WO2007083644A1 - 新規タンパク質発現系 - Google Patents

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WO2007083644A1
WO2007083644A1 PCT/JP2007/050556 JP2007050556W WO2007083644A1 WO 2007083644 A1 WO2007083644 A1 WO 2007083644A1 JP 2007050556 W JP2007050556 W JP 2007050556W WO 2007083644 A1 WO2007083644 A1 WO 2007083644A1
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minus
protein
virus
strand rna
helper
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PCT/JP2007/050556
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Jun You
Toshiaki Tabata
Makoto Inoue
Tsugumine Shu
Mamoru Hasegawa
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Dnavec Corporation
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    • C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a foreign gene in a target cell comprising a step of introducing into a target cell a helper minus-strand RNA virus vector and a virus particle each packaged with a minus-strand RNA virus minigenome carrying a foreign gene. It is related with the method of expressing.
  • the present invention also relates to a helper minus strand RNA virus vector and a minus strand RNA virus minigenome.
  • the present invention relates to a method for producing virus particles each packaged with a helper minus-strand RNA virus vector and a minus-strand RNA virus minigenome, and the virus particles.
  • Non-viral protein expression system has advantages such as easy production, low cost, short-term preparation in large quantities, and high biosafety, but in vitro gene transfer efficiency greatly depends on the introduction reagent and cell type However, gene transfer efficiency is very low in vivo.
  • Viral protein expression systems on the other hand, often provide high gene transfer efficiency both in vitro and in vivo, but costly preparations are expensive compared to non-viral vectors, and biosafety distribution is important. There are also disadvantages such as consideration. Since these two types of protein expression systems have advantages and disadvantages, respectively, development of a new protein expression system with higher performance has been desired.
  • Sendai virus vector (hereinafter sometimes referred to as SeV) is a cytoplasmic virus vector and has high gene transfer efficiency and expression efficiency both in vitro and in vivo. It has excellent performance such as sustained expression. However, it also has the common weaknesses of viral vectors, such as high production costs and difficulty in large-scale preparation in a short period of time.
  • DI sex deficient particles
  • Non-patent literature l Vullienoz et al, Journal of General Virology, 86: 171-180, 2005 Disclosure of invention
  • an object of the present invention is a virus in which a helper negative strand RNA virus vector and a minus strand RNA virus minigenome carrying a foreign gene are packaged.
  • An object of the present invention is to provide a method for expressing a foreign gene in a target cell, which comprises the step of introducing particles into the target cell.
  • Another object of the present invention is to provide a helper minus-strand RNA viral vector and a minus-strand RNA virus minigenome.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing virus particles each packaged with a helper minus-strand RNA virus vector and a minus-strand RNA virus minigenome, and to provide the virus particles.
  • the present inventors have developed a new protein expression system that is easy to produce, that can be mass-produced in a short period of time, while taking advantage of the superior performance of SeV vectors.
  • SeV minigenome (MiniSeV) system.
  • the SeV minigenome system has advantages such as easy production and high transcription and replication efficiency, but it requires normal virus or NP, P, and L expression plasmids as helpers for autonomous replication in cells. Therefore, it was difficult to complete as a vector with high expression ability.
  • the present inventors have devised a system of the MiniSeV-SeV particle coexisting protein expression system (Fig.
  • SeV / ⁇ F which lacks SeV fusion protein (F protein), and a SeV minigenome cDNA plasmid carrying a gene of interest (GOI), T7 RNA polymerase and SeV fusion protein (F protein) It was introduced into the production cells. Thereafter, the culture supernatant in which MiniSeV / GOI particles and SeV / AF particles coexisted was collected.
  • RNA polymerase I promoter when used in the SeV minigenome of the above-mentioned coexisting particle system, or when a tag sequence (HA-Tag) is added to the target gene, the target gene can be introduced into the target cell at high efficiency, In addition, it has become clear that high expression in the cells and high expression efficiency are realized.
  • the present inventors have succeeded in constructing a MiniSeV-SeV particle coexisting protein expression system that retains a high ability to introduce a target gene into a target cell and a high expression ability of the target gene in the target cell.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following [1] to [51].
  • a method for expressing a foreign gene in a target cell comprising the following steps (a) to (c):
  • step (c) Step of introducing the virus particles recovered in step (b) into target cells
  • [2] The method according to [1], further comprising the step of introducing a vector expressing NP protein, P protein, and L protein into the production cell in step (a).
  • the helper minus-strand RNA virus vector is a ribonucleoprotein (RNP) complex or a virus-like particle (VLP).
  • the helper minus-strand RNA virus vector is modified so as not to express any one or more of paramyxovirus F protein, M protein or HN protein, and the 5 ′ end trailer [6]
  • [15] Production cell strength The method according to any one of [1] to [14], which is a cell expressing T7 RNA polymerase.
  • the target cell is any one of 293T cell, A549 cell, BHK-21 cell, C2C12 cell, HeLa cell, LLC-MK cell, MDCK cell, or NIH3T3 cell,
  • Paramyxovirus F protein, M protein, or HN protein was modified so as not to express one or more proteins, and the trailer region at the 5 'end was replaced with the leader region A helper minus-strand RNA viral vector containing a minus-strand single-stranded RNA.
  • helper minus-strand RNA virus vector is a ribonucleoprotein (RNP) complex or a virus-like particle (VLP).
  • RNP ribonucleoprotein
  • VLP virus-like particle
  • a minus-strand RNA virus minigenome carrying a foreign gene A minus-strand RNA virus minigenome carrying a foreign gene.
  • helper minus-strand RNA virus vector according to any one of [21] to [27] and the minus-strand RNA virus minigenome according to any of [28] to [34] or any of the above as target cells.
  • a method of expressing a foreign gene in a target cell comprising a step of introducing.
  • a method for producing virus particles comprising the following steps (a) and (b):
  • step (a) The method according to [36], further comprising a step of introducing a vector expressing NP protein, P protein, and L protein into the production cell in step (a).
  • the helper minus-strand RNA virus vector is a ribonucleoprotein (RNP) complex or a virus-like particle (VLP).
  • the helper minus-strand RNA viral vector is modified so as not to express any one or more of the paramyxovirus F protein, M protein or HN protein, and the 5 ′ end trailer
  • the method according to [41] which is a vector comprising a negative-strand single-stranded RNA substituted with a regional force S leader region.
  • FIG. L Construction diagram of pSeVagp 55 / AF.
  • FIG. 2 is a construction diagram of pSeVagp55 / (P / C) m / ⁇ F.
  • FIG. 4 is a construction diagram of SeV single-promoter minigenome cDNA.
  • FIG. 5 is a construction diagram of SeV double-promoter minigenome cDNA.
  • FIG. 6 is a diagram showing the mechanism of a MiniSeV-SeV / ⁇ F particle coexisting protein expression system.
  • FIG. 7 A photograph showing the effect of Helper SeV design on coexistence particle productivity.
  • A Production of coexisting particles in packaging cell
  • B Infection of target cell with coexisting particles
  • FIG. 8 A photograph and a diagram showing the effect of MiniSeV cDNA design on coexistence particle productivity.
  • A Production of coexisting particles in Packaging Cell
  • B Titer of produced coexisting particles
  • FIG. 9 is a photograph and a diagram showing a comparison of coexistence particle productivity using SeVagp55 / ⁇ F and SeVagp55 / (P / C) m / ⁇ F.
  • A Production of coexisting particles in Packaging Cell
  • B Infection of Target Cell with coexisting particles
  • C Titer of coexisting particles produced
  • FIG. 10 A photograph and a diagram showing an improvement in the quantity ratio between MiniSeV and Helper SeV in coexisting particles.
  • A Production of coexisting particles in Packaging Cell
  • B Titer of produced coexisting particles and Helper Se V / MiniSeV amount ratio
  • FIG. 12 is a photograph showing in vivo expression by coexisting particles (intranasal GFP expression).
  • FIG. 13 Tampering with MiniSeV / GFP cDNA plasmid and SeVagp55 / ⁇ F infectious particles
  • FIG. 1 A first figure.
  • FIG. 14 is a construction diagram of minigenome cDNA using RNA polymerase I promoter.
  • FIG. 15 is a construction diagram of a minigenome cDNA loaded with a gene with a HA-Tag (GFP).
  • FIG. 16 is a photograph showing in vitro expression by a coexisting particle system using RNA polymerase I promoter.
  • FIG. 17 is a photograph showing in vitro expression by a coexisting particle system carrying a gene with HA-Tag.
  • the present inventors introduced a helper minus-strand RNA viral vector and a minus-strand RNA virus minigenome carrying a foreign gene into a production cell, and each packaged virus particle in the production cell. It was found that high introduction efficiency and expression efficiency of the target gene can be realized by introduction into the target cells.
  • the present invention is based on these findings.
  • the present invention relates to a method for expressing a foreign gene in a target cell, comprising the following steps (a) to (c).
  • step (c) Step of introducing the virus particles recovered in step (b) into target cells
  • the minus-strand RNA virus is a virus containing as a genome RNA of a minus strand (an antisense strand complementary to a strand encoding a viral protein). Negative strand RNA viruses are also called negative strand RNA viruses.
  • the minus-strand RNA virus used in the present invention is particularly a single-strand minus-strand RNA. Viruses (also referred to as non-segmented minus-strand RNA viruses) are preferred.
  • Single-stranded negative-strand RNA virus refers to a virus having a single-stranded negative strand [ie, minus strand] RNA in the genome.
  • Such viruses include noramyxovirus (Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, and Pneumovirus rot), Funo'towinoles (including the genus Rhabdovindae; Vesiculovirus, Lyssavirus, and Ephemerovirus), filovirus Viruses belonging to families such as (Filoviridae), Buyaviridae (including Buny avirus, Hantavirus, Nairovirus, and Phlebovirus genera), and arena vinores (Are naviridae) are included.
  • the negative-strand RNA viral vector used in the present invention may be a defective vector that may or may not have the ability to propagate.
  • “Having a transmission ability” means that when a viral vector infects a host cell, the virus replicates in the cell and infectious virus particles are produced.
  • the deficient vector include a vector deficient in at least one gene encoding a protein constituting the envelope. Specific examples include vectors lacking at least one of genes encoding envelope-constituting proteins such as F, H, HN, G, M, and Ml, although they vary depending on the type of virus (WO00). / 70055 and WO00 / 70070; Li, H.-0. Et al, J. Virol. 74 (14) 6564-6569 (2000)).
  • Paramyxovirus is preferably Paramyxovirinae (Respirovirus genus, Rubra virus) A virus belonging to the genus Respiro virus (also referred to as Paramyxovirus) or a derivative thereof.
  • Respiro virus also referred to as Paramyxovirus
  • Viruses whose genes have been altered, viruses that have been chemically modified, and the like are included.
  • respirovirus viruses to which the present invention can be applied include human parainfluenza virus type 1 (HPIV-1), human parainfluenza virus type 3 (HPIV-3), ushipaline fluenza virus type 3 (BPIV-3), This includes Sendai virus (also called mouse parinfluenza virus type 1) and simian parainfluenza virus type 10 (SPIV-10).
  • the paramyxovirus is most preferably Sendai virus. These viruses may be derived from natural strains, wild strains, mutant strains, laboratory passage strains, artificially constructed strains, and the like.
  • Sendai virus the genome size of a natural virus is about 15,000 bases, the negative strand is followed by a short 3 'leader region, NP (nucleocapsid), P (phospho). , M (Matrix), F (Fusion), HN (Hemagolechurn-Neura Minidase), and L (Large) proteins are lined with 6 genes, short V, 5 'trailer region at the 5' end Have.
  • Paramyxovirus "NP, P, M, F, HN, and L genes” encode nucleocapsid, phospho, matrix, fusion, hemaggluten-neuramidase, and large protein, respectively. It refers to a gene.
  • Phospho (P) protein is a phosphate protein that is a small subunit of RNA polymerase.
  • Matrix (M) protein functions to maintain the internal force of the virus particle structure.
  • the fusion (F) protein is a membrane fusion protein involved in entry into the host cell, and the hemadalunno-ilaminidase (HN) protein is a protein involved in binding to the host cell. Large proteins are the large subunits of RNA polymerase.
  • Each gene has an individual transcription control unit, and each gene force also transcribes a single mRNA and transcribes a protein.
  • a nonstructural protein (C) that is translated using a different ORF and a protein (V) that is created by RNA editing in the middle of reading the P protein mRNA are translated.
  • C nonstructural protein
  • V protein
  • each gene in each virus belonging to the subfamily Nomyxovirus is expressed as follows in order from 3 '.
  • the NP gene is sometimes referred to as “N gene”.
  • accession number of the nucleotide sequence database of each gene of Sendai virus is M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218 for the N gene, M30202, M30203, M30204, M55565 for the P gene.
  • M gene is D11446, K02742, M30202, M30 203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056
  • F gene is D00152, D 11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131, HN gene D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X0058 6, X02808, X56131, L gene D00053, M30202, M30203, M30204, M69 040, X00587, X58886 See
  • the viral genes encoded by other viruses are as follows: CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128
  • the minus-strand RNA virus minigenome is a portion of the genome that has been deleted. Therefore, a helper virus having a function of complementing the deleted gene is required for growth.
  • a helper virus having a function of complementing the deleted gene is required for growth.
  • the interference-deficient particles that are necessary and suppress the growth of helper virus those derived from minus-strand RNA viruses! Uh.
  • the minus-strand RNA virus minigenome can introduce a desired foreign gene into genomic RNA.
  • a foreign gene encodes a full-length natural protein without restriction, a partial fragment thereof (7 amino acids or more, preferably 8, 10, or 15 amino acids or more), or a fusion polypeptide of these and other polypeptides. Even so!
  • a recombinant viral vector into which a foreign gene has been introduced can be obtained by inserting a gene encoding the gene into an antisense into the genome of a minus-strand RNA virus minigenome.
  • Transcription and replication efficiency is better when the number of genes mounted on the minigenome is smaller (the genome size is shorter). It is most preferable to delete all the proteins constituting the minus-strand single-stranded RNA virus in the minus-strand RNA virus minigenome of the present invention.
  • the insertion position of the gene can be selected, for example, from a desired region of the protein non-coding region of the viral genome, for example, the 3 'leader region and 3' end of genomic RNA closest to the viral protein ORF. Between each viral protein ORF and / or between the viral protein ORF closest to the 5 ′ end and the 5 ′ trailer region. In the minus-strand RNA virus minigenome from which multiple genes are deleted, it may be inserted into the deleted region. When introducing a foreign gene into the nora myxoviridae virus minigenome, insert it so that the polynucleotide chain length of the inserted fragment into the genome is a multiple of 6. (Kolakofski, D. et al, J. Virol.
  • E- ⁇ S sequence should be constructed between the minus-strand RNA virus minigenome ORF. Two or more foreign genes can be inserted in tandem via the E- ⁇ S sequence.
  • the minus-strand RNA virus minigenome of the present invention may have one or more genomic promoters.
  • the genomic promoter is not particularly limited, but an RNA polymerase I promoter can be mentioned as an example.
  • RNA polymerase I promoter can be mentioned as an example.
  • a cell that expresses RNA polymerase I in a cell is used as a production cell, it is not necessary to supply RNA polymerase I with a foreign vector (helper minus-strand RNA virus vector), and the supply cost is eliminated.
  • high expression efficiency of the gene can be realized as with the T7 system.
  • the expression level of a foreign gene can be regulated by the type of transcription initiation sequence added upstream of the gene (3 'side of the negative strand (negative strand)) (WO01 / 18223). Moreover, it can be controlled by the insertion position of the foreign gene on the genome, and the expression level becomes lower as it is inserted closer to 3 ′ of the minus strand, and the expression level becomes lower as it is inserted closer to 5 ′.
  • a gene encoding a foreign polypeptide is preferably linked to a transcription initiation sequence with high efficiency and inserted near the 3 ′ end of the minus-strand genome.
  • it is inserted between the 3 ′ leader region and the viral protein ORF closest to 3 ′.
  • it may be inserted between the viral protein gene closest to 3 'and the ORF of the second viral protein gene, or between the second and third viral protein genes from 3'.
  • Particularly preferred are 3'-UCCCAGUUUC-5 '(SEQ ID NO: 23), 3 -UCCCACUUAC-5' (SEQ ID NO: 24), and 3 UCCCACUUU C-5 '(SEQ ID NO: 25).
  • sequences are expressed as 5'-AGGGTCAAAG-3 '(SEQ ID NO: 26) and 5'-AGGGTGAATG-3' Column number: 27), and 5'-AGGGTGAAAG-3 '(SEQ ID NO: 28).
  • E sequence of the Sendai virus vector for example, 3′-AUUCUUUU-5 ′ (SEQ ID NO: 29) (5′-TAAGAAAAA-3 (SEQ ID NO: 30) in the DNA encoding the plus strand) is preferable.
  • 3′-GAA-5 ′ (5′-CT T-3 ′ for plus-strand DNA) may be used as the I sequence.
  • a base sequence encoding a Tag sequence may be added to the foreign gene of the present invention.
  • a Tag sequence By adding a Tag sequence, it is possible to confirm the expression of a foreign gene even when the function of the foreign gene is unknown.
  • the position to which the Tag sequence is added is not particularly limited, and may be added to the amino terminal side of the foreign gene, or may be added to the carboxyl terminal side.
  • the type of Tag sequence is not particularly limited, but an HA-Tag sequence can be used as an example.
  • the helper minus-strand RNA virus vector means a minus-strand RNA virus minigenome that has a function of complementing a gene from which the minus-strand RNA virus minigenome has been deleted. Indicates a strand RNA virus vector.
  • the helper minus-strand RNA viral vector of the present invention may be a ribonucleoprotein (RNP) complex or a virus-like particle (VLP).
  • RNP ribonucleoprotein
  • VLP virus-like particle
  • Paramyxoviruses generally contain a complex of RNA and protein (ribonucleoprotein; RNP) inside the envelope.
  • RNP ribonucleoprotein
  • the RNA contained in RNP is a single-stranded (negative) single-stranded RNA that is the genome of paramyxovirus. This single-stranded RNA binds NP protein, P protein, and L protein, and RNP Forming.
  • the RNA contained in this RNP becomes a trap for transcription and replication of the viral genome (Lamb, RA, and D. Kolakofsky, 1996, Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Pp.1177—1204.
  • the minus-strand single-stranded RNA (genomic RNA) in the helper minus-strand viral vector of the present invention typically preferably expresses NP protein, P protein, and L protein, It is not limited to this.
  • a paramyxovirus is obtained using a helper minus-strand RNA virus vector or a minus-strand RNA virus minigenome. As long as the NP protein, P protein, and L protein are expressed.
  • the minus-strand single-stranded RNA (genomic RNA) in the helper minus-strand viral vector of the present invention is modified so as not to express all or part of the F protein, M protein, and / or HN protein.
  • Noramxovirus F protein is involved in membrane fusion to the host cell membrane, and HN protein is involved in membrane adhesion.
  • M protein is a protein that maintains the viral particle structure and internal forces.
  • the virus vector of the present invention does not express genomic RNA F, M, and HN proteins, and therefore does not have particle forming ability and spreadability.
  • the infectious virus particle cannot be produced in the host cell and the daughter virus cannot enter the cells adjacent to the infected cell.
  • the viral vector of the present invention may produce infectious particles.
  • the F protein, M protein and / or HN protein are co-expressed when reconstructing the viral vector of the present invention, the reconstructed viral vector has infectivity to the host.
  • a force F gene that can be modified so as not to express the envelope protein is missing.
  • the NP, P, and L genes encoded in the genome of the vector may be the virus-derived gene sequences as they are, but the proteins encoded by these genes bind to the genomic RNA and replicate the RNP in the cell. As long as it has activity, a mutation may be introduced.
  • a minus-strand single-stranded RNA encoding a polypeptide in which one or more amino acids of the polypeptide encoded by the minus-strand RNA containing the base sequence of these genomic RNAs has been deleted, substituted, inserted or added, the genome
  • the negative strand single-stranded RNA that is hybridized under stringent conditions with the complementary strand of the negative strand RNA containing the base sequence of RNA also has NP, P, and L proteins encoded by the gene in the RNA.
  • it can be the genomic RNA of the vector of the present invention.
  • Such mutations can be made by techniques well known by those skilled in the art.
  • hybridization conditions are suitable for those skilled in the art. It can be selected as appropriate. For example, in a hybridization solution containing 25% formamide, 50% formamide under severe conditions, 4 X SSC, 50 mM Hepes pH 7.0, 10 X Denhardt's solution, 20 g / ml denatured salmon sperm DNA, 42 ° After prehybridization at C, perform hybridization at 42 ° C.
  • a polypeptide encoded by a polynucleotide isolated using such a hybridization technique usually has high homology in amino acid sequence with the polypeptide encoded by the ( ⁇ ) strand RNA.
  • High homology means at least 40% or more, preferably 60% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably at least 95% or more, more preferably at least 97% or more (e.g.
  • sequence homology The identity of the amino acid sequence is determined by, for example, the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993) by Karlin and Altschul. Can be determined by.
  • BLASTX Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403-4 10, 1990
  • wordlength 3
  • BLAST and Gapped BLAST programs use the default parameters of each program. Specific methods for these analysis methods are known &) (nttp: //www.ncbi.nlm.nih.gov.).
  • helper minus-strand RNA viral vector of the present invention may be a vector containing a minus-strand single-stranded RNA substituted with a 5'-end trailer single-region force S-leader region.
  • Genomic transcription and replication efficiency of the antigenome promoter existing in the end trailer region ⁇ is higher than the genome promoter present in the end leader region. Therefore, the end end trailer region becomes the 3 'end leader region. Substitution reduces the helper virus genome transcription and replication efficiency, reduces competition with the minigenome, and results in higher expression of the minigenome protein (Le Mercier P. et al. J Virol. 2002 76 (11): 5492-5502).
  • helper minus-strand RNA viral vector of the present invention may retain mutations in the P gene and the Z or C gene. This mutation is a minor It may be a mutation that reduces cell damage.
  • the site where such mutation occurs is not particularly limited, but the 9th Lys (K9), 13th Glu (E13), 17th Glu 17), 29th (129), 38 of SeVP protein 361 "(338), 39th 01 ⁇ 39), 41st 13 ⁇ 4" (Ding 41), 47th Arg (R47), 48th Ser (S48), 52nd Asn (N52), 55th Asn (N 55), 56th Thr (T56), 58th Gin (Q58), SeV C protein 16th Leu (L1 6), 17th 1 ⁇ 3 (1 17), 18 Lyth (K18), 21st Lys (K21), 22nd Leu (L22), 25th Arg (R25), 27th Gin (Q27), 28th Glu (E28), 30th Glu (E 30), 35th Met (M35
  • amino acids include basic amino acids (eg, lysine, arginine, histidine), acidic amino acids (eg, aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar amino acids (eg, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, thixin, cysteine), non-amino acids.
  • basic amino acids eg, lysine, arginine, histidine
  • acidic amino acids eg, aspartic acid, glutamic acid
  • uncharged polar amino acids eg, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, thixin, cysteine
  • Polar amino acids eg, alanine, norine, leucine, isoleucine, proline, ferrolanine, methionine, tryptophan
  • j8 branched amino acids eg, threonine, parin, isoleucine
  • aromatic amino acids eg, tyrosine, ferrolanine
  • Substituting amino acids other than those belonging to the group to which the amino acids belong, such as tryptophan and histidine can be classified into powerful amino acids.
  • basic amino acids can be substituted with acidic or neutral amino acids
  • polar amino acids can be substituted with nonpolar amino acids
  • a mutation may be introduced into the L protein.
  • L protein mutation sites include substitution of 1197 Asn (N1197) and / or 1795 Lys (K1795) with other amino acids, or substitution of homologous sites of other minus-strand RNA virus L proteins. It is done. Particularly preferred are L protein genes having both of these two mutations of the L protein.
  • the amino acid mutation may be a substitution with another desired amino acid, but is preferably a substitution with an amino acid having a different side chain chemistry as described above. For example, as described above, substitution with a different group of amino acids may be mentioned. Specific examples include substitution of N1197 with Ser (N1197S) and substitution of K1795 with Glu (K1795E).
  • the helper minus-strand RNA viral vector of the present invention may contain the minus-strand single-stranded RNA described in (a) or (b) below. (a) minus-strand single-stranded RNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10
  • stringent hybridization conditions refer to 6M urea, 0.4% SDS, 0.5 X SSC conditions, or equivalent stringency hybridization conditions. Isolation of DNA with higher homology can be expected by using conditions with higher stringency, for example, 6M urea, 0.4% SDS, 0.1 X SSC.
  • the isolated DNA is considered to have high homology with the amino acid sequence of the target protein at the amino acid level. High homology means that the entire amino acid sequence is at least 50% or more, more preferably 70% or more, more preferably 90% or more (eg, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more). Refers to the identity of the sequence.
  • the helper minus-strand RNA virus vector of the present invention may be a wild-type Sendai virus vector.
  • helper minus-strand RNA virus vector described above and a minus-strand RNA virus minigenome carrying a foreign gene are introduced into production cells.
  • a vector expressing NP protein, P protein, and L protein may be further introduced into the production cell.
  • a desired mammalian cell or the like can be preferably used as the “production cell”. Specifically, for example, LLC-MK cells derived from monkey kidney (ATCC CCL-7)
  • CV-1 cells eg, ATCC CCL-70
  • BHK-21 cells derived from hamster kidney eg, ATCC CCL-10
  • human-derived cells e.g., human-derived cells, and the like.
  • the force capable of mentioning BHK-21 cells is not particularly limited.
  • Minus-strand RNA virus minigenome cDNA can be introduced into cells by the following methods: (0) Making a DNA precipitate that can be taken up by the target cells; (Iii) Instantly open holes in the target cell membrane that allow DNA molecules to pass through with an electric pulse. There are methods.
  • transfection reagents can be used. Examples include Lipofectamine 2 000 (Invitrogen Cat. No. 11668-019), DOTMA (Boehringer), Superfect (QIAGEN # 301305), DOTAP, DOPE, DOSPER (Boehringer # 1811169).
  • An example of (i) is the transfection method using calcium phosphate, and the DNA that has entered the cell by this method is taken into the phagocytic vesicle. A sufficient amount of DNA also enters the nucleus. (Graham, FL and Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silverstein, S., 1977, Cell 11: 223) 0 Chen and Okayama 1) Incubate cells with coprecipitate incubation conditions 2-4% CO, 35 ° C, 15-24 hours, 2) DNA is more circular than linear ) Precipitation
  • Method (ii) is suitable for transient transfer, which was previously prepared by preparing a mixture of DEAE-dextran (Sigma # D-9885 MW 5 X 105) at the desired DNA concentration ratio. Since many of the complexes are broken down in the endonomes, it is possible to hold the black mouth quince to enhance its effectiveness (Calos, MP, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • (iii) is a method called electroporation, which is less versatile than the methods (0 and (ii)).
  • the efficiency is the duration of the pulse current, the shape of the pulse, It is considered to be good under the optimal conditions of electric field (gap between electrodes, voltage), buffer conductivity, DNA concentration, and cell density.
  • a transfection reagent is suitable in the present invention.
  • Lipofectamine 2000 Invitrogen Cat. No. 11668-019
  • Superfect Transfection Ragent QIAGEN, Cat No. 301305
  • DOSPER Liposomal Transfection Reagent Boehringer Mannheim, Cat No. 1811169
  • Reconstitution of the helper minus-strand RNA viral vector can be performed by a known method.
  • the titer of the recovered virus can be determined by, for example, CIU (Cell-Infected Unit) measurement or hemagglutination activity (HA) measurement (WO00 / 70070; Kato, A. et al. , 199, Genes Cells 1: 569—579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan— lipid— mediated gene delivery to vascular cells. Ed. By Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Presess: pp. 295-306, 1999).
  • CIU Cell-Infected Unit
  • HA hemagglutination activity
  • the titer can be quantified by directly counting infected cells using the marker as an index (eg, as GFP-CIU).
  • the titer measured in this way can be handled in the same way as CIU (WO00 / 70070).
  • the expression method of T7 RNA polymerase and F protein (may be mutant F5R) is not particularly limited. And methods using cells that continuously express T7 RNA polymerase and F protein (F5R).
  • the production cell expresses any one or more of F protein, M protein, and HN protein modified so as not to be expressed in the helper minus-strand RNA virus vector! / Well! /
  • These protein groups other than the viral genome can be used to introduce mutations as long as the activity in introducing nucleic acid is equal to or higher than that of the natural type, even if the amino acid sequence is not the same as the virus-derived sequence.
  • a homologous gene of another virus may be substituted.
  • viruses include the G protein of vesicular stomatitis virus (VSV) Quality (VSV-G) can be mentioned.
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • VSV-G vesicular stomatitis virus Quality
  • envelope proteins are cytotoxic, it can be expressed only when the vector is reconstituted under the control of an inducible promoter.
  • the envelope protein is expressed in the production cell when the vector is reconstituted in the cell, the envelope protein is incorporated into the minigenome virus particle to produce a viral vector that retains the infectivity of the envelope protein. Is possible.
  • Such a vector once infected with a cell, can propagate RNP in the cell, but it does not have an envelope gene itself, so it again produces a virus with the same envelope protein. I can't do it.
  • Such a vector is extremely useful particularly in fields requiring high safety such as gene therapy.
  • helper minus-strand RNA virus vector and a minus-strand RNA virus minigenomic force carrying a foreign gene are reconstituted and the production cell force is released.
  • the helper SeV / ⁇ F is expressed in the production cells that express F protein, which is a fusion protein of T7 RNA polymerase and SeV (or mutant F5R).
  • F protein which is a fusion protein of T7 RNA polymerase and SeV (or mutant F5R).
  • SeVagp55 / ⁇ F is preferred;
  • SeV minigenomic cDNA plasmid (pSeVmini / GOI) carrying the target foreign gene (GOI) is introduced, the RNA genome strength of MiniSeV / GOI is 3 ⁇ 4SeVmini by the action of T7 RNA polymerase.
  • the SeNP / ⁇ F force that is transcribed from / GOI and plays the role of Helper The NP, P, and L proteins expressing MiniSeV / GOI are formed and replicated.
  • This MiniSeV / GOI RNP is packaged as infectious MiniSeV / GOI particles using ⁇ , ⁇ expressed from Helper SeV / ⁇ F and F / F5R expressed from production cells, and infectious Helper SeV / ⁇ It is released into the culture supernatant together with F particles.
  • virus particles each packaged with a helper minus-strand RNA virus vector and a minus-strand RNA virus minigenome produced in the production cell are used. to recover.
  • the recovered virus particles can be purified to be substantially pure.
  • Purification methods include filtration (filtration), centrifugation, adsorption, column purification, etc. Can be carried out by known purification / separation methods including any combination thereof.
  • “Substantially pure” means that the virus component occupies a major proportion in the solution containing the virus vector.
  • a substantially pure viral vector composition is the total protein in a solution (except for proteins that are tailored as carriers or stabilizers).
  • the percentage of protein contained as a viral vector component is 10% (weight / weight) or more, preferably 20% or more, more preferably 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably This can be confirmed by accounting for 90% or more.
  • a method using cellulose sulfate ester or a crosslinked polysaccharide sulfate ester Japanese Patent Publication No. 62-30752, Japanese Patent Publication No. 62-33879, and Japanese Patent Publication No.
  • the present invention relates to a method for producing virus particles each packaged with a helper minus-strand RNA virus vector and a minus-strand RNA virus minigenome, each including the first and second steps.
  • a method for producing virus particles each packaged with a helper minus-strand RNA virus vector and a minus-strand RNA virus minigenome each including the first and second steps.
  • a variant such as SeVagp55AF as a helper minus-strand RNA virus vector, the amount of virus particles packaged with a minus-strand RNA virus minigenome can be improved.
  • helper minus-strand RNA virus vector minus It is necessary to equalize the strand RNA virus minigenome (the number of minus strand RNA virus minigenomes to the helper minus strand RNA virus vector is preferably increased).
  • a modified variant such as SeVagp55 / (P / C) m / ⁇ F as a helper minus-strand RNA virus vector
  • the release rate of virus particles packaged with minus-strand RNA virus minigenome Can be increased.
  • various purposes introduction's expression improvement, toxicity reduction
  • the virus particles recovered in the second step are introduced into target cells.
  • the “target cell” refers to a desired cell in which a foreign gene is expressed by introducing the viral particle of the present invention!
  • the target cell into which the viral particle is introduced may be a target cell in vitro or a target cell in vivo (that is, a foreign gene is directly expressed in an animal).
  • Target cells in vitro include 293T cells, A549 cells, BHK-21 cells, C2C12 cells, HeLa cells, LLC-MK cells, MDCK cells, or NIH3T3 cells
  • the target cells are infected with the virus particles in a desired physiological aqueous solution such as a culture solution or physiological saline.
  • the MOI multiplicity of infection; the number of infectious viruses per cell
  • the contact between the virus particles and the cells is sufficient even for a short time, for example, 1 minute or more, preferably 3 minutes or more, 5 minutes or more, 10 minutes or more, or 20 minutes or more. It may be about 5 minutes to 30 minutes.
  • the contact time may be longer than that. For example, the contact time may be several days or longer.
  • RNP containing virus genomic RNA or non-infectious virus particles virus-like particles (VLP)
  • VLP virus-like particles
  • a well-known transfection method can be used. Specifically, calcium phosphate (Chen, C. & Okayama, H. (1988) BioTechniques 6: 632-63 8; Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745), DEAE-dextran (Rosenthal, N. (1987) Methods Enzymol. 152: 704-709), various ribosome-based transcription reagents (Sambrook, J. et al.
  • Envelope viruses are known to take up host cell-derived proteins during virus particle formation, and these proteins may cause antigenicity and cytotoxicity when introduced into cells ( J. Biol. Chem. (1997) 272, 16578-16584). Therefore, it is advantageous to use RNP with the envelope removed (WO00 / 70055).
  • helper minus-strand RNA virus vector of the present invention and the minus-strand RNA virus minigenome are introduced into target cells to directly form viral RNPs in the cells and to express foreign genes in target cells. You can also.
  • Cells into which the virus particle (or virus vector) of the present invention has been introduced are cultured for about 12 hours to 5 days (preferably 1 to 3 days) to express foreign genes.
  • the viral particles of the present invention are directly administered to animals to express foreign genes.
  • Example vivo administration may be used.
  • Cells are inoculated into the animal as is or lysed as lysates.
  • Lysates of vector-infected cells can be prepared by lysing cell membranes with surfactants or by repeatedly freezing and thawing.
  • surfactant nonionic Triton X-100, Nonidet P-40, etc. are used at a concentration of 0.1 to 1%.
  • the cell mass collected by centrifugation after washing with PBS is resuspended in TNE buffer [25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, ImM EDTA, 1% Nonidet P-40] and incubated on ice for 10 to 30 minutes.
  • the protein used as an antigen is soluble in the cytoplasm
  • the supernatant obtained after removing the unnecessary insoluble fraction as a precipitate by centrifuging the obtained lysate should be used for immunization.
  • the lysate to be used at the administration site can be obtained by repeatedly freezing and thawing the cells after washing and resuspending in PBS 5-6 times.
  • the inoculation route is not particularly limited, and for example, intramuscular injection (for example, gastrocnemius), subcutaneous administration, intranasal administration (nasal nose), palm or foot scab administration, spleen direct administration, intraperitoneal administration, etc. are preferable.
  • the inoculation site may be one site or a plurality of sites (for example, 2 to 15 sites).
  • the dose varies depending on the disease, patient weight, age, sex, symptom, administration purpose, administration composition, administration method, transgene, etc., but can be determined appropriately by those skilled in the art. .
  • the inoculation amount per site is 1 ⁇ 10 4 CIU to 5 ⁇ 10 11 CIU (cell infectious unit), preferably 1 ⁇ 10 6 CIU to 1 ⁇ 10 1 in terms of virus titer. CIU is good.
  • the same kind of cultured cell line eg, Sarcoma cell line
  • 10 4 to 10 9 cells preferably 10 5 to 10 8.
  • Cells can be inoculated with cells, or lysates thereof.
  • the dose per administration is preferably 2 X 10 5 CIU to 2 X 10 1Q CIU.
  • the number of doses that can be administered can be one time or multiple in the range of clinically acceptable side effects. The same applies to the number of daily doses.
  • the protein dosage is, for example, from lOng / kg to 100 g / kg, preferably from 100 ng / kg to g / kg, more preferably 1 ⁇ g. It should be in the range of / kg to 5 / zg / kg.
  • an amount converted from the above-mentioned dose can be administered based on the body weight ratio between the target animal and human or the volume ratio (for example, average value) of the administration target site.
  • the administration target of the composition containing the vector of the present invention includes all mammals such as humans, monkeys, mice, rats, magpies, hedges, ushi, and nu.
  • helper minus-strand RNA virus vector, minus-strand RNA virus genome of the present invention, virus particles in which these are packaged, cells into which the virus particles are introduced, or lysates thereof are pharmacologically May be used in combination with any acceptable carrier or medium that is acceptable!
  • desired pharmacologically acceptable carriers or vehicles include sterilized water and physiological saline, stabilizers, excipients, buffers, preservatives, surfactants, chelating agents (EDTA, etc.), binding An agent etc. can be mentioned.
  • examples of the surfactant include nonionic surfactants, such as sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate; Glycerin fatty acid esters such as caprylate, glycerin monomylate, glycerin monostearate; polyglycerin fatty acid esters such as decaglyceryl monostearate, decaglyceryl distearate, decaglyceryl monolinoleate; polyoxyethylene sorbitan Monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan trioleate, polyoxygen Polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as lensorbitan tristearate; Polyoxyethylene sorbite fatty acid esters such as polyoxyethylene sorbite tetrastearate and polyoxyethylene
  • the surfactant may also be an anionic surfactant, for example, an alkyl sulfate having an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms such as cetyl sodium sulfate, sodium lauryl sulfate, sodium oleyl sulfate; The average number of moles of ethylene oxide added, such as sodium polyoxyethylene lauryl sulfate, is 2 to 4, and the number of carbon atoms in the alkyl group is 10
  • Typical examples include oral phospholipids; fingophospholipids such as sphingomyelin; sucrose fatty acid esters of fatty acids having 12 to 18 carbon atoms,
  • surfactants can be added in combination.
  • Preferred surfactants for use in the formulations of the present invention are polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as polysorbate 20, 40, 60 or 80, with polysorbates 20 and 80 being particularly preferred. Also preferred are polyoxyethylene polyoxypropylene glycols such as poloxamer (Pull Mouth Nick F-68 (registered trademark))!
  • the amount of surfactant added varies depending on the type of surfactant used. In the case of polysorbate 20 or polysorbate 80, it is generally 0.001 to 100 mgZmL, preferably 0.003 to 50 mgZmL, more preferably 0.005 to 2. mgZmL.
  • the buffering agents include phosphoric acid, citrate buffer, acetic acid, malic acid, tartaric acid, succinic acid, lactic acid, potassium phosphate, darconic acid, strong prillic acid, deoxycholic acid, salicylic acid.
  • examples thereof include other organic acids such as acid, triethanolamine, and fumaric acid, and carbonate buffer, tris buffer, histidine buffer, and imidazole buffer.
  • a solution formulation may be prepared by dissolving in an aqueous buffer known in the field of solution formulation.
  • concentration of the buffer is generally 1 to 500 mM, preferably 5 to 100 mM, and more preferably 10 to 20 mM.
  • the present invention also includes other low molecular weight polypeptides, proteins such as serum albumin, gelatin and immunoglobulin, saccharides such as amino acids, polysaccharides and monosaccharides, carbohydrates, and sugar alcohols. May be.
  • the amino acids include basic amino acids such as arginine, lysine, histidine, orthine, or inorganic salts of these amino acids (preferably in the form of hydrochlorides, phosphates, That is, phosphoric acid amino acid).
  • the preferred pH value is determined by appropriate physiologically acceptable buffer substances such as inorganic acids, especially hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, formic acid or their salts. Adjusted. In this case, phosphorus
  • acid salts is particularly advantageous in that a particularly stable lyophilizate is obtained.
  • the preparation is substantially free of organic acids such as malic acid, tartaric acid, succinic acid, succinic acid, fumaric acid, etc. or the corresponding anions (malate ion, tartaric acid ion, succinic acid ion, succinic acid ion, This is particularly advantageous when no fumaric acid ion or the like is present.
  • organic acids such as malic acid, tartaric acid, succinic acid, succinic acid, fumaric acid, etc. or the corresponding anions (malate ion, tartaric acid ion, succinic acid ion, succinic acid ion, This is particularly advantageous when no fumaric acid ion or the like is present.
  • Preferred amino acids are arginine, lysine, histidine or ortin.
  • acidic amino acids such as glutamic acid and aspartic acid, and their salt forms (preferably sodium salts) or neutral amino acids such as isoleucine, leucine, glycine, serine, threonine, parin, methionine, cysteine, or alanine, or Aromatic amino acids such as ferulalanin, tyrosine, tryptophan, or the derivative N-acetyl tryptophan can be used.
  • saccharides and carbohydrates such as polysaccharides and monosaccharides include dextran, gnolecose, fructose, ratatose, xylose, mannose, manolethose, sucrose, trehalose, and raffinose.
  • examples of the sugar alcohol include mannitol, sorbitol, inositol and the like.
  • aqueous solution for injection for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • an appropriate solubilizing agent such as alcohol (ethanol etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50) etc. may be used in combination.
  • it may further contain a diluent, a solubilizing agent, a pH adjuster, a soothing agent, a sulfur-containing reducing agent, an antioxidant, and the like.
  • examples of the sulfur-containing reducing agent include N-acetyl cysteine, N-acetyl homocystine, thiotate, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycol.
  • examples thereof include acids and salts thereof, sodium thiosulfate, glutathione, and those having a sulfhydryl group such as thioalkanoic acid having 1 to 7 carbon atoms.
  • examples of the anti-oxidation agent include erythorbic acid, dibutyl hydride, and the like.
  • examples include chelating agents such as propyl benzoate, disodium ethylenediamine tetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate, and sodium metaphosphate.
  • microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, and poly (methacrylic acid)
  • colloid drug delivery systems ribosomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles, and nanoparticles.
  • a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; U.S. Patent 3,773,919; European Patent Application Publication (EP) 58,481; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556; EP ⁇ 133,988 ⁇ -) 0
  • the desired pharmacologically acceptable carrier or medium to be used is not limited to the above-mentioned intermediate force, which is appropriately or in combination selected depending on the method of use.
  • a virus particle is prepared using a gene for treating a disease as a foreign gene, it becomes possible to administer gene therapy by administering the virus particle.
  • a gene expression by direct administration or a gene expression by indirect (ex vivo) administration can be performed in a foreign gene or a patient's body that can be expected to have a therapeutic effect. It is possible to express endogenous genes, etc., for which supply is insufficient.
  • nucleic acids that encode proteins that are not particularly restricted as foreign genes for example, do not code for proteins such as antisense or ribozyme! / ⁇
  • a gene encoding a bacterial or viral antigen related to an infectious disease is used as a foreign gene, immunity can be induced in the animal by administering it to the animal. That is, it can be used as a vaccine.
  • a gene having a therapeutic effect can be expressed in tumor cells or antigen-presenting cells (APC) such as DC cells using the vector of the present invention.
  • a gene having a therapeutic effect can be expressed in tumor cells or antigen-presenting cells (APC) such as DC cells using the vector of the present invention.
  • a gene having a therapeutic effect can be expressed in tumor cells or antigen-presenting cells (APC) such as DC cells using the vector of the present invention.
  • a gene having a therapeutic effect can be expressed in tumor cells or antigen-presenting cells (APC) such as DC cells using the vector of the present invention.
  • APC antigen-presenting cells
  • genes include cancer antigen Muc-1 or Muc-1-like mucin tandem repeat peptide (US Pat. No. 5,744,144), melanoma gplOO antigen and the like.
  • Such gene therapy has been widely applied to breast cancer, colon cancer, spleen cancer, prostate cancer, lung cancer and the like. It is also effective to combine cytosines that enhance the adjuvant effect
  • genes include i) a combination of IL-2 and single-stranded IL-12 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1 5): 8591-8596, 1999), ii) IL- 2 and interferon- ⁇ (US Pat. No. 5,798,100), iii) Granulocyte colony stimulating factor (GM-CSF) used alone, iv) Combination of GM-CSF and IL-4 for treatment of brain tumors (J. Neurosurgery 90 (6), 1115-1124 (1999)).
  • GM-CSF Granulocyte colony stimulating factor
  • the treatment of infectious diseases in the case of influenza, for example, the virulent strain H5N1 type envelope, in the case of Japanese lupus, for example, an envelope chimera (Vaccine, vol. 17, No. 1 5-16, 1869-1882). (1999)), in AIDS, for example, HIV gag or SIV gag protein (J. Immunology (2000) vol. 164, 4968-4978), vaccine treatment by oral administration of HIV envelope protein, polylactic acid-daricol Administration in polymers (Kaneko, H.
  • cholera for example, the cholera toxin B subunit (CTB) (Arakawa T, et al, Nature Biotechnology (1998) 16 (10): 934-8, Arak awa T, et al., Nature Biotechnology (1998) 16 (3): 292-7).
  • CTB cholera toxin B subunit
  • rabies for example, the rabies virus glycoprotein (Lodmell DL et al. al., 1998, Nature Medicine 4 (8): 949-52)
  • capsid of human papillomavirus type 6 Examples include protein LI (J. Med. Virol, 60, 200-204 (2000)).
  • pSeV TDK
  • a purified fragment containing the Se V trailer sequence (genome 5 'promoter) was used as a template for Primer agp55-IF
  • Fragment 1 was obtained by PCR using 5 -caggtttgaggatattatacatag, 24 mer (Ti column number: 1)
  • agp55-1R 5-caggattttag tttttcttactattgtc, 28 mer (SEQ ID NO: 2)
  • Primer agp55-3F Fragment 3 was obtained by PCR using 5-, ctcttgttggtgggtcggcatggcatctc, 30mer (SEQ ID NO: 3)) and agp55-3R (5-ttagctcactcattaggcaccccag, 25mer (first tl column number: 4)).
  • pSeV (TDK) was digested with restriction enzymes Kas I and Not I, and purified as a SeV Leader promoter fragment Kgenome ⁇ 'promoter) 3 ⁇ 4r fragment Template.
  • Primer agp55-2F (5-gtaagaa aaactaaaatcctgtataacttc, ⁇ mer 3 ⁇ 4 ⁇ No .: Fragment 2 was obtained by PCR using 5 and agp55-2R (5 -gccgacccaccaaacaag agaaaaaacatg, 30 mer (SEQ ID NO: 6)).
  • Sac PSeVagp55 / AF SEQ ID NO: 7
  • Sac PSeVagp55 / AF SEQ ID NO: 7
  • agp55 is Leader -Leader type (Trailer replaced with Leader)
  • ⁇ F means that the F gene is missing Show.
  • SeV / 4C (-) / w was subjected to virus cloning by the limiting dilution method, RNA genome was extracted from each clone, RT-PCR was performed, and the genome sequence was examined. Clone 4 with numerous mutations in the P / C gene was obtained.
  • RNA genome of this clone 4 was used as a template, Primer 3 ⁇ 4eVF RI 9 (5 — atgggtatcctgcatgcctaggag, 24 mer (Tatsumi [J: 8)) and SeVR2111 (5, -atcgattatcttgggtcgacg, 21 mer (SEQ ID NO: 9) ) was used to obtain a fragment (SEQ ID NO: 10) having Sph I and Sal restriction enzyme sites at both ends.
  • the virus is produced using LLC-MK / F / Ad cells.
  • the supernatant after P1 was added to CIU Ass
  • SeVminiSP / GOI with a normal single-promoter (GP) and SeVminiDP / GOI with a double-promoter (GP58A-GPdl2) two types of minigenomes are designed.
  • GP normal single-promoter
  • GP58A-GPdl2 double-promoter
  • Primer Not GFP-N (5-agttcacgcggccgcagatcttcacgatggtgagcaagggcgaggagctg, 50 mer) , 65 mer (SEQ ID NO: 13)) Not I-GFP-Sac II fragment obtained by PCR using Not I and Sac II, purified, and used as a GFP insert in the same manner with Not I and Sac II.
  • PSeV (TDK) vector including Not I and Sac II sites. 437-670 positions indicate the MiniSeV genomic sequence.
  • MiniSeV / GFP genome sequence is shown in SEQ ID NO: 15. 1st to 137th and 858th to 99th
  • the 6th position shows the MiniSeV genome sequence
  • the 138th to 857th positions show the ORF sequence of the loaded GFP.
  • the sequence of Primer Not I-GOI-N is "5,-agttcacgcggccgcagatcttcacg (SEQ ID NO: 16) + the first 18-24 sense sequence including the Start codon of G OI ORF", and Primer GOI- 3 ⁇ 4ac II—C "5 -caggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaa ( ⁇ ⁇ ⁇ : 1 + phosphorus
  • the final 18-24 antisense sequence, including the Kerr + GOI-ORF Stop codon, is adjusted so that the linker is 0-2 bases and the total number of genomes is a multiple of 6.
  • Primer 224N (5,-ataccgca with pMiniSeV / GFP as template
  • Position 516 shows the MiniSeV genome sequence
  • positions 658 to 1377 show the ORF sequence of the loaded GFP.
  • Helper SeV / ⁇ F (SeVagp55 / ⁇ F is preferred for production cells expressing F protein (which can be mutant F5R), which is a fusion protein of T7 RNA polymerase and SeV!
  • F protein which can be mutant F5R
  • F protein which can be mutant F5R
  • pSeVmini / GOI the SeV minigenome cDNA plasmid carrying the target gene (GOI)
  • the RNA geonome of MiniSeV / GOI is transcribed from pSeV mini / GOI by the action of T7 RNA polymerase. Playing a role! /, Expressed from SeV / ⁇ F!
  • T7 RNA polymerase and F / F5R are not particularly limited, and examples thereof include a method of temporary expression using a plasmid and the like, and a method using T7 RNA polymerase and F / F5R sustained expression cells.
  • T7 RNA polymerase and F / F A cell that continuously expresses both 5R proteins is preferred, but a cell that expresses either of them may be used.
  • This MinSeV / GOI RNP is packaged as infectious MiniSeV / GOI particles using ⁇ , ⁇ expressed from Helper SeV / ⁇ F and F / F5R expressed from production cells. And released into the culture supernatant.
  • MiniSeV / AF transcription / replication system NP, P, L protein
  • the target gene GOI carried in GOI is expressed.
  • Helper SeV is the force shown here with SeV / ⁇ F as an example.
  • SeV's constituent proteins NP, P, L, M, F, HN may be a type that lacks one or more! / However, these deficient proteins must also express production cell power separately.
  • Fig. 7A when SeVagp55 / AF was used as Helper SeV, the protein expression efficiency by the minigenome (percentage of GFP-expressing cells) was higher than that of normal SeV / AF.
  • the number of GFP-expressing cells shown in Fig. 7B represents the amount of MiniSeV in the produced coexisting particles! /, But the productivity of coexisting particles using SeVagp55 / ⁇ F is much higher than that of SeV / ⁇ F. I was strong.
  • the cells were cultured in a serum-free medium, and on the second day, the number of GFP-expressing cells was counted and counted as a MiniSeV titer.
  • antibody staining was performed using the Anti-SeV antibody DN2, and the number of DN2-positive cells was counted and counted as a helper SeV titer.
  • Example 7 Comparison of coexistence particle productivity using SeVagp55 / ⁇ F and SeVagp55 / (P / C) m / ⁇ F
  • SeVagp55 / ⁇ F and SeVagp55 / (P / C) m / ⁇ F were applied to BHK / T7 / Ad (T7 RNA polymerase persistently expressing cells) seeded with 3e5 cells / well (12—well collagen-coated plate, IWAKI) the day before.
  • BHK / T7 / Ad T7 RNA polymerase persistently expressing cells
  • 3e5 cells / well (12—well collagen-coated plate, IWAKI
  • High minigenome protein expression efficiency was obtained by introducing the particles into target cells.
  • the minigenome cDNA is introduced into the production cells at the same time as the T7 polymerase expression plasmid, or the method using the Helper-SeV carrying the T7 polymerase gene. T7 polymerase must be supplied. In the case of the former method, there are fears that there will be a negative impact on production costs and production efficiency due to the large number of types of plasmids to be introduced. In the latter method, Helper-SeV force polymerase is always expressed simultaneously with the target gene (GOI) mounted on MiniSeV, which may have a negative impact on protein function analysis. In order to avoid these problems, a coexisting particle system using RNA polymerase I promoter instead of T7 promoter was studied.
  • GOI target gene
  • Primer Apa I / polmPr- F (5 -gtacgggcccgtacgtctgaggccgagggaaag, ⁇ 3mer ( ⁇ c row 3 ⁇ 4 ⁇ : and polmPr / GP- R (5- No. 32)) was used to obtain & I— polmPr Fragment, and Primer pol mPr / GP- F (5,-gacctggagataggtaccaaacaagagaaaaaac, 34mer ( ⁇ ⁇ ) using pMiniSeVDP / GFP as a template.
  • the size of the GFP gene is 0.7 kb, which is relatively short.
  • a fusion protein of GFP and Luciferase (GFP-Luci, 2.3 kb) was used as a model. It was constructed. As shown in Fig.
  • Primer GFP Not I—r (5 ⁇ atatgcggccgcaatggtgagcaagggcgaggag, 34mer and Gri 3 — Luci3m— R (5 '— tggcgtcttccttgtacagctcgtccatgccg, 32mer (I-U U number: 36)) was used to obtain Not I-GFP Fragment with PCR, and pSeV18 + Luci3m / ⁇ F as a template, ⁇ Primer GFP- Luci3m- F (5-acgagctgtacaaggaagacgccaaaacataaag, Luci3m-Not I Fragment was obtained by PCR using 35mer (S column number: 37) and Luci3m—Not I—R (5′— atatgcggccgcttacacggcgatctttccgc, 32mer (U number: 38).
  • Lipofectamine / DNA 2 1 / g).
  • ⁇ pCAGGS / NP, P, L 0.5, 0.5, 2 ⁇ g / well
  • pCA GGS / F5R 4 ⁇ g / well
  • pMiniSeV / GFP- Luci (5 ⁇ g / well) '' were introduced.
  • (Guide Reagents: Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine / DNA l. 5 l / g)
  • infection was performed with Se Vagp55 / AF at moi 10.
  • coexisting particles containing MiniSeV of le7 GFP-CIU / ml or more were produced for both the short gene (GFP, 0.7 kb) and the long gene (GFP-Luci, 2.3 kb). It was confirmed that high productivity of coexisting particles can be obtained using RNA polymerase I promoter.
  • a minigenome cDNA was constructed to attach an HA-Tag to the N-terminus of GFP.
  • Primer HA- GFP- Not I- F (5 '-atagcggccgcaatgtacccatacgacgtcccagactacgctgtgagcaagggcgaggagctg, 63mer (Iti column number: 42) and GFP- Not I-R2 (5'-tatgcggccgcttcctctg No: 43 >> PCR was performed to obtain Not-to-HA-GFP-Not I Fragment, and Primer GFP-Not I-F (see Example 12 above) and GFP-HA-Not to the same template.
  • the MiniSeV-SeV particle co-existing protein expression system developed by the present inventors has the advantage of "high gene transfer efficiency and high expression efficiency" of conventional viral vectors, and "non-viral vector simple production, short-term mass production. It also has the advantage of “easy preparation and low cost”.
  • the expression system of the present invention since the expression system of the present invention has the advantages of both conventional non-viral vectors and viral vectors, it can be used in a wide range of fields such as useful protein production, antibody production, protein functional analysis, gene therapy, and gene vaccines. Application to is expected.
  • helper virus vector when a protein-deficient type is used for a helper virus vector, it is excellent in terms of biosafety, in which infectious particles are not likely to be released again after infecting target cells with the coexisting particles. .

Abstract

　本発明者らは、MiniSeV-SeV粒子共存タンパク質発現系のシステムを考案し、本発現系の標的細胞への目的遺伝子の導入能、目的遺伝子の標的細胞における発現能について検討を行った。その結果、本発明の発現系が、標的細胞への目的遺伝子の高い導入能、目的遺伝子の標的細胞における高い発現能を保持していることが明らかとなった。

Description

明 細 書
新規タンパク質発現系
技術分野
[0001] 本発明は、ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載し たマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウィルス粒子を 標的細胞に導入する工程を含む、標的細胞において外来遺伝子を発現させる方法 に関する。また本発明は、ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターおよび、マイナ ス鎖 RNAウィルスミニゲノムに関する。さらに本発明は、ヘルパーマイナス鎖 RNAウイ ルスベクターおよびマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされ たウィルス粒子の製造方法、および当該ウィルス粒子に関する。
背景技術
[0002] これまでのタンパク質発現 (タンパク質生産、機能解析など）系は非ウィルスタンパ ク質発現系とウィルスタンパク質発現系の 2種類に大別できる。非ウィルスタンパク質 発現系は作製簡便、低コスト、短期間での大量調製が可能、生物安全性が高いなど の長所があるが、 in vitroでの遺伝子導入効率が導入試薬や細胞種類などに大きく 依存し、 in vivoにおいて遺伝子導入効率が非常に低い。一方、ウィルスタンパク質発 現系は in vitroと in vivoの両方において高い遺伝子導入効率が得られることが多いが 、非ウィルスベクターに比べてコストが高ぐ調製に時間がかかり、生物安全性への配 慮が必要などの短所もある。これら 2種類のタンパク質発現系にはそれぞれ長所と短 所があるため、より高性能な新規タンパク質発現系の開発が望まれていた。
[0003] センダイウィルスベクター（以下 SeVと標記することもある）は細胞質型のウィルスべ クタ一であり、 in vitroと in vivoの両方において遺伝子導入効率、発現効率が高いこと や、 in vitroでは長期持続発現が可能など優れた性能が有している。しかしながら、作 製コストが高ぐ短期間での大量調製が困難などウィルスベクターに共通な弱点も保 持している。
[0004] 一方、 SeVゲノムの一部が欠失しており、増殖するためには正常ウィルスをへルパ 一として必要とし、かつ正常ウィルスの増殖を抑制（干渉)する性質を持っている干渉 性欠損粒子 (DI)の存在が知られている。この DI粒子の性質を利用して、外来遺伝子 を搭載した人工 DI (SeVミニゲノム）の cDNAプラスミドを構築し、 NP,P,Lを発現するへ ルパー SeV或いはへルパープラスミドと一緒に標的細胞へ導入することにより、 目的 外来蛋白の発現を試みた例が報告されている（非特許文献 1)。このことにより、組換 え SeVベクターと比べ、よりベクター cDNAの作製が容易なミニゲノム系によるタンパク 発現が可能となった力 in vivoや in vitroにおける遺伝子導入および発現効率が低く 、これらの改善が求められている。
上記のことから、ウィルスベクターおよびミニゲノムを用いた発現系の双方の利点を 保持した新 U、発現系の開発が求められて ヽる。
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
非特許文献 l :Vullienoz et al, Journal of General Virology, 86:171-180, 2005 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヘルパーマイ ナス鎖 RNAウィルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖 RNAウィルス ミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウィルス粒子を標的細胞に導入する工程 を含む、標的細胞において外来遺伝子を発現させる方法を提供することにある。また 本発明は、ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターおよび、マイナス鎖 RNAウィル スミニゲノムの提供を課題とする。さらに本発明は、ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルス ベクターおよびマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたゥ ィルス粒子の製造方法、および当該ウィルス粒子の提供を課題とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、上記の課題を解決するために、 SeVベクターの優れた性能を活かし ながら、作製が簡便で、低コスト、短期間での大量調製が可能な新しいタンパク質発 現系を開発するため、 SeVミニゲノム (MiniSeV)系の利用を試みた。 SeVミニゲノム系 は、作製が簡便で、転写複製効率が高いなどの有利な特徴を有しているが、細胞内 での自律的な複製に正常ウィルスあるいは NP,P,L発現プラスミドをヘルパーとして必 要とするため、高発現能のベクターとして仕上げるには困難であった。 [0007] そこで、本発明者らは MiniSeV-SeV粒子共存タンパク質発現系（図 6)のシステムを 考案し、本発現系の標的細胞への目的遺伝子の導入能、 目的遺伝子の標的細胞に おける発現能について検討を行った。まず、 SeV融合タンパク質 (Fタンパク質)を欠 損させた SeV/ Δ F、および目的遺伝子 (GOI： gene of interest)を搭載した SeVミニゲノ ム cDNAプラスミドを、 T7RNAポリメラーゼと SeV融合タンパク質（Fタンパク質）が発現 している生産細胞に導入した。その後、 MiniSeV/GOI粒子と SeV/ A F粒子が共存し た培養上清を回収した。この MiniSeV/GOIと SeV/ A F共存粒子を用いることにより、 in vitroと in vivoの両方にお!、て、 目的遺伝子（GOI)の標的細胞への高!、導入効率、 および該細胞内での高い発現効率を実現した。本発明においては、 目的遺伝子 (G 01)の一例として GFPを用いた。
さらに、上記共存粒子系の SeVミニゲノムにおいて RNAポリメラーゼ Iプロモーターを 用いた場合、又は目的遺伝子に Tag配列（HA-Tag)を付加した場合にも、 目的遺伝 子の標的細胞への高 、導入効率、および該細胞内での高!、発現効率が実現される ことが明ら力となった。
[0008] 即ち、本発明者らは、 目的遺伝子の標的細胞への高い導入能、および目的遺伝子 の標的細胞における高 ヽ発現能を保持する、 MiniSeV-SeV粒子共存タンパク質発現 系の構築に成功し、これにより本発明を完成するに至った。
[0009] 本発明は、より具体的には以下の〔1〕〜〔51〕を提供するものである。
〔1〕以下の（a)〜 (c)の工程を含む、標的細胞にぉ ヽて外来遺伝子を発現させる方 法。
(a)ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナ ス鎖 RNAウィルスミニゲノムを生産細胞に導入する工程
(b)該生産細胞内で生産されたヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターおよびマイ ナス鎖 RNAウィルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウィルス粒子を回収 する工程
(c)工程 (b)で回収されたウィルス粒子を標的細胞に導入する工程
〔2〕工程 (a)において、 NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発現するべ クタ一を、さらに生産細胞に導入する工程を含む、〔1〕に記載の方法。 〔3〕ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターが、リボヌクレオプロテイン (RNP)複合 体または、ウィルス様粒子 (VLP)である〔1〕に記載の方法。
〔4〕マイナス鎖 RNAウィルスミニゲノム力 一つまたは複数のプロモーターを保持して いることを特徴とする、〔1〕に記載の方法。
〔5〕プロモーターの少なくとも一つが RNAポリメラーゼ Iプロモーターであることを特徴 とする、〔4〕に記載の方法。
〔6〕マイナス鎖 RNAウィルスがパラミクソウィルスである、〔1〕〜〔5〕の!、ずれかに記載 の方法。
〔7〕ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターまたはマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノ ムにより、パラミクソウィルスの NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発現 させることを特徴とする、〔6〕に記載の方法。
〔8〕ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターが、パラミクソウィルスの Fタンパク質、 Mタンパク質または HNタンパク質のうち、 、ずれか一つまたは複数のタンパク質を発 現しないように改変され、 5'端のトレイラ一領域力 Sリーダー領域に置換された、マイナ ス鎖一本鎖 RNAを含むベクターである、〔6〕に記載の方法。
〔9〕生産細胞が、ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターにお!/、て発現しな!、よう に改変された、 Fタンパク質、 Mタンパク質または HNタンパク質のうち、いずれか一つ または複数のタンパク質を発現していることを特徴とする、〔8〕に記載の方法。
〔10〕ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターの改変されたタンパク質力 Fタンパ ク質である、〔8〕または〔9〕に記載の方法。
〔11〕ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクター力 P遺伝子および Zまたは C遺伝子 に変異を保持することを特徴とする、〔8〕〜〔10〕のいずれかに記載の方法。
〔12〕ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクター力 下記（a)または（b)に記載のマイ ナス鎖一本鎖 RNAを含む、〔11〕に記載の方法。
(a)配列番号： 10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖一本鎖 RNA
(b)配列番号： 10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖 RNAの相補鎖とストリンジェン トな条件でノヽイブリダィズするマイナス鎖一本鎖 RNA
〔13〕パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、〔6〕に記載の方法。 〔14〕ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターが、野生型センダイウィルスベクター である〔6〕に記載の方法。
〔15〕生産細胞力 T7 RNAポリメラーゼを発現している細胞である〔1〕〜〔 14〕のいず れかに記載の方法。
〔16〕 in vitroにおける標的細胞において外来遺伝子を発現させることを特徴とする、 〔1〕〜〔15〕のいずれかに記載の方法。
〔17〕標的細胞が、 293T細胞、 A549細胞、 BHK- 21細胞、 C2C12細胞、 HeLa細胞、 L LC-MK細胞、 MDCK細胞、または NIH3T3細胞のいずれかである、〔16〕に記載の
2
方法。
〔18〕 in vivoにおける標的細胞において外来遺伝子を発現させることを特徴とする、〔 1〕〜〔15〕の 、ずれかに記載の方法。
〔19〕外来遺伝子に Tag配列が付加されていることを特徴とする、〔1〕〜〔18〕のいず れかに記載の方法。
〔20〕Tag配列力 HA-Tagである〔19〕に記載の方法。
〔21〕パラミクソウィルスの Fタンパク質、 Mタンパク質または HNタンパク質のうち、いず れか一つまたは複数のタンパク質を発現しないように改変され、 5'端のトレイラ一領域 がリーダー領域に置換された、マイナス鎖一本鎖 RNAを含む、ヘルパーマイナス鎖 R NAウィルスベクター。
〔22〕改変されたタンパク質力 Fタンパク質である、〔21〕に記載のベクター。
〔23〕 P遺伝子および Zまたは C遺伝子に変異を保持することを特徴とする、〔21〕ま たは〔22〕に記載のベクター。
〔24〕マイナス鎖一本鎖 RNAが下記（a)または (b)に記載のマイナス鎖一本鎖 RNAで ある、〔23〕に記載のベクター。
(a)配列番号： 10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖一本鎖 RNA
(b)配列番号： 10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖 RNAの相補鎖とストリンジェン トな条件でノヽイブリダィズするマイナス鎖一本鎖 RNA
〔25〕ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターが、リボヌクレオプロテイン (RNP)複合 体または、ウィルス様粒子 (VLP)である〔21〕〜〔24〕の!、ずれかに記載のベクター。 〔26〕マイナス鎖 RNAウィルスがパラミクソウィルスである、〔21〕〜〔25〕の!、ずれかに 記載のベクター。
〔27〕パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、〔26〕に記載のベクター。
〔28〕
外来遺伝子を搭載したマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノム。
〔29〕一つまたは複数のプロモーターを保持していることを特徴とする、〔28〕に記載 のマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノム。
〔30〕プロモーターの少なくとも一つが RNAポリメラーゼ Iプロモーターであることを特 徴とする、〔29〕に記載のマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノム。
〔31〕マイナス鎖 RNAウィルスがパラミクソウィルスである、〔28〕〜〔30〕の!、ずれかに 記載のマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノム。
〔32〕パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、〔31〕に記載のマイナス鎖 RNAウイ ルスミニゲノム。
〔33〕外来遺伝子に Tag配列が付加されていることを特徴とする、請求項 28〜32のい ずれかに記載のマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノム。
〔34〕 Tag配列力 HA-Tagである請求項 33に記載のマィナス鎖1^ ゥィルスミ-ゲノ ム。
〔35〕〔21〕〜〔27〕のいずれかに記載のヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクター、 および〔28〕〜〔34〕の!、ずれかに記載のマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムを標的細 胞に導入する工程を含む、標的細胞において外来遺伝子を発現させる方法。
〔36〕以下の（a)および (b)の工程を含む、ウィルス粒子の製造方法。
(a)ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナ ス鎖 RNAウィルスミニゲノムを生産細胞に導入する工程
(b)該生産細胞内で生産されたヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターおよびマイ ナス鎖 RNAウィルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウィルス粒子を回収 する工程
〔37〕工程 (a)において、 NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発現する ベクターを、さらに生産細胞に導入する工程を含む、〔36〕に記載の方法。 〔38〕ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターが、リボヌクレオプロテイン (RNP)複合 体または、ウィルス様粒子 (VLP)である〔36〕に記載の方法。
〔39〕マイナス鎖 RNAウィルスミニゲノム力 一つまたは複数のプロモーターを保持し ていることを特徴とする、〔36〕に記載の方法。
〔40〕プロモーターの少なくとも一つが RNAポリメラーゼ Iプロモーターであることを特 徴とする、〔39〕に記載の方法。
〔41〕マイナス鎖 RNAウィルスがパラミクソウィルスである、〔36〕〜〔40〕の!、ずれかに 記載の方法。
〔42〕ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターまたはマイナス鎖 RNAウィルスミニゲ ノムにより、パラミクソウィルスの NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発 現させることを特徴とする、〔41〕に記載の方法。
〔43〕ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターが、パラミクソウィルスの Fタンパク質、 Mタンパク質または HNタンパク質のうち、 、ずれか一つまたは複数のタンパク質を発 現しないように改変され、 5'端のトレイラ一領域力 Sリーダー領域に置換された、マイナ ス鎖一本鎖 RNAを含むベクターである、〔41〕に記載の方法。
〔44〕生産細胞が、ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターにお!/、て発現しな!、よ うに改変された、 Fタンパク質、 Mタンパク質または HNタンパク質のうち、いずれか一 つまたは複数のタンパク質を発現していることを特徴とする、〔43〕に記載の方法。 〔45〕ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターの改変されたタンパク質力 Fタンパ ク質である、〔43〕または〔44〕に記載の方法。
〔46〕ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクター力 P遺伝子および Zまたは C遺伝子 に変異を保持することを特徴とする、〔43〕〜〔45〕の 、ずれかに記載の方法。
〔47〕ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクター力 下記（a)または（b)に記載のマイ ナス鎖一本鎖 RNAを含む、〔46〕に記載の方法。
(a)配列番号： 10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖一本鎖 RNA
(b)配列番号： 10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖 RNAの相補鎖とストリンジェン トな条件でノヽイブリダィズするマイナス鎖一本鎖 RNA
〔48〕パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、〔41〕に記載の方法。 〔49〕ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターが、野生型センダイウィルスベクター である〔41〕に記載の方法。
〔50〕生産細胞が、 T7 RNAポリメラーゼを発現して!/、る細胞である〔36〕〜〔49〕の!、 ずれかに記載の方法。
〔51〕〔36〕〜〔50〕のいずれかに記載の方法において回収される、ヘルパーマイナス 鎖 RNAウィルスベクターおよびマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムがそれぞれパッケ一 ジングされたウィルス粒子。
図面の簡単な説明
[図 l]pSeVagp55/ A Fの構築図である。
[図 2]pSeVagp55/(P/C)m/ Δ Fの構築図である。
[図《3]SeV minigenomeのァザイン |≤3で teる。 Single— promoter ¾eV minigenome; Mi niSeV /GOI (B) Double— promoter SeV minigenome; MiniSeV /GOI (l) GPの第 58
SP DP
番目の塩基 C力 に変異、この変異によって Sの機能が大きく下がる。（2) GPの最初 1
2塩基の欠失によって 3 ' -promoter機能が大きく下がる。
[図 4]SeV single-promoter minigenome cDNAの構築図である。
[図 5]SeV double-promoter minigenome cDNAの構築図である。
[図 6]MiniSeV-SeV/ Δ F粒子共存蛋白発現系の仕組みを示す図である。
[図 7]Helper SeVデザインによる共存粒子生産性への影響を示す写真である。 (A) Pa ckaging Cellでの共存粒子の生産 （B) Target Cellへの共存粒子による感染
[図 8]MiniSeV cDNAデザインによる共存粒子生産性への影響を示す写真および図 である。 (A) Packaging Cellでの共存粒子の生産 （B)生産された共存粒子のタイター
[図 9]SeVagp55/ Δ Fと SeVagp55/(P/C)m/ Δ Fを用いた共存粒子生産性の比較を示 す写真および図である。（A) Packaging Cellでの共存粒子の生産 （B) Target Cellへ の共存粒子による感染 （C)生産された共存粒子のタイター
[図 10]共存粒子中 MiniSeVと Helper SeVの量比改善を示す写真および図である。 (A) Packaging Cellでの共存粒子の生産 （B)生産された共存粒子のタイターと Helper Se V/MiniSeV量比
[図 l l]MiniSeV /GFP-SeVagp55/ Δ F共存粒子による in vitro発現を示す写真である [図 12]共存粒子による in vivo発現 (鼻腔内 GFP発現)を示す写真である。
[図 13]MiniSeV /GFP cDNAプラスミドおよび SeVagp55/ Δ F感染性粒子によるタンパ
DP
ク質発現を示す写真である。
[図 14]RNA polymerase I promoterを用いた minigenome cDNAの構築図である。
[図 15]HA- Tag付き遺伝子（GFP)搭載 minigenome cDNAの構築図である。
[図 16]RNA polymerase I promoterを用いた共存粒子系による in vitro発現を示す写 真である。
[図 17]HA-Tag付き遺伝子を搭載した共存粒子系による in vitro発現を示す写真であ る。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明者らは、ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターおよび、外来遺伝子を搭 載したマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムを生産細胞に導入し、生産細胞内でそれぞ れパッケージングされたウィルス粒子を標的細胞に導入することで、高い目的遺伝子 の導入効率および発現効率を実現することが可能であることを見出した。本発明は、 これらの知見に基づくものである。
[0012] 本発明は、以下の（a)〜(c)の工程を含む、標的細胞において外来遺伝子を発現 させる方法に関する。
(a)ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナ ス鎖 RNAウィルスミニゲノムを生産細胞に導入する工程
(b)該生産細胞内で生産されたヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターおよびマイ ナス鎖 RNAウィルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウィルス粒子を回収 する工程
(c)工程 (b)で回収されたウィルス粒子を標的細胞に導入する工程
[0013] 本発明にお 、て、マイナス鎖 RNAウィルスとは、マイナス鎖（ウィルスタンパク質をセ ンスにコードする鎖と相補的なアンチセンス鎖）の RNAをゲノムとして含むウィルスの ことである。マイナス鎖 RNAウィルスはネガティブ鎖 RNAウィルスとも呼ばれる。本発 明にお 、て用いられるマイナス鎖 RNAウィルスとしては、特に一本鎖マイナス鎖 RNA ウィルス（非分節型（non- segmented)マイナス鎖 RNAウィルスとも言う）が好ましい。「 一本鎖ネガティブ鎖 RNAウィルス」とは、一本鎖ネガティブ鎖 [すなわちマイナス鎖] R NAをゲノムに有するウィルスを言う。このようなウィルスとしては、ノ ラミクソウィルス（P aramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus,およひ Pneumovirus腐等 む)、フノ'トウイノレス (Rhabdovindae; Vesiculovirus, Lyssavirus,および Ephemer ovirus属等を含む）、フイロウィルス (Filoviridae)、ブ-ャウィルス (Bunyaviridae; Buny avirus, Hantavirus, Nairovirus,および Phlebovirus属等を含む)、ァレナウイノレス (Are naviridae)などの科に属するウィルスが含まれる。本発明にお 、て用いられるマイナ ス鎖 RNAウィルスベクターは、伝播能を有していてもよぐ伝播能を有さない欠損型 ベクターであってもよい。「伝播能を有する」とは、ウィルスベクターが宿主細胞に感 染した場合、該細胞においてウィルスが複製され、感染性ウィルス粒子が産生される ことを指す。欠損型ベクターとしては、例えばエンベロープを構成するタンパク質をコ ードする遺伝子の少なくとも一つを欠損するベクターが挙げられる。具体的には、ウイ ルスの種類によっても異なるが、 F、 H、 HN、 G、 M、 Mlなどのエンベロープ構成タン ノ ク質をコードする遺伝子の少なくとも一つを欠損するベクターが例示できる (WO00 /70055および WO00/70070; Li, H.- 0. et al, J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000))。
本発明にお!/、て特に好適に用いられるマイナス鎖 RNAウィルスを具体的に挙げれ ば、例えばパラミクソウィルス科 (Paramyxoviridae)ウィルスのセンダイウィルス (Sendai virus) ^ニューカツスノレ;)丙ゥづ /レス (Newcastle disease virus) ^おたふく力ぜゥイノレス (mu mps virus八 J# ゥイノレス (measles virus) ^ RSヮ ノレス (respiratory syncytial virus) ^牛 疫ゥイノレス (rinderpest virus) ^ジステンノ ーウイノレス (distemper virus) ^サノレノ《ラインフ ルェンザウィルス（SV5)、ヒトパラインフルエンザウイルス 1,2, 3型、ラブドウィルス科 (rh abdoviridae)の水抱'性口内炎ウイノレス (vesicular stomatitis virus) ^狂犬病ウイノレス (Ra bies virus)等が例示できる。本発明においてパラミクソウィルスは、好ましくはパラミク ソウィルス亜科（Paramyxovirinae) (レスピロウィルス属、ルブラウィルス属、およびモ 一ピリウィルス属を含む）に属するウィルス、より好ましくはレスピロウィルス属（Respiro virus) (パラミクソウィルス属（Paramyxovirus)とも言う）に属するウィルスまたはその誘 導体である。誘導体には、ウィルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウィルス 遺伝子が改変されたウィルス、およびィ匕学修飾されたウィルス等が含まれる。本発明 を適用可能なレスピロウィルス属ウィルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイ ルス 1型 (HPIV-1)、ヒトパラインフルエンザウイルス 3型（HPIV- 3)、ゥシパラインフル ェンザウィルス 3型（BPIV- 3)、センダイウィルス (Sendai virus;マウスパラインフルェン ザウィルス 1型とも呼ばれる)、およびサルパラインフルエンザウイルス 10型（SPIV-10) などが含まれる。本発明においてパラミクソウィルスは、最も好ましくはセンダイウィル スである。これらのウィルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的 に構築された株などに由来してもよい。
[0015] 例えば、センダイウィルス (Sendai virus; SeV)の場合、天然のウィルスのゲノムサイ ズは約 15,000塩基で、ネガティブ鎖は 3'の短いリーダー領域に続き、 NP (ヌクレオキ ャプシド）、 P (ホスホ）、 M (マトリックス）、 F (フュージョン）、 HN (へマグノレチュン-ノイラ ミニダーゼ）、および L (ラージ）タンパク質をコードする 6つの遺伝子が並んでおり、短 V、5'トレイラ一領域を 5 '端に有する。
[0016] パラミクソウィルスの「NP、 P、 M、 F、 HN、および L遺伝子」とは、それぞれヌクレオキ ャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、へマグルチュン-ノイラミ-ダーゼ、およ びラージタンパク質をコードする遺伝子のことを指す。ホスホ（P)タンパク質は、 RNA ポリメラーゼの小サブユニットであるリン酸ィ匕タンパク質である。マトリックス (M)タンパ ク質は、ウィルス粒子構造を内側力 維持する機能を果たす。フュージョン (F)タンパ ク質は、宿主細胞への侵入にかかわる膜融合タンパク質であり、へマダルチュンーノ イラミニダーゼ (HN)タンパク質は宿主細胞との結合にかかわるタンパク質である。ラ ージタンパク質は、 RNAポリメラーゼの大サブユニットである。上記各遺伝子は個々 の転写制御ユニットを有し、各遺伝子力も単独の mRNAが転写され、タンパク質が転 写される。 P遺伝子からは、 Pタンパク質以外に、異なる ORFを利用して翻訳される非 構造タンパク質 (C)と、 Pタンパク質 mRNAを読み取り途中の RNA編集により作られる タンパク質 (V)が翻訳される。ノ ミクソウィルス亜科に属する各ウィルスにおける各 遺伝子は、一般に、 3'から順に、次のように表記される。また、一般に、 NP遺伝子は「 N遺伝子」と表記されることもある。
レスピロウィルス属 N P/C/V M F HN - L ルブラウィルス属 N P/V M F HN (SH) L
モービリウィルス属 N P/C/V M F H - L
例えばセンダイウィルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのァクセッション番 号は、 N遺伝子については M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218, P遺伝子については M30202, M30203, M30204, M55565, M6904 6, X00583, X17007, X17008, M遺伝子については D11446, K02742, M30202, M30 203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056、 F遺伝子については D00152, D 11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131、 H N遺伝子については D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X0058 6, X02808, X56131、 L遺伝子については D00053, M30202, M30203, M30204, M69 040, X00587, X58886を参照のこと。またその他のウィルスがコードするウィルス遺伝 子を例示すれば、 N遺伝子については、 CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV- 1, D01070; HPIV— 2, M55320; HPIV— 3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442;および Tupaia, AF079780, P遺伝子については、 CDV, X51 869; DMV, Z47758; HPIV- 1, M74081; HPIV- 3, X04721; HPIV- 4a, M55975; HPIV- 4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X 68311; SeV, M30202; SV5, AF052755;および Tupaia, AF079780, C遺伝子につい ては CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV- 1. M74081; HPIV- 3, D00047; MV, AB 016162; RPV, X68311; SeV, AB005796;および Tupaia, AF079780, M遺伝子につ いては CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV- 1, S38067; HPIV- 2, M62734; HPIV- 3, D00130; HPIV- 4a, D10241; HPIV- 4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956;およ び SV5, M32248, F遺伝子については CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN- 1, M 22347; HPIV— 2, M60182; HPIV— 3, X05303, HPIV— 4a, D49821; HPIV— 4b, D49822; Mumps, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ22470 6; RPV, M21514; SeV, D17334;および SV5, AB021962, HN (Hまたは G)遺伝子に ついては CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV- 1, U709498; HPIV- 2. D000865 ； HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, X74443; PDV, Z36979; RPV, AF132934; Se V, U06433;および SV-5, S76876、 L遺伝子については CDV, AF014953; DMV, AJ 608288; HPIV-1, AF117818; HPIV-2, X57559; HPIV-3, AB012132; Mumps, AB04 0874; MV, K01711; NDV, AY049766; PDPR, AJ849636; PDV, Y09630; RPV.Z3069 8;および SV-5, D13868が例示できる。但し、各ウィルスは複数の株が知られており、 株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。
[0018] 本発明にお!/、て、マイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムとは、ゲノムの一部を欠失して いるため、増殖するには欠失した遺伝子を相補する働きを持つヘルパーウィルスを 必要とし、かつヘルパーウィルスの増殖を抑制する干渉性欠損粒子のうち、マイナス 鎖 RNAウィルスに由来するものを！、う。
[0019] マイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムは、ゲノム RNA中に所望の外来遺伝子を導入す ることができる。外来遺伝子は特に制限はなぐ天然のタンパク質全長、その部分断 片（7アミノ酸以上、好ましくは 8、 10、または 15アミノ酸以上）、またはそれらと他のポリ ペプチドとの融合ポリペプチド等をコードするものであってよ!、。外来遺伝子が導入さ れた組換えウィルスベクターは、マイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムのゲノムに該遺伝 子をアンチセンスにコードする遺伝子を挿入することによって得られる。
ミニゲノムに搭載する遺伝子数が少な 、 (ゲノムサイズが短 、)方が転写複製効率 がよい。本発明のマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノム中のマイナス鎖一本鎖 RNAウイ ルスを構成するタンパク質を全部欠失するのが最も好まし ヽが、複数を欠失して ヽて ちょい。
[0020] 遺伝子の挿入位置は、例えばウィルスゲノムのタンパク質非コード領域の所望の部 位を選択することができ、例えばゲノム RNAの 3'リーダー領域と 3'端に最も近 、ウィル スタンパク質 ORFとの間、各ウィルスタンパク質 ORFの間、および/または 5'端に最も 近いウィルスタンパク質 ORFと 5'トレイラ一領域の間に挿入することができる。また、複 数の遺伝子を欠失するマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムでは、その欠失領域に挿入 してもよい。なお、ノ ラミクソウィルス科ウィルスミニゲノムに外来遺伝子を導入する場 合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が 6の倍数となるように挿入する ことが望ましい（Kolakofski, D. et al, J. Virol. 1998: 72; 891-899; Calain, P. and Ro ux,し J. Virol. 1993: 67; 4822-4830) 0挿入した外来遺伝子とマイナス鎖 RNAウィル スミニゲノム ORFとの間には、 E-卜 S配列が構成されるようにする。 E-卜 S配列を介して 2またはそれ以上の外来遺伝子をタンデムに並べて挿入することもできる。
[0021] 本発明のマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムは、一つまたは複数のゲノムプロモータ 一を保持していてもよい。本発明において、ゲノムプロモーターは特に制限されるも のではないが、一例として RNAポリメラーゼ Iプロモーターを挙げることができる。 RNA ポリメラーゼ Iを細胞内で発現する細胞を生産細胞として用いる場合には、 RNAポリメ ラーゼ Iを外来ベクター（ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクター）により供給する必 要がなぐその供給分のコストが省かれる。その上で、 T7系と同様に遺伝子の高い発 現効率が実現できる。
[0022] 外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流 (マイナス鎖 (ネガティブ鎖）の 3' 側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる (WO01/18223)。ま た、ゲノム上の外来遺伝子の挿入位置によって制御することができ、マイナス鎖の 3' の近くに挿入するほど発現レベルが高ぐ 5'の近くに挿入するほど発現レベルが低く なる。外来遺伝子を高発現させるためには、外来ポリペプチドをコードする遺伝子は 、効率の高い転写開始配列に連結し、マイナス鎖ゲノムの 3'端近くに挿入することが 好ましい。具体的には、 3'リーダー領域と 3'に最も近いウィルスタンパク質 ORFとの間 に挿入される。あるいは、 3'に一番近いウィルスタンパク質遺伝子と 2番目のウィルス タンパク質遺伝子の ORFの間、または 3'から 2番目と 3番目のウィルスタンパク質遺伝 子の間に挿入してもよい。
[0023] 外来遺伝子をコードする核酸をゲノムに挿入するときに付加する S配列としては、例 えばマイナス鎖 RNAウィルスの所望の S配列を用いることができる力 センダイウィル スであれば、 3'- UCCCWVUUWC- 5' (W= Aまたは C; V= A, C,または G) (配列番号 : 22)のコンセンサス配列を好適に用いることができる。特に 3'-UCCCAGUUUC-5' ( 配列番号： 23)、 3 -UCCCACUUAC-5' (配列番号： 24)、および 3し UCCCACUUU C-5' (配列番号： 25)が好ましい。これらの配列は、プラス鎖をコードする DNA配列で 表すとそれぞれ 5'- AGGGTCAAAG- 3' (配列番号： 26)、 5'- AGGGTGAATG- 3' (配 列番号： 27)、および 5'-AGGGTGAAAG-3' (配列番号： 28)である。センダイウィル スベクターの E配列としては、例えば 3'-AUUCUUUUU-5' (配列番号： 29) (プラス鎖 をコードする DNAでは 5'-TAAGAAAAA-3，（配列番号： 30))が好ましい。 I配列は、 例えば任意の 3塩基であってよぐ具体的には 3'- GAA- 5' (プラス鎖 DNAでは 5'- CT T-3')を用いればよい。
また、本発明の外来遺伝子には、 Tag配列をコードする塩基配列を付加していても よい。 Tag配列を付加することによって、外来遺伝子の機能が不明な場合であっても 、外来遺伝子の発現を確認することが可能となる。 Tag配列が付加される位置は特に 限定されるものではなぐ外来遺伝子のァミノ末端側に付加されていてもよいし、カル ボキシル末端側に付加されて 、てもよ 、。 Tag配列の種類は特に限定されるものでは ないが、一例として、 HA-Tag配列を用いることが可能である。
[0024] 本発明にお 、て、ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターとは、マイナス鎖 RNA ウィルスミニゲノムが増殖するために、マイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムが欠失した 遺伝子を相補する働きをする、マイナス鎖 RNAウィルスベクターのことを示す。
本発明のヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターは、リボヌクレオプロテイン (RNP )複合体または、ウィルス様粒子 (VLP)であってもよ 、。
[0025] パラミクソウィルスは、一般に、エンベロープの内部に RNAとタンパク質からなる複 合体（リボヌクレオプロテイン； RNP)を含んでいる。 RNPに含まれる RNAはパラミクソゥ ィルスのゲノムである（一）鎖（ネガティブ鎖）の一本鎖 RNAであり、この一本鎖 RNAが 、 NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質が結合し、 RNPを形成している。こ の RNPに含まれる RNAがウィルスゲノムの転写および複製のための铸型となる（Lamb , R.A., and D. Kolakofsky, 1996, Paramyxoviridae： The viruses and their replication . pp.1177— 1204. In Fields Virology, 3rd edn. Fields, B. N., D. M. Knipe, and P. M. Howley et al. (ed.), Raven Press, New York, N. Y.)。
[0026] 本発明のヘルパーマイナス鎖ウィルスベクター中のマイナス鎖一本鎖 RNA (ゲノム R NA)は、典型的には、 NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発現している ことが好ましいが、これに限定されない。本発明においては、ヘルパーマイナス鎖 RN Aウィルスベクターまたはマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムにより、パラミクソウィルス の NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質が発現されていればよい。
[0027] また、本発明のヘルパーマイナス鎖ウィルスベクター中のマイナス鎖一本鎖 RNA ( ゲノム RNA)は、 Fタンパク質、 Mタンパク質およびまたは HNタンパク質の全部または 一部を発現しな 、ように改変されて 、てもよ 、。ノ ラミクソウィルスの Fタンパク質は宿 主細胞膜への膜融合に、 HNタンパク質は膜接着に関わるタンパク質である。 Mタン ノ ク質は、ウィルス粒子構造を内側力も維持するタンパク質である。本発明のウィル スベクターは、ゲノム RNA力 F、 Mおよび HNタンパク質を発現しないため、粒子形 成能および伝播性を有しな ヽ。すなわち本発明のウィルスベクターが宿主細胞に感 染した場合、該宿主細胞内において感染性ウィルス粒子を産生して自らが感染した 細胞の隣接細胞へ娘ウィルスを侵入させることはできない。一方、本発明のウィルス ベクターは感染性粒子を産生してもよい。後述するように、本発明のウィルスベクター を再構築する際に Fタンパク質、 Mタンパク質および/または HNタンパク質を共発現さ せれば、再構築されたウィルスベクターは宿主への感染性を有する。
[0028] 本発明においては、このうち F、 HN、および M遺伝子を欠損するゲノムを設計する ことにより、エンベロープタンパク質を発現しないように改変することができる力 F遺 伝子が欠損していることが特に好ましい。またベクターのゲノムにコードされる NP、 P 、および L遺伝子は、ウィルス由来の遺伝子配列そのままでもよいが、これらの遺伝 子がコードするタンパク質がゲノム RNAと結合し、細胞内で RNPの複製を行う活性を 持つ限り、変異が導入されていてもよい。さらに、これらのゲノム RNAの塩基配列を含 むマイナス鎖 RNAがコードするポリペプチドの 1または複数のアミノ酸が欠失、置換、 挿入または付加したポリペプチドをコードするマイナス鎖一本鎖 RNA、当該ゲノム RN Aの塩基配列を含むマイナス鎖 RNAの相補鎖とストリンジェントな条件でノヽイブリダィ ズするマイナス鎖一本鎖 RNAも、該 RNA中の遺伝子によってコードされる NP、 P、およ び Lタンパク質がゲノム RNAと結合し、 RNP複製活性を有する限り、本発明のベクター のゲノム RNAとなり得る。このような変異は、当業者によって周知の技術によって行う ことができる。例えば、 PCR法やカセット変異法等により部位特異的に変異を導入す ることや、化学試薬やランダムヌクレオチド等によりランダム変異を導入することが可 能である。上記ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件は、当業者であれば適 宜選択することができる。例えば、 25%ホルムアミド、より厳しい条件では 50%ホルム アミド、 4 X SSC、 50mM Hepes pH7.0、 10 Xデンハルト溶液、 20 g/ml変性サケ精子 DNAを含むハイブリダィゼーシヨン溶液中、 42°Cで一晚プレハイブリダィゼーシヨンを 行った後、 42°Cでー晚ハイブリダィゼーシヨンを行う。その後の洗浄は、「1 X SSC、 0.1 % SDS、 37°C」程度で、より厳しい条件としては「0.5 X SSC、 0.1% SDS、 42°C」程度で、 さらに厳しい条件としては「0.2 X SSC、 0.1% SDS、 65°C」程度の洗浄液および温度条 件で実施することができる。このようなハイブリダィゼーシヨン技術を利用して単離され るポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、通常、上記 (-)鎖 RNAがコードするポリ ペプチドとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも 40 %以上、好ましくは 60%以上、さらに好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上 、さらに好ましくは少なくとも 95%以上、さらに好ましくは少なくとも 97%以上 (例えば、 98から 99%)の配列の相同性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。こ のアルゴリズムに基づいて開発された BLASTX(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-4 10, 1990)によってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータ一はたとえば score = 50、 wordlength = 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、各 プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は 公知で &)る (nttp://www.ncbi. nlm.nih.gov.)。
[0029] また、本発明のヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターは、 5'端のトレイラ一領域 力 Sリーダー領域に置換された、マイナス鎖一本鎖 RNAを含むベクターであってもよ ヽ
。 5，端のトレイラ一領域に存在するアンチゲノムプロモーターのゲノム転写複製効率 力^，端のリーダー領域に存在するゲノムプロモーターより高 、ため、 5，端のトレイラ一 領域が 3'端のリーダー領域に置換されると、ヘルパーウィルスのゲノム転写複製効 率が低下し、ミニゲノムとの競合が抑えられ、より高いミニゲノム蛋白発現が得られる（ Le Mercier P. et al.J Virol. 2002 76(11): 5492-5502)。
[0030] また、本発明のヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターは、 P遺伝子および Zま たは C遺伝子に変異を保持していてもよい。本変異は、マイナス鎖 RNAウィルスの細 胞障害性を低下させる変異であってもよい。このような変異が起こる部位は特に限定 されな 、が、 SeV Pタンパク質の 9番目の Lys (K9)、 13番目の Glu (E13)、 17番目の Glu 17)、 29番目の (129)、 38番目の361"(338)、 39番目の01 ^39)、 41番目の1¾"(丁 41)、 47番目の Arg (R47)、 48番目の Ser (S48)、 52番目の Asn (N52)、 55番目の Asn (N 55)、 56番目の Thr (T56)、 58番目の Gin (Q58)、 SeV Cタンパク質の 16番目の Leu (L1 6)、 17番目の1^3 (1 17)、 18番目の Lys (K18)、 21番目の Lys (K21)、 22番目の Leu (L 22)、 25番目の Arg (R25)、 27番目の Gin (Q27)、 28番目の Glu (E28)、 30番目の Glu (E 30)、 35番目の Met (M35)、 36番目の Leu (L36)、 38番目の Asp (D38)、 41番目の Met ( M41)、 47番目の Asn (N47)、 48番目の Gin (Q48)、 52番目の Glu (E52)、 55番目の Glu (E55)、 63番目の Thr (T63)、 66番目の Lys (K66)、または 68番目の Gin (Q68)の他の アミノ酸への置換を、好ましい例として挙げることができる。一つの部位において変異 が導入されてもよぐまた複数の部位において変異が導入されていてもよい。アミノ酸 変異は、所望の他のアミノ酸への置換であってよいが、好ましくは、側鎖の化学的性 質の異なるアミノ酸への置換である。例えばアミノ酸は、塩基性アミノ酸 (例えばリジン 、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばァスパラギン酸、グルタミン酸）、非 荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、ァスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チ 口シン、システィン）、非極性アミノ酸（例えばァラニン、ノ リン、ロイシン、イソロイシン 、プロリン、フエ-ルァラニン、メチォニン、トリプトファン）、 j8分岐アミノ酸（例えばスレ ォニン、パリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フエ-ルァラ ニン、トリプトファン、ヒスチジン）などのグループに分類することができる力 あるアミノ 酸にっ 、て、そのアミノ酸が属するグループのアミノ酸以外のアミノ酸に置換すること などが挙げられる。具体的には、塩基性アミノ酸であれば、酸性または中性アミノ酸 への置換、極性アミノ酸であれは非極性アミノ酸への置換、 20種の天然のアミノ酸の 平均分子量より大きい分子量を持つアミノ酸であれば、その平均分子量より小さいァ ミノ酸への置換、逆にその平均分子量より小さいアミノ酸であれば、それより大きいァ ミノ酸への置換などが挙げられる力 それに限定されない。具体的には、 SeV Pタンパ ク質の K9の Glyへの置換（K9G)、 E13の Glyへの置換（E13G)、 E17の Glyへの置換（E 17G)、 129の Valへの置換（I29V)、 S38の Glyへの置換（S38G)、 E39の Glyへの置換（E 39G)、 T41の Alaへの置換 (T41A)、 R47の Glyへの置換（R47G)、 S48の Glyへの置換（ S48G)、 N52の Serへの置換 (N52S)、 N55の Glyへの置換 (N55G)、 T56の Alaへの置 換（T56A)、 Q58の Argへの置換（Q58R)、 SeV Cタンパク質の L16の Trpへの変異（LI 6W)、 K17の Glyへの変異（K17G)、 K18の Argへの変異（K18R)、 K21の Glyへの変異 (K21G)、 L22の Trpへの変異（L22W)、 R25の Glyへの変異（R25G)、 Q27の Argへの 変異（Q27R)、 E28の Glyへの変異（E28G)、 E30の Glyへの変異（E30G)、 M35の Thr への変異（M35T)、 L36の Trpへの変異（L36W)、 D38の Glyへの変異（D38G)、 M41 の Thrへの変異（M41T)、 N47の Glyへの変異（N47G)、 Q48の Argへの変異（Q48R)、 E52の Glyへの変異（E53G)、 E55の Glyへの変異（E55G)、 T63の Alaへの変異（T63A) 、 K66の Glyへの変異（K66G)、または Q68の Argへの変異（Q68R)などが例示できる。
[0031] 本発明では Lタンパク質にお ヽても変異が導入されて 、てもよ 、。 Lタンパク質の変 異部位としては、 1197番目の Asn (N1197)および/または 1795番目の Lys (K1795)の 他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖 RNAウィルス Lタンパク質の相同部位 の置換が挙げられる。 Lタンパク質のこれら 2つの変異の両方を有する Lタンパク質遺 伝子が特に好ましい。アミノ酸変異は、やはり所望の他のアミノ酸への置換であって よいが、好ましくは、上記と同様、側鎖の化学的性質の異なるアミノ酸への置換である 。例えば、上記したように異なるグループのアミノ酸に置換することなどが挙げられる 。具体的には、 N1197の Serへの置換 (N1197S)、 K1795の Gluへの置換（K1795E)な どが例示できる。
[0032] P遺伝子と C遺伝子の変異は、両方持って ヽることで、持続感染性、 2次粒子放出の 抑制、または細胞傷害性の抑制の効果を顕著に高めることができる。上記の Fタンパ ク質、 HNタンパク質および Mタンパク質を発現しな 、ように改変された組み換えマイ ナス鎖 RNAウィルスに上記変異を組み合わせることで、これらの効果を劇的に上昇さ せることができる。特に P、および C遺伝子の両方に変異を有するウィルスがより好まし い。 P遺伝子に上記箇所の変異を、さらに C遺伝子に上記の変異を持つウィルスは最 も好ましい。
[0033] また、本発明のヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターは、下記（a)または（b)に 記載のマイナス鎖一本鎖 RNAを含んで 、てもよ 、。 (a)配列番号： 10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖一本鎖 RNA
(b)配列番号： 10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖 RNAの相補鎖とストリンジェン トな条件でノヽイブリダィズするマイナス鎖一本鎖 RNA
[0034] 本発明においてストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件とは、 6M尿素、 0.4%S DS、 0.5 X SSCの条件またはこれと同等のストリンジエンシーのハイブリダィゼーシヨン 条件を指す。よりストリンジエンシーの高い条件、例えば、 6M尿素、 0.4%SDS、 0.1 X SS Cの条件を用いることにより、より相同性の高い DNAの単離を期待することができる。 これにより単離された DNAは、アミノ酸レベルにおいて、 目的タンパク質のアミノ酸配 列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なく とも 50%以上、さらに好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 90%以上（例えば、 95%,9 6%,97%,98%,99%以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は 、カーリンおよびアルチユールによるアルゴリズム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、 Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993)を用いて決定できる 。 BLASTのアルゴリズムに基づ!/、た BLASTNや BLASTXと呼ばれるプログラムが開発 されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990)。 BLASTNを用いて塩基配 列を解析する場合は、パラメータ一は、例えば score= 100、 wordlength= 12とする。ま た、 BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメータ一は、例えば score = 50、 wordlength=3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合は、各 プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は 公知である。
[0035] また、本発明のヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターは、野生型センダイウイ ルスベクターであってもよ 、。
以下において、本発明の発現系の各工程について説明する。
本発明の発現系においては、第一の工程として、上記に記載のヘルパーマイナス 鎖 RNAウィルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖 RNAウィルスミニ ゲノムを生産細胞に導入する。
本発明においては、上記工程において、 NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタン パク質を発現するベクターを、さらに生産細胞に導入してもよい。 本発明において、「生産細胞」として好ましくは、所望の哺乳動物細胞などを用いる ことができるが、具体的には、例えば、サル腎由来の LLC- MK細胞 (ATCC CCL-7)
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および CV- 1細胞（例えば ATCC CCL- 70)、ハムスター腎由来の BHK- 21細胞（例え ば ATCC CCL-10)などの培養細胞、ヒト由来細胞等が挙げられる。本発明において 、より好ましい例としては、 BHK-21細胞を挙げることができる力 特に限定されるもの ではない。
[0036] マイナス鎖 RNAウィルスミニゲノム cDNAを細胞内に導入する方法には、次のような 方法、（0目的の細胞が取り込めるような DNA沈殿物を作る方法、 GO目的の細胞によ る取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つ DNAを含む複合体を作 る方法、（iii)目的の細胞膜に、 DNA分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パル スによって瞬間的に開ける方法などがある。
[0037] (ii)としては、種々のトランスフエクシヨン試薬が利用できる。例えば、 Lipofectamine 2 000 (Invitrogen Cat. No.11668-019)、 DOTMA (Boehringer) , Superfect (QIAGEN # 301305)、 DOTAP、 DOPE, DOSPER (Boehringer #1811169)などが挙げられる。（i)と しては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフエクシヨン法が挙げられ、この方法に よって細胞内に入った DNAは貧食小胞に取り込まれる力 核内にも十分な量の DNA が入ることが知られている（Graham, F.L. and Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456 ； Wigler, M. and Silverstein, S.， 1977, Cell 11: 223) 0 Chenおよび Okayamaはトランス ファー技術の最適化を検討し、 1)細胞を共沈殿物のインキュベーション条件を 2〜4 % CO 、 35°C、 15〜24時間、 2) DNAは直鎖状より環状のものが活性が高ぐ 3)沈殿
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混液中の DNA濃度が 20〜30 /z g/mlのとき最適な沈殿が得られると報告している（Ch en, C. and Okayama, H" 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745) 0 (ii)の方法は、一過的なト ランスフエクシヨンに適している。古くは DEAE-デキストラン（Sigma #D-9885 M.W. 5 X 105 )混液を所望の DNA濃度比で調製し、トランスフエクシヨンを行う方法が知られ ている。複合体の多くはエンドノームの中で分解されてしまうため、効果を高めるため にクロ口キンをカ卩えることもできる（Calos, M.P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015)。（iii)の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がな 、と 、う点で (0 や (ii)の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、 電界 (電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、 DNA濃度、細胞密度の 最適条件下で良!ヽとされて!/、る。
[0038] 以上、 3つのカテゴリーの中で GOの方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数 の検体を検討することができるので、本発明においては、トランスフエクシヨン試薬が 適している。好適には Lipofectamine 2000 (Invitrogen Cat. No.11668-019)、 Superfe ct Transfection Ragent (QIAGEN, Cat No. 301305)、または DOSPER Liposomal Tra nsfection Reagent (Boehringer Mannheim, Cat No. 1811169)力 S用 ヽられる。
ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターの再構成は公知の方法により行うことが できる。
[0039] 回収されたウィルスの力価は、例えば CIU (Cell-Infected Unit)測定または赤血球 凝集活性 (HA)の測定することにより決定することができる (WO00/70070; Kato, A. et al., 199り, Genes Cells 1: 569—579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan— liposome— mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Pr ess: pp. 295-306, 1999)。また、 GFP (緑色蛍光タンパク質）などのマーカー遺伝子を 搭載したベクターについては、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントするこ とにより力価を定量することができる（例えば GFP-CIUとして)。このようにして測定し た力価は、 CIUと同等に扱うことができる（WO00/70070)。
[0040] 本発明の発現系にお 、て T7 RNAポリメラーゼと Fタンパク質（変異型 F5Rであっても よい)の発現方法は特に制限されず、例えば、プラスミドなどで一時発現させる方法 や、生産細胞に T7 RNAポリメラーゼと Fタンパク質 (F5R)持続発現する細胞を用いる 方法などが挙げられる。本発明において、生産細胞は、ヘルパーマイナス鎖 RNAウイ ルスベクターにおいて発現しないように改変された、 Fタンパク質、 Mタンパク質または HNタンパク質のうち、 、ずれか一つまたは複数のタンパク質を発現して!/、てもよ!/、。 ウィルスゲノム以外力 供給されるこれらのタンパク質群は、そのアミノ酸配列はウイ ルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同 等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウィルスの相同遺伝子で代用 してもよい。他のウィルスとしては、例えば水疱性口内炎ウィルス (VSV)の Gタンパク 質 (VSV-G)を挙げることができる。一般に、エンベロープタンパク質は細胞毒性を示 すものが多いため、誘導性プロモーターの制御下にベクターの再構成時にのみ発現 させることちでさる。
[0041] 細胞内でベクターを再構成させる時にエンベロープタンパク質を生産細胞におい て発現させれば、このエンベロープタンパク質がミニゲノムウィルス粒子に取り込まれ 、エンベロープタンパク質による感染性を保持するウィルスベクターを生産することが できる。
このようなベクターは、一度細胞に感染すると、細胞内で RNPを増殖させることはで きても、それ自身はエンベロープ遺伝子を持たないため、初めと同じようなェンベロ ープタンパク質を持つウィルスを再度生産することはできな 、。このようなベクターは 、特に遺伝子治療など高い安全性が要求される分野に極めて有用である。
[0042] 上記の第一の工程を行うことで、ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターおよび、 外来遺伝子を搭載したマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノム力 ウィルス再構成され、生 産細胞力 放出される。
具体的には、実施例（図 6)に示すように、 T7 RNAポリメラーゼと SeVの融合タンパク 質である Fタンパク質 (変異型 F5Rでも可）が発現して ヽる生産細胞にヘルパー SeV/ Δ F (SeVagp55/ Δ Fが好ま 、；)と目的外来遺伝子 (GOI)を搭載した SeVミニゲノム cD NAプラスミド（pSeVmini/GOI)が導入されると、 T7 RNAポリメラーゼの働きで MiniSeV/ GOIの RNAゲノム力 ¾SeVmini/GOIから転写され、 Helperの役割を担っている SeV/ Δ F力 発現している NP,P,Lタンパク質を利用して MiniSeV/GOIの RNPが形成、複製さ れる。この MiniSeV/GOIの RNPは Helper SeV/ Δ Fから発現した Μ,ΗΝと生産細胞から 発現した F/F5Rを利用して、感染性 MiniSeV/GOI粒子としてパッケージングされ、感 染性 Helper SeV/ Δ F粒子と共に培養上清に放出される。
[0043] 本発明の発現系においては、第二の工程として、該生産細胞内で生産されたヘル パーマイナス鎖 RNAウィルスベクターおよびマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムがそれ ぞれパッケージングされたウィルス粒子を回収する。
回収したウィルス粒子（ウィルスベクター）は実質的に純粋になるよう精製することが できる。精製方法はフィルトレーシヨン (濾過）、遠心分離、吸着、およびカラム精製等 を含む公知の精製 ·分離方法またはその任意の組み合わせにより行うことができる。「 実質的に純粋」とは、ウィルスベクターを含む溶液中で該ウィルスの成分が主要な割 合を占めることを言う。例えば実質的に純粋なウィルスベクター組成物は、溶液中に 含まれる全タンパク質 (但しキャリアーや安定剤としてカ卩えたタンパク質は除く）のうち
、ウィルスベクターの成分として含まれるタンパク質の割合が 10% (重量/重量）以上、 好ましくは 20%以上、より好ましくは 50%以上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80 %以上、さらに好ましくは 90%以上を占めることにより確認することができる。例えば ノ ラミクソウィルスベクターであれば、具体的な精製方法としては、セルロース硫酸ェ ステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法 (特公昭 62-30752号公 報、特公昭 62-33879号公報、および特公昭 62-30753号公報）、およびフコース硫酸 含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法 (WO97/32010)等を例示する ことができるが、これらに制限されない。
[0044] 本発明は、これら第一および第二の工程を含む、ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルス ベクターおよびマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたゥ ィルス粒子の製造方法に関する。マイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムの高 ヽ導入能、 目的遺伝子の高い発現能を実現するためには、マイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムが ノ ッケージングされたウィルス粒子の放出量を増加させる必要がある。本発明のよう に、ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターとして SeVagp55 A F等の改変体を用い ることによって、マイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムがパッケージングされたウィルス粒 子の放出量を向上させることができる。
[0045] またヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターがパッケージングされたウィルス粒子 の毒性 (細胞障害性)を下げるためには、生産細胞力 放出されるウィルス粒子の比 率（ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクター：マイナス鎖 RNAウィルスミニゲノム）を 同等にさせることが必要である（ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターに対する マイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムの数が多くなることが好ましい）。本発明のように、 ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターとして SeVagp55/(P/C)m/ Δ F等の改変体 を用いることによって、マイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムがパッケージングされたウイ ルス粒子の放出割合を増カロさせることができる。 ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターを使 、分けることによって、様々な目的（ 導入'発現の向上、毒性の低下)を達成することができる。
[0046] 本発明の発現系においては、第三の工程として、上記の第二の工程で回収された ウィルス粒子を標的細胞に導入する。
本発明において「標的細胞」とは、本発明のウィルス粒子を導入することにより外来 遺伝子を発現させた!/ヽ所望の細胞を示す。
本発明において、ウィルス粒子を導入する標的細胞は、 in vitroにおける標的細胞 でもよいし、 in vivoにおける標的細胞 (すなわち動物において直接外来遺伝子を発 現させる）でもよい。 in vitroにおける標的細胞としては、 293T細胞、 A549細胞、 BHK- 21細胞、 C2C12細胞、 HeLa細胞、 LLC- MK細胞、 MDCK細胞、または NIH3T3細胞
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のいずれかを挙げることができる力 特に限定されるものではない。
[0047] in vitroにお 、てウィルス粒子を標的細胞に導入する場合は、例えば培養液または 生理食塩水など所望の生理的水溶液中で標的細胞にウィルス粒子を感染させる。こ の際、 MOI (多重感染度；細胞 1つあたりの感染ウィルス数）は 1〜1000の間にすること が好ましぐより好ましくは 2〜500、さらに好ましくは 3〜300、さらに好ましくは 5〜100 である。ウィルス粒子と細胞との接触は短い時間でも十分であり、例えば 1分以上、好 ましくは 3分以上、 5分以上、 10分以上、または 20分以上接触させればよぐ例えば 1 〜60分程度、より特定すれば 5分〜 30分程度であってよい。もちろん、それ以上の時 間接触させてもよぐ例えば数日間またはそれ以上接触させてもよい。
[0048] ウィルスゲノム RNAを含む RNPや非感染性ウィルス粒子（ウィルス様粒子（VLP))を 細胞に導入するには、周知のトランスフエクシヨン方法を利用することができる。具体 的には、リン酸カルシウム（Chen, C. & Okayama, H. (1988) BioTechniques 6:632-63 8; Chen, C. and Okayama, H.， 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745)、 DEAE-デキストラン（ Rosenthal, N. (1987) Methods Enzymol. 152:704-709)、種々のリボソームベースのト ランスフエクシヨン試薬 (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY))、エレクトロポレ■ ~~ シヨン (Ausubel, F. et al. (1994) In Current Protocols in Molecular Biology (John Wil ey and Sons, NY), Vol. 1, Ch. 5および 9)など、当業者に知られる様々な技術で細 胞にトランスフエタトすることが可能である。エンドノームでの分解を抑制するため、ト ランスフエクシヨンにおいてクロ口キンをカ卩えることもできる（Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015)。トランスフエクシヨン試薬を幾つか例示すれば、 DO TMA (Roche)、 Superfect Transfection Ragent (QIAGEN, Cat No. 301305)、 DOTAP 、 DOPE, DOSPER (Roche #1811169)、 TransIT-LTl (Mirus, Product No. MIR 2300) 、 CalPhos Mammalian Transfection Kit (Clontech #K2051- 1)、 CLONfectin (Clon tech #8020-1)などが挙げられる。エンベロープウィルスはウィルス粒子形成の際に 宿主細胞由来のタンパク質を取り込むことが知られており、このようなタンパク質は、 細胞に導入した際に抗原性や細胞傷害性の原因となることが考えられる (J. Biol. Ch em. (1997) 272, 16578-16584)。従って、エンベロープが除去された RNPを用いること には利点がある（WO00/70055)。
[0049] また、本発明のヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクター、およびマイナス鎖 RNA ウィルスミニゲノムを標的細胞に導入して、細胞内でウィルス RNPを直接形成させ、標 的細胞において外来遺伝子を発現させることもできる。
本発明のウィルス粒子 (またはウィルスベクター）が導入された細胞を 12時間〜 5日 間 (好ましくは 1〜3日間)程度培養し、外来遺伝子を発現させる。
in vivoにおいてウィルス粒子を標的細胞に導入する場合は、本発明のウィルス粒 子を直接動物に投与し、外来遺伝子を発現させる。
[0050] 上記に記載の本発明のウィルス粒子が感染した (導入された)細胞を、動物に投与
(ex vivo投与）してもよい。細胞は、そのまま、あるいは溶解してライセート (溶解物）と して動物に接種する。ベクター感染細胞のライセートは界面活性剤で細胞膜を溶解 する方法、凍結 ·融解をくり返す方法などで作製することができる。界面活性剤として は非イオン性の Triton X- 100、 Nonidet P- 40などが 0.1〜1%の濃度で用いられる。例 えば PBSで洗浄したあと遠心によって回収した細胞塊を TNE buffer [25mM Tris-HCl (pH7.5), 150mM NaCl, ImM EDTA, 1% Nonidet P- 40]に再懸濁し氷上で 10から 30 分間放置することで得られる。抗原として使用するタンパクが細胞質に可溶性である 場合は得られたライセートを遠心（10,000 X g, 10分)して不要な不溶性画分を沈澱と して除去した後の上清を免疫に用いることができる。界面活性剤を用いることが望ま しくな 、投与部位に使用するライセートは洗浄後 PBSに再懸濁した細胞を 5-6回にわ たってくり返し凍結 ·融解して破壊することで得られる。
[0051] 接種ルートに特に制限はないが、例えば筋注 (例えば腓腹筋)、皮下投与、鼻腔内 投与 (点鼻)、手掌または足躕皮内投与、脾臓直接投与、腹腔内投与などが好適で ある。接種部位は、一箇所または複数箇所 (例えば 2〜15箇所)であってよい。また、 接種量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、 投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能 である。投与の際には、接種対象動物、接種部位、接種回数などを適宜調整してよ い。例えば、一箇所当たりの接種量は、ウィルス力価に換算して、 1 X 104 CIU〜 5 X 1011 CIU (cell infectious unit)ゝ好ましくは 1 X 106 CIU〜 1 X 101。 CIUとするとよい。 細胞を介して接種 (ex vivo投与)する場合は、例えば同種の培養細胞株 (例えばサ ルコーマ細胞株）に本発明のウィルスを感染させ、 104〜109細胞、好ましくは 105〜108 細胞、またはそのライセートを動物に接種することができる。
[0052] 例えば、ヒトにおいては 1回当たりの投与量は 2 X 105 CIU〜 2 X 101Q CIUが好まし ぐ投与回数は、 1回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、 1 日の投与回数についても同様である。本発明のベクターを用いて製造されたタンパ ク質製剤であれば、タンパク質の投与量は例えば、 lOng/kgから 100 g/kg、好ましく は 100ng/kgから g/kg、より好ましくは 1 μ g/kgから 5 /z g/kgの範囲であるとよい。ヒ ト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の 容積比 (例えば平均値)で上記の投与量を換算した量を投与することができる。本発 明のベクターを含む組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ゥサギ、ヒ ッジ、ゥシ、ィヌなど全ての哺乳動物が含まれる。
[0053] 本発明のヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクター、マイナス鎖 RNAウィルスミ-ゲ ノム、これらがそれぞれパッケージングされたウィルス粒子、該ウィルス粒子が導入さ れた細胞、またはそのライセートは、薬理学的に許容される所望の担体または媒体と 組み合わされて使用されてもよ!ヽ。
薬理学的に許容される所望の担体または媒体としては、例えば、滅菌水や生理食 塩水、安定剤、賦形剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤 (EDTA等)、結合 剤等を挙げることができる。
[0054] 本発明にお 、て、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例 えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート 等のソルビタン脂肪酸エステル;グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、 グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル;デカグリセリルモノステアレ ート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂 肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソル ビタンモノォレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシェチ レンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキ シエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステ ル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテト ラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレング リセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレ ングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシェ チレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシェチレ ンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピル エーテノレ、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチノレエーテノレ等のポリオキシェ チレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシェチェレンノニルフエニル エーテル等のポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマ シ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオ キシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシェチ レンミツロウ誘導体;ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体 ；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等の HLB 6〜 18を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。
[0055] また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル 硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ォレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数 10〜 18のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム 等の、エチレンォキシドの平均付加モル数が 2〜4でアルキル基の炭素原子数が 10 〜 18であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エス テルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が 8〜18のアルキルスルホコハク酸ェ ステル塩;天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセ口リン脂質;スフインゴミエリ ン等のフィンゴリン脂質;炭素原子数 12〜18の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を 典型的例として挙げることができる。
[0056] 本発明おいては、これらの界面活性剤の 1種または 2種以上を組み合わせて添カロ することができる。本発明の製剤で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルベート 2 0, 40, 60又は 80などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソル ペート 20及び 80が特に好ましい。また、ポロキサマー（プル口ニック F— 68 (登録商標 )など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好まし!/、。 界面活性剤の添加量は使用する界面活性剤の種類により異なる力 ポリソルベート 20又はポリソルベート 80の場合では、一般には 0.001〜100 mgZmLであり、好ましく は 0.003〜50 mgZmLであり、さらに好ましくは 0.005〜2 mgZmLである。
[0057] 本発明にお 、て緩衝剤としては、リン酸、クェン酸緩衝液、酢酸、リンゴ酸、酒石酸 、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、ダルコン酸、力プリル酸、デォキシコール酸、サリチ ル酸、トリエタノールァミン、フマル酸等 他の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリ ス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることが出来る。
また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製 してもよい。緩衝液の濃度は一般には l〜500mMであり、好ましくは 5〜100mMで あり、さらに好ましくは 10〜20mMである。
[0058] また、本発明にお 、ては、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラ チンや免疫グロブリン等のタンパク質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物 、糖アルコールを含んでいてもよい。
[0059] 本発明にお 、てアミノ酸としては、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒス チジン、オル-チン等、またはこれらのアミノ酸の無機塩 (好ましくは、塩酸塩、リン酸 塩の形、すなわちリン酸アミノ酸)を挙げることが出来る。遊離アミノ酸が使用される場 合、好ましい pH値は、適当な生理的に許容される緩衝物質、例えば無機酸、特に塩 酸、リン酸、硫酸、酢酸、蟻酸又はこれらの塩の添カ卩により調整される。この場合、リン 酸塩の使用は、特に安定な凍結乾燥物が得られる点で特に有利である。調製物が 有機酸、例えばリンゴ酸、酒石酸、クェン酸、コハク酸、フマル酸等を実質的に含有し ない場合あるいは対応する陰イオン (リンゴ酸イオン、酒石酸イオン、クェン酸イオン、 コハク酸イオン、フマル酸イオン等）が存在しない場合に、特に有利である。好ましい アミノ酸はアルギニン、リジン、ヒスチジン、またはオル-チンである。さらに、酸性アミ ノ酸、例えばグルタミン酸及びァスパラギン酸、及びその塩の形 (好ましくはナトリウム 塩）あるいは中性アミノ酸、例えばイソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、スレオニン 、パリン、メチォニン、システィン、またはァラニン、あるいは芳香族アミノ酸、例えばフ ェ-ルァラニン、チロシン、トリプトファン、または誘導体の N-ァセチルトリプトファンを 使用することちできる。
[0060] 本発明にお 、て、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン 、グノレコース、フラクトース、ラタトース、キシロース、マンノース、マノレトース、スクロー ス，トレハロース、ラフイノース等を挙げることができる。
本発明において、糖アルコールとしては、例えばマン-トール、ソルビトール、イノシ トール等を挙げることができる。
注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬 を含む等張液、例えば、 D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マン-トール、塩化ナトリ ゥムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール (エタノール等)、ポリアルコ ール (プロピレングリコール、 PEG等)、非イオン性界面活性剤 (ポリソルベート 80、 HCO -50)等と併用してもよい。
所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、 pH調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸ィ匕 防止剤等を含有してもよい。
[0061] 本発明において、含硫還元剤としては、例えば、 N—ァセチルシスティン、 N—ァセ チルホモシスティン、チォタト酸、チォジグリコール、チォエタノールァミン、チォグリ セロール、チォソルビトール、チォグリコール酸及びその塩、チォ硫酸ナトリウム、グ ルタチオン、並びに炭素原子数 1〜7のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有す るもの等を挙げることができる。
[0062] また、本発明にお 、て酸ィ匕防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒド ロキシトルエン、ブチルヒドロキシァ-ソール、 a—トコフエロール、酢酸トコフエロール 、 L—ァスコルビン酸及びその塩、 L—ァスコルビン酸パルミテート、 L—ァスコルビン 酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリァミル、没食 子酸プロピルあるいはエチレンジァミン四酢酸ニナトリウム（EDTA)、ピロリン酸ナトリ ゥム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤を挙げることが出来る。
また、必要に応じ、マイクロカプセル (ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ^ チルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシス テム (リボソーム、アルブミンミクロスフエア、マイクロエマルジヨン、ナノ粒子及びナノ力 プセノレ等)とすることもできる ( Remington s Pharmaceutical Science 1り edition , Osl o Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明 に適用し得る (Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167—277; Langer, Chem . Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第 3,773,919号;欧州特許出願公開 (EP)第 58,481 号； Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556;EP^133,988^-)0
使用される薬理学的に許容される所望の担体または媒体は、使用方法に応じて上 記の中力 適宜あるいは組合せて選択される力 これらに限定されるものではない。
[0063] 外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いてウィルス粒子を調製すれば、この ウィルス粒子を投与して遺伝子治療を行なうことが可能となる。本発明のウィルス粒 子の遺伝子治療への応用としては、直接投与による遺伝子発現、間接 (ex vivo)投 与による遺伝子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待できる外来遺伝子 もしくは患者の体内で供給が不足している内在遺伝子等を発現させることが可能で ある。外来遺伝子としては特に制限はなぐタンパク質をコードする核酸に加え、例え ば、アンチセンスまたはリボザィムなどのタンパク質をコードしな!、核酸であってもよ！/ヽ
[0064] 外来遺伝子として、感染症に関する細菌またはウィルスの抗原をコードする遺伝子 を用いれば、これを動物に投与することにより、該動物において免疫を誘導すること ができる。即ち、ワクチンとして利用することができる。
ワクチンとして用いる場合、例えば腫瘍、感染症、およびその他の一般的な疾患に 対し本発明のウィルス粒子を適用することが考えられる。例えば腫瘍治療としては、 腫瘍細胞、または DC細胞などの抗原提示細胞 (APC)に本発明のベクターを用いて 治療効果を有する遺伝子を発現させることができる。このような遺伝子としては、癌抗 原 Muc-1または Muc-1様ムチンタンデムリピートペプチド（米国特許第 5, 744,144号 )、メラノーマ gplOO抗原などが挙げられる。このような遺伝子による治療は、乳癌、結 腸癌、脾臓癌、前立腺癌、肺癌等、幅広い応用が示されている。また、アジュバント 効果を高めるサイト力イン類を組み合わせることも有効である。このような遺伝子として は、例えば i) IL- 2と一本鎖 IL- 12との組み合わせ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1 5): 8591-8596, 1999)、 ii) IL- 2とインターフ ロン- γ (米国特許第 5,798, 100号）、 iii) 単独で用いられる顆粒球コロニー刺激因子 (GM-CSF)、iv)脳腫瘍を治療対象とした GM-CSFと IL- 4の組み合わせ (J. Neurosurgery 90 (6), 1115-1124 (1999))などが 挙げられる。
[0065] 感染症の治療としては、インフルエンザにおいては、例えば強毒株 H5N1型ェン ベロープ、 日本月 炎においては、例えばエンベロープキメラ（Vaccine, vol. 17, No. 1 5-16, 1869-1882 (1999))、エイズにおいては、例えば HIV gagまたは SIV gagタンパ ク質（J. Immunology (2000) vol. 164, 4968- 4978)、 HIVエンベロープタンパク質の経 口投与によるワクチン治療、ポリ乳酸-ダリコール共重合体に包んでの投与 (Kaneko, H. et al.， Virology 267: 8-16 (2000))、コレラにおいては、例えばコレラ毒素の Bサブ ユニット（CTB) (Arakawa T, et al, Nature Biotechnology (1998) 16(10): 934-8、 Arak awa T, et al., Nature Biotechnology (1998) 16(3): 292- 7)、狂犬病においては、例え ば狂犬病ウィルスの糖タンパク（Lodmell DL et al., 1998, Nature Medicine 4(8):949- 52)、子宮頸癌においては、ヒトパピローマウィルス 6型のカプシドタンパク LI (J. Med. Virol, 60, 200-204 (2000))などが挙げられる。
なお本明細書において引用されたすベての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。
実施例
[0066] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
〔実施例 1〕ヘルパー SeVの cDNA構築 1.1 pSeVagp55/ Δ Fの構築
図 1に示したように、先ず、 pSeV(TDK)を制限酵素 Kas Iと Fse Iで処理、精製した Se Vトレイラ一配列 (genome 5 ' promoter)を含む断片を Templateとして、 Primer agp55- IF (5 -caggtttgaggatattatacatag, 24 mer (目 ti列 号： 1) )と agp55- 1R (5 - caggattttag tttttcttactattgtc, 28 mer (配列番号： 2) )を用いた PCRで Fragment 1が得られ、 Primer agp55-3F (5，- ctcttgtttggtgggtcggcatggcatctc, 30 mer (配列番号： 3) )と agp55- 3R ( 5 - ttagctcactcattaggcaccccag, 25 mer (目 tl列番号： 4) ) 用いた PCRで Fragment 3か 得られた。また、 pSeV(TDK)を制限酵素 Kas Iと Not Iで処理、精製した SeV Leader配 タKgenome ό ' promoter)¾r む断片 Templateとして、 Primer agp55— 2F (5 -gtaagaa aaactaaaatcctgtataacttc, ύθ mer (目己列 ¾·号： 5 と agp55- 2R (5 -gccgacccaccaaacaag agaaaaaacatg, 30 mer (配列番号： 6) )を用いた PCRで Fragment 2が得られた。次に、 Fragment 1, 2, 3を Templateとして、 Primer agp55- IFと agp55- 3Rを用いた PCRで Sac I Iと Mlu I制限酵素サイトを含む断片が得られた。最後に、この断片を Sac IIと Mlu Iで処 理、精製した後、同様に Sac IIと Mlu Iで処理して、 SeVトレイラ一配列を含む断片を 取り除いた pSeV/ A Fベクターにインサートとして挿入し、 pSeVagp55/ A F (配列番号： 7)が得られた。上記において、 agp55とは Leader- Leaderタイプ（Trailerを Leaderに入 れ替えたもの）であることを、 Δ Fは F遺伝子が欠損して ヽることを示す。
1.2 pSeVagp55/(P/C)m/ A Fの構築
図 2に示したように、 SeV/4C(- )/wを限外希釈法でウィルスクローユングを行い、各 クローンから RNA genomeを抽出し、 RT- PCRを行い、ゲノム配列を調べたところ、 P/C 遺伝子に多数の変異があるクローン 4が得られた。このクローン 4の RNA genomeを Te mplateとして、 Primer ¾eVFり丄 9 (5 — atgggtatcctgcatgcctaggag, 24 mer (酉己歹 [J番 ： 8) )と SeVR2111 (5， - atcgattatcttgggtcgacg, 21 mer (配列番号： 9) )を用いた PCRで両端 に Sph Iと Sal淛限酵素サイトを持つ断片 (配列番号：10)が得られた。この断片を Sp h Iと Sal Iで処理、精製し、インサートとして、 pSeVagp55/ A Fベクターに対応する両 端に Sph Iと Sal I制限酵素サイトを含む配列と入れ替え、 pSeVagp55/(P/C)m/ A Fが 得られた。上記において、（P/C)mとは P遺伝子および Zまたは C遺伝子に変異が導 入されて!、ることを示す。 pSeVagp55/(P/C)m/ Δ Fの全長配列を配列番号： 11に示 す。
[0068] 〔実施例 2〕 Helper SeVの調製（SeV/ Δ F, SeVagp55/ Δ F, SeVagp55/(P/C)m/ Δ F )
2.1 準備
1)細胞：前日〜8e5 BHK-21 cells/well (6— well plate)
2) 20%FBS/opti-MEM [Cat No. 31985—070, Lot No. 1183337, Invitrogen社] (P&S 無添加）
3) opti-MEM (原液）
[0069] 2.2 Transfection溶液準備
1) DNA溶液
1 well
opti-MEM (無添加原液） 250 μ L
pCAGGS-NP (Z) , 1 μ g/ 0.5 L
pCAGGS-P (Z)/4C (-) , ί μ g/ μ L 0.5 u L
pCAGGS-L (TDK), 1 ^ g/ ^ L 2.0 L
pCAGGS— F5R, 1 ^ g/ ^ L 0.5
PCAGGS-T7, 1 g/ L 0.5 L
SeV cDNA, 1 ^ g/ ^ L 5 L
2) LipofectAMINE 2000 reagent [Cat No. 11668-019, Lot No. 1188609, Invitrogen 社]溶液
1 well
opti-MEM (無添加原液） 250 μ L
LipofectAMINE2000 18 ^ L
3) 2)の溶液を準備した 5分後に、 1)の溶液と混合、 RTで 20-30分置く。
[0070] 2.3 opti-MEM (原液)で 1回洗浄、 0.5 mL/wellの 20%FBS/opti- MEMを添カ卩した後
、上記 Transfection溶液を 0.5 mL/well細胞へ添カ卩する。
[0071] 2.4 37°Cで 6h後、 1 mL/well 10%FBS/G- MEMを添カ卩する。翌日、 VP- SFMで 1回洗 浄した後、 5 μ g/mL Trypsin/VP- SFMをカ卩えて培養する。 3日目の上清（P0ウィルス 溶液)を回収し、新鮮の LLC- MK /F/Ad細胞へ感染する（P0力も P1へウィルス継代）
2
。以後、 LLC- MK /F/Ad細胞を用いてウィルスを生産する。 P1以後の上清を CIU Ass
2
ayでウィルスのタイターを調べる。
[0072] 〔実施例 3〕 SeV minigenomeのデザインと cDNA構築
3.1 ¾eV minigenomeのァサイン
図 3に示したように、通常の Single- promoter (GP)を有する SeVminiSP/GOIと Double -promoter (GP58A- GPdl2)を有する SeVminiDP/GOI、 2種類の Minigenomeをデザィ ンし 7こ。 (参^"文献： Nature of a paramyxovirus replication promoter influences a nea rby transcription signal, Diane Vullienoz et al, Journal of General Virology, pl71— 18 0, v86, 2005)
[0073] 3.2 SeV single-promoter (SP) minigenome cDNAの構築
図 4Aに示したように、巿販 GFPプラスミドを Templateとして、 Primer Notト GFP- N (5 - agttcacgcggccgcagatcttcacgatggtgagcaagggcgaggagctg, 50 mer (酉 c列番 ： 12) )と FP-Sac II- C (5 - caggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaattacttgtacagctcgtc catg, 65 mer (配列番号： 13) )を用いた PCRで得られた Not I- GFP- Sac II断片を Not I と Sac IIで処理、精製し、 GFPインサートとして、同様に Not Iと Sac IIで処理、 NP,P,L,M ,F,HN配列を含む断片を除いた pSeV(TDK)ベクター（Not Iと Sac IIサイトを含む。 437 〜670位は MiniSeVゲノム配列を示す。配列番号： 14、特開 2002-272465)に挿入し、 pMiniSeV /GFPが得られた。
SP
MiniSeV /GFPゲノム配列を配列番号： 15に示す。なお、 1〜137位および 858〜99
SP
6位は MiniSeVゲノム配列、 138〜857位は搭載した GFPの ORF配列を示す。
図 4Bに示したように、 GFP以外の他の目的遺伝子（GOI)を搭載した SeV minigenom e cDNAを構築する場合、 Primer Not I- GOI- Nと GOI- Sac II- Cを用いた PCRで GOIの 両側に Not Iと Sac II制限酵素サイトを付け、 pMiniSeV /GFPの Not I- GFP- Sac II配列
SP
と入れ替えることで簡単に作製できる。
Primer Not I- GOI- Nの配列は「5，- agttcacgcggccgcagatcttcacg (配列番号： 16) +G OI ORFの Startコドンを含む最初の 18〜24 sense配列」になるよう、また Primer GOI- ¾ac II— Cは「5 -caggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaa (酉列备号： 1 +リン カー +GOI-ORFの Stopコドンを含む最後の 18〜24 antisense配列、リンカ一が 0〜2塩 基でゲノム総塩基数が 6の倍数になるよう調整する」になるよう設計する。
[0074] 3.3 SeV Double-promoter (DP) minigenome cDNAの構築
図 5Aに示したように、 pMiniSeV /GFPを Templateとして Primer 224N (5，- ataccgca
SP
tcaggcgccattcg, 22 mer (配列番号： 18))と (GP58A- GPdl2)R (5，- gttttttagggtctggaa cctgctcctcagggtggatactttgacactaaaatcctg, 57 mer (目 ti列番 ： 19)) 用いた Pし Rでネ守 られた断ハと、 Primer (GP58 A-GPd 12) F (5 - ggttccagaccctaaaaaacatgtatgggatatg, 3 4 mer (配列番号： 20))と GFP-Sac II-C (配列上記参照)を用いた PCRで得られた断 片を精製した後、 Templateとして、 Primer 224Nと GFP- Sac II- Cを用いた PCRで得ら れた断片を Kas Iと Sal Iで処理、精製し、インサートとして、同様に Kas Iと Sal Iで処理し て Single- promoterを含む配列を除いた pMiniSeV /GFPベクターに挿入し、 pMiniSeV
SP
/GFPが得られた。 pMiniSeV /GFPの配列を、配列番号： 21に示す。なお、 437〜1
DP DP
516位は MiniSeVゲノム配列、そのうち 658〜1377位は搭載した GFPの ORF配列を示 す。
図 5Bに示したように、 GFP以外の他の目的遺伝子（GOI)を搭載した SeV minigenom e cDNAを構築する場合、 Primer Not I- GOI- Nと GOI- Sac II- C (設計方法は上記参 照）を用いた PCRで GOIの両側に Not Iと Sac II制限酵素サイトを付け、 pMiniSeV /G
DP
FPの Not I-GFP-Sac II配列と入れ替えることで簡単に作製できる。
[0075] 〔実施例 4〕 MiniSeV-SeV/ A F粒子共存タンパク質発現系の仕組み
図 6に示したように、 T7 RNAポリメラーゼと SeVの融合タンパク質である Fタンパク質（ 変異型 F5Rでも可）が発現して!/、る生産細胞に Helper SeV/ Δ F (SeVagp55/ Δ Fが好 ましい）と目的遺伝子 (GOI)を搭載した SeVミニゲノム cDNAプラスミド（pSeVmini/GOI) が導入されると、 T7 RNAポリメラーゼの働きで MiniSeV/GOIの RNA geonomeが pSeV mini/GOIから転写され、ヘルパーの役割を担って!/、る SeV/ Δ Fから発現して!/、る NP, P,Lタンパク質を利用して MiniSeV/GOIの RNPが形成、複製される。生産細胞は BHK -21細胞が好ましいが、それに限らない。 T7 RNAポリメラーゼと F/F5Rの発現方法は 特に制限されず、例えば、プラスミドなどで一時発現させる方法や T7 RNAポリメラー ゼと F/F5R持続発現細胞を用いる方法などが挙げられる。 T7 RNAポリメラーゼと F/F 5R両蛋白持続発現細胞が好ましいが、どちらかを単独発現する細胞でもよい。この M iniSeV/GOIの RNPは Helper SeV/ Δ Fから発現した Μ,ΗΝと生産細胞から発現した F/ F5Rを利用して、感染性 MiniSeV/GOI粒子として包装され、感染性 Helper SeV/ A F 粒子と共に培養上清に放出される。この感染性 MiniSeV/GOIと Helper SeV/ A F粒子 が共存した培養上清を回収し、目的細胞へ感染すると、 Helper SeV/ A Fの転写複製 システム（NP,P,Lタンパク質）を利用して MiniSeV/GOIに搭載した目的遺伝子 GOIが 発現される。
Helper SeVはここで SeV/ Δ Fを例として示した力 それに限らず、 SeVの構成タンパ ク質 NP,P,L,M,F,HNの任意一つ或いは複数を欠損したタイプでもよ!/、が、それら欠 損したタンパク質が生産細胞力も別途発現する必要がある。
[0076] 〔実施例 5〕 Helper SeV/ A Fデザインによる MiniSeV- SeV/ A F共存粒子生産性への 影響
前日、 3e5 cells/well (12- well collagen-coated plate, IWAKI)で播いた BHK/T7/Ad (T7 RNAポリメラーゼ持続発現細胞）へ SeV/ Δ Fと SeVagp55/ Δ F (SeVゲノムの 5'側 5 5塩基配列を 3'側 55塩基の anitisense配列に換えた Leader/Leaderタイプ）を moi 10で 感染 lh後、 pCAGGS/F5R (1 μ g/well)と pMiniSeV /GFP (2 μ g/well)を導入した（導
SP
入試薬： Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2 L/ g)。培養 (10% FBS/G- MEM培地) 2日目、無血清培地 VP-SFMで 1回洗浄した後、 5 μ g/mL Trypsin を添加した VP-SFMに培地交換し、 4日目の培養上清を回収した。 4日まで毎日 GFP 写真を撮影した (図 7A)。上記回収した培養上清を 100 L/wellで LLC-MK細胞（6-w
2 ell plate)へ感染し、 2日目 GFP写真を撮影した (図 7B)。
図 7Aに示したように、 SeVagp55/ A Fを Helper SeVとした場合の方が、通常の SeV/ A Fと比べて、ミニゲノムによるタンパク質の発現効率 (GFP発現細胞の割合）が高か つた。また、図 7Bに示した GFP発現細胞数は生産された共存粒子中の MiniSeVの量 を表して!/、るが、 SeVagp55/ Δ Fを用いた共存粒子の生産性が SeV/ Δ Fよりはるかに 高力つた。
[0077] 〔実施例 6〕 MiniSeV cDNAデザインによる MiniSeV- SeV/ A F共存粒子生産性への 影響 前日、 3e5 cells/well (12- well collagen-coated plate, IWAKI)で播いた BHK/T7/Ad (T7 RNAポリメラーゼ持続発現細胞）へ SeVagp55/ A Fを moi 10で感染 lh後、 pCAGG S/F5R (1 μ g/well)と Minigenome cDNA (2 μ g/well)を導入した（導入試薬： Lipofecta mine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2 L/ g)。ここで MiniSeV cDNAとして は、 pMiniSeV /GFP、 pMiniSeV /GFPの 2種類を用いた。培養 (10%FBS/G- MEM培
SP DP
地) 2日目、無血清培地 VP-SFMで 1回洗浄した後、 5 μ g/ml Trypsinを添カ卩した VP-S FMに培地交換し、 4日目の培養上清を回収した。 4日まで毎日 GFP写真を撮影した（ 図 8A)。上記回収した培養上清を用いて、 CIU Assayを行った (図 8B)。具体的には、 サンプルを 10倍ずつ希釈し、 100 μ L/wellで 6-well plateの LLC- MK細胞へ lh感染さ
2
せた後、無血清培地で培養して 2日目に、 GFP発現細胞数をカウントし、 MiniSeVタイ ターとして計測した。また、 Anti-SeV抗体 DN2を用いて抗体染色を行い、 DN2-positiv e細胞数をカウントし、ヘルパー SeVタイターとして計測した。
図 8に示したように SPと DPデザイン両方において高い GFP発現効率が得られたが、 DPデザインにおいて、より高い MiniSeV生産性（GFP-CIU)および低いヘルパー SeV /MiniSeV量比が得られた。
〔実施例 7〕 SeVagp55/ Δ Fと SeVagp55/(P/C)m/ Δ Fを用いた共存粒子生産性の比 較
前日 3e5 cells/well (12— well collagen-coated plate, IWAKI)で播いた BHK/T7/Ad ( T7 RNAポリメラーゼ持続発現細胞）へ SeVagp55/ Δ Fと SeVagp55/(P/C)m/ Δ Fを moi 1, 3, 10で lh感染させた後、 pCAGGS/F5R (1 μ g/well)と pMiniSeV /GFP (2 μ g/wel
DP
1)を導入した（導入試薬： Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2 μ L/ μ g)。培養 (10%FBS/G- MEM培地) 2日目、無血清培地 VP-SFMで 1回洗浄した後、 5 μ g/mL Trypsinを添カ卩した VP-SFMに培地交換し、 4日目の培養上清を回収した。 4 日まで毎日 GFP写真を撮影した (図 9A)。上記回収した培養上清を 100 μ L/wellで LL C-MK細胞（6-well plate)へ感染し、 2日目に GFP写真を撮影した (図 9B)。また、上
2
記回収した培養上清を用いて、 CIU Assayを行った (図 9C)。
図 9に示したように、 SeVagp55/ A Fを Helper SeVとして共存粒子を生産した場合、 より高い MiniSeV生産性が得られた力 Helper SeV/MiniSeVの量比（〜10倍)も高か つた。一方、 SeVagp55/(P/C)m/ A Fを用いて共存粒子を生産した場合は、比較的低 い MiniSeV生産性であつたが、 Helper SeV/MiniSeVの量比（約 1： 1)が非常に低かつ た。目的によってこの 2種類 Helper SeVを使い分けることが可能である。
[0079] 〔実施例 8〕 Helper SeV/MiniSeV量比の改善
前日 8e5 cells/well (6- well collagen-coated plate, IWAKI)で播いた BHK- 21細胞へ SeVagp55/ A Fを moi 0.5, 1, 2で lh感染させた後、「pCAGGS/T7 (1 μ g/well), pCAG GS/F5R (4 μ g/well)および pMiniSeV /GFP (5 μ g/well)」或いは「pCAGGS/NP,P,L
DP
(0.5,0.5,2 μ g/well), pCAGGS/T7 (1 μ g/well), pCAGGS/F5R (4 μ g/well)および pMi niSeV /GFP (5 μ g/well)」を導入した（導入試薬： Lipofectamine 2000, Invitrogen, Li
DP
pofectamine/DNA=2 1/ g)。また、上記 2条件プラスミドを導入した 6時間後の BHK - 21細胞へ SeVagp55/ A Fを moi 0.5, 1, 2で感染を行った。培養 (10%FBS/G- MEM培 地) 1日目、無血清培地 VP-SFMで 1回洗浄した後、 5 μ g/mL Trypsinを添カ卩した VP- SFMに培地交換し、 3日目 GFP写真を撮影し (図 10A)、培養上清を回収した。上記回 収した培養上清を用いて CIU Assayを行った (図 10B)。
図 10に示したように、 MiniSeV cDNAを導入する時に NP,P,L発現するプラスミドを一 緒に導入すると、生産された共存粒子中の MiniSeVの量に大きな変化はな力つた力 Helper SeV/MiniSeVの量比が低下する傾向が見られた。
[0080] 〔実施例 9〕共存粒子による in vitro発現
24- well collagen-coated plateで〜 90%コンフルェントになるよう培養した 293T, A54 9, BHK-21, C2C12, HeLa, LLC- MK , MDCK, NIH3T3細胞へ MiniSeV /GFP- SeV
2 DP
agp55/ Δ F共存粒子（2e6 GFP- CIU/mL, 7.7e6 DN2- CIU/mL)を MOI3で感染させた 後、 32°Cで培養した。 2日目に GFP写真を撮影した (図 11)。
図 11に示したように、 MiniSeV /GFP- SeVagp55/ A F共存粒子によって、検討した
DP
8種類細胞のすべてにぉ 、て高 、GFP導入、発現効率が得られた。
[0081] 〔実施例 10〕共存粒子による in vivo発現
MiniSeV /GFP- SeVagp55/ Δ F共存粒子を用いて（5e6 GFP- CIU/head)マウス (n=
DP
3)への鼻腔内投与を行った。コントロールとして同量 SeV18+GFP/ A Fを投与した。 2 日目解剖、鼻腔を摘出し、 GFP写真を撮影した (図 12)。 図 12に示したように、 MiniSeV /GFP-SeVagp55/ A F共存粒子を用いて高い in viv
DP
o発現 (鼻腔内 GFP発現)が得られた。
[0082] 〔実施例 11〕
12- well collagen-coated plateで〜 90%コンフルェントになるよう培養した BHK- 21, HeLa細胞へ Helper- SeVとしての SeVagp55/T7/ Δ F感染性粒子を moi20で lh感染さ せた後、 MiniSeV /GFP cDNA plasmidを Lipofectamine 2000試薬 [Lipofectamine 20
DP
00/DNA=2.0 ( L/ g), 2 g DNA/well]で導入し、 2日目で GFP写真を撮影した（ 図 13)。
図 13に示すように、 MiniSeV /GFPの cDNAプラスミドと SeVagp55/T7/ Δ F感染性
DP
粒子を標的細胞へ導入することによって、高いミニゲノム蛋白発現効率が得られた。
[0083] 〔実施例 12〕 RNA polymerase I promoterを用いた共存粒子系
SeVベクターは T7 promoterを用いているため、ウィルスを再構築する時に T7 polym eraseを供給する必要がある。上記実施例における共存粒子生産の際にも、 minigeno me cDNAを生産細胞へ導入すると同時に T7 polymerase発現プラスミドも一緒に導入 する方法、又は T7 polymerase遺伝子を搭載した Helper- SeVを使用する方法によつ て、 T7 polymeraseを供給しなければならない。前者の方法の場合、導入するプラスミ ドの種類が多ぐ生産コストと生産効率においてマイナス影響を与える恐れがある。ま た、後者の方法の場合、 Helper-SeV力 polymeraseを、 MiniSeVに搭載した目的遺 伝子 (GOI)と常に同時に発現するため、蛋白機能の解析にマイナス影響を与える可 能性がある。これら問題を回避するため、 T7 promoterの代わりに RNA polymerase I p romoterを用 V、た共存粒子系を検討した。
[0084] 12.1 RNA polymerase I promoter 用 ヽ 7こ minigenome cDNA plasmidの構築
図 14に示したように、 pMpolBDV plasmidを Templateとして、 Primer Apa I/polmPr- F (5 -gtacgggcccgtacgtctgaggccgagggaaag, ^3mer (酉 c列 ¾·号： と polmPr/GP- R (5 - ctcttgtttggtacctatctccaggtccaatagg, 34mer (配列番号： 32))を用ぃた1^1?で & I— polmPr Fragmentが得られた。また、 pMiniSeVDP/GFPを Templateとして、 Primer pol mPr/GP- F (5，- gacctggagataggtaccaaacaagagaaaaaac, 34mer (酉己列番号： 33》と Mini DP/Not I-R (5，- gactagcggccgcgtgaactttggcag, 27mer (配列番号： 34》を用いた PC Rで DP- Not I Fragmentが得られた。次に、 Apa I- polmPr Fragmentと DP- Not I Fragm entを Templateとして、 Primer Apa I/polmPr- Fと MiniDP/Notト Rを用いた PCRで得ら れた Apa I- polmDP- Not I Fragmentを、 Apa I/Not Iによって処理し、精製した。精製 後の断片を、同様に Apa I/Not I処理し、 Apa Iから Not Iまでの断片を取り除いた pMin iSeVDP/GFPに挿入し、 pMiniSeVDPpolm/GFPを得た。
[0085] GFP遺伝子のサイズは 0.7kbで比較的に短ぐより長いサイズの遺伝子の共存粒子 生産性を検討するため、 GFPと Luciferaseの融合蛋白（GFP-Luci, 2.3kb)をモデルと して構築した。図 14に示したように、 pMiniSeVDP/GFPを Templateとして、 Primer GFP —Not I— r (5 ― atatgcggccgcaatggtgagcaagggcgaggag, 34mer (目己歹 号： 35》と Gri3— Luci3m— R (5 '— tggcgtcttccttgtacagctcgtccatgccg, 32mer (酉己歹 U番号： 36))を用 ヽた P CRで Not I- GFP Fragmentが得られた。また、 pSeV18+Luci3m/ Δ Fを Templateとして ゝ Primer GFP- Luci3m- F (5 - acgagctgtacaaggaagacgccaaaaacataaag, 35mer (目 S列 番号： 37》と Luci3m— Not I— R (5 '— atatgcggccgcttacacggcgatctttccgc, 32mer (酉己歹 U番 号： 38》を用いた PCRで Luci3m- Not I Fragmentが得られた。次に、 Not I- GFP Fragm entと Luci3m— Not I Fragmentを Templateとして、 Primer GFP— Not I/Luci3m— Not Iを 用いた overlap PCRで得られた Not I- GFP- Luci- Not I Fragmentを Not I処理し、イン サートとして調製した。 pMiniSeVDPpolm/GFPを Templateとして、 Primer MiniDP/Not I— F (5 - tcacgcggccgctagtccctatcgtgcagaacg, 3^mer (目己歹 [J番 ： d9》と iiniDP/Not I - R (5，- gactagcggccgcgtgaactttggcag, 27mer (配列番号： 40》を用いた PCRで得られ た Not I- MiniSeVDPpolm- Not I Fragmentを Not I処理し、ベクターとして調製した。さ らに、 GFP- Luciインサート (2384nt (配列番号： 41》を MiniSeVDPベクターに挿入し、 p MiniSeVDPpolm/GFP- Luciを得た。
[0086] 12.2 RNA polymerase I promoterを用いた共存粒子の生産
前日 le6 cells/well (6- well collagen-coated plate, IWAKI)で播いた BHK- 21細胞へ SeVagp55/ A Fを moi 10で lh感染させた後、「pCAGGS/F5R (5 g/well)および pMini SeV /GFP (5 μ g/well)jを導入した（導入試薬： Lipofectamine 2000, Invitrogen,
DPpolm
Lipofectamine/DNA=2 1/ g)。また、「pCAGGS/NP,P,L (0.5,0.5,2 μ g/well)、 pCA GGS/F5R (4 μ g/well)および pMiniSeV /GFP- Luci (5 μ g/well)」を導入した（導 入試薬： Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=l .5 l/ g)翌日に Se Vagp55/ A Fを moi 10で感染を行った。培養 (10%FBS/G- MEM培地) 1日目、無血清 培地 VP-SFMで 1回洗浄した後、 3 μ g/ml Trypsinを添カ卩した VP-SFMに培地交換し、 以後毎日培地交換及び GFP写真を撮影し、 Day 4培養上清を用いて CIU Assayを行 つた (図 16)。
図 16に示したように、サイズが短い遺伝子（GFP, 0.7kb)と長い遺伝子（GFP-Luci, 2.3kb)の両方において、 le7 GFP-CIU/ml以上の MiniSeVを含む共存粒子が生産さ れ、 RNA polymerase I promoterを用いても共存粒子の高い生産性が得られることを 確認した。
[0087] 〔実施例 13〕 HA-Tag付き遺伝子を搭載した共存粒子系
GFPなどマーカー遺伝子や免疫染色可能な抗体をコードする遺伝子を、本発明の 共存粒子系に搭載した場合には、共存粒子中の MiniSeVのタイターを容易に測定す ることができる。し力しながら、性能不明な遺伝子を搭載した場合又は免疫染色可能 な抗体をコードする遺伝子を搭載しな ヽ場合には、共存粒子中の MiniSeVのタイター を測定するのは困難である。この問題を解決するため、 HA-Tag付きの遺伝子 (GFP) を搭載した共存粒子系を検討した。
[0088] 13.1 HA- Tag付き遺伝子 (GFP)搭載 minigenome cDNAの構築
図 15に示したように、 GFPの N末端に HA- Tagを付けるため、 minigenome cDNAの構 築を行った。まず、 GFP搭載プラスミドを Templateとして、 Primer HA- GFP- Not I- F (5 ' - atagcggccgcaatgtacccatacgacgtcccagactacgctgtgagcaagggcgaggagctg, 63mer (Iti 列番号： 42》と GFP- Not I-R2 (5 ' - tatgcggccgcttacttgtacagctcgtccatg, 33mer (配歹 lj 番号： 43》を用いた PCRで Notト HA- GFP- Not I Fragmentが得られた。また、同じ Te mplateで、 Primer GFP- Not I- F (上記実施例 12参照)と GFP- HA- Not I- R (5，- tatgc ggccgcttaagcgtagtctgggacgtcgtatgggtacttgtacagctcgtccatgccg, 63mer (酉己列番号： 44 》を用いた PCRで Notト GFP- HA- Not I Fragmentが得られた。この 2種類 Fragment ( Notト HA— GFP— Not Iと Notト GFP— HA— Not I)を Not I処理し、インサートとして同じ No 1 1処理した上記実施例 12で得られた Not I-MiniSeVDPpolm-Not I Fragmentへ挿入 し、 pMiniSeVDPpolm/HA- GFPと pMiniSeVDPpolm/GFP- HAを得た。 [0089] 13.2 HA-Tag付き遺伝子 (GFP)を搭載した共存粒子の生産
前日 le6 cells/well (6- well collagen-coated plate, IWAKI)で播いた BHK- 21細胞へ SeVagp55/ A Fを moi 10で lh感染させた後、「pCAGGS/F5R (5 μ g/well) + pMiniSeV /GFP (5 μ g/well) or pMiniSeV /HA— GFP (5 μ g/well) or pMiniSeV /GF
DPpolm DPpolm DPpolm
P-HA (5 μ g/well)」を導入した（導入試薬： Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofecta mine/DNA=1.5 l/ g)。培養 (10%FBS/G- MEM培地) 1日目、無血清培地 VP- SFM で 1回洗浄した後、 3 g/ml Trypsinを添カ卩した VP-SFMに培地交換し、以後毎日培 地交換及び GFP写真を撮影し、 Day 4培養上清を用いて CIU Assayを行った（図 17) 。また、 Rabbit Anti- HA- Tag抗体を一次抗体、 Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit Ig G抗体を二次抗体として、共存粒子で感染した LLC-MK2細胞を免疫染色した（図 17
) o
図 17- Aに示したように、 N末端或は C末端に HA- Tag付き GFPを搭載した場合、コン トロール（HA-Tagなし GFP搭載）と同レベルの共存粒子が生産された。また、図 17-B に示したように、 HA-Tag抗体を用いた蛍光抗体染色で、 HA-Tag付き遺伝子 (GFP) を搭載した共存粒子に感染された細胞を特異的に染色できることが明らかとなった。 産業上の利用可能性
[0090] 本発明者らが開発した MiniSeV-SeV粒子共存タンパク質発現系は、従来のウィルス ベクターの「遺伝子導入効率 ·発現効率が高い」という利点、および非ウィルスベクタ 一の「作製簡便、短期大量調製容易、低コスト」という利点を併せて保持している。す なわち、本発明の発現系は、従来の非ウィルスベクターおよびウィルスベクター双方 の利点を持ち合わせているため、有用なタンパク質の生産、抗体作製、タンパク質機 能解析、遺伝子治療、遺伝子ワクチンなど幅広い分野への応用が期待される。
[0091] また、ヘルパーウィルスベクターにタンパク質欠損タイプを用いた場合には、共存 粒子を標的細胞に感染させた後、再び感染性粒子が放出する恐れがなぐ生物安 全性の面で優れている。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の (a)〜 (c)の工程を含む、標的細胞にぉ 、て外来遺伝子を発現させる方法
(a)ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナ ス鎖 RNAウィルスミニゲノムを生産細胞に導入する工程
(b)該生産細胞内で生産されたヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターおよびマイ ナス鎖 RNAウィルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウィルス粒子を回収 する工程
(c)工程 (b)で回収されたウィルス粒子を標的細胞に導入する工程
[2] 工程 (a)にお 、て、 NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発現するべク ターを、さらに生産細胞に導入する工程を含む、請求項 1に記載の方法。
[3] ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターが、リボヌクレオプロテイン (RNP)複合体ま たは、ウィルス様粒子 (VLP)である請求項 1に記載の方法。
[4] マイナス鎖 RNAウィルスミニゲノム力 一つまたは複数のプロモーターを保持してい ることを特徴とする、請求項 1に記載の方法。
[5] プロモーターの少なくとも一つが RNAポリメラーゼ Iプロモーターであることを特徴と する、請求項 4に記載の方法。
[6] マイナス鎖 RNAウィルスがパラミクソウィルスである、請求項 1〜5のいずれかに記載 の方法。
[7] ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターまたはマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノム により、パラミクソウィルスの NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発現さ せることを特徴とする、請求項 6に記載の方法。
[8] ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターが、パラミクソウィルスの Fタンパク質、 Mタ ンパク質または HNタンパク質のうち、 、ずれか一つまたは複数のタンパク質を発現し ないように改変され、 5'端のトレイラ一領域力 Sリーダー領域に置換された、マイナス鎖 一本鎖 RNAを含むベクターである、請求項 6に記載の方法。
[9] 生産細胞が、ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターにお!/、て発現しな!、ように 改変された、 Fタンパク質、 Mタンパク質または HNタンパク質のうち、いずれか一つま たは複数のタンパク質を発現していることを特徴とする、請求項 8に記載の方法。
[10] ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターの改変されたタンパク質力 Fタンパク質 である、請求項 8または 9に記載の方法。
[11] ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクター力 P遺伝子および Zまたは C遺伝子に 変異を保持することを特徴とする、請求項 8〜 10のいずれかに記載の方法。
[12] ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクター力 下記（a)または（b)に記載のマイナス 鎖一本鎖 RNAを含む、請求項 11に記載の方法。
(a)配列番号： 10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖一本鎖 RNA
(b)配列番号： 10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖 RNAの相補鎖とストリンジェン トな条件でノヽイブリダィズするマイナス鎖一本鎖 RNA
[13] パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、請求項 6に記載の方法。
[14] ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターが、野生型センダイウィルスベクターであ る請求項 6に記載の方法。
[15] 生産細胞が、 T7 RNAポリメラーゼを発現している細胞である請求項 1〜14のいず れかに記載の方法。
[16] in vitroにおける標的細胞にぉ ヽて外来遺伝子を発現させることを特徴とする、請 求項 1〜15のいずれかに記載の方法。
[17] 標的細胞が、 293T細胞、 A549細胞、 BHK- 21細胞、 C2C12細胞、 HeLa細胞、 LLC-
MK細胞、 MDCK細胞、または NIH3T3細胞のいずれかである、請求項 16に記載の
2
方法。
[18] in vivoにおける標的細胞にぉ ヽて外来遺伝子を発現させることを特徴とする、請求 項 1〜15のいずれかに記載の方法。
[19] パラミクソウィルスの Fタンパク質、 Mタンパク質または HNタンパク質のうち、 、ずれ か一つまたは複数のタンパク質を発現しな 、ように改変され、 5'端のトレイラ一領域が リーダー領域に置換された、マイナス鎖一本鎖 RNAを含む、ヘルパーマイナス鎖 RN
Aウィルスベクター。
[20] 外来遺伝子を搭載したマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノム。
[21] 請求項 19に記載のヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクター、および請求項 20に 記載のマイナス鎖 RNAウィルスミニゲノムを標的細胞に導入する工程を含む、標的細 胞において外来遺伝子を発現させる方法。
以下の（a)および (b)の工程を含む、ウィルス粒子の製造方法。
(a)ヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナ ス鎖 RNAウィルスミニゲノムを生産細胞に導入する工程
(b)該生産細胞内で生産されたヘルパーマイナス鎖 RNAウィルスベクターおよびマイ ナス鎖 RNAウィルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウィルス粒子を回収 する工程
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010008054A1 (ja) 2008-07-16 2010-01-21 ディナベック株式会社 染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いてリプログラムされた細胞を製造する方法
WO2010050586A1 (ja) 2008-10-31 2010-05-06 ディナベック株式会社 組み換え蛋白質の発現を増強する方法
WO2012029770A1 (ja) 2010-08-30 2012-03-08 ディナベック株式会社 多能性幹細胞を誘導するための組成物およびその使用
WO2015046229A1 (ja) 2013-09-24 2015-04-02 ディナベック株式会社 多能性幹細胞の誘導効率を改善する方法
WO2019017438A1 (ja) 2017-07-21 2019-01-24 株式会社Ｉｄファーマ 標的配列を改変するためのポリヌクレオチドおよびその使用
WO2022050419A1 (ja) 2020-09-04 2022-03-10 Ｈｅａｒｔｓｅｅｄ株式会社 ｉＰＳ細胞の品質改善剤、ｉＰＳ細胞の製造方法、ｉＰＳ細胞、及びｉＰＳ細胞製造用組成物
WO2022138964A1 (ja) 2020-12-25 2022-06-30 国立大学法人京都大学 体細胞からのナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞製造方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2612168A1 (en) * 2005-06-14 2006-12-21 Dnavec Corporation Methods for producing antibodies
CN101517079A (zh) * 2006-07-13 2009-08-26 生物载体株式会社 非复制型副粘病毒科病毒载体
AU2011323090B2 (en) 2010-11-05 2015-02-12 Novavax Inc. Rabies glycoprotein virus-like particles (VLPs)
WO2013049389A1 (en) * 2011-09-27 2013-04-04 Yale University Compositions and methods for transient expression of recombinant rna

Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
EP0058481A1 (en) 1981-02-16 1982-08-25 Zeneca Limited Continuous release pharmaceutical compositions
EP0133988A2 (de) 1983-08-02 1985-03-13 Hoechst Aktiengesellschaft Regulatorische Peptide enthaltende pharmazeutische Präparate mit protrahierter Freisetzung und Verfahren zu deren Herstellung
JPS6230752B2 (ja) 1984-08-09 1987-07-03 Kagaku Oyobi Ketsusei Ryoho Kenkyusho
JPS6230753B2 (ja) 1984-08-10 1987-07-03 Kagaku Oyobi Ketsusei Ryoho Kenkyusho
JPS6233879B2 (ja) 1984-08-09 1987-07-23 Kagaku Oyobi Ketsusei Ryoho Kenkyusho
WO1997016538A1 (fr) * 1995-10-31 1997-05-09 Dnavec Research Inc. Vecteur de virus d'arn a brin negatif possedant une activite de replication autonome
WO1997016539A1 (fr) * 1995-11-01 1997-05-09 Dnavec Research Inc. Virus sendai recombinant
WO1997032010A1 (fr) 1996-02-29 1997-09-04 Takara Shuzo Co., Ltd. Procede pour la purification et l'elimination de virus
US5744144A (en) 1993-07-30 1998-04-28 University Of Pittsburgh University Patent Committee Policy And Procedures Synthetic multiple tandem repeat mucin and mucin-like peptides, and uses thereof
US5798100A (en) 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
WO2000070055A1 (fr) 1999-05-18 2000-11-23 Dnavec Research Inc. Ribonucleoproteine derivee d'un paramyxovirus
WO2000070070A1 (fr) 1999-05-18 2000-11-23 Dnavec Research Inc. Vecteur de virus paramyxoviridae defectueux dans un gene enveloppe
WO2001018223A1 (fr) 1999-09-06 2001-03-15 Dnavec Research Inc. Paramoxyvirus possedant une sequence d'initiation de transcription modifiee
JP2002272465A (ja) 2000-05-18 2002-09-24 Dnavec Research Inc 外来遺伝子導入用パラミクソウイルスベクター
WO2003025570A1 (en) * 2001-09-18 2003-03-27 Dnavec Research Inc. Method of examining (-) strand rna virus vector having lowered ability to form grains and method of constructing the same

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2230033C (en) * 1995-09-27 2010-01-26 Peter L. Collins Production of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
US6828138B1 (en) * 1998-08-11 2004-12-07 Dnavec Research Inc. Recombinant sendai virus vector including a gene encoding a chemokine
US20030022376A1 (en) * 1999-05-18 2003-01-30 Kaio Kitazato Paramyxovirus-derived RNP
US20030166252A1 (en) * 1999-05-18 2003-09-04 Kaio Kitazato Paramyxovirus-derived RNP
US7226786B2 (en) * 1999-05-18 2007-06-05 Dnavec Research Inc. Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector
US20020169306A1 (en) * 1999-05-18 2002-11-14 Kaio Kitazato Envelope gene-deficient paramyxovirus vector
US7314614B1 (en) * 1999-11-02 2008-01-01 Dnavec Research, Inc. Recombinant sendai virus vector for introducing exogenous genes to airway epithelia
JPWO2001072340A1 (ja) * 2000-03-30 2004-01-08 株式会社ディナベック研究所 センダイウイルスベクターを用いたａｉｄｓウイルスワクチン
JP2002142770A (ja) * 2000-11-08 2002-05-21 Dnavec Research Inc 循環系への遺伝子送達用パラミクソウイルスベクター
KR20040040475A (ko) * 2001-09-28 2004-05-12 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 에피토프 결합 β２ｍ을 코드하는 포유동물 세포감염성 바이러스 벡터 및 그의 이용
CA2488270A1 (en) * 2002-06-03 2003-12-11 Dnavec Research Inc. Paramyxoviral vectors encoding antibodies, and uses thereof
AU2003275581A1 (en) * 2002-10-24 2004-05-13 Dnavec Research Inc. Method of transferring gene into t cells
CN1902312B (zh) * 2003-11-04 2011-02-23 株式会社载体研究所 制备导入了基因的树突细胞的方法
KR20060129013A (ko) * 2004-01-13 2006-12-14 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 면역자극성 사이토카인을 코드하는 마이너스 가닥 ｒｎａ 바이러스 벡터를 사용하는 종양의 유전자 치료
WO2005071085A1 (ja) * 2004-01-22 2005-08-04 Dnavec Research Inc. ウイルスベクターの製造方法
JP4999330B2 (ja) * 2004-01-22 2012-08-15 株式会社ディナベック研究所 サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ−アクチンプロモーターを含むハイブリッドプロモーターを利用したマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターの製造方法
CN1957084A (zh) * 2004-03-23 2007-05-02 株式会社载体研究所 与组织的维持和/或修复相关联的骨髓相关细胞
AU2005257105A1 (en) * 2004-06-24 2006-01-05 Dnavec Research Inc. Anticancer agent containing minus-strand RNA virus
US20090170798A1 (en) * 2005-04-20 2009-07-02 Japan As Represented By President Of National Center For Geriatrics And Gerontology Highly safe intranasally administrable gene vaccines for treating alzheimer's disease

Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
EP0058481A1 (en) 1981-02-16 1982-08-25 Zeneca Limited Continuous release pharmaceutical compositions
EP0133988A2 (de) 1983-08-02 1985-03-13 Hoechst Aktiengesellschaft Regulatorische Peptide enthaltende pharmazeutische Präparate mit protrahierter Freisetzung und Verfahren zu deren Herstellung
JPS6230752B2 (ja) 1984-08-09 1987-07-03 Kagaku Oyobi Ketsusei Ryoho Kenkyusho
JPS6233879B2 (ja) 1984-08-09 1987-07-23 Kagaku Oyobi Ketsusei Ryoho Kenkyusho
JPS6230753B2 (ja) 1984-08-10 1987-07-03 Kagaku Oyobi Ketsusei Ryoho Kenkyusho
US5744144A (en) 1993-07-30 1998-04-28 University Of Pittsburgh University Patent Committee Policy And Procedures Synthetic multiple tandem repeat mucin and mucin-like peptides, and uses thereof
US5798100A (en) 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
WO1997016538A1 (fr) * 1995-10-31 1997-05-09 Dnavec Research Inc. Vecteur de virus d'arn a brin negatif possedant une activite de replication autonome
WO1997016539A1 (fr) * 1995-11-01 1997-05-09 Dnavec Research Inc. Virus sendai recombinant
WO1997032010A1 (fr) 1996-02-29 1997-09-04 Takara Shuzo Co., Ltd. Procede pour la purification et l'elimination de virus
WO2000070055A1 (fr) 1999-05-18 2000-11-23 Dnavec Research Inc. Ribonucleoproteine derivee d'un paramyxovirus
WO2000070070A1 (fr) 1999-05-18 2000-11-23 Dnavec Research Inc. Vecteur de virus paramyxoviridae defectueux dans un gene enveloppe
WO2001018223A1 (fr) 1999-09-06 2001-03-15 Dnavec Research Inc. Paramoxyvirus possedant une sequence d'initiation de transcription modifiee
JP2002272465A (ja) 2000-05-18 2002-09-24 Dnavec Research Inc 外来遺伝子導入用パラミクソウイルスベクター
WO2003025570A1 (en) * 2001-09-18 2003-03-27 Dnavec Research Inc. Method of examining (-) strand rna virus vector having lowered ability to form grains and method of constructing the same

Non-Patent Citations (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Remington's Pharmaceutical Science", 1980
ALTSCHUL ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 410
ALTSCHUL SF ET AL., J MOL BIOL, vol. 215, 1990, pages 403
ARAKAWA T ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 16, no. 10, 1998, pages 934 - 8
ARAKAWA T ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 16, no. 3, 1998, pages 292 - 7
AUSUBEL, F. ET AL.: "Current Protocols in Molecular Biology", vol. 1, 1994, JOHN WILEY AND SONS
CALAIN, P.; ROUX, L., J. VIROL., vol. 67, 1993, pages 4822 - 4830
CALOS, M. P., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 80, 1983, pages 3015
CHEN, C.; OKAYAMA, H., BIOTECHNIQUES, vol. 6, 1988, pages 632 - 638
CHEN, C.; OKAYAMA, H., MOL. CELL. BIOL., vol. 7, 1987, pages 2745
DIANE VULLIENOZ ET AL.: "Nature of a paramyxovirus replication promoter influences a nearby transcription signal", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 86, 2005, pages 171 - 180
GRAHAM, F. L.; VAN DER EB, J., VIROLOGY, vol. 52, 1973, pages 456
IIDA A. ET AL.: "Sendai Virus no Reverse Genetics o Katsuyo shita Shinki Idenshi Chiryoyo RNA Vector (Development of a novel cytoplasma RNA vector based on the reverse genetics of Sendai virus: A breakthrough to the cytoplasma gene therapy", PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, vol. 48, no. 10, 2003, pages 1371 - 1377, XP002996633 *
J. BIOL. CHEM., vol. 272, 1997, pages 16578 - 16584
J. IMMUNOLOGY, vol. 164, 2000, pages 4968 - 4978
J. MED. VIROL., vol. 60, 2000, pages 200 - 204
J. NEUROSURGERY, vol. 90, no. 6, 1999, pages 1115 - 1124
KANEKO, H. ET AL., VIROLOGY, vol. 267, 2000, pages 8 - 16
KARIN; ALTSCHUL, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 87, 1990, pages 2264 - 2268
KARLIN; ALTSCHUL, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 87, 1990, pages 2264 - 2268
KATO, A. ET AL., GENES CELLS, vol. 1, 1996, pages 569 - 579
KOLAKOFSKI, D. ET AL., J. VIROL., vol. 72, 1998, pages 891 - 899
LAMB, R.A.; D. KOLAKOFSKY ET AL.: "Fields Virology", 1996, RAVEN PRESS, article "Paramyxoviridae: The viruses and their replication", pages: 1 177 - 1204
LANGER ET AL., J. BIOMED. MATER. RES., vol. 15, 1981, pages 167 - 277
LANGER, CHEM. TECH., vol. 12, 1982, pages 98 - 105
LE MERCIER P. ET AL., J VIROL., vol. 76, no. 11, 2002, pages 5492 - 5502
LE MERCIER P. ET AL.: "Ambisense sendai viruses are inherently unstable but are useful to study viral RNA synthesis", J. VIROL., vol. 76, no. 11, 2002, pages 5492 - 5502, XP003015470 *
LI H.O. ET AL.: "A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression", J. VIROL., vol. 74, no. 14, 2000, pages 6564 - 6569, XP002931595 *
LI, H.-O. ET AL., J. VIROL., vol. 74, no. 14, 2000, pages 6564 - 6569
LODMELL, D. L. ET AL., NATURE MEDICINE, vol. 4, no. 8, 1998, pages 949 - 52
NAGAI Y. ET AL.: "Sendai Virus Kogaku no Tenkai", PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, vol. 51, no. 1, 1 January 2006 (2006-01-01), pages 27 - 37, XP003015469 *
PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 90, 1993, pages 5873
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873 - 5877
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 96, no. 15, 1999, pages 8591 - 8596
ROSENTHAL, N., METHODS ENZYMOL., vol. 152, 1987, pages 704 - 709
SAMBROOK, J. ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY
See also references of EP1983048A4 *
SIDMAN ET AL., BIOPOLYMERS, vol. 22, 1983, pages 547 - 556
VACCINE, vol. 17, no. 15-16, 1999, pages 1869 - 1882
VULLIENOZ ET AL., JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 86, 2005, pages 171 - 180
WIGLER, M.; SILVERSTEIN, S., CELL, vol. 11, 1977, pages 223
YONEMITSU, Y.; KANEDA, Y.: "Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine", 1999, HUMANA PRESS, article "Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells", pages: 295 - 306

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010008054A1 (ja) 2008-07-16 2010-01-21 ディナベック株式会社 染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いてリプログラムされた細胞を製造する方法
EP3075850A1 (en) 2008-07-16 2016-10-05 IP Pharma Co., Ltd. Method for production of reprogrammed cell using chromosomally unintegrated virus vector
WO2010050586A1 (ja) 2008-10-31 2010-05-06 ディナベック株式会社 組み換え蛋白質の発現を増強する方法
WO2012029770A1 (ja) 2010-08-30 2012-03-08 ディナベック株式会社 多能性幹細胞を誘導するための組成物およびその使用
WO2015046229A1 (ja) 2013-09-24 2015-04-02 ディナベック株式会社 多能性幹細胞の誘導効率を改善する方法
WO2019017438A1 (ja) 2017-07-21 2019-01-24 株式会社Ｉｄファーマ 標的配列を改変するためのポリヌクレオチドおよびその使用
WO2022050419A1 (ja) 2020-09-04 2022-03-10 Ｈｅａｒｔｓｅｅｄ株式会社 ｉＰＳ細胞の品質改善剤、ｉＰＳ細胞の製造方法、ｉＰＳ細胞、及びｉＰＳ細胞製造用組成物
WO2022138964A1 (ja) 2020-12-25 2022-06-30 国立大学法人京都大学 体細胞からのナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞製造方法

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