WO2007091409A1 - 組織幹細胞由来フィーダー細胞 - Google Patents

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Shigeto Shimmura
Hideyuki Miyashita
Satoru Yoshida
Kazuo Tsubota
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Keio University
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Definitions

  • the present invention relates to a tissue stem cell-derived feeder cell and use thereof.
  • Corneal limbal stem cell exhaustion is the death of stem cells of the corneal epithelium due to alkaline trauma or the like, and the vision is markedly impaired by the entry of opaque conjunctiva (Non-patent Document 1).
  • a feeder cell is a fibroblast that has stopped growing by treatment with a drug, etc., and has a function of promoting the proliferation of epithelial cells and suppressing the proliferation of mixed fibroblasts (Non-patent Document 3).
  • Cultured epithelium using 3T3 as a feeder has a track record of more than 20 years in clinical practice.
  • Non-patent Document 6 The inventor's group also used this method for the mouse cornea. We succeeded in isolating and culturing stem cells (Non-patent Document 7).
  • Non-Patent Document 1 Ann Acad Med Singapore 2004; 33: 576-80
  • Non-patent document 2 CANCER RESEARCH 63, 7815-7824, November 15, 2003
  • Non-patent document 3 Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 76, No. 11, pp. 5665-5668, Novemb er 1979
  • Non-Patent Document 4 Guidelines for Regenerative Medicine of Epithelial System Using 3T3J2 and 3T3NIH Strains as Feeder Cells Based on “Guidelines for Public Health Infectious Diseases Associated with Xenotransplantation” 2003 Welfare Labor Grant-in-Aid for Scientific Research, Research Laboratories for Health and Labor Sciences Chief Researcher Akira Yoshikura (Director, National Institute of Infectious Diseases)
  • Non-Patent Document 5 STEM CELLS 2003; 21: 481-494
  • Non-Patent Document 6 STEM CELLS 2005; 23: 727-737
  • Non-Patent Document 7 Investigative Ophthalmology & Visual Science, May 2005, Vol. 46, No. 5, 1653-1658
  • An object of the present invention is to provide a feeder cell with little variation in quality.
  • a stem cell can be used as a single-cell source of feeder cells, if it has the ability to replicate itself, that is, there is no quality fluctuation, it is theoretically possible to use one lot of high-quality cells indefinitely. Can be expected. Therefore, the present inventor succeeded in culturing human epithelium for transplantation by using a feeder cell prepared from mouse corneal stromal stem cells, and completed the present invention.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • Feeder cell derived from yarn and weave stem and Z or progenitor cells (1) Feeder cell derived from yarn and weave stem and Z or progenitor cells.
  • Tissue stem and Z or progenitor cells are derived from corneal stroma, skin or bone marrow mesenchyme (1) to ( 3)! One feeder cell as described in any of the above.
  • a method for producing a feeder cell which comprises inducing tissue stem and Z or progenitor cells into fibroblasts as necessary and performing a treatment for reducing the proliferation ability.
  • tissue stem and Z or progenitor cells are mammalian.
  • tissue stem and Z or progenitor cells are derived from corneal stroma, skin or bone marrow mesenchyme.
  • a method for preparing a cultured cell comprising co-culturing the cell with the feeder cell according to any one of (1) to (4).
  • a cell culture kit comprising the feeder cell according to any one of (1) to (4).
  • An advantage of the present invention resides in that a homogeneous feeder cell can be stably supplied because stem cells are used as a cell source. Furthermore, if human cells are used as feeder cells, the risk of heterologous infection can be reduced.
  • FIG. 1 A: Mouse parenchymal stem cells in culture, B: A treated as a feeder cell by drug treatment C: Actual epithelial culture, D: Epithelial cells in culture.
  • FIG. 2 Tissue specimen of cultured epithelial cells.
  • HE Hematoxylin / eosin stained image.
  • K3 Immunostained image of keratin 3 which is a marker of corneal epithelial differentiation
  • Cx43 Immunostained image of connexin 43 which is a marker for epithelial cell differentiation
  • Int bl Immunostained image of integrin
  • P63 Immunostained image of p63, which is a marker of undifferentiated epithelial cells.
  • FIG. 3 Rhodamine B-stained image after co-culture of 1000 epithelial cells with each feeder cell for 2 weeks. Lower left: epithelial colony formation rate (CFE), lower right: average size of epithelial colonies.
  • CFE epithelial colony formation rate
  • FIG. 4 Feeder cell derived from epithelial cells and human bone marrow mesenchymal stem cells (cultured epithelial sheet prepared using MASCD.
  • Contact coculture Feeder cells are seeded together in a culture insert to produce feeders.
  • Duplex coculture Culture cultured in contact with a continuous supply of humoral factors by seeding feeder cells both in the culture insert and in the tool under the insert.
  • Epithelial sheet Separated coculture Cultured epithelial sheet co-cultured without contact with feeder cells by seeding the feeder cells only in the weinole under the force-removal insert HE: Hematoxylin / eosin stained image
  • K3 Immunostained image of keratin 3 which is a corneal epithelial marker
  • K15 keratin 15 which is a corneal limbal epithelial marker Epidemic staining image.
  • FIG. 5 Feeder cells derived from epithelial cells and human bone marrow mesenchymal stem cells (cultured epithelial sheet prepared using MASCD.
  • K12 Immunostained image of keratin 12, a marker of corneal epithelial differentiation
  • K15 corneal ring Immunostained image of keratin 15 which is a cervical epithelial marker
  • K12 + K15 Double stained image of keratin 3 and keratin 15.
  • the present invention provides a feeder cell derived from tissue stem and Z or progenitor cells.
  • Yarn and woven stem and Z or progenitor cells may be of mammals (eg, human, mouse), and of these, mammals are preferred, particularly humans.
  • Tissue stem and Z or progenitor cells may be adult or fetal
  • the tissue stem and Z or progenitor cells may be derived from any thread and tissue, but those derived from tissues such as bone marrow, muscle, nerve, skin, cornea, liver, spleen, small intestine, oral mucosa, fat, etc. Among these, those derived from cornea (particularly corneal stroma), skin or bone marrow (particularly bone marrow mesenchyme) are preferable.
  • Tissue stem and Z or progenitor cells can be prepared as follows. After collecting the target tissue, remove as much of the unnecessary part as possible. After dispase treatment at 4 ° C overnight, remove the epithelium, and further perform collagenase treatment at 37 ° C for 1 to 2 hours to thaw the tissue. To do. Cells are collected by centrifugation, then cultured in tissue-free and serum-free medium for Z or progenitor cell culture, and passaged every 2 to 3 weeks.
  • the feeder cell of the present invention can be prepared by inducing tissue stem and Z or progenitor cells to fibroblasts as necessary, and subjecting them to treatment for reducing the proliferation ability.
  • tissue stem and Z or progenitor cells into fibroblasts
  • the following procedure is recommended. Collect tissue stem and Z or progenitor cells cultured in serum-free medium by centrifugation and disperse them by enzyme treatment (Accumax TM, Innovative Cell Technologies, Inc.) at 37 ° C. Differentiation into fibroblasts is induced by culturing the dispersed cells in a medium containing 10% serum. Inducing tissue stem and Z or progenitor cells into fibroblasts is an optional step. Tissue stem Z progenitor cells, such as bone marrow mesenchymal stem cells, that originally have the properties of fibroblasts can proceed to a proliferative reduction process without requiring special differentiation induction.
  • Fibroblasts derived from tissue stem and Z or progenitor cells are subjected to treatment for reducing proliferation ability such as irradiation and mitomycin treatment.
  • treatment for reducing proliferation ability such as irradiation and mitomycin treatment.
  • fibroblasts that have reached semiconfluence are cultured in a medium supplemented with mitomycin C at 37 ° C for 2 hours, or a lethal dose of radiation is applied.
  • the growth and differentiation of the cultured cells can be regulated.
  • the cells co-cultured with the feeder cell of the present invention are preferably human.
  • the type of cells co-cultured with the feeder cell of the present invention is not particularly limited! /, Force corneal cells (eg, corneal epithelial cells), skin cells (eg, epidermal cells), heart cells ( Examples include cardiomyocytes), gastrointestinal cells (eg, gastric mucosal epithelial cells, small intestinal mucosal epithelial cells, large intestine mucosal epithelial cells), bone marrow cells, embryonic stem cells, oral mucosal cells, and the like. If stem and Z or progenitor cells are present in the cells to be cultured, co-cultured with the feeder cell of the present invention allows the cells to grow or be separated only by maintaining cell survival. it can. When the cells to be cultured are tissue cells, the tissue may be regenerated. Regenerated tissue can be transplanted.
  • Force corneal cells eg, corneal epithelial cells
  • skin cells eg, epidermal cells
  • heart cells Examples include cardiomyocytes
  • gastrointestinal cells eg, gas
  • the cells co-cultured with the feeder cell of the present invention are corneal epithelial cells or skin cells
  • the cultured cells can proliferate and stratify.
  • the cells co-cultured with the feeder cells of the present invention are bone marrow cells or embryonic stem cells, the cultured cells will proliferate but will not stratify.
  • Co-culture with the feeder cell of the present invention can be performed as follows. First, feeder cells are seeded in a culture dish so as to be 70% to 90% confluent, and the cells to be co-cultured the next day are seeded. The cells may be cultured in contact with a feeder cell, or may be cultured without contact with a forceful insert or the like.
  • corneal epithelial cells, skin epithelial cells, oral mucosal epithelial cells, etc. are layered, cells are first cultured on a culture insert until confluent using a serum-added medium. Next, reduce the volume of the medium until the cells touch the boundary between the gas phase and the liquid phase, and culture for about one week.
  • cultured cells for use in transplantation can be prepared.
  • a graft in which epithelium is cultured in advance on an amniotic membrane is prepared by the above method. Put a layer of amniotic membrane in the culture dish, and culture a small amount of cells collected from the donor cornea or patient.
  • Cultured epithelial transplantation has the advantage that wound healing can be obtained at an early stage compared to transplantation of amnion alone, and has the effect of suppressing inflammation.
  • undifferentiated cells are also included in the proliferated cells, which has the potential to regenerate a small amount of stem cell corneal epithelium.
  • the present invention provides a cell culture kit comprising the feeder cell described above.
  • the kit of the present invention includes a feeder cell, a medium (eg, F12 / DMEM, DMEM), a growth factor (eg, EGF, insulin, cholera toxin, hyidocortisone, transferrin, isoproterenol, Lyodothyronine, adenine) and the like.
  • a medium eg, F12 / DMEM, DMEM
  • a growth factor eg, EGF, insulin, cholera toxin, hyidocortisone, transferrin, isoproterenol, Lyodothyronine, adenine
  • Cells can be cultured by using the kit of the present invention, and the cultured cells may be used for transplantation.
  • mouse keratocyte progenitor cells treated with trypsin, collagenase and hyaluro-dase were mechanically And then suspended in Caro DMEM / F12 supplemented with 10% urinary fetal serum (FBS), seeded so that 3 ⁇ 10 6 cells are present in a 75 cm 2 flask, and cultured at 37 ° C for 4 days. Induced to fibroblasts.
  • the cells were treated with 4 g / ml mitomycin C (Sigma) at 37 ° C for 2 hours, and then dispersed with 0.05% trypsin EDTA (Invit rogen) to obtain 3xl0 6 cells / ml. It was diluted with a cell banker (Juzen field) and stored frozen in a deep freezer. The day before plating the epithelial cells were thawed the cells were seeded at a density of 2.5xl0 4 / cm 2 to 6 ⁇ El plates was diluted with 10% FBS ⁇ Ka ⁇ DMEM / F12 (Falcon).
  • the limbus was separated from the rest of the cornea transplanted from the US eye bank, and the iris, ciliary body, Descemet's membrane, endothelium, and conjunctiva were surgically removed.
  • serum-supplemented medium supplemented with despase (Invitrogen, 10 mg / ml) D-sorbitol (Wako, 9 mg / ml) at 4 degrees
  • the epithelium was detached from the parenchyma, followed by 0.05% Epithelial cells were dispersed by treatment with trypsin ED TA at 37 ° C for 30 minutes.
  • Epithelial cells are seeded on culture insert (Cornig, Transwell (registered trademark), cat no 3450) coated with fibrin gel (Bolheel, Kakenken, 2 mg / cm 2 ), and about 2 weeks with the feeder cell prepared the previous day Cultured.
  • paraffin sections were prepared, HE staining power or embedded in 4% CMC solution (Sakura finetek) and frozen in liquid nitrogen to prepare frozen sections.
  • Frozen slices were fixed with acetone, blocked with PBS supplemented with 10% serum, mouse monoclonal anti-keratin 3 antibody (AE5, Progen Biotechnik GmbH), anti-connexin 43 antibody (Chemicon int ernational Inc), ⁇ inaglin ⁇ 13 ⁇ 4 ⁇ ⁇ body (Chemicon), stained with anti-p63 antibody (Oncogene Research Products), reacted with Cy3-labeled anti-mouse antibody, and detected using a fluorescence microscope.
  • feeder cells were seeded on 100 millidish, and the next day, 100 epithelial cells were seeded. This was cultured for 2 weeks, fixed with 10% formalin, and stained with rhodamine B.
  • FIG. 1A shows mouse parenchymal stem cells in culture.
  • FIG. 1B the mouse parenchymal stem cells in the figure are made into feeder cells by drug treatment.
  • Figure 1C shows the epithelial culture.
  • the feeder cell is cultured at the bottom of the culture dish, and the epithelium is cultured in a carrier insert placed thereon.
  • FIG. 1D shows epithelial cells in culture.
  • the cultured epithelial sheet produced using this feeder cell (Fig. 2, row center) is layered in the same manner as the cultured epithelial sheet produced using the conventional 3T 3 (left column).
  • the gene expression pattern of a marker and an undifferentiated marker is shown. That is, K3 positive cells were found in the outermost layer, Cx43 was found in the entire epithelium including basal cells, and integerin iS 1 and p63 expression was found in the entire epithelium excluding the outermost layer. This means that mouse keratocytes stem cells This suggests that there is no difference in the quality of the cultured epithelial sheet whether using a single feeder cell or 3T3.
  • FIG. 3 shows the difference in colony formation rates when very few epithelial cells are seeded. Without feeder cells, no epithelial cell colony formation was observed, whereas when this feeder cell was used, epithelial cell colony formation was observed. This suggests that this feeder cell can provide a microenvironment that can support the survival and proliferation of epithelial cells.
  • Corneal parenchymal stem cells were cultured according to the method of Yoshida et al. And induced into fibroblasts using a serum-supplemented medium (Yoshida. Et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005 May; 46 (5): 1653-8 .)
  • o Human bone marrow mesenchymal stem cells were supplied by SanBio and cultured according to the company's protocol. Cells that reached confluence were treated with mitomycin C (4 ug / ml, 37 degrees, 2 hours) to form feeder cells and stored frozen at -80 ° C until use.
  • feeder cells In order to examine the ability of feeder cells to support epithelial growth, human limbal epithelial cells were prepared from the US cornea cornea by enzymatic treatment, and 1000 cells were seeded on a 100 mm diameter culture dish prepared with each feeder cell. And cultured for 2 weeks. The medium used was SHEM (same as that used in Example 1). After culturing, the culture dish was fixed with formalin and stained with rhodamine B. The percentage obtained by dividing the number of colonies by the number of seeded cells was defined as the colony formation rate. To examine whether feeder cells can support epithelial differentiation and stratification, feeder cells were prepared on 6-well plates and fibrin-coated cell culture inserts. Epithelial cells were cultured in three dimensions.
  • the cell culture insert used in the same manner as in Example 1 was Cornig Transwell (registered trademark) (cat no 3450) coated with borheal (Ye Blood Laboratory, 2 mg / cm 2 ). After the human epithelial cells reached confluence, air lift culture was subsequently performed for 1 week to prepare a cultured epithelial sheet. Cultured skin sheets were fixed in formalin and then paraffin sections were stained with HE and used for histological examination, or fresh frozen sections were used for immunohistological examination.
  • primary antibody is anti-keratin 3, anti-keratin 12, iHikeratin 15, anti-connexin 43, anti-integrin b etal, and anti-p63 antibody, Alexa flour-labeled antibody (Invitrogen) as the secondary antibody, DAPI for nuclear staining, and the presence or absence of expression was examined using a fluorescence microscope (Axioplan 2, Carl Zeiss)
  • the cultured epithelium co-cultured with corneal parenchymal stem cells is stratified, contains cells that express the differentiation markers K3 and Cx43, and contains cells that express the undifferentiation markers Intbl and p63 It was out.
  • the cultured epithelial sheet co-cultured with corneal parenchymal stem cells maintained cells that maintained proliferation ability sufficient to form colonies.
  • the epithelial cells that had not been co-cultured with the feeder cells were hardly layered, the expression of differentiation markers was hardly observed, and the cells with colony-forming ability were maintained.
  • the epithelial cells co-cultured with the feeder cells derived from human mesenchymal stem cells were able to form stratified epithelial sheets.
  • These epithelial sheets contained differentiated cells expressing K3 and K12, whether they were brought into contact with the feeder or not.
  • K15 expression was observed in the same manner as in the corneal ring where corneal epithelial stem cells were present.
  • a feeder cell is provided.
  • a cultured cell for transplantation can be prepared.

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Abstract

【課題】質の変動が少ないフィーダー細胞を提供すること。 【解決手段】組織幹及び／又は前駆細胞に由来するフィーダー細胞。フィーダー細胞の作製方法、フィーダー細胞を用いて培養細胞を調製する方法、細胞培養キットも提供される。

Description

明 細 書
組織幹細胞由来フィーダ一細胞
技術分野
[0001] 本発明は、組織幹細胞由来フィーダ一細胞及びその利用に関する。
背景技術
[0002] 培養上皮移植は角膜輪部幹細胞疲弊症の治療に用いられる。角膜輪部幹細胞疲 弊症とはアルカリ外傷等により角膜上皮の幹細胞が死滅するもので、不透明な結膜 が進入することにより視力が著しく損なわれる (非特許文献 1)。
上皮細胞の培養法には、フィーダ一細胞を使わない方法と使う方法がある力 使う 方法の方が上皮細胞の維持能力に優れている（非特許文献 2)。フィーダ一細胞は、 薬剤処理などで増殖を停止させた線維芽細胞で、上皮細胞の増殖を促し、また混入 してきた線維芽細胞の増殖を抑制する働きがある (非特許文献 3)。フィーダ一に 3T3 を用 、た培養上皮は臨床にぉ 、て 20年以上の実績を持つ。
[0003] しかし、 3T3はマウス由来のため異種感染の危険性を完全に排除できず、厚生労働 省の指針では異種移植として分類されている (非特許文献 4)。
この問題の回避にはヒト細胞をフィーダ一とすればよいわけで、実際ヒト線維芽細胞 をフィーダ一として表皮細胞 (皮膚の上皮細胞）を培養維持できることが報告されて いる (非特許文献 5)。
[0004] ただし、マウスの株細胞 (不死化した細胞)である 3T3とは異なり、正常なヒト線維芽 細胞は継代を重ねると次第に老化することが知られている。このことは、 1つのロットの 細胞をいつまでも使用できないことを意味する。このため、継代やロット差によりフィー ダ一の質が変動する可能性があり、これは培養上皮の質のコントロールに悪影響を 及ぼすものと予想される。
[0005] 最近、脳や皮膚の幹細胞を培養、維持する方法が開発された。この方法で培養さ れる幹細胞は上皮には分ィ匕しないものの、線維芽細胞には分化することが出来る。こ の方法を用いて、マウスだけでなくヒトの皮膚幹細胞も長期維持できることが報告され ている（非特許文献 6)。また、本発明者のグループも、この方法を用いてマウス角膜 の実質力 幹細胞を分離培養することに成功した (非特許文献 7)。
[0006] 非特許文献 1： Ann Acad Med Singapore 2004; 33: 576-80
非特許文献 2 : CANCER RESEARCH 63, 7815-7824, November 15, 2003 非特許文献 3 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 76, No. 11, pp. 5665-5668, Novemb er 1979
非特許文献 4:「異種移植の実施に伴う公衆衛生上の感染症問題に関する指針」に 基づく 3T3J2株及び 3T3NIH株をフィーダ一細胞として利用する上皮系の再生医 療への指針 平成 15年度厚生労働科学研究費補助金厚生労働科学特別研究事業 主任研究者 吉倉廣 (国立感染症研究所長）
非特許文献 5 : STEM CELLS 2003;21:481-494
非特許文献 6 : STEM CELLS 2005;23:727-737
非特許文献 7： Investigative Ophthalmology & Visual Science, May 2005, Vol. 46, No .5, 1653-1658
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、質の変動が少ないフィーダ一細胞を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0008] もし自己自身を複製できる能力を持つ、つまり質の変動がない、幹細胞をフィーダ 一細胞の細胞源に用いることができれば、良質な 1ロットの細胞を理論上は無限に使 用することが出来ると予想できる。そこで、本発明者は、マウス角膜実質幹細胞から 作成したフィーダ一細胞を用いることにより、移植用ヒト上皮の培養に成功し、本発明 を完成させるに至った。
[0009] 本発明の要旨は以下の通りである。
(1)糸且織幹及び Z又は前駆細胞に由来するフィーダ一細胞。
(2)糸且織幹及び Z又は前駆細胞が哺乳動物のものである（1)記載のフィーダ一細胞
(3)哺乳動物がヒトである（2)記載のフィーダ一細胞。
(4)組織幹及び Z又は前駆細胞が角膜実質、皮膚又は骨髄間葉由来である（1)〜（ 3)の!、ずれかに記載のフィーダ一細胞。
(5)組織幹及び Z又は前駆細胞を必要により線維芽細胞に誘導し、増殖能を低下さ せる処理を施すことを含む、フィーダ一細胞の作製方法。
(6)組織幹及び Z又は前駆細胞が哺乳動物のものである（5)記載の方法。
(7)哺乳動物がヒトである（6)記載の方法。
(8)組織幹及び Z又は前駆細胞が角膜実質、皮膚又は骨髄間葉由来である（5)〜 ( 7)の 、ずれかに記載の方法。
(9)細胞を（1)〜 (4)の 、ずれかに記載のフィーダ一細胞と共培養することを含む、 培養細胞を調製する方法。
(10) (1)〜 (4)のいずれかに記載のフィーダ一細胞と共培養する細胞が哺乳動物 のものである（9)記載の方法。
(11)哺乳動物がヒトである（10)記載の方法。
(12) (1)〜 (4)のいずれかに記載のフィーダ一細胞と共培養する細胞力 角膜細胞 、皮膚細胞、歯肉細胞、心臓細胞、消化管細胞、骨髄細胞、胚性幹細胞及び口腔 粘膜細胞からなる群より選択される（9)〜（ 11)の ヽずれかに記載の方法。
(13) (1)〜 (4)のいずれかに記載のフィーダ一細胞と共培養する細胞力 角膜上皮 細胞又は皮膚細胞である（12)記載の方法。
( 14)培養細胞が重層化される（ 13)記載の方法。
(15)培養細胞が移植に用いられる（9)〜（14)の 、ずれかに記載の方法。
(16) (1)〜 (4)のいずれかに記載のフィーダ一細胞を含む、細胞培養キット。
発明の効果
[0010] 本発明の利点は、幹細胞を細胞源に用いるため、均質なフィーダ一細胞を安定的 に供給することが出来る点にある。さらに、フィーダ一細胞にヒト細胞を用いれば、異 種感染の危険性を減少させることができる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願 2006-030997の明 細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]A:培養中のマウス実質幹細胞、 B:Aを薬剤処理によりフィーダ一細胞としたもの 、 C:上皮培養の実際、 D:培養中の上皮細胞。
[図 2]培養した上皮細胞の組織標本。 HE :へマトキシリン/ェォシン染色像。 K3 :角膜 上皮分ィヒマーカーであるケラチン 3の免疫染色像、 Cx43：上皮細胞分化マーカーで あるコネキシン 43の免疫染色像、 Int bl :未分ィ匕上皮の指標であるインテグリン |8 1の 免疫染色像、 p63：未分化上皮細胞のマーカーである p63の免疫染色像。
[図 3] 1000個の上皮細胞をそれぞれのフィーダ一細胞と 2週間共培養した後のローダ ミン B染色像。左下図：上皮コロニーの形成率 (CFE)、右下図：上皮コロニーの平均 サイズ。
[図 4]上皮細胞とヒト骨髄間葉系幹細胞由来のフィーダ一細胞 (MASCDを用いて作成 した培養上皮シート。 Contact coculture :カルチャーインサート内に上皮細胞とフィー ダー細胞を共に播種することで、フィーダ一細胞と接触させながら培養した上皮シー ト。 Duplex coculture :カルチャーインサート内およびインサート下のゥヱル双方にフィ ーダー細胞を播種することで、接触かつ液性因子の持続的供給を受けながら培養し た培養上皮シート。 Separated coculture :力ノレチヤ一インサート下のウエノレにのみフィ ーダー細胞を播種することで、フィーダ一細胞と接触させずに共培養した培養上皮 シート。 HE :へマトキシリン/ェォシン染色像。 K3 :角膜上皮分ィ匕マーカーであるケラ チン 3の免疫染色像、 K15：角膜輪部上皮マーカーであるケラチン 15の免疫染色像。
[図 5]上皮細胞とヒト骨髄間葉系幹細胞由来のフィーダ一細胞 (MASCDを用いて作成 した培養上皮シート。 K12 :角膜上皮分ィ匕マーカーであるケラチン 12の免疫染色像、 K15：角膜輪部上皮マーカーであるケラチン 15の免疫染色像、 K12+K15：ケラチン 3と ケラチン 15の二重染色像。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、組織幹及び Z又は前駆細胞に由来するフィーダ一細胞を提供する。 糸且織幹及び Z又は前駆細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス）のものであるとよく 、このうち、哺乳動物のものであることが好ましぐ特に、ヒトものであることが好ましい。 組織幹及び Z又は前駆細胞は、成人のものであっても、胎児のものであってもよい 組織幹及び Z又は前駆細胞は、いかなる糸且織由来のものであってもよいが、骨髄、 筋肉、神経、皮膚、角膜、肝臓、脾臓、小腸、口腔粘膜、脂肪などの組織由来のもの を挙げることができ、このうち、角膜 (特に、角膜実質)、皮膚又は骨髄 (特に、骨髄間 葉）由来のものが好ましい。
[0013] 組織幹及び Z又は前駆細胞は、以下のようにして調製することができる。目的の組 織を採取後、必要ない部分をできるだけ除去する. 4°Cで終夜のデイスパーゼ処理 後、上皮を除去し、さらに 37°Cで 1時間〜 2時間コラゲナーゼ処理を行うことによって 組織を融解する。遠心分離操作によって細胞を回収後、組織幹及び Z又は前駆細 胞培養用の無血清培地で培養し、 2〜3週間毎に継代を行う。
[0014] 本発明のフィーダ一細胞は、組織幹及び Z又は前駆細胞を必要により線維芽細胞 に誘導し、増殖能を低下させる処理を施すことにより作製することができる。
組織幹及び Z又は前駆細胞を線維芽細胞に誘導するには、以下のような手順で 行うとよい。無血清培地中で培養した組織幹及び Z又は前駆細胞を遠心操作によつ て回収し、 37°Cで酵素処理 (Accumax™, Innovative Cell Technologies, Inc.)を行つ て分散させる。分散させた細胞を 10%血清を含む培地中で培養することによって線 維芽細胞へと分化誘導を行う。組織幹及び Z又は前駆細胞を線維芽細胞に誘導す るのは随意の工程である。組織幹 Z前駆細胞のうち、骨髄間葉系幹細胞などもともと 線維芽細胞としての性質を持つ細胞は、特別な分化誘導を必要とせず増殖能低下 処理に進むことができる。
[0015] 組織幹及び Z又は前駆細胞から誘導された線維芽細胞には、放射線照射、マイト マイシン処理などの増殖能を低下させる処理が施される。例えば、セミコンフルェント に達した線維芽細胞をマイトマイシン C添加培地で 37°C、 2時間培養する、あるいは 致死量の放射線を照射する、といった処理を行う。
本発明のフィーダ一細胞と共培養することにより、培養細胞の増殖や分化を調節す ることがでさる。
本発明のフィーダ一細胞と共培養する細胞は、ヒトのものであることが好ましい。
[0016] 本発明のフィーダ一細胞と共培養する細胞の種類は特に限定されるものではな!/、 力 角膜細胞 (例えば、角膜上皮細胞）、皮膚細胞 (例えば、表皮細胞）、心臓細胞（ 例えば、心筋細胞）、消化管細胞 (例えば、胃粘膜上皮細胞、小腸粘膜上皮細胞、 大腸粘膜上皮細胞）、骨髄細胞、胚性幹細胞、口腔粘膜細胞などを挙げることがで きる。培養する細胞中に幹及び Z又は前駆細胞が存在すれば、本発明のフィーダ一 細胞と共培養することにより、細胞の生存を維持するだけでなぐ細胞を増殖したり、 分ィ匕させることができる。培養する細胞が組織細胞である場合には、組織が再生され ることもある。再生された組織は移植することができる。
[0017] 本発明のフィーダ一細胞と共培養する細胞が角膜上皮細胞又は皮膚細胞である 場合には、培養細胞は増殖して、重層化しうる。
本発明のフィーダ一細胞と共培養する細胞が骨髄細胞又は胚性幹細胞である場 合には、培養細胞は増殖するが、重層化しないであろう。
本発明のフィーダ一細胞との共培養は、以下のようにして行うことができる。まずフィ ーダー細胞を培養皿に 70%〜90%コンフルェントになるように播種し、翌日共培養 する細胞を播種する。細胞はフィーダ一細胞と接触させて培養しても良いし、また力 ルチヤーインサート等を用いて接触させずに培養しても良 、。
[0018] 角膜上皮細胞、皮膚表皮細胞、口腔粘膜上皮細胞などを重層させる場合は、まず 血清添加培地を用いてカルチャーインサート上で細胞をコンフルェントになるまで培 養する。次に培地量を細胞が気相と液相の境界に接するまで減らし、 1週間程度培 養する。
[0019] 本発明のフィーダ一細胞と共培養することにより、移植に用いるための培養細胞を 調製することができる。限られた組織で広い範囲を被覆するために、あらかじめ羊膜 上に上皮を培養した移植片を上記方法で用意する。培養シャーレ内に羊膜を一層 敷き、ドナー角膜、あるいは患者より採取した少量の細胞を培養する。培養上皮移植 は、羊膜単独の移植に比べて早期より創傷治癒が得られるメリットがあり、炎症を抑え る効果がある。また、増殖した細胞の中には未分化な細胞も含まれていることが示唆 されており、少量の幹細胞力 角膜上皮を再生できる可能性を秘めている。手術は、 角膜を覆っている異常上皮を全て切除し、止血をする。次に、培養細胞シートを眼表 面に展開をして、縫合糸にて固定をする。培養細胞が脱落しないために、保護用コ ンタクトレンズを装用して手術は終了する。 [0020] さらに、本発明は、上記のフィーダ一細胞を含む、細胞培養キットを提供する。 本発明のキットには、フィーダ一細胞の他、培地（例えば、 F12/DMEM、 DMEM、）、 増殖因子類（例えば EGF、インスリン、コレラトキシン、ハイド口コルチゾン、トランスフエ リン、イソプロテレノール、トリョードチロニン、アデニン)などを含んでもよい。本発明 のキットを用いることにより、細胞を培養することができ、培養された細胞は移植に用 いてもよい。
実施例
[0021] 以下、本発明を実施例により具体的に説明する。本発明の範囲はこれらの実施例 により限定されることはない。
[0022] 〔実施例 1〕
,験 法及び材料
Inventigative Ophthalmology & Visual Science, May 2005, Vol.46, No.5, ρ.16ΰ«3—丄 658に記載の方法に従って、トリプシン、コラゲナーゼ及びヒアル口-ダーゼで処理し たマウス角膜実質前駆細胞を機械的に分散させた後、 10%ゥシ胎児血清 (FBS)添 カロ DMEM/F12に懸濁し、 75 cm2フラスコに 3χ106個の細胞が存在するよう播種、 4日間 37°Cで培養することで線維芽細胞に誘導した。誘導後の細胞を 4 g/mlのマイトマイ シン C (Sigma)を用いて 37°Cで 2時間処理したのち、 0.05%トリプシン EDTA処理（Invit rogen)により細胞を分散させ、 3xl06個/ mlになるようセルバンカー（十善フィールド） で希釈してディープフリーザーで凍結保存した。上皮細胞を播種する前日にこの細 胞を解凍し、 10%FBS添カ卩 DMEM/F12で希釈して 6ゥエルプレート（Falcon)に 2.5xl04 /cm2の密度で播種した。
翌日、米国アイバンク由来の強角膜切片を角膜移植に用いた残りから輪部を分離 し、外科的に虹彩、毛様体、デスメ膜、内皮、結膜を取り除いた。デイスパーゼ (Invitr ogen, 10 mg/ml) D-ソルビトール (Wako, 9 mg/ml)を添加した血清添加培地を用い て 4度でー晚処理したのち、上皮を実質から剥離させ、引き続いて 0.05%トリプシン ED TAによる 37°C、 30分処理にて上皮細胞を分散させた。上皮細胞をフイブリンゲル (ボ ルヒール、化血研, 2 mg/cm2)塗布したカルチャーインサート（Cornig, Transwell (登録 商標）， cat no 3450)に播種し、前日用意したフィーダ一細胞と約 2週間培養した。培 地には F12/DMEMに FBS (10%)、 human recombinant epidermal growth factor (Invit rogen, 10 ng/ml), human recombinant insulin (Wako, 5 μ g/ml)、 transferrin human ce 11 culture tested (Sigma, 5 μ g/mi), hydrocortisone water soluble (Sigma, 0.5 μ g/ml), DL— isoproterenol hydrochloride (Sigma 0.25 μ g/ml)、ストレプトマイシン Zペニシリン を添カ卩した Supplement hormonal epithelial medium (SHEM)に、さらにァプロチュン (W ako, 666 KlU/ml)を添カ卩したものを用い、 1週間に 3回交換した。細胞がコンフルェン トに達した後に培地量を減らして空気に曝露させ、毎日培地を交換して引き続いて 6 日間培養した。
培養後はホルマリン固定後パラフィン切片にして HE染色する力 あるいは 4% CMC 溶液 (Sakura finetek)に包埋して液体窒素で凍結し、凍結切片を作成した。凍結切 片はアセトン固定後、 10%血清添加 PBSでブロッキングし、マウスモノクロナールの抗 ケラチン 3抗体（AE5, Progen Biotechnik GmbH)、抗コネキシン 43抗体（Chemicon int ernational Inc)、饥インァグリン β 1¾η·体 (Chemicon)、抗 p63抗体 (Oncogene Researc h Products)を用いて染色した後、 Cy3標識抗マウス抗体と反応させ、蛍光顕微鏡を 用いて検出した。
コロニー形成率の測定では、 100ミリディッシュにフィーダ一細胞を播種し、翌日 100 0個の上皮細胞を播種した。これを 2週間培養した後、 10%ホルマリンで固定し、ロー ダミン Bで染色した。
¾
結果を図 1に示す。図 1Aは、培養中のマウス実質幹細胞である。図 1Bは、図 の マウス実質幹細胞を薬剤処理によりフィーダ一細胞としたものである。図 1Cは、上皮 培養の様子を示している。培養皿底部にフィーダ一細胞を、その上に置いたカルチ ヤーインサート内で上皮を培養する。図 1Dは、培養中の上皮細胞である。
このフィーダ一細胞を用いて作製した培養上皮シート（図 2、列中央）は、従来の 3T 3を用いて作製した培養上皮シート (左列)と同様に重層しており、またほぼ同様の分 化マーカー、未分化マーカーの遺伝子発現パターンを示す。すなわち、 K3陽性細胞 は最表層に、 Cx43は基底細胞を含む上皮全体に、 integerin iS 1及び p63の発現は最 表層を除く上皮全体に認められた。このことは、マウス角膜実質幹細胞を細胞源とす るフィーダ一細胞を用いても 3T3を用いても、培養上皮シートの質に差がな 、ことを示 唆している。
図 3は、ごく少数の上皮細胞を播種した際のコロニー形成率の差を示している。フィ ーダー細胞なしではまったく上皮細胞のコロニー形成が認められないのに対し、この フィーダ一細胞を用いた場合には上皮細胞のコロニー形成が認められた。このことは 、このフィーダ一細胞が上皮細胞の生存と増殖を支持できる微小環境を提供しうるこ とを示唆している。
〔実施例 2〕
実,験方法及び材料
角膜実質幹細胞 (COPs)は吉田らの方法に従って培養し、血清添加培地を用いて 線維芽細胞に誘導した（Yoshida. et al.， Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005 May;46(5): 1653-8.) oヒト骨髄間葉系幹細胞 (MASC)は SanBio社より供給を受け、同社のプロト コルに従い培養した。コンフルェントに達した細胞を mitomycin C ( 4 ug/ml, 37度、 2 時間)処理してフィーダ一細胞とし、- 80°Cで使用するまで凍結保存した。
フィーダ一細胞の上皮増殖支持能力を検討するため、ヒト輪部上皮細胞を米国ァ ィバンク角膜から酵素処理により調整し、各フィーダ一細胞を用意した径 100 mmの 培養皿上に 1000個ずつ播種して 2週間培養した。培地には SHEM (実施例 1で使用し たものと同じ)を用いた。培養後培養皿をホルマリン固定し、ローダミン Bで上皮コ口- 一を染色した。コロニー数を播種細胞数で除した百分率をコロニー形成率とした。 フィーダ一細胞が上皮の分ィ匕および重層化を支持できる力否かを検討するため、 フィーダ一細胞を 6ゥエルプレートおよびフイブリンコートしたセルカルチャーインサー トに用意し、このインサート中でヒト輪部上皮細胞を三次元培養した。セルカルチャー インサートは実施例 1と同様、 Cornig社 Transwell (登録商標）（cat no 3450)にボルヒ ール (ィ匕血研, 2 mg/cm2)を塗布したものを用いた。ヒト上皮細胞がコンフルェントに達 した後、引き続いて 1週間 air lift cultureを行い、培養上皮シートを作成した。培養上 皮シートはホルマリン固定後パラフィン切片にして HE染色し、組織学的検定に供す るか、あるいは新鮮凍結切片にして免疫組織学的検定に供した。免疫組織学的検定 では 1次抗体に抗 keratin 3,抗 keratin 12, iHikeratin 15,抗 connexin 43,抗 integrin b etal,および抗 p63抗体を、 2次抗体に Alexa flour標識抗体 (Invitrogen社)、核染色に DAPIを用い、蛍光顕微鏡 (Axioplan 2, Carl Zeiss社)を用いて発現の有無を検討した
[0025]
図 2に示されるとおり、角膜実質幹細胞と共培養することでも、従来使用されてきた マウス 3T3と共培養した場合と同等の培養上皮シートを作成することができた。具体 的には、角膜実質幹細胞と共培養した培養上皮は重層し、分ィ匕マーカーである K3 および Cx43を発現する細胞を含み、かつ未分化マーカーである Int blおよび p63を 発現する細胞を含んでいた。また、図 3に示すとおり、角膜実質幹細胞と共培養した 培養上皮シートは、コロニー形成できるだけの増殖能を保った細胞を維持して 、た。 一方、フィーダ一細胞と共培養しな力つた上皮細胞はほとんど重層せず、分化マー カーの発現がほとんど認められず、かつコロニー形成能を持つ細胞も維持していな 力つた。図 4、 5に示されるとおり、ヒト間葉系幹細胞由来のフィーダ一細胞と共培養し た上皮細胞も、重層した上皮シートを形成できた。フィーダ一と接触させた場合でも 接触させなカゝつた場合でも、これらの上皮シートは K3, K12を発現する分化細胞を含 んでいた。また、特に液性因子が持続的に供給された場合において（Duplex cocultu re, separated coculture)、角膜上皮幹細胞が存在する角膜輪部と同様に K15の発現 が認められた。
[0026] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
[0027] 本発明により、フィーダ一細胞が提供された。本発明のフィーダ一細胞を用いること により、移植用の培養細胞を調製することができる。

Claims

請求の範囲
[I] 糸且織幹及び Z又は前駆細胞に由来するフィーダ一細胞。
[2] 組織幹及び Z又は前駆細胞が哺乳動物のものである請求項 1記載のフィーダ一細 胞。
[3] 哺乳動物がヒトである請求項 2記載のフィーダ一細胞。
[4] 組織幹及び Z又は前駆細胞が角膜実質、皮膚又は骨髄間葉由来である請求項 1〜
3の!、ずれかに記載のフィーダ一細胞。
[5] 組織幹及び Z又は前駆細胞を必要により線維芽細胞に誘導し、増殖能を低下させ る処理を施すことを含む、フィーダ一細胞の作製方法。
[6] 組織幹及び Z又は前駆細胞が哺乳動物のものである請求項 5記載の方法。
[7] 哺乳動物がヒトである請求項 6記載の方法。
[8] 組織幹及び Z又は前駆細胞が角膜実質、皮膚又は骨髄間葉由来である請求項 5〜
7の!、ずれかに記載の方法。
[9] 細胞を請求項 1〜4のいずれかに記載のフィーダ一細胞と共培養することを含む、培 養細胞を調製する方法。
[10] 請求項 1〜4のいずれかに記載のフィーダ一細胞と共培養する細胞が哺乳動物のも のである請求項 9記載の方法。
[II] 哺乳動物がヒトである請求項 10記載の方法。
[12] 請求項 1〜4のいずれかに記載のフィーダ一細胞と共培養する細胞が、角膜細胞、 皮膚細胞、歯肉細胞、心臓細胞、消化管細胞、骨髄細胞、胚性幹細胞及び口腔粘 膜細胞力 なる群より選択される請求項 9〜11のいずれかに記載の方法。
[13] 請求項 1〜4のいずれかに記載のフィーダ一細胞と共培養する細胞が、角膜上皮細 胞又は皮膚細胞である請求項 12記載の方法。
[14] 培養細胞が重層化される請求項 13記載の方法。
[15] 培養細胞が移植に用いられる請求項 9〜14のいずれかに記載の方法。
[16] 請求項 1〜4のいずれかに記載のフィーダ一細胞を含む、細胞培養キット。
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