WO2007082980A1 - Composiciones y procedimientos para tratar trastornos inflamatorios e inmunitarios con cortistatina - Google Patents

Composiciones y procedimientos para tratar trastornos inflamatorios e inmunitarios con cortistatina Download PDF

Info

Publication number
WO2007082980A1
WO2007082980A1 PCT/ES2007/070014 ES2007070014W WO2007082980A1 WO 2007082980 A1 WO2007082980 A1 WO 2007082980A1 ES 2007070014 W ES2007070014 W ES 2007070014W WO 2007082980 A1 WO2007082980 A1 WO 2007082980A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cortistatin
cells
disorder associated
activity
group
Prior art date
Application number
PCT/ES2007/070014
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mario Delgado Mora
Elena GONZÁLEZ REY
Alejo Chorny
Amelia FERNÁNDEZ MARTÍN
Original Assignee
Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior De Investigaciones Científicas filed Critical Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Publication of WO2007082980A1 publication Critical patent/WO2007082980A1/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
    • G01N2800/065—Bowel diseases, e.g. Crohn, ulcerative colitis, IBS
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Definitions

  • This invention relates to cortistatin and its use in the regulation of inflammation and immunity.
  • the methods and pharmaceutical compositions described herein are useful for diagnosing, forecasting, controlling, treating, improving and / or preventing disorders associated with the immune response mediated by CD4 + collaborating T cells of type 1 (Th1) (ie , disorders related to the alteration of the regulation of one or more activities of Th 1 cells), for example inflammatory disorders (for example, inflammatory bowel disease), immune disorders (including disorders associated with the immune system (for example, nephropathies ), autoimmune disorders (e.g., arthritis, multiple sclerosis, insulin-dependent diabetes), and atopic disorders (e.g., asthma, atopic eczema / atopic dermatitis, allergic rhinitis)), septic disorders (e.g., endotoxemia, septic shock, endotoxic shock ), and disorders related to the transplantation / grafting of organs or tissues (for example or, graft versus host disease
  • Cortistatin is a cyclic neuropeptide with a high homology with somastostatin (SST) (from Lecea et al. (1996) Nature 381: 242-45; from Lecea et al. (1997) Genomics 42: 499-506) .
  • Somatostatins form a family of cyclopeptides produced by normal endocrine, gastrointestinal immune and neuronal cells and by certain tumors and granulomas (Zavros et al. (2004) Am. J. Physiol. Gastrointestinal. Liver Physiol. 286 (5): G698-701 ; Ten Bokum et al. (1999) Eur. J. Clin. Invest. 29: 630-36).
  • SST (such as SST-14 and SST-28) and CST (such as CST-14 and CST-29) are generated as C-terminal products of prepropeptides cleaved by proprotein convertase, an enzyme that cleaves by amino acid pairs RR, RK and KK (Spier and de Lecea (2000) Brain Res. Brain Res. Rev. 33: 228 ⁇ 1; Taylor et al. (2003) FASEB J. 17: 1215-27).
  • SST and CST share a significant homology, they are products of different genes (Spier and de Lecea, supra; Li et al. (2005) World J. Surg. 29: 354-56).
  • the CST and SST propeptides contain a loop of Cys-Cys, in which there is a reason for binding to the FWKT receptor (Spier and de Lecea, supra).
  • the CST-14 (sequence: Pro- [Cys-Arg-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Ser-Ser-Cys] -I_ys) contains 10 amino acids identical to those identical to those found in the SST -14 (sequence: Ala-Gly- [Cys-l_ys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys]) (Spier and de Lecea, supra).
  • the CST-14 contains a residue of Lys directly in the C-terminal position to the Cys-Cys loop, a Ser replacing a Thr in the Cys-Cys loop, an Arg replacing a Lys in the Cys-Cys loop, and a Pro residue instead of the AI-GIy pair located directly N-terminal with respect to the Cys-Cys loop. It is believed that these residues provide the CST with a unique function or functions.
  • the Cys-Cys loop present in the SST and the CST allow both molecules to bind to the receptors of the SST (SSTR) with a similar affinity (Moller et al. (2003) Biochim. Biophys. Acta 1616: 1-84 ; Lichtenauer et al. (2004) Eur. J. Endocrinol. 150: 565-77).
  • SSTR SST
  • the CST is a high affinity ligand for the five SSTRs
  • recent evidence indicates that the CST binds to receptors to which the SST does not bind, for example the Mas-related gene (MRgX2) and the ghrelin receptor (a growth hormone secretagogue receptor (GHS-R))
  • MRgX2 Mas-related gene
  • GHS-R growth hormone secretagogue receptor
  • Some studies indicate that the administration of ghrelin can have an anti-inflammatory effect (see, for example, Granado et al. (2005) Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab.
  • CST CST
  • SST SST
  • monocytes macrophages
  • B and T lymphocytes dendritic cells
  • peripheral blood monocytes DaIm et al. (2003a and 2003b), supra.
  • the expression profile of the CST suggests a unique role for this neuropeptide in the regulation of the immune system.
  • the collaborating CD4 (+) T cells (Th cells) of the immune system have two main functions, to stimulate cellular immunity and inflammation, and to stimulate B cells to produce antibodies (Crane and Forrester (2005) Crit. Rev. Immunol .25: 75-102).
  • Th1 and Th2 There are two subpopulations of functionally distinct T cells that secrete cytokines that stimulate these two different activities.
  • Th1 cells produce IL-2, IFN ⁇ and TNF ⁇ , which activate T-cell receptors and macrophages to stimulate cellular immunity and inflammation.
  • Th2 cells secrete IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 and IL-13, which stimulate the production of antibodies by B cells.
  • These cytokines usually have double activities, for example, Ia IL-4, produced by Th2 cells, functions as an autocrine factor by stimulating Th2 activity, and as a paracrine factor by suppressing the function of Th1 cells.
  • the cytokine of Th1 IFN ⁇ cells inhibits the proliferation of Th2 cells, while the cytokine of Th2 IL-10 cells inhibits secretion by Th1 cells of I FNy and IL-2. Therefore, some cytokines produced by Th1 and Th2 cells antagonize each other, and the balance between Th1 and Th2 activity directs immunity as mediated by cells or humoral. It has been shown that somatostatin suppresses immunity (Vana), T
  • the SST inhibits the proliferation of lymphocytes and the release of the inflammatory cytokine TNF ⁇ and the cytokine of the Th1 IFN ⁇ cells in vitro (Peluso et al. (1996) Neuropeptides 29: 77-81).
  • the expression profile of the SST mRNA suggests that the SST may not duplicate this immunomodulatory role in vivo.
  • CST which is expressed in monocytes, monocytes, macrophages, B and T lymphocytes, dendritic cells and peripheral blood monocytes, works by mediating in the immune system, possibly by regulating the decrease in immunity of type Th1 (DaIm et al. (2003a and 2003b), supra). It has been shown that although SST inhibits the spontaneous and TNF ⁇ induced secretion of TNF ⁇ in vitro, the addition of TNF ⁇ to cell cultures suppresses the expression of CST in vitro (Lang et al. (2005) Liver Int. 25 (4) : 808-16; Yan et al. (2005) J. Surg. Res. 123: 294-301).
  • type 1 diabetes, multiple sclerosis, Hashimoto's thyroiditis, rheumatoid arthritis and subsequent uveitis are considered autoimmune disorders mediated by Th 1 cells, and the suppression of Th1 cells (or the activation of Th2 cells ) is a plausible immune procedure to improve or prevent these disorders (Crane and Forrester, supra).
  • the CST instead of the SST, maintains an expression profile that suggests involvement in the regulation of immunity, the CST can alter the balance mediated by Th1 / Th2 cells by decreasing the Th1 type immunity. Consequently, the modulation of the level, expression and activity of the CST and the variants and analogs of the CST is an excellent biochemical / pharmaceutical tool for treating, improving or preventing disorders related to immunity induced by Th 1 cells and Ia inflammatory answer.
  • the present application provides, at least in part, pharmaceutical compositions and methods for treating individuals (for example, patients) suffering from disorders related to immunity mediated by CD4 + T-type helper cells type 1 (Th1).
  • cortistatin, cortistatin variants or cortistatin analogs are used to reduce, neutralize and / or antagonize at least one Th1 cell activity.
  • the present invention also provides pharmaceutical compounds composed of cortistatin, cortistatin variants or cortistatin analogs that are useful for treating various immunological disorders.
  • cortistatin is a highly effective therapeutic when used to treat animals that suffer, for example, inflammatory bowel disease (IBD), endotoxemia (or septic shock) or arthritis, and that the administration of cortistatin reduces the immune response mediated by Th 1 cells that occurs during the course, onset or recurrence of such disorders.
  • cortistatin is highly effective in the regulation of factors associated with Th1 and Th2 cells, for example chemokines such as MIP and Rantes, interleukins such as IL-6 and IL-10, and cytokines such as TNF ⁇ and IFN ⁇ .
  • chemokines such as MIP and Rantes
  • interleukins such as IL-6 and IL-10
  • cytokines such as TNF ⁇ and IFN ⁇ .
  • the invention is characterized by a method to treat (for example, cure, suppress), improve or prevent (for example, delay or prevent the onset, or prevent recurrence or relapse) of a disorder associated with Th1 cells in a subject (for example, a patient, ie a human patient, a non-human mammalian patient).
  • a subject for example, a patient, ie a human patient, a non-human mammalian patient.
  • the method includes administering to the subject a Th1 cell antagonist, for example cortistatin (for example, a cortistatin peptide, a cortistatin propeptide, a cortistatin prepropeptide or a polynucleotide encoding a cortistatin peptide, a cortistatin peptide or a prepropeptide of cortistatin), a variant of cortistatin (for example, a cortistatin with a change in the nucleic acid or amino acid sequence, in which the molecule retains the cortistatin type activity), a cortistatin analog (for example, a molecule small, a peptide mimetic or an antibody with cortistatin-like activity), or a pharmaceutical composition thereof, in an amount sufficient to treat, improve or prevent the disorder associated with Th1 cells.
  • a Th1 cell antagonist for example cortistatin (for example, a cortistatin peptide, a
  • the Th 1 cell antagonist can be administered to the subject alone or in combination with other therapeutic modalities as described herein.
  • the administration of a Th 1 cell antagonist is useful for treating, improving or preventing activities associated with Th1 cells, for example, cytokine release, Th2 cell-induced immunity antagonism or immunity induction and cell-mediated inflammation.
  • Th 1 cell antagonists can be administered therapeutically, prophylactically, or both.
  • the subject is a mammal, for example a human being suffering from a disorder associated with Th1 cells, including, for example, immune and inflammatory disorders.
  • the subject is a human being. More preferably, the subject is a human being suffering from a disorder associated with Th 1 cells as described herein.
  • the present invention provides safe and effective therapeutic procedures to diagnose, predict, control, select, treat, improve and / or prevent disorders associated with Th1 cells, for example inflammatory disorders, immune disorders (including disorders associated with Ia immunity, autoimmune disorders and atopic disorders), septic disorders and disorders related to organ or tissue transplants / grafts (for atopic disorders, see, for example, Zheng and Zhu (2005) Curr. Allergy Asthma Rep. 5 (4): 291-97; Simón et al. (2005) Allergy 60 (7): 944-51; Lugovic et al. (2005) Int. Arch. Allergy Immunol. 137 (2): 125 -33; Chen et al. (2004) Clin. Exp.
  • the present invention provides safe and effective therapeutic procedures to diagnose, detect, predict, control, select, treat, improve and / or prevent inflammatory disorders, immune disorders and related disorders, which include, among others, autoimmune disorders, disorders associated with immunity, chronic inflammatory disorders, septic disorders and disorders related to transplants / grafts of organs or tissues;
  • inflammatory disorders immune disorders and related disorders
  • examples of such disorders include, among others, multiple sclerosis (MS), pyoderma gangrenosum (PG), thyropathy, insulin-dependent type 1 diabetes mellitus, Hashimoto's thyroiditis, rheumatoid arthritis, Grave's disease, autoimmune hepatitis, septic shock, toxic shock syndrome (SST), sepsis, endotoxemia (for example, induced by several pathogens such as bacteria or fungi), allergic encephalomyelitis, uveoretinitis, uveitis (e.g., autoimmune and subsequent), transplant rejection, allograft rejection
  • the invention provides safe and effective therapeutic procedures to diagnose, predict, control, select, treat, improve and / or prevent immune and inflammatory disorders in vertebrates, in particular mammals, and more particularly humans.
  • the immune or inflammatory disorder diagnosed, predicted, controlled, selected, treated, improved and / or prevented is inflammatory bowel disease (IBD), endotoxemia and other disorders related to endotoxin (for example, sepsis, septic shock (endotoxic shock, bacteremic shock, septic shock, heat shock (thermal shock), etc.), rheumatoid arthritis, type 1 diabetes, or multiple sclerosis.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • endotoxemia for example, sepsis, septic shock (endotoxic shock, bacteremic shock, septic shock, heat shock (thermal shock), etc.
  • rheumatoid arthritis for example, sepsis, septic shock (endotoxic shock, bacteremic shock, septic shock, heat shock (thermal shock),
  • the invention provides methods for reducing the immune response mediated by Th 1 cells in vivo or in vivo.
  • These procedures are useful for treating immune and inflammatory disorders, in particular chronic autoimmune and inflammatory disorders including, but not limited to, IBD, endotoxemia and rheumatoid arthritis (RA).
  • the procedures are useful for reducing the immune response mediated by Th 1 cells in normal animals, preferably humans, with the aim of, for example, reducing the rejection of organ transplants or the rejection of allografts.
  • the subject procedures can be used in cells in vitro (for example, in a system without cells), or in culture, for example, in vitro or ex vivo.
  • immune cells can be cultured in vitro in medium and contacted with cortistatin or a variant or a cortistatin analog.
  • the procedure can be performed on cells present in a subject, for example as part of an in vivo protocol (for example, therapeutic or prophylactic).
  • the invention provides methods for identifying a compound capable of treating, improving or preventing a disorder characterized by alteration of the regulation of an activity associated with Th1 cells. These procedures are based on the finding that cortistatin has therapeutic effects on disorders associated with Th1 cells and / or related models, for example endotoxemia, arthritis and colitis. Therefore, it is possible to selectively detect compounds that show an effect similar to that observed with cortistatin.
  • the subject procedures can be used to selectively detect compounds in vitro (for example, in a cellless system), or in culture, for example in vitro or ex vivo; In vivo procedures are also contemplated to selectively detect compounds similar to cortistatin.
  • immune cells can be cultured in vitro in culture medium and contacted with a Th1 cell antagonist, for example, cortistatin, a cortistatin variant, a cortistatin analog, etc.
  • a Th1 cell antagonist for example, cortistatin, a cortistatin variant, a cortistatin analog, etc.
  • parallel cultures can be contacted with a compound of interest, and the resulting changes can be compared with cultures treated with a Th1 cell antagonist.
  • a similar response between a sample treated with Th1 cell antagonists and a sample treated with a different compound indicates that the compound of interest can be used to prevent, treat or improve a disorder characterized by the alteration of the regulation of an activity associated with Th1 cells .
  • the invention provides methods for selectively detecting compounds capable of treating, improving or preventing a disorder characterized by the alteration of the regulation of an activity associated with Th1 cells, which comprises contacting a compound of interest with a sample, and determining if the activity of the Th 1 cell in the sample decreases with respect to a sample that has not been contacted with the compound of interest.
  • the existence of a substantially decreased level of activity associated with Th1 cells in the sample that has been contacted, compared to the sample that has not been contacted identifies the compound of interest as a compound capable of treating, improving or preventing a disorder characterized by the alteration of the regulation of an activity associated with Th1 cells.
  • the invention characterizes a method for modulating, for example, interfering with (for example, inhibiting, blocking or otherwise reducing) the immunity mediated by Th1 cells.
  • the method comprises providing a Th1 cell antagonist, for example cortistatin, a variant of cortistatin, an analogue of cortistatin, a pharmaceutical compound thereof, etc., and contacting the Th 1 cell antagonist with a Th cell. 1 or a culture of Th 1 cells, for example in vivo, in vitro or ex vivo, thereby modulating, for example interfering with (for example, inhibiting, blocking or otherwise reducing) the activity of Th1 cells, for example, immunity and / or cell-mediated inflammation.
  • a Th1 cell antagonist for example cortistatin, a variant of cortistatin, an analogue of cortistatin, a pharmaceutical compound thereof, etc.
  • Th 1 cell activity includes, for example, (i) cell-mediated immunity and / or cell-mediated inflammation (for example, macrophage activation, MHC class II expression, increased levels of nitric oxide (NO) , phagocytosis, IgG production, induction of nitric oxide synthase, activation and differentiation of cytotoxic CD8 + T cells or stimulation of neutrophils), (ii) stimulation of the chemokine signal (for example, CCRF, CCL2, CXCR3 and its receptors), (iii) cytokine release (for example, IFN, TNF, TNF, IL-2), and (iv) Th2 cell antagonism (for example, by inhibiting the action or secretion of IL-2, -5, -6, -9, -10, -13, the prevention of the stimulation of B cells, the prevention of the production and / or release of eosinophils from the bone marrow, preventing the change of isotype of the B
  • the subject process can be used in cells in vitro (for example, in a system without cells), or in culture, for example in vitro or ex vivo.
  • Th1 cells can be cultured in vitro in medium, and the contact step can be performed by adding to the culture medium one or more Th1 cell antagonists, for example cortistatins, cortistatin variants, cortistatin analogues, pharmaceutical compounds thereof, etc.
  • the procedure can also be carried out in cells present in a subject, for example, as part of an in vivo protocol (for example therapeutic or prophylactic).
  • the invention characterizes a method for treating (for example, curing, improving, suppressing, improving) or preventing (for example, delaying or preventing the onset, or preventing recurrence or relapse) of a disorder associated with Th 1 cells in a subject.
  • the procedure includes administering to the subject a Th 1 cell antagonist in sufficient quantity to treat or prevent the disorder associated with Th1 cells.
  • the Th1 cell antagonist can be administered to the subject alone or in combination with one or more antagonists other than Th 1 cells, or combined with other therapeutic modalities as described herein.
  • the subject is a mammal, for example a human being suffering from a disorder associated with Th1 cells.
  • the Th1 cell antagonist (s) are selected from cortistatin, a variant of cortistatin, a cortistatin analog or a pharmaceutical compound thereof.
  • the invention provides a method for treating (for example, reducing, improving) or preventing one or more symptoms associated with a disorder associated with Th1 cells.
  • the method comprises administering to the subject a Th 1 cell antagonist in sufficient quantity to treat (for example, reduce, improve) or prevent one or more symptoms.
  • the Th 1 cell antagonist can be administered therapeutically or prophylactically, or in both ways, and can be administered to the subject alone, combined with one or more Th1 cell antagonists or combined with other therapeutic modalities as described herein. descriptive memory.
  • the invention provides a method for diagnosing or detecting a disorder associated with Th1 cells as described herein.
  • the procedure includes: (i) detecting the level of expression or activity of cortistatin in one or more samples of one or more individuals without a disorder associated with Th 1 cells; (ii) detect the level of expression or activity of cortistatin in one (or more samples of a patient of interest; and (iii) compare the level of cortistatin type activity the expression of cortistatin among the samples, in which a level of substantially lower expression or cortistatin activity in the patient sample indicates that the patient may be suffering from a disorder associated with Th 1 cells.
  • the invention provides a method for controlling a disorder associated with Th 1 cells as described herein.
  • the procedure includes: (i) detecting the level of cortistatin-like activity or cortistatin expression in one or more samples of a patient suffering from a disorder associated with Th 1 cells at an initial time point; (ii) detect the level of cortistatin-like activity or cortistatin expression in one or more samples from a patient at a later time point; and (iii) comparing the level of uncle cortistatin activity or cortistatin expression between samples, where a level of cortistatin activity or cortistatin expression substantially decreased in the sample or samples at the subsequent time point indicates that The severity of the disorder associated with Th 1 cells has increased.
  • the invention provides a method for controlling a disorder associated with Th 1 cells as described herein.
  • the procedure includes: (i) detecting the level of a Th1 cell activity, a cortistatin type activity or Ia cortistatin expression in a sample of a patient suffering from a disorder associated with Th1 cells at an initial time point; (ii) provide the patient with cortistatin, a cortistatin analogue, a variant of cortistatin or a pharmaceutical compound thereof; (iii) detect the level of Th 1 cell activity, cortistatin type activity, or cortistatin expression in a sample from the patient after cortistatin treatment, a cortistatin analogue, a variant of cortistatin, or a pharmaceutical compound thereof ; and (iv) compare the level of Th1 cell activity, cortistatin type activity or cortistatin expression between the two samples, where a substantial decrease in Th1 cell activity, or a substantial increase in cortistatin
  • the invention provides a method for predicting a disorder associated with Th1 cells as described herein.
  • the procedure includes: (i) detecting the level of a cortistatin-like activity or cortistatin expression in a sample of a patient of interest at an initial time point; (ii) detect the level of cortistatin type activity or cortistatin expression in the patient's sample at a later time point; and (iii) compare the level of the cortistatin type activity or cortistatin expression between the two samples, in which a substantially decreased level of the cortistatin type activity or cortistatin expression in the sample corresponding to the latest time point in Comparison with the sample corresponding to the initial time point indicates a greater probability that the patient develops a disorder associated with Th1 cells.
  • the invention provides a method for predicting a disorder associated with Th1 cells as described herein.
  • the procedure includes: (i) determining the level of a cortistatin-like activity or cortistatin expression in a sample of a patient of interest; (ii) determine the level of cortistatin-like activity or cortistatin expression in the sample of an individual known to not suffer from a disorder associated with Th1 cells; and (iii) comparing the level of cortistatin type activity or cortistatin expression in the patient's sample with the level of cortistatin type activity or cortistatin expression in the sample of the individual known to not suffer from an associated disorder.
  • Th1 cells in which a level substantially diminished of the activity of type cortistatina or expression of cortistatina in the sample of the patient indicates a greater probability that the patient develops a disorder associated to Th1 cells.
  • Th 1 cell antagonists used in the described methods and pharmaceutical compounds are prepared from mammalian cortistatin, for example cortistatin from humans, sheep, mice, rats or non-human primates. These Th 1 cell antagonists can be used to diagnose, predict, control, select, treat, improve and / or prevent immune, inflammatory and other disorders associated with Th1 cells.
  • cortistatin refers to all cortistatin proteins and polynucleotides, for example, cortistatin peptides (for example, CST-14 or CST-17), cortistatin propeptides (for example, CST-29 or CST-31), cortistatin prepropeptides (eg, products not cleaved from the cortistatin gene, such as CST-155 or CST-105), or polynucleotides encoding any cortistatin peptide, propeptide or prepropeptide .
  • cortistatin peptides for example, CST-14 or CST-17
  • cortistatin propeptides for example, CST-29 or CST-31
  • cortistatin prepropeptides eg, products not cleaved from the cortistatin gene, such as CST-155 or CST-105
  • polynucleotides encoding any cortistatin peptide, pro
  • Th 1 cell antagonists include natural and modified forms, for example fusion proteins or glycosylated proteins, of cortistatin proteins such as CST-12, CST-13, CST-14, CST-17, CST- 29, CST-31, CST-105 and CST-155.
  • the nucleotide sequence for the human cortistatin gene is indicated in SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide and amino acid sequences for human preprocortistatin are indicated in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • the nucleotide and amino acid sequences for the putative human proteolytic product CST-31 are indicated in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, respectively.
  • the nucleotide and amino acid sequences for human procortistatin, CST-105 are indicated in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, respectively.
  • nucleotide and amino acid sequences for human procortistatin, CST-29 are indicated in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, respectively.
  • the nucleotide and amino acid sequences for human Ia CST 17 are shown in SEQ ID N0: 10 and SEQ ID NO: 11, respectively.
  • the nucleotide and amino acid sequences for human CST-14 are indicated in SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13, respectively.
  • Nucleotide and amino acid sequences for human CST-13 are indicated in SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, respectively.
  • the nucleotide and amino acid sequences for the CST-12 that is the Cys-Cys loop of cortistatin, are indicated in SEQ ID N 0 : 16 and SEQ ID N 0 : 17, respectively.
  • the amino acid sequence for CST-14 variants are indicated in SEQ ID NO: 18.
  • the invention also includes polynucleotides encoding a cortistatin, procortistatin or preprocortistatin, but, due to the well-known degeneracy of the genetic code, they differ from the polynucleotide sequences set forth herein.
  • the invention includes polynucleotides that hybridize under very stringent conditions with the polynucleotides set forth herein, or with polynucleotides that differ from those set forth herein but encode polypeptides that retain a substantial biological activity associated with cortistatin. , and the peptides, propeptides or prepropeptides encoded by such hybridization polynucleotides.
  • the Th1 cell antagonist may derive or be linked to another functional molecule, for example another peptide or protein (for example, a Fab fragment of an antibody or a marker peptide).
  • these antagonists may be functionally linked (for example, by chemical coupling, genetic fusion, non-covalent association or others) to one or more molecular entities, such as an antibody (for example, a bispecific or multispecific antibody), toxins, radioisotopes, cytotoxic or cytostatic agents, among others.
  • the Th 1 cell antagonist is administered alone or in combination treatment, that is, in combination with other agents, for example therapeutic agents, which are useful for treating disorders associated with Th1 cells.
  • a combination treatment may include one or more Th1 cell antagonists jointly formulated, and administered together with them, with one or more additional therapeutic agents, for example one or more cytokine inhibitors and growth factors, immunosuppressants, anti-inflammatory agents (for example, systemic anti-inflammatory agents), metabolic inhibitors, enzymatic inhibitors and / or cytotoxic or cytostatic agents, as described in more detail herein.
  • compositions for example pharmaceutical compositions, that include a pharmaceutically acceptable carrier and at least one Th1 cell antagonist, for example cortistatin, a cortistatin variant or a cortistatin analog.
  • compositions for example pharmaceutical compositions, comprise a combination of two or more of the cell antagonists. Th1 listed in the present specification.
  • Th 1 cell antagonist and another drug, including, among others, a therapeutic agent (for example, one or more cytokine or growth factor inhibitors, immunosuppressants, immunosuppressants, anti-inflammatory agents (for example, systemic anti-inflammatory agents), metabolic inhibitors, enzymatic inhibitors and / or cytotoxic or cytostatic agents as described herein.
  • a therapeutic agent for example, one or more cytokine or growth factor inhibitors, immunosuppressants, immunosuppressants, anti-inflammatory agents (for example, systemic anti-inflammatory agents), metabolic inhibitors, enzymatic inhibitors and / or cytotoxic or cytostatic agents as described herein.
  • the invention also characterizes nucleic acids comprising nucleotide sequences encoding cortistatin, for example cortistatin, procortistatin and preprocortistatin peptides. Likewise, the invention characterizes nucleic acids that comprise nucleotide sequences that encode cortistatin variants as described herein. In another aspect, the invention characterizes host cells and vectors containing the nucleic acids of the invention.
  • Th 1 cell antagonists Methods for releasing or directing Th 1 cell antagonists to a Th 1 cell or to a patient in need of such treatment are also described.
  • kits comprising Th 1 cell antagonists for therapeutic and diagnostic uses are also within the scope of the invention.
  • FIG. 2 Cortistatin treatment protects against TNBS-induced colitis. Colitis was induced with TNBS, and the mice were treated with CST-29 as described below. The clinical evolution and severity were controlled by changes in body weight (A and B), the colitis score (C), and survival (D). The macroscopic damage score was determined three days after the administration of TNBS (E).
  • FIG. 3 Treatment with cortistatin reverses the established colitis and reduces the recurrence of colitis.
  • B Recurrence of the disease. Colitis was induced in Balb / c and SJL mice by intracolonic administration of TNBS (3 mg / mouse) on days 0 and 9 (arrows). The mice were treated i.p.
  • n 8-10 mice / group.
  • FIG. 6 Cortistatin suppresses the cytokine response of Th1 cells and stimulates the production of IL-10 in TNBS-induced colitis. Be induced colitis with TNBS, and the mice were treated with CST-29 as described below. At the peak of the disease (day 3) mesenteric lymph node cells (GLM) and mononuclear cells of the lamina propria (CMLP) were isolated and cultured only with medium (without stimulating or with PMA plus ConA (stimulated)).
  • LMM mesenteric lymph node cells
  • CMLP mononuclear cells of the laminalitis
  • Cortistatin inhibits the production of inflam mediators Atorios by activated macrophages in vitro.
  • Peritoneal macrophages were stimulated with LPS (1 ⁇ g / ml) in the absence (control) or presence of different concentrations of cortistatin ("neuropeptide").
  • neuropeptide cortistatin
  • NO levels were analyzed by the Griess method, as described in the Examples. * p ⁇ 0.001 against untreated control mice.
  • FIG. 8 Cortistatin treatment protects against lethal endotoxemia.
  • AC Balb / c mice were injected ip with different doses of LPS (control).
  • Cortistatin (2 nmol / mouse) was injected ip 30 min after the administration of LPS. Survival was monitored for the next 96 h. Mortality curves in B were used to calculate the DL 50 , and the horizontal bars indicate the 95% confidence limits of the LD 50 determinations .
  • C the mean survival time for non-survivors in the untreated and cortistatin treated groups was calculated.
  • D The mice were injected ip400 ⁇ g of LPS and different doses of cortistatin (from 0 to 5 nmol / animal).
  • FIG. 9 Cortistatin treatment reduces the histopathological signs of endotoxemia.
  • the mice were injected ip via LPS (control).
  • Cortistatin (2 nmol / mouse) was administered ip 30 min later of the administration of LPS.
  • A Cortistatin reduces inflammatory infiltration and disseminated coagulation in the target organs. Histopathological analysis was determined in sections of lung and liver stained with H-E obtained 24 hours after the disease (x150).
  • Cortistatin reduces leukocyte recruitment in the peritoneal cavity. Peritoneal cell suspensions were obtained at different times after the injection of LPS and the number of PMN, macrophages and lymphocytes was determined. * p ⁇ 0.001 against control mice treated with LPS.
  • Cortistatin treatment improves the incidence and severity of collagen-induced arthritis (AIC). Fragments of collagen were injected into the hind legs of the mice. The peptide treatment began with the onset of the disease and cortistatin was administered via i.p. on alternate days for 5 days at 0.5-5 nmol / mouse. In each experiment, only PBS was injected into a control group of mice. Clinical arthritis was assessed by swelling of the legs by measuring the thickness of the hind legs affected with calipers.
  • AIC collagen-induced arthritis
  • FIG. 12 Complete transcript of human cortistatin and the corresponding amino acid sequence.
  • the pairs of basic residues (RK and RR) that are believed to be substrates of convertase enzymes (proteolytic cleavage sites) are underlined.
  • the amino acid residues comprising the CST-14 are shown in bold, while the additional residues comprising the CST-17 are italicized.
  • a second initiation codon is designated "Initiation 2"
  • FIG. 13 Alignment of the amino acid sequences of the propeptides of the CST-29 and the SST-28 of rat, mouse and human. In bold, the consensus residues between cortistatin and somatostatin are shown.
  • Th1 cell antagonists are described, for example cortistatin, cortistatin variants, cortistatin analogs and pharmaceuticals thereof.
  • cortistatin and cortistatin variants in the form of polypeptides and polynucleotides are described.
  • Methods and compositions that modulate and reduce one or more activities associated with Th1 cells are also described.
  • Th1 cell antagonizing activity can be used to mitigate Th1 cell mediated disorders, for example to treat autoimmune disorders, chronic inflammatory disorders, septic disorders or induced disorders.
  • Th 1 cell antagonists as described herein can be used alone, in combinations or in combination with other treatments used to treat the target disorder or another disorder, for example an allergic response.
  • cortistatin which antagonizes the function of Th1 cells, reduces endotoxic shock, arthritis and inflammatory bowel disease (Examples 1-3, below). Consequently, cortistatin, cortistatin variants and cortistatin analogs, or pharmaceutical compositions thereof, which neutralize or inhibit one or more activities associated with Th1 cells, can be used to reduce one or more activities associated with Th cells. 1 in vivo, for example to treat or prevent disorders associated with Th1 cells. Cortistatin, cortistatin variants and cortistatin analogues
  • the present invention uses molecules and compounds, for example polynucleotides, polypeptides, small molecules and pharmaceutical compositions composed thereof, that neutralize and / or inhibit one or more activities associated with Th1 cells, for example, the secretion of TNF ⁇ .
  • These and similar molecules are useful in the treatment of Th1 cell mediated disorders, such as autoimmunity, chronic inflammation, sepsis or induced disorders or syndromes, such as rejection of an organ transplant or an allograft.
  • the present invention relates, in part, to the generation of the pharmaceutical compositions described.
  • the present invention concerns procedures for identifying and generating new compounds with cortistatin type activity, for example the reduction of immunity and inflammation mediated by Th 1 cells.
  • cortistatin type activity refers to activities such as those described in the examples, for example the reduction of the activity of Th1 cells, the decrease in the production of inflammatory mediators (p eg, TNF ⁇ , NO and IL-6); reversion of TNBS-induced colitis (2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid); Ia reversal of the established colitis; Ia regulation by reduction of the inflammatory response in the mucous membranes; Ia reduction of the systemic inflammatory response; The suppression of the cytokine response by Th 1 cells; The stimulation of the production of IL-10 in the colitis induced by TNBS; Ia protection against endotoxemia; Ia inhibition of the production of inflammatory mediators by activated macrophages; Ia reduction of histopathological signs of endotoxemia; and improvement of collagen induced arthritis; as well as other activities, including, among others, the activation and migration / infiltration of self reactive Th 1 cells in the central nervous system (CN).
  • inflammatory mediators
  • the measurements of the cortistatin type activity include measuring, for example, the reduced activity of Th1 cells, the minor production of inflammatory mediators (for example, TNF ⁇ , NO and IL-6), the suppressed response of cytokines by Th1 cells, the higher production of IL-10, the lower production of inflammatory mediators by macrophages, the dominance of the activity of Th2 cells, etc.
  • the inflammatory mediators for example, TNF ⁇ , NO and IL-6
  • one or more cortistatin-type activities can be measured.
  • the measurement of cortistatin type activity can also include the isolation of cortistatin polynucleotides or polypeptides from the patient sample in order to directly analyze the cortistatin type activity using the procedures described in the present specification.
  • the activity of cortistatin peptides, propeptides or prepropeptides can be analyzed as described herein, or by methods well known in the art, without significantly modifying the polypeptide.
  • the polynucleotide can be sequenced to determine the presence of mutations or alterations in the gene or message of the cortistatin, or the expressed polypeptide can be expressed and analyzed to determine the activity.
  • the procedures for isolating polypeptides and polynucleotides from a sample are well known in the art, as are the procedures for sequencing and expressing polynucleotides.
  • the sequence of the human cortistatin gene is described as SEQ ID NO: 1.
  • the human cortistatin gene that is CORT, contains 2 exons separated by a single 1 kb intron (Ejeskar et al. (2000) Cytogenet. CeII Genet. 89: 62-66).
  • the complete transcript of the human cortistatin and the corresponding amino acid sequence are shown in FIG. 12 and are described as SEQ ID NO: 2 and 3, respectively.
  • Preprocortistatin is expressed in the form of two mRNAs in the human brain, a 317 bp transcript and a 701 bp transcript (Ejeskar et al., Supra; de Lecea et al. (1997), supra).
  • the human cortistatin polypeptide is called “the cortistatin prepropeptide” or, alternatively, “preprocortistatin,” and is composed of 105-155 amino acids.
  • Human preprocortistatin is normally cleaved by two dibasic cleavage points at the C terminal to produce procortistatin (29 amino acids) and cortistatin (Spier and Lecea, supra).
  • procortistatin 29 amino acids
  • cortistatin cortistatin
  • cortistatin Spier and Lecea, supra.
  • There are several forms of mature cortistatin including 17 and 14 amino acid peptides (Fukusumi et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 232 (1): 157-63).
  • amino acid and nucleic acid sequences of preprocortistatin, procortistatin and mouse cortistatin, human and rat are described in US Pat. No. 6,814,967, which is incorporated herein by reference.
  • Other amino acid and nucleic acid sequences of human cortistatin are described in US Pat. No. 6,524,826, 6,479,642, 6,232,100 and 6,074,872, and in the application for published US patents. No. 2003/0171293, 2003/0148355, 2002/0133000, 2002/0013456, all of which are incorporated herein by reference.
  • cortistatin is used interchangeably with “CST,” and refers to all forms of cortistatin, that is, mature cortistatin (for example, cortistatin peptides), procortistatin and preprocortistatin, as well as polynucleotides encoding mature cortistatin, procortistatin and preprocortistatin.
  • cortistatin variant is used to indicate the polypeptide and polynucleotide sequences that differ from those described in FIGS. 12 and 13, and SEQ ID NO: 1-18, but that retain a substantial biological activity of the cortistatin type.
  • the amino acid sequence for human cortistatin (CST) and human somatostatin (SST) differ in two positions in the Cys-Cys loop (Spier and Lecea, supra). As shown in FIG. 13, while the first amino acid of the Cys-Cys loop is R (Arg) in the human CST, in the human SST the same position is occupied by an amino acid K (Lys). Similarly, while the ninth amino acid within the Cys-Cys loop is an S (Ser) in the human CST, in the human SST the same position is occupied by T (Thr). Therefore, these amino acids can be important to confer specific activity or activities to the CST.
  • CST cortistatin
  • SST human somatostatin
  • Some amino acid sequences of cortistatin can be varied by significantly modifying the structure or function of the cortistatin. In general, it is possible to replace residues that form the tertiary structure of the cortistatin protein, provided that residues that perform a similar function are used. In other cases, the type of waste can be completely irrelevant if an alteration occurs in a non-crucial area. Therefore, the invention also concludes cortistatin variants that show a substantial biological activity of the cortistatin type. Such variants include deletions, insertions, inversions, repetitions and substitutions of the type (for example, the replacement of one hydrophilic residue with another, but not a very hydrophilic residue with a very hydrophobic residue). Small changes, or "neutral" amino acid substitutions will often have little impact on protein function. (Taylor (1986) J. Theor. Biol. 119: 205-18).
  • Conservative substitutions may include, among others, substitutions between the aliphatic amino acids (Ala, Val, Leu e lie), exchange of the Asp and GIu acid residues, substitution between the Asn and GIn amide residues, exchange of the basic residues Lys and Arg, and substitutions between the aromatic residues Phe, and Tyr. More information about what amino acid changes are likely to be phenotypically silent (that is, it is unlikely to significantly affect the function) can be found in Bowie et al. (1990) "Deciphering the message in protein sequences: tolerance to amino acid substitutions," Science 247: 1306-10.
  • the cortistatin peptide of SEQ ID N 0 : 18 may contain arginine, lysine, histidine, glutamine, or asparagine in the Xaa 3 position (that is, X 3 ), and / or serine, alanine, threonine, glycine, glutamic acid, proline, asparagine or aspartic acid in the Xaan position (that is, Xn), while retaining the substantial cortistatin-like activity (see, in general, for example, Zvelebil et al. (1987) J. Mol. Biol. 195: 957-61).
  • a derivative or variant of the polypeptides set forth in FIGS. 12 and 13, and SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 18 may be (i) one in which one or more amino acid residues are subtitled by a conserved or unconserved amino acid residue (preferably conserved) and such a substituted amino acid residue may or may not be encoded by the genetic code, or (ii) one in which one or more of the amino acid residues includes a substituent group, or (iii) one in which the mature polypeptide is condensed with another compound, such as a compound that increases the half-life of the polypeptide (eg, polyethylene glycol), or (iv) one in which additional amino acids they are condensed to the polypeptide, such as an Fc region fusion peptide of IgG Fc, a leader or secretory sequence or a sequence that is used for the purification of the polypeptide. It has been estimated that such fragments, derivatives and variants are within
  • Variations also include the replacement of charged amino acids with other charged amino acids and with neutral or negatively charged amino acids.
  • the latter results in proteins with reduced positive charge that improve the characteristics of cortistatin. It is very desirable to prevent aggregation, since protein aggregation results in a decrease in activity and interferes with the preparation of pharmaceutical formulations when creating (Pinckard et al. (1967) Clin. Exp. Immunol. 2: 331-40; Robbins et al. (1987) Diabetes 36: 838-45; Cleland et al. (1993) Crit. Rev. Therapeutics. Drug Carrier Sys. 10: 307-77).
  • the changes are preferably of a minor nature, such as substitutions with conservative amino acids that do not change so significant folding or protein activity.
  • the number of amino acid substitutions that an expert would make depends on many factors, including those described herein. In general terms, the number of substitutions for any given cortistatin protein will not exceed 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3, 2, or 1 amino acid, depending on the objective.
  • the amino acids in cortistatin that are essential for its function can be identified by methods known in the art, such as site-directed mutagenesis or alanine detection (for example, Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-85). This last procedure introduces unique alanine mutations in each residue of the peptide chain.
  • the resulting molecules are analyzed below to determine the biological activity using, for example, the analyzes described in the examples section.
  • the crucial sites for ligand-receptor binding can be determined by structural analysis, such as crystallization, nuclear magnetic resonance, anomalous diffraction of multiple wavelengths (DAM), or photoaffinity marking (Smith et al. (1992) J Mol. Biol. 224: 899-904; de Vos et al. (1992) Science 255: 306-12).
  • Cortistatin can be conjugated by chemical procedures with radionuclides, drugs, macromolecules or other agents, or it can be prepared as fusion proteins comprising one or more cortistatins of the invention.
  • cortistatin can be glycosylated, pegylated or bound to albumin or a non-proteinaceous polymer.
  • cortistatin can be linked to one of one series of non-proteinaceous polymers, for example polyethylene glycol, polypropylene glycol or polyoxyalkylenes, by methods well known in the art.
  • Cortistatins can be chemically modified by covalent conjugation to a polymer to increase their circulation half-life, for example.
  • Such polymers, and the methods to bind them to peptides are also well known in the art.
  • Cortistatin can also mark with a detectable or functional marking.
  • the detectable tides include radiomarkers, such as 131 I, 35 S, 3 H, or 32 P, which can be linked to the peptides and polynucleotides of the invention using conventional chemical methods known in the art.
  • the markers also include enzymatic markers, such as horseradish peroxidase or phosphatase alkaline
  • the markers also include chemical fractions such as biotin, which can be detected through binding to a specific known detectable fraction, for example labeled avidin.
  • the ability of a variant or analogue of cortistatin to perform a cortistatin-like activity can be measured by, for example, analysis to measure the activity of Th1 cells; analysis to measure the production of inflammatory mediators (for example, TNF ⁇ , NO and IL-6); analysis to measure the reversal of colitis induced by TNBS; analysis to measure the reversal of established colitis; analysis for the regulation by reduction of the inflammatory response of the mucosa; analysis for the reduction of the systemic inflammatory response; analysis for the suppression of the cytokine response by Th1 cells; analysis for the stimulation of the production of IL-10 in the colitis; analysis for protection against endotoxemia; analysis to inhibit the production of inflammatory mediators by activated macrophages; analysis to detect the reduction of histopathological signs of endotoxemia; analysis for the improvement of collagen-induced arthritis, and other analyzes that are well known in the art, including those described in the following Examples.
  • inflammatory mediators for example, TNF ⁇ , NO and
  • Cortistatin analogs are also contemplated as useful in the methods and pharmaceutical compounds of the invention.
  • Analogues and variants include those described in Nunn et al. (2003) Eur. J. Pharmacol. 465: 211-18 (eg, CGP 23996), Hannon et al. (2002) J. Mol. Neurosci. 18: 15-27 (e.g., BIM23027, MK678, lanreotida, CH-275, sst3-ODN-8, BIM23268, L757.519, L779.976, L796.778, NNC 26-9100, L803.087, L817 .018), Deghenghi et al.
  • lanreotide SOMATULINE TM, Ipsen
  • TT-232 CYN-154806, sst3-ODN-8
  • BIM23056 BIM23627, SB-710411, L 054,552, L 779,976, L 817,818, NNC 26- 9100, SRA- 880, BN-81674, [DTPA-D-Phe1] octreotide (ie OCTREOSCAN TM, Novartis), [DTPA-D-Phe1, Tyr3] octreotide (ie SMT487, OCTREOTHER TM, Novartis), STILAMIN TM (Serano), Nunn et al. (2003) Naunyn Sch. Arch.
  • cortistatin analogues and variants include, among others, CGP 23996, BIM23027, sst3-ODN-8, L757.519, L796.778, L803.087, L.817.018, EP1572, octreotide, SANDOSTATIN TM, SMS 201-995, SOM230, MK-678, L362.855, BIM23268, BIM23052, KE108, CH-275, PTR3173, SDZ 222-100, BIM23014, lanreotide, SOMATULINE TM, TT-232, CYN-154806, BIM23056, BIM23656 , SB-710411, L 054,552, L 779,976, L 817,
  • the invention uses purified and isolated polynucleotides encoding cortistatin and cortistatin variants that modulate one or more activities associated with Th1 cells (eg, TNF ⁇ secretion).
  • Preferred DNA sequences used in the invention include genomic cDNA, cDNA, and chemically synthesized DNA sequences.
  • the invention provides methods for selectively detecting new polynucleotides that encode cortistatin-type biological activity polypeptides.
  • Non-limiting examples of nucleotide sequences used in the invention include those as set forth in SEQ ID N 0 : 1-18 (listed in Table 1).
  • the polynucleotides useful in the present invention also include polynucleotides that hybridize under stringent conditions with any of the sequences of the list in Table 1 or complementary thereto, and / or encoding polypeptides that retain a substantial biological activity of cortistatin.
  • the polynucleotides of use in the present invention also include continuous portions of any of the human sequences listed in Table 1, which comprise at least 15 consecutive nucleotides, more preferably 21-30 consecutive nucleotides.
  • polynucleotides and polypeptides are illustrative only;
  • the invention contemplates the use of other human cortistatin sequences, as well as other polynucleotide and polypeptide sequences of cortistatin derived from other species, including, among others, mice and rats.
  • polynucleotides used in the present invention are also included, in addition to the polynucleotides described above, polynucleotides encoding any of the amino acid sequences listed in Table 1, or a continuous portion thereof, and differ from the polynucleotides described above only due to the well known degeneracy of the genetic code.
  • Table 1 SEQ ID N 0 are listed for the amino acid sequences of several examples of polypeptides, and the nucleotide sequences of several examples of polynucleotides used in the invention.
  • polynucleotides and polypeptides are illustrative only;
  • the invention contemplates the use of other human cortistatin sequences, as well as other polynucleotide and polypeptide sequences of cortistatin derived from other species, including, among others, mice and rats.
  • Another aspect of the invention provides a method for identifying compounds, (for example, small molecules, antibodies, peptides, polypeptides or polynucleotides), capable of treating, improving or preventing a disorder associated with Th1 cells, comprising the steps: (a) contacting a compound of interest with a sample; and (b) determine if the cortistatin-like activity or the expression of cortistatin is increased in relation to a sample that has not been contacted with the compound of interest, where a higher level of cortistatin-like activity or the expression of cortistatin in the sample that has been contacted, in comparison with the sample that has not been contacted, identifies the compound of interest as a compound capable of treating, improving or preventing a disorder associated with Th 1 cells.
  • compounds for example, small molecules, antibodies, peptides, polypeptides or polynucleotides
  • Another aspect of the invention provides a method to identify compounds capable of treating, improving or preventing a disorder. associated with Th1 cells, comprising the steps: (a) contacting a sample containing at least one Th 1 cell with cortistatin; (b) contacting a sample containing at least one Th 1 cell with a compound of interest; and (c) determining if the sample treated with cortistatin and the sample treated with the compound of interest show a similar Th 1 cell response, where a similar Th 1 cell response shown between the sample treated with cortistatin and the sample treated with the Compound of interest indicates that the compound of interest can be used to prevent, treat or ameliorate a disorder associated with Th1 cells.
  • Th1 cell activity refers to, for example, (i) cell-mediated immunity and / or cell-mediated inflammation (for example, macrophage activation, MHC class II expression, increased levels of nitric oxide, phagocytosis, IgG production, induction of nitric oxide synthase, activation and differentiation of CD8 + cytotoxic T cells, or neutrophil stimulation), (ii) chemokine signal stimulation (eg, CCRF, CCL2, CXCR3 and their receptors), (iii) cytokine release (for example, IFN ⁇ , TNF ⁇ , TNF ⁇ , IL-2), and (iv) Th2 cell antagonism (for example, by inhibition of the action or secretion of IL-2, -5, -6, - 9, -10, -13, preventing the stimulation of B cells, preventing the production of eosinophils and / or the release from the bone marrow, prohibiting the change of isotype of B cells to I
  • chemokine signal stimulation
  • the invention also provides isolated polynucleotides and polypeptides, which are identified by the described methods for selectively identifying and / or detecting compounds (eg, peptides, polypeptides, small molecules, antibodies or polynucleotides) capable of treating, improving or preventing a disorder. associated with Th1 cells.
  • compounds eg, peptides, polypeptides, small molecules, antibodies or polynucleotides
  • the polynucleotides identified by the described procedures in addition to their use in the treatment, improvement or prevention of disorders associated with Th1 cells, can be used as hybridization probes and primers to identify or assimilate other nucleic acids having identical or similar sequences. to those encoding the polynucleotides described.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Hybridization reactions can be performed under conditions of different restrictions.
  • the restriction of a hybridization reaction considers the degree and conditions under which any two nucleic acid molecules will hybridize with each other.
  • each hybridization polynucleotide with its corresponding polynucleotide under reduced restriction conditions, more preferably under restrictive conditions, and more preferably under highly restrictive conditions.
  • restriction conditions are shown in Table 2 below. Therefore, highly restrictive conditions are those that are at least as restrictive as, for example, the A-F conditions; the restrictive conditions are at least as restrictive as, for example, the G-L conditions; and the reduced restriction conditions are at least as restrictive as, for example, the M-R conditions.
  • the length of the hybrid is that provided for the hybridized regions or regions of the hybridizing polynucleotides.
  • the length of the hybrid will be Ia of the polynucleotide that will hybridize.
  • the length of the hybrid can be determined by the alignment of the polynucleotide sequences and the identification of the region or regions of optimum sequence complementarity.
  • SSPE (IxSSPE is 0.15 M NaCI, 10 mM NaH2PO4, and 1.25 mM EDTA, pH 7.4) can be replaced by SSC (0.15 M NaxSSC and 15 mM sodium citrate) in the buffers hybridization and washing; the washes are performed for 15 min after completing the hybridization.
  • allelic variants are natural alternative forms of the described polynucleotides that encode polypeptides that are identical or that have significant similarity to the polypeptides encoded by the described polynucleotides.
  • allelic variants have a sequence identity of at least 90% (more preferably, an identity of at least 95%, more preferably an identity of at least 99%) with the polynucleotides described.
  • polynucleotides of the present invention can also be used as probes and hybridization primers to identify and isolate DNA that have sequences encoding polypeptides homologous to the isolated polynucleotides.
  • These homologs are polynucleotides and polypeptides isolated from a species different from that of the polynucleotides and polypeptides described, or within the same species, but with a significant sequence similarity with the polynucleotides and polypeptides described.
  • the homologues of the polynucleotides have a sequence identity of at least 50% (more preferably, an identity of at least 75%; more preferably, an identity of at least 90%) with the polynucleotides described, while polypeptide homologs possess a sequence identity of at least 30% (more preferably, an identity of at least 45%; more preferably, an identity of at least 60%) with the described antibodies.
  • the homologues of the polynucleotides and polypeptides described are those isolated from mammalian species.
  • the isolated polynucleotides of the present invention can also be used as probes and hybridization primers to identify cells and tissues that express the polynucleotides and the conditions in which they are expressed.
  • the isolated polynucleotides of the present invention can be used to alter (ie, enhance or modify) the expression of the corresponding gene in a cell or organism.
  • “Corresponding gene” refers to genomic DNA sequences that are transcribed to produce the polynucleotides identified by the methods described in the present invention.
  • the isolated polynucleotides of the present invention can be operably linked to an expression control sequence for the recombinant production of the polypeptides of the present invention.
  • General methods of expressing recombinant proteins are well known in the art. Such recombinant proteins can be expressed in soluble form for use in the treatment of disorders resulting from the alteration of the regulation of a Th 1 cell activity (for example, inflammatory bowel disease, endotoxemia, type 1 diabetes, arthritis, multiple sclerosis).
  • the recombinant expression vectors of the invention can carry additional sequences, such as sequences that regulate the replication of the vector in host cells (for example, origins of replication) and selectable marker genes.
  • the selectable marker gene facilitates the selection of host cells in which the vector has been introduced.
  • the selectable marker gene confers resistance to drugs, such as G418, hygromycin or methotrexate, in a host cell in which the vector has been introduced.
  • Selecting marker genes include the dihydrofolate reductase (DHFR) gene (for use in host cells - with amplification / selection with methotrexate) and the neo gene (for selection with G418).
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • a series of cell lines can act as suitable host cells for the recombinant expression of the polypeptides of the present invention.
  • Mammalian host cell lines include, for example, COS cells, CHO cells, 293T cells, A431 cells, 3T3 cells, CV-1 cells, HeLa cells, L cells, BHK21 cells, HL-60 cells, U937 cells, cells HaK, Jurkat cells, as well as cell strains derived from in vivo culture of primary tissue and primary explants.
  • yeasts such as yeasts
  • prokaryotes such as yeasts
  • yeast strains include Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces strains and Candida strains.
  • Potentially suitable bacterial strains include Escherichia coli, Bacillus subtilis and Salmonella typhimurium. If the polypeptides of the present invention are formed in yeasts or bacteria, it may be necessary to modify them by, for example, phosphorylation or glycosylation of the appropriate sites, in order to obtain functionality. Such covalent bonds can be obtained using well known chemical or enzymatic procedures.
  • polypeptides of the present invention can also be produced recombinantly by the operable binding of the isolated polynucleotides of the present invention with suitable control sequences in one or more insect expression vectors, such as baculovirus vectors, and using an expression system insect cell (INSECT).
  • suitable control sequences such as baculovirus vectors, and using an expression system insect cell (INSECT).
  • INSECT expression system insect cell
  • Materials and procedures for baculovirus / Sf9 expression systems are commercially available as a kit (for example, the MAXBAC ® kit, Invitrogen, Carlsbad, CA).
  • the polypeptides of the present invention can then be purified from the culture medium or from cell extracts using known purification procedures, such as gel filtration and ion exchange chromatography.
  • the purification may also include affinity chromatography with agents known to bind the polypeptides of the present invention. These purification procedures can also be use to purify the polypeptides of the present invention from natural sources.
  • polypeptides of the present invention can also be expressed recombinantly in a way that facilitates purification.
  • polypeptides can be expressed as fusions with proteins such as maltose binding protein (MBP), glutathione-S-transferase (GST), or thioredoxin (TRX).
  • MBP maltose binding protein
  • GST glutathione-S-transferase
  • TRX thioredoxin
  • the kits for the expression and purification of such fusion proteins are commercially available from New England BioLabs (Beverly, MA), Pharmacia (Piscataway, NJ) and Invitrogen, respectively.
  • the polypeptides of the present invention can also be labeled with a small epitope and subsequently identified or purified using a specific antibody against the epitope.
  • a preferred epitope is the FLAG epitope, which is commercially available from Eastman Kodak (New Haven, CT).
  • the polypeptides of the present invention can also be produced by known conventional chemical synthesis. The procedures for chemically synthesizing the polypeptides of the present invention are well known to those skilled in the art. Such chemically synthetic polypeptides may possess biological properties in common with purified natural polypeptides, and, therefore, may be employed as biologically active or immunological substitutes for natural polypeptides.
  • polypeptides of the present invention also encompass molecules that are structurally different from the polypeptides described (for example, that have a slightly altered sequence), but that have substantially the same biochemical properties as the polypeptides described (for example, are modified only in functionally non-essential amino acid residues).
  • molecules include natural allelic variants and deliberately engineered variants that contain alterations, substitutions, replacements, insertions or deletions. The techniques for such alterations, substitutions, replacements, insertions or deletions are well known to those skilled in the art. Procedures to diagnose, predict and control the progression of disorders associated with Th1 cells
  • Th 1 cells in inflammatory and autoimmune disorders, and the subsequent discovery about the ability of cortistatin to regulate the activity of Th1 cells, allows procedures for diagnosing, forecasting and controlling the progression of a disorder associated with Th1 cells by measuring the level and activity of Th1 cell activity, for example, cytokine secretion or Th2 cell antagonism, and a biological sample .
  • cortistatin can be used in procedures to distinguish whether a patient suffers from a disorder associated with Th1 cells or with Th2 cells.
  • Cortistatin can also be used in the procedures described to determine if a patient suffers from a disorder related to cortistatin.
  • this discovery allows the identification of new Th1 cell antagonists, which will also be useful in the treatment of disorders associated with Th1 cells.
  • Diagnostic procedures include determining a problem amount of a Th 1 cell activity or a cortistatin type activity in a biological sample of a subject, and comparing the problem amount with a normal amount or range (ie, ie, a amount or interval of one or more individuals known to not suffer from a disorder associated with Th1 cells).
  • the invention provides a method of diagnosis or detection of a disorder associated with Th 1 cells, which comprises the steps of: (a) determining the level of cortistatin type activity or cortistatin expression in an individual without an associated disorder with Th1 cells; (b) determine the level of cortistatin-like activity or cortistatin expression in a patient of interest; and (c) comparing the level of cortistatin-like activity or cortistatin expression in an individual without a disorder associated with Th1 cells with the level of cortistatin-like activity or cortistatin expression in the patient of interest, where an activity of substantially lower cortistatin type or cortistatin expression indicates that the patient may suffer from a disorder associated with Th1 cells.
  • a specific diagnostic procedure may not provide a definitive diagnosis of a disorder associated with Th1 cells, it is sufficient if the procedure provides a positive indication that helps in the diagnosis.
  • the present invention also provides methods for predicting disorders associated with Th1 cells.
  • "Prognosis” or “forecasting” means predicting the probable development and / or the severity of a pathological condition.
  • the invention provides a prognostic method comprising the steps of: (a) determining the level of cortistatin-like activity or cortistatin expression in a patient of interest at an initial time point; (b) determine the level of cortistatin type activity or cortistatin expression in the patient at a later time point; and (c) comparing the levels of cortistatin or cortistatin expression activity between the samples, where a substantial decrease in cortistatin or cortistatin expression activity indicates a greater probability that the patient develops a disorder associated with Th1 cells or has developed a more severe form of the disorder.
  • Prognostic procedures may also involve determining a problem amount of cortistatin-like activity or cortistatin expression in a biological sample of a subject (human or non-human mammal), and comparing the problem amount with a normal amount or range (i.e., ie, an amount or interval of one or more individuals known to not suffer from a disorder associated with Th1 cells).
  • a normal amount or range i.e., ie, an amount or interval of one or more individuals known to not suffer from a disorder associated with Th1 cells.
  • the invention provides a method of prognosis of a disorder characterized by the alteration of the regulation of a Th1 cell activity, which comprises the steps of: (a) determining the level of cortistatin type activity or cortistatin expression in a patient of interest; (b) determine the level of cortistatin-like activity or cortistatin expression in an individual known to not suffer from a disorder associated with Th1 cells; and (c) comparing the level of cortistatin type activity or cortistatin expression in the patient sample with the level of cortistatin type activity or cortistatin expression in the sample of the individual known to not suffer from an associated disorder.
  • Th1 cells where a substantially lower cortistatin-like activity or cortistatin expression in the patient sample indicates a higher probability that the patient develops a disorder associated with Th1 cells.
  • the present invention also provides methods for controlling the course of a disorder associated with Th 1 cells by detecting the increase or decrease of Th1 cell activities.
  • the invention also relates to the control of the course of a disorder associated with Th1 cells by detecting the increase or decrease in cortistatin expression levels or protein activity.
  • Control procedures involve determining problem amounts of: (i) Th1 cell activity, or (ii) cortistatin-like activity or cortistatin expression in biological samples taken from a subject at a first and second moment, and comparing the amounts.
  • a change in the amount of Th1 cell activity or cortistatin type expression or cortistatin expression between the first and second moments indicates a change in the course of the disorder associated with Th 1 cells.
  • a substantial decrease in the activity of Th1 cells indicates a remission of the disorder and a substantial increase in the activity of Th1 cells (or a substantial decrease in the activity or expression of cortistatin ) indicates progression of the disorder.
  • These control analyzes are also useful for evaluating the efficacy of a particular therapeutic intervention (for example, attenuation and / or reversal of the disease) in patients treated for a disorder associated with Th1 cells.
  • the invention also relates to the control of the course of therapeutic treatment of a disorder associated with Th1 cells by detecting an increase or decrease in the expression of cortistatin or levels of protein activity.
  • the method comprises the steps of: (i) detecting the level of a cortistatin-like activity or cortistatin expression activity in one or more samples of a patient suffering from a disorder associated with Th 1 cells at an initial time point; (ii) provide the patient with cortistatin, a cortistatin analog, a variant of cortistatin or a pharmaceutical compound thereof; (iii) detect the level of a cortistatin-like activity or cortistatin expression activity in one or more patient samples after treatment with cortistatin, a cortistatin analogue, a variant of cortistatin or a pharmaceutical compound thereof; (iv) comparing the levels of cortistatin type activity or cortistatin expression between the samples, where a substantial increase in cortistatin type activity or
  • compositions that is, combined with a pharmaceutically acceptable carrier
  • Such composition may contain, in addition to the compounds of the invention, transporters, various diluents, fillers, salts, buffers, stabilizers, solubilizers, and other materials well known in the art.
  • pharmaceutically acceptable means an innocuous material that does not interfere with the efficacy of the biological activity of the active ingredient (s). The characteristics of the conveyor will depend on the route of administration.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may include, for example, lipids, collagen spheres, cationic emulsion systems, water, saline buffers, vectors viral, chylomicron residues, polymeric nanoparticles (for example, DNA-gelatin or chitosan DNA), gold particles, polymeric complexes, lipoplejos, poliplejos, etc. (for example, Gardlik et al. (2005) Med. Sci. Monit. 11 (4): RA110-21).
  • the pharmaceutical composition of the invention may also contain other factors, such as, among others, anti-cytokine antibodies or other anti-inflammatory agents as described in more detail herein.
  • a pharmaceutical composition of the invention may include anti-IL-4 antibodies or drugs known to reduce an allergic response.
  • compositions of the invention can be in the form of a liposome in which cortistatin, cortistatin variants or cortistatin analogs are combined, in addition to other pharmaceutically acceptable carriers, with antipathic agents such as lipids that exist in aggregate form as micelles, insoluble monolayers, liquid crystals or lamellar layers in aqueous solution.
  • Suitable lipids for the liposomal formulation include, without limitation, monoglycerides, diglycerides, sulfatides, lysolecitin, phospholipids, saponin, bile acids, and the like. The preparation of such a liposomal formulation is within the level of the person skilled in the art.
  • the term "therapeutically effective amount” means the total amount of each active component of the pharmaceutical composition or procedure that is sufficient to show a significant benefit to the patient, including, among others, the improvement. of the symptoms, the cure, or increase in the cure rate, of such conditions.
  • the term refers to that ingredient alone.
  • the term refers to combined amounts of active ingredients that result in a therapeutic effect, whether administered in combination, sequentially or simultaneously.
  • a therapeutically effective amount of a Th1 cell antagonist for example cortistatin, variants of a subject is administered to a subject, for example a mammal cortistatin, cortistatin analogues or pharmaceutical compounds composed of them.
  • a Th 1 cell antagonist can be administered according to the method of the invention, either alone or in combinations of two or more Th1 cell antagonists, or in combination with other treatments, such as treatments that employ cytokines, lymphokines or hematopoietic factors. , or anti-inflammatory agents.
  • a Th 1 cell antagonist can be administered either simultaneously with the second agent or sequentially.
  • Th 1 cell antagonist can be done in several conventional ways, such as oral ingestion, inhalation or by cutaneous, subcutaneous or intravenous injection. Oral or subcutaneous administration to the patient is preferred.
  • oral administration includes, among others, administration of one or more cortistatin analogs and administration of cortistatin or one or more cortistatin variants protected from degradation (for example by micelles, nanoparticles, etc.).
  • the binder When a therapeutically effective amount of a Th1 cell antagonist is administered orally, the binder will be in the form of a tablet, capsule, powder, solution or elixir.
  • the pharmaceutical composition of the invention can also contain a solid carrier such as gelatin, or an adjuvant.
  • the tablets, capsules and powder contain from 5 to 95% of binding agent, and preferably from about 25 to 90% of binding agent.
  • liquid carriers such as water, petrolatum, animal or vegetable oils, such as peanut oil, mineral oil, soybean oil or sesame oil, or synthetic oils can be added.
  • the liquid form of the pharmaceutical composition may also contain physiological saline, dextrose or other saccharide solution, or glycols such as ethylene glycol, propylene glycol or polyethylene glycol.
  • the pharmaceutical composition When administered in liquid form, the pharmaceutical composition contains from about 0.5 to 90% by weight of the binder, and preferably from about 1 to 50% of binder.
  • a therapeutically effective amount of a Th1 cell antagonist When administered by intravenous, cutaneous or subcutaneous injection, the binder will be in the form of an aqueous solution, parenterally acceptable and pyrogen free.
  • the preparation of such parenterally acceptable protein solutions, in relation to pH, isotonicity, stability, and the like, is within the scope of the person skilled in the art.
  • a preferred pharmaceutical composition for intravenous, cutaneous or subcutaneous injection should contain, in addition to a binder, an isotonic vehicle such as sodium chloride injection, Ringer injection, dextrose injection, sodium chloride and dextrose injection, Ringer lactate injection , or another vehicle known in the art.
  • an isotonic vehicle such as sodium chloride injection, Ringer injection, dextrose injection, sodium chloride and dextrose injection, Ringer lactate injection , or another vehicle known in the art.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may also contain stabilizers, preservatives, buffers, antioxidants or other additives known to those skilled in the art.
  • Th 1 cell antagonist of the present invention The amount of a Th 1 cell antagonist of the present invention will depend on the nature and severity of the conditions being treated and the nature of previous treatments that the patient has received. Ultimately, the attending physician will decide the amount with which to treat each individual patient. Initially, the attending physician will administer low doses and observe the patient's response. Higher doses of a Th 1 cell antagonist can be administered until the optimal therapeutic effect is obtained for the patient and, in general, at that time the dose is not increased. It is contemplated that the various pharmaceutical compositions used to implement the process of the present invention should contain approximately 0.1 ⁇ g to approximately 100 mg of cortistatin per kg of body weight.
  • a composition can be formulated that includes a Th 1 cell antagonist for inhalation or other form of lung release. Consequently, the compound described in the present specification can be administered to the lung tissue by inhalation.
  • lung tissue refers to any tissue of the respiratory tract and includes the upper and lower respiratory tract, unless otherwise indicated.
  • a Th1 cell antagonist may be administered in combination with one or more of the existing modalities for treating inflammatory or immune disorders.
  • the compound is formulated for a nebulizer.
  • the compound can be stored in lyophilized form (for example, at room temperature) and reconstituted in solution before inhaling. It is also possible to formulate the compound for inhalation using a medical device, for example an inhaler (see, for example, U.S. Patent Nos.
  • the inhaler may include separate compartments for the active compound at a suitable pH for storage and another compartment for the active compound at a suitable pH for storage and another compartment for a neutralizing buffer, and a mechanism for combining the compound with a neutralizing buffer just before the atomization
  • the inhaler is an inhaler with a dose applicator.
  • the three frequent systems used to release drugs locally to the airways include dry powder inhalers (DPI), inhalers with Dose applicator (MDI) and nebulizers MDI, used in the most frequent methods of inhalation administration, can be used to release medication. cough in solubilized form or as dispersions.
  • MDIs comprise a relatively high freon or vapor pressure propellant that forces the aerosol medication into the respiratory tract after activation of the device.
  • IPRs depend entirely on the patient's inspiratory efforts to introduce a medication in the form of dry powder into the lungs.
  • Nebulizers form an aerosol of the drug for inhalation by providing energy to a liquid solution.
  • the direct pulmonary release of drugs during liquid ventilation or lung lavage using a fluorochemical medium has also been explored.
  • a Th 1 cell antagonist is released in the form of an aerosol atomizer from a pressurized container or dispenser containing a suitable propellant or a nebulizer.
  • the compound may be in the form of a dry particle or a liquid.
  • the particles that include the compound can be prepared, for example, by spray drying, drying an aqueous solution of the Th 1 cell antagonist with a neutralizing-loading agent and then creating particles from the dry powder, or drying an aqueous solution in an organic modifier and then creating particles from the dry powder.
  • the compound can be conveniently released in the form of an aerosol spray presentation from pressurized containers or a nebulizer, with the use of a suitable propellant, for example, dichlorodifluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas.
  • a suitable propellant for example, dichlorodifluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas.
  • the dosage unit can be determined by means of a valve to release a measured amount.
  • Capsules and cartridges for use in an inhaler or insufflator may be formulated to contain a powder mixture of a Th 1 cell antagonist and a suitable powder base, such as lactose or starch, if the particle is a formulated particle.
  • Th1 cell antagonist can be formulated for aerosol release, for example, in the form of dry aerosol particles, so that when administered it can be absorbed rapidly and can produce a rapid local or systemic therapeutic result.
  • Administration can be adjusted to provide detectable activity in 2 min, 5 min, 1 hour or 3 hours of administration. In some embodiments, the maximum activity can be achieved even more quickly, for example in half an hour or even 10 minutes. .
  • a Th1 cell antagonist can be formulated to have a longer biological half-life (for example, by association with a polymer such as PEG) and can be used as an alternative to other modes of administration, for example, so that the compound enters in the circulation from the lungs and is distributed to other organs or to a specific target organ.
  • a polymer such as PEG
  • the Th 1 cell antagonist is released in an amount such that at least 5% of the mass of the molecule is released in the lower respiratory tract or in the deepest part of the lungs.
  • the deep part of the lungs has an extremely rich capillary network.
  • the respiratory membrane that separates the capillary light from the alveolar airspace is very thin and extremely permeable.
  • the liquid layer that The alveolar surface is rich in pulmonary surfactants.
  • at least 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, or 80% of the composition of a cell antagonist Th1 is released in the lower respiratory tract or in the deep part of the lungs. The release in both tissues results in an effective absorption of the compound and high bioavailability.
  • the compound is provided in a measured dose using, for example, an inhaler or nebulizer.
  • the compound is released as a unit dose of at least about 0.02, 0.1, 0.5, 1, 1, 5, 2, 5, 10, 20, 40, or 50 mg / inhalation or more .
  • release enhancers such as surfactants
  • a "surfactant” refers to a compound with hydrophilic and lipophilic fractions that stimulate the absorption of a drug through interaction with an interface between two immiscible phases.
  • the surfactants are useful with dry particles for several reasons, for example, reduction of particle agglomeration, reduction of phagocytosis by macrophages, etc.
  • a more efficient absorption of the compound can be achieved, since the surfactants, such as DPPC, will greatly facilitate the diffusion of the compound.
  • the surfactants include, among others, phosphoglycerides, for example phosphatidylcholines, L-alpha-phosphatidylcholine dipalmitoyl (DPPC) and diphosphatidyl glycerol (DPPG); hexadecanol; fatty acids; polyethylene glycol (PEG); polyoxytethylene-9-; auryl ether; palmitic acid; oleic acid; sorbitan trioleate (Span 85); glycocholate; surfactin; poloxomer; sorbitan fatty acid ester; sorbitan trioleate; tyloxapol; and phospholipids.
  • phosphoglycerides for example phosphatidylcholines, L-alpha-phosphatidylcholine dipalmitoyl (DPPC) and diphosphatidyl glycerol (DPPG); hexadecanol; fatty acids; polyethylene glycol (PEG); polyoxytethylene-9-; auryl ether;
  • a Th 1 cell antagonist is physically associated with a fraction that improves its stabilization and / or retention in the circulation, for example in blood, serum, lymph, bronchopulmonary or bronchoalveolar lavage fluid, or other tissues, for example, at least it is 1, 5, 2, 5, 10 or 50 times.
  • a Th1 cell antagonist can be associated with a polymer, for example a substantially non-antigenic polymer, such as polyalkylene oxides or polyethylene oxides.
  • Suitable polymers will vary substantially in weight. Polymers with varying average molecular weights of about 200 to about 35,000 (or about 1,000 to about 15,000, or about 2,000 to about 12,500) can be used.
  • a Th 1 cell antagonist can be conjugated with a water-soluble polymer, for example, hydrophilic polyvinyl polymers, for example polyvinyl alcohol and polyvinylpyrrolidone.
  • a water-soluble polymer for example, hydrophilic polyvinyl polymers, for example polyvinyl alcohol and polyvinylpyrrolidone.
  • a non-limiting list of such polymers includes homopolymers of polyalkylene oxide such as polyethylene glycol (PEG) or polypropylene glycols, polyoxyethylene polyols, copolymers thereof and block copolymers thereof, provided that the water solubility of block copolymers is maintained. .
  • polystyrene resin examples include polyoxyalkylenes such as polyoxyethylene, polyoxypropylene and crosslinked polyoxyethylene and polyoxypropylene (Pluronics) copolymers; polymethacrylates; carbomers; branched or unbranched polysaccharides, comprising the saccharide monomers D-mannose, D- and L-galactose, fucose, fructose, D-xylose, L-arabinose, D-glucuronic acid, sialic acid, D-galacturonic acid, D- Mannuronic acid (for example, polymanuronic acid or alginic acid), D-glucosamine, D-galactosamine, D-glucose and neuraminic acid, including homopolysaccharides and heteropolysaccharides such as lactose, amylopectin, starch, hydroxyethylammonmidon, amylose, dextran dextran dextran sulfate , glyco
  • PEO polyoxyalkylene oxides
  • mPEG monomethoxy terminated polyethylene glycols
  • Glycols bis-activated polyethylene oxides
  • the polymer before its overcrossing with the molecule does not need, although preferably it is, water soluble.
  • the product is water soluble, for example it exhibits a solubility of at least about 0.01 mg / ml, and more preferably of at least about 0.1 mg / ml, and even more preferably, of at least approximately 1 mg / ml
  • the polymer It should not be very immunogenic in the conjugated form, nor should it show viscosity, which is incompatible with intravenous infusion, aerosolization or injection, if the conjugate is intended to be administered through such routes.
  • the polymer contains only a single group that is reactive. This helps prevent overcrossing of molecules from each other.
  • the polymer contains two or more reactive groups in order to bind multiple ligands to the polymer structure.
  • gel filtration or ion exchange chromatography can be used to recover the desired derivative in substantially homogeneous form.
  • the molecular weight of the polymer may vary up to about 500,000 D, and preferably is at least about 20,000 D, or at least about 30,000 D, or at least about 40,000 D.
  • the molecular weight chosen may depend on the effective size of the conjugate to be left. to obtain, the nature (for example, the structure, as linear or branched) of the polymer and the degree of derivation.
  • a covalent bond can be used to bind a Th1 cell antagonist to a polymer, for example, cross-linking with the N-terminal amino group of the ligand and the epsilon amino groups found in the lysine residues of the ligand, as well as other amino groups, imino, carboxyl, sulfydryl, hydroxyl or other hydrophilic groups.
  • the polymer may be covalently bound directly to the Th 1 cell antagonist without the or a multifunctional cross-linking agent (usually bifunctional).
  • Covalent binding to amino groups is achieved by known chemical procedures based on cyanuric chloride, diimidazole carbonyl and reactive aldehyde groups (PEG alkoxide plus diethyl acetyl of bromoacetaldehyde; PEG plus DMSO and acetic anhydride, or PEG chloride plus phenoxide of 4- hydroxybenzaldehyde, activated esters of succinimidyl, PEG 2,4,5-trichlorophenylchloroformate activated PEG or activated PEG nitrophenylchloroformate PEG).
  • Carboxyl groups can be derived by coupling PEG-amine using carbodiimide.
  • the sulfhydryl groups can be derived by coupling with maleimido substituted PEG (eg, alkoxy-PEG amine plus 4 (N maleimidomethyl) cyclohexane-1 sulfosuccinimidyl carboxylate or PEG-maleimide).
  • maleimido substituted PEG eg, alkoxy-PEG amine plus 4 (N maleimidomethyl) cyclohexane-1 sulfosuccinimidyl carboxylate or PEG-maleimide.
  • free amino groups in the ligand for example, epsilon amino groups or lysine residues
  • 2-imino-thiolane Traut reagent
  • PEG polymers that can bind to a Th1 cell antagonist, for example from Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL).
  • Such commercially available PEG derivatives include, for example, amino-PEG, amino acid esters of PEG, PEG hydrazide, PEG thiol, PEG succinate, carboxymethylated PEG, PEG propionic acid, PEG amino acids, PEG succinimidyl succinate, PEG succinimidyl, carboxymethylated PEG succinimidyl ester, PEG succinimidyl carbonate, PEG amino acid succinimidyl esters, PEG-oxycarbonylimidazole, PEG-nitrofil carbonate, PEG triplate, glycidyl ether-PEG, PEG-aldehyde, PEG vinyldehyde, PEG vinyldehyde, PEG vinyldehyde, PEG , PEG-orthopyridyl disulfide, heterofunctional PEG, derivatives of
  • the reaction conditions for the coupling of these PEG derivatives may vary depending on the Th1 cell antagonist and a polymer can be separated from the unreacted starting materials, for example by gel filtration or ion exchange chromatography, for example, HPLC .
  • the heterologous species of the conjugates are purified from each other in the same way. It is also possible to resolve different species (for example, that contain one or two PEG residues), due to the difference in the ionic properties of the amino acids without reaction. . It is expected that the cortistatin polynucleotides and polypeptides of the present invention exhibit one or more of the biological use or activities identified in the present specification (including those associated with analyzes cited herein).
  • proteins of the present invention can be provided by the administration or use of such proteins or by the administration or use of polynucleotides encoding such proteins (for example, in gene treatments, or vectors suitable for the introduction DNA Use of cortistatin to neutralize activities associated with Th1 cells in vivo
  • the invention characterizes a method to neutralize and / or inhibit one or more activities associated with live Th1 / n cells by administering a sufficient amount of antagonist of Th1 cells to inhibit or reduce the activity of Th1 cells.
  • a Th1 cell antagonist can also be administered to subjects for whom an inhibition of the inflammatory response mediated by Th1 cells is required. These conditions include, for example, inflammatory bowel disease, sepsis, arthritis, or the suppression of immunity after an organ transplant or an allograft.
  • cortistatin reduces the activity of Th 1 cells in mice with induced colitis, endotoxemia and arthritis. Consequently, cortistatin interferes with the signaling of Th1 cells and can neutralize one or more activities associated with Th1 cells. Therefore, cortistatin can be used to reduce in vivo Ia immunity mediated by Th1 cells, for example, to treat or prevent disorders associated with Th1 cells, including IBD, endotoxemia and arthritis, and / or their associated symptoms.
  • a Th 1 cell antagonist is administered in combination treatment, that is, in combination with other agents, for example therapeutic agents, which are useful for treating pathological conditions or disorders, such as autoimmune and chronic inflammatory disorders.
  • the term "in combination” in this context means that the agents are administered in a substantially contemporary manner, or simultaneously or sequentially. If administered sequentially, at the beginning of the administration of the second compound, preferably the first of the two compounds will still be detectable at effective concentrations at the treatment site or in the subject.
  • the combination treatment may include one or more Th1 cell antagonists, that is to say that they interfere with the signaling of Th1 cells, formulated together with and / or co-administered, one or more additional therapeutic agents, for example one or more cytokine and growth factor inhibitors, immunosuppressants, anti-inflammatory agents, metabolic inhibitors, enzyme inhibitors and / or cytotoxic or cytostatic agents, as described in more detail below.
  • Th1 cell antagonists can be used in combination with two or more of the therapeutic agents described herein. Such combination treatments can advantageously use lower doses of the therapeutic agents administered, thereby avoiding possible toxicities or complications associated with the various monotherapies.
  • Therapeutic agents that interfere with different immunity or inflammation triggers for example the therapeutic agents used in the treatment of infections or transplant rejections, can be used in combination with a Th1 cell antagonist.
  • one or more Th 1 cell antagonists can be formulated together with, and / or co-administered with one or more additional agent agents, such as other cytokine or growth factor antagonists (e.g., soluble receptors, peptide inhibitors, small molecules, ligand fusions, antibodies or antigen binding fragments (e.g., antibodies that bind cytokines or growth factors, their receptors, or other cell surface molecules), and anti-inflammatory or agonist cytokines thereof
  • additional agent agents such as other cytokine or growth factor antagonists (e.g., soluble receptors, peptide inhibitors, small molecules, ligand fusions, antibodies or antigen binding fragments (e.g., antibodies that bind cytokines or growth factors, their receptors, or other cell surface molecules), and anti-inflammatory or agonist cytokines thereof
  • agents that can be used in combination with a Th1 cell antagonist include, among others, modulators of one or more interleukins (IL) or their receptors, for example,
  • Th 1 cell antagonists can also be combined with modulators of, for example, antibodies against surface molecules such as CD2, CD3, CD4, CD8, CD23, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7 .1), CD86 (B7.2), CD90, or its ligands, including CD154 (gp39 or CD40L), or LFA-1 / ICAM-1 and VLA-4 ⁇ / CAM-1 (Yusuf-Makagiansar et al. (2002 ) Med. Res. Rev. 22: 146-67).
  • Preferred modulators that can be used in combination with a Th 1 cell antagonist include agonists of IL-4, IL-1, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL -15, IL-17, IL-18 and IL-22, and antagonists of IL-1, IFN ⁇ and TNF.
  • Th 1 cell antagonists examples include, among others, one or more of: inhaled steroids; beta agonists, for example short-acting or long-acting beta agonists; leukotriene antagonists or leukotriene receptor antagonists; combination drugs, such as ADVAIR®; anti-IgE antibodies, for example XOLAI R®; phosphodiesterase inhibitors; methylxanthines; anticholinergic drugs; mast cell stabilizing agents such as cromolin; and antihistamines.
  • inhaled steroids beta agonists, for example short-acting or long-acting beta agonists
  • leukotriene antagonists or leukotriene receptor antagonists combination drugs, such as ADVAIR®
  • anti-IgE antibodies for example XOLAI R®
  • phosphodiesterase inhibitors phosphodiesterase inhibitors
  • methylxanthines for example XOLAI R®
  • mast cell stabilizing agents such as cromolin
  • antihistamines examples include, among others, one or
  • TNF antagonists are concluded (eg, a fragment soluble of a TNF receptor, for example, p55 or p75 receptor of human TNF or derivatives thereof, for example, 75 kd TNFR-IgG (75 kD TNF-IgG receptor fusion protein, ENBREL TM)); TNF enzyme antagonists, for example inhibitors of the TNF ⁇ converting enzyme (TACE)); methotrexate, leflunomide, sirolimus (rapamycin), or an analogue thereof, for example CCI-779; COX2 and PLA2 inhibitors; NSAIDs; p38 inhibitors, TPL-2, Mk-2 and NFkB inhibitors, among others.
  • TNF antagonists eg, a fragment soluble of a TNF receptor, for example, p55 or p75 receptor of human TNF or derivatives thereof, for example, 75 kd TNFR-IgG (75 kD TNF-IgG receptor fusion protein, ENBREL TM
  • one or more Th 1 cell antagonists may be formulated together with and / or co-administered with one or more anti-inflammatory drugs, immunosuppressants or metabolic or enzymatic inhibitors.
  • drugs or inhibitors that can be used in combination with a Th 1 cell antagonist include, among others, one or more non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), for example ibuprofen, tenidap; naproxen; meloxicam, mesalamine, piroxicam, diclofenac and indomethacin; sulfasalazine; corticosteroids such as prednisolone; anti-inflammatory cytokine suppressor drugs (AISC); nucleotide biosynthesis inhibitors, for example purine biosynthesis inhibitors, folate antagonists (for example, methotrexate (N- [4 - [[(2,4-diamino-6-pteridinyl) methyl] methylamino] benzoy
  • NSAIDs non
  • Preferred therapeutic agents for use in combination with a Th1 cell antagonist include NSAIDs, AISC, Ia (DHODH) inhibitors (for example, leflunomide), and folate antagonists (for example, methotrexate)
  • additional inhibitory therapeutic agents include one or more of: corticosteroids (oral, inhaled and for local injection ); immunosuppressants, for example, cyclosporine, tacrolimus (FK-506); and mTOR inhibitors, for example, sirolimus (rapamycin) or rapamycin derivatives, for example, soluble derivatives of rapamycin (for example, ester derivatives d and rapamycin, for example, CCI 779 (ENt (2002) Curr. Opin. Investig.
  • Additional examples of therapeutic agents that can be combined with a Th 1 cell antagonist include one or more of: 6- mercaptopurines (6-MP); azathioprine sulfasalazine; mesalazine; olsalazine chloroquinine / hydroxychloroquine; penicillamine; aurothiomalate (intramuscular and oral); azathioprine; colchicine; beta-2 agonites of the adrenoceptor (salbutamol, terbutaline, salmeterol); xanthans (theophylline, arninophilin); cromoglycate; nedocromil; ketotifen; ipratropium and oxitropium; mycophenolate mofetil; adenosine agonists; antithrombotic agents; complement inhibitors and adrenergic agents.
  • 6-MP 6- mercaptopurines
  • kits for carrying out the combined administration of a Th 1 cell antagonist with another Th 1 cell antagonist and / or with other therapeutic compounds refers accordingly to a kit for carrying out the combined administration of a Th 1 cell antagonist with another Th 1 cell antagonist and / or with other therapeutic compounds.
  • the kit comprises one or more Th1 cell antagonist formulated in a pharmaceutical carrier, and at least one agent, for example a therapeutic agent, formulated as appropriate, in one or more different pharmaceutical preparations.
  • Example 1 The treatment with cortistatin reverses the colitis and reduces the recurrence of the disease
  • Example 1.1 Cortistatin inhibits the production of inflammatory mediators by macrophages activated in vitro.
  • Peritoneal macrophages were obtained by peritoneal lavage of BALB / c mice with 4 ml of RPMI 1640. The cells of the peritoneal exudate were washed and resuspended in complete medium at 10 6 cells / ml, and after 2 h at 37 0 C in CO 2 to the 5%, by repeated washing the cells that did not adhere were removed. Macrophage monolayers were incubated with complete medium in the absence (without stimulation) or presence of lipopolysaccharide (LPS 1 ⁇ g / ml, from E. coli serotype 055: B5, Sigma). In some experiments, CST-29 (10 8 M) was added at the beginning of the culture. Supernatants are cells were collected at different times and cytokine levels were determined as described above.
  • nitric oxide (NO) formed was estimated from the accumulation of stable NO metabolite nitrite by Griess analysis (Busch and Pollack (2001) Pharm. Res. 18: 1607-12). Equal volumes of supernatants (90 ⁇ l) and Griess reagents (90 ⁇ l of 1% sulfanilamide / N- [naphthyl] ethyl-ennediamine dihydrochloride 0.1% in 2.5% of H 3 PO 4 ) were mixed and mixed. measured absorbance at 550 nm. The amount of nitrite was calculated from a standard NaNO 2 curve.
  • Example 1.2 Treatment with cortistatin protects against TNBS-induced colitis.
  • Colitis was induced in Balb / c and SJL mice (68 weeks old, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) as previously described (Neurath et al. (1995) J. Exp. Meó. 182: 1281-90) . Briefly, the mice were lightly anesthetized with halothane and a 3.5F catheter was inserted intrarectally at 4 cm from the anus. To induce colitis, it was slowly administered in the lumen through the catheter provided with a 1 ml 100 ⁇ l syringe of 3 mg of TNBS (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) in 50% ethanol (to break the Ia epithelial barrier of the intestine). Control mice received only 50% ethanol (100 ⁇ l).
  • TNBS Sigma Chemical Co, St. Louis, MO
  • the animals were treated ip with vehicle or with different concentrations (0.05-2.0 nmol / mouse; 6-250 ⁇ g / kg) of cortistatin 1-29 (American Peptides Company, Sunnyvale, CA) 12 h after administration from TNBS.
  • i.pcortistatin (2 nmol / mouse) was injected daily for 3 consecutive days, beginning 6 days after the administration of TNBS.
  • 1.5 mg of TNBS were administered on days 0 and 9, and cortistatin (2 nmol / mouse) and cortistatin i.p. at 12 h after the first administration of TNBS.
  • the colon were examined with a dissecting microscope (x5) and the macroscopic lesions were classified with a scale of 0 to 10 based on criteria that reflect inflammation, such as hyperemia, thickening of the intestine and the extent of the ulceration (Fiorucci et al. . (2001) Proc. Nati. Acad. ScL USA 98: 13936-41). The consistency of stool and rectal bleeding were also evaluated and assessed.
  • a sample of colon of the central part was fixed in 10% formalin phosphate buffer, introduced into sucrose, frozen in dry ice using compound O. CT. and it was cryosected.
  • the cross sections were stained with hematoxylin / eosin, and the inflammation was scored from 0 to 4 as follows, masked by the same pathologist: 0, with no signs of inflammation; 1, low leukocyte infiltration; 2, moderate leukocyte infiltration; 3, high leukocyte infiltration, moderate fibrosis, high vascular density, thickening of the colon wall, moderate loss of goblet cells, focal loss of crypts; 4 infiltrations Transmurals, massive loss of goblet cells, extensive fibrosis, diffuse loss of crypts.
  • cryosections were blocked in 3% BSA / PBS for 30 min at room temperature, washed and incubated with 5 ⁇ g / ml of Acmo anti-CD4, anti-CD11 ⁇ or anti-TNF ⁇ labeled with FITC during 1 h room temperature. After assembly, the stained sections were examined by dual immunofluorescent microscopy (Leica, Wetzlar, Germany).
  • Neutrophil infiltration in the colon was monitored by measuring the MPO activity using a procedure cited above (Bradley et al. (1982) J. Invest. Dermatol. 78: 206-09). Briefly, the colonic segments were homogenized at 50 mg / ml in phosphate buffer (50 mM, pH 6.0) with 0.5% hexadecyltrimethylammonium bromide. The samples were frozen and thawed 3 times, then centrifuged at 30.00Og for 20 minutes.
  • the supernatants were diluted to 1:30 with an assay buffer consisting of 50 mM phosphate buffer at pH 6.0 with 0.167 mg / ml of o-dianisidine (Sigma) and 0.0005% H 2 O 2 and the colorimetric reaction was measured at 450 nm for 1 to 3 min on a spectrophotometer (Beckman Instruments, Irvine, CA).
  • the 13.5 coefficient was determined empirically so that the MPO activity of 1 U is the amount of enzyme that will reduce 1 ⁇ mol of peroxide / min.
  • FIG. 2 shows that cortistatin treatment reduced weight loss in mice with TNBS-induced colitis (A and B). This response was reflected as a lower colitis score in mice treated with cortistatin (C) along with greater survival in treated mice (D). Mice treated with cortistatin showed less macroscopic colonic damage (E) and also showed less inflammatory infiltrates in the colon (F), and fewer TNF ⁇ -producing cells or CD4 T cells in colonic tissue (G). In addition, mice treated with cortistatin showed lower colonic MPO activity compared to control mice treated with TNBS (H). Therefore, cortistatin is an effective treatment for TNBS-induced colitis and inflammatory bowel disease in mice.
  • FIG. 3 shows that cortistatin reduces weight loss in mice with established colitis (A) as well as in mice with recurrent colitis (B). In addition, the data show that cortistatin treatment significantly increases survival in mice suffering from colitis (C).
  • Example 1.3 Cortistatin regulates by decreasing the inflammatory response in colitis induced by TNBS.
  • protein extracts were isolated by homogenization of colonic segments (0.5 mg of tissue / ml) in 50 mM TrisHCI, at pH 7.4, with 0.5 mM DTT and 10 ⁇ g / ml of a mixture of proteinase inhibitors containing phenylmethylsulfonyl fluoride, pepstatin and leupeptin (Sigma). The samples were centrifuged at 30.00Og for 20 min and stored at -8O 0 C until the cytokines were determined.
  • Serum cytokine and chemokine levels were determined by a specific sandwich ELISA using capture / biotinylated detection antibodies from BD Pharmingen (San Diego, CA) and Preprotech ( Rocky HiII, NJ) following manufacturers recommendations.
  • Serum amyloid A (ASA) levels were determined in serum samples using a murine ELISA kit (Tridelta Development, NJ).
  • PMA 1 ng / ml
  • ionomycin (20 ng / ml) for 8 h, in the presence of monensin.
  • Cells were labeled with anti-CD4 Ac labeled with PerCP for 30 min at 4 C, washed, fixed / permeabilized with saponin with Cytofix / Cytoperm, labeled with 0.5 ⁇ g / sample of FITC-conjugated specific Acm-conjugates and with PE (BD Pharmingen), and analyzed using a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson). In order to distinguish between sources of monocytes / macrophages and T cells, the analysis of intracellular cytokines was performed exclusively in the population of CD4 T cells labeled with PerCP.
  • the monocuclear cells of the lamina intestinal (LPMC) were isolated from recently obtained colonic samples. Briefly, the colon was washed in medium with Hank's balanced saline solution (HBSS) without calcium and without magnesium and then treated with 1 mM EDTA / PBS for 20 min to remove the epithelium. The tissue was then digested with collagenase type IV and with DNase I (Sigma) for 20 min in a shaker incubator at 37 ° C. The released cells were layered in a 30-70% Percoll gradient (Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden) and stirred at 1,800 rpm to obtain the leukocyte-rich population at the interface of 30-70%.
  • HBSS Hank's balanced saline solution
  • DNase I Sigma
  • Cell suspensions were obtained from freshly collected MLN in the peak moment of the disease.
  • Cells mesenteric lymph nodes (MLN) were enriched in T cells by incubation of MLN cells in petri plates for 2 h at 37 0 C to remove cells that did not adhere.
  • the LPMC and MLN cells were incubated in complete medium (RPMI-1640 supplemented with 100 U / ml penicillin / streptomycin, 2 mM L-glutamine, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol and 10% fetal bovine serum heat inactivated) at a concentration of 10 6 cells / ml, in the absence (without stimulation) or presence of PMA (10 ng / ml) and With A (2.5 ⁇ g / ml).
  • complete medium RPMI-1640 supplemented with 100 U / ml penicillin / streptomycin, 2 mM L-glutamine, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol and 10% fetal bovine serum heat inactivated
  • Cell proliferation (expressed as A 450 ) was evaluated in 96-well microtiter plates for 96 h using a cell proliferation assay (BrdU) from Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Germany). The production of cytokines / chemokines in the culture supernatants was determined after 48 h of culture as described above. The intracellular content of cytokines was determined in stimulated cells as described above.
  • FIG. 4 shows that cortistatin regulates by significantly decreasing the levels of proteins and mRNA of inflammatory mediators, for example TNF ⁇ , IL-6, MIP-2, Rantes, IL-1 ⁇ , IL-12 and IFN ⁇ , during colitis in Colon mucosa cells of mice (A and B).
  • cortistatin treatment regulates by increasing the levels of protein and mRNA expression of Th2 cell cytokine, IL-10, in mice with TNBS-induced colitis (A and B).
  • Cortistatin treatment also regulated the mRNA level of several chemokines (for example, Rantes, MIP, MCP) and chemokine receptors (for example, CCR1-8 and XCR1) (A and B). Therefore, FIG. 4 shows that cortistatin regulates by decreasing the inflammatory response of the mucosa during TNBS-induced colitis in mice.
  • chemokines for example, Rantes, MIP, MCP
  • chemokine receptors for example, CCR1
  • FIG. 5 shows that cortistatin regulated by significantly decreasing the protein levels of several cytokines, that is, TNF ⁇ , MIP-2, IL-6 and IL-1 ⁇ , in serum levels during TNBS-induced colitis in mice.
  • cortistatin treatment also significantly reduced ASA levels in the same mice affected by colitis. Therefore, FIG. 5 shows that cortistatin decreases systemic inflammation during TNBS-induced colitis in mice.
  • FIG. 6 shows that cortistatin treatment decreased the proliferation of LPMC and MLN cells stimulated and not stimulated during TNBS-induced colitis (A).
  • the cytokine content of the supernatant of stimulated LPMC and MLN cells showed reduced levels of IFN ⁇ and increased levels of IL-10 in response to cortistatin (A, right-hand panels).
  • the number of INF4 producing CD4 cells decreased in mice with cortistatin treated colitis, while the number of IL-10 producing CD4 cells increased.
  • Resident macrophages were obtained by peritoneal lavage with RPM 1-1 640 medium. Peritoneal cells were washed in cold medium and incubated in complete medium (RPMI-1 640 supplemented with 100 U / ml penicillin / streptomycin, L-glutamine 2 mM, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol and 10% fetal bovine serum inactivated by heat) at a concentration of 10 6 cells / ml. After 2 h at 37 0 C, cells not adhered were removed by extensive washing. At least 95% of the adherent cells were macrophages, according to morphological and phagocytic criteria and flow cytometry.
  • the macrophage monolayers were incubated with complete medium in the absence (without stimulation) or presence of LPS (1 ⁇ g / ml, of E. coli serotype 055: B5; Sigma).
  • LPS 1 ⁇ g / ml, of E. coli serotype 055: B5; Sigma.
  • cortistatin was added at different concentrations (from 10 "7 to 10 " 12 M) at the beginning of the culture.
  • the Supernatants without cells were collected at different times and cytokine / chemokine levels were determined as described above.
  • the amount of nitric oxide (NO) formed was estimated from the accumulation of stable NO metabolite nitrite by Griess analysis (Bush et al., Supra). Equal volumes of supernatants (90 ⁇ l) and Griess reagents (90 ⁇ l of 1% sulfanilamide / N- [naphthyl] ethyl-enenediamine dihydrochloride 0.1% in 2.5% of H 3 PO 4 ) were mixed and mixed. measured absorbance at 550 nm. The amount of nitrite was calculated from a standard NaNO 2 curve.
  • the results of these experiments are shown in FIG. 7.
  • the peritoneal macrophages of the mice showed lower levels of the cytokines TNF ⁇ , IL-6, IL-1 ⁇ , IL-12, Rantes and MIP-2 in response to cortistatin treatment.
  • these cells exhibited lower levels of nitric oxide (NO) in response to cortistatin. Therefore, cortistatin inhibits the production by activated macrophages of inflammatory mediators in activated macrophages in vitro.
  • NO nitric oxide
  • Example 2.2 Cortistatin protects against lethal endotoxemia and reduces the histopathological signs of Endotoxemia.
  • endotoxemia i.p. was injected into Balb / c and C57BI / 6 mice (6-8 weeks old, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). different amounts (25-600 ⁇ g / mouse; 400 ⁇ g / mouse unless otherwise indicated) of lipopolysaccharide (LPS, from Salmonella enteridis; Sigma). The animals were treated i.p. with medium (controls) or with different concentrations (0.05-5.0 nmol / mouse; 6-550 ⁇ g / kg) of cortistatin-29 (American Peptides Company, Sunnyvale, CA) 30 min after the LPS test.
  • LPS lipopolysaccharide
  • ip cortistatin was injected (2 nmol / mouse 2 or 4 hours after administration of endotoxin. Animals were monitored daily to observe survival and other clinical signs, including ruffled skin, lethargy, diarrhea and loss of body weight Some animals were sacrificed at different times after the injection of LPS; blood samples were collected by cardiac puncture, peritoneal exudates were obtained and liver, lungs and small intestine were collected. The blood samples were allowed to coagulate for 1 h at room temperature and the serum was obtained after centrifugation for the determination of cytokines, chemokines and serum amyloid A (ASA). The tissue samples were immediately frozen in liquid nitrogen.
  • ASA serum amyloid A
  • peritoneal suspension was centrifuged 5 min at 180Og and the cell-free supernatants (peritoneal fluid) were recilected and analyzed to determine the production of cytokines / chemokines.
  • Peritoneal cells were counted and adjusted in medium with 3 mM PBS / EDTA at 3 x 10 6 cells / ml. The number of viable cells in the different peritoneal subpopulations was determined by flow cytometry (FACScan; BD Biosciences, Mountain View, CA).
  • peritoneal lymphocytes, macrophages and polymorphonuclear cells were obtained according to their different characteristics of frontal dispersion and lateral dispersion and were counted.
  • the great predominance of neutrophils (99%) in the PMN population was confirmed in cytospine preparations marked with May-Grunwald and Giemsa.
  • the liver, lungs and small intestine freshly collected were fixed in 10% formalin phosphate buffer, introduced into sucrose, frozen in dry ice using compound O. CT. and it was cryosected.
  • the cross sections were stained with hematoxylin / eosin by standard techniques.
  • the supernatants were diluted at 1:30 with an assay buffer consisting of 50 mM phosphate buffer at pH 6.0 with 0.167 mg / ml of o-dianisidine (Sigma) and 0.0005% H2O2 and the colorimetric reaction was measured at 450 nm for 1 to 3 min on a spectrophotometer (Beckman Instruments, Irvine, CA).
  • the 13.5 coefficient was determined empirically so that the MPO activity of 1 U is the amount of enzyme that will reduce 1 ⁇ mol of peroxide / min. The results of these studies are shown in FIGS. 8 and 9.
  • cortistatin treatment reduced the incidence of mortality in mice that had been injected with LPS and increased the average survival time for mice treated.
  • Cortistatin treatment was effective at several doses of LPS (CA) and was most effective when administered at a dose of 0.5-5 nmol (D).
  • FIG. 9 shows that mice stimulated with LPS and then treated with cortistatin, experienced a reduction in inflammatory infiltration and dissemination in target organs (lungs and liver) (A).
  • the cortistatin significantly decreased the MPO activity in several tissues after the stimulation of LPS, including the lungs, liver and intestine.
  • cortistatin treatment reduced the recruitment of leukocytes (PMN, macrophages and lymphocytes) into the peritoneal cavity of mice in which LPS had been injected.
  • Example 2.3 Cortistatin reduces local and systemic inflammatory responses in endotoxemic mice.
  • cytokines For the determination of cytokines in the tissues, protein extracts were isolated by homogenizing portions of the lung, liver and small intestine (0.5 mg of tissue / ml) in 50 mM TrisHCI, at pH 7.4, with DTT 0, 5 mM and 10 ⁇ g / ml of a mixture of proteinase inhibitors containing phenylmethylsulfonyl fluoride, pepstatin and leupeptin (Sigma). The samples were centrifuged at 30.00Og for 20 min and stored at - 8O 0 C until the cytokines were determined.
  • Serum cytokine and chemokine levels were determined by a specific sandwich ELISA using BD Pharmingen (San Diego, CA) and Preprotech capture / biotinylated detection antibodies. (Rocky HiII, NJ) following the manufacturers recommendations as previously described. Serum amyloid A (ASA) levels were determined in serum samples using a murine ELISA kit (Tridelta Development, NJ).
  • the amount of nitric oxide (NO) formed was estimated from the accumulation of stable NO metabolite nitrite by Griess analysis. Equal volumes of supernatants (90 ⁇ l) and Griess reagents (90 ⁇ l of 1% sulfanilamide / N- [naphthyl] ethyl-enenediamine dihydrochloride 0.1% in 2.5% of H 3 PO 4 ) were mixed and mixed. measured absorbance at 550 nm. The amount of nitrite was calculated from a standard NaNO 2 curve. The results of these experiments are shown in FIG. 10.
  • cortistatin treatment decreased the levels of inflammatory mediators TNF ⁇ , IL-6, IL-1 ⁇ , Rantes, NO, SAA, MIP-2, IFN ⁇ and IL-12 in serum (A).
  • Cortistatin also increased serum levels of IL-10, a cytokine of Th2 (A).
  • Cortistatin treatment successfully decreased the peritoneal levels of TNF ⁇ , Rantes, IL-6, MIP-2, IL-12, IFN ⁇ , and NO (B). This suggests that cortistatin decreases the local and systemic inflammatory responses in endotoxemic mice.
  • mice Native bovine type II collagen (CII; Sigma) was dissolved in 0.05 M acetic acid at 4 0 C for overnight Ia and emulsified with an equal volume of complete Freund 's adjuvant (CFA; Difco, Detroit, Michigan). Sc was injected into the base of the tail of male DBA / 1 J mice (6-10 weeks old, Jackson Labs, Bar Harbor, ME) 0.15 ml of emulsion containing 200 ⁇ g of IIC. At 21 of the primary immunization, the mice received an ip booster with 200 ⁇ g of CII in PBS. The mice were analyzed by two independent evaluators masked on alternate days and monitored for signs of arthritis onset using two clinical parameters, the swelling of the leg and the clinical score.
  • CFA complete Freund 's adjuvant
  • the swelling of the leg was evaluated by measuring the thickness of the affected hind legs by means of 0-10 mm calipers.
  • Clinical arthritis was evaluated using the following system: grade 0, without swelling; grade 1, slight swelling and erythema; 2, pronounced edema; 3, joint stiffness. Each limb was graduated, with a maximum possible score of 12 per animal.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

La presente invención proporciona procedimientos para inhibir, es decir, reducir, neutralizar y/o antagonizar, al menos una actividad de células Th 1 usando polinucleótidos o polipéptidos de cortistatina, o análogos o variantes de cortistatina, o productos farmacéuticos de la misma. La presente invención también está dirigida a nuevos procedimientos de diagnóstico, pronóstico, monitorización de la progresión y tratamiento de trastornos asociados con células Th1. La presente invención además está dirigida a procedimientos de detección selectiva y evaluación de compuestos problema para la intervención (tratamiento) y prevención de trastornos asociados con células Th 1. La presente invención también proporciona nuevos productos farmacéuticos compuestos por antagonistas de células Th1 , por ejemplo polinucleótidos o polipéptidos de cortistatina, o análogos de cortistatina o variantes de cortistatina, que específicamente reducen, neutralizan y/o antagonizan al menos una actividad asociada con células Th 1.

Description

COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS PARA TRATAR TRASTORNOS INFLAMATORIOS E INMUNITARIOS CON CORTISTATINA
Objeto de Ia invención Esta invención se refiere a Ia cortistatina y su uso en Ia regulación de Ia inflamación y Ia inmunidad. Los procedimientos y composiciones farmacéuticas descritos en Ia presente memoria descriptiva son útiles para diagnosticar, pronosticar, controlar, tratar, mejorar y/o prevenir los trastornos asociados con Ia respuesta inmunitaria mediada por las células T colaboradoras CD4+ de tipo 1 (Th1 ) (es decir, los trastornos relacionados con Ia alteración de Ia regulación de una o más actividades de las células Th 1 ), por ejemplo trastornos inflamatorios (por ejemplo, enfermedad intestinal inflamatoria), trastornos inmunitarios (incluidos trastornos asociados con el sistema inmunológico (por ejemplo, nefropatías), trastornos autoinmunitarios (por ejemplo, artritis, esclerosis múltiple, diabetes insulinodependiente), y trastornos atópicos (por ejemplo, asma, eccema atópico/dermatitis atópica, rinitis alérgica)), trastornos sépticos (por ejemplo , endotoxemia, shock séptico, shock endotóxico), y trastornos relacionados con el trasplante/injerto de órganos o tejidos (por ejemplo, enfermedad del injerto contra el huésped, rechazo de trasplantes/injertos).
Antecedentes de Ia invención
La cortistatina (CST) es un neuropéptido cíclico con una elevada homología con Ia somastostatina (SST) (de Lecea y col. (1996) Nature 381 :242-45; de Lecea y col. (1997) Genomics 42:499-506). Las somatostatinas forman una familia de ciclopéptidos producidos por células endocrinas, gastrointestinales inmunitarias y neuronales normales y por ciertos tumores y granulomas (Zavros y col. (2004) Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 286(5):G698-701 ; Ten Bokum y col. (1999) Eur. J. Clin. Invest. 29:630-36).
Las SST (tales como Ia SST-14 y Ia SST-28) y las CST (como Ia CST- 14 y Ia CST-29) se generan como productos C-terminales de prepropéptidos escindidos por Ia proproteína convertasa, una enzima que escinde por los pares de aminoácidos RR, RK y KK (Spier y de Lecea (2000) Brain Res. Brain Res. Rev. 33:228^1 ; Taylor y col. (2003) FASEB J. 17:1215-27). Sin embargo, aunque Ia SST y Ia CST comparten una homología significativa, son productos de genes distintos (Spier y de Lecea, supra; Li y col. (2005) World J. Surg. 29:354-56). Los propéptidos de CST y de SST contienen un bucle de Cys-Cys, en el que existe un motivo de unión al receptor FWKT (Spier y de Lecea, supra). La CST-14 (secuencia: Pro-[Cys-Arg-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys- Thr-Phe-Ser-Ser-Cys]-I_ys) contiene 10 aminoácidos idénticos a los idénticos a los encontrados en Ia SST-14 (secuencia: Ala-Gly-[Cys-l_ys-Asn-Phe-Phe- Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys]) (Spier y de Lecea, supra). Es notable hecho de que, en comparación con Ia SST-14, Ia CST-14 contiene un residuo de Lys en posición directamente C-terminal al bucle de Cys-Cys, una Ser reemplazando a una Thr en el bucle de Cys-Cys, una Arg reemplazando a una Lys en el bucle de Cys-Cys, y un residuo de Pro en lugar de el par AIa- GIy localizada en posición directamente N-terminal con respecto al bucle de Cys-Cys. Se cree que estos residuos proporcionan a Ia CST una función o funciones únicas.
El bucle de Cys-Cys presente en Ia SST y Ia CST permiten que ambas moléculas se unan a los receptores de Ia SST (SSTR) con una afinidad similar (Moller y col. (2003) Biochim. Biophys. Acta 1616:1-84; Lichtenauer y col. (2004) Eur. J. Endocrinol. 150:565-77). Existen cinco SSTR conocidos, que se expresan de forma diferenciada en varios órganos, incluidos el cerebro y las células inmunitarias (es decir, los linfocitos B y T, y los monocitos activados) (Moller y col., supra; Lichtenauer y col., supra). Aunque Ia CST es un ligando de alta afinidad por los cinco SSTR, pruebas recientes indican que Ia CST se une a receptores a los que Ia SST no se une, por ejemplo el gen relacionado con Mas (MRgX2) y el receptor de grelina (un receptor del secretagogo de Ia hormona de crecimiento (GHS-R)) (Kamohara y col. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 330:1146-52; Deghenghi y col. (2003) Endocrinology 22:13 - 18). Algunos estudios indican que Ia administración de grelina puede tener un efecto antiinflamatorio (véase, por ejemplo, Granado y col. (2005) Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 288:E486-92; Dixit y col. (2004) J. Clin. Invest. 114(1 ):57-66). Además, auque el ARNm de Ia SST se expresa en el sistema nervioso, las glándulas endocrinas y el tracto gastrointestinal, Ia CST se expresa en mayor cantidad, y se han encontrado transcritos en el sistema nervioso, el estómago, los ríñones, los leucocitos, el tejido linfático y Ia médula ósea (Reichlin (1983) N. Engl. J. Med. 309:1495-501 , 1556-63; DaIm y col. (2003a) Am. J. Physiol. Endocrinol Metab. 285:E344-53; DaIm y col. (2003b) J. Clin. Endocr. Metab. 88:270-76). De hecho, Ia CST, pero no Ia SST, se encuentra en monocitos, macrófagos, linfocitos B y T, células dendríticos y monocitos de sangre periférica (DaIm y col. (2003a y 2003b), supra). El perfil de expresión de Ia CST sugiere un papel único para este neuropéptido en Ia regulación del sistema inmunitario. Las células T colaboradoras CD4(+) (células Th) del sistema inmunitario tienen dos funciones principales, estimular Ia inmunidad celular y Ia inflamación, y estimular a las células B para que produzcan anticuerpos (Crane y Forrester (2005) Crit. Rev. Immunol. 25:75-102). Existen dos subpoblaciones de células T funcionalmente distintas (Th1 y Th2) que secretan citoquinas que estimulan estas dos actividades diferentes. Las células Th1 producen IL-2, IFNγ y TNFβ, que activan los receptores de células T y los macrófagos para que estimulen Ia inmunidad celular y Ia inflamación. Las células Th2 secretan IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13, que estimulan Ia producción de anticuerpos por las células B. Estas citoquinas suelen tener actividades dobles, por ejemplo, Ia IL-4, producida por las células Th2, funciona como factor autocrino mediante Ia estimulación de Ia actividad Th2, y como factor paracrino mediante Ia supresión de Ia función de las células Th1. Por el contrario, Ia citoquina de las células Th1 IFNγ inhibe Ia proliferación de células Th2, mientras que Ia citoquina de las células Th2 IL-10 inhibe Ia secreción por las células Th 1 de I FNy e IL-2. Por tanto, algunas citoquinas producidas por las células Th1 y Th2 se antagonizan entre sí, y el equilibrio entre Ia actividad Th1 y Th2 dirige Ia inmunidad como mediada por células o humoral. Se ha mostrado que Ia somatostatina suprime Ia inmunidad (Van
Hagen y col. (1994) Eur. J. Nucí. Med. 21 :497-502). Por ejemplo, Ia SST inhibe Ia proliferación de linfocitos y Ia liberación de Ia citoquina inflamatoria TNFα y de Ia citoquina de las células Th1 IFNγ in vitro (Peluso y col. (1996) Neuropeptides 29:77-81 ). Sin embargo, el perfil de expresión del ARNm de Ia SST (es decir, en el sistema nervioso, las glándulas endocrinas y el tracto gastrointestinal) sugiere que Ia SST puede no duplicar este papel inmunomodulador in vivo. Por tanto, se ha postulado que Ia CST, que se expresa en monocitos, monocitos, macrófagos, linfocitos B y T, células dendríticos y monocitos de sangre periférica, funciona mediando en el sistema inmunitario, posiblemente mediante Ia regulación por disminución de Ia inmunidad de tipo Th1 (DaIm y col. (2003a y 2003b), supra). Se ha mostrado que aunque Ia SST inhibe Ia secreción espontánea e inducida por el TNFα de TNFα in vitro, Ia adición de TNFα a cultivos celulares suprime Ia expresión de CST in vitro (Lang y col. (2005) Liver Int. 25(4):808-16; Yan y col. (2005) J. Surg. Res. 123:294-301). Este antagonismo mutuo entre los miembros de Ia familia de las somatostatinas y Ia citoquina inflamatoria TNFα es una reminiscencia del antagonismo observado entre las citoquinas secretadas por las células Th 1 y Th2. El equilibrio inmunitario controlado por las subpoblaciones de células T colaboradoras CD4(+) es crucial para Ia inmunorregulación. El desequilibrio en Ia señalización de las células Th1 y Th2 induce varios trastornos inmunitarios, incluidos infecciones y autoinmunidad (Crane y Forrester (2005) Crit. Rev. Immunol. 25(2):75-102). Por ejemplo, Ia diabetes de tipo 1 , Ia esclerosis múltiple, Ia tiroiditis de Hashimoto, Ia artritis reumatoide y Ia uveítis posterior se consideran trastornos autoinmunitarios mediados por células Th 1 , y Ia supresión de las células Th1 (o Ia activación de las células Th2) es un procedimiento inmunológico plausible para mejorar o prevenir estos trastornos (Crane y Forrester, supra). Dado que Ia CST, en lugar de Ia SST, mantiene un perfil de expresión que sugiere implicación en Ia regulación de Ia inmunidad, Ia CST puede alterar el equilibrio mediado por las células Th1/Th2 mediante Ia disminución de Ia inmunidad de tipo Th1. En consecuencia, Ia modulación del nivel, Ia expresión y Ia actividad de Ia CST y las variantes y análogos de Ia CST es una excelente herramienta bioquímica/farmacéutica para tratar, mejorar o prevenir los trastornos relacionados con Ia inmunidad inducida por células Th 1 y Ia respuesta inflamatoria.
Descripción de Ia invención La presente solicitud proporciona, al menos en parte, composiciones farmacéuticas y procedimientos para tratar individuos (por ejemplo, pacientes) que sufran trastornos relacionados con Ia inmunidad mediada por las células T colaboradoras CD4+ de tipo 1 (Th1 ). En una forma de realización, Ia cortistatina, las variantes de cortistatina o los análogos a Ia cortistatina se usan para reducir, neutralizar y/o antagonizar al menos una actividad de células Th1. La presente invención también proporciona compuestos farmacéuticos compuestos por cortistatina, variantes de cortistatina o análogos a cortistatina que son útiles para tratar varios trastornos inmunológicos. La presente invención describe que Ia cortistatina es una terapéutica altamente eficaz cuando se usa para tratar animales que sufran, por ejemplo, enfermedad intestinal inflamatoria (EII), endotoxemia (o shock séptico) o artritis, y que Ia administración de cortistatina reduce Ia respuesta inmunitaria mediada por las células Th 1 que se produce durante el curso, inicio o recurrencia de tales trastornos. Además, Ia presente invención describe que Ia cortistatina es altamente eficaz en Ia regulación de factores asociados con las células Th1 y Th2, por ejemplo quimioquinas tales como MIP y Rantes, interleuquinas tales como IL-6 e IL-10, y citoquinas tales como TNFα e IFNγ. Como resultado, Ia invención instruye acerca de que Ia cortistatina y las variantes y análogos de Ia cortistatina son composiciones eficaces para tratar trastornos inmunitarios, inflamatorios y otros que son el resultado de Ia alteración de Ia regulación de las células Th1.
En una forma de realización, Ia invención se caracteriza por un procedimiento para tratar (por ejemplo, curar, suprimir), mejorar o prevenir (por ejemplo, retrasar o prevenir el inicio, o prevenir Ia recurrencia o Ia recaída) de un trastorno asociado con células Th1 en un sujeto (por ejemplo, un paciente, es decir un paciente humano, un paciente mamífero no humano). El procedimiento incluye administrar al sujeto un antagonista de células Th1 , por ejemplo cortistatina (por ejemplo, un péptido de cortistatina, un propéptido de cortistatina, un prepropéptido de cortistatina o un polinucleótido que codifica un péptido de cortistatina, un propéptido de cortistatina o un prepropéptido de cortistatina), una variante de cortistatina (por ejemplo, una cortistatina con un cambio en Ia secuencia del ácido nucleico o de aminoácidos, en Ia que Ia molécula retiene Ia actividad de tipo cortistatina), un análogo de cortistatina (por ejemplo, una molécula pequeña, un mimético peptídico o un anticuerpo con actividad de tipo cortistatina), o una composición farmacéutica del mismo, en cantidad suficiente para tratar, mejorar o prevenir el trastorno asociado con células Th1. El antagonista de células Th 1 puede administrarse al sujeto solo o combinado con otras modalidades terapéuticas como se ha descrito en Ia presente memoria descriptiva. La administración de un antagonista de células Th 1 es útil para tratar, mejorar o prevenir actividades asociadas con células Th1 , por ejemplo, liberación de citoquinas, antagonismo de inmunidad inducida por células Th2 o inducción de inmunidad e inflamación mediada por células. Los antagonistas de células Th 1 se puede administrar terapéutica, profilácticamente, o de ambos modos. En una forma de realización, el sujeto es un mamífero, por ejemplo un ser humano que sufra un trastorno asociado con células Th1 , incluidos, por ejemplo, trastornos inmunitarios e inflamatorios. Preferentemente, el sujeto es un ser humano. Más preferentemente, el sujeto es un ser humano que sufre un trastorno asociado con células Th 1 como se ha descrito en Ia presente memoria descriptiva.
En una forma de realización, Ia presente invención proporciona procedimientos terapéuticos seguros y eficaces para diagnosticar, pronosticar, controlar, seleccionar, tratar, mejorar y/o prevenir trastornos asociados con células Th1 , por ejemplo trastornos inflamatorios, trastornos inmunitarios (incluidos trastornos asociados con Ia inmunidad, trastornos autoinmunitarios y trastornos atópicos), trastornos sépticos y trastornos relacionados con trasplantes/injertos de órganos o tejidos (en cuanto a los trastornos atópicos, véase, por ejemplo, Zheng y Zhu (2005) Curr. Allergy Asthma Rep. 5(4):291 - 97; Simón y col. (2005) Allergy 60(7):944-51 ; Lugovic y col. (2005) Int. Arch. Allergy Immunol. 137(2): 125 -33; Chen y col. (2004) Clin. Exp. Immunol. 138(3):375-87; Biedermann y col. (2004) J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 9(1 ):5-14; GaIIi y col. (2003) Curr. Mol. Med. 3(2):127-38; Lewis (2002) Curr. Opin. Immunol. 14(5):644-51 ; y Ring y col. (2001) Curr. Allergy Rep. 1(1):39- 43). En otra forma de realización, Ia presente invención proporciona procedimientos terapéuticos seguros y eficaces para diagnosticar, detectar, pronosticar, controlar, seleccionar, tratar, mejorar y/o prevenir trastornos inflamatorios, trastornos inmunitarios y trastornos relacionados en los que se incluyen, entre otros, trastornos autoinmunitarios, trastornos asociados con Ia inmunidad, trastornos inflamatorios crónicos, trastornos sépticos y trastornos relacionados con trasplantes/injertos de órganos o tejidos; entre los ejemplos de tales trastornos se incluyen, entre otros, esclerosis múltiple (EM), pioderma gangrenoso (PG), tireopatía, diabetes mellitus de tipo 1 insulinodependiente, tiroiditis de Hashimoto, artritis reumatoide, enfermedad de Grave, hepatitis autoinmunitaria, shock séptico, síndrome del shock tóxico (SST), sepsis, endotoxemia (por ejemplo, inducida por varios patógenos tales como bacterias u hongos), encefalomielitis alérgica, uveoretinitis, uveítis (por ejemplo, autoinmunitaria y posterior), rechazo de trasplantes, rechazo de aloinjerto, enfermedad injerto contra huésped (EICH), endocarditis de Libman- Sacks, lupus (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico (LES) o lupus eritematoso cutáneo (LEC)), enfermedad mixta del tejido conjuntivo (EMTC), esclerodermia, dermato-polimiositis, granulomatosis de Wegener, síndrome de Sjogren, granulomas, liquen escleroso (LE), cirrosis biliar primaria (CBP), enfermedad intestinal inflamatoria (EII) (por ejemplo, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn), colitis crónica (no ulcerosa), gastritis autoinmunitaria (GAI), queratitis, glomerulonefritis, artritis reactiva, sinovialitis, síndrome de Reiter, enfermedad de Lime, artritis psoriásica, artritis inducida, espondilitis anquilosante, miastenia gravis, vasculitis, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis/eccema (tanto por contacto, por ejemplo alérgica e irritante, como formas atópicas), psoriasis, fibrosis (por ejemplo trastornos oculares orgánicos, cutáneos, dermáticos y fibróticos), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, encefalomielitis, tiroiditis autoinmunitaria, úlcera añosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, espondiloartropatía, vaginitis, proctitis, erupciones por fármacos, reacciones inversas de lepra, eritema nodoso leproso, encefalopatía hemorrágica necrotizante aguda, sordera sensorineural bilateral progresiva idiopática, anemia aplásica, anemia pura de glóbulos rojos, trombocitopenia idiopática, policondritis, hepatitis activa crónica, síndrome de Stevens-Johnson, esprúe idiopático, liquen plano, sarcoidosis y alergia (por ejemplo, alergia atópica).
En otra forma de realización, Ia invención proporciona procedimientos terapéuticos seguros y eficaces para diagnosticar, pronosticar, controlar, seleccionar, tratar, mejorar y/o prevenir trastornos inmunitarios e inflamatorios en vertebrados, en particular mamíferos, y más particularmente seres humanos. En otra forma de realización de Ia invención, el trastorno inmunitario o inflamatorio diagnosticado, pronosticado, controlado, seleccionado, tratado, mejorado y/o prevenido es enfermedad intestinal inflamatoria (EII), endotoxemia y otros trastornos relacionados con endotoxina (por ejemplo, sepsis, shock séptico (shock endotóxico, shock bacteriémico, shock septicémico, shock por calor (shock térmico), etc.), artritis reumatoide, diabetes de tipo 1 , o esclerosis múltiple.
En otra forma de realización, Ia invención proporciona procedimientos para disminuir Ia respuesta inmunitaria mediada por células Th 1 in vivo o in vito. Estos procedimientos son útiles para tratar trastornos inmunitarios e inflamatorios, en particular trastornos autoinmunitarios e inflamatorios crónicos incluidos, entre otros, EII, endotoxemia y artritis reumatoide (AR). Asimismo, los procedimientos son útiles para disminuir Ia respuesta inmunitaria mediada por células Th 1 en animales normales, preferentemente seres humanos, con el objetivo de, por ejemplo, disminuir el rechazo de trasplantes de órganos o el rechazo de aloinjertos. Los procedimientos objeto se pueden usar en células in vitro (por ejemplo, en un sistema sin células), o en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo. Por ejemplo, las células inmunitarias se pueden cultivar in vitro en medio y ponerse en contacto con cortistatina o una variante o un análogo de cortistatina. Como alternativa, el procedimiento se puede realizar en células presentes en un sujeto, por ejemplo como parte un protocolo in vivo (por ejemplo, terapéutico o profiláctico).
En otra forma de realización, Ia invención proporciona procedimientos para identificar un compuesto capaz de tratar, mejorar o prevenir un trastorno caracterizado por alteración de Ia regulación de una actividad asociada con células Th1. Estos procedimientos se basan en el hallazgo de que Ia cortistatina posee efectos terapéuticos sobre los trastornos asociados con células Th1 y/o modelos relacionados, por ejemplo endotoxemia, artritis y colitis. Por tanto, se puede detectar de forma selectiva compuestos que muestren un efecto similar al observado con Ia cortistatina. Los procedimientos objeto se pueden usar para detectar de forma selectiva compuestos in vitro (por ejemplo, en un sistema sin células), o en cultivo, por ejemplo in vitro o ex vivo; también se contemplan procedimientos in vivo para detectar de forma selectiva compuestos similares a Ia cortistatina. Por ejemplo, se pueden cultivar células inmunitarias in vitro en medio de cultivo y ponerse en contacto con un antagonista de células Th1 , por ejemplo, cortistatina, una variante de cortistatina, un análogo de cortistatina, etc. En una forma de realización, cultivos paralelos se pueden poner en contacto con un compuesto de interés, y los cambios resultantes se pueden comparar con los cultivos tratados con un antagonista de células Th1. Una respuesta similar entre una muestra tratada con antagonistas de células Th1 y una muestra tratada con un compuesto diferente indica que el compuesto de interés puede usarse para prevenir, tratar o mejorar un trastorno caracterizado por Ia alteración de Ia regulación de una actividad asociada con células Th1. Como alternativa, Ia invención proporciona procedimientos para detectar de forma selectiva compuestos capaces de tratar, mejorar o prevenir un trastorno caracterizado por Ia alteración de Ia regulación de una actividad asociada con células Th1 , que comprende poner en contacto un compuesto de interés con una muestra, y determinar si Ia actividad de Ia célula Th 1 en Ia muestra disminuye con respecto a una muestra que no se ha puesto en contacto con el compuesto de interés. La existencia de un nivel sustancialmente disminuido de actividad asociada con células Th1 en Ia muestra que se ha puesto en contacto, en comparación con Ia muestra que no se ha puesto en contacto, identifica el compuesto de interés como compuesto capaz de tratar, mejorar o prevenir un trastorno caracterizado por Ia alteración de Ia regulación de una actividad asociada con células Th1.
En otra forma de realización, Ia invención caracteriza un procedimiento para modular, por ejemplo, interfiriendo con (por ejemplo, inhibiendo, bloqueando o, de otro modo, reduciendo) Ia inmunidad mediada por células Th1. El procedimiento comprende proporcionar un antagonista de células Th1 , por ejemplo cortistatina, una variante de Ia cortistatina, un análogo de Ia cortistatina, un compuesto farmacéutico de Ia misma, etc., y poner en contacto el antagonista de células Th 1 con una célula Th 1 o un cultivo de células Th 1 , por ejemplo in vivo, in vitro o ex vivo, modulando de este modo, por ejemplo interfiriendo con (por ejemplo, inhibiendo, bloqueando o, de otro modo, reduciendo) Ia actividad de células Th1 , por ejemplo Ia inmunidad y/o Ia inflamación mediada por células. La frase "actividad de células Th 1" como se usa en Ia presente memoria descriptiva incluye, por ejemplo, (i) inmunidad mediada por células y/o inflamación mediada por células (por ejemplo, activación de macrófagos, expresión del MHC de clase II, aumento de los niveles de óxido nítrico (NO), fagocitosis, producción de IgG, inducción de Ia óxido nítrico sintasa, activación y diferenciación de las células T CD8+ citotóxicas o estimulación de neutrófilos), (ii) estimulación de Ia señal de las quimioquinas (por ejemplo, CCRF, CCL2, CXCR3 y sus receptores), (iii) liberación de citoquinas (por ejemplo, IFN , TNF , TNF , IL-2), y (iv) antagonismo de células Th2 (por ejemplo, mediante Ia inhibición de Ia acción o Ia secreción de IL-2, -5, -6, -9, -10, -13, Ia prevención de Ia estimulación de células B, Ia prevención de Ia producción y/o liberación de eosinófilos desde Ia médula ósea, impidiendo el cambio de isotipo de las células B a IgE, impidiendo Ia producción de CCL11 (eotaxina), impidiendo Ia producción de mucus y/o impidiendo Ia contracción de las células de músculo liso). El procedimiento objeto se puede usar en células in vitro (por ejemplo, en un sistema sin células), o en cultivo, por ejemplo in vitro o ex vivo. Por ejemplo, las células Th1 se pueden cultivar in vitro en medio, y Ia etapa de contacto se puede realizar mediante Ia adición al medio de cultivo de uno o más antagonistas de células Th1 , por ejemplo cortistatinas, variantes de cortistatina, análogos de cortistatina, compuestos farmacéuticos de las mismas, etc. El procedimiento también se puede llevar a cabo en células presentes en un sujeto, por ejemplo, como parte de un protocolo in vivo (por ejemplo terapéutico o profiláctico).
En otra forma de realización, Ia invención caracteriza un procedimiento para tratar (por ejemplo, curar, mejorar, suprimir, mejorar) o prevenir (por ejemplo, retrasar o prevenir el inicio, o prevenir Ia recurrencia o Ia recaída) de un trastorno asociado con células Th 1 en un sujeto. El procedimiento incluye administrar al sujeto un antagonista de células Th 1 en cantidad suficiente para tratar o prevenir el trastorno asociado con células Th1. El antagonista de células Th1 se puede administrar al sujeto solo o combinado con uno o más antagonistas distintos de células Th 1 , o combinado con otras modalidades terapéuticas como se ha descrito en Ia presente memoria descriptiva. En una forma de realización, el sujeto es un mamífero, por ejemplo un ser humano que sufra un trastorno asociado con células Th1. En otra forma de realización, el o los antagonistas de células Th 1 se seleccionan de cortistatina, una variante de cortistatina, un análogo de cortistatina o un compuesto farmacéutico de Ia misma. En una forma de realización, Ia invención proporciona un procedimiento para tratar (por ejemplo, reducir, mejorar) o prevenir uno o más síntomas asociados con un trastorno asociado con células Th1. El procedimiento comprende administrar al sujeto un antagonista de células Th 1 en cantidad suficiente para tratar (por ejemplo, reducir, mejorar) o prevenir uno o más síntomas. El antagonista de células Th 1 se puede administrar de forma terapéutica o profiláctica, o de ambas formas, y se puede administrar al sujeto solo, combinado con uno o más antagonistas de células Th1 o combinado con otras modalidades terapéuticas como se ha descrito en Ia presente memoria descriptiva.
En una forma de realización, Ia invención proporciona un procedimiento para diagnosticar o detectar un trastorno asociado con células Th1 como se ha descrito en Ia presente memoria descriptiva. El procedimiento incluye: (i) detectar el nivel de expresión o actividad de cortistatina en una o más muestras de uno o varios individuos sin un trastorno asociado con células Th 1 ; (ii) detectar el nivel de expresión o actividad de cortistatina en una (o más muestras de un paciente de interés; y (iii) comparar el nivel de actividad de tipo cortistatina Ia expresión de cortistatina entre las muestras, en Ia que un nivel de expresión o actividad de cortistatina sustancialmente menor en Ia muestra del paciente indica que éste puede estar sufriendo un trastorno asociado con células Th 1.
En una forma de realización, Ia invención proporciona un procedimiento para controlar un trastorno asociado con células Th 1 como se ha descrito en Ia presente memoria descriptiva. El procedimiento incluye: (i) detectar el nivel de actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina en una o más muestras de un paciente que sufra un trastorno asociado con células Th 1 en un punto de tiempo inicial; (ii) detectar el nivel de actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina en una o más muestras procedentes de un paciente en un punto de tiempo posterior; y (iii) comparar el nivel de Ia actividad de tio cortistatina o Ia expresión de cortistatina entre las muestras, donde un nivel de Ia actividad de cortistatina o de expresión de cortistatina sustancialmente disminuido en Ia o las muestras en el punto de tiempo posterior indica que Ia gravedad del trastorno asociado con células Th 1 ha aumentado. En una forma de realización, Ia invención proporciona un procedimiento para controlar un trastorno asociado con células Th 1 como se ha descrito en Ia presente memoria descriptiva. El procedimiento incluye: (i) detectar el nivel de una actividad de células Th1 , una actividad de tipo cortistatina o Ia expresión de cortistatina en una muestra de un paciente que sufra un trastorno asociado con células Th1 en un punto de tiempo inicial; (ii) facilitar al paciente Ia cortistatina, un análogo de cortistatina, una variante de cortistatina o un compuesto farmacéutico de Ia misma; (iii) detectar el nivel de actividad de células Th 1 , actividad de tipo cortistatina, o expresión de cortistatina en una muestra procedente del paciente tras tratamiento con cortistatina, un análogo de cortistatina, una variante de cortistatina, o un compuesto farmacéutico de Ia misma; y (iv) comparar el nivel de Ia actividad de células Th1 , actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina entre las dos muestras, donde una disminución sustancial de Ia actividad de células Th1 , o un incremento sustancial de Ia actividad de tipo cortistatina o Ia expresión de cortistatina en Ia muestra tras el tratamiento indica que el tratamiento terapéutico producía una reducción de Ia gravedad del trastorno asociado con células Th1. En una forma de realización, Ia invención proporciona un procedimiento para pronosticar un trastorno asociado con células Th1 como se ha descrito en Ia presente memoria descriptiva. El procedimiento incluye: (i) detectar el nivel de una actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en una muestra de un paciente de interés en un punto de tiempo inicial; (ii) detectar el nivel de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en Ia muestra del paciente en un punto de tiempo posterior; y (iii) comparar el nivel de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina entre las dos muestras, en el que un nivel sustancialmente disminuido de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en Ia muestra correspondiente al punto de tiempo más tardío en comparación con Ia muestra correspondiente al punto de tiempo inicial indica una mayor probabilidad de que el paciente desarrolle un trastorno asociado a células Th1.
En otra forma de realización, Ia invención proporciona un procedimiento para pronosticar un trastorno asociado con células Th1 como se ha descrito en Ia presente memoria descriptiva. El procedimiento incluye: (i) determinar el nivel de una actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en una muestra de un paciente de interés; (ii) determinar el nivel de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en Ia muestra de un individuo del que se sabe que no sufre un trastorno asociado a células Th1 ; y (iii) comparar el nivel de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en Ia muestra del paciente con el nivel de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en Ia muestra del individuo del que se sabe que no sufre un trastorno asociado a células Th1 , en el que un nivel sustancialmente disminuido de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en Ia muestra del paciente indica una mayor probabilidad de que el paciente desarrolle un trastorno asociado a células Th1.
Los antagonistas de células Th 1 usados en los procedimientos y compuestos farmacéuticos descritos se preparan a partir de cortistatina de mamíferos, por ejemplo de cortistatina de seres humanos, ovejas, ratones, ratas o primates no humanos. Estos antagonistas de células Th 1 se pueden usar para diagnosticar, pronosticar, controlar, seleccionar, tratar, mejorar y/o prevenir trastornos inmunitarios, inflamatorios y otros asociados con células Th1. Como se ha hecho referencia en Ia presente memoria descriptiva, el término "cortistatina" se refiere a todas las proteínas y polinucleótidos de cortistatina, por ejemplo, péptidos de cortistatina (por ejemplo, CST-14 o CST- 17), propéptidos de cortistatina (por ejemplo, CST-29 o CST-31 ), prepropéptidos de cortistatina (por ejemplo, productos sin escindir del gen de cortistatina, tales como CST-155 o CST-105), o polinucleótidos que codifican cualquier péptido, propéptido o prepropéptido de cortistatina. Entre otros ejemplos de antagonistas de células Th 1 se incluyen formas naturales y modificadas, por ejemplo proteínas de fusión o proteínas glucosiladas, de las proteínas de cortistatina tales como CST-12, CST-13, CST-14, CST-17, CST- 29, CST-31 , CST-105 y CST-155.
La secuencia nucleotídica para el gen de Ia cortistatina humana se indica en Ia SEC ID N°:1. Las secuencias nucleotídica y de aminoácidos para Ia preprocortistatina humana se indican en las SEC ID N°:2 y SEC ID N°:3, respectivamente. Las secuencias nucleotídica y de aminoácidos para el producto proteolítico humano putativo CST-31 (residuos 94-124 de Ia SEC ID N°:3) se indican en las SEC ID N°:4 y SEC ID N°:5, respectivamente. Las secuencias nucleotídica y de aminoácidos para Ia procortistatina humana, CST-105 (residuos 51 a 155 de Ia SEC ID N°:3), se indican en las SEC ID N°:6 y SEC ID N°:7, respectivamente. Las secuencias nucleotídica y de aminoácidos para Ia procortistatina humana, CST-29 (residuos 127 a 155 de Ia SEC ID N°:3), se indican en las SEC ID N°:8 y SEC ID N°:9, respectivamente. Las secuencias nucleotídica y de aminoácidos para Ia CST- 17 humana se indican en las SEC ID N0: 10 y SEC ID N°:11 , respectivamente. Las secuencias nucleotídica y de aminoácidos para Ia CST- 14 humana se indican en las SEC ID N°:12 y SEC ID N°:13, respectivamente. Las secuencias nucleotídica y de aminoácidos para Ia CST-13 humana se indican en las SEC ID N°:14 y SEC ID N°:15, respectivamente. Las secuencias nucleotídica y de aminoácidos para Ia CST-12, es decir el bucle Cys-Cys de cortistatina, se indican en las SEC ID N0: 16 y SEC ID N0: 17, respectivamente. La secuencia de aminoácidos para las variantes de CST-14 se indican en Ia SEC ID N°:18. La invención también incluye los polinucleótidos que codifican una cortistatina, procortistatina o preprocortistatina, pero, debido a Ia bien conocida degeneración del código genético, difieren de las secuencias polinucleotídicas expuestas en Ia presente memoria descriptiva. Además, Ia invención incluye los polinucleótidos que hibridan en condiciones muy rigurosas con los polinucleótidos expuestos en Ia presente memoria descriptiva, o con polinucleótidos que difieren de los expuestos en Ia presente memoria descriptiva pero que codifican polipéptidos que conservan una actividad biológica sustancial asociada con Ia cortistatina, y los péptidos, propéptidos o prepropéptidos codificados por tales polinucleótidos de hibridación.
El antagonista de células Th1 puede derivar o estar ligado a otra molécula funcional, por ejemplo otro péptido o proteína (por ejemplo, un fragmento Fab de un anticuerpo o un péptido marcador). Por ejemplo, estos antagonistas pueden estar funcionalmente ligados (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otras) a una o más entidades moleculares, tales como un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o multiespecífico), toxinas, radioisótopos, agentes citotóxicos o citostáticos, entre otros.
En otra forma de realización más, el antagonista de células Th 1 se administra solo o en tratamiento combinado, es decir combinado con otros agentes, por ejemplo agentes terapéuticos, que son útiles para trata trastornos asociados con células Th1. Un tratamiento de combinación puede incluir uno o más antagonistas de células Th1 formulados de forma conjunta, y administrados junto con ellos, con uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo uno o más inhibidores de citoquinas y factores de crecimiento, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios (por ejemplo, agentes antiinflamatorios sistémicos), inhibidores metabólicos, inhibidores enzimáticos y/o agentes citotóxicos o citostáticos, como se describe con más detalle en Ia presente memoria descriptiva.
En otro aspecto, Ia invención proporciona composiciones, por ejemplo composiciones farmacéuticas, que incluyen un vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos un antagonista de células Th1 , por ejemplo cortistatina, una variante de cortistatina o un análogo de cortistatina. En otra forma de realización, las composiciones, por ejemplo las composiciones farmacéuticas, comprenden una combinación de dos o más de los antagonistas de células Th1 enumerados en Ia presente memoria descriptiva. Asimismo, dentro del alcance de Ia invención se encuentran las combinaciones del antagonista de células Th 1 y otro fármaco, incluido, entre otros, un agente terapéutico (por ejemplo, uno o más inhibidores de citoquinas o de factores de crecimiento, inmunosupresores, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios (por ejemplo, agentes antiinflamatorios sistémicos), inhibidores metabólicos, inhibidores enzimáticos y/o agentes citotóxicos o citostáticos como se describe en Ia presente memoria descriptiva.
La invención también caracteriza ácidos nucleicos que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican cortistatina, por ejemplo péptidos de cortistatina, procortistatina y preprocortistatina. Asimismo, Ia invención caracteriza ácidos nucleicos que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican variantes de cortistatina como se describe en Ia presente memoria descriptiva. En otro aspecto, Ia invención caracteriza células huésped y vectores que contienen los ácidos nucleicos de Ia invención.
También se describen procedimientos para liberar o dirigir antagonistas de células Th 1 a una célula Th 1 o a un paciente que necesite tal tratamiento.
Los kit que comprenden s antagonistas de células Th 1 para usos terapéuticos y diagnósticos también se encuentran dentro del alcance de Ia invención.
A partir de Ia siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones se harán evidentes otras características y ventajas de Ia invención.
Breve descripción de las figuras FIG. 1 : La cortistatina inhibe Ia producción de mediadores inflamatorios por parte de macrófagos activados in vitro. Macrófagos peritoneales se estimularon con LPS (1 μg/ml) en ausencia (control; círculos negros) o presencia de cortistatina (108 M) (círculos en blanco). Los mediadores proinflamatorios se analizaron como se describe más adelante (n=6). * p<0,001 frente a ratones control sin tratar.
FIG. 2: El tratamiento con cortistatina protege frente a Ia colitis inducida por TNBS. Se indujo colitis con TNBS, y los ratones se trataron con CST-29 como se describe más adelante. La evolución clínica y Ia gravedad se controlaron mediante los cambios en el peso corporal (A y B), Ia puntuación de Ia colitis (C), y Ia supervivencia (D). La puntuación del daño macroscópico se determinó tres días después de Ia administración de TNBS (E). El análisis histopatológico se determinó en secciones de colon teñidas con hematoxilina- eosina (H-E) al tercer día de Ia enfermedad (F) (x200) y se les asignaron puntuaciones histológicas. Los infiltrados inflamatorios en el colon (día 3) se caracterizaron fenotípicamente mediante inmunotinción frente a células CD11 β (monocitos/macrófagos y neutrófilos), células productoras de TN Fa o células T CD4 (G) (x200). La actividad MPO colónica se determinó en Ia fase aguda de Ia enfermedad (día 3) (H). n=12-18 ratones/grupo. * p<0,001 frente a ratones tratados con TNBS.
FIG. 3: El tratamiento con cortistatina revierte Ia colitis establecida y reduce Ia recurrencia de colitis. A: Colitis establecida. Se indujo colitis mediante administración intracolónica de TNBS (1 ,5 mg/ratón) los días 0 y 6. Los ratones fueron tratados con cortistatina (2 nmol/ratón; i.p.) diariamente durante 3 días consecutivos, comenzando 6 días después de Ia administración de TNBS (flecha). La progresión de Ia enfermedad se valoró mediante Ia pérdida de peso corporal. n=8 ratones/grupo. B: Recurrencia de Ia enfermedad. Se indujo colitis en ratones Balb/c y SJL mediante administración intracolónica de TNBS (3 mg/ratón) los días 0 y 9 (flechas). Los ratones fueron tratados i.p. con cortistatina (2 nmol/ratón) o etanol (50%; control del vehículo) 12 h después de Ia administración intracolónica de TNBS. La progresión de Ia enfermedad se valoró mediante Ia pérdida de peso corporal y el porcentaje de supervivencia. Los números entre paréntesis representan el porcentaje de mortalidad diario tras Ia segunda infusión de TNBS. n=8-10 ratones/grupo.
FIG. 4: La cortistatina regula por disminución Ia respuesta inflamatoria de Ia mucosa en el modelo de colitis por TNBS. Se indujo colitis con TNBS y los ratones se trataron con CST-29 como se describe más adelante. Los extractos de proteínas y el ARN total se obtuvieron a partir de colon en Ia fase aguda de Ia enfermedad (día 3). A: Contenido de citoquinas/quimioquinas en los extractos proteicos. n=5-6 ratones/grupo. * p<0,001 frente a ratones tratados con TNBS. B: Expresión génica de varios mediadores inflamatorios/autoinmunitarios. Los resultados son representativos de dos experimentos distintos (n=4-5 ratones/grupo).
FIG. 5: El tratamiento con cortistatina reduce Ia respuesta inflamatoria sistémica en ratones con colitis inducida con TNBS. Se indujo colitis con TNBS, y los ratones se trataron con CST-29 como se describe más adelante. Se recogió suero en el momento álgido de Ia enfermedad (día 3), y se determinó el contenido en citoquinas/quimioquinas y amiloide sérico A (ASA). n=5-6 ratones/grupo. * p<0,001 frente a ratones tratados con TNBS.
FIG. 6: La cortistatina suprime Ia respuesta de citoquinas de las células Th1 y estimula Ia producción de IL-10 en Ia colitis inducida por TNBS. Se indujo colitis con TNBS, y los ratones se trataron con CST-29 como se describe más adelante. En el momento álgido de Ia enfermedad (día 3) se aislaron células de ganglios linfáticos mesentéricos(GLM) y células mononucleares de Ia lámina propia (CMLP) y se cultivaron sólo con medio (sin estimular o con PMA más ConA (estimuladas). A: Se determinó Ia respuesta proliferativa tras 4 días de cultivo. El contenido en citoquinas en los sobrenadantes se determinó tras 48 h. B: Los linfocitos estimulados se analizaron para determinar Ia expresión intracelular de citoquinas y CD4. Se realizó una tinción doble para determinar Ia expresión de IFNγ/IL-2 o IL-4/IL- 10 en las células T CD4 controladas (paneles de Ia izquierda). Se determinó el número de células T que expresaron IFNγ e IL-10 en relación con 104 células T CD4 (paneles de Ia derecha). Los datos representan valores combinados de dos experimentos independientes (n=5-6 ratones/grupo/experimento). * p<0,001 frente a ratones tratados con TNBS. FIG. 7: La cortistatina inhibe Ia producción de mediadores inflamatorios por parte de macrófagos activados in vitro. Macrófagos peritoneales se estimularon con LPS (1 μg/ml) en ausencia (control) o presencia de concentraciones diferentes de cortistatina ("neuropéptido"). Tras diferentes periodos de tiempo (6 h para TNFα, y 24 h IL-6, IL-12, IL-1 β, Rantes y MIP-2), se analizaron los mediadores proinflamatorios (n=6). Como una medida adicional de Ia inflamación, se analizaron los niveles de NO mediante el método de Griess, como se describe en los Ejemplos. * p<0,001 frente a ratones control sin tratar.
FIG. 8: El tratamiento con cortistatina protege frente a Ia endotoxemia letal. A-C: A ratones Balb/c se les inyectaron i.p. dosis diferentes de LPS (control). Se inyectó cortistatina (2 nmol/ratón) por vía i.p. 30 min después de Ia administración de LPS. Se controló Ia supervivencia durante las siguientes 96 h. Se usaron curvas de mortalidad en B para calcular Ia DL50, y las barras horizontales indican los límites de confianza del 95% de las determinaciones de Ia DL50. En C, se calculó el tiempo de supervivencia medio para los no supervivientes en los grupos sin tratar y tratados con cortistatina. D: A los ratones se inyectó por vía i.p.400 μg de LPS y dosis diferentes de cortistatina (desde 0 a 5 nmol/animal). E: Se inyectó cortistatina (2 nmol/ratón) por vía i.p. 2 ó 4 h tras Ia prueba con LPS. n=12-20 ratones/grupo. * p<0,001 frente a ratones control tratados con LPS.
FIG. 9: El tratamiento con cortistatina reduce los signos histopatológicos de endotoxemia. A los ratones se inyectó por vía i.p LPS (control). Se administró cortistatina (2 nmol/ratón) por vía i.p. 30 min después de Ia administración de LPS. A: La cortistatina reduce Ia infiltración inflamatoria y Ia coagulación diseminada en los órganos diana. El análisis histopatológico se determinó en secciones de pulmón e hígado teñidas con H- E obtenidas a las 24 h de Ia enfermedad (x150). B: La cortistatina disminuye Ia actividad MPO en pulmones, hígado e intestino. El contenido en MPO se determinó en momentos diferentes tras Ia infusión de LPS. n=8-12 ratones/grupo. C: La cortistatina reduce el reclutamiento de leucocitos en Ia cavidad peritoneal. Se obtuvieron suspensiones de células peritoneales a diferentes momentos tras Ia inyección de LPS y se determinó el número de PMN, macrófagos y linfocitos. * p<0,001 frente a ratones control tratados con LPS.
FIG. 10: El tratamiento con cortistatina reduce las respuestas inflamatorias local y sistémica en ratones endotoxémicos. La endotoxemia se indujo mediante inyección i.p. de LPS (400 μg/ratón). Los ratones se trataron 30 min después con vehículo (controles) o con cortistatina (2 nmol/ratón; i.p.). Se recogió suero (A) y fluido peritoneal (B) en varios puntos de tiempo tras Ia inyección de endotoxina, y el contenido en citoquinas/quimioquinas (A y B), NO (A y B), y ASA (A sólo) se determinaron como se ha mostrado. n=5-6 ratones/grupo. * p<0,001 frente a ratones control tratados con LPS. FIG. 11 : EL tratamiento con cortistatina mejora Ia incidencia y Ia gravedad de Ia artritis inducida por colágeno (AIC). Se inyectaron fragmentos de colágeno en las patas traseras de los ratones. EL tratamiento con péptidos comenzó con el inicio de Ia enfermedad y se administró cortistatina por vía i.p. en días alternos durante 5 días a 0,5-5 nmol/ratón. En cada experimento, se inyectó solo PBS en un grupo control de ratones. La artritis clínica se valoró mediante Ia tumefacción de las patas midiendo el espesor de las patas traseras afectadas con calibradores.
FIG. 12: Transcrito completo de Ia cortistatina humana y Ia secuencia de aminoácidos correspondiente. Los pares de residuos básicos (RK y RR) que se cree que son sustratos de las enzimas convertasas (sitios de escisión proteolítica) están subrayados. Los residuos de aminoácidos que comprenden Ia CST-14 se muestran en negrita, mientras que los residuos adicionales que comprenden Ia CST-17 se encuentran en cursiva. Un segundo codón de iniciación se designa "Iniciación 2" FIG. 13: Alineación de las secuencias de aminoácidos de los propéptidos de Ia CST-29 y Ia SST-28 de rata, ratón y humanas. En negrita se muestran los residuos consenso entre Ia cortistatina y Ia somatostatina. Los pares de residuos básicos (KK, RR y RK) que se cree que son sustratos de las enzimas convertasas (sitios de escisión proteolítica) están subrayados. Además, los residuos de Cys con más probabilidad de ciclar los péptidos se muestran en minúscula.
Descripción detallada de Ia invención
Se describen antagonistas de células Th1 , por ejemplo cortistatina, variantes de cortistatina, análogos de cortistatina y productos farmacéuticos de los mismos. Además, se describe Ia cortistatina y variantes de cortistatina en forma de polipéptidos y polinucleótidos. También se describen procedimientos y composiciones que modulan y reducen una o más actividades asociadas con células Th1. La actividad antagonizante de células Th1 se puede usar para mitigar trastornos mediados por células Th1 , por ejemplo para tratar trastornos autoinmunitarios, trastornos inflamatorios crónicos, trastornos sépticos o trastornos inducidos. Los antagonistas de células Th 1 como se han descrito en Ia presente memoria descriptiva se pueden usar solos, en combinaciones o en combinación con otros tratamientos usados para tratar el trastorno objetivo u otro trastorno, por ejemplo una respuesta alérgica.
Entre otros, se ha encontrado que Ia reducir Ia actividad de las células Th1 con cortistatina, que antagoniza Ia función de las células Th1 , se reduce el shock endotóxico, Ia artritis y Ia enfermedad intestinal inflamatoria (Ejemplos 1-3, más adelante). En consecuencia, Ia cortistatina, las variantes de cortistatina y los análogos de cortistatina, o composiciones farmacéuticas de Ia misma, que neutralizan o inhiben una o más actividades asociadas con las células Th1 , pueden usarse para reducir uno o más actividades asociadas con las células Th 1 in vivo, por ejemplo para tratar o prevenir trastornos asociados con células Th1. Cortistatina, variantes de cortistatina y análogos de cortistatina
La presente invención usa moléculas y compuestos, por ejemplo polinucleótidos, polipéptidos, moléculas pequeñas y composiciones farmacéuticas compuestas por los mismos, que neutralizan y/o inhiben una o más actividades asociadas con las células Th1 , por ejemplo, Ia secreción de TNFα. Éstas y moléculas similares son útiles en el tratamiento de trastornos mediados por células Th1 , tales como autoinmunidad, inflamación crónica, sepsis o trastornos o síndromes inducidos, tales como rechazo a un trasplante de órganos o de un aloinjerto. Como tal, Ia presente invención atañe, en parte, a Ia generación las composiciones farmacéuticas descritas. Además, Ia presente invención atañe a procedimientos para identificar y generar compuestos nuevos con actividad de tipo cortistatina, por ejemplo Ia reducción de Ia inmunidad y Ia inflamación mediadas por células Th 1.
Como se usa en Ia presente memoria descriptiva, Ia frase "actividad de tipo cortistatina" se refiere a actividades como las descritas en los ejemplos, por ejemplo Ia reducción de Ia actividad de las células Th1 , Ia disminución de Ia producción de mediadores inflamatorios (p. ej., TNFα, NO e IL-6); reversión de Ia colitis inducida por TNBS (ácido 2, 4, 6-trinitrobenzeno sulfónico); Ia reversión de Ia colitis establecida; Ia regulación por disminución de Ia respuesta inflamatoria en las mucosas; Ia reducción de Ia respuesta inflamatoria sistémica; Ia supresión de Ia respuesta de citoquinas por las células Th 1 ; Ia estimulación de Ia producción de IL-10 en Ia colitis inducida por TNBS; Ia protección frente a endotoxemia; Ia inhibición de Ia producción de mediadores inflamatorios por parte de macrófagos activados; Ia reducción de signos histopatológicos de endotoxemia; y Ie mejora de Ia artritis inducida por colágeno; así como otras actividades, incluidas, entre otras, Ia activación y Ia migración/infiltración de células Th 1 autorreactivas en el sistema nervioso central (SNC); LA PRODUCCIÓN de mediadores inflamatorios/citotóxicos en el SNC; Ia activación y Ia migración/infiltración de células Th1 autorreactivas en las células de los islotes del páncreas; Ia producción de mediadores inflamatorios/citotóxicos en las células de los islotes del páncreas; Ia mejora, o Ia protección contra su desarrollo, de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE); y mejora, o Ia protección contra su desarrollo, de diabetes en ratones diabéticos no obesos (DNO); así como otras actividades relacionadas con otros análisis bien conocidos en Ia técnica y/o descritos en los Ejemplos que se exponen más adelante o en otro lugar de Ia presente memoria descriptiva. Al medir Ia actividad de tipo cortistatina en Ia muestra de un paciente (tal como en un procedimiento diagnóstico, pronóstico o de control), las mediciones de Ia actividad de tipo cortistatina incluyen medir, por ejemplo, Ia actividad reducida de células Th1 , Ia menor producción de mediadores inflamatorios (por ejemplo, TNFα, NO e IL-6), Ia respuesta suprimida de citoquinas por las células Th1 , Ia mayor producción de IL-10, Ia menor producción de mediadores inflamatorios por los macrófagos, Ia dominancia de Ia actividad de las células Th2, etc. Durante el curso de un procedimiento diagnóstico, pronóstico o de control se pueden medir una o varias actividades de tipo cortistatina. La medición de actividad de tipo cortistatina puede también incluir el aislamiento de polinucleótidos o polipéptidos de cortistatina de Ia muestra del paciente con el fin de analizar directamente Ia actividad de tipo cortistatina usando los procedimientos descritos en Ia presente memoria descriptiva. La actividad de los péptidos, propéptidos o prepropéptidos de cortistatina puede analizarse como se describe en Ia presente memoria descriptiva, o mediante procedimientos bien conocidos en Ia técnica, sin modificar de forma significativa el polipéptido. En el caso de un polinucleótido aislado (ADN o ARN), el polinucleótido puede secuenciarse para determinar Ia presencia de mutaciones o alteraciones en el gen o el mensaje de Ia cortistatina, o bien puede expresarse y analizarse el polipéptido expresado para determinar Ia actividad. Los procedimientos para aislar polipéptidos y polinucleótidos de una muestra son bien conocidos en Ia técnica, como también Io son los procedimientos para secuenciar y expresar polinucleótidos.
La secuencia del gen de Ia cortistatina humana se describe como SEC ID N°:1. El gen de Ia cortistatina humana , es decir CORT, contiene 2 exones separados por un único intrón de 1 kb (Ejeskar y col. (2000) Cytogenet. CeII Genet. 89:62-66). El transcrito completo de Ia cortistatina humana y Ia correspondiente secuencia de aminoácidos se muestran en Ia FIG. 12 y se describen como SEC ID N°:2 y 3, respectivamente. La preprocortistatina se expresa en forma de dos ARNm en el cerebro humano, un transcrito de 317 pb y un transcrito de 701 pb (Ejeskar y col., supra; de Lecea y col. (1997), supra). En Ia presente memoria descriptiva el polipéptido de cortistatina humana se denomina "el prepropéptido de cortistatina" o, como alternativa, "preprocortistatina," y está compuesto por 105-155 aminoácidos. La preprocortistatina humana normalmente se escinde por dos puntos de escisión dibásicos en el C terminal para producir procortistatina (29 aminoácidos) y cortistatina (Spier y de Lecea, supra). Existen varias formas de cortistatina madura, incluidos péptidos de 17 y 14 aminoácidos (Fukusumi y col. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 232(1 ):157-63). Las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de Ia preprocortistatina, Ia procortistatina y Ia cortistatina de ratón, ser humano y rata se describen en Ia patente de EE.UU. n° 6.814.967, que se incorpora en Ia presente memoria descriptiva como referencia. Otras secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de Ia cortistatina humana se describen en las patente de EE.UU. n° 6.524.826, 6.479.642, 6.232.100 y 6.074.872, y en Ia solicitud de patentes publicadas de EE.UU. n° 2003/0171293, 2003/0148355, 2002/0133000, 2002/0013456, todas las cuales se incorporan en Ia presente memoria descriptiva como referencia.
Como se usa en Ia presente memoria descriptiva, el término "cortistatina" se usa de forma intercambiable con "CST," y hace referencia a todas las formas de cortistatina, es decir cortistatina madura (por ejemplo, péptidos de cortistatina), procortistatina y preprocortistatina, así como polinucleótidos que codifican cortistatina madura, procortistatina y preprocortistatina. Como se usa en Ia presente memoria descriptiva, Ia frase "variante de cortistatina" se usa para indicar las secuencias polipeptídica y polinucleotídica que difieren de las descritas en las FIGS. 12 y 13, y Ia SEC ID N°:1 -18, pero que conservan una actividad biológica sustancial de tipo cortistatina.
La secuencia de aminoácidos para Ia cortistatina humana (CST) y Ia somatostatina humana (SST) difieren en dos posiciones en el bucle Cys-Cys (Spier y de Lecea, supra). Como se muestra en Ia FIG. 13, mientras que el primer aminoácido del bucle Cys-Cys es R (Arg) en Ia CST humana, en Ia SST humana Ia misma posición está ocupada por un aminoácido K (Lys). De igual forma, mientras que el noveno aminoácido dentro del bucle Cys-Cys es una S (Ser) en Ia CST humana, en Ia SST humana Ia misma posición está ocupada por T (Thr). Por tanto, estos aminoácidos pueden ser importantes para conferir actividad o actividades específicas a Ia CST. Además, pruebas recientes han mostrado que el aminoácido P (Pro) localizado directamente en el N-terminal al bucle de Cys-Cys de Ia CST, así como el aminoácido K (Lys) localizado directamente en el C terminal al bucle de Cys-Cys de Ia CST, son importantes para conferir a Ia CST al menos algunas actividades biológicas (Criado y col. (1999) "Structural and compositional determinants of cortistatin- type activity," J. Neurosci. Res. 56:611-19). Por tanto, es posible crear variantes de cortistatina sobre Ia base de las secuencias descritas del péptido y el polinucleótido de cortistatina centrándose en los residuos de aminoácidos no cruciales.
Algunas secuencias de aminoácidos de cortistatina se pueden variar son modificar de forma significativa Ia estructura o Ia función de Ia cortistatina. En general, es posible reemplazar residuos que forman Ia estructura terciaria de Ia proteína cortistatina, siempre que se usen residuos que realicen una función similar. En otros casos, el tipo de residuo puede ser completamente irrelevante si se produce una alteración en una zona no crucial. Por tanto, Ia invención además concluye variantes de cortistatina que muestran una sustancial actividad biológica de tipo cortistatina. Entre tales variantes se incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones del tipo (por ejemplo, Ia sustitución de un residuo hidrófilo por otro, pero no un residuo muy hidrófilo por un residuo muy hidrófobo). Los cambios pequeños, o las sustituciones de aminoácidos "neutros" a menudo tendrán poco impacto sobre Ia función proteica. (Taylor (1986) J. Theor. Biol. 119:205-18).
Las sustituciones conservadoras pueden incluir, entre otras, sustituciones entre los aminoácidos alifáticos (Ala, Val, Leu e lie), intercambio de los residuos ácidos Asp y GIu, sustitución entre los residuos de amida Asn y GIn, intercambio de los residuos básicos Lys y Arg, y sustituciones entre los residuos aromáticos Phe, y Tyr. Más información acerca de qué cambios de aminoácidos es probable que sean fenotípicamente silentes (es decir, es poco probable que afecte de forma significativa a Ia función) se puede encontrar en Bowie y col. (1990) "Deciphering the message in protein sequences: tolerance to amino acid substitutions," Science 247:1306 -10. A modo ilustrativo, el péptido de cortistatina de Ia SEC ID N0: 18 puede contener arginina, lisina, histidina, glutamina, o asparagina en Ia posición Xaa3 (es decir, X3), y/o serina, alanina, treonina, glicina, ácido glutámico, prolina, asparagina o ácido aspártico en Ia posición Xaan (es decir, Xn), mientras conserva Ia sustancial actividad de tipo cortistatina (véase, en general, por ejemplo, Zvelebil y col. (1987) J. Mol. Biol. 195:957-61 ).
Por tanto, un derivado o variante de los polipéptidos expuestos en las FIGS. 12 y 13, y las SEC ID N°:3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17 y 18 (veáse Ia Tabla 1 , a más adelante) puede ser (i) uno en el que uno o más residuos de aminoácidos están susitiuidos por un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferentemente conservado) y tale residuo de aminoácido sustituido puede o no estar codificado por el código genético, o (ii) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno en el que el polipéptido maduro está condensado con otro compuesto, tal como un compuesto que incremente Ia semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales están condensados al polipéptido, tal como un péptido de fusión región Fc de IgG Fc, una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para Ia purificación del polipéptido. Se ha estimado que tales fragmentos, derivados y variantes se encuentran dentro del alcance de los expertos en Ia técnica a partir de las enseñanzas de Ia presente memoria descriptiva. Tabla 1 : Secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de Ia cortistatina humana
Figure imgf000024_0001
Entre las variaciones también se incluye Ia sustitución de aminoácidos cargados por otros aminoácidos cargados y con aminoácidos neutros o con carga negativa. Esto último tiene como resultado proteínas con carga positiva reducida que mejoran las características de Ia cortistatina. Es muy deseable prevenir Ia agregación, ya que Ia agregación de proteínas da como resultado una disminución de Ia actividad e interfiere con Ia preparación de formulaciones farmacéuticas al crear (Pinckard ycol. (1967) Clin. Exp. Immunol. 2:331-40; Robbins y col. (1987) Diabetes 36:838-45; Cleland y col. (1993) Crit. Rev. Therapeut. Drug Carrier Sys. 10:307-77). Como se ha indicado, los cambios son, preferentemente, de naturaleza menor, tal como sustituciones con aminoácidos conservadores que no modifican de forma significativa el plegamiento o Ia actividad de las proteínas. El número de sustituciones aminoacídicas que un experto realizaría depende de muchos factores, incluidos los que se describen en Ia presente memoria descriptiva. En términos generales, el número de sustituciones para cualquier proteína de cortistatina dada no será superior a 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3, 2, ó 1 aminoácido, depende del objetivo.
Los aminoácidos en Ia cortistatina que son esenciales para su función se pueden identificar mediante procedimientos conocidos en Ia técnica, tales como mutagénesis dirigida a sitio o detección de alanina (por ejemplo, Cunningham y Wells (1989) Science 244:1081 -85). Este último procedimiento introduce mutaciones únicas de alanina en cada residuo de Ia cadena peptídica. Las moléculas resultantes se analizan a continuación para determinar Ia actividad biológica utilizando, por ejemplo, los análisis descritos en Ia sección de ejemplos. Asimismo, los sitios cruciales para Ia unión ligando-receptor se pueden determinar mediante análisis estructural, tal como cristalización, resonancia magnética nuclear, difracción anómala de múltiples longitudes de onda (DAM), o mareaje por fotoafinidad (Smith y col. (1992) J. Mol. Biol. 224:899-904; de Vos y col. (1992) Science 255:306-12).
La cortistatina se puede conjugar mediante procediemientos químicos con radionúclidos, fármacos, macromoléculas u otros agentes, o se puede preparar como proteínas de fusión que comprenden una o más cortistatinas de Ia invención.
Además de los cambios en Ia o las secuencias de aminoácidos indicados anteriormente, Ia cortistatina se puede glicosilar, pegilar o ligar a albúmina o a un polímero no proteináceo. Por ejemplo, Ia cortistatina puede ligarse a una de uno serie de polímeros no proteináceos, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, mediante procedimientos bien conocidos en Ia técnica. Las cortistatinas pueden modificarse químicamente mediante conjugación covalente a un polímero para incrementar su semivida en circulación, por ejemplo. Tales polímeros, y los procedimientos para unirlos a los péptidos, también son bien conocidos en Ia técnica.
La cortistatina, como se usa en Ia invención, también puede marcar con un mareaje detectable o funcional. Los mareajes detectables incluyen radiomarcadores, tales como 131I, 35S, 3H, o 32P, que pueden unirse a los péptidos y polinucleótidos de Ia invención utilizando métodos químicos convencionales conocidos en Ia técnica. Los marcadores también incluyen marcadores enzimáticos, tales como peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina. Los marcadores además incluyen fracciones químicas tales como biotina, que puede detectarse a través de Ia unión a una fracción detectable específica conocida, por ejemplo avidina marcada.
La capacidad de una variante o análogo de cortistatina para realizar una actividad de tipo cortistatina (por ejemplo, una actividad biológica) se puede medir mediante, por ejemplo, análisis para medir Ia actividad de las células Th1 ; análisis para medir Ia producción de mediadores inflamatorios (por ejemplo, TNFα, NO y IL-6); análisis para medir Ia reversión de Ia colitis inducida por TNBS; análisis para medir Ia reversión de Ia colitis establecida; análisis para Ia regulación por disminución de Ia respuesta inflamatoria de Ia mucosa; análisis para Ia reducción de Ia respuesta inflamatoria sistémica; análisis para Ia supresión de Ia respuesta de citoquinas por las células Th1 ; análisis para Ia estimulación de Ia producción de IL-10 en Ia colitis; análisis para Ia protección frente a endotoxemia; análisis para inhibir Ia producción de mediadores inflamatorios por macrófagos activados; análisis para detectar Ia reducción de signos histopatológicos de endotoxemia; análisis para Ia mejora de Ia artritis inducida por colágeno, y otros análisis que son bien conocidos en Ia técnica, incluidos los descritos en los Ejemplos siguientes.
Los análogos de cortistatina también se contemplan como útiles en los procedimientos y compuestos farmacéuticos de Ia invención. Entre los análogos y variantes se incluyen los descritos en Nunn y col. (2003) Eur. J. Pharmacol. 465:211-18 (e.g., CGP 23996), Hannon y col. (2002) J. Mol. Neurosci. 18:15-27 (por ejemplo., BIM23027, MK678, lanreotida, CH-275, sst3-ODN-8, BIM23268, L757.519, L779.976, L796.778, NNC 26-9100, L803.087, L817.018), Deghenghi y col. (2003) Endocrine 22:13-18 (por ejemplo, EP1572 y CST-8), Weckbecker y col. (2003) Nat. Rev.: Drug Disc. 2:999-1017 (por ejemplo, octreotida (es decir, SANDOSTATIN™, SMS 201- 995, Novartis), SOM230, MK-678, L362.855, BIM 23268, BIM23052, KE108, CH-275, PTR3173, SDZ 222-100, BIM23014 (es decir, lanreotida, SOMATULINE™, Ipsen), TT-232, CYN-154806, sst3-ODN-8, BIM23056, BIM23627, SB-710411 , L 054,552, L 779,976, L 817,818, NNC 26-9100, SRA- 880, BN-81674, [DTPA-D-Phe1]octreotida (es decir, OCTREOSCAN™, Novartis), [DTPA-D-Phe1 , Tyr3]octreotida (es decir, SMT487, OCTREOTHER™, Novartis), STILAMIN™ (Serano), Nunn y col. (2003) Naunyn Sch. Arch. Pharmacol. 367:1-9 (por ejemplo, [Tyr10]cortistatina-14, [Tyr3]octreotida, CYN154806, CGP 23996, L-Tyr8CYN 154806, D-Tyr8CYN 154806), Paran y col. (2001 ) Ann. Rheum. Dis. 60:888-91 (por ejemplo, Sandostatin-LAR), Liu y col. (2005) Mol. Pharmacol. 68:90-101 , Criado y col. (1999) J. Neurosci Res. 56:611-19 (D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Lys- NH2, Pro-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val -Cys]-N H2, Pro-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val- Cys]-Lys-NH2, Pro-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys]-Lys-NH2), Pawlikowski y Melen- Mucha (2004) Curr. Opinión Pharm. 4:608-13 (por ejemplo, BIM23244, SOM230, DTPA-octreotida (OCTREOSCAN™), octreotato, [tyr3]octreotato, Oct-LAR, BIM-23A378, TT-232), Broglio y col. (2002) J. Clin. Endo. Metab. 87:3783-90, así como otras moléculas pequeñas y miméticos peptídicos con actividad de tipo cortistatina.
Como se usa en Ia presente memoria descriptiva, el término "análogo" en general se refiere a moléculas pequeñas, miméticos peptídicos y anticuerpos, mientras que el término "variante" por Io general se refiere a polinucleótidos, ácidos nucleicos, péptidos y polipéptidos. Por tanto, entre los análogos y variantes de cortistatina se incluyen, entre otros, CGP 23996, BIM23027, sst3-ODN-8, L757.519, L796.778, L803.087, L.817,018, EP1572, octreotida, SANDOSTATIN™, SMS 201-995, SOM230, MK-678, L362.855, BIM23268, BIM23052, KE108, CH-275, PTR3173, SDZ 222-100, BIM23014, lanreotida, SOMATULINE™, TT-232, CYN-154806, BIM23056, BIM23627, SB-710411 , L 054,552, L 779,976, L 817,818, NNC 26-9100, SRA-880, BN- 81674, [DTPA-D-Phe1]octreotida, OCTREOSCAN™, [DTPA-D-Phe1 , Tyr3]octreotida, SMT487, OCTREOTHER™, STILAMIN™, [Tyr10]cortistatina- 14, [Tyr3]octreotida, L-Tyr8CYN 154806, D-Tyr8CYN 154806, SANDOSTATIN-LAR™ , BIM23244, D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Lys- NH2, DTPA-octreotida, octreotato, Pro-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-NH2, OCTREOSCAN™ , BIM23A378, Pro-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Lys-NH2, Oct-LAR, [tyr3]octreotato y Pro-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys]-Lys-NH2.
La invención usa polinucleótidos purificados y aislados que codifican cortistatina y variantes de cortistatina que modulan una o más actividades asociadas con células Th1 (por ejemplo, secreción de TNFα). Entre las secuencias de ADN preferidas usadas en Ia invención se incluyen ADNc genómico, ADNc, y secuencias de ADN sintetizado químicamente. Además, Ia invención proporciona procedimientos para detectar de forma selectiva nuevos polinucleótidos que codifican polipéptidos con actividad biológica de tipo cortistatina.
Entre ejemplos no limitantes de secuencias de nucleótidos usadas en Ia invención se incluyen aquéllas como las expuestas en las SEC ID N0: 1-18 (enumeradas en Ia Tabla 1 ). Los polinucleótidos útiles en Ia presente invención también incluyen polinucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con alguna de las secuencias de Ia lista de Ia Tabla 1 o complementarias de las mismas, y/o que codifican polipéptidos que conservan una actividad biológica sustancial de cortistatina. Entre los polinucleótidos de uso en Ia presente invención también incluyen porciones continuas de cualquiera de las secuencias humanas enumeradas en Ia Tabla 1 , que comprenden al menos 15 nucleótidos consecutivos, más preferentemente 21 - 30 nucleótidos consecutivos. Se entiende que tales polinucleótidos y polipéptidos son sólo ilustrativos; Ia invención contempla el uso de otras secuencias de cortistatina humana, así como otras secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas de cortistatina derivadas de otras especies, incluidas, entre otras, ratones y ratas.
Entre los polinucleótidos usados en Ia presente invención también se incluyen, además de los polinucleótidos descritos anteriormente, polinucleótidos que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos enumeradas en Ia Tabla 1 , o una porción continua de las mismas, y difieren de los polinucleótidos descritos anteriormente sólo debido a Ia degeneración bien conocida del código genético. En Ia Tabla 1 se enumeran las SEC ID N0 para las secuencias aminoacídicas de varios ejemplos de polipéptidos, y las secuencias nucléotídicas de varios ejemplos de polinucleótidos, usadas en Ia invención. Se entiende que tales polinucleótidos y polipéptidos son sólo ilustrativos; Ia invención contempla el uso de otras secuencias de cortistatina humana, así como otras secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas de cortistatina derivadas de otras especies, incluidas, entre otras, ratones y ratas. Procedimientos para identificar compuestos que modulan Ia actividad de células Th1 Otro aspecto de Ia invención proporciona un procedimiento para identificar compuestos, (por ejemplo, moléculas pequeñas, anticuerpos, péptidos, polipéptidos o polinucleótidos), capaces de tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th1 , que comprende las etapas: (a) poner en contacto un compuesto de interés con una muestra; y (b) determinar si Ia actividad de tipo cortistatina o Ia expresión de cortistatina se incrementa en relación con una muestra que no se ha puesto en contacto con el compuesto de interés, donde un nivel mayor de actividad de tipo cortistatina o Ia expresión de cortistatina en Ia muestra que sí se ha puesto en contacto, en comparación con Ia muestra que no se ha puesto en contacto, identifica al compuesto de interés como un compuesto capaz de tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th 1.
Otro aspecto de Ia invención proporciona un procedimiento para identificar compuestos capaces de tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th1 , que comprende las etapas: (a) poner en contacto una muestra que contenga al menos una célula Th 1 con cortistatina; (b) poner en contacto una muestra que contenga al menos una célula Th 1 con un compuesto de interés; y (c) determinar si Ia muestra tratada con cortistatina y Ia muestra tratada con el compuesto de interés muestran una respuesta de células Th 1 similar, donde una respuesta de células Th 1 similar mostrada entre Ia muestra tratada con cortistatina y Ia muestra tratada con el compuesto de interés indica que el compuesto de interés puede usarse para prevenir, tratar o mejorar un trastorno asociado con células Th 1. Como se usa en Ia presente memoria descriptiva, Ia frase "actividad de células Th 1" se refiere a, por ejemplo, (i) inmunidad mediada por células y/o inflamación mediada por células (por ejemplo, activación de macrófagos, expresión del MHC clase II, incremento de los niveles de óxido nítrico, fagocitosis, producción de IgG, inducción de Ia óxido nítrico sintasa, activación y diferenciación de células T citotóxicas CD8+, o estimulación de neutrófilos), (ii) estimulación de señal de quimioquinas (por ejemplo, CCRF, CCL2, CXCR3 y sus receptores), (iii) liberación de citoquinas (por ejemplo, IFNγ, TNFα, TNFβ, IL-2), y (iv) antagonismo de células Th2 (por ejemplo, mediante inhibición de Ia acción o Ia secreción de IL-2, -5, -6, -9, -10, -13, previniendo Ia estimulación de células B, previniendo Ia producción de eosinófilos y/o Ia liberación desde Ia médula ósea, prohibiendo el cambio de isotipo de las células B a IgE, prohibiendo Ia producción de CCL11 (eotaxina), prohibiendo Ia producción de mucus, y/o prohibiendo Ia contracción de las células de músculo liso). Polinucleótidos y polipéptidos
La invención también proporciona Polinucleótidos y polipéptido aislados, que se identifican mediante los procedimientos descritos para identificar y/o detectar de forma selectiva compuestos (por ejemplo, péptidos, polipéptidos, moléculas pequeñas, anticuerpos o polinucleótidos) capaces de tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th1. Los polinucleótidos identificados mediante los procedimientos descritos, además de su uso en el tratamiento, Ia mejora o Ia prevención de trastornos asociados con células Th1 , se pueden usar como sondas de hibridación y cebadores para identificar u asilar otros ácidos nucleicos que tengan secuencias idénticas o similares a las que codifican los polinucleótido descritos. Entre los procedimientos de hibridación para identificar y aislar los ácidos nucleicos se incluyen Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR), las hibridaciones según Ia técnica Southern, hibridación in situ, el perfil de Ia forma de Ia onda y Ia hibridación de Ia técnica Northern, y son bien conocidos para los expertos en Ia técnica.
Las reacciones de hibridación se pueden realizar en condiciones de diferentes restricciones. La restricción de una reacción de hibridación considera el grado y las condiciones en las cuales dos moléculas cualesquiera de ácido nucleico hibridarán entre sí. Preferentemente, cada polinucleótido de hibridación híbrida con su polinucleótido correspondiente en condiciones de restricción reducida, más preferentemente en condiciones restrictivas, y más preferentemente en condiciones altamente restrictivas. En Ia Tabla 2 más adelante se muestran ejemplos de condiciones de restricción. Por tanto, condiciones altamente restrictivas son aquéllas que son al menos tan restrictivas como, por ejemplo, las condiciones A-F; las condiciones restrictivas son al menos tan restrictivas como, por ejemplo, las condiciones G-L; y las condiciones de restricción reducida son al menos tan restrictivas como, por ejemplo, las condiciones M-R.
Tabla 2: Condiciones de restricción para Ia hibridación de polinucleótidos.
Figure imgf000031_0001
1 : La longitud del híbrido es Ia prevista para Ia o las regiones hibridadas de los polinucleótidos que hibridan. Al hibridar un polinucleótido con un polinucleótido diana de secuencia desconocida, se supone que Ia longitud del híbrido será Ia del polinucleótido que va hibridar. Cuando se hibridan polinucleótidos de secuencia conocida, Ia longitud del híbrido se puede determinar mediante Ia alineación de las secuencias de los polinucleótidos y Ia identificación de Ia región o las regiones de complementariedad de secuencia óptima. 2: SSPE (IxSSPE es NaCI 0,15 M, NaH2PO4 10 mM , y EDTA 1 ,25 mM, pH 7,4) se puede sustituir por SSC (IxSSC NaCI 0,15 M y citrato sódico 15 mM) en los tampones de hibridación y de lavado; los lavados se realizan durante 15 min después de completar Ia hibridación. TB* - TR*: La temperatura de hibridación para los híbridos cuya longitud se ha previsto que será inferior a 50 pares de bases deberá ser 5-1O0C menos que Ia temperatura de fusión (Tf) del híbrido, donde Tf se determina según las siguientes ecuaciones. Para los híbridos de longitud inferior a 18 pares de bases, Ia Tf(0C) = 2(# de bases A + T) + 4(# de bases G + C). Para los híbridos con una longitud de entre 18 y 49 pares de bases, Ia Tf(0C) = 81 ,5 + 16,6(log10Na+) + 0,41 (%G + C) - (600/N), donde N es el número de bases en el híbrido y Na+ es Ia concentración de iones de sodio en el tampón de hibridación (Na+ para 1X SSC = 0,165 M).
Otros ejemplos de condiciones de restricción para Ia hibridación de polinucleótidos se encuentran en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Chs. 9 & 11 , CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY (1989), y en Ausubel y col., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Sects. 2.10 & 6.3-6.4, John Wiley & Sons, Inc. (1995), que se incorporan en Ia presente memoria descriptiva como referencia.
Los polinucleótidos aislados de Ia presente invención se pueden usar como sondas y cebadores de hibridación para identificar y aislar ADN con secuencias que codifican variantes alélicas de los polinucleótidos aislados. Las variantes alélicas son formas alternativas naturales de los polinucleótidos descritos que codifican polipéptidos que son idénticos o que tienen una similitud significativa a los polipéptidos codificados por los polinucleótidos descritos. Preferentemente, las variantes alélicas poseen una identidad de secuencia de al menos un 90% (más preferentemente, una identidad de al menos un 95%, más preferentemente una identidad de al menos un 99%) con los polinucleótidos descritos. Los polinucleótidos de Ia presente invención también se pueden usar como sondas y cebadores de hibridación para identificar y aislar ADN que tengan secuencias que codifican polipéptidos homólogos a los polinucleótidos aislados. Estos homólogos son polinucleótidos y polipéptidos aislados de una especie diferente que Ia de los polinucleótidos y polipéptidos descritos, o dentro de Ia misma especie, pero con una similitud de secuencia significativa con los polinucleótidos y polipéptidos descritos. Preferentemente, los homólogos de los polinucleótidos poseen una identidad de secuencia de al menos un 50% (más preferentemente, una identidad de al menos el 75%; más preferentemente, una identidad de al menos el 90%) con los polinucleótidos descritos, mientras que los homólogos de polipéptidos poseen una identidad de secuencia de al menos un 30% (más preferentemente, una identidad de al menos un 45%; más preferentemente, una identidad de al menos un 60%) con los anticuerpos descritos. Preferentemente, los homólogos de los polinucleótidos y polipéptidos descritos son los aislados de especies de mamíferos.
Los polinucleótidos aislados de Ia presente invención también se pueden usar como sondas y cebadores de hibridación para identificar células y tejidos que expresan los polinucleótidos y las condiciones en las que se expresan.
Además, los polinucleótidos aislados de Ia presente invención se pueden usar para alterar (es decir, potenciar o modificar) Ia expresión del gen correspondiente en una célula u organismo. "Gen correspondiente" se refiere a secuencias de ADN genómico que se transcriben para producir los polinucleótidos identificados mediante los procedimientos descritos en Ia presente invención.
Los polinucleótidos aislados de Ia presente invención pueden estar ligados operablemente a una secuencia de control de Ia expresión para Ia producción recombinante de los polipéptidos de Ia presente invención. En Ia técnica se conocen bien procedimientos generales de expresar proteínas recombinantes. Tales proteínas recombinantes pueden expresarse en forma soluble para usar en el tratamiento de trastornos resultantes de Ia alteración de Ia regulación de una actividad de células Th 1 (por ejemplo, enfermedad intestinal inflamatoria, endotoxemia, diabetes de tipo 1 , artritis, esclerosis múltiple).
Los vectores de expresión recombinante de Ia invención pueden portar secuencias adicionales, tal como secuencias que regulan Ia replicación del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionares. El gen marcador seleccionable facilita Ia selección de células huésped en las que el vector se ha introducido. Por ejemplo, normalmente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tal como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en Ia que el vector se ha introducido. Entre los genes marcadores seleccionares se incluyen el gen de Ia dihidrofolato reductasa (DHFR) (para usar en células huésped- con amplificación/selección con metotrexato) y el gen neo (para Ia selección con G418). Una serie de líneas celulares pueden actuar como células huésped adecuadas para Ia expresión recombinante de los polipéptidos de Ia presente invención. Las líneas de células huésped de mamíferos incluyen, por ejemplo, células COS, células CHO, células 293T, células A431 , células 3T3, células CV-1 , células HeLa, células L, células BHK21 , células HL-60, células U937, células HaK, células Jurkat, así como cepas celulares derivadas del cultivo in vito de tejido primario y de explantes primarios.
Como alternativa, puede ser posible producir de forma recombinante los polipéptidos de Ia presente invención en eucariotas inferiores, tal como levaduras, o en procariotas. Entre las cepas de levaduras potencialmente adecuadas se incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, cepas de Kluyveromyces y cepas de Candida. . Entre las cepas bacterianas potencialmente adecuadas se incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis y Salmonella typhimurium. Si los polipéptidos de Ia presente invención se forman en levaduras o bacterias, puede ser necesario modificarlos mediante, por ejemplo, fosforilación o glucosilación de los sitios adecuados, con el fin de obtener funcionalidad. Tales uniones covalentes se pueden obtener utilizando procedimientos químicos o enzimáticos bien conocidos.
Los polipéptidos de Ia presente invención también se pueden producir de forma recombinante mediante Ia unión operable de los polinucleótidos aislados de Ia presente invención con secuencias control adecuadas en uno o más vectores de expresión de insectos, tal como vectores baculovirus, y empleando un sistema de expresión celular de insectos(INSECT). Los materiales y procedimientos para los sistemas de expresión de baculovirus/Sf9 están disponibles comercialmente en forma de kit (por ejemplo, el kit MAXBAC®, Invitrogen, Carlsbad, CA).
Tras Ia expresión recombinante en las células huésped adecuadas, los polipéptidos de Ia presente invención se pueden purificar después a partir del medio de cultivo o de extractos celulares usando procedimientos de purificación conocidos, tal como filtración en gel y cromatografía de intercambio iónico. LA purificación también puede incluir cromatografía de afinidad con agentes de los que se sabe que se unen a los polipéptidos de Ia presente invención. Estos procedimientos de purificación también se pueden usar para purificar los polipéptidos de Ia presente invención a partir de fuentes naturales.
Como alternativa, los polipéptidos de Ia presente invención también se pueden expresar de forma recombinante en una forma que facilite Ia purificación. Por ejemplo, los polipéptidos pueden expresarse como fusiones con proteínas tales como proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S- transferasa (GST), o tioredoxina (TRX). Los kit para Ia expresión y purificación de tales proteínas de fusión están disponibles comercialmente en New England BioLabs (Beverly, MA), Pharmacia (Piscataway, NJ) e Invitrogen, respectivamente. Los polipéptidos de Ia presente invención también se pueden marcar con un epítopo pequeño e identificar o purificar posteriormente usando un anticuerpo específico contra el epítopo. Un epítopo preferido es el epítopo FLAG, que está disponible comercialmente en Eastman Kodak (New Haven, CT). Los polipéptidos de Ia presente invención también pueden producirse mediante síntesis química convencional conocida. Los procedimientos para sintetizar químicamente los polipéptidos de Ia presente invención son bien conocidos para los expertos en Ia técnica. Tales polipéptidos sintéticos químicamente pueden poseer propiedades biológicas en común con los polipéptidos naturales purificados, y, por tanto, pueden emplearse como sustitutos biológicamente activos o inmunológicos de los polipéptidos naturales.
Los polipéptidos de Ia presente invención también abarcan moléculas que son estructuralmente diferentes a los polipéptidos descritos (por ejemplo, que tienen una secuencia ligeramente alterada), pero que poseen sustancialmente las mismas propiedades bioquímicas que los polipéptidos descritos (por ejemplo, se encuentran modificados sólo en residuos de aminoácidos funcionalmente no esenciales). Tales moléculas incluyen variantes alélicas naturales y variantes sometidas a ingeniería genética deliberadamente que contienen alteraciones, sustituciones, reemplazos, inserciones o deleciones. Las técnicas para tales alteraciones, sustituciones, reemplazos, inserciones o deleciones son bien conocidas para los expertos en Ia técnica. Procedimientos para diagnosticar, pronostica y controlar Ia progresión de los trastornos asociados con células Th1
La implicación de las células Th 1 en trastornos inflamatorios y autoinmunitarios, y el posterior descubrimiento acerca de Ia capacidad de Ia cortistatina para regular Ia actividad de las células Th1 , permite procedimientos para diagnosticar, pronosticar y controlar Ia progresión de un trastorno asociado con las células Th1 mediante Ia medición del nivel y Ia actividad de Ia actividad de células Th1 , por ejemplo, Ia secreción de citoquinas o el antagonismo de células Th2, e una muestra biológica. En concreto, Ia cortistatina se puede usar en procedimientos para distinguir si un paciente sufre un trastorno asociado con células Th1 o con células Th2. La cortistatina también se puede usar en los procedimientos descritos para determinar si un paciente sufre un trastorno relacionado con Ia cortistatina. Además, este descubrimiento permite Ia identificación de nuevos antagonistas de células Th1 , que también serán útiles en el tratamiento de trastornos asociados con células Th1.
Entre los procedimientos diagnósticos se incluyen determinar una cantidad problema de una actividad de célula Th 1 o de una actividad de tipo cortistatina en una muestra biológica de un sujeto, y comparar Ia cantidad problema con una cantidad o intervalo normal (es decir, i.e., una cantidad o intervalo de uno o varios individuos de los que se sabe que no sufren un trastorno asociado con células Th1 ). Por tanto, Ia invención proporciona un procedimiento de diagnóstico o detección de un trastorno asociados con células Th 1 , que comprende las etapas de: (a) determinar el nivel de actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina en un individuo sin un trastorno asociado con células Th1 ; (b) determinar el nivel de actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina en un paciente de interés; y (c) comparar el nivel de actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina en un individuo sin un trastorno asociado con células Th1 con el nivel de actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina en el paciente de interés, donde una actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina sustancialmente menor indica que el paciente puede sufrir un trastorno asociado con células Th1. Aunque un procedimiento diagnóstico concreto puede no proporcionar un diagnóstico definitivo de un trastorno asociado con células Th1 , basta si el procedimiento proporciona una indicación positiva que ayuda en el diagnóstico.
La presente invención también proporciona procedimientos para pronosticar trastornos asociados con células Th1. "Pronóstico" o "pronosticar" significa predecir el desarrollo probable y/o Ia gravedad de una afección patológica. Por ejemplo, Ia invención proporciona un procedimiento pronóstico que comprende las etapas de: (a) determinar el nivel de actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina en un paciente de interés en un punto de tiempo inicial; (b) determinar el nivel de actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina en el paciente en un punto de tiempo posterior; y (c) comparar los niveles de Ia actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina entre las muestras, donde una disminución sustancial de Ia actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina indica una mayor probabilidad de que el paciente desarrolle un trastorno asociado con células Th1 o ha desarrollado una forma más graves del trastorno.
Los procedimientos pronósticos también pueden implicar determinar una cantidad problema de actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina en una muestra biológica de un sujeto (humano o mamífero no humano), y comparar Ia cantidad problema con una cantidad o intervalo normal (es decir, i.e., una cantidad o intervalo de uno o varios individuos de los que se sabe que no sufren un trastorno asociado con células Th1 ). Por tanto, Ia invención proporciona un procedimiento de pronóstico de un trastorno caracterizado por Ia alteración de Ia regulación de una actividad de células Th1 , que comprende las etapas de: (a) determinar el nivel de actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina en un paciente de interés; (b) determinar el nivel de actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina en un individuo del que se sabe que no sufre un trastorno asociado con células Th1 ; y (c) comparar el nivel de actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina en Ia muestra del paciente con el nivel de actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina en Ia muestra del individuo del que se sabe que no sufre un trastorno asociado con células Th1 , donde una actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina sustancialmente menor en Ia muestra del paciente indica una mayor probabilidad de que el paciente desarrolle un trastorno asociado con células Th1.
La presente invención también proporciona procedimientos para controlar el curso de un trastorno asociado con células Th 1 mediante Ia detección del incremento o disminución de actividades de células Th1. La invención además se refiere al control del curso de un trastorno asociado con células Th1 mediante Ia detección del incremento o disminución de los niveles de expresión de cortistatina o de actividad proteica. Los procedimientos de control implican determinar cantidades problema de: (i) actividad de células Th1 , o (ii) actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en muestras biológicas tomadas de un sujeto en un primer y un segundo momento, y comparar las cantidades. Un cambio en Ia cantidad de actividad de células Th1 o de expresión de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina entre el primer y el segundo momento indica un cambio en el curso del trastorno asociado con células Th 1 . Una disminución sustancial en Ia actividad de células Th1 (o un incremento sustancial de Ia actividad o expresión de cortistatina) indica una remisión del trastorno y un incremento sustancial de Ia actividad de células Th 1 (o una disminución sustancial en Ia actividad o expresión de cortistatina) indica progresión del trastorno. Estos análisis de control también son útiles para evaluar Ia eficacia de una intervención terapéutica particular (por ejemplo, atenuación y/o reversión de Ia enfermedad) en pacientes tratados por un trastorno asociado con células Th1.
La invención además se refiere al control del curso del tratamiento terapéutico de un trastorno asociado con células Th1 mediante Ia detección de un incremento o disminución de Ia expresión de cortistatina o de los niveles de actividad proteica. El procedimiento comprende las etapas de: (i) detectar el nivel de una actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina en una o más muestras de un paciente que sufra un trastorno asociado con células Th 1 en un punto de tiempo inicial; (ii) proporcionar al paciente cortistatina, un análogo de cortistatina, una variante de cortistatina o un compuesto farmacéutico de los mismos; (iii) detectar el nivel de una actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina en una o más muestras del paciente tras tratamiento con cortistatina, un análogo de cortistatina, una variante de cortistatina o un compuesto farmacéutico de los mismos; (iv) comparar los niveles de actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina entre las muestras, donde un incremento sustancial en Ia actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina en Ia muestra tras el tratamiento indica que Ia gravedad del trastorno asociado con células Th1 ha disminuido.
Procedimientos de tratamiento
Los procedimientos y las moléculas de Ia presente invención se pueden usar in vitro, ex vivo, o incorporar en una composición farmacéutica (es decir, combinados con un vehículo farmacéuticamente aceptable) para administración in vivo. Tal composición puede contener, además de los compuestos de Ia invención, transportadores, varios diluyentes, cargas, sales, tampones, estabilizantes, solubilizantes, y otros materiales bien conocidos en Ia técnica. El término"farmacéuticamente aceptable" quiere decir un material inocuo que no interfiere con Ia eficacia de Ia actividad biológica del o los ingredientes activos. Las características del transportador dependerán de Ia vía de administración. En el caso de terapia génica, el transportador farmacéuticamente aceptable puede incluir, por ejemplo, lípidos, esferas de colágeno, sistemas de emulsión catiónica, agua, tampones salinos, vectores víricos, residuos de quilomicrones, nanopartículas poliméricas (por ejemplo, ADN-gelatina o ADN quitosano), partículas de oro, complejos poliméricos, lipoplejos, poliplejos, etc. (por ejemplo, Gardlik y col. (2005) Med. Sci. Monit. 11 (4):RA110-21 ). La composición farmacéutica de Ia invención puede también contener otros factores, tales como, entre otros, anticuerpos anticitoquinas u otros agentes antiinflamatorios como se describe con más detalle en Ia presente memoria descriptiva. Tales agentes y/o factores adicionales se pueden incluir en Ia composición farmacéutica para producir un efecto sinérgico con Ia cortistatina, variantes de cortistatina o análogos de cortistatina. Por ejemplo, en el tratamiento de Ia artritis, una composición farmacéutica de Ia invención puede incluir anticuerpos anti-IL-4 o fármacos de los que se sabe que reducen una respuesta alérgica.
Las composiciones farmacéuticas de Ia invención pueden estar en forma de un liposoma en el que se combinan Ia cortistatina, las variantes de cortistatina o los análogos de cortistatina, además de otros transportadores farmacéuticamente aceptables, con agentes antipáticos tales como lípidos que existen en forma agregada como micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos o capas lamelares en solución acuosa. Entre los lípidos adecuados para Ia formulación liposómica se incluyen, sin limitaciones, monoglicéridos, diglicéridos, sulfatidas, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares, y similares. La preparación de tal formulación liposómica se encuentra dentro del nivel del experto en Ia técnica.
Como se usa en Ia presente memoria descriptiva, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" quiere decir Ia cantidad total de cada componente activo de Ia composición o procedimiento farmacéutico que es suficiente para mostrar un beneficio significativo para el paciente, incluido, entre otros, Ia mejora de los síntomas, Ia curación, o incremento en Ia tase de curación, de tales afecciones. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, el término se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de ingredientes activos que tienen como resultado un efecto terapéutico, ya se administre en combinación, de forma secuencial o simultáneamente.
Al poner en práctica el procedimiento de tratamiento o uso de Ia presente invención, a un sujeto, por ejemplo un mamífero (por ejemplo, un ser humano) se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de células Th1 , por ejemplo cortistatina, variantes de cortistatina, análogos de cortistatina o compuestos farmacéuticos compuestos por ellos. Un antagonista de células Th 1 se puede administrar de acuerdo con el procedimiento de Ia invención, bien solo o en combinaciones de dos o más antagonistas de células Th1 , o en combinación con otros tratamientos, tales como tratamientos que emplean citoquinas, linfoquinas o factores hematopoyéticos, o agentes antiinflamatorios. Cuando se administra de forma conjunta con uno o más agentes, un antagonista de células Th 1 se puede administrar bien de forma simultánea con el segundo agente o secuencialmente. Si se administra de forma secuencial, el médico de cabecera decidirá Ia secuencia de administración adecuada. La administración de un antagonista de células Th 1 se puede realizar de varias formas convencionales, tales como ingestión oral, inhalación o mediante inyección cutánea, subcutánea o intravenosa. Se prefiere Ia administración oral o subcutánea al paciente. Por ejemplo, Ia administración oral incluye, entre otras, administración de uno o más análogos de cortistatina y administración de cortistatina o de una o más variantes de cortistatina protegidos de Ia degradación (por ejemplo mediante micelas, nanopartículas, etc.).
Cuando una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de células Th1 se administra por vía oral, el aglutinante estará en forma de comprimido, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de comprimido, Ia composición farmacéutica de Ia invención puede contener además un transportador sólido tal como gelatina, o un adyuvante. Los comprimidos, las cápsulas y el polvo contienen de un 5 a un 95% de agente aglutinante, y preferentemente de aproximadamente 25 a 90% de agente aglutinante. Cuando se administra en forma líquida se pueden añadir transportadores líquidos, tales como agua, vaselina, aceites de origen animal o vegetal, tal como aceite de cacahuete, aceite mineral, aceite de soja o aceite de sésamo, o aceites sintéticos. La forma líquida de Ia composición farmacéutica puede además contener solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución sacárida, o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, Ia composición farmacéutica contiene de aproximadamente 0,5 a 90% en peso del aglutinante, y preferentemente de aproximadamente 1 a 50% de agente aglutinante. Cuando una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de células Th1 se administra mediante inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, el aglutinante estará en forma de una solución acuosa, parenteralmente aceptable y sin pirógenos. La preparación de tales soluciones proteicas parenteralmente aceptables, en relación con el pH, isotonicidad, estabilidad, y similares, se encuentra dentro del alcance del experto en Ia técnica. Una composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea debería contener, además de un aglutinante, un vehículo isotónico tal como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de cloruro de sodio y dextrosa, inyección de Ringer lactato, u otro vehículo conocido en Ia técnica. Las composiciones farmacéuticas de Ia presente invención pueden también contener estabilizantes, conservantes, tampones, antioxidantes u otros aditivos conocidos para los expertos en Ia técnica.
La cantidad de un antagonista de células Th 1 de Ia presente invención dependerá de Ia naturaleza y Ia gravedad de las afecciones que se estén tratando y de Ia naturaleza de tratamientos previos que el paciente haya recibido. En último término, el médico de cabecera decidirá Ia cantidad con Ia cual tratar a cada paciente individual. Inicialmente, el médico de cabecera administrará dosis bajas y observará Ia respuesta del paciente. Se pueden administrar dosis mayores de un antagonista de células Th 1 hasta obtener el efecto terapéutico óptimo para el paciente y, en general, en ese momento Ia dosis no se incrementa. Se contempla que las diversas composiciones farmacéuticas usadas para poner en práctica el procedimiento de Ia presente invención deberían contener aproximadamente 0,1 μg a aproximadamente 100 mg de cortistatina por kg de peso corporal.
La duración del tratamiento usando Ia composición farmacéutica de Ia presente invención variará en función de Ia gravedad del trastorno que se esté tratando, Ia vía de administración y el estado y Ia potencial respuesta idiosincrásica de cada uno de los pacientes individuales. En último término, el médico de cabecera decidirá Ia duración adecuada del tratamiento usando una composición farmacéutica de Ia presente invención. Inhalación Se puede formular una composición que incluya un antagonista de células Th 1 para inhalación u otra forma de liberación pulmonar. En consecuencia, el compuesto descrito en Ia presente memoria descriptiva se puede administrar al tejido pulmonar mediante inhalación. Como se usa en Ia presente memoria descriptiva, el término "tejido pulmonar "se refiere a cualquier tejido del tracto respiratorio e incluye las vías respiratorias altas y bajas, salvo que se indique Io contrario. Se puede administrar un antagonista de células Th1 en combinación con una o más de las modalidades existentes para tratar trastornos inflamatorios o inmunitarios. En un ejemplo, el compuesto se formula para un nebulizador. En una forma de realización, el compuesto se puede almacenar en forma liofilizada (por ejemplo, a temperatura ambiente) y reconstituir en solución antes de inhalar. También es posible formular el compuesto para inhalación usando un dispositivo médico, por ejemplo un inhalador (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n° 6.102.035 (un inhalador en polvo) y 6.012.454 (un inhalador en polvo seco). El inhalador puede incluir compartimentos separados para el compuesto activo a un pH adecuado para su almacenamiento y otro compartimento para el compuesto activo a un pH adecuado para su almacenamiento y otro compartimento para un tampón neutralizante, y un mecanismo para combinar el compuesto con un tampón neutralizante justo antes de Ia atomización. En una forma de realización, el inhalador es un inhalador con aplicador de dosis. Los tres sistemas frecuentes usados para liberar los fármacos localmente a las vías aéreas incluyen inhaladores de polvo seco (DPI), inhaladores con aplicador de dosis (MDI) y nebulizadores. Los MDI, usados en el procedimientos más frecuente de administración por inhalación, se pueden usar para liberar medicamentos en forma solubilizada o como dispersiones. Por Io general, los MDI comprenden un propelente de freón o de presión de vapor relativamente alta que fuerza Ia medicación en aerosol hacia el interior del tracto respiratorio tras Ia activación del dispositivo. Al contrario que los MDI, los DPI dependen por completo de los esfuerzos inspiratorios del paciente para introducir en los pulmones un medicamento en forma de polvo seco. Los nebulizadores forman un aerosol del medicamento para su inhalación al proporcionar energía a una solución líquida. También se ha explorado Ia liberación pulmonar directa de fármacos durante Ia ventilación líquida o el lavado pulmonar usando un medio fluoroquímico. Estos y otros procedimientos se pueden usar para liberar un antagonista de células Th 1 en el paciente. En una forma de realización, el antagonista de células Th 1 se asocia con un polímero, por ejemplo un polímero que estabiliza o incrementa Ia semivida del compuesto.
Por ejemplo, para Ia administración mediante inhalación, un antagonista de células Th 1 se libera en forma de un atomizador aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propelente adecuado o un nebulizador. El compuesto puede encontrase en forma de una partícula seca o un líquido. Las partículas que incluyen el compuesto se pueden preparar, por ejemplo, mediante secado por pulverización, secando una solución acuosa del antagonista de células Th 1 con un agente neutralizante-carga y, a continuación, creando partículas a partir del polvo seco, o secando una solución acuosa en un modificador orgánico y , a continuación, creando partículas a partir del polvo seco. El compuesto puede liberarse de forma conveniente en forma de una presentación en atomizador aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, Ia unidad de dosificación puede determinarse mediante una válvula para liberar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos para usar en un inhalador o insuflador se pueden formular de forma que contengan una mezcla en polvo de un antagonista de células Th 1 y una base de polvo adecuada, como lactosa o almidón, si Ia partícula es una partícula formulada. Además del compuesto formulado o no formulado, otros materiales tales como DPPC al 100% u otros tensioactivos se pueden mezclar con el antagonista de células Th1 para estimular Ia liberación y dispersión del compuesto formulado o no formulado. Procedimientos para preparar partículas secas se describen en , por ejemplo, Ia publicación PCT WO 02/32406. Un antagonista de células Th 1 se puede formular para Ia liberación en aerosol, por ejemplo, en forma de partículas secas de aerosol, de forma que cuando se administra se pueda absorber con rapidez y pueda producir un resultado terapéutico local o sistémico rápido. La administración se puede ajustar para proporcionar actividad detectable en 2 min, 5 min, 1 hora ó 3 horas de administración. En algunas formas de realización, Ia actividad máxima se puede conseguir incluso con mayor rapidez, por ejemplo en media hora o incluso en 10 minutos. . Un antagonista de células Th1 se puede formular para que tenga una semivida biológica más prolongada (por ejemplo, mediante asociación con un polímero tal como PEG) y se puede usar como alternativa de otros modos de administración, por ejemplo, de forma que el compuesto entra en Ia circulación desde los pulmones y se distribuye a otros órganos o a un órgano diana concreto.
En una forma de realización, el antagonista de células Th 1 se libera en una cantidad tal que al menos el 5% de Ia masa de Ia molécula se libera en el tracto respiratorio inferior o en Ia parte más profunda de los pulmones. La parte profunda de los pulmones tiene una red capilar extremadamente rica. LA membrana respiratoria que separa Ia luz capilar del espacio aéreo alveolar es muy fina y extremadamente permeable. Además, Ia capa líquida que reviste la superficie alveolar es rica en tensioactivos pulmonares. En otras formas de realización, al menos el 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, u 80% de Ia composición de un antagonista de células Th1 se libera en el tracto respiratorio inferior o en Ia parte profunda de los pulmones. La liberación en ambos tejidos tiene como resultado una absorción eficaz del compuesto y una elevada biodisponibilidad. En una forma de realización, el compuesto se facilita en una dosis medida usando, por ejemplo, un inhalador o nebulizador. Por ejemplo, el compuesto se libera en forma de unidosis de al menos aproximadamente 0,02, 0,1 , 0,5, 1 , 1 ,5, 2, 5, 10, 20, 40, ó 50 mg/inhalación o más.
La biodisponibilidad en porcentaje se puede calcular del siguiente modo: porcentaje de biodisponibilidad = (AUC no invasiva/AUC i.v. o s.c.) x (dosis i.v. o s.c./dosis no invasiva) x 100.
Aunque no es necesario, se pueden usar potenciadores de Ia liberación, tal como tensioactivos, para potenciar Ia liberación pulmonar. Como se usa en Ia presente memoria descriptiva, un "tensioactivo" se refiere a un compuesto con fracciones hidrófilas y lipófilas que estimulan Ia absorción de un fármaco mediante Ia interacción con una interfaz entre dos fases inmiscibles. Los tensioactivos son útiles con las partículas secas por varias razones, por ejemplo, reducción de Ia aglomeración de partículas, reducción de Ia fagocitosis por parte de los macrófagos, etc. Cuando se acopla con un tensioactivo pulmonar, se puede conseguir una absorción más eficaz del compuesto, ya que los tensioactivos, tal como DPPC, facilitarán mucho Ia difusión del compuesto. Los tensioactivos son bien conocidos en Ia técnica e incluye, entre otros, fosfoglicéridos, por ejemplo fosfatidilcolinas, L-alfa- fosfatidilcolina dipalmitoílo (DPPC) y difosfatidil glicerol (DPPG); hexadecanol; ácidos grasos; polietilenglicol (PEG); polioxiteilen-9-; éter de aurilo; ácido palmítico; ácido oleico; trioleato de sorbitán (Span 85); glicocolato; surfactina; poloxómero; éster de sorbitán de ácido graso; trioleato de sorbitán; tiloxapol; y fosfolípidos.
Estabilización y retención
En una forma de realización, un antagonista de células Th 1 se asocia físicamente con una fracción que mejora su estabilización y/o retención en Ia circulación, por ejemplo en sangre, suero, linfa, líquido de lavado broncopulmonar o broncoalveolar, u otros tejidos, por ejemplo, al menos es 1 ,5, 2, 5, 10 ó 50 veces.
Por ejemplo, un antagonista de células Th1 se puede asociar con un polímero, por ejemplo un polímero sustancial mente no antigénico, tal como óxidos de polialquileno u óxidos de polietileno. Los polímeros adecuados variarán sustancialmente en peso. Se pueden usar polímeros con pesos moleculares medios variables de aproximadamente 200 a aproximadamente 35.000 (o aproximadamente 1.000 a aproximadamente 15.000, o aproximadamente 2.000 a aproximadamente 12.500).
Por ejemplo, un antagonista de células Th 1 se puede conjugar con un polímero hidrosoluble, por ejemplo, polímeros de polivinilo hidrófilos, por ejemplo alcohol polivinílico y polivinilpirrolidona. Una lista no limitante de tales polímeros incluye homopolímeros de óxido de polialquileno tal como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros de bloque de los mismos, siempre que se mantenga Ia solubilidad en agua de los copolímeros de bloque. Entre otros polímeros útiles se incluyen polioxialquilenos tal cornos polioxietileno, polioxipropileno y copolímeros reticulados de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbómeros; polisacáridos ramificados o no ramificados, que comprenden los monómeros sacáridos D-manosa, D- y L- galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (por ejemplo, ácido polimanurónico o ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico, incluyendo homopolisacáridos y heteropolisacáridos tales como lactosa, amilopectina, almidón, hidroxietilalmidón , amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glucógeno, o Ia unidad polisacárida de mucopolisacáridos ácidos, por ejemplo, ácido hialurónico; polímeros de alcoholes de azúcar, tal como polisorbitol y polimanitol; heparina o heparona. Otros compuestos también se pueden unir al mismo polímero, por ejemplo una citotoxina, un marcador, u otro agente dirigido, por ejemplo otro antagonista de células Th1 o una molécula no relacionada. Los óxidos de polioxialquileno terminados en alcoxi y monoactivados (PAO), por ejemplo polietilenglicoles monometoxi-terminados (mPEG), polímeros terminados en C1-4 alquilo y óxidos de polietileno bis-activados (glicoles) se pueden usar para sobrecruzamiento (véase, por ejemplo, Ia patente de EE.UU. n° 5.951.974).
En una forma de realización, el polímero antes de su sobrecruzamiento con Ia molécula no necesita , aunque preferiblemente Io es, hidrosoluble. En general, tras el sobrecruzamiento, el producto es hidrosoluble, por ejemplo exhibe una solubilidad de al menos aproximadamente 0,01 mg/ml, y más preferentemente de al menos aproximadamente 0,1 mg/ml, y todavía más preferiblemente, de al menos aproximadamente 1 mg/ml. Además, el polímero no debe ser muy inmunogénico en Ia forma conjugada, ni tampoco debe .mostrar viscosidad, que es incompatible con Ia infusión intravenosa, aerosolización o inyección, si se pretende administrar el conjugado a través de tales vías. En una forma de realización, el polímero contiene sólo un único grupo que es reactivo. Esto ayuda a evitar el sobrecruzamiento de moléculas entre sí. Sin embargo, está dentro del alcance de Ia presente memoria descriptiva maximizar las condiciones de reacción para reducir el sobrecruzamiento entre moléculas, o para purificar los productos de reacción a través de filtración en gel o cromatografía de intercambio iónico para recuperar derivados sustancialmente homogéneos. En otras formas de realización, el polímero contiene dos o más grupos reactivos con el fin de ligar múltiples ligandos a Ia estructura del polímero. De nuevo, se puede usar filtración en gel o cromatografía de intercambio iónico para recuperar el derivado deseado en forma sustancialmente homogénea.
El peso molecular del polímero puede variar hasta aproximadamente 500.000 D, y preferentemente es de al menos aproximadamente 20.000 D, o al menos aproximadamente 30.000 D, o al menos aproximadamente 40.000 D. El peso molecular escogido puede depender del tamaño efectivo del conjugado que se va a obtener, Ia naturaleza (por ejemplo, Ia estructura, como lineal o ramificada) del polímero y el grado de derivación.
Se puede usar un enlace covalente para unir un antagonista de células Th1 a un polímero, por ejemplo, sobrecruzamiento con el grupo amino N- terminal del ligando y los grupos epsilon amino encontrados en los residuos de lisina del ligando, así como otros grupos amino, imino, carboxilo, sulfidrilo, hidroxilo u otros grupos hidrófilos. El polímero puede estar covalentemente unido directamente al antagonista de células Th 1 sin el o de un agente de sobrecruzamiento multifuncional (por Io general bifuncional). La unión covalente a los grupos amino se consigue mediante procedimientos químicos conocidos sobre Ia base de cloruro cianúrico, diimidazol carbonilo y grupos aldehido reactivos (PEG alcóxido más dietil acetilo de bromoacetaldehído; PEG más DMSO y anhídrido acético, o cloruro de PEG más el fenóxido de 4- hidroxibenzaldehído, esteres activados de succinimidilo, ditiocarbonato de PEG 2,4,5-triclorofenilcloroformiato activado o P-nitrofenilcloroformiato activado PEG). Los grupos carboxilo se pueden derivar mediante acoplamiento de PEG-amina usando carbodiimida. Los grupos sulfidrilo se pueden derivar mediante acoplamiento con PEG sustituido con maleimido (por ejemplo, alcoxi-PEG amina más 4 (N maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato de sulfosuccinimidilo o PEG-maleimida). Como alternativa, los grupos amino libres en el ligando (por ejemplo, grupos epsilon amino o residuos de lisina) se pueden tiolar con 2-imino-tiolano (reactivo de Traut ) y después acoplar a derivados de PEG que contengan maleimido, como se conoce en Ia técnica.
Existen polímeros de PEG funcionalizados que se pueden unir a un antagonista de células Th1 , por ejemplo de Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL). Tales derivados de PEG comercialmente disponibles incluyen, por ejemplo, amino-PEG, esteres aminoacídicos de PEG, PEG- hidrazida, PEG-tiol, PEG-succinato, PEG carboximetilado, ácido PEG- propiónico, PEG aminoácidos, PEG succinato de succinimidilo, propionato de PEG succinimidilo, éster de succinimidilo de PEG carboximetilado, carbonato de succinimidilo de PEG, esteres de succinimidilo de aminoácidos PEG, PEG- oxicarbonilimidazol, PEG-nitrofil carbonato, tresilato PEG, éter glicidílico-PEG, PEG-aldehído, PEG vinilsulfona, PEG-maleimido, PEG-ortopiridil-disulfuro, PEG heterofunccional, derivados de PEG vinilo, PEG silanos y PEG fosfolidos. Las condiciones de reacción para el acoplamiento de estos derivados de PEG puede variar dependiendo del antagonista de células Th1 y un polímero se puede separar de los materiales de partida sin reaccionar, por ejemplo mediante filtración en gel o cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo, HPLC. Las especies heterólogas de los conjugados se purifican entre sí del mismo modo. También es posible Ia resolución de especies diferentes (por ejemplo, que contengan uno o dos residuos de PEG) , debido a Ia diferencia en las propiedades iónicas de los aminoácidos sin reacción. . Cabe esperar que los polinucleótidos y polipéptidos de cortistatina de Ia presente invención exhiben uno o más de los uso o actividades biológicas identificadas en Ia presente memoria descriptiva (incluidos los asociados con análisis citados en Ia presente memoria descriptiva ). Los usos o actividades descritos para proteínas de Ia presente invención, pueden proporcionarse mediante Ia administración o el uso de tales proteínas o mediante Ia administración o el uso de polinucleótidos que codifican tales proteínas (por ejemplo, en tratamientos génicos, o vectores adecuados para Ia introducción de ADN . Uso de cortistatina para neutralizar actividades asociadas con células Th1 in vivo
En otro aspecto más, Ia invención caracteriza un procedimiento para neutralizar y/o inhibir una o más actividades asociadas con células Th1/n vivo mediante Ia administración de una cantidad suficiente de antagonista de células Th1 para inhibir o reducir Ia actividad de células Th1. También se puede administrar un antagonista de células Th 1 a sujetos para los que se requiere una inhibición de Ia respuesta inflamatoria mediada por células Th1. Estas afecciones incluyen, por ejemplo, enfermedad intestinal inflamatoria, sepsis, artritis, o Ia supresión de Ia inmunidad tras un trasplante de órgano o un aloinjerto.
Los solicitantes han mostrado que Ia cortistatina reduce Ia actividad de células Th 1 en ratones con colitis inducida, endotoxemia y artritis. En consecuencia, Ia cortistatina interfiere con Ia señalización de las células Th 1 y puede neutralizar una o más actividades asociadas con células Th1. Por tanto, Ia cortistatina se puede usar para reducir in vivo Ia inmunidad mediada por células Th1 , por ejemplo, para tratar o prevenir los trastornos asociados con células Th1 , incluidos EII, endotoxemia y artritis, y/o sus síntomas asociados . En una forma de realización, un antagonista de células Th 1 se administra en tratamiento de combinación, es decir combinado con otros agentes, por ejemplo agentes terapéuticos, que son útiles para tratar afecciones o trastornos patológicos, tales como trastornos inflamatorios autoinmunitarios y crónicos. El término "en combinación" en este contexto significa que los agentes se administran de un modo sustancialmente contemporáneo., o simultánea o secuencialmente. Si se administra de forma secuencial, al principio de Ia administración del segundo compuesto, preferentemente el primero de los dos compuestos será todavía detectable a concentraciones eficaces en el sitio del tratamiento o en el sujeto. Por ejemplo, el tratamiento de combinación puede incluir uno o más antagonistas de células Th1 , es decir que interfieren con Ia señalización de células Th1 , formulados junto con, y/o administrados de forma conjunta, uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo uno o más inhibidores de citoquinas y de factores del crecimiento, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, inhibidores metabólicos, inhibidores enzimáticos y/o agentes citotóxicos o citostáticos, como se describe con más detalle más adelante. Además, se pueden usar uno o más antagonistas de células Th1 en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos descritos en Ia presente memoria descriptiva. Tales tratamientos de combinación pueden utilizar de forma ventajosa dosis menores de los agentes terapéuticos administrados, evitando de este modo .posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias. Los agentes terapéuticos que interfieren con diferentes desencadenantes de inmunidad o de inflamación, por ejemplo los agentes terapéuticos usados en el tratamiento de infecciones o rechazos a trasplantes, se pueden usar en combinación con un antagonista de células Th1. En una forma de realización, uno o más antagonistas de células Th 1 se pueden formular junto con, y/o administrarse de forma conjunta con uno o más agentes agentes adicionales, tal como otros antagonistas de citoquinas o de factores del crecimiento (por ejemplo, receptores solubles, inhibidores peptídicos, moléculas pequeñas, fusiones de ligandos, anticuerpos o fragmentos de unión antigénica (por ejemplo, anticuerpos que se unen a citoquinas o factores de crecimiento, sus receptores, u otras moléculas de superficie celular), y citoquinas antiinflamatorias o agonistas de las mismas. Entre los ejemplos no limitantes de los agentes que se pueden usar en combinación con un antagonista de células Th1 se incluyen, entre otros, moduladores de una o más interleuquinas (IL) o sus receptores, por ejemplo, IL-1 , IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-18 y IL-22; moduladores de citoquinas o factores de crecimiento o sus receptores, tales como factores de necrosis tumoral (TNF), LT, EMAP-II, GM-CSF, FGF y PDGF; péptidos antiinflamatorios endógenos, tal como el péptido vasoactivo intestinal (VIP), urocortina (UCN) y adrenomedulina (AM); así como glucocorticoides, vitamina D3 y Ia hormona estimuladora de melanocitos alfa (alfa-MSH). Los antagonistas de células Th 1 también se pueden combinar con moduladores de, por ejemplo, anticuerpos frente a moléculas se superficie tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD23, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1 ), CD86 (B7.2), CD90, o sus ligandos, incluidos CD154 (gp39 o CD40L), o LFA-1/ICAM-1 y VLA-4Λ/CAM-1 (Yusuf-Makagiansar y col. (2002) Med. Res. Rev. 22:146-67). Entre los moduladores preferidos que se pueden usar en combinación con un antagonista de células Th 1 se incluyen agonistas de IL-4, IL-1 , IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18 e IL-22, y antagonistas de IL-1 , IFNγ y TNF.
Entre los ejemplos de agentes terapéuticos adicionales preferidos que se pueden coadministrar y/o formular junto con uno o más antagonistas de células Th 1 se incluyen, entre otros, uno o más de: esteroides inhalados; agonistas beta, por ejemplo agonistas beta de acción corta o de acción prolongada; antagonistas de leucotrienos o antagonistas de receptores de leucotrienos; fármacos de combinación, tal como ADVAIR®; anticuerpos anti- IgE, por ejemplo XOLAI R®; inhibidores de Ia fosfodiesterasa; metilxantinas; fármacos anticolinérgicos; agentes estabilizantes de mastocitos tales como cromolin; y antihistamínicos. Entre ejemplos adicionales de agentes terapéuticos que se pueden coadministrar y/o formular junto con uno o más cortistatinas, variantes o análogos de cortistatina, o composiciones farmacéuticas compuestas por las mismas se concluyen uno o más de: antagonistas de TNF (por ejemplo, un fragmento soluble de un receptor de TNF, por ejemplo, receptor p55 o p75 de TNF humano o derivados del mismo, por ejemplo, TNFR-IgG de 75 kd (proteína de fusión receptor de TNF-IgG de 75 kD, ENBREL™)); antagonistas enzimáticos de TNF, por ejemplo inhibidores de Ia enzima convertidora del TNFα (TACE)); metotrexato, leflunomida, sirolimus (rapamicina), o un análogo de los mismos, por ejemplo CCI-779; inhibidores de Ia COX2 y Ia PLA2; AINE; inhibidores de p38, inhibidores de TPL-2, Mk-2 y NFkB, entre otros.
En otras formas de realización, uno o más antagonistas de células Th 1 se pueden formular junto con y/o administrar de forma conjunta con uno o más fármacos antiinflamatorios, inmunosupresores o inhibidores metabólicos o enzimáticos. Entre los ejemplos no limitantes de los fármacos o inhibidores que se pueden usar en combinación con un antagonista de células Th 1 se incluyen, entre otros, uno o más fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), por ejemplo ibuprofeno, tenidap; naproxeno; meloxicam, mesalamina, piroxicam, diclofenaco e indometacina; sulfasalazina; corticosteroides tales como prednisolona; fármacos antiinflamatorios supresores de citoquinas (AISC); inhibidores de Ia biosíntesis de nucleótidos, por ejemplo inhibidores de Ia biosíntesis de purinas, antagonistas de folato (por ejemplo, metotrexato (ácido N-[4-[[(2,4-diamino-6-pteridinil)metil]metilamino]benzoil]-L-glutámico); e inhibidores de Ia biosíntesis de pirimidina, por ejemplo inhibidores de Ia dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH) (por ejemplo, leflunomida). Entre los agentes terapéuticos preferidos para usar en combinación con un antagonista de células Th1 se incluyen AINE, AISC, inhibidores de Ia (DHODH) (por ejemplo, leflunomida), y antagonistas de folato (por ejemplo, metotrexato). Entre los ejemplos de agentes terapéuticos inhibidores adicionales se incluyen uno o más de: corticosteroides (orales, inhalados y para inyección local); inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus (FK-506); e inhibidores de mTOR, por ejemplo, sirolimus (rapamicina) o derivados de rapamicina, por ejemplo, derivados solubles de rapamicina (por ejemplo, derivados éster de rapamicina, por ejemplo, CCI 779 (ENt (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3(8): 1249 -53; Huang y col. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3(2):295-304); agentes que interfieren en Ia señalización mediante citoquinas proinflamatorias tales como TNFα o IL-1 (por ejemplo, inhibidores de IRAK, NIK, IKK, p38 o MAP quinasa);inhibidores de Ia COX2, (por ejemplo, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib, y variantes de los mismos; inhibidores de Ia fosfodiesterasa, por ejemplo, R973401 (inhibidor de Ia fosfodiesterasa tipo IV); inhibidores de Ia fosfolipasa, por ejemplo, inhibidores de Ia fosfolipasa citosólica 2 (cPLA2) (por ejemplo, análogos de trifluorometil cetona (patente de EE.UU.n0 6.350.892)); inhibidores del factor de crecimiento de células endoteliales vascular o del receptor del factor del crecimiento, por ejemplo, inhibidor del VEGF y/o inhibidor del VEGF-R; e inhibidores de Ia angiogénesis. Agentes terapéuticos preferidos para usar en combinación con un antagonista de células Th1 son los inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus (FK-506); e inhibidores de mTOR, por ejemplo, sirolimus (rapamicina) o derivados de rapamicina, por ejemplo, derivados solubles de rapamicina (por ejemplo, derivados éster de rapamcina, por ejemplo, CCI 779; inhibidores de Ia COX2, por ejemplo celecoxib y variantes del mismo; e inhibidores de Ia fosfolipasa, por ejemplo, inhibidores de Ia fosfolipasa citosólica 2 (cPLA2) (por ejemplo, análogos de trifluorometil cetona).
Entre los ejemplos adicionales de agentes terapéuticos que se pueden combinar con un antagonista de células Th 1 se incluyen uno o más de : 6- mercaptopurinas (6-MP); azatioprina sulfasalazina; mesalazina; olsalazina cloroquinina/ hidroxicloroquina; penicilamina; aurotiomalato (intramuscular y oral); azatioprina; colchicina; agonitas beta-2 del adrenorreceptor (salbutamol, terbutalina, salmeterol); xantnas (teofilina, arninofilina); cromoglicato; nedocromil; ketotifen; ipratropium y oxitropium; micofenolato mofetilo; agonistas de adenosina; agentes antitrombóticos; inhibidores del complemento y agentes adrenérgicos.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere de acuerdo con ella a kit para llevar a cabo Ia administración combinada de un antagonista de células Th 1 con otro antagonista de células Th 1 y/o con otros compuestos terapéuticos. En una forma de realización, el kit comprende uno o más antagonista de células Th1 formulados en un transportador farmacéutico, y al menos un agente, por ejemplo un agente terapéutico, formulado como sea adecuado, en una o más preparaciones farmacéuticas distintas.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se exponen para ayudar a Ia comprensión de Ia invención, pero con ellos no se pretende limitar su alcance en ningún modo, ni debe interpretarse así . Los ejemplos no incluyen descripciones detalladas de procedimientos convencionales, tales como ELISA, ensayos de proliferación, análisis por citometría de flujo y técnicas de ADN recombinantes. Tales procedimientos son bien conocidos para los expertos en Ia técnica. Ejemplo 1 EL tratamiento con cortistatina revierte Ia colitis y reduce Ia recurrencia de Ia enfermedad
Ejemplo 1.1 : Ia cortistatina inhibe Ia producción de mediadores inflamatorios por los macrófagos activados in vitro.
Se obtuvieron macrófagos peritoneales mediante lavado peritoneal de ratones Balb/c con 4 mi de medio RPMI 1640. Las células del exudado peritoneal se lavaron y resuspendieron en medio completo a 106 células/ml y, tras 2 h a 370C en CO2 al 5%, mediante lavados repetidos se eliminaron las células que no se adhirieron. Las monocapas de macrófagos se incubaron con medio completo en ausencia (sin estimular) o presencia de lipopolisacárido (LPS 1 μg/ml, de E. coli serotipo 055:B5, Sigma). En algunos experimentos, se añadió CST-29 (108 M) al principio del cultivo. Los sobrenadantes son células se recogieron a tiempos diferentes y se determinaron los niveles de citoquinas como se ha descrito anteriormente.
La cantidad de óxido nítrico (NO) formado se estimó a partir de Ia acumulación del nitrito metabolito estable de NO mediante el análisis de Griess (Busch y Pollack (2001 ) Pharm. Res. 18:1607-12). Se mezclaron volúmenes iguales de sobrenadantes (90 μl) y reactivos de Griess (90 μl de sulfanilamida al 1% /N-[naftil]etil-enediamina diclorhidrato al 0,1% en 2,5% de H3PO4) y se midió Ia absorbancia a 550 nm. La cantidad de nitrito se calculó a partir de una curva estándar NaNO2.
Como se muestra en Ia FIG. 1 , el tratamiento de los macrófagos activados con cortistatina disminuyó los niveles de TNFα, IL-6 y NO. La reducción se produjo ya a las 6 horas de Ia administración de cortistatina y continuó durante Ia duración del estudio del cultivo (48 h). Ejemplo 1.2: El tratamiento con cortistatina protege frente a Ia colitis inducida por TNBS.
La colitis se indujo en ratones Balb/c y SJL (de 68 semanas de edad, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) como se ha descrito anteriormente (Neurath y col. (1995) J. Exp. Meó. 182:1281 -90). Brevemente, se anestesió ligeramente a los ratones con halotano y se insertó un catéter de 3,5F por vía intrarrectal a 4 cm del ano. Para inducir colitis, lentamente se administró en el lumen a través del catéter provisto con una jeringa de 1 mi 100 μl de 3 mg de TNBS (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) en etanol al 50% (para romper Ia barrera epitelial del intestino). Los ratones control recibieron solo etanol al 50% (100 μl). Los animales se trataron i.p. con vehículo o con concentraciones diferentes (0,05-2,0 nmol/ratón; 6-250 μg/kg) de cortistatina 1-29 (American Peptides Company, Sunnyvale, CA) 12 h después de Ia administración de TNBS.
Para estudiar el efecto terapéutico de Ia administración retardada de cortistatina sobre Ia colitis establecida se inyectó i.pcortistatina (2 nmol/ratón) diariamente durante 3 días consecutivos, comenzando 6 días después de Ia administración de TNBS. Para estudiar el efecto sobre Ia recurrencia de Ia enfermedad, se administraron 1 ,5 mg de TNBS los días 0 y 9, y cortistatina (2 nmol/ratón) y se inyectó cortistatina i.p. a las 12 h tras Ia primera administración de TNBS.
Los animales se monitorizaron diariamente para detectar Ia aparición de diarrea, pérdida de peso corporal y supervivencia. Algunos animales se sacrificaron en el momento álgido de Ia enfermedad (Día 3); se obtuvieron muestras de sangre mediante punción cardíaca y se extirpó un segmento del colon (de 7 cm de longitud) para evaluar el dalo macroscópico y pesar. Los segmentos tisulares se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido para estudios histológicos e inmunohistológicos, extracción de proteínas y determinación de citoquinas, medición de actividad mieloperoxidasa (MPO) y extracción de ARN total. En otra serie de experimentos, se usaron segmentos de colon para el aislamiento de células mononucleares de lámina propia (LPMC).
Los colon se examinaron con microscopio de disección (x5) y se clasificaron las lesiones macroscópicas con una escala de 0 a 10 sobre Ia base de criterios que reflejan inflamación, tal como hiperemia, engrosamiento del intestino y Ia extensión de Ia ulceración (Fiorucci y col. (2001 ) Proc. Nati. Acad. ScL U.S.A. 98:13936-41 ). También se evaluaron y valoraron Ia consistencia de las heces y Ia hemorragia rectal. Para el análisis histopatológico, una muestra de colon de Ia parte central se fijó en tampón fosfato de formalina al 10%, en introdujo en sacarosa, se congeló en hielo seco usando compuesto O. CT. y se crioseccionó. Las secciones transversales se tiñeron con hematoxilina/eosina, y se puntuó Ia inflamación de 0 a 4 del siguiente modo, de forma enmascarada por el mismo patólogo: 0, sin signos de inflamación; 1 , baja infiltración leucocitaria ; 2, infiltración leucocitaria moderada; 3, infiltración leucocitaria alta, fibrosis moderada, densidad vascular elevada, engrosamiento de Ia pared del colon, pérdida moderada de células caliciformes, pérdida focal de criptas ; 4, infiltraciones transmurales, pérdida masiva de células caliciformes, fibrosis extensa, pérdida difusa de criptas . Para el análisis inmunohistológico, las criosecciones se bloquearon en 3% de BSA/PBS durante 30 min a temperatura ambiente, se lavaron y se incubaron con 5 μg/ml de Acmo anti- CD4, anti-CD11β o anti-TNFα marcados con FITC durante 1 h temperatura ambiente. Tras el montaje, las secciones teñidas se examinaron mediante microscopía inmunofluorescente dual (Leica, Wetzlar, Alemania).
La infiltración de neutrófilos en el colon se monitorizó midiendo Ia actividad MPO usando un procedimiento citado anteriormente (Bradley y col. (1982) J. Invest. Dermatol. 78:206 -09). Brevemente, se homogeneizaron los segmentos colónicos a 50 mg/ml en tampón fosfato (50 mM, pH 6,0) con bromuro de hexadeciltrimetilamonio al 0,5%. Las muestras se congelaron y descongelaron 3 veces, después se centrifugaron a 30.00Og durante 20 minutos. Los sobrenadantes se diluyeron a 1 :30 con tampón de ensayo consistente en tampón fosfato 50 mM a pH 6,0 con 0,167 mg/ml de o- dianisidina (Sigma) y H2O2 al 0,0005% y Ia reacción colorimétrica se midió a 450 nm entre 1 y 3 min en un espectrofotómetro (Beckman Instruments, Irvine, CA). La actividad MPO por gramo de tejido húmedo se calculó como: actividad MPO (U/g tejido húmedo) = (A450) (13,5)/peso de tejido (g), donde A450 es el cambio en Ia absorbancia de luz a 450 nm de 1 a 3 min tras el inicio de Ia reacción. El coeficiente 13,5 se determinó de forma empírica de forma que Ia actividad MPO de 1 U es Ia cantidad de enzima que reducirá 1 μmol de peróxido/min.
Los resultados de estos estudios se muestran en las FIGS. 2 y 3. La FIG. 2 muestra que el tratamiento con cortistatina redujo Ia pérdida de peso en ratones con colitis inducida por TNBS (A y B). Esta respuesta se reflejó como una menor puntuación de colitis en ratones tratados con cortistatina (C) junto con una mayor supervivencia en ratones tratados (D). Los ratones tratados con cortistatina mostraron un menor daño colónico macroscópico (E) y de igual forma mostraron menos infiltrados inflamatorios en el colon (F), y menos células productoras de TNFα o células CD4 T en el tejido colónico (G). Además, los ratones tratados con cortistatina mostraron una menor actividad MPO colónica en comparación con los ratones control tratados con TNBS (H). Por tanto, Ia cortistatina es un tratamiento eficaz para Ia colitis inducida por TNBS-y Ia enfermedad intestinal inflamatoria en ratones.
La FIG. 3 muestra que Ia cortistatina reduce Ia pérdida de peso en ratones con colitis establecida (A) así como en ratones con colitis recurrente (B). Además, los datos muestran que el tratamiento con cortistatina incrementa de forma significativa Ia supervivencia en ratones que sufren colitis (C).
Ejemplo 1.3: La cortistatina regula por disminución Ia respuesta inflamatoria en Ia colitis inducida por TNBS . Para Ia determinación de citoquinas en Ia mucosa del colon, los extractos proteicos se aislaron mediante homogeneización de segmentos colónicos (0,5 mg de tejido/ml) en TrisHCI 50 mM ,a pH 7,4, con DTT 0,5 mM y 10 μg/ml de una mezcla de inhibidores de proteinasa que contiene fluoruro de fenilmetilsulfonilo, pepstatina y leupeptina (Sigma). Las muestras se centrifugaron a 30.00Og durante 20 min y se almacenaron a -8O0C hasta Ia determinación de las citoquinas. Los niveles de citoquinas y quimioquinas en el suero, los extractos proteicos de colon y los sobrenadantes de los cultivos se determinaron mediante un ELISA de tipo sandwich específico usando anticuerpos de detección de captura/biotinilados de BD Pharmingen (San Diego, CA) y Preprotech (Rocky HiII, NJ) siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. Los niveles de amiloide sérico A (ASA) se determinaron en muestras de suero mediante un kit de ELISA murino (Tridelta Development, NJ). Para el análisis intracelular de citoquinas en células LPMC y MLN estimuladas, se recogieron 106 células/ml y se estimularon con PMA (1 ng/ml) más ionomicina (20 ng/ml) durante 8 h, en presencia de monensina. Las células se marcaron con Ac anti-CD4 marcados con PerCP durante 30 min a 4 C, se lavaron, se fijaron/permeabilizaron con saponina con Cytofix/Cytoperm, se marcaron con 0,5 μg/muestra de Acm específicos anticitoquinas conjugados con FITC y con PE (BD Pharmingen), y se analizaron usando un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson). Con el fin de distinguir entre fuentes de monocitos/macrófagos y células T, el análisis de citoquinas intracelulares se realizó exclusivamente en Ia población de células T CD4 marcadas con PerCP.
Las células monocucleares de Ia lámina propia (LPMC) se aislaron de muestras colónicas de obtención reciente. Brevemente, los colon se lavaron en medio con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin calcio y sin magnesio y después se trataron con EDTA1 mM/PBS durante 20 min para eliminar el epitelio. A continuación, el tejido se digirió con colagenasa tipo IV y con DNasa I (Sigma) durante 20 min en un incubador en agitación a 370C. Las células liberadas se colocaron en capas en un gradiente de Percoll al 30- 70% (Amersham Pharmacia, Upsala, Suecia) y se agitaron a 1.800 rpm para obtener Ia población rica en leucocitos en Ia interfase de 30-70%. Se obtuvieron suspensiones de células a partir de MLN recién recogidos en el momento álgido de Ia enfermedad. Las células de ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) se enriquecieron en células T mediante incubación de las células MLN en placas petri durante 2 h a 370C para eliminar las células que no se adhirieron. Las células LPMC y MLN se incubaron en medio completo (RPMI-1640 complementado con 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, L- glutamina 2 mM , 2-mercaptoetanol 50 μM y suero bovino fetal al 10% inactivado por calor) a una concentración de 106 células/ml, en ausencia (sin estimular) o presencia de PMA (10 ng/ml) y Con A (2,5 μg/ml). La proliferación celular (expresada como A450) se evaluó en placas de microtitulación de 96 pocilios durante 96 h usando un ensayo de proliferación celular (BrdU) de Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Alemania). La producción de citoquinas/quimioquinas en los sobrenadantes de los cultivos se determinó tras 48 h de cultivo como se ha descrito anteriormente. El contenido intracelular de citoquinas se determinó en células estimuladas como se ha descrito anteriormente.
El ARN total se aisló a partir de muestras de colon usando el procedimiento de isotiocianato de guanidinio/fenol/cloroformo, y Ia expresión del ARNm de una variedad de quimioquinas, receptores de quimioquinas, citoquinas, enzimas y marcadores leucocitarios se cuantificó usando una micromatriz de ADN deGEArray para 96 marcadores inflamatorios y autoinmunitarios (Superarray Bioscience Corporation, Frederick, MD) siguiendo las recomendaciones del fabricante. LA variación de una muestra a otra en Ia carga de ARN se controló mediante comparación con el gen doméstico G3PDH. Los resultados de estos experimentos se muestran en las FIGS. 4-6.
La FIG. 4 muestra que Ia cortistatina regula por disminución de forma significativa los niveles de proteínas y de ARNm de mediadores inflamatorios, por ejemplo TNFα, IL-6, MIP-2, Rantes, IL-1 β, IL-12 y IFNγ, durante colitis en células de Ia mucosa de colon de ratones (A y B). Además, el tratamiento con cortistatina regula por aumento los niveles de expresión de proteínas y de ARNm de las citoquina de células Th2, IL-10, en ratones con colitis inducida por TNBS (A y B). El tratamiento con cortistatina además reguló el nivel de ARNm de varias quimioquinas (por ejemplo, Rantes, MIP, MCP) y receptores de quimioquinas (por ejemplo, CCR1-8 y XCR1 ) (A y B). Por tanto, Ia FIG. 4 muestra que Ia cortistatina regula por disminución Ia respuesta inflamatoria de Ia mucosa durante Ia colitis inducida por TNBS en ratones.
La FIG. 5 muestra que Ia cortistatina reguló por disminución de forma significativa los niveles proteicos de varias citoquinas, es decir TNFα, MIP-2, IL-6 e IL-1 β, en los niveles séricos durante Ia colitis inducida por TNBS en ratones. Además, Ia FIG. 5 muestra que el tratamiento con cortistatina también disminuyó de forma significativa los niveles de ASA en los mismos ratones afectados por colitis. Por tanto, Ia FIG. 5 muestra que Ia cortistatina disminuye Ia inflamación sistémica durante Ia colitis inducida por TNBS en ratones.
La FIG. 6 muestra que el tratamiento con cortistatina disminuyó Ia proliferación de células LPMC y MLN estimuladas y sin estimular durante Ia colitis inducida por TNBS (A). Además, el contenido en citoquinas del sobrenandante de células LPMC y MLN estimuladas mostró niveles reducidos de IFNγ y niveles incrementados de IL-10 en respuesta a cortistatina (A, paneles de Ia derecha). Como se muestra en B (paneles de Ia derecha), el número de células CD4 productoras de INFγ disminuyó en ratones con colitis tratados con cortistatina, mientras que el número células CD4 productoras de IL-10 aumentó. Además, el mareaje doble (B, paneles de Ia izquierda) para Ia expresión de IFNγ/IL-2 o IL-4/IL-10 en células T CD4 controladas mostró que las células que expresaban IFNγ/IL-2 respondían a Ia cortistatina disminuyendo los niveles de IFNγ y IL-2, mientras que las células productoras de IL-4/IL-10 respondían incrementando Ia expresión de IL-10. En conjunto, estos resultados muestran que Ia cortistatina suprime Ia respuesta de citoquinas de células Th1 y estimula Ia producción de IL-10 (una citoquina de células Th2) durante Ia colitis inducida por TNBS . Ejemplo 2 El tratamiento con cortistatina revierte y protege contra Ia endotoxemia letal Ejemplo 2.1 : La cortistatina inhibe Ia producción de mediadores inflamatoriopor los macrófagos activados in vitro.
Los macrófagos residentes se obtuvieron mediante lavado peritoneal con medio RPM 1-1 640. Las células peritoneales se lavaron en medio frío y se incubaron en medio completo (RPMI-1 640 complementado con 100 U/ml de penicilina/ estreptomicina, L-glutamina 2 mM , 2-mercaptoetanol 50 μM y suero bovino fetal al 10% inactivado por calor) a una concentración de 106 células/ml. Tras 2 h a 370C, las células que no se adhirieron se eliminaron mediante lavado exhaustivo. AL menos un 95% de las células adherentes eran macrófagos, según criterios morfológicos y fagocíticos y por citometría de flujo. Las monocapas de macrófagos se incubaron con medio completo en ausencia (sin estimular) o presencia de LPS (1 μg/ml, de E. coli serotipo 055:B5; Sigma). En algunos experimentos, se añadió cortistatina a concentraciones diferentes (de 10"7 a 10"12 M) al principio del cultivo. Los sobrenadantes sin células se recogieron a tiempos diferentes y se determinaron los niveles de citoquinas/quimioquinas como se ha descrito anteriormente.
La cantidad de óxido nítrico (NO) formado se estimó a partir de Ia acumulación del nitrito metabolito estable de NO mediante el análisis de Griess (Bush y col., supra). Se mezclaron volúmenes iguales de sobrenadantes (90 μl) y reactivos de Griess (90 μl de sulfanilamida al 1% /N- [naphtil]etil-enediamina diclorhidrato al 0,1% en 2,5% de H3PO4) y se midió Ia absorbancia a 550 nm. La cantidad de nitrito se calculó a partir de una curva estándar NaNO2.
Los resultados de estos experimentos se muestran en Ia FIG. 7. Los macrófagos peritoneales de los ratones mostraron niveles menores de las citoquinas TNFα, IL-6, IL-1 β, IL-12, Rantes y MIP-2 como respuesta al tratamiento con cortistatina. Además, estas células exhibieron menores niveles de óxido nítrico (NO) como respuesta a Ia cortistatina. Por tanto, Ia cortistatina inhibe Ia producción por los macrófagos activados de mediadores inflamatorios en los macrófagos activados in vitro.
Ejemplo 2.2: La cortistatina protege frente a Ia endotoxemia letal y reduce los signos histopatológicos de Endotoxemia. Para inducir endotoxemia, en ratones Balb/c y C57BI/6 (de 6-8 semanas de edad, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) se inyectó i.p. cantidades diferentes (25-600 μg/ratón; 400 μg/ratón a menos que se indique Io contrario) de lipopolisacárido (LPS, de Salmonella enteridis; Sigma). Los animales se trataron i.p. con medio (controles) o con concentraciones diferentes (0,05-5,0 nmol/ratón; 6-550 μg/kg) de cortistatina-29 (American Peptides Company, Sunnyvale, CA) 30 min tras Ia prueba con LPS.
Para estudiar el efecto terapéutico de Ia administración retardada de cortistatina sobre Ia endotoxemia establecida, se inyectó i.p cortistatina (2 nmol/ratón 2 ó 4 horas tras Ia administración de endotoxina. Los animales se monitorizaron diariamente para observar Ia supervivencia y otros signos clínicos, incluidos piel erizada, letargo, aparición de diarrea y pérdida de peso corporal. Algunos animales se sacrificaron a tiempos diferentes tras Ia inyección de LPS; se recogieron muestras de sangre mediante punción cardíaca, se obtuvieron exudados peritoneales y se recogieron hígado, pulmones e intestino delgado. Las muestras de sangre se dejaron coagular durante 1 h a temperatura ambiente y el suero se obtuvo tras centrifugación para Ia determinación decitoquinas, qumioquinas y amiloide sérico A (ASA). Las muestras tisulares se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido para estudios histológicos , extracción de proteínas y determinación de citoquinas y medición de Ia actividad (MPO). La suspensión peritoneal se centrifugó 5 min a 180Og y los sobrenadantes sin células (fluido peritoneal) se recilectaron y analizaron para determinar Ia producción de citoquinas/quimioquinas. Se contaron las células peritoneales y se ajustaron en medio con PBS/EDTA 3 mM a 3 x 106 células/ml. El número de células viables en las diferentes subpoblaciones peritoneales se determinó mediante citometría de flujo (FACScan; BD Biosciences, Mountain View, CA). Brevemente, los linfocitos, macrófagos y células polimorfonucleares (PMN) peritoneales se obtuvieron según sus diferentes características de dispersión frontal y de dispersión lateral y se contaron. La gran predominancia de neutrófilos (99%) en Ia población PMN se confirmó en preparaciones de citospina marcadas con May-Grunwald y Giemsa.
Para Ia evaluación histopatológica, el hígado, los pulmones y el intestino delgado recién recogidos se fijaron en tampón fosfato de formalina al 10%, se introdujeron en sacarosa, se congelaron en hielo seco usando compuesto O. CT. y se crioseccionó. Las secciones transversales se tiñeron con hematoxilina/eosina mediante técnicas estándar.
La infiltración de neutrófilos en los pulmones, el hígado y el intestino delgado se monitorizó midiendo Ia actividad MPO, pero usando un procedimiento citado anteriormente (Bradley y col., supra). Brevemente, las muestras tisulares se homogeneizaron a 50 mg/ml en tampón fosfato (50 mM, pH 6,0) con bromuro de hexadeciltrimetilamonio al 0,5%. Las muestras se congelaron y descongelaron 3 veces, después se centrifugaron a 30.00Og durante 20 minutos. Los sobrenadantes se diluyeron a 1 :30 con tampón de ensayo consistente en tampón fosfato 50 mM a pH 6,0 con 0,167 mg/ml de o- dianisidina (Sigma) y H2O2 al 0,0005% y Ia reacción colorimétrica se midió a 450 nm entre 1 y 3 min en un espectrofotómetro (Beckman Instruments, Irvine, CA). La actividad MPO por gramo de tejido húmedo se calculó como: actividad MPO (U/g tejido húmedo) = (A450) (13,5)/peso de tejido (g), donde A450 es el cambio en Ia absorbancia de luz a 450 nm de 1 a 3 min tras el inicio de Ia reacción. El coeficiente 13,5 se determinó de forma empírica de forma que Ia actividad MPO de 1 U es Ia cantidad de enzima que reducirá 1 μmol de peróxido/min. Los resultados de estos estudios se muestran en las FIGS. 8 y 9.
Como se muestra en los paneles A-D de Ia FIG. 8, el tratamiento con cortistatina redujo Ia incidencia de mortalidad en ratones a los que se había inyectado LPS y aumentó el tiempo de supervivencia media para los ratones tratados. El tratamiento con cortistatina fue eficaz a varias dosis de LPS (A-C) y fue más eficaz cuando se administró a una dosis de 0,5-5 nmol (D). El tratamiento con cortistatina tuvo un efecto ligeramente más fuerte sobre Ia supervivencia cuando se administró 2 h, en lugar de 4 h, tras Ia prueba con LPS (E; "NP" = cortistatina).
La FIG. 9 muestra que los ratones estimulados con LPS y después tratados con cortistatina, experimentaron una reducción de Ia infiltración inflamatoria y Ia diseminación en órganos diana (pulmones e hígado) (A). Además, (B) Ia cortistatina disminuyó de forma significativa Ia actividad MPO en varios tejidos tras Ia estimulación de LPS, incluidos los pulmones, el hígado y el intestino. Además, (C) el tratamiento con cortistatina redujo el reclutamiento de leucocitos (PMN, macrófagos y linfocitos) en Ia cavidad peritoneal de ratones a los que se había inyectado LPS. En conjunto, estos datos sugieren que Ia cortistatina reduce Ia respuesta inflamatoria sistémica que se produce como resultado de Ia endotoxemia.
Ejemplo 2.3: La cortistatina reduce las respuestas inflamatorias local y sistémica en ratones endotoxémicos .
Para Ia determinación de citoquinas en los tejidos, los extractos proteicos se aislaron mediante homogeneización de porciones de pulmón, hígado e intestino delgado (0,5 mg de tejido/ml) en TrisHCI 50 mM ,a pH 7,4, con DTT 0,5 mM y 10 μg/ml de una mezcla de inhibidores de proteinasa que contiene fluoruro de fenilmetilsulfonilo, pepstatina y leupeptina (Sigma). Las muestras se centrifugaron a 30.00Og durante 20 min y se almacenaron a - 8O0C hasta Ia determinación de las citoquinas. Los niveles de citoquinas y quimioquinas en el suero, los extractos proteicos de los tejidos y los sobrenadantes de los cultivos se determinaron mediante un ELISA de tipo sandwich específico usando anticuerpos de detección de captura/biotinilados de BD Pharmingen (San Diego, CA) y Preprotech (Rocky HiII, NJ) siguiendo las recomendaciones de los fabricantes como se ha descrito previamente. Los niveles de amiloide sérico A (ASA) se determinaron en muestras de suero mediante un kit de ELISA murino (Tridelta Development, NJ).
La cantidad deóxido nítrico (NO) formado se estimó a partir de Ia acumulación del nitrito metabolito estable de NO mediante el análisis de Griess . Se mezclaron volúmenes iguales de sobrenadantes (90 μl) y reactivos de Griess (90 μl de sulfanilamida al 1%/N-[naphtil]etil-enediamina diclorhidrato al 0,1% en 2,5% de H3PO4) y se midió Ia absorbancia a 550 nm. La cantidad de nitrito se calculó a partir de una curva estándar NaNO2. Los resultados de estos experimentos se muestran en Ia FIG. 10. Estos datos muestran que el tratamiento con cortistatina (tras Ia inducción de endotoxemia) disminuyó los niveles de los mediadores inflamatorios TNFα, IL- 6, IL-1β, Rantes, NO, SAA, MIP-2, IFNγ e IL-12 en suero (A). La cortistatina también aumentó los niveles séricos de IL-10, una citoquina de Th2 (A). El tratamiento con cortistatina disminuyó con éxito los niveles peritoneales de TNFα, Rantes, IL-6, MIP-2, IL-12, IFNγ, y NO (B). Esto sugiere que Ia cortistatina disminuya las respuestas inflamatorias local y sistémica en ratones endotoxémicos. Ejemplo 3
El tratamiento con cortistatina mejora Ia incidencia y gravedad de Ia artritis inducida por colágeno (AIC) en ratones
Se disolvió colágeno tipo Il bovino nativo (CII, Sigma) en ácido acético 0,05 M a 40C durante Ia noche y se emulsionó con un volumen igual de adyuvante de Freund completo (CFA; Difco, Detroit, Michigan). Por vía s.c se inyectó en Ia base de Ia cola de ratones macho DBA/1 J (de 6-10 semanas de edad, Jackson Labs, Bar Harbor, ME) 0,15 mi de emulsión que contenía 200 μg de CII. A los 21 de Ia inmunización primaria, los ratones recibieron un refuerzo por vía i.p. con 200 μg de CII en PBS. Los ratones fueron analizados por dos evaluadores independientes enmascarados en días alternos y se monitorizaron para detectar signos de inicio de artritis usando dos parámetros clínicos, Ia tumefacción de Ia pata y Ia puntuación clínica. La tumefacción de Ia pata se evaluó midiendo el espesor de las patas traseras afectadas mediante calibradores de 0-10 mm. La artritis clínica se evaluó usando el siguiente sistema: grado 0, sin tumefacción; grado 1 , ligera tumefacción y eritema; 2, edema pronunciado; 3, rigidez articular. Se graduó cada extremidad, con una puntuación máxima posible de 12 por animal.
Los resultados de estos experimentos se muestran en Ia FIG. 11. Estos datos muestran que los ratones CIA exhiben una gravedad clínica significativamente menor ya el día 25 tras el tratamiento con inmunización.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica para tratar un trastorno asociado con células Th1 , caracterizada porque comprende un polipéptido compuesto por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N0: 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15 y 17, y un transportador farmacéuticamente aceptable.
2. Una composición farmacéutica para tratar un trastorno asociado con células Th1 , caracterizada porque comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N0: 1 , 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16, y un transportador farmacéuticamente aceptable.
3. Una composición farmacéutica para tratar un trastorno asociado con células Th1 , caracterizada porque comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido compuesto por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N°:3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15 y 17, y un transportador farmacéuticamente aceptable.
4. Una composición farmacéutica para tratar un trastorno asociado con células Th1 , caracterizada porque comprende un polinucleótido que híbrida en condiciones restrictivas con un polinucleótido que tiene una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N°:1 , 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16, y un transportador farmacéuticamente aceptable.
5. Una composición farmacéutica para tratar un trastorno asociado con células Th1 , caracterizada porque comprende un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida en condiciones restrictivas con un polinucleótido que tiene una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N°:1 , 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16, y un transportador farmacéuticamente aceptable.
6. Una composición farmacéutica para tratar un trastorno asociado con células Th1 , caracterizada porque comprende un polinucleótido que híbrida en condiciones restrictivas con un polinucleótido que codifica un polipéptido compuesto por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N°:3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15 y 17, y un transportador farmacéuticamente aceptable.
7. Una composición farmacéutica para tratar un trastorno asociado con células Th1 , caracterizada porque comprende un polipéptido compuesto por una secuencia de aminoácidos como Ia expuesta en Ia SEC ID N°:18, en Ia que X3 es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por arginina, lisina, histidina, glutamina o asparagina, y en Ia que Xn es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por serina, alanina, treonina, glicina, ácido glutámico, prolina, asparagina o ácido aspártico.
8. Una composición farmacéutica para tratar un trastorno asociado con células Th1 , caracterizada porque comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido compuesto por una secuencia de aminoácidos como Ia expuesta en Ia SEC ID N°:18, en Ia que X3 es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por arginina, lisina, histidina, glutamina o asparagina, y en Ia que Xn es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por serina, alanina, treonina, glicina, ácido glutámico, prolina, asparagina o ácido aspártico.
9. Una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque el trastorno asociado con células Th1 se selecciona del grupo constituido por trastornos inflamatorios, trastornos inmunitarios, trastornos séptico y trastornos relacionados con el trasplante/injerto de órganos o tejidos.
10. Una composición farmacéutica de acuerdo con Ia reivindicación 9, caracterizada porque el trastorno asociado con células Th 1 se selecciona del grupo constituido por esclerosis múltiple, pioderma gangrenoso, tireopatía, diabetes mellitus de tipo 1 insulinodependiente, tiroiditis de Hashimoto, artritis reumatoide, enfermedad de Graves, hepatitis, endotoxemia, shock séptico, encefalomielitis, uveretinitis, endocarditis de Libman-Sacks, lupus eritematoso sistémico, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerodermia, dermato- polimiositis, granulomatosis de Wegener, síndrome de Sjogren, granulomas, liquen escleroso, sepsis, cirrosis biliar primaria, enfermedad intestinal inflamatoria , colitis crónica, enfermedad de Crohn, gastritis autoinmunitaria , endotoxemia, sepsis, rechazo de trasplante/injerto, enfermedad de injerto contra huésped.
11. Un procedimiento para tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th1 , caracterizado porque comprende Ia etapa de administrar a un paciente un polipéptido conmpuesto por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N°:3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15 y 17.
12. Un procedimiento para tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th1 , caracterizado porque comprende Ia etapa de administrar a un paciente un polinucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N°:1 , 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16.
13. Un procedimiento para tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th1 , caracterizado porque comprende Ia etapa de administrar a un paciente un polinucleótido que codifica un polipéptido compuesto por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N°:3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15 y 17.
14. Un procedimiento para tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th1 , caracterizado porque comprende Ia etapa de administrar a un paciente un polinucleótido que híbrida en condiciones restrictivas con un polinucleótido que tiene una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N°:1 , 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16.
15. Un procedimiento para tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th1 , caracterizado porque comprende Ia etapa de administrar a un paciente un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida en condiciones restrictivas con a un polinucleótido que tiene una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N°:1 , 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16.
16. Un procedimiento para tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th1 , caracterizado porque comprende Ia etapa de administrar a un paciente un polinucleótido que híbrida en condiciones restrictivas con un polinucleótido que codifica un polipéptido compuesto por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N°:3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15 y 17.
17. Un procedimiento para tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th1 , caracterizado porque comprende Ia etapa de administrar a un paciente un polipéptido compuesto por una secuencia de aminoácidos como Ia expuesta en Ia SEC ID N0: 18, en Ia que X3 es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por arginina, lisina, histidina, glutamina o asparagina, y en Ia que Xn es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por serina, alanina, treonina, glicina, ácido glutámico, prolina, asparagina o ácido aspártico.
18. Un procedimiento para tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th1 , caracterizado porque comprende Ia etapa de administrar a un paciente un polinucleótido que codifica un polipéptido compuesto por una secuencia de aminoácidos como Ia expuesta en Ia SEC ID N0: 18, en Ia que X3 es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por arginina, lisina, histidina, glutamina o asparagina, y en Ia que Xn es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por serina, alanina, treonina, glicina, ácido glutámico, prolina, asparagina o ácido aspártico.
19. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-18, caracterizado porque el trastorno asociado con células Th1 se selecciona del grupo constituido por trastornos inflamatorios, trastornos inmunitarios, trastornos séptico y trastornos relacionados con el trasplante/injerto de órganos o tejidos.
20. Un procedimiento de acuerdo con Ia reivindicación 19, caracterizado porque el trastorno asociado con células Th 1 se selecciona del grupo constituido por esclerosis múltiple, pioderma gangrenoso, tireopatía, diabetes mellitus de tipo 1 insulinodependiente, tiroiditis de Hashimoto, artritis reumatoide, enfermedad de Graves, hepatitis, endotoxemia, shock séptico, encefalomielitis, uveoretinitis, endocarditis de Libman-Sacks, lupus eritematoso sistémico, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerodermia, dermato- polimiositis, granulomatosis de Wegener, síndrome de Sjogren, granulomas, liquen escleroso, sepsis, cirrosis biliar primaria, enfermedad intestinal inflamatoria , colitis crónica, enfermedad de Crohn, gastritis autoinmunitaria , endotoxemia, sepsis, rechazo de trasplante/injerto, enfermedad de injerto contra huésped.
21. Un procedimiento para tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th1 , caracterizado porque comprende Ia etapa de administrar al paciente una composición farmacéutica como en una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
22. Un procedimiento de acuerdo con Ia reivindicación 21 , caracterizado porque el trastorno asociado con células Th 1 se selecciona del grupo constituido por trastornos inflamatorios, trastornos inmunitarios, trastornos séptico y trastornos relacionados con el trasplante/injerto de órganos o tejidos.
23. Un procedimiento de Ia reivindicación 22, caracterizado porque el trastorno asociado con células Th1 se selecciona del grupo constituido por esclerosis múltiple, pioderma gangrenoso, tireopatía, diabetes mellitus de tipo 1 insulinodependiente, tiroiditis de Hashimoto, artritis reumatoide, enfermedad de Graves, hepatitis, endotoxemia, shock séptico, encefalomielitis, uveoretinitis, endocarditis de Libman-Sacks, lupus eritematoso sistémico, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerodermia, dermato-polimiositis, granulomatosis de Wegener, síndrome de Sjogren, granulomas, liquen escleroso, sepsis, cirrosis biliar primaria, enfermedad intestinal inflamatoria , colitis crónica, enfermedad de Crohn, gastritis autoinmunitaria , endotoxemia, sepsis, rechazo de trasplante/injerto, enfermedad de injerto contra huésped.
24. Un procedimiento de diagnosticar o detectar un trastorno asociado con células Th 1 , caracterizado porque comprende las etapas de:
(a) determinar el nivel de una actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en una muestra de un individual no afectado por un trastorno asociado con células Th1 ;
(b) determinar el nivel de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en un muestra de un paciente de interés; y
(c) comparar los niveles de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina entre las muestras, en el que una disminución sustancial de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en Ia muestra del paciente indica que el paciente sufre un trastorno asociado con células Th 1.
25. Un procedimiento para monitorizar el curso de un tratamiento terapéutico para un trastorno asociado con células Th1 , caracterizado porque comprende las etapas de:
(a) determinar el nivel de una actividad de células Th 1 en un paciente afectado con el trastorno asociado con células Th1 ; (b) tratar al paciente según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11-18; y
(c) determinar el nivel de Ia actividad de células Th 1 en el paciente tras el tratamiento, en el que una disminución sustancial de Ia actividad de células Th 1 tras el tratamiento indica que se reduce Ia gravedad del trastorno asociado con células Th1.
26. Un procedimiento para monitorizar el curso de un trastorno asociado con células Th1 , caracterizado porque comprende las etapas de:
(a) determinar el nivel de una actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en una muestra tomada de un paciente afectado con un trastorno asociado con células Th1 en un punto de tiempo inicial; (b) determinar el nivel de una actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en una muestra tomada del paciente en un punto de tiempo posterior; y (c) comparar los niveles de actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina entre las muestras, en el que una disminución sustancial de Ia actividad de tipo cortistatina o de Ia expresión de cortistatina en Ia muestra tomada en el punto de tiempo posterior indica que Ia gravedad del trastorno asociado con células Th 1 ha aumentado.
27. Un procedimiento para monitorizar un trastorno asociado con células Th1 , caracterizado porque comprende las etapas de:
(a) determinar el nivel de una actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en una muestra tomada de un paciente afectado por el trastorno asociado con células Th1 ; (b) determinar el nivel de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en una muestra de un individuo no afectado por un trastorno asociado con células Th1 ; (c) comparar los niveles de Ia actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina entre las muestras, en el que un nivel sustancialmente menor de Ia actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina o Ia expresión de cortistatina en Ia muestra del paciente en comparación con Ia muestra del individuo no afectado por el trastorno asociado con células Th 1 indica que Ia gravedad del trastorno asociado con células Th 1 ha aumentado.
28. Un procedimiento para pronosticar un trastorno asociado con células Th1 , caracterizado porque comprende las etapas de:
(a) determinar el nivel de una actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en una muestra de un paciente de interés en un punto de tiempo inicial;
(b) determinar el nivel de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en una muestra tomada del paciente en un punto de tiempo posterior; y
(c) comparar los niveles de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina entre las muestras, en el que una disminución sustancial de Ia actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina en Ia muestra procedente del punto de tiempo posterior indica una mayor probabilidad de que el paciente desarrolle un trastorno asociado con células Th1 o de que desarrollará una forma más grave del trastorno.
29. Un procedimiento para pronosticar un trastorno asociado con células Th1 , caracterizado porque comprende las etapas de:
(a) determinar el nivel de una actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en una muestra de un paciente de interés; (b) determinar el nivel de una actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en una muestra de un individuo no afectado con el trastorno asociado con células Th; y (c) comparar los niveles de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina entre las muestras, en el que un nivel sustancialmente menor de Ia actividad de tipo cortistatina o de expresión de cortistatina o Ia expresión de cortistatina en Ia muestra del paciente en comparación con Ia muestra del individuo no afectado por el trastorno asociado con células Th 1 indica una mayor probabilidad de que el paciente desarrolle un trastorno asociado con células Th 1 o de que desarrollará una forma más grave del trastorno.
30. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 y 26-29, caracterizado porque el trastorno asociado con células Th 1 se selecciona del grupo constituido por trastornos inflamatorios, trastornos inmunitarios, trastornos séptico y trastornos relacionados con el trasplante/injerto de órganos o tejidos.
31. Un procedimiento de acuerdo con Ia reivindicación 25, caracterizado porque el trastorno asociado con células Th 1 se selecciona del grupo constituido por trastornos inflamatorios, trastornos inmunitarios, trastornos séptico y trastornos relacionados con el trasplante/injerto de órganos o tejidos.
32. Un procedimiento de Ia reivindicación 30, caracterizado porque el trastorno asociado con células Th 1 se selecciona del grupo constituido por endotoxemia, artritis reumatoide y enfermedad intestinal inflamatoria.
33. Un procedimiento de Ia reivindicación 31 , caracterizado porque el trastorno asociado con células Th 1 se selecciona del grupo constituido por endotoxemia, artritis reumatoide y enfermedad intestinal inflamatoria.
34. Un procedimiento para identificar un compuesto capaz de tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th1 , caracterizado porque comprende las etapas de:
(a) determinar el nivel de una actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en una muestra;
(b) poner en contacto Ia muestra con un compuesto de interés; y (c) determinar si el nivel de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina aumenta en Ia muestra que se pone en contacto, en el que un incremento sustancial de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en Ia muestra que se ha puesto en contacto identifica el compuesto de interés capaz de tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th1.
35. Un procedimiento para identificar un compuesto capaz de tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th1 , caracterizado porque comprende las etapas de:
(a) obtener dos muestras;
(b) poner en contacto sólo una muestra con un compuesto de interés, dejando Ia otra muestra sin contactar; y (c) determinar si el nivel de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina aumenta en Ia muestra que se pone en contacto en comparación con Ia muestra que no se ha puesto en contacto, en el que un incremento sustancial de Ia actividad de tipo cortistatina o expresión de cortistatina en Ia muestra que se ha puesto en contacto en comparación con Ia muestra que no se ha puesto en contacto identifica el compuesto de interés como un compuesto capaz de tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th 1.
36. Un compuesto caracterizado porque se identifica según el procedimiento de Ia reivindicación 34 ó 35.
37. Un procedimiento para tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con células Th1 en un paciente, caracterizado porque comprende administrar al paciente el compuesto de Ia reivindicación 36.
38. Un procedimiento para disminuir al menos una actividad de células Th1 en células o en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a las células o al sujeto un polipéptido compuesto por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N°:3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15 y 17.
39. Un procedimiento para disminuir al menos una actividad de células Th 1 en células o en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a las células o al sujeto un polipéptido compuesto por una secuencia de aminoácidos como se expone en Ia SEC ID N0: 18, en Ia que X3 es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por arginina, lisina, histidina, glutamina o asparagina, y en Ia que Xn es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por serina, alanina, treonina, glicina, ácido glutámico, prolina, asparagina o ácido aspártico.
40. Un procedimiento para disminuir al menos una actividad de células Th1 en células o en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a las células o al sujeto un polinucleótido que tiene una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N°:1 , 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16.
41. Un procedimiento para disminuir al menos una actividad de células Th1 en células o en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a las células o al sujeto un polinucleótido que codifica un polipéptido compuesto por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N°:3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15 y 17.
42. Un procedimiento para disminuir al menos una actividad de células Th1 en células o en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a las células o al sujeto un polinucleótido que codifica un polipéptido compuesto por una secuencia de aminoácidos como Ia expuesta en Ia SEC ID N0: 18, en Ia que X3 es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por arginina, lisina, histidina, glutamina o asparagina, y en Ia que Xn es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por serina, alanina, treonina, glicina, ácido glutámico, prolina, asparagina o ácido aspártico.
43. Un procedimiento para disminuir al menos una actividad de células Th1 en células o en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a las células o al sujeto un polinucleótido que híbrida en condiciones restrictivas con un polinucleótido que tiene una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N0: 1 , 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16.
44. Un procedimiento para disminuir al menos una actividad de células Th1 en células o en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a las células o al sujeto un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida en condiciones restrictivas con un polinucleótido que tiene una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N°:1 , 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16.
45. Un procedimiento para disminuir al menos una actividad de células Th 1 en células o en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a las células o al sujeto un polinucleótido que híbrida en condiciones restrictivas con un polinucleótido que codifica un polipéptido compuesto por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N°:3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15 y 17.
46. Un procedimiento para disminuir al menos una actividad de células Th1 en un sujeto caracterizado porque comprende administrar al sujeto Ia composición farmacéutica como en una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8 y 10.
47. Un procedimiento para disminuir al menos una actividad de células Th1 en un sujeto caracterizado porque comprende administrar al sujeto Ia composición farmacéutica de Ia reivindicación 9.
48. Un procedimiento para disminuir al menos una actividad de células Th1 en un sujeto caracterizado porque comprende administrar al sujeto el compuesto de Ia reivindicación 36.
PCT/ES2007/070014 2006-01-23 2007-01-22 Composiciones y procedimientos para tratar trastornos inflamatorios e inmunitarios con cortistatina WO2007082980A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP200600193 2006-01-23
ES200600193 2006-01-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007082980A1 true WO2007082980A1 (es) 2007-07-26

Family

ID=38287301

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2007/070014 WO2007082980A1 (es) 2006-01-23 2007-01-22 Composiciones y procedimientos para tratar trastornos inflamatorios e inmunitarios con cortistatina

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2007082980A1 (es)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009033769A2 (en) * 2007-09-11 2009-03-19 Mondobiotech Laboratories Ag Use of cortistatin 14 and others as a therapeutic agent
WO2009043523A2 (en) * 2007-09-11 2009-04-09 Mondobiotech Laboratories Ag Cortistatin 17 and neuropeptide 1 for use as therapeutic agent
WO2015040089A1 (en) 2013-09-18 2015-03-26 Bcn Peptides S.A. Co rti statin analogues for the treatment of inflammatory and/or immune diseases
US9714255B2 (en) 2008-08-28 2017-07-25 President And Fellows Of Harvard College Cortistatin analogues and syntheses thereof
US9994582B2 (en) 2013-12-24 2018-06-12 President And Fellows Of Harvard College Cortistatin analogues and syntheses and uses thereof
US10273240B2 (en) 2015-05-08 2019-04-30 President And Fellows Of Harvard College Cortistatin analogues, syntheses, and uses thereof
US10273264B2 (en) 2015-07-01 2019-04-30 President And Fellows Of Harvard College Cortistatin analogues and syntheses and uses thereof
WO2020165457A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas (Csic) Cortistatin or an analogue thereof as a pharmaceutically active agent in latent form
US11285144B2 (en) * 2016-08-03 2022-03-29 The Broad Institute, Inc. Use of CDK8 inhibitors to treat diseases of inflammation and autoimmunity

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BROWN S. ET AL.: "Cortistatin modulates immune responses and is efficient in lamina propria mononuclear cells from inflammatory bowel disease (IBD) patients", ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN-GASTROENTEROLOGICAL-ASSOCIATION/DIGESTIVE-DISEASE-WEEK, vol. 128, no. 4, SUPPL. 2, 14 May 2005 (2005-05-14) - 19 May 2005 (2005-05-19), pages A501, XP003015755 *
DALM V.A. ET AL.: "Cortistatin rather than somatostatin as a potential endogenous ligand for somatostatin receptors in the human immune system", THE JOURNAL OF CLINICAL ENDOCRINOLOGY, vol. 88, no. 1, 2003, pages 270 - 276, XP003015751 *
DALM V.A. ET AL.: "Expression of somastotatin, cortistatin, and somastotatin receptors in human monocytes, macrophagues and dendritic cells", AM. J. PHYSIOL. ENDOCRINOL. METAB., vol. 285, 2003, pages E344 - E353, XP003015756 *
ELLIOT D.E. ET AL.: "Cortistatin is expressed at sites of inflammation and inhibits antigen-stimulated IFN gamma release", EXPERIMENTAL BIOLOGY 2004 MEETING/35TH INTERNATIONAL CONGRESS OF PHYSIOLOGICAL SCIENCES, FASEB JOURNAL, vol. 19, no. 4, PART 1 SUPPL. S, 31 March 2005 (2005-03-31) - 6 April 2005 (2005-04-06), pages A36 *
FERONE D.: "Potential indications for somatostatin analogues: immune system and limphoproliferative disorders", J. ENDOCRINOL. INVEST., vol. 28, no. 11, SUPPL., 2005, pages 111 - 117 *
VAYSSE N. ET AL.: "Novel therapeutic targets for somatostatin in inflammatory chronic diseases", CURRENT MEDICINAL CHEMISTRY: ANTI-INFLAMMATORY AND ANTI-ALLERGY AGENTS, vol. 4, no. 1, 2005, pages 91 - 104, XP003015757 *

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009043523A2 (en) * 2007-09-11 2009-04-09 Mondobiotech Laboratories Ag Cortistatin 17 and neuropeptide 1 for use as therapeutic agent
WO2009043523A3 (en) * 2007-09-11 2009-07-23 Mondobiotech Lab Ag Cortistatin 17 and neuropeptide 1 for use as therapeutic agent
WO2009033769A3 (en) * 2007-09-11 2009-07-30 Mondobiotech Lab Ag Use of cortistatin 14 and others as a therapeutic agent
WO2009033769A2 (en) * 2007-09-11 2009-03-19 Mondobiotech Laboratories Ag Use of cortistatin 14 and others as a therapeutic agent
US9714255B2 (en) 2008-08-28 2017-07-25 President And Fellows Of Harvard College Cortistatin analogues and syntheses thereof
US10202400B2 (en) 2008-08-28 2019-02-12 President And Fellows Of Harvard College Cortistatin analogues and syntheses thereof
CN105579467B (zh) * 2013-09-18 2021-03-09 Bcn肽类股份有限公司 用于治疗炎性疾病和/或免疫疾病的皮质抑素类似物
WO2015040089A1 (en) 2013-09-18 2015-03-26 Bcn Peptides S.A. Co rti statin analogues for the treatment of inflammatory and/or immune diseases
CN105579467A (zh) * 2013-09-18 2016-05-11 Bcn肽类股份有限公司 用于治疗炎性疾病和/或免疫疾病的皮质抑素类似物
JP2016535760A (ja) * 2013-09-18 2016-11-17 ビーシーエヌ ペプタイズ エセ．ア．Ｂｃｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｓ．Ａ． 炎症性疾患および／または免疫疾患の治療のためのコルチスタチンアナログ
RU2678315C2 (ru) * 2013-09-18 2019-01-28 БКН Пептидес С.А. Аналоги кортистатина для лечения воспалительных и/или иммунопатологических заболеваний
US9994582B2 (en) 2013-12-24 2018-06-12 President And Fellows Of Harvard College Cortistatin analogues and syntheses and uses thereof
US10273241B2 (en) 2013-12-24 2019-04-30 President And Fellows Of Harvard College Cortistatin analogues and syntheses and uses thereof
US10508121B2 (en) 2013-12-24 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Cortistatin analogues and syntheses and uses thereof
US10273240B2 (en) 2015-05-08 2019-04-30 President And Fellows Of Harvard College Cortistatin analogues, syntheses, and uses thereof
US10273264B2 (en) 2015-07-01 2019-04-30 President And Fellows Of Harvard College Cortistatin analogues and syntheses and uses thereof
US11285144B2 (en) * 2016-08-03 2022-03-29 The Broad Institute, Inc. Use of CDK8 inhibitors to treat diseases of inflammation and autoimmunity
WO2020165457A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas (Csic) Cortistatin or an analogue thereof as a pharmaceutically active agent in latent form

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2007082980A1 (es) Composiciones y procedimientos para tratar trastornos inflamatorios e inmunitarios con cortistatina
JP6675394B2 (ja) 疾患及び障害の治療のためにインターロイキン−１０を使用する方法
EP2864360B1 (en) Targeted therapeutics
RU2679889C2 (ru) Способы применения интерлейкина-10 для лечения заболеваний и расстройств
AU2003256603B2 (en) Therapies for renal failure using interferon-Beta
ES2690147T3 (es) Apelina pegilada y usos de la misma
ES2863410T3 (es) Métodos para prevenir o tratar ciertos trastornos mediante la inhibición de la unión de IL-4 y/o IL-13 a sus respectivos receptores.
US20080269137A1 (en) Compositions and methods for modulating the immune system
EP3065765B1 (en) Use of il-22 dimers in manufacture of medicaments for treating pancreatitis
US10363306B2 (en) Cytokines and neuroantigens for treatment of immune disorders
MXPA05002219A (es) Composiciones y metodos para tratar una enfermedad cardiovascular.
JP2013527834A (ja) 抗炎症因子
JP6858305B2 (ja) 関節リウマチを予防及び治療するための薬物の製造における選択性ｔｎｆｒ１拮抗ペプチドの使用
JP2018524299A (ja) 免疫応答を調節するための方法およびポリペプチド
JP2020511415A (ja) 線維症の処置のためのインターフェロン−ラムダの医学的使用
US20150025022A1 (en) Novel il-17r-ecd mutants
WO2020036987A1 (en) Peptides and compositions for targeted treatment and imaging
JP2009521503A (ja) インターロイキン−２２結合タンパク質に対する抗体と、代謝性疾患の処置のためのその使用
EP1663294B1 (en) Treatment of fibrotic disease
Geng et al. Monocytes reprogrammed by 4-PBA potently contribute to the resolution of inflammation and atherosclerosis
AU2014324094A1 (en) Modified anti-inflammatory proteins and method of use
KR20230097094A (ko) 질환의 치료를 위한 융합 단백질
WO2022011284A1 (en) Epidermal growth factor-like 7 peptide and uses thereof
CN117794562A (zh) ActRII蛋白及其用途
Roeleveld et al. Systemic IL-22 overexpression induces SOCS3 expression and potently attenuates collagen-induced arthritis

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 07704774

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1