf000014_0002
dans laquelle R à les significations précédemment indiquées, B représente un groupement hydroxyle, et C et D représentent un atome d'hydrogène, que
- soit l'on soumet à l'action d'un agent d'oxydation pour obtenir un composé de formule VIII
Figure imgf000014_0003
(VIII) dans laquelle R a les significations précédemment indiquées, dont l'on prépare la base de Schiff puis réduit, puis l'on soumet à l'action d'un agent de déprotection de la fonction cétone en position 5, puis l'on fait réagir avec l'hydroxylamine pour obtenir un composé de formule I dans laquelle R a les significations précédemment indiquées, X et Y représentent ensemble un groupement oxime, B représente un groupement méthylamine, et C et D représentent un atome d'hydrogène,
- soit l'on soumet à l'action d'un agent de déprotection de la fonction cétone en position 5, puis l'on fait réagir avec une aminé choisie parmi l'hydroxylamine, la méthylhydroxylamine et la carboxyméthylhydroxylamine pour obtenir un composé de formule I dans laquelle R a les significations précédemment indiquées, X et Y représentent ensemble respectivement un groupement oxime, méthyloxime, et carboxyméthyloxime, B représente un groupement hydroxyle, et C et D représentent un atome d'hydrogène, et l'on isole et si désiré salifie les composés de formule I ou on les estérifie, les isole puis si désiré les salifie.
Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre du procédé ci- dessus décrit,
- la réaction du composé de formule III avec la méthylamine est réalisée en présence d'un agent de couplage activant la fonction acide comme le BOP (Benzotriazole-i-yl-oxy-tris-(diméthylamino)-phosphonium hexafluorophosphate) ou le TBTU (2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1 ,1 ,3,3-tétraméthyluronium tétrafluoroborate) avantageusement en présence d'une base comme la N- méthylmorpholine, notamment dans un solvant adapté comme le dichlorométhane ou Ie diméthylformamide. De préférence on la réalise en présence de EDCI (1-Ethyl-3-(3'-diméthylaminopropyl)carbodiimide) associé à la 4-diméthylaminopyridine dans le dichlorométhane, le mélange étant soumis à une agitation à température ambiante pendant 24 h. Le produit est ensuite mis en solution de préférence dans la pyridine, puis on ajoute de 5 à 7 et notamment 6 équivalents de chlorhydrate d'hydroxylamine.
- la méthylation du composé de formule III est réalisée par réaction avec le méthanol en présence de chlorure de thionyle, de préférence en solubilisant l'acide de formule II dans un volume adapté d'un mélange de 70% de méthanol et 30% de dichlorométhane. On refroidit à 00C et l'on ajoute goutte-à-goutte 3 équivalents de chlorure de thionyle. On agite alors 2 heures à température ambiante. Sur ce composé, la protection de la fonction cétone est effectuée de préférence en solubilisant le produit dans un excès, par exemple 10 équivalents de triméthylorthoformate et un volume suffisant d'éthylène glycol, puis addition d'acide p-toluènesulfonique anhydre.
- la réaction du composé de formule V avec le méthyl lithium est de préférence effectuée dans le THF anhydre puis après refroidissement à environ - 45 0C, addition goutte-à-goutte d'un excès de méthyl lithium. La déprotection du dioxolane qui bloque la fonction cétone en position 5, est réalisée dans l'acétone en présence d'acide sulfurique. De préférence on l'effectue dans du dioxane, en présence d'un mélange eau /acide acétique 1/1. L'oxime de la cétone est avantageusement réalisée comme ci-dessus.
- la saponification du composé de formule V est réalisée avec la soude de préférence dans le dioxane. On ajoute notamment environ 2 équivalents d'une solution aqueuse de soude. Ce produit est mis en réaction avec un composé de formule H3C-NH-OCH3 par exemple en présence d'un agent de couplage activant la fonction acide comme le BOP ou le TBTU en présence d'une base comme la N-méthylmorpholine dans un solvant adapté comme le dichlorométhane ou le diméthylformamide. De préférence on la réalise en présence de EDCI associé à l'hydroxybenzotriazole avec de la triéthylamine ajoutée goutte-à-goutte dans le solvant. Ce produit est mis en réaction avec le méthyl lithium sous atmosphère d'argon selon le protocole décrit ci-dessus, puis la fonction cétone en 3 est réduite par le borohydrure de sodium. Le produit obtenu est ensuite soumis à la déprotection de la fonction cétone en position 5 et mis en réaction avec l'hydroxylamine selon le même protocole décrit ci-dessus.
- la réduction du composé de formule V pour obtenir le composé de formule VII est réalisée de préférence par de l'hydrure d'aluminium lithium notamment en le plaçant en suspension dans du tétrahydrofurane. On hydrolyse avec précaution par addition d'une solution de sulfate de sodium.
- l'oxydation du composé de formule VII est réalisée à l'aide de chlorochromate de pyridimium. Sur ce produit on obtient la base de Schiff qui est réduite instantanément notamment en solubilisant sous argon de préférence dans l'éthanol en présence de triéthylamine, de chlorhydrate de méthylamine et de tétraisopropoxyde de titane, puis addition de borohydrure de sodium. La déprotection de la fonction cétone en position 5 ainsi que la réaction avec l'hydroxylamine sont effectuées dans les conditions précédemment décrites.
Les exemples qui suivent illustrent la présente demande sans toutefois la limiter.
Exemples
Les temps de rétention ci-après sont exprimés en minutes et centièmes de minute.
La méthode de chromatographie liquide utilisée pour l'ensemble des produits est la suivante :
Colonne : Macherey-Nagel - Nucleosil® 300-6 C4 - 150x4,6 mm Gradient : eau (+0.05% acide trifluoroacétique) / acétonitrile (+0,05% acide trifluoroacétique) t = 0 min : 60% acétonitrile, 40% H2O t = 6 min : 100% acétonitrile, 0% H2O t = 11 min : 100% acétonitrile, 0% H2O t = 13 min : 60% acétonitrile, 40% H2O t = 15 min : 60% acétonitrile, 40% H2O.
Les conditions d'ionisation pour le spectromètre de masse sont :
Température de la source : 25O0C
Tension de cône : 50 V
Capillaire voltage : 3 kV
Rf lens : 0.3 V
Exemple 1 : synthèse de la 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one, oxime-3- methylamide
Etape A : Dans un premier temps, dans un ballon on introduit 250 mg de 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one, oxime-3-oic acide, 38 mg de chlorhydrate de méthylamine, 250 mg d'EDCI, 100 mg de DMAP et 2,5 mL de dichlorométhane. La solution est agitée 24 heures à température ambiante puis le milieu réactionnel est dilué par ajout de dichlorométhane et lavé avec une solution de bicarbonate de sodium à 10%. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium puis concentrée sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie (CH2CI2 / MeOH 95/5). On récupère 176 mg de 3,5- seco-4-nor-cholestane-5-one -3-méthylamide avec un rendement de 68%.
Analyse
RMN-1H (CDCI3) : conforme
Temps de rétention : 4 min 42 centièmes
Pics détectés en spectrométrie de masse : [M+H]+ = 418 ; [2M+H]+=835
Etape B : Ensuite, dans un ballon, on introduit 50 mg de 3,5-seco-4-nor- cholestane-5-one-3-méthylamide, 50 mg de chlorhydrate d'hydroxylamine dans 1 mL de pyridine. On agite 16 heures à température ambiante puis le milieu réactionnel est concentré sous pression réduite. Le résidu obtenu est repris dans un mélange CH2CI2 / H2O ; la phase organique est séparée, lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium anhydre et concentrée sous pression réduite. On récupère 40,6 mg de 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one, oxime-3-méthylamide avec un rendement de 78%.
Analyse
RMN-1 H (CDCI3) : conforme
Temps de rétention : 3 min 70 centièmes
Pics détectés en spectrométrie de masse : [M+H]+= 433 ; [2M+H]+=865
Exemple 2 : synthèse du 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one-3-dimethyl alcool
Etape A : Dans un ballon, on solubilise 10,5 g d'acide 3,5-seco-4-nor- cholestane-5-one-3-oique dans 378 mL de méthanol et 146 mL de dichlorométhane. On refroidit à O0C et l'on ajoute goutte-à-goutte 5,7 mL de chlorure de thionyle. On agite alors 2 heures à température ambiante. Le milieu réactionnel est concentré sous pression réduite, co-évaporé au toluène puis au dichlorométhane. On obtient 10,3 g de 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one-3-méthyl ester avec rendement de 94%. Le produit est utilisé tel quel sans purification.
RMN-1H (CDCI3) : conforme
Temps de rétention : 4 min 69 centièmes
Pic détecté en spectrométrie de masse : {M+H}+ = 419 ; [2M+H]+ = 785
Etape B : Dans un ballon, on met en solution 9,62 g de 3,5-seco-4-nor- cholestane-5-one-3-méthyl ester dans 25 mL de triméthylorthoformate et 53 mL d'éthylène glycol. On ajoute alors 400 mg (2,3 mmol) d'acide p-toluènesulfonique anhydre puis on agite 1 nuit à température ambiante. On ajoute de l'acétate d'éthyle au milieu réactionnel ; on réalise un lavage par une solution à 10% d'hydrogénocarbonate de sodium. La phase organique est séparée, séchée sur sulfate de magnésium anhydre et concentrée sous pression réduite. On obtient 9,95 g de 3,5-seco-4-nor-cholestane-5,5(éthylène dioxy)-3-méthyl ester avec rendement de 93%. Le produit est utilisé tel quel sans purification.
RMN-1H (CDCI3) : conforme
Temps de rétention : 5 min 76 centièmes
Pic détecté en spectrométrie de masse : {M+H}+ = 463
Etape C : Dans un ballon, on solubilise 300 mg de 3,5-seco-4-nor- cholestane-5,5(éthylène dioxy)-3-méthyl ester dans 5 mL de THF anhydre. Le milieu est refroidi à -45 0C puis on ajoute goutte-à-goutte 1,36 mL d'une solution de méthyllithium 1,6M dans l'éther. Après 30 minutes d'agitation à -45°C. On ajoute quelques gouttes de méthanol au milieu réactionnel et ramène à température ambiante. On reprend dans 20 mL d'éther diéthylique et on lave avec une solution saturée de bicarbonate de sodium, puis avec une solution saturée de chlorure de sodium. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, puis concentrée sous pression réduite. On obtient 295 mg 3,5-seco- 4-nor-cholestane-5,5(éthylène dioxy)-3-diméthyl alcool (PM=462) avec un rendement de 98%.
Temps de rétention : 5 min 56 centièmes
Pics détectés en spectrométrie de masse : [M- (CH2OH-CH2OH + H2O)+H]+]=401
Etape D : Dans un ballon, on ajoute 6 mL d'un mélange eau /acide acétique 1/1 et 295 mg de 3,5-seco-4-nor-cholestane-5,5(éthylène dioxy)-3-diméthyl alcool ; on chauffe à reflux pendant 1h30. Après refroidissement, le milieu réactionnel est dilué avec de l'acétate d'éthyle, lavé avec une solution de saturée de chlorure de sodium, puis avec une solution saturée de bicarbonate de sodium. Enfin, la phase organique est séchée sur sulfate de magnésium et concentrée sous pression réduite. Le produit brut obtenu est purifié par flash chromatographie (éther de pétrole / acétate d'éthyle 8/2). On obtient 180 mg 3,5- seco-4-nor-cholestane-5-one-3-diméthyl alcool avec un rendement de 68%. RMN-1H (CDCI3) : conforme Temps de rétention : 5 min 08 centièmes
Pics détectés en spectrométrie de masse : [M+H]+= 419 ; [M- H2O+H]+=401 ; [2M+H]+=837
Exemple 3 : synthèse du 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one, oxime-3- diméthyl alcool
Dans un ballon, on introduit 1 g du composé de l'exemple 2, 1 g de chlorhydrate d'hydroxylamine dans 53 ml_ de pyridine et quelques ml_ de dichlorométhane pour solubiliser la cétone. On agite 16 heures à température ambiante puis le milieu réactionnel est concentré sous pression réduite. Le résidu obtenu est repris dans un mélange CH2CI2 / H2O ; la phase organique est séparée, lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium anhydre et concentrée sous pression réduite. On récupère 814 mg de 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one, oxime-3-diméthyl alcool avec un rendement de 78%. RMN-1H (CDCI3) : conforme Temps de rétention : 5 min 09 centièmes
Pics détectés en spectrométrie de masse : [M+H]+= 434 ; [2M+H]+=867 Exemple 4 : synthèse du 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one, oxime- 3- méthyl alcool
Etape A : Dans un ballon, on place 2 g de 3,5-seco-4-nor-cholestane- 5,5(éthylène dioxy)-3-méthyl ester dans 26 ml_ de dioxane. On ajoute 8,6 mL d'une solution de soude 1N. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 1h30 et le dioxane est évaporé sous pression réduite. On acidifie la solution obtenue par ajout d'une solution d'acide chlorhydrique 1N jusqu'à pH=1 et l'on extrait 2 fois au toluène. Les phases organiques sont réunies, séchées sur sulfate de magnésium anhydre et concentrées sous pression réduite. On récupère 1,92 g d'acide 3,5-seco-4-nor-cholestane-5,5(éthylène dioxy)-3-oïque avec un rendement de 99% qui est utilisé sans traitement supplémentaire dans l'étape suivante.
Etape B : Dans un ballon, on place 1,9 g d'acide 3,5-seco-4-nor-cholestane- 5,5(éthylène dioxy)-3-oïque dans 30 mL de dichlorométhane. On ajoute à cette solution 1,06 g d'EDCI, 743 mg d'HOBT, 537 mg de chlorhydrate de N1O- diméthylhydroxylamine puis 1.37 mL de triéthylamine goutte-à-goutte. On agite à température ambiante pendant 16 heures. On ajoute un mélange CH2CI2ZH2O au milieu réactionnel et l'on extrait 3 fois au dichlorométhane. Les phases organiques sont réunies, séchées sur sulfate de magnésium anhydre et concentrées sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie (CHaCb/acétate d'éthyle 8/2). On récupère 1,46 g 3,5-seco-4- nor-cholestane-5,5(éthylène dioxy)-3-(N,N-méthoxy-méthyl) amide avec un rendement de 70%.
RMN-1H (CDCI3) : conforme
Temps de rétention : 5 min 31 centièmes
Pic détecté en spectrométrie de masse : [M+H]+= 492
Etape C : dans un ballon sous argon, on introduit 1 ,4 g de 3,5-seco-4-nor- cholestane-5,5(éthylène dioxy)-3-(N,N-méthoxy-méthyl) amide dans 20 mL de tétrahydrofurane anhydre et l'on refroidit à 00C. On ajoute alors goutte-à-goutte 3,38 mL d'une solution de méthyllithium 1.6M dans l'éther. Le milieu réactionnel est agité 3h40 à 00C puis on ajoute goutte-à-goutte une solution de 0.72 mL d'acide chlorhydrique concentré dans 7.28 mL d'eau. Le tétrahydrofurane est évaporé sous pression réduite ; la solution aqueuse obtenue est basifiée par ajout de soude 1 N jusqu'à pH=10. On extrait à l'éther diéthylique ; les phases organiques sont réunies, séchées sur sulfate de magnésium anhydre, et concentrées sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie (éther de pétrole/acétate d'éthyle 9/1). On récupère 930 mg de 3,5-seco-4-nor-cholestane-5,5(éthylène dioxy)-3-méthyl cétone avec un rendement de 73%.
RMN-1H (CDCI3) : conforme
Temps de rétention : 5 min 65 centièmes
Pic détecté en spectrométrie de masse : [M+H]+= 403
Etape D : Dans un ballon, on place 119 mg de 3,5-seco-4-nor-cholestane- 5,5(éthylène dioxy)-3-méthylcétone de l'étape C dans 1 ,5 mL de méthanol. On refroidit à 0°C et l'on ajoute 10 mg de borohydrure de sodium. Le milieu réactionnel est agité à 00C pendant 1h puis concentré sous pression réduite. Le résidu est repris dans de l'eau et extrait au dichlorométhane. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium et concentrée sous pression réduite. On récupère 94 mg 3,5-seco-4-nor-cholestane-5,5(éthylène dioxy)-3-méthylalcool avec un rendement de 78%, ce produit est utilisé tel quel. RMN-1H (CDCI3) : conforme Temps de rétention : 5 min 22 centièmes Pics détectés en spectrométrie de masse : [M+H]+= 387 Etape E : On opère comme à l'étape D de l'exemple 2 pour déprotéger la cétone en 5.
Etape F : Dans un ballon on introduit 121 mg de 3,5-seco-4-nor-cholestane- 5-one-3-méthyl alcool, 1,5 mL de pyridine et 121 mg de chlorhydrate d'hydroxylamine. La solution est agitée deux jours à température ambiante. Le milieu réactionnel est concentré sous pression réduite, repris dans l'eau et extrait au dichlorométhane. La phase organique est ensuite lavée à l'eau, puis séchée sur sulfate de magnésium et concentrée sous pression réduite. Le produit ainsi obtenu est purifié par flash chromatographie (éther de pétrole/acétate d'éthyle 9/1). On obtient 66 mg de 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one, oxime-3-méthyl alcool avec un rendement de 53%. RMN-1H (CDCI3) : conforme Temps de rétention : 4 min 91 centièmes Pics détectés en spectrométrie de masse : [M+H]+= 420 Exemple 5 : synthèse de la 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one, oxime-3- méthylamine
Etape A : Dans un ballon, on place en suspension 615 mg de LiAIH4 dans 57 mL de THF. On refroidit à O0C et l'on ajoute goutte-à-goutte une solution de 3,0 g de 3,5-seco-4-nor-cholestane-5,5(éthylène dioxy)-3-méthyl ester, dans 57 mL de tétrahydrofurane. On agite alors à O0C pendant 5h. On hydrolyse avec précaution par ajout d'une solution de sulfate de sodium ; la solution blanche obtenue est agitée 30 minutes, puis filtrée. Le filtrat est concentré sous pression réduite et repris dans de l'eau, extrait avec de l'acétate d'éthyle. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium puis concentrée sous pression réduite. On obtient 2,55 g 3,5-seco-4-nor-cholestane-5,5(éthylène dioxy)-3-ol avec un rendement de 85%, ce produit est utilisé tel quel. RMN-1H (CDCI3) : conforme Temps de rétention : 4 min 82 centièmes Pics détectés en spectrométrie de masse : [M- (CH2OH-CH2OH + H2O)+H]+= 373
Etape B : Dans un ballon sous argon, on solubilise 476 mg de 3,5-seco-4- nor-cholestane-5,5(éthylène dioxy)-3-ol, dans 7 mL de dichlorométhane, puis on ajoute 189 mg d'alumine neutre et 399 mg de chlorochromate de pyridinium ; on agite à température ambiante pendant 3h30. Le milieu réactionnel est filtré sur Célite® ; le filtrat est concentré sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie (toluène / acétate d'éthyle 9/1 puis 8/2). On obtient 328 mg de 3,5-seco-4-nor-cholestane-5,5(éthylène dioxy)-3-al avec un rendement de 69%.
Temps de rétention : 5 min 57 centièmes Pics détectés en spectrométrie de masse : [M+H]+= 433 Etape C : Dans un ballon sous argon, on solubilise 323 mg de 3,5-seco-4- nor-cholestane-5,5(éthylène dioxy)-3-al dans 3 mL d'éthanol, puis on ajoute 209 μL de triéthylamine, 100 mg de chlorhydrate de méthylamine et 444 μL de tétraisopropoxyde de titane. Le milieu réactionnel est agité 6h à température ambiante, puis on ajoute 42,5 mg de borohydrure de sodium. On agite 16 heures à température ambiante. Le milieu réactionnel est filtré et lavé avec du dichlorométhane. Le filtrat est séché sur sulfate de magnésium et concentré sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie (dichlorométhane / méthanol 9/1 à 5/5). On obtient 84 mg de 3,5-seco-4-nor- cholestane-5,5(éthylène dioxy)-oxime-3-méthylamine avec un rendement de 25%.
RMN-1H (CDCI3) : conforme Temps de rétention : 3 min 93 centièmes Pics détectés en spectrométrie de masse : [M+H]+= 448 Etape D : Dans un ballon, on introduit 50 mg de 3,5-seco-4-nor-cholestane- 5,5(éthylène dioxy)-3-méthylamine et 976 μL d'un mélange eau/acide acétique 1/1. Le mélange est porté au reflux pendant 6h. Après refroidissement, le milieu réactionnel est dilué avec de l'acétate d'éthyle et lavé avec une solution saturée de chlorure de sodium puis avec une solution de bicarbonate de sodium à 5%. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium et concentrée sous pression réduite. Le produit obtenu est purifié par flash chromatographie (dichlorométhane / méthanol 95/5) ; on obtient 5 mg 3,5-seco-4-nor-cholestane- 5-one-3-méthylamine avec un rendement de 11%. RMN-1H (CDCI3) : conforme Temps de rétention : 3 min 68 centièmes Pics détectés en spectrométrie de masse : [M+H]+= 404 Etape E : Dans un ballon, on introduit 5 mg de 3,5-seco-4-nor-cholestane-5- one-3-méthylamine, 5 mg de chlorhydrate d'hydroxylamine et 287 μl_ de pyridine. Le mélange est agité 16 heures à température ambiante. On reprend ensuite dans du dichlorométhane et on lave à l'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium et concentrée sous pression réduite. On obtient 5 mg de 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one, oxime-3-méthylamine avec un rendement de 91%.
Temps de rétention : 3 min 66 centièmes Pics détectés en spectrométrie de masse : [M+H]+ = 419 Exemple 6 : synthèse du 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one, méthyloxime-3-ol
Dans un ballon, on introduit 20 mg de 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one-3- ol, 20 mg de chlorhydrate de O-méthylhydroxylamine dans 1 mL de pyridine. On agite 36h à température ambiante et l'on rajoute 10 mg de chlorhydrate de O-méthylhydroxylamine. On agite à nouveau 16 heures à température ambiante puis le milieu réactionnel est concentré sous pression réduite. Le résidu obtenu est repris dans un mélange CH2CI2 / H2O ; la phase organique est séparée, lavée à l'eau, séchée sur sulfate de magnésium anhydre et concentrée sous pression réduite. On obtient 18 mg d'une huile jaune qui est purifiée par flash chromatographie (éther de pétrole / acétate d'éthyle 9/1). On récupère 5,8 mg de 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one, methyloxime-3-ol avec un rendement de 27%. Analyse
RMN-1H (CDCI3) : conforme Temps de rétention : 5 min 50 centièmes Pic détecté en spectrométrie de masse : [M+H]+= 420 Exemple 7 : synthèse du 3,5-seco-4-nor-cholestane-5-one carboxyméthyIoxime-3-ol
Dans un ballon, on introduit 52 mg de cétone, 25 mg d'hémi-chlorhydrate de carboxyméthoxylamine dans 0,5 mL de pyridine. On agite 2 jours à température ambiante puis le milieu réactionnel est concentré sous pression réduite. Le résidu obtenu est repris dans un mélange CH2CI2 / H2O ; la phase organique est séparée, lavée à l'eau puis par une solution d'acide chlorhydrique à 2%, séchée sur sulfate de sodium anhydre et concentrée sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie (éther de pétrole / acétate d'éthyle 8/2). On obtient 24 mg avec un rendement de 39% de la carboxyméthyloxime.
Analyse
RMN-1H (CDCI3) : conforme
Temps de rétention : 4 min 40 centièmes
Pic détecté en spectrométrie de masse : [M+H]+= 464 ; [2M+H]+=927
Exemple 8
On a préparé une suspension répondant à la formule
3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime- 3-ol 20 mg par ml
Excipient : Emulsion huileuse
Exemple 9
On a préparé une forme sèche répondant à la formule
Chlorydrate de 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime- 3- N.N-diméthylglycine ester 250 mg
Excipient : qsp une gélule terminée à 750 mg
Exemple 10 : synthèse du 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3- N,N-diméthylglycine ester : prodrogue du 3,5-seco-4-nor-choIestan-5-one oxime-3-ol
Dans un ballon, on place 509 mg de 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one-3-ol, 182 mg de chlorhydrate de N,N-diméthylglycine, 275 mg d'EDCI et 207 mg de DMAP dans 10 à 15 mL de dichlorométhane. On agite à température ambiante pendant 16 heures. On ajoute au milieu réactionnel une solution de bicarbonate de sodium à 5% et l'on extrait au dichlorométhane. Les phases organiques sont réunies, séchées sur sulfate de sodium anhydre et concentrées sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie (toluène / acétate d'éthyle 8/2). On récupère 488 mg avec un rendement de 78%.
Analyse
RMN-1H (CDCI3) : conforme
Temps de rétention : 3 min 77 centièmes
Pic détecté en spectrométrie de masse : [M+H]+= 476
Le produit est ensuite engagé dans la réaction suivante :
Dans un ballon, on introduit 488 mg du produit obtenu et 488 mg de chlorhydrate d'hydroxylamine dans 23 mL de pyridine. On agite 16 heures à température ambiante puis le milieu réactionnel est repris dans un mélange CH2CI2 / H2O ; Ia phase organique est séparée, lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium anhydre et concentrée sous pression réduite. On récupère 378 mg de l'oxime avec un rendement de 75%. Le produit est ensuite salifié en présence d'une solution d'éther acidifiée par une solution d'HCI, pour obtenir le produit sous forme de chlorhydrate.
Analyse
RMN-1 H (CDCI3) : conforme
Temps de rétention : 3 min 43 centièmes
Pic détecté en spectrométrie de masse : [M+H]+= 491
Exemple 11 : synthèse du 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one,oxime-3-(4- methyl-1-piperazine) propanoate ester : Prodrogue du 3,5-seco-4-nor- cholestan-5-one, oxime-3-ol
Dans un ballon, on place 264 mg de 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one-3-ol, 121 mg d'acide 4-méthyl-1-piperazine propanoïque sous forme de sel de lithium, 1425 mg d'EDCI et 106 mg de DMAP dans 2 à 3 mL de dichlorométhane. On agite à température ambiante pendant 1 nuit. On ajoute de l'eau au milieu réactionnel et l'on extrait au dichlorométhane. Les phases organiques sont réunies, séchées sur sulfate de sodium anhydre et concentrées sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie (toluène / acétate d'éthyle 98/2). On récupère 54 mg du produit désiré avec un rendement de 15%.
Analyse
RMN-1H (CDCI3) : conforme
Temps de rétention : 3 min 66 centièmes Pic détecté en spectrométrie de masse : [M+H]+= 545
Le produit est ensuite engagé dans la réaction suivante :
Dans un ballon, on introduit 30 mg du produit obtenu et 30 mg de chlorhydrate d'hydroxylamine dans 1.2 ml_ de pyridine. On agite 5h30 à température ambiante puis le milieu réactionnel est repris dans un mélange CH2CI2 / H2O ; la phase organique est séparée, lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium anhydre et concentrée sous pression réduite. On récupère 19 mg de l'oxime avec rendement de 13%.
Analyse
RMN-1H (CDCI3) : conforme
Temps de rétention : 3 min 62 centièmes
Pic détecté en spectrométrie de masse : [M+H]+= 560
Le produit est ensuite salifié en présence d'une solution d'éther acidifiée par une solution aqueuse d'acide chlorhydrique, pour obtenir le produit sous forme de di-chlorhydrate.
Exemple 12 : Effet anti-apoptotique du 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol : Contractilité et apoptose des cardiomyocytes ventriculaires de lapin
Les propriétés antiapoptotiques du 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime- 3-ol (Azasteroidal alkaloids. Synthesis of A-nor-B-homo-5-azacholestane. Rodewald, W. J.; Wicha, J. Univ. Warsaw, Bulletin de l'Académie Polonaise des Sciences, Série des Sciences Chimiques (1963), 11(8), 437-441) ont été analysées sur des cardiomyocytes, par un test de dysfonctionnement contractile induit par la doxorubicine. > Matériels et Méthodes
Composé à tester
Une solution stock de 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol à la concentration de 1OmM dans 100% de DMSO a été utilisée.
La concentration finale en DMSO a été la même pour tous les points expérimentaux, indépendamment des concentrations en molécules utilisées.
Le 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol a été testé aux concentrations de 0,1 et 0,3 μM, dilué dans une solution de Tyrode (composition en mmol/L: NaC1 135, KCL 5,4, NaH2PO4 0,33, CaCI2 1,2, MgCI2 1,0, Hepes 10 ; pH ajusté à 7,4 avec NaOH).
Obtention de cellules isolées de cardiomyocytes ventriculaires de lapin
Des cellules ventriculaires isolées sont obtenues à partir de cœurs de lapins maies de Nouvelle Zélande comme décrit dans A. d'Anglemont de Tassigny et al., Fund Clin Pharmacol, 18: 531-38, 2004. En bref, les lapins (2,0- 2,5 kg) sont anesthésiés avec une solution de pentobarbital (50 mg/kg) puis reçoivent de l'héparine (200 lU/kg). Les coeurs sont excisés et immédiatement perfusés, pendant 10 à 15 minutes grâce à un appareil de Langendorff sans recirculation avec une solution isotonique de tyrode (sans calcium) oxygénée (95%, 2-5% CO2) (en mM : NaCI 135, KCI 5,4, Na2PO4 0,33, MgCI2 1,0, HEPES 10, pH ajusté à 7,4 avec NaOH 1 N à 37°C, 280-300 mOsmol/kgH2O). Ensuite, tous les coeurs sont perfusés pendant 3 minutes en mode "recirculation" avec la même solution de Tyrode sans calcium (débit coronaire, 10-15 mL/min) additionnée de 1 mg/mL de collagénase type II et 0,28 mg/mL de protéase type XIV. Finalement, tous les cœurs sont perfusés en mode sans recirculation avec la même solution de Tyrode supplémentée avec 0,3 mM CaCI2 pendant 10 min. Le ventricule gauche est enlevé et découpé en petits morceaux, la dissociation cellulaire est réalisée par agitation mécanique douce. Du calcium extracellulaire est ajouté par incrément toutes les 15 minutes, pour arriver à une concentration physiologique de 1,O mM. Les myocytes isolés sont maintenus dans un milieu sans sérum contenant (en mM) NaCI 110, KCI 5,4, Na2PO4 0,33, NaHCO3 25, Glucose 5, MgCI2 0,8, CaCI2 1, pH ajusté à 7,4 jusqu'à 1h30 avant l'expérimentation. Toutes les cellules sont en forme de baguette, ont une striation croisée claire et ne présentent pas de vésicule à leur surface au microscope optique.
Marquage à l'annexine V
Le marquage à l'annexine V de la phosphatidylsérine a été utilisé comme méthode quantitative de mesure de l'apoptose en utilisant le kit MiniMacs cell isolation (Miltenyi Biotec, Bergisch, Gladbach, Germany). En bref, les cellules exposant de la phosphatidylsérine sont marquées magnétiquement avec des microbilles d'annexine V, puis passées dans une colonne placée dans un champ magnétique. Les cellules marquées (qui présentent de la phosphatidylsérine marquée magnétiquement) sont retenues dans la colonne alors que celles non marquées (cellules nécrotiques et non-apoptotiques) ne sont pas retenues. La colonne est retirée du champ magnétique, les cellules exposant de la phosphatidylsérine retenues magnétiquement sont éluées comme fraction positive et comptées avec une cellule de Mallassez. Le pourcentage de cellules apoptotiques est alors rapporté au nombre initial de cellules. Mesure de l'activité caspase-3
L'activité caspase-3 est utilisée comme méthode quantitative de mesure de l'apoptose. En bref, les cellules sont lysées et le surnageant est utilisé pour la mesure d'activité caspase-3 en utilisant le kit AK-005 (Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, PA, USA). Le substrat fluorogène pour mesurer l'activité caspase-3 (DEVD) est marqué avec le fluorochrome 7-amino-4-methyl coumarine (AMC) qui produit une fluorescence jaune-verte détectable à la lumière UV à 360/460 nm pendant 210 min. L'AMC est libéré du substrat par clivage par la caspase-3, l'expression de l'enzyme est exprimée en fmol/min. Mesure de la contractilité
Les myocytes sont transférés dans une chambre à 37°C perfusée de façon continue et positionnée sur la platine d'un microscope inversé. La chambre est perfusée avec du tampon physiologique contenant (en mM): NaC1 140 ; KCI 5.4 ; CaCI2 1 ; MgCI2 0,8 ; HEPES 10 et glucose 5,6 (pH = 7,4 ; 290 mOsmol/kgH2O). La contraction des myocytes est induite une fois par seconde (1 Hz) avec des électrodes de champ en platine placées dans la chambre et reliées à un stimulateur. Les images sont saisies de façon continue avec un objectif x 20 et transmises à une caméra CCD à raison de 240 échantillons/s. Les images de la caméra CCD sont projetées sur un écran vidéo.
Les myocytes ont été sélectionnés pour l'étude selon le critère suivant : une apparence en forme de baguette avec des striations bien apparentes et pas de vacuole intracellulaire, pas de contraction spontanée quand on les stimule avec 1 mM Ca2+, et avec une longueur de repos et une amplitude de contraction constantes. La longueur des sarcomères a été mesurée grâce à un programme d'analyse d'image vidéo et les données ont été saisies à un rythme de 240 échantillons/s. Les images caméra ont été converties en mesures de longueur de sarcomère. Le pourcentage de contraction est calculé à partir de ces données sur la longueur du sarcomère.
Analyse des données
Toutes les données ont été exprimées en moyenne ± écart-type. Les comparaisons des données entre les différents groupes ont été réalisées par ANOVA suivi d'un test de Student avec une différence significative à p<0.05.
> Protocole expérimental
L'apoptose est induite dans les cardiomyocytes isolés par exposition pendant 3 à 8h à 1 μM de doxorubicine ajoutée dans une solution isotonique contenant (en mM) NaCI 110, KCI 5,4, Na2PO4 0,33, NaHCO3 25, Glucose 5, MgCI2 0,8, CaCI2 1 , pH ajusté à 7,4. Le marquage à l'annexine V a été réalisé 3 h après le début de l'exposition à la doxorubicine puisque ce phénomène apparaît très tôt dans la cascade apoptotique. Les mesures d'activité caspase-3 sont réalisées 8 h après l'exposition à la doxorubicine puisque ce phénomène a lieu plus tard dans le phénomène d'apoptose. La contractilité des cardiomyocytes a été mesurée toutes les heures pendant les 8 h d'exposition à la doxorubicine. Après tous les traitements, les cellules ont été comparées aux cardiomyocytes contrôles non exposés à la doxorubicine.
Les cardiomyocytes ont été prétraités avec le composé 3,5-seco-4-nor- cholestan-5-one oxime- 3-ol pendant 15 min avant l'exposition à la doxorubicine. Deux concentrations de ce composé ont été testées lors de cette étude : 0,1 et 0,3 μM.
> Résultats
La longueur moyenne des sarcomères des cellules utilisées dans cette étude n'était pas significativement différente entre les groupes. o Effet de la doxorubicine sur la contractilité des myocytes et l'apoptose L'exposition à la doxorubicine a résulté en une diminution au cours du temps du raccourcissement du sarcomère. Le raccourcissement du pic sous doxorubicine était similaire au contrôle pendant les trois premières heures puis devint significativement diminué après 4 h d'exposition (-53,20 ± 7,70% contre - 19,49 ± 2,06% par rapport à la ligne de base de la doxorubicine et du contrôle respectivement, p<0.05, n=5). Le traitement avec 1 μM de doxorubicine a induit l'apoptose avec une augmentation significative en marquage à l'annexine V et en activité caspase-3. o Effet du 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol sur le dysfonctionnement au niveau de la contractilité induite par la doxorubicine et sur l'apoptose.
Le traitement avec 1 μM de doxorubicine a résulté en une réduction significative du raccourcissement du pic des cardiomyocytes ventriculaires qui est abolie en présence de 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime- 3-ol (0,1 et 0,3 μM). En effet, après 4 h d'exposition, le raccourcissement du pic sous doxorubicine (-53,20 ± 7,70%) devint significativement diminué avec le composé à 0,1 μM (-18,9 ± 5,4%) et à 0,3 μM (-8,1 ± 9,6%) par rapport à la ligne de base.
De plus, les augmentations de marquage à l'annexine V et d'activité caspase-3, dues à la doxorubicine ont été bloquées par le 3,5-seco-4-nor- cholestan-5-one oxime- 3-ol à 0,1 et 0,3 μM.
L'apoptose évaluée en % de changement en marquage à l'annexine V 3h après doxorubicine donne les résultats suivants : contrôle : 100% ; doxorubicine : 320%±48,7 ; doxorubicine + 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime- 3-ol 0,1 μM : 116,3%±15,1 ; doxorubicine + 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime- 3-ol 0,3 μM : 137,3%±19,3. Les résultats concernant les mesures d'activité caspase-3 sont les suivants : contrôle : 19+9 fmol/min ; doxorubicine : 120±15 fmol/min ; doxorubicine + 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime- 3-ol 0.1 μM : 27±20 fmol/min ; doxorubicine + 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime- 3-ol 0.3 μM : 15±7 fmol/min. > Commentaires et conclusions
Le composé 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol montre un effet cardioprotecteur sur le dysfonctionnement de contractilité induit par la doxorubicine et sur l'apoptose sur des cardiomyocytes isolés de lapin. La molécule, quand utilisée à des doses appropriées peut effectivement protéger contre la cardiotoxicité induite par la doxorubicine qui est connue comme étant le facteur limitant dans le traitement de patients cancéreux avec cette anthracycline. Ainsi, le composé 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol pourrait être utilisé pour limiter la cardiotoxicité de la doxorubicine chez ces patients. Exemple 13 : Effet des composés 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol et 3,5-seco-4-nor-choIestan-5-one oxime-3-N,N-diméthylglycine ester dans un modèle in vivo d'infarctus du myocarde chez la souris
Le but de cette expérience est d'étudier in vivo dans un modèle d'occlusion- reperfusion coronaire chez la souris, les propriétés cardioprotectrices des composés 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol et 3,5-seco-4-nor- cholestan-5-one oxime-3-N,N-dimethylglycine ester.
Les composés à tester sont administrés par voie intraveineuse chez la souris, 5 minutes avant reperfusion du myocarde précédemment ischémie. A titre de contrôles, les véhicules des composés, respectivement la bêta-cyclodextrine (ci-après appelée DCD) et l'eau, sont administrés dans les mêmes conditions que les composés.
Afin de déterminer l'effet des composés testés, on mesure la taille de l'infarctus après une reperfusion de 24 heures.
Instrumentation chirurgicale des animaux
Des souris mâles C57BL6 âgées de 6 à 8 semaines sont anesthésiées par du pentobarbital sodique (50 mg/kg i.p.) et sont ventilées après intubation avec un mélange de O2/CO2 (95%/5%) tout au long de l'expérience. L'électrocardiogramme de surface (ECG) est enregistré et visualisé sur un oscilloscope pendant toute la durée de la chirurgie. Dans des conditions d'asepsie rigoureuses, la veine jugulaire est cathétérisée pour l'administration intraveineuse des composés. Une thoracotomie latérale gauche est effectuée et après péricardiotomie, une branche majeure de l'artère coronaire gauche est repérée dans la région latéro-postérieure du ventricule gauche. Un fil prolène numéro 8 est positionné autour de cette artère de manière à former une boucle mobile pour la réalisation d'une occlusion coronaire temporaire.
Protocoles expérimentaux
Toutes les souris ont fait l'objet d'une occlusion coronaire temporaire de 30 minutes. L'ischémie de la région du myocarde est confirmée par la présence d'une cyanose de la surface du myocarde et par une déviation du segment ST de l'électrocardiogramme. Chacun des composés (groupe traité, n = 10) ou son solvant (groupe contrôle, n = 10) a été administré en bolus par voie intraveineuse 5 min avant la levée des 30 min d'occlusion coronaire.
Le 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol, préalablement dissout à une concentration finale de 0,46 mg/ml dans une solution de DCD à 30% dans du tampon phosphate préparée par saturation suivi d'une centrifugation, est administré à la dose de 1mg/kg.
Le 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime- 3-N,N-dimethylglycine ester, préalablement dissout à une concentration finale de 1 ,56 mg/ml dans de l'eau stérile par agitation et sonication est administré à la dose de 3,9 mg/kg.
Le même volume de véhicule est administré dans les groupes contrôles correspondants.
La reperfusion a été confirmée par l'aspect du segment QRS de l'électrocardiogramme.
Après fermeture du thorax plan par plan et évacuation du pneumothorax par aspiration à l'aide d'un drain, les souris sont ensuite progressivement réveillées et sevrées de leur assistance ventilatoire jusqu'à reprise d'une ventilation spontanée normale. Si nécessaire, de la buprénorphine (1 mg/kg) est administrée par voie intra-péritonéale pour assurer une couverture antalgique efficace.
Vingt-quatre heures après la fin de l'occlusion coronaire, les souris sont ré- anesthésiées par du pentobarbital sodique (50 mg/kg i.p.) et de l'héparine est administrée par voie intraveineuse (héparine Choay© 1000UI/kg). Une ligature de l'artère coronaire est réalisée au même endroit que celle ayant fait l'objet de la première occlusion 24h auparavant. Les souris sont ensuite euthanasiées par une dose létale de chlorure de potassium saturée et leur cœur est rapidement excisé puis monté par l'artère aorte sur un système de perfusion rétrograde de type Langendorf.
Une solution de bleu Evans à 5 % est perfusée de manière rétrograde afin que le myocarde sain soit coloré en bleu ; la zone rendue ischémique lors de l'occlusion coronaire, ou « aire à risque AR » restant non colorée par défaut. Le ventricule gauche est ensuite découpé en 5 tranches d'épaisseurs égales (1 mm) à l'aide d'un tranchoir spécialement conçu pour les coeurs de souris (Les Isolants de Paris, Palaiseau) qui sont ensuite pesées.
Ces tranches sont incubées dans une solution de chlorure de triphenyltetrazolium (TTC, Sigma, Poole, UK) à 1 % pH 7, 4 pendant 20 min à 37° C puis fixées dans du formol à 4 %. Le TTC a la propriété de colorer en rouge le myocarde non infarci, et donc de faire apparaître les zones infarcies en blanc. Chaque tranche de cœur est placée sous stéréo-microscope pour une prise de photo numérique de haute définition.
La quantification de l'infarctus et de l'aire à risque est effectuée par planimétrie (Scion Image, Scion, Frederick MD, USA) et rapportée au poids de chaque tranche.
L'aire à risque (zone non-bleue) est exprimée en pourcentage du poids du ventricule gauche. Les tailles d'infarctus sont exprimées en pourcentage du poids de l'aire à risque.
Toutes les valeurs de taille d'infarctus et d'aire à risque sont exprimées en moyenne ± SEM. Une ANOVA à un facteur suivie d'un test t de Student non paire avec correction de Bonferonni est utilisée pour comparer les aires à risque et les tailles d'infarctus entre les groupes expérimentaux, le seuil de signification étant fixé à p<0, 05.
Résultats et conclusions
Les tailles d'infarctus des souris traitées avec les composés diffèrent significativement de celles des souris traitées par le véhicule.
Les résultats présentés dans le tableau ci-dessous sont exprimés d'une part par l'aire à risque et d'autre part par la taille de l'infarctus.
Figure imgf000035_0001
Dans le modèle expérimental utilisé, les deux composés testés réduisent la taille d'infarctus. De plus, les résultats ont montré que les composés réduisent les tailles d'infarctus quelle que soit l'étendue de la zone à risque.
Ces résultats montrent donc que ces deux composés présentent in vivo des effets cardioprotecteurs.
Exemple 14 : Effet du composé 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxîme- 3-ol dans un modèle in vivo d'hépatotoxicité aigu.
Dans cette expérience, on teste la capacité du composé 3,5-seco-4-nor- cholestan-5-one oxime-3-ol à protéger les hépatocytes.
Les hépatocytes comme de nombreuses autres cellules portent le récepteur Fas/CD95 sur leur membrane cytoplasmique. La stimulation de cette voie Fas induit la mort cellulaire en activant la cascade des caspases.
Un modèle aigu de dommage hépatique peut être induit par une injection unique de l'anticorps anti-Fas Jo2 (Ogasawara et al., Nature, août 1993), produisant des dommages hépatiques sévères et ressemblant à l'hépatite virale, autoimmune ou induite par des drogues.
L'Alanine Aminotransferase (ALAT) aussi appelée la Sérum Glutamic Pyruvic Transaminase sérique (SGPT) est une enzyme présente dans les hépatocytes. Son activité augmente de façon importante dans le plasma après lyse hépatique et est donc un bon marqueur pour évaluer le dommage hépatique. Matériels et Méthodes Animaux
Des souris adultes CD1 mâles en provenance de "Elevage Janvier", (Le Genest-Saint-Isle, France) ont été utilisées. Les animaux ont été identifiés individuellement et ont eu libre accès à l'eau et à la nourriture.
Les installations ont été maintenues à un cycle contrôlé de lumière (7:00 - 19:00), et à des températures de 20 ± 2 0C et d'humidité de 50 ± 20 %.
Préparation de l'anticorps Jo2
Une solution stock d'anticorps monoclonal de hamster anti-souris CD95 (Fas), appelé Jo2, provenant de Pharmingen (BD Biosciences, réf. 554254 batch 32699) est préparée à la concentration de 1 mg/mL dans de l'eau. Les dilutions utilisées sont réalisées dans du chlorure de sodium à 0,9% dans de l'eau.
Préparation du composé à tester
La quantité désirée de 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol est pesée et broyée en une fine poudre, puis mélangée avec du Cremophore EL (Sigma C5135) et de l'éthanol absolu (Carlo Erba RPE 41571) (respectivement 5% et 10% du volume final). Après dissolution complète, du chlorure de sodium à 0,9% dans l'eau est ajouté extemporanément (85% du volume final).
Deux types d'expériences sont conduites : l'intoxication par Jo2 suivi d'un dosage des ALAT et l'intoxication létale par Jo2. intoxication par Jo2 et dosage des ALAT :
Protocole
Un prétraitement par le 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol est réalisé aux doses de 10 et 30 mg/kg par administration intrapéritonéale 1h avant l'administration de l'anticorps Jo2. L'anticorps Jo2 est administré par injection intrapéritonéale à la dose de 125 μg/kg dans un volume de 5 mL/kg de poids corporel.
Un contrôle est réalisé sur des animaux recevant un prétraitement par administration intrapéritonéale 1h avant l'administration de l'anticorps d'un volume identique de solution ayant été utilisée pour la préparation du composé à tester, sans composé. Dosage des ALAT
Du sang des souris anesthésiées est prélevé 24h après administration de Jo2. Le dosage des ALAT est réalisé en utilisant un kit (Roche Diagnostics) avec un spectrophotomètre (Hitachi Modular), selon la méthode standardisée par NFCC (Fédération Internationale de Chimie Clinique).
Résultats et conclusions
L'administration intrapéritonéale de Jo2 à 125 μg/kg n'induit pas de mortalité chez les souris dans les 24h suivant l'injection.
L'activité ALAT est significativement réduite par le composé 3,5-seco-4-nor- cholestan-5-one oxime-3-ol à 10 et 30 mg/kg.
Table 1 : Activité ALAT mesurée 24h après administration de Jo2
Figure imgf000037_0001
** : p< 0.01 , ANOVA suivi du test comparatif de Dunnett effectué par rapport au groupe placebo
Le 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol administré à 10 et 30 mg/kg, 1h avant l'anticorps Jo2, a permis de limiter la mort cellulaire induite par une dose sublétale d'anticorps.
L'activité ALAT1 biomarqueur de la cytolyse hépatique dans le plasma, est significativement plus basse chez les souris traitées par le 3,5-seco-4-nor- cholestan-5-one oxime-3-ol que chez les souris contrôles non traitées. Intoxication létale par l'anticorps Jo2
Dans cette expérience on évalue l'effet du 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol sur la survie des animaux après administration d'une dose létale de l'anticorps Jo2.
Protocole
L'anticorps Jo2 est administré par injection intrapéritonéale à la dose de 200 ou 250 μg/kg dans un volume de 5 mL/kg de poids corporel. Le 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol est testé à 10 et 30 mg/kg, en prétraitement, 1h avant l'administration de Jo2 ou en post-traitement, 1h après l'administration de Jo2.
Un contrôle est réalisé sur des animaux recevant un prétraitement par administration intrapéritonéale 1h avant ou 1h après l'administration de l'anticorps d'un volume identique de solution ayant été utilisée pour la préparation du composé à tester, sans composé.
Résultats et conclusions
Table 2 : Survie des animaux à 24h
Figure imgf000038_0001
Aux doses administrées, l'anticorps Jo2 induit une importante mortalité en 24h (70 à 100% des animaux) dans le groupe contrôle.
Le prétraitement et/ou le post-traitement au 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol aux doses administrées induit une augmentation de la survie des animaux.
Ainsi, lorsqu'une dose létale d'anticorps est utilisée (200 ou 250 μg/kg), le 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol, administré à 10 et 30 mg/kg, 1h avant ou après l'anticorps, augmente la survie des souris sur 24h.
Conclusions
Le modèle d'hépatotoxicité aigϋe induite chez la souris par un anticorps anti Fas (Jo2) a permis de mettre en évidence les propriétés hépatoprotectrices du 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-ol.
Ces effets remarquables permettent d'envisager pour les composés de formule I une utilisation dans la préparation d'un médicament cytoprotecteur en général.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'au moins un composé répondant à la formule I
Figure imgf000040_0001
dans laquelle
- X et Y pris ensemble représentent une fonction céto (=0), un groupement oxime (=NOH) ou un groupement méthyloxime (≈NHOMe) ou X représente un hydroxyle et Y un atome d'hydrogène ;
- B représente un radical hydroxyle et C et D, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, ou un radical alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 4 atomes de carbone ; ou B et C pris ensemble représentent une fonction céto et D un radical méthyle, hydroxyle, ou méthylamine ; ou B et C représentent un atome d'hydrogène et D un radical méthylamine ; ou B et C pris ensemble représentent un groupement oxime et D un radical méthyle ; et R représente un radical alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 10 atomes de carbone ; ou l'un de ses sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables, ou l'un de ses esters ou l'un des sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables desdits esters, pour l'obtention d'un médicament cytoprotecteur, à l'exception d'un médicament neuroprotecteur.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que dans la formule I, R représente le radical du cholestane de formule II
Figure imgf000041_0001
3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que dans la formule I, X et Y pris ensemble représentent une fonction céto.
4. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que dans la formule I, B représente un radical hydroxyle et C et D, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou, un radical alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 4 atomes de carbone.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que dans la formule I, B et C pris ensemble représentent une fonction céto et D représente un radical méthyle.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que dans la formule I, X et Y pris ensemble représentent un groupement oxime.
7. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé de formule I est choisi parmi le 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime- 3-ol, le 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-méthyl alcool, ou le 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-diméthyl alcool, ou l'un de ses sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables, ou l'un de ses esters ou l'un des sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables desdits esters.
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement ou à la prévention de la nécrose et/ou de l'apoptose pathologique et/ou de la nécroptose (médicaments antinécrotiques et/ou antiapoptotiques et/ou antinécroptotique) ou encore des affections comme les maladies des os, des articulations, du tissu conjonctif et/ou du cartilage ; les maladies musculaires ; les maladies de la peau ; les maladies cardiovasculaires ; les maladies circulatoires ; les maladies hématologiques et vasculaires ; les maladies du poumon ; les maladies du tractus gastro-intestinal ; les maladies du foie ; les maladies du pancréas ; les maladies métaboliques ; les maladies des reins ; les infections virales et bactériennes ; les intoxications sévères ; les affections dégénératives associées au Syndrome Immuno Déficitaire Acquis (SIDA) ; les désordres associés au vieillissement ; les maladies inflammatoires ; les maladies auto-immunes ; les désordres dentaires ; les maladies ou désordres ophtalmiques ; les maladies des voies auditives ; les maladies associées aux mitochondries.
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament est destiné à la protection des cellules cardiaques (médicament cardioprotecteur).
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisée en ce que le médicament est destiné à la protection des cellules hépatiques (médicament hépatoprotecteur).
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement ou à la prévention des maladies associées aux mitochondries.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le médicament est destiné à la protection de cellules, d'un tissu ou d'un organe, avant, pendant ou après une transplantation.
13. Composition, notamment composition pharmaceutique ou médicament, comprenant au moins un composé de formule I tels que décrits à la revendication 1, ou un de ses sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables ou l'un de ses esters ou l'un des sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables desdits esters.
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