CN101437521B - 3，5-裂-4-失碳-胆甾烷的衍生物用于制备细胞保护性药物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及3，5-裂-4-失碳-胆甾烷的衍生物用于获得除神经保护性药物以外的细胞保护性药物的用途，特别是获得心脏保护性或肝脏保护性药物。

Description

3,5-裂-4-失碳-胆甾烷的衍生物用于制备细胞保护性药物的用途
本发明涉及3，5-裂-4-失碳-胆甾烷的衍生物用于获得除神经保护性药物以外的细胞保护性药物的用途。 
细胞变性过程的特征在于通常引起不希望的细胞活性和细胞死亡的细胞功能障碍。 
细胞已发展出对应激作出应答的适应机制，这延长了它们的寿命或者延迟或阻止细胞死亡(细胞保护机制)。 
然而，这些细胞保护机制有时是不足的、不适当的或太迟被诱导而无效，并且细胞死亡。因此，提供有助于细胞保护的新型细胞保护性药物显得是有益的。这是本发明的目的之一。 
术语“细胞保护”涉及天然或非天然试剂保护细胞免于细胞死亡(特别是病理性细胞死亡)和/或免于导致细胞死亡的细胞功能障碍的能力。这些细胞功能障碍可以是例如线粒体起源的，例如产生ATP的能力的降低，不能捕获和/或保留钙，或产生自由基。 
在细胞死亡的主要机制中，在坏死、凋亡和坏死状凋亡(nécroptose)之间存在本质差异。 
坏死是在组织损伤期间发生的所谓的“偶发性”细胞死亡。细胞的质膜是最受影响的，引起细胞的稳态的改变。细胞将吸收水，直至这将引起其质膜裂解的程度。这种细胞裂解导致细胞质内容物释放到周围环境中。坏死是炎症性过程的起始。 
坏死可以影响一组细胞或组织，而其他邻近部分仍是存活的。所产生的转变是细胞或组织的坏疽。 
换言之，坏死通过在细胞由于事件而达到其生命的终点时发生的形态学改变来定义，所述事件例如为重大创伤例如器官范围内血液循环的停止或减少、高热(温度的显著上升)、化学产品中毒、物理休 克等。最为人所知的坏死之一是在由于冠状动脉闭塞(梗阻)而引起的梗死(在心肌范围内的血流供应的停止)时心肌的坏死。 
凋亡是生物的正常生理学的整体部分之一。它是高度受调节的细胞死亡的生理学形式，并且它是多细胞生物存活所必需的。凋亡是在胚胎发育期间起极其重要作用的过程。 
凋亡中的细胞或凋亡的细胞将使其自身与其他细胞相隔离。凋亡通常涉及组织中的单个细胞并且不引起炎症。凋亡的特征性形态学要点之一是细胞核和细胞质的显著固缩(condensation)，这引起细胞体积的显著减少。核随后片段化，每个片段由双重被膜包围。随后，凋亡小体(细胞质和细胞核元件)被释放，并且将通过吞噬作用被邻近细胞吸收。 
凋亡可以以不同方式被诱导。例如，辐射、化学化合物或激素的存在是可能引起细胞中的凋亡事件级联的刺激。细胞内信号例如不完全的有丝分裂或DNA损伤也可以诱导凋亡。 
凋亡还在遗传毒性试剂作用后或在疾病期间发生。某些病理状态的特征在于异常凋亡，其引起某些细胞群体的丧失，例如肝细胞毒性、视网膜病、心脏毒性。 
因此，在生理性凋亡和病理性凋亡之间存在差异。本发明基本上集中于病理性凋亡。 
存在细胞死亡的其他机制，例如坏死状凋亡，其具有坏死和凋亡的特征。由于坏死状凋亡而死亡的细胞具有与由于坏死而死亡的细胞相似的特征，但这种机制的生物化学步骤更类似于凋亡。这种细胞死亡的机制例如在缺血时发生。 
因此，本发明的目的之一还是提供新型药物，其可以允许预防和/或治疗坏死和/或病理性凋亡和/或坏死状凋亡(抗坏死和/或抗凋亡和/或抗坏死状凋亡的药物)。 
细胞变性过程可能尤其是由于被分组在变性疾病或疾患这一术语之下的病理情况、创伤或暴露于各种因素。 
这些创伤和因素可以例如包括暴露于辐射(UV、γ)、低氧或缺乏氧、缺乏营养素、缺乏生长因子、毒物、细胞毒素、废物、环境毒素、自由基、活性氧或者某些医学事件和/或操作过程，例如外科手术创伤，包括细胞、组织和器官的移植。还可以提及在医学治疗背景下用作治疗剂的化学或生物试剂，例如细胞生长抑制剂或抗炎剂。 
本发明的目的不是治疗可能导致细胞死亡的病理状态或变性过程的细胞外起因，而是治疗所述病理过程或所述病理状态的在细胞水平上的后果，和特别是保护细胞不受所述后果影响。 
在以变性过程为特征的最重要的病理情况中，除本发明不涉及的神经学或神经变性疾病以外，发现下述病况： 
骨、关节、结缔组织和软骨疾病，例如骨质疏松症，骨髓炎，关节炎(包括例如骨关节炎、类风湿性关节炎和银屑病关节炎)，无血管性坏死，进行性骨化性纤维发育不良，佝偻病，库欣综合征； 
肌疾病，例如肌营养不良，例如迪谢纳肌营养不良，强直性肌营养不良，肌病和肌无力； 
皮肤疾病，例如皮炎，湿疹，银屑病，衰老或者瘢痕形成的改变； 
心血管疾病，例如心脏和/或血管缺血，心肌梗塞，缺血性心脏病，慢性或急性心功能不全，心脏节律障碍，心房纤维性颤动，心室纤维性颤动，阵发性心动过速，心功能不全，肥厚性心脏病，缺氧，低氧，由于用抗癌剂进行治疗而引起的副作用； 
循环系统疾病，例如动脉粥样硬化，动脉硬化，和外周血管疾病，脑血管意外，动脉瘤； 
血液学和血管疾病，例如贫血，血管淀粉样变性，出血，镰状细胞病，红细胞破裂综合征(red cell fragmentation syndrome)，嗜中性白细胞减少症，白细胞减少症，髓发育不全，全血细胞减少症，血小板减少症，血友病； 
肺疾病，包括肺炎，哮喘；肺的阻塞性慢性疾病，例如慢性支气管炎和肺气肿； 
胃肠道疾病，例如溃疡； 
肝脏疾病，例如肝炎，特别是病毒起源的或具有其他传染原作为致病因子的肝炎、自身免疫性肝炎、暴发性肝炎，某些遗传性代谢疾病，威尔逊病，肝硬化，非酒精性肝脂肪变性，由于毒素或药物引起的肝脏疾病； 
胰腺疾病，例如急性或慢性胰腺炎； 
代谢疾病，例如糖尿病和尿崩症，甲状腺炎； 
肾疾病，例如急性肾病症或肾小球肾炎； 
病毒和细菌感染，例如败血病； 
由化学试剂、毒素或药物引起的严重中毒； 
与获得性免疫缺陷综合征(AIDS)相关的变性疾病； 
与衰老相关的病症，例如加速衰老综合征； 
炎性疾病，例如克罗恩病，类风湿性多关节炎； 
自身免疫疾病，例如红斑狼疮； 
牙疾病，例如导致组织降解的那些牙疾病，例如牙周炎； 
眼疾病或病症，包括糖尿病性视网膜病，青光眼，黄斑变性，视网膜变性，色素性视网膜炎，视网膜裂孔或撕裂，视网膜脱离，视网膜缺血，与创伤相关的急性视网膜病，炎症性变性，外科手术后的并发症，由药物引起的视网膜病，白内障； 
听觉通道(voie auditive)病症，例如耳硬化和由抗生素诱导的耳聋； 
与线粒体相关的疾病(线粒体病理状态)，例如弗里德赖希共济失调，伴随有结构性线粒体异常的先天性肌营养不良，某些肌病(MELAS综合征、MERFF综合征、皮尔森综合征)，MIDD综合征(线粒体性糖尿病和耳聋)，沃尔弗拉姆综合征，张力障碍。 
本发明的目的还在于保护经移植的细胞、组织和/或器官，无论是在移植之前、之时(取出、运输和/或再植入)还是之后。 
仍然寻求用于控制上文提及的变性过程的药理学活性化合物。 
本发明满足了细胞保护性化合物的这种需要。这是因为，申请人已发现，3，5-裂-4-失碳-胆甾烷的衍生物，特别是3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇，以及其酯之一具有显著的细胞保护性质。
这因为如此，本发明的目的为至少一种式I的化合物 
其中 
-X与Y一起表示酮官能团(＝O)、肟基团(＝NOH)或甲基肟基团(＝NHOMe)，或者X表示羟基且Y表示氢原子； 
-B表示羟基，且C和D相同或不同，它们表示氢原子或含1-4个碳原子的直链或支化的烷基； 
或者B与C一起表示酮官能团，且D表示甲基、羟基或甲胺基团； 
或者B和C表示氢原子，且D表示甲胺基团； 
或者B与C一起表示肟基团，且D表示甲基； 
和R表示含1-10个碳原子的直链或支化的烷基， 
或其与药学上可接受的酸的加成盐之一、或其酯之一、或所述酯与药学上可接受的酸的加成盐之一，用于制备除神经保护性药物以外的细胞保护性药物的用途。 
根据本发明，与药学上可接受的酸的加成盐例如可以是与下述酸形成的盐：盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、乙酸、甲酸、丙酸、苯甲酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、草酸、乙醛酸、天冬氨酸、链烷磺酸例如甲磺酸或乙磺酸、芳基磺酸例如苯磺酸或对甲苯磺酸、或者羧酸。 
根据本发明，肟基团表示纯或混合的与相对于双键C＝N而言N-O键的方向相关的顺式和反式异构体。 
根据本发明的一个具体实施方案，可以使用的式I的化合物的基团R优选是式II的胆甾烷的基团，
Figure G2007800163948D00061
根据本发明的其他具体实施方案，优选使用这样的式I的化合物，其中X和Y一起表示酮官能团，或表示肟基团。 
根据本发明的另外的其他具体实施方案，优选使用这样的式I的化合物，其中B表示羟基，且C和D相同或不同，它们表示氢原子或含1-4个碳原子的直链或支化的烷基，或者其中B与C一起表示酮官能团，且D表示甲基。 
非常优选地，根据本发明使用至少一种选自下列的式I的化合物： 
3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇， 
3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-甲基醇，或 
3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-二甲基醇， 
或其与药学上可接受的酸的加成盐之一、或其酯之一、或所述酯与药学上可接受的酸的加成盐之一。 
式I化合物的有益的细胞保护性质证明其用于制备细胞保护性药物的用途是正确的，特别是用于治疗或预防坏死、和/或凋亡、和/或坏死状凋亡(抗坏死和/或抗凋亡和/或抗坏死状凋亡的药物)，或者诸如下列的疾病： 
骨、关节、结缔组织和/或软骨疾病， 
肌疾病， 
皮肤疾病， 
心血管疾病， 
循环系统疾病， 
血液学和血管疾病， 
肺疾病， 
胃肠道疾病，
肝脏疾病， 
胰腺疾病， 
代谢疾病， 
肾疾病， 
病毒和细菌感染， 
严重中毒， 
与获得性免疫缺陷综合征(AIDS)相关的变性疾病， 
与衰老相关的病症， 
炎性疾病， 
自身免疫疾病， 
牙病症， 
眼疾病或病症， 
听觉通道疾病， 
与线粒体相关的疾病(线粒体病理状态)。 
本发明的目的还在于保护经移植的细胞、组织和/或器官，无论是在移植之前、之时(取出、运输和/或再植入)还是之后。 
有利地，式I的化合物可以用于制备用于保护心脏细胞的药物(心脏保护性药物)、用于保护肝细胞的药物(肝脏保护性药物)或用于治疗或预防与线粒体相关的疾病的药物。 
根据本发明，式I的化合物有利地以生理学有效剂量存在于细胞保护性药物中；所述药物尤其包含有效的细胞保护剂量的至少一种式I的化合物。 
作为药物，式I的化合物，其酯、其与药学上可接受的酸的加成盐、以及所述酯与药学上可接受的酸的加成盐，可以配制成用于经消化或肠胃外途径进行施用。 
此外，根据本发明的药物可以包含至少一种具有治疗活性的其他成分(无论其是对于相同病理状态具有活性，还是对于于不同病理状态具有活性)，其用于同时、分开或错时使用，特别是当治疗患有前述病理状态之一的受试者时。
根据本发明，式I的化合物可以与一种或多种惰性赋形剂或载体(即药物学上无活性的且无毒的赋形剂或载体)相混合地用于药物中。例如，可以提及与药物用途相容的且是本领域技术人员已知的盐水溶液、生理溶液、等渗溶液、缓冲溶液等。所述组合物可以包含选自分散剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂等的一种或多种试剂或载体。可以在制剂(液体的和/或可注射的和/或固体的制剂)中使用的试剂或载体特别是甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、环糊精、聚山梨醇酯80、甘露醇、明胶、乳糖、植物油或动物油、阿拉伯胶等。所述组合物可以配制为可注射的悬浮液、凝胶剂、油、片剂、栓剂、粉剂、明胶胶囊(gélule)、胶囊等，任选通过提供持续释放和/或延缓释放的盖仑氏制剂形式或装置进行配制。对于这种类型的制剂，有利地使用诸如纤维素、碳酸盐或淀粉的试剂。 
施用可以通过本领域技术人员已知的任何方法来完成，优选经由口服途径或通过注射，通常经由腹膜内、大脑内、鞘内、静脉内、动脉内或肌内途径。经由口服途径的施用是优选的。因为这是长期治疗，所以优选的施用途径将是舌下、口服或经皮的。 
对于注射，所述化合物一般调制为液体悬浮液，它例如可以通过注射器或通过灌注来注射。应当理解，流量和/或注射剂量，或一般地，待施用的剂量，可以由本领域技术人员根据患者、病理状态、给药方式等而进行调整。应当理解，可以进行重复施用，任选与其他活性成分和/或任何药学上可接受的载体(缓冲液，盐水溶液，等渗溶液，在稳定剂存在下等)组合。 
本发明可以用于哺乳动物中，特别是用于人类中。 
一般地，该化合物的日剂量将是达到所希望的治疗作用的最小剂量。对于人类来说，上述化合物和例如3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇的剂量一般将为0.001-100mg/公斤/天。 
需要时，日剂量可以每天2、3、4、5、6或更多次施用，或者在一天中采用适当的间隔以多次亚剂量进行施用。 
所选择的量将取决于多重因素，特别是取决于给药途径，给药持 续时间，给药时刻，该化合物的清除速率，与该化合物组合使用的不同产品，患者的年龄、体重和身体健康状况，以及他/她的医疗史，和医学中已知的任何其他信息。 
主治医师的处方可以从比通常使用的剂量低的剂量开始，随后这些剂量将逐渐增加，以便更好地控制可能的副作用的发生。 
根据本发明的组合物，特别是药物组合物或药物，可以包含至少一种如前所述的式I的化合物，或其与药学上可接受的酸的加成盐之一、或其酯之一、或所述酯与药学上可接受的酸的加成盐之一。 
此外，根据本发明的药物药物可以包含至少一种具有治疗活性的其他成分，其用于同时、分开或错时使用，特别是当治疗患有前述病理状态之一的受试者时。 
根据本发明的药物组合物可以有利地包含一种或多种惰性赋形剂或载体，即药物学上无活性的且无毒的赋形剂或载体。 
根据本发明使用的式I的化合物可以通过使式III的化合物发生反应来合成， 
Figure G2007800163948D00091
其中R具有前面所述的含义，该化合物 
-要么
经历甲胺的作用，然后为羟胺的作用，以获得式I的化合物，其中R具有前面所述的含义，X与Y一起表示肟基团，B与C一起表示酮官能团，且D表示甲胺基团， 
-要么
经历甲基化，以获得式IV的化合物
其中R具有前面所述的含义，该化合物与保护在5位处的酮官能团的试剂发生作用，以获得式V的化合物 
其中R具有前面所述的含义，该化合物 
-或者
与甲基锂反应，然后与对在5位处的酮官能团进行去保护的试剂发生作用，然后与羟胺反应，以获得式I的化合物，其中R具有前面所述的含义，X与Y一起表示肟基团，B表示羟基，且C和D表示含1-4个碳原子的直链或支化的烷基， 
-或者
进行皂化，然后与式H3C-NH-OCH3的化合物反应，然后与甲基锂反应，以获得式VI的化合物
Figure G2007800163948D00111
该化合物经历酮官能团的还原，然后与对在5位处的酮官能团进行去保护的试剂发生作用，然后与羟胺反应，以获得式I的化合物，其中R具有前面所述的含义，X与Y一起表示肟基团，B表示羟基，且C表示任选取代的含1-4个碳原子的直链或支化的烷基，且D表示氢原子， 
-或者
被还原，以获得式VII的化合物 
Figure G2007800163948D00112
其中R具有前面所述的含义，B表示羟基，且C和D表示氢原子，该化合物 
-要不 
经历氧化剂的作用，以获得式VIII的化合物
Figure G2007800163948D00121
其中R具有前面所述的含义，制备该化合物的席夫碱，随后还原，然后与对在5位处的酮官能团进行去保护的试剂发生作用，然后与羟胺反应，以获得式I的化合物，其中R具有前面所述的含义，X与Y一起表示肟基团，B表示甲胺基团，且C和D表示氢原子， 
-要不 
与对在5位处的酮官能团进行去保护的试剂发生作用，然后与选自羟胺、甲基羟胺和羧甲基羟胺的胺反应，以获得式I的化合物，其中R具有前面所述的含义，X与Y一起分别表示肟基团、甲基肟基团和羧甲基肟基团，B表示羟基，且C和D表示氢原子， 
并且分离式I的化合物，并在需要时使其成盐，或者使所述化合物酯化，分离，并随后在需要时使其成盐。 
在用于实施上述方法的优选条件下， 
-有利地，特别是在适当的溶剂例如二氯甲烷或二甲基甲酰胺中，在碱例如N-甲基吗啉存在下，在激活酸官能团的偶联剂存在下，进行式III的化合物与甲胺的反应，所述偶联剂例如为BOP(苯并三唑-1-基-氧-三-(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐)或TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐)。优选地，在二氯甲烷中，在EDCI(1-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)以及4-二甲基氨基吡啶存在下进行该反应，混合物随后在环境温度下搅拌24小时。然后，将产物优选溶解在吡啶中，随后加入5-7当量并且特别是6当量的盐酸羟胺。 
-式III化合物的甲基化通过在亚硫酰氯存在下与甲醇反应来进行，优选通过在适当体积的70％甲醇和30％二氯甲烷的混合物中溶 解式III的酸。将其冷却至0℃，并逐滴加入3当量的亚硫酰氯。随后在环境温度下搅拌2小时。对于这种化合物，酮官能团的保护优选如此来进行，即将产物溶解在过量例如10当量的原甲酸三甲酯以及足够体积的乙二醇中，然后加入无水的对甲苯磺酸。 
-式V化合物与甲基锂的反应优选在无水THF中进行，然后在冷却至约-45℃之后，逐滴加入过量的甲基锂。在丙酮中，在硫酸存在下进行封闭在5位处的酮官能团的二氧戊环的去保护。优选地，在二噁烷中，在水/乙酸1/1混合物存在下进行去保护。有利地，如上产生酮的肟。 
-式V化合物的皂化优选在二噁烷中用氢氧化钠来完成。特别地，加入约2当量的氢氧化钠水溶液。例如，在适当的溶剂例如二氯甲烷或二甲基甲酰胺中，在碱例如N-甲基吗啉存在下，在激活酸官能团的偶联剂例如BOP或TBTU存在下，这种产物与式H3C-NH-OCH3的化合物反应。优选地，在EDCI以及羟基苯并三唑存在下进行该反应，其中将三乙胺逐滴加入到溶剂中。这种产物根据上述分案在氩气气氛下与甲基锂进行反应，然后将在3位处的酮官能团用硼氢化钠还原。然后，使所获得的产物进行在5位处的酮官能团的去保护，并根据与上述相同的分案与羟胺进行反应。 
-还原式V的化合物以获得通式VII的化合物，这一还原过程优选通过氢化铝锂来完成，特别是通过将其悬浮在四氢呋喃中。通过加入硫酸钠溶液小心地进行水解。 
-式VII化合物的氧化借助于氯铬酸吡啶鎓来完成。在这个产物之上，获得席夫碱，它即刻被还原，特别是通过在三乙胺、盐酸甲胺和四异丙醇钛存在下，在氩气中，优选溶解在乙醇中，然后加入硼氢化钠。在5位处的酮官能团的去保护以及与羟胺的反应在前述条件下进行。 
下面的实施例举例说明本申请，而不是限制本申请。
实施例 
下文中的保留时间以分钟和分钟的百分之一来表示。 
对于所有产物所使用的液相色谱法如下： 
柱：Macherey-Nagel-
Figure G2007800163948D00141
300-6C4-150×4.6mm 
梯度：水(+0.05％三氟乙酸)/乙腈(+0.05％三氟乙酸) 
t＝0分钟：60％乙腈，40％H2O 
t＝6分钟：100％乙腈，0％H2O 
t＝11分钟：100％乙腈，0％H2O 
t＝13分钟：60％乙腈，40％H2O 
t＝15分钟：60％乙腈，40％H2O。 
质谱仪的离子化条件为： 
源温度：250℃ 
锥孔电压：50V 
毛细管电压：3kV 
Rf透镜：0.3V。 
实施例1：3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-甲酰胺的合成 
步骤A：首先，将250mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-羧酸、38mg盐酸甲胺、250mg EDCI、100mg DMAP和2.5mL二氯甲烷放置入烧瓶中。溶液在环境温度下搅拌24小时，然后通过添加二氯甲烷来稀释反应介质并用10％碳酸氢钠溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，然后在减压下浓缩。所获得的残留物通过快速色谱法(CH2Cl2/MeOH95/5)进行纯化。回收了176mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮-3-甲酰胺，产率为68％。 
分析 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：4.42分钟
在质谱法中检测的峰：[M+H]+＝418；[2M+H]+＝835。 
步骤B：然后，在烧瓶中，将50mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮-3-甲酰胺、50mg盐酸羟胺放置入1mL吡啶中。在环境温度下搅拌16小时，然后在减压下浓缩反应介质。将所获得的残留物接纳在CH2Cl2/H2O混合物中；分离有机相，用水洗涤，用无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。回收了40.6mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-甲酰胺，产率为78％。 
分析 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：3.70分钟 
在质谱法中检测的峰：[M+H]+＝433；[2M+H]+＝865。 
实施例2：3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮-3-二甲基醇的合成 
步骤A：在烧瓶中，将10.593，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮-3-羧酸溶解于378mL甲醇和146mL二氯甲烷中。将混合物冷却至0℃并逐滴加入5.7mL的亚硫酰氯。然后在环境温度下搅拌2小时。在减压下浓缩反应介质，与甲苯并随后与二氯甲烷共蒸发。得到10.3g3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮-3-甲基酯，产率为94％。该产物可就这样使用而无需纯化。 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：4.69分钟 
在质谱法中检测的峰：{M+H}+＝419；[2M+H]+＝785。 
步骤B：在烧瓶中，将9.62g3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮-3-甲酯溶解于25mL原甲酸三甲酯和53mL乙二醇中。然后加400mg(2.3mmol)无水对甲苯磺酸，随后在环境温度下搅拌过夜。向反应介质中加入乙酸乙酯；用10％碳酸氢钠溶液进行洗涤。分离有机相， 用无水硫酸镁干燥并在减压下浓缩。得到9.9593，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-甲基酯，产率为93％。该产物可就这样使用而无需纯化。 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：5.76分钟 
在质谱法中检测的峰：{M+H}+＝463。 
步骤C：在烧瓶中，将300mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-甲基酯溶解于5mL无水THF中。将介质冷却至-45℃，然后逐滴加入1.36mL在醚中的1.6M甲基锂溶液。在-45℃搅拌30分钟后，向反应介质中加入数滴甲醇，并且回复至环境温度。将其接纳在20mL乙醚中，并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，然后用饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，然后在减压下浓缩。得到295mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-二甲基醇(MW＝462)，产率为98％。 
保留时间：5.56分钟 
在质谱法中检测的峰：[M-(CH2OH-CH2OH+H2O)+H]+＝401。 
步骤D：在烧瓶中，加入6mL水/乙酸1/1混合物和295mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-二甲基醇；回流加热1小时30分钟。冷却后，反应介质用乙酸乙酯稀释，用饱和氯化钠溶液洗涤，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。最后，有机相用硫酸镁干燥并在减压下浓缩。获得的粗产物通过快速色谱法(石油醚/乙酸乙酯8/2)进行纯化。获得180mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮-3-二甲基醇，产率为68％。 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：5.08分钟 
在质谱法中检测的峰：[M+H]+＝419；[M-H2O+H]+＝401；[2M+H]+＝837。
实施例3：3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-二甲基醇的合成 
在烧瓶中，将1g实施例2的化合物、1g盐酸羟胺放置入53mL吡啶和数毫升二氯甲烷中以溶解该酮。在环境温度下搅拌16小时，然后在减压下浓缩反应介质。将所获得的残留物接纳在CH2Cl2/H2O混合物中；分离有机相，用水洗涤，用无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。回收了814mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-二甲基醇，产率为78％。 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：5.09分钟 
在质谱法中检测的峰：[M+H]+＝434；[2M+H]+＝867。 
实施例4：3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-甲基醇的合成 
步骤A：在烧瓶中，将2g3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-甲基酯放置入26mL二噁烷中。加入8.6mL1N氢氧化钠溶液。将反应介质回流加热1小时30分钟，并将二噁烷在减压下蒸发。所获得的溶液通过加入1N盐酸溶液而酸化至pH＝1，并用甲苯提取2次。合并有机相，用无水硫酸镁干燥并在减压下浓缩。回收了1.92g3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-羧酸，产率为99％，它无需任何额外的处理即可在随后的步骤中使用。 
步骤B：在烧瓶中，将1.9g3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-羧酸放置入30mL二氯甲烷中。向这个溶液中加入1.06gEDCI、743mg HOBT、537mg盐酸N，O-二甲基羟胺，然后逐滴加入1.37mL三乙胺。在环境温度下搅拌16小时。向反应介质中加入CH2Cl2/H2O混合物，并用二氯甲烷提取3次。合并有机相，用无水硫酸镁干燥并在减压下浓缩。所获得的残留物通过快速色谱法(CH2Cl2/乙酸乙酯 8/2)进行纯化。回收了1.4693，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-(N，N-甲氧基-甲基)酰胺，产率为70％。 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：5.31分钟 
在质谱法中检测的峰：[M+H]+＝492。 
步骤C：在氩气下于烧瓶中，将1.493，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-(N，N-甲氧基-甲基)酰胺放置入20mL无水四氢呋喃中，并冷却至0℃。随后逐滴加入3.38mL在醚中的1.6M甲基锂溶液。反应介质在0℃搅拌3小时40分钟，然后逐滴加入在7.28mL水中的0.72mL浓盐酸的溶液。将四氢呋喃在减压下蒸发；所获得的水溶液通过加入1N氢氧化钠而碱化至pH＝10。用乙醚进行提取；合并有机相，用无水硫酸镁干燥并在减压下浓缩。所获得的残留物通过快速色谱法(石油醚/乙酸乙酯9/1)进行纯化。回收了930mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-甲基酮，产率为73％。 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：5.65分钟 
在质谱法中检测的峰：[M+H]+403。 
步骤D：在烧瓶中，将来自步骤C的119mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-甲基酮放置入1.5mL甲醇中。冷却至0℃并加入10mg硼氢化钠。反应介质在0℃搅拌1小时，然后在减压下浓缩。将残留物接纳在水中，并用二氯甲烷提取。有机相用硫酸镁干燥并在减压下浓缩。回收了94mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-甲基醇，产率为78％，该产物就这样使用。 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：5.22分钟 
在质谱法中检测的峰：[M+H]+＝387。
步骤E：如在实施例2的步骤D中一样进行操作以对在5位处的酮实施去保护。 
步骤F：在烧瓶中，放置入121mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮-3-甲基醇、1.5mL吡啶和121mg盐酸羟胺。溶液在环境温度下搅拌2天。反应介质在减压下浓缩，接纳在水中并用二氯甲烷提取。然后用水洗涤有机相，随后用硫酸镁干燥并在减压下浓缩。如此获得的产物通过快速色谱法(石油醚/乙酸乙酯9/1)进行纯化。获得66mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-甲基醇，产率为53％。 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：4.91分钟 
在质谱法中检测的峰：[M+H]+＝420。 
实施例5：3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-甲胺的合成 
步骤A：在烧瓶中，将615mg LiAlH4悬浮于57mL THF中。混合物冷却至0℃，并逐滴加入3.0g3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-甲基酯在57mL四氢呋喃中的溶液。然后在0℃搅拌5小时。通过添加硫酸钠溶液，小心地进行水解；将所获得的白色溶液搅拌30分钟并随后进行过滤。滤液在减压下浓缩并接纳在水中，用乙酸乙酯提取。有机相用硫酸镁干燥，然后在减压下浓缩。获得2.55g3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-醇，产率为85％，这种产物就这样进行使用。 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：4.82分钟 
在质谱法中检测的峰：[M-(CH2OH-CH2OH+H2O)+H]+＝373。 
步骤B：在氩气下于烧瓶中，将476mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-醇溶解于7mL二氯甲烷中，并随后加入189mg 中性氧化铝和399mg氯铬酸吡啶鎓；在环境温度下搅拌3小时30分钟。反应介质在
Figure G2007800163948D0020091115QIETU
上过滤；滤液在减压下浓缩。所获得的残留物通过快速色谱法(甲苯/乙酸乙酯，9/1，随后为8/2)进行纯化。得到了328mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-醛，产率为69％。 
保留时间：5.57分钟 
在质谱法中检测的峰：[M+H]+＝433。 
步骤C：在氩气下于烧瓶中，将323mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-醛溶解于3mL乙醇中，并随后加入209μL三乙胺、100mg盐酸甲胺和444μL四异丙醇钛。反应介质在环境温度下搅拌6小时，然后加入42.5mg硼氢化钠。在环境温度下搅拌16小时。将反应介质过滤并用二氯甲烷洗涤。滤液用硫酸镁干燥并在减压下浓缩。所获得的残留物通过快速色谱法(二氯甲烷/甲醇9/1-5/5)进行纯化。得到了84mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-肟-3-甲胺，产率为25％。 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：3.93分钟 
在质谱法中检测的峰：[M+H]+＝448。 
步骤D：在烧瓶中，放置入50mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5，5-(亚乙二氧基)-3-甲胺和976μL水/乙酸1/1混合物。所得混合物回流6小时。冷却后，反应介质用乙酸乙酯稀释，并用氯化钠饱和溶液洗涤，随后用5％碳酸氢钠溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥并在减压下浓缩。所获得的产物通过快速色谱法(二氯甲烷/甲醇95/5)进行纯化；得到了5mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮-3-甲胺，产率为11％。 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：3.68分钟 
在质谱法中检测的峰：[M+H]+＝404。
步骤E：在烧瓶中，放置入5mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮-3-甲胺、5mg盐酸羟胺和287μL吡啶。所得混合物在环境温度下搅拌16小时。然后接纳到二氯甲烷中并用水洗涤。有机相用硫酸镁干燥并在减压下浓缩。得到了5mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-甲胺，产率为91％。 
保留时间：3.66分钟 
在质谱法中检测的峰：[M+H]+＝419。 
实施例6：3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮甲基肟-3-醇的合成 
在烧瓶中，将20mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮-3-醇、20mg盐酸O-甲基羟胺放置入1mL吡啶中。在环境温度下搅拌36小时并再次加入10mg盐酸O-甲基羟胺。再次在环境温度下搅拌16小时，然后将反应介质在减压下浓缩。所获得的残留物接纳在CH2Cl2/H2O混合物中；分离有机相，用水洗涤，用无水硫酸镁干燥并在减压下浓缩。获得了通过快速色谱法(石油醚/乙酸乙酯9/1)纯化的18mg黄色油。回收了5.8mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮甲基肟-3-醇，产率为27％。 
分析 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：5.50分钟 
在质谱法中检测的峰：[M+H]+＝420。 
实施例7：3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮羧甲基肟-3-醇的合成 
在烧瓶中，将52mg酮、25mg羧甲氧基胺的半盐酸化物放置入0.5mL吡啶中。在环境温度下搅拌2天，然后将反应介质在减压下浓缩。所获得的残留物接纳在CH2Cl2/H2O混合物中；分离有机相，用水 并随后用2％盐酸溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。获得的残留物通过快速色谱法(石油醚/乙酸乙酯8/2)进行纯化。获得了24mg羧甲基肟，产率为39％。 
分析 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：4.40分钟 
在质谱法中检测的峰：[M+H]+＝464；[2M+H]+＝927。 
实施例8 
制备下列配方的悬浮液： 
3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇               20mg/ml 
赋形剂：                                        油状乳液。 
实施例9 
制备下列配方的干燥形式： 
3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-N，N-二甲基 
甘氨酸酯的盐酸化物             250mg 
赋形剂：量足以完成胶囊至       750mg。 
实施例10：3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-N，N-二甲基甘氨酸酯：3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇的前药的合成 
在烧瓶中，将509mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮-3-醇、182mgN，N-二甲基甘氨酸的盐酸化物、275mg EDCI和207mg DMAP放置入10-15mL二氯甲烷中。在环境温度下搅拌16小时。向反应介质中加入5％的碳酸氢钠溶液并用二氯甲烷提取。合并有机相，用无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。获得的残留物通过快速色谱法(甲苯/乙酸乙 酯8/2)进行纯化。回收了488mg，产率为78％。 
分析 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：3.77分钟 
在质谱法中检测的峰：[M+H]+476。 
该产物随后进入下述反应： 
在烧瓶中，将488mg所获得的产物和488mg盐酸羟胺放置入23mL吡啶中。在环境温度下搅拌16小时，然后将反应介质接纳在CH2Cl2/H2O混合物中；分离有机相，用水洗涤，用无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。回收了378mg肟，产率为75％。该产物随后在用HCl溶液酸化的醚溶液存在下成盐，以获得盐酸化物形式的产物。 
分析 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：3.43分钟 
在质谱法中检测的峰：[M+H]+＝491。 
实施例11：3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-(4-甲基-1-哌嗪)丙酸酯：3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇的前药的合成 
在烧瓶中，将264mg3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮-3-醇、以锂盐形式的121mg4-甲基-1-哌嗪-丙酸、1425mg EDCI和106mg DMAP放置入2-3mL二氯甲烷中。在环境温度下搅拌过夜。向反应介质中加入水并用二氯甲烷进行提取。合并有机相，用无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。获得的残留物通过快速色谱法(甲苯/乙酸乙酯98/2)进行纯化。回收了54mg所需产物，产率为15％。 
分析 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：3.66分钟 
在质谱法中检测的峰：[M+H]+＝545。
该产物随后进入下述反应： 
在烧瓶中，将30mg所获得的产物和30mg盐酸羟胺放置入1.2mL吡啶中。在环境温度下搅拌5小时30分钟，然后将反应介质接纳在CH2Cl2/H2O混合物中；分离有机相，用水洗涤，用无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。回收了19mg肟，产率为13％。 
分析 
1H-NMR(CDCl3)：一致 
保留时间：3.62分钟 
在质谱法中检测的峰：[M+H]+＝560。 
该产物随后在用盐酸水溶液酸化的醚溶液存在下成盐，以获得二盐酸化物形式的产物。 
实施例12：3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇的抗凋亡效应：兔心室心肌细胞的收缩性和凋亡 
3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇(Azasteroidal alkaloids.Synthesis of A-nor-B-homo-5-azacholestane.Rodewald，W.J.；Wicha，J.Univ.Warsaw，Bulletin de l′Académie Polonaise desSciences，Série des Sciences Chimiques(1963)，11(8)，437-441)的抗凋亡特性在心肌细胞上通过由多柔比星诱导的收缩功能障碍测试进行分析。 
Figure G2007800163948D00241
 材料与方法 
待测试的化合物 
使用在100％DMSO中浓度为10mM的3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇的原液。 
在DMSO中的终浓度对于所有实验点都是相同的，与所使用的分子浓度无关。 
3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇以在蒂罗德溶液(组成以 mmol/L表示：NaCl135，KCl5.4，NaH2PO40.33，CaCl21.2，MgCl21.0，Hepes10；pH用NaOH调整至7.4)中稀释的0.1和0.3μM的浓度进行测试。 
获得兔心室心肌细胞的分离细胞 
如A.d′Anglemont de Tassigny等人，Fund.Clin.Pharmacol，18：531-38，2004中所述，由雄性新西兰兔的心脏获得分离的心室细胞。简而言之，兔(2.0-2.5kg)用戊巴比妥溶液(50mg/kg)进行麻醉，并随后接受肝素(200IU/kg)。取出心脏，并立即无再循环地通过Langendorff装置用充氧(95％，2-5％CO2)的蒂罗德等渗溶液(无钙)(以mM表示：NaCl135，KCl5.4，Na2PO40.33，MgCl21.0，HEPES10，pH用1N NaOH调整至7.4，于37℃，280-300mOsmol/kgH2O)灌注10-15分钟。然后，所有心脏以“再循环”方式用相同的无钙蒂罗德溶液灌注3分钟(冠状动脉流量，10-15mL/分钟)，所述无钙蒂罗德溶液中添加有1mg/mLII型胶原酶和0.28mg/mLXIV型蛋白酶。最后，所有心脏以无再循环的方式用补充有0.3mM CaCl2的相同的蒂罗德溶液灌注10分钟。取出左心室并切成小片；细胞解离通过轻度机械搅拌来完成。通过每15分钟增加一次来添加细胞外的钙，以达到1.0mM的生理浓度。将分离的肌细胞维持在无血清培
Figure G2007800163948D0025091621QIETU
基中直至实验前1小时30分钟，所述培养基包含(以mM表示)NaCl110、KCl5.4、Na2PO40.33、NaHCO325、葡萄糖5、MgCl20.8、CaCl21，pH调整至7.4。在光学显微镜下，所有细胞都是杆状的，具有清晰的交叉条纹，并且在其表面上无囊泡。 
用膜联蛋白V进行标记 
用膜联蛋白V进行的磷脂酰丝氨酸的标记用作用于测量凋亡的定量方法，其中使用MiniMacs细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Bergisch，Gladbach，Germany)。简而言之，暴露出磷脂酰丝氨酸的细胞用膜联蛋白V的微珠进行磁性标记，然后在放置于磁场中的柱中经过。经标记的细胞(其具有经磁性标记的磷脂酰丝氨酸)被保留在柱中，而未标记的细胞(坏死的和非凋亡的细胞)未被保留。从磁场 中取出柱，通过磁性保留的、暴露出磷脂酰丝氨酸的细胞作为阳性级分被洗脱，并且用Mallassez细胞计数器进行计数。随后，将凋亡细胞的百分比相关于细胞的起始数目。 
胱天蛋白酶-3活性的测量 
将胱天蛋白酶-3活性用作用于测量凋亡的定量方法。简而言之，裂解细胞，并且将上清液用于测量胱天蛋白酶-3活性，其中使用AK-005试剂盒(Biomol Research Laboratories，Plymouth Meeting，PA，USA)。用于测量胱天蛋白酶-3活性的荧光底物(DEVD)用荧光染料7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)进行标记，所述AMC于210分钟期间产生在UV光下可检测的360/460nm处的黄绿色荧光。通过经由胱天蛋白酶-3的切割而从底物中释放出AMC，酶的表达以fmol/分钟表示。 
收缩性的测量 
将肌细胞转移到在37℃下的持续灌注的室中，并且置于倒置显微镜的载物台上。所述室用生理缓冲液进行灌注，该生理缓冲液包含(以mM表示)：NaCl140；KCl5.4；CaCl21；MgCl20.8；HEPES10；和葡萄糖5.6(pH＝7.4；290mOsmol/kgH2O)。 
肌细胞的收缩用置于室中并与刺激器连接的铂场电极以每秒1次(1Hz)来诱导。用x20物镜连续捕获图像，并以240个样品/秒的速度传送给CCD照相机。将CCD照相机的图像投射到视频屏上。 
根据下述标准来选择肌细胞以用于该研究：具有非常明显的条纹且无细胞内空泡的杆状外观，当用1mM Ca2+刺激时无自发性收缩，并且具有恒定的静息长度和收缩幅度。肌节的长度借助于视频图像分析程序来测量，并且以240个样品/秒的速度获取数据。将照相机图像转变成肌节长度的测量。由在肌节长度方面的这些数据来计算收缩百分比。 
数据分析 
所有数据均表示为平均值±标准差。不同组之间的数据比较通过ANOVA以及随后的Student检验(p<0.05，具有显著差异)来进行。
 实验方案 
在分离的心肌细胞中通过暴露于加入至等渗溶液中的1μM多柔比星3-8小时来诱导凋亡，所述等渗溶液包含(以mM表示)：NaCl110，KCl5.4，Na2PO40.33，NaHCO325，葡萄糖5，MgCl20.8，CaCl21，pH调整至7.4。在暴露于多柔比星开始后3小时用膜联蛋白V进行标记，因为这个现象在凋亡级联中非常早出现。在暴露于多柔比星后8小时进行胱天蛋白酶-3活性的测量，因为这个现象在凋亡现象中较晚发生。心肌细胞的收缩性在暴露于多柔比星的8小时期间每小时进行测量。载所有处理后，将所述细胞与未暴露于多柔比星的对照心肌细胞进行比较。 
在暴露于多柔比星前，心肌细胞用化合物3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇预处理15分钟。在该研究中测试这种化合物的2个浓度：0.1和0.3μM。 
Figure G2007800163948D00272
 结果 
在该研究中使用的细胞的肌节的平均长度在这些组中无显著不同。 
○ 多柔比星对肌细胞的收缩性和凋亡的影响 
暴露于多柔比星导致肌节的缩短随着时间过去而减少。在多柔比星下的峰的缩短在前3个小时期间类似于对照，随后在暴露4小时后变得显著减少(相对于多柔比星和对照的基线而言分别为-53.20±7.70％vs-19.49±2.06％，p<0.05，n＝5)。 
用1μM多柔比星进行的处理诱导了凋亡，伴随着膜联蛋白V的标记和胱天蛋白酶-3活性的显著增加。 
○ 3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇对于由多柔比星诱导的在收缩性水平上的功能障碍和对于凋亡的影响 
用1μM多柔比星进行的处理导致了心室心肌细胞的峰的缩短方面的显著减少，这在3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇(0.1和0.3 μM)的存在下被取消。这是因为，在暴露4小时后，相对于基线，在多柔比星下的峰的缩短(-53.20±7.70％)在使用0.1μM(-18.9±5.4％)和0.3μM(-8.1±9.6％)的该化合物时变得明显减少。 
此外，由于多柔比星而引起的膜联蛋白V的标记和胱天蛋白酶-3活性的增加被0.1和0.3μM的3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇阻断。 
在多柔比星后3小时以膜联蛋白V的标记的变化的％进行评估的凋亡给出下述结果：对照：100％；多柔比星：320％±48.7；多柔比星+0.1μM3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇：116.3％±15.1；多柔比星+0.3μM3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇：137.3％±19.3。关于胱天蛋白酶-3活性测量的结果如下：对照：19±9fmol/分钟；多柔比星：120±15fmol/分钟；多柔比星+0.1μM3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇：27±20fmol/分钟；多柔比星+0.3μM3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇：15±7fmol/分钟。 
Figure G2007800163948D00281
  评述和结论 
在分离的兔心肌细胞上，化合物3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇显示出对于由多柔比星诱导的收缩性功能障碍和对于凋亡的心脏保护效应。当该分子以合适的剂量使用时，可以有效地提供针对由多柔比星诱导的心脏毒性的保护，所述多柔比星已知为在用这种蒽环类抗生素治疗癌症患者中的限制因素。因此，化合物3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇可以用于限制这些患者中的多柔比星的心脏毒性。 
实施例13：在小鼠中的心肌梗塞体内模型中，化合物3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇和3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-N，N-二甲基甘氨酸酯的效应 
这个实验的目的是在小鼠中的冠状动脉闭塞-再灌注模型中于体 内研究化合物3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇和3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-N，N-二甲基甘氨酸酯的心脏保护性质。 
在事先缺血的心肌的再灌注前5分钟，在小鼠中通过静脉内途径施用待测试的化合物。作为对照，化合物的载体即β-环糊精(在下文中称为βCD)和水分别在与化合物相同的条件下进行施用。 
为了测定待测试的化合物的效应，在再灌注24小时后测量梗塞的大小。 
动物的外科手术器具 
将6-8周大的雄性C57BL6小鼠用戊巴比妥钠(50mg/kg i.p.)进行麻醉，并且在实验自始至终在插管后用O2/CO2(95％/5％)混合物进行换气。在外科手术的整个过程中，在示波器上记录和呈现体表心电图(ECG)。在严格无菌的条件下，向颈静脉中插入导管以用于所述化合物的静脉内施用。执行左侧胸廓切开术，并且在心包切开术后，在左心室的侧后区中找到左冠状动脉的主分支。将8号聚丙烯(prolène)缝线置于这个动脉周围，以便形成活动环以用于产生暂时的冠状动脉闭塞。 
实验方案 
对所有小鼠实施30分钟的暂时冠状动脉闭塞。心肌区域的缺血通过心肌表面的发绀的存在和心电图的ST段的偏离而得到证实。 
在开始30分钟的冠状动脉闭塞前5分钟，通过静脉内途径以快速浓注形式施用每种化合物(处理组，n＝10)或其溶剂(对照组，n＝10)。 
以1mg/kg的剂量施用3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇，该化合物预先以0.46mg/ml的终浓度溶解在通过饱和并随后进行离心而制备的在磷酸盐缓冲液中的30％βCD溶液之中。 
以3.9mg/kg的剂量施用3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-N，N-二甲基甘氨酸酯，该化合物预先通过搅拌和超声处理以1.56mg/ml的终浓度溶解在无菌水中。 
将相同体积的载体施用于相应的对照组。
再灌注通过心电图的QRS段的样子得到了证实。 
在逐层关闭胸腔并通过借助于引流进行抽吸而排空气胸后，小鼠随后逐渐醒来，并去除其换气辅助设备直至其重新开始正常的自发换气。需要时，通过腹膜内途径施用丁丙诺啡(1mg/kg)以提供有效的止痛覆盖。 
在冠状动脉闭塞结束后24小时，小鼠用戊巴比妥钠(50mg/kgi.p.)再次麻醉，并且通过静脉内途径施用肝素(
Figure G2007800163948D00301
肝素1,000IU/kg)。在24小时前已实施第一次闭塞的相同部位进行冠状动脉的结扎。随后，小鼠用饱和氯化钾的致死剂量实施安乐死，并且迅速摘除其心脏并随后通过主动脉安置在Langendorff类型的逆灌注系统上。 
以逆行方式灌注5％伊文思蓝溶液，从而健康心肌的颜色为蓝色；在冠状动脉闭塞期间变得缺血的区带，或“风险区域(aire 
Figure G2007800163948D0030091939QIETU
 risque)AR”，由于缺乏该溶液而保持为未染色的。 
随后，借助于特别设计用于小鼠心脏的切片机(Les Isolants deParis，Palaiseau)将左心室切成具有相同厚度(1mm)的5个切片，所述切片随后进行称重。 
将这些切片于37℃在pH7.4的1％三苯基四唑鎓氯化物溶液(TTC，Sigma，Poole，UK)中温育20分钟，并随后在4％福尔马林中固定。TTC具有使无梗塞的心肌变成红色的性质，并因此使梗塞的区带显示为白色。将每个心脏切片放置在立体显微镜下以用于获得高分辨率的数码照片。 
梗塞和风险区域的定量通过面积法(Scion Image，Scion，Frederick MD，USA)来进行，并且涉及每个切片的重量。 
风险区域(非蓝色区带)表示为左心室的重量的百分比。梗塞大小表示为风险区域的重量的百分比。 
所有梗塞大小和风险区域的值都表示为平均值±SEM。将单因素ANOVA和随后的不成对Student t检验(具有Bonferonni校正)用于使实验组间的风险区域和梗塞大小相比较，显著性阈值设为p<0.05。
结果和结论 
用所述化合物处理的小鼠的梗塞大小显著不同于用载体处理的小鼠。 
下表中显示的结果一方面由风险区域表示，和另一方面由梗塞大小表示。 
  
经处理的小鼠 风险区域 梗塞大小
3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇 9+/-4％ 21+/-7％
载体 14+/-4％ 33+/-7％
  P<0.01 P<0.0007
梗塞大小的减小   36.4％
3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-N，N-二甲基甘氨酸酯                       8+/-3％ 23+/-9％
载体 16+/-8％ 40+/-15％
  P<0.07 P<0.006
梗塞大小的减小   42.5％
在所使用的实验模型中，2种被测试的化合物都减小了梗塞大小。此外，结果显示，所述化合物减小梗塞大小，与风险区带的范围无关。 
因此，这些结果显示，这2种化合物都具有体内心脏保护效应。实施例14：化合物3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇在急性肝毒性体内模型中的效应。 
在这个实验中，测试了化合物3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇保护肝细胞的能力。 
肝细胞如许多其他细胞一样在其细胞质膜上具有受体Fas/CD95。这种Fas途径的刺激通过激活胱天蛋白酶级联而诱导了细胞死亡。 
肝损害的急性模型可以通过单次注射抗-Fas抗体Jo2来诱导(Ogasawara等人，Nature，1993年8月)，产生严重的肝损害，并 且类似于病毒性肝炎、自身免疫性肝炎或药物诱发的肝炎。 
丙氨酸氨基转移酶(ALAT)也称为血清谷丙转氨酶(SGPT)，其是存在于肝细胞中的酶。它的活性在肝裂解后在血浆中显著增加，并因此是用于评估肝损害的良好标记物。 
材料与方法 
动物 
使用来自″Elevage Janvier″(Le Genest-Saint-Isle，France)的雄性成年CD1小鼠。动物独个地进行鉴定，并随意获取水和食物。 
使设备维持于受控制的光照循环(7:00-19:00)，以及20±2℃的温度和50±20％的湿度。 
抗体Jo2的制备 
在水中以1mg/mL的浓度制备来自Pharmingen(BD Biosciences，ref.554254，批次32699)的称为Jo2的仓鼠抗小鼠CD95(Fas)单克隆抗体的原液。在处于水中的0.9％氯化钠之中制备所使用的稀释物。 
待测试的化合物的制备 
称取所需量的3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇，并磨成细粉，然后与Cremophore EL(SigmaC5135)和无水乙醇(Carlo ErbaRPE41571)(分别为终体积的5％和10％)相混合。完全溶解后，即时加入处于水中的0.9％氯化钠(终体积的85％)。 
进行两类实验：由Jo2引起中毒并随后测定ALAT的含量，以及由Jo2引起致死性中毒。 
-由Jo2引起中毒并测定ALAT的含量： 
方案 
在施用抗体Jo2前1小时通过腹膜内施用以10和30mg/kg的剂量来进行用3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇的预处理。通过以5 mL体积/kg体重并采用125μg/kg的剂量进行腹膜内注射来施用抗体Jo2。 
在通过如下方式接受预处理的动物上实现对照：在施用所述抗体前1小时腹膜内施用等体积的已用于制备待测试的化合物但不含该化合物的溶液。 
测定ALAT的含量 
在施用Jo2后24小时抽取被麻醉的小鼠的血液。通过使用试剂盒(Roche Diagnostics)与分光光度计(Hitachi Modular)，根据由IFCC(Fédérat ion Internationale de Chimie Clinique)标准化的方法来进行ALAT含量的测定。 
结果和结论 
在注射后24小时内，以125μg/kg腹膜内施用Jo2在小鼠中不诱导任何死亡率。 
10和30mg/kg的化合物3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇显著降低ALAT活性。 
表1：在施用Jo2后24小时测量的ALAT活性 
  
    处理 ALAT活性(U/L)                 平均值+/-SEM(n)
对照 2860±382(61)
3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇(10mg/kg)                         511±140(19)**
3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇(30mg/kg)                         533±150(20)**
**：p<0.01，相对于安慰剂组进行的ANOVA及随后的Dunnett′s比较检验 
在抗体Jo2前1小时以10和30mg/kg施用的3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇使得能够限制由亚致死剂量的抗体诱导的细胞死亡。 
ALAT活性(其为血浆中的肝细胞裂解的生物标记物)在用3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇处理的小鼠中显著低于未处理的对照 小鼠。 
-由抗体Jo2引起致命性中毒 
在这个实验中，评估了在施用致死剂量的抗体Jo2后，3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇对于动物存活的影响。 
方案 
通过以5mL体积/kg体重并采用200或250μg/kg的剂量进行腹膜内注射来施用抗体Jo2。 
作为预处理在施用Jo2前1小时，或者作为后处理在施用Jo2后1小时，以10和30mg/kg测试3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇。 
在通过如下方式接受预处理的动物上实现对照：在施用所述抗体前1小时或后1小时腹膜内施用等体积的已用于制备待测试的化合物但不含该化合物的溶液。 
结果和结论 
表2：在24小时时动物的存活 
Figure G2007800163948D00341
在所施用的剂量上，抗体Jo2在对照组中在24小时内诱导相当大 的死亡率(70-100％的动物)。 
以所施用的剂量用3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇进行预处理和/或后处理诱导了动物存活的增加。 
因此，当使用致死剂量的抗体(200或250μg/kg)时，在所述抗体前或后1小时以10和30mg/kg施用的3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇增加了经过24小时的小鼠存活率。 
结论 
在小鼠中由抗-Fas抗体(Jo2)诱导的急性肝毒性模型使得能够证实3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇的肝脏保护性质。 
这些显著的效应使得能够考虑将式I的化合物通常用于制备细胞保护性药物。

Claims (14)

1.至少一种式I的化合物
Figure FSB00001107270800011
其中
-X与Y一起表示酮官能团(＝O)、肟基团(＝NOH)或甲基肟基团(＝NHOMe)，或者X表示羟基且Y表示氢原子；
-B表示羟基，且C和D相同或不同，它们表示氢原子或含1-4个碳原子的直链或支化的烷基；或者
B与C一起表示酮官能团，且D表示甲基、羟基或甲胺基团；或者
B和C表示氢原子，且D表示甲胺基团；或者
B与C一起表示肟基团，且D表示甲基；和
-R表示含1-10个碳原子的直链或支化的烷基，
或其与药学上可接受的酸的加成盐之一的用途，所述用途为用于制备除神经保护性药物以外的细胞保护性药物，所述药物用于治疗可能导致细胞死亡的病理状态或变性过程的在细胞水平上的后果，但不用于治疗可能导致细胞死亡的病理状态或变性过程的细胞外起因，
其中所述药物用于保护心脏细胞，即其为心脏保护性药物；或者所述药物用于保护肝细胞，即其为肝脏保护性药物。
2.根据权利要求1的用途，其特征在于，在式I中，R表示式II的胆甾烷的基团
Figure FSB00001107270800021
3.根据权利要求1的用途，其特征在于，在式I中，X与Y一起表示酮官能团。
4.根据权利要求1的用途，其特征在于，在式I中，B表示羟基，且C和D相同或不同，它们表示氢原子或含1-4个碳原子的直链或支化的烷基。
5.根据权利要求1的用途，其特征在于，在式I中，B与C一起表示酮官能团，且D表示甲基。
6.根据权利要求1的用途，其特征在于，在式I中，X与Y一起表示肟基团。
7.根据权利要求1的用途，其特征在于，式I的化合物选自
3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-醇，
3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-甲基醇，或
3，5-裂-4-失碳-胆甾烷-5-酮肟-3-二甲基醇，
或其与药学上可接受的酸的加成盐之一。
8.根据权利要求1-7中任一项的用途，其特征在于，所述药物用于治疗或预防心血管疾病或肝脏疾病。
9.根据权利要求8的用途，其特征在于，所述心血管疾病选自心脏和/或血管缺血，心肌梗塞，缺血性心脏病，慢性或急性心功能不全，心脏节律障碍，心房纤维性颤动，心室纤维性颤动，阵发性心动过速，心功能不全，肥厚性心脏病，缺氧，低氧，由于用抗癌剂进行治疗而引起的副作用。
10.根据权利要求8的用途，其特征在于，所述肝脏疾病选自自身免疫性肝炎、暴发性肝炎，某些遗传性代谢疾病，威尔逊病，肝硬化，非酒精性肝脂肪变性，由于毒素或药物引起的肝脏疾病。
11.根据权利要求1-7中任一项的用途，其特征在于，所述药物用于在移植之前、之时或之后保护细胞、组织或器官。
12.根据权利要求1-7中任一项的用途，其特征在于，所述药物用于保护心脏细胞免于由多柔比星诱导的心脏毒性。
13.根据权利要求1-7中任一项的用途，其特征在于，所述药物用于保护心脏细胞免于心肌梗塞。
14.根据权利要求1-7中任一项的用途，其特征在于，所述药物用于保护肝细胞免于自身免疫性肝炎或者由于毒素或药物引起的肝脏疾病。
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