WO2007082737A1 - Mikrofluidisches system und zugehöriges betriebsverfahren - Google Patents

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WO2007082737A1
WO2007082737A1 PCT/EP2007/000389 EP2007000389W WO2007082737A1 WO 2007082737 A1 WO2007082737 A1 WO 2007082737A1 EP 2007000389 W EP2007000389 W EP 2007000389W WO 2007082737 A1 WO2007082737 A1 WO 2007082737A1
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microfluidic system
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field
feldkafige
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PCT/EP2007/000389
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Torsten Müller
Thomas Schnelle
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Evotec Technologies Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
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    • B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
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    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0421—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic electrophoretic flow

Definitions

  • the invention relates to an operating method for a microfluidic system and a correspondingly configured microfluidic system according to the dependent claims.
  • Microfluidic systems with dielectrophoretic electrode arrangements for the manipulation of suspended particles are known, for example, from Muller, T. et al. : "A 3D micro-electrode for handling and caging smgle cells and particels", Biosensors and Bioelectronics 14, 247-256 (1999).
  • the dielectrophoretic electrode arrangements may, for example, be field cages ("cages") for fixing the suspended particles.
  • the conventional micro fluidic systems enable a targeted investigation of suspended particles by being rolled into the microfluidic system and fixed in a field cage. In the fixed state, the suspended particles can then be examined for example by impedance spectroscopy or optically.
  • a disadvantage of the known micro-fluidic systems described above is the fact that the particles of interest in each case can only be examined individually. In contrast, it is often desirable to investigate the chemical or biochemical interaction between different particles, which is possible only with great effort with the conventional microfluidic systems. For example, there is an interest in studying the differentiation of stem cells or immune cells depending on one certain cell stimulation by chemical or trigger substances. Another example is the monitoring of cell-cell interactions.
  • the invention is therefore based on the object to improve the known microfluidic systems to the effect that the interaction of different particles can be examined. Furthermore, the object of the invention is to specify a corresponding operating method for a micro-fluidic system.
  • the invention comprises the general technical teaching of loading the field cage in a microfluidic system successively with particles of different particle types, so that subsequently at least one of the field-cage particles of different particle types is located, which enables a particle-specific interaction of the different particle types.
  • the invention thus enables a targeted investigation of the interaction between different particles with which the field cages are loaded, which is of interest, for example, in pharmaceutical research.
  • a variety of particle-particle interactions can be studied to determine, for example, pharmacologically active substances.
  • the invention makes it possible to selectively stimulate particles with specific trigger substances in order to trigger a reaction, which is known, for example, in stem cell research.
  • the field cages can excite certain trigger substances to reach and observe a particular cell differentiation.
  • the individual Feldkafige be selectively loaded with the particles of a first type of particle by the individual Feldkafige selectively be electrically energized during loading.
  • the selective electrical control of the individual Feldkafige here can act repulsive, so that the affected Feldkafige repel the insufflated particles and thereby prevent loading of the affected Feldkafige with the respective particle.
  • the alternative there is also the alternative
  • the suspended particles After loading the field cages with the suspended particles, the suspended particles preferably adhere to the respective field cages, i. the particles stick in the
  • adhesion is used here in a general sense and encompasses both the actual active process of living cells and passive attachment, which can occur both in living cells and in other particles.
  • Adhering of the particles in the field cage is, however, not absolutely necessary in the context of the invention. Rather, it is u.U. also when the suspended particles are held in the respective Feldkafig by negative dielectrophoresis just above the channel wall of the carrier flow channel.
  • the adhe- vated particles in the field cages can then be removed again by introducing a surface-liberating substance into the microfluidic system.
  • the superficial substance for releasing the adhdated particles can, for example, act enzymatically. Examples of such surface-sparing substances are trypsin, verses, Accumax, Accutase or chelate images, in particular EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid).
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the surface-flattening substance preferably changes the surface tension of the carrier fluid and thereby causes the detachment of the adhdated particles.
  • the invention is not limited to the above examples with regard to the surface-liberating substance, but can in principle also be realized with other substances.
  • the surface-liberating substance is then preferably ejected from the microfluidic system after an exposure time, wherein the detached particles are fixed in the field cages by an electrical control of the field cages and therefore are not initially unrolled.
  • the detachment of the adhdated particles can be achieved by a temperature change of the adhesive surface (eg of the carrier flow channel), whereby the adhesive surface changes its surface property due to the temperature change, for example from hydrophilic to hydrophobic or vice versa Resistance heating) or cooling (eg by means of Peltier elements) are effected, which are integrated into the microfluidic system.
  • the already mentioned above loading the Feldkafige with the particles of the second particle type is preferably carried out by the individual Feldkafige selectively be electrically energized during loading to either repel or attract the particles.
  • the Feldkafige be controlled for loading with the particles of the second particle type so that flow vortices arise, which claim the particles of the second particle type in the Feldkafige.
  • certain particles can then be selected in the associated field cages.
  • the selected particles are preferably the particles with which the Feldkafige first were loaded.
  • the selected particles it is alternatively also possible for the selected particles to be the Pa. delt, with which the Feldkafige were last loaded.
  • the particles of the different types of particles can undergo a reaction, which can lead to a permanent connection of the particles, for example.
  • the one particle is a stem cell
  • this stem cell may undergo certain cell differentiation due to the interaction with the other particle.
  • the invention enables a real-time observation or a real-time investigation of the process of cell differentiation. The selection can then be made depending on whether and, if appropriate, how the cell differentiation takes place.
  • the particles selected in this way can then be removed from the microfluidic system, for example by unwinding the particles.
  • negative dielectrophoresis is used for selective loading of the field cage.
  • negative dielectrophoresis generally repels the particles.
  • particles that are close enough, preferably only one particle reach the potential minimum of the field cage, with the other particles experiencing only the repulsive forces. If the particles, cells brought close enough to the channel / Gefubbwand, they adharieren. A once adhdated cell is stable bound independently of the field and can only be discharged by "Losesch".
  • a second particle preferably reaches the first particle by switching off the field. If the field remains switched on, the repulsive forces predominate and the second particle does not get into the field cage.
  • the Feldkafige can thus be controlled so that the particles are taken up by means of negative di- electrophoresis of the Feldkafigen.
  • the Feldkafige to be loaded are then turned on while loading, while the other Feldkafige can be switched off.
  • the particles are attracted to the Feldkafigen by means of positive dielectrophoresis.
  • the particles are deposited on the edge of the ring electrodes.
  • a punctiform electrode is arranged within the ring electrodes, e.g. in the middle of the ring structure.
  • the Feldkafige for selective loading are controlled so that the suspended particles are repelled by dielectrophoresis selectively from the Feldkafigen.
  • the field cages to be loaded can then be switched off during loading, while the other field cages are switched on and then act repulsively.
  • both the Feldkafige to be loaded are electrically controlled and the Feldkafige that should not be loaded.
  • the Feldkafig to be loaded are then controlled so that the particles are attracted.
  • the other field cages are controlled repulsively, so that the particles are repelled.
  • the speed of the individual field cells in the Belac particles of the second particle type is controlled to be different and / or different, so that a gradient of the particles of the second particle type is formed between the field cages.
  • any spatial concentration distributions of the particles of the second particle type can be achieved within the microfluidic system.
  • the invention is not limited to a loading of the individual Feldkafige with particles of two different particle types. Rather, it is within the scope of the invention also the possibility that the individual Feldkafige be loaded with more than two particles or with particles of more than two types of particles. Thus, the loading of the field cages with three different particles allows an investigation of the interaction between these three particles.
  • the possibility of marking the suspended particles for example by a fluorescent label or by a radioactive label. This advantageously facilitates the tracking of the particle reactions or of the particles themselves.
  • both the particles of the first particle type and the particles of the second particle type can be very different particles.
  • examples include biological cells, stem cells and immune cells.
  • the particles are magnetic or magnetizable particles, in particular particles with a magnetic or magnetizable core.
  • Particles also antigens, antibodies, hormones, Vir * technically modified viruses in question.
  • the particles to be examined within the scope of the invention may also be biological cells, macromolecules, in particular immunoglobulin, particles with a coated target substance in the particle interior, eg RNA, siRNA, DNA, or particles which have a target structure on their particle surface , in particular in the form of molecules, such as biological cells, stem cells or nanostructures.
  • biological cells macromolecules, in particular immunoglobulin, particles with a coated target substance in the particle interior, eg RNA, siRNA, DNA, or particles which have a target structure on their particle surface , in particular in the form of molecules, such as biological cells, stem cells or nanostructures.
  • the particles are 2-phase systems, such as, for example, droplets.
  • 2-phase systems may comprise an aqueous phase and an oil phase, or an oil phase and a water phase or phase, and a solvent phase, wherein the solvent may be, for example, perfluorotripentylamine (FC70).
  • FC70 perfluorotripentylamine
  • a two-phase system may have a gas phase and a water phase.
  • a particle consists of several areas / phases (inhomogeneous).
  • a cell could be in a drop of aqueous medium, which in turn is suspended in, for example, FC70.
  • Application can find this system in combinatorial chemistry and for setting (in the array of different) defined concentrations.
  • a drop of an aqueous medium is caught in an FC70 solution in Feldkafig and then loaded with other known droplets in which a chemical substance (compound) is dissolved in a known concentration. After the merger, the chemical substance is well-known in the now trapped drop dilute concentration.
  • These drops can be fused elsewhere in the chip with another drop containing one cell. This can be used for kinetics studies, for example for IC 50 determination.
  • the invention is not limited to the above particle types with respect to the particles to be used, but in principle also with other types of particles feasible.
  • the invention makes it possible to study an interaction of any desired combinations of the above-mentioned particle types.
  • the first particles of the first type of particle which have been wound in first are larger than the particles of the second particle type which are subsequently injected.
  • the first particles of the first particle type, which are first injected it is also possible within the scope of the invention for the first particles of the first particle type, which are first injected, to be smaller than the subsequently wetted particles of the second particle type.
  • the particles of the different particle types are the same size.
  • the possibility that the particles of the different types of particles are moved by magnetic forces relative to each other.
  • the particles of the different particle types can be moved toward each other by the magnetic forces during loading of the field cages so that the field cages are loaded with particles of different particle types.
  • the particles of the different particle types are affected by the magnetic forces during the unwinding of the particles. from the microfluidic system.
  • the magnetic forces during loading of the field cage are set lower than the dielectrophoretic forces of the field cage, so that the dielectrophoretic forces generated by the field cage dominate via the external magnetic forces.
  • the magnetic forces during the unwinding of the particles from the microfluidic system to be set lower than the binding forces between the particles of the types of particles that have been shown.
  • this examination can be carried out by means of measuring electrodes which, for example, carry out an impedance spectroscopic examination.
  • the suspended particles can be deposited directly on the measuring electrodes, which is particularly advantageous in the case of the so-called patch-clamp technique.
  • the measuring electrodes are preferably set at the frequency of the capture field to a potential level that corresponds to the potential level that would prevail even without the measuring electrodes in their place.
  • the settling of the particles to be examined directly on the measuring electrodes offers the advantage that electrical measurements can be carried out much more sensitively.
  • the measuring electrodes can be used within the scope of the invention manipulation electrodes, beisp particle fusion, cell-cell fusion or for particle cultivation.
  • the field cages are not electrically activated during the examination, in order to avoid a falsification of the electrical examination by the control of the field cages.
  • the capture field is switched off while the measurement field is switched on.
  • the invention relates not only to the operating method described above for a micro-fluidic system, but also to a correspondingly designed microfluidic system itself.
  • microfluidic system is to be understood generally and not limited to microfluidic systems, which are integrated ⁇ chip, having a closed support: and having leads and output leads. Rather, the term of a microfluidic system also includes a flat or curved plate on which at least one Feldkafig is arranged. Another example of a microfluidic system in the sense according to the invention is a (micron) titer plate.
  • the loading of the individual Feldkafige can also be done by pipetting, so that the Trager- power supply is formed by a pipetting device.
  • the microfluidic system according to the invention preferably provides a carrier flow channel as a carrier current feed, via which a carrier flow with particles suspended therein can be supplied.
  • a carrier flow channel as a carrier current feed, via which a carrier flow with particles suspended therein can be supplied.
  • the term of a Tragerstromkanals used in the invention is to be understood in general and not limited to narrow channels with a polygonal cross-section. Rather, the carrier flow channel can also have a flat extension, so that a plurality of FeId- kafigen can be arranged in the Tragerstromkanal in a common plane.
  • the microfluidic system has a plurality of dielectric field cages, which are arranged spatially separated from one another in the carrier flow channel and either fix or repel the suspended particles as a function of their electrical activation. By means of a corresponding electrical activation of the field cage, these can then be loaded selectively with the particles of the different particle types.
  • the individual field cages can be, for example, three-dimensional, as described in the publication cited above. Muller T. et al .: "A 3D microelectrode and caging single cells and particles" described that the content of this publication is fully within the scope of the present description with respect to the structural design and operation of the field cages.
  • the individual Feldkafige thus each have eight Kafigelektroden, which are arranged cubic.
  • the microfluidic system according to the invention can have at least one auxiliary electrode arrangement, which is arranged in the carrier flow channel upstream or downstream behind at least one of the field cages for the fixation or repulsion of the particles.
  • auxiliary electrodes may, for example, be funnel-shaped
  • the individual Feldkafige are arranged on a carrier, which is for example plate-shaped.
  • the carrier consists essentially of glass, ceramic, a semiconductor, in particular silicon, or of plastic. 1, however, is not limited to the materials mentioned above with regard to the material for the wearer, but can also be realized with other materials.
  • the carrier for the Feldkafige this forms boundary surfaces for the Tragerstromkanal.
  • the electrodes of the individual Feldkafige may be attached to the upper and lower channel wall of the Tragerstromkanals.
  • the electrodes of the Feldkafige are attached to the opposite side channel walls of the Tragerstromkanals, wherein the spatial orientation data refer to the gravitational field of the earth.
  • the individual Feldkafige each annular and / or closed, wherein the Feldkafige downstream may have a weakening, which may for example consist of a passivation layer, which is known per se.
  • the passivation layer then allows the coupling-out of the capture field for the fixation of the suspended particles, whereas the passivation layer has a shielding effect for measurement signals (for example DC measurement signals or low-frequency measurement signals as in patch clamp measurements or membrane impedance measurements).
  • the field cells may have electrodes that are curved in the opposite direction to the direction of flow.
  • the electrodes of the Feldkafige each semicircular or arcuate, the electrode ends facing the direction of flow.
  • the individual Feldkafige matri rows and columns are arranged, which can be selectively controlled individually preferably by row control lines and column control lines.
  • Such a matrix-like arrangement of a multiplicity of field cages is described, for example, in German Patent Application 10 2006 002 462, so that the content of this patent application is to be fully added to the present description with regard to the matrix-like arrangement of the field cages.
  • the microfluidic system has connection contacts which enable a detachable electrical connection of the field cage with a separate driver circuit (generator).
  • a releasable electrical contact can be realized by spring contacts.
  • the Feldkafige an outer ring electrode and an inner ring electrode, wherein the outer ring electrode, the inner ring electrode preferably concentrically surrounds.
  • the two ring electrodes can each be planar. In this case, there is the possibility that the planar ring electrodes are arranged in a common electrode plane. However, it is alternatively possible for the planar ring electrodes to be arranged in parallel but mutually offset electrode planes.
  • At least one measuring electrode is arranged within the inner ring electrode in order to measure the particles fixed in the field cage.
  • the individual measuring electrodes can optionally be round, in particular o-val, or angular, in particular rectangular.
  • the arrangement of the measuring electrodes within the ring electrodes offers the advantage that the dielectrophoretic barrier is reduced upwards and thus facilitates the capture of particles from the carrier flow, in particular when the particles are heavier than the carrier fluid, which is typical in biological cells.
  • the use of at least one internal electrode enables the process of catching and loading in a non-adsorbed state, which is advantageous for suspension cells such as blood cells. The whole works with only one inner electrode
  • Rmg-Rmg-Dot structure If settling onto the substrate is necessary or desirable, it is preferably set to the potential at which the electrode area would, on average, even without an internal electrode, be in switched ring electrodes. Measurements or manipulations can then take place between the central electrode and the inner ring electrode. Another advantage of the internal electrode is that both positive and negative dielectrophoresis can be used. For pDEP Positiomerung about a field of appropriate frequency between the central electrode and the inner and / or outer ring is switched.
  • the ring electrodes may have a passivation layer, wherein the passivation layer is preferably formed so strongly that the passivation layer allows a coupling out of an electric field for particle fixation, whereas the passivation layer for shielding direct current signals and low-frequency signals.
  • the fixation of the individual particles in the field can be additionally supported by negative pressure.
  • the microfluidic system has a vacuum connection which emits in a flexible cage in order to additionally fix the particles located there.
  • the vacuum connection can also be located between the two measuring electrodes in order to fix the particles there for a measurement.
  • the measuring electrodes in the field cage can be arranged either symmetrically or asymmetrically.
  • FIG. 1A is a plan view of a field cage of a microfluidic system according to the invention.
  • FIG. 1B shows a cross-sectional view through the field cage according to FIG. 1A along the line A-A
  • FIG. 2A shows a microfluidic system according to the invention with a plurality of field cells during a selective loading with particles, wherein one field cage is loaded with particles, while the other field cage repulses the inserted particles
  • FIG. 2B shows the microfluidic system according to the loading of the field cages
  • FIG. 3A shows an alternative exemplary embodiment of a microfluidic system according to the invention, in which the loading of the field cage is effected from above,
  • FIG. 3B shows the microfluidic system according to FIG. 3B after the loading
  • FIG. 4A shows an alternative exemplary embodiment of a field cage for use in a microfluidic system according to the invention
  • FIG. 4B shows a cross-sectional view of the field cage according to FIG. AA along the line A-A
  • FIG. 5 shows a matrix-like arrangement of a plurality of field cages in a microfluidic system according to the invention
  • FIG. 6A shows a plan view of an alternative embodiment of a field cage for use in a microfluidic system according to the invention
  • FIG. 6B shows a cross-sectional view of the field cage according to FIG. 6A along the lines A-A,
  • FIG. 7A, 7B show the method according to the invention for a microfluidic system in the form of a flow chart
  • 8 shows an alternative embodiment of a field cage according to the invention with coplanar ring electrodes and two measuring electrodes inside the inner ring electrode
  • FIG. 8 shows an alternative embodiment of a field cage according to the invention with coplanar ring electrodes and two measuring electrodes inside the inner ring electrode
  • FIG. 9A shows the field distribution E 2 in the field cage according to FIG. 9A
  • FIG. 8 in the sectional plane A-A, wherein the inner ring electrode and the outer ring electrode are driven in opposite directions with the same voltage while the measuring electrodes are grounded, FIG.
  • FIGS. 10A-10C show a perspective view of a field cage with eight cage electrodes, wherein the capture field is modified for loading with the particles of the second particle type, as well as FIGS. 10A-10C
  • Figures 11A-11C is a perspective view of a Feldkafigs with eight Kafigelektroden, wherein for loading with the particles of the second Parti- keltyps Stromungswirbel be generated.
  • FIGS. 1A and 1B show an exemplary embodiment of a dielectrophoretic field cage 1 which can be used in a microfluidic system according to the invention, such as it is shown for example in Figures 2A and 2B and 3B.
  • the Feldkafig 1 has in this exemplary embodiment, two planar ring electrodes 2, 3, which are arranged coplanar in a common electrode plane, as can be seen from the cross-sectional view in Figure IB.
  • the two ring electrodes 2, 3 are in this case arranged concentrically on a plate-shaped carrier 4 made of glass and can be actuated electrically independently of each other.
  • a particle 5 shown here only schematically can enter the field box 1 by means of negative dielectrophoresis and be fixed in the field cage 1, the particle 5 adhering to the carrier 4 in the fixed state. ren and then after a shutdown of Feldkafigs 1 sticks to the carrier 4.
  • the Feldkafig 1 can, however, also be controlled electrically such that the particle 5 is repelled by the Feldkafig 1 by means of dielectrophoresis, whereby a loading of the Feldkafigs 1 with the particle 5 and thereby also adharie ren of the particle 5 inside the inner ring electrode 3 prevented becomes.
  • Selective activation of the field cage 1 thus makes it possible, within the inventive microfluidic system described below, optionally to load the field cage 1 with the particle 5 or to repel the particle 5 in order to prevent the field cage 1 from being loaded with the particle 5.
  • FIGS 2A and 2B show detail of a Inventions geaireses microfluidic system with a plurality of cages FeId- 1 ', l' 1 corresponding to the figures IA and IB, in which For the sake of simplicity, only two of the drawings I 1 , I 1 'are shown in the drawings.
  • the carrier 4 in this case runs a Tragerstromkanal through which flows in the direction of arrow Tragerstrom with particles 6 suspended therein.
  • FIG. 2A shows a state of the microfluidic system in which the particles 5 are already fixed in the two field cage 1 'and I 1 ' and adhere to the carrier 4 there.
  • the right field cage 1 "is electrically driven in this state in such a way that it repels the particles 6 by means of dielectrophoresis in order to prevent the particles 6 from attaching to the particles 5.
  • the two particles 5, 6 in this case belong to different particle types.
  • the particle 5 is a biological cell, while the particles 6 are viruses that act on the particles 5.
  • FIG. 2B shows a state in which the two field boxes I 1 , I ' 1 are switched off.
  • the particles 5 then remain adhered to the carrier 4 and can later be dissolved with an upper flattening substance such as trypsin and let out of the microfluidic system.
  • the particles 5 are then examined with the particles 6 deposited there in order to investigate the interaction between the particles 5, 6.
  • particles 5 could be selectively extracted and reused.
  • FIGS. 3A and 3B show an alternative exemplary embodiment of a microfluidic system according to the invention, which largely corresponds to the exemplary embodiment described above and illustrated in FIGS. 2A and 2B, so that reference is made to the above description to avoid repetition, with corresponding references being made Parts the same reference numerals are used.
  • a special feature of this exemplary embodiment is that the loading of the Feldkafige I 1 and l ' 1 is not parallel to the electrode plane, ie parallel to the carrier 4, but at right angles thereto parallel to gravity, as illustrated by the drawn direction of gravity g.
  • FIG. 3B shows a state of the microfluidic system according to the invention after loading when the two field batteries 1 'and I 1 ' are switched off.
  • a multiplicity of the particles 6 has then deposited, which applies in particular to the interior of the field cage 1', where the particles 5, 6 directly adjoin one another. which adjoin so that their interaction can take place.
  • the individual particles 5 can thus be brought together specifically with certain particles 6 in order to investigate their interaction.
  • FIGS. 4A and 4B show an alternative exemplary embodiment of a field cage for use in the microfluidic system according to the invention. This embodiment is partly in accordance with the exemplary embodiments of a field cage described above and shown in FIGS. 1A and 1B, so that reference is made to the above description to avoid repetition, the same reference numerals being used for corresponding components.
  • a special feature of this exemplary embodiment is that the ring electrodes 2, 3 are not closed annularly, but only semicircular, wherein the two semicircular ring electrodes 2, 3 are curved against the flow direction.
  • Figure 5 shows a matrixformige arrangement of a plurality of Feldkafige 1 according to Figures 4A and 4B, wherein the individual Feldkafige 1 can be selectively controlled by a plurality of column control lines 7 and a plurality of row control lines 8.
  • the column control lines 7 are in each case with the inner ring electrode 3 of the Feldkafige 1 of the column concerned, line control lines 8 are each connected to the outer de 2 of the field cages 1 of the relevant row.
  • the procedure is, for example, as follows.
  • Cells are wound from the left by means of a flow.
  • the column control line 7 and the row control lines 8 are grounded except for the column control lines 6 having the indices imax and imax-1.
  • the next two columns (imax-2) and (imax-3) are subsequently activated by additional activation of the column control lines 7 filled with the indices (imax-2) and (imax-3).
  • This process can be continued column-by-column until the array is completely filled and has the advantage that the upstream structures do not hinder the loading of the downstream ones.
  • Loading with the second particles takes place by means of flow from the right, wherein all column and row control lines 7, 8 (for example, inverse phase) are activated except for the cells to be loaded (1, M), the column and row control lines 6, 7 (1, M) are grounded.
  • the optional detachment of target cells is carried out by an analog control by means of a flow over a transverse channel. It is particularly advantageous if the base electrode structure has been produced as shown in FIG. 1, but has been provided on one side with a passivation layer which, at a sufficiently low frequency, corresponds dielectrically to the structure according to FIG. Then one became the initial loading with cells, for example with the lower frequency, the targeted triggering and the discharge of the target cells with d ⁇ the cells can then be discharged in the channel direction (to or from the left).
  • FIGS. 6A and 6B show an alternative exemplary embodiment of a field cage 1 for use in a microfluidic system according to the invention. This embodiment is partly in accordance with the embodiment described above and shown in Figures IA and IB, so that reference is made to avoid repetition of the above description, wherein the same reference numerals are used for corresponding parts.
  • a special feature of this exemplary embodiment is that the field cage 1 does not have the outer ring electrode 2, as is the case in the exemplary embodiment according to FIGS. 1A and 1B.
  • the field cage 1 in this exemplary embodiment has a funnel-shaped electrode arrangement 9 ("funnel") upstream of the field cage, through which the particles 5 are directed into the field cage 1 in a targeted manner.
  • the inner ring electrode 3 is not closed, but is open on its upstream side and merges into the funnel-shaped electrode assembly 9.
  • a Tra biological cells suspended therein are fed into the visible system.
  • the individual FeId- kafige are then loaded in the microfluidic system with the cells insisted by the individual Feldkafige be selectively controlled.
  • the field cages which are to be loaded with the insulatated cells, are for this purpose controlled so that the cells are fixed by means of negative dielectrophoresis.
  • the other field cages, which are not to be loaded with the biological cells, are electrically controlled so that the biological cells are rejected by negative dielectrophoresis.
  • step S3 the biological cells then adhere to the previously selectively loaded field cages, so that the adha ⁇ erten cells not loose after a subsequent shutdown of the individual Feldkafige, but remain in the loaded Feldkafigen.
  • triggering particles for example antigens are then fed into the carrier flow channel of the microfluidic system.
  • the Feldkafige are then loaded m in a further step S5 selectively with the trigger particles, which by a speaking selective electrical control of the means of positive or negative Dielektrophores is.
  • the individual Feldkafige be loaded with both biological cells and with trigger particles, the interaction between the first zugechtten cells and the subsequent zugeschreibten trigger particles in a further step S6 is examined, which can be done for example by optical or impedance spectroscopy. However, the examination can also be carried out by a patch clamp measurement or by a direct current measurement.
  • step S7 specific cells are then selected as a function of the investigation of the interaction between the biological cells and the added trigger particles.
  • the cells loaded in the field cage can be dissolved by application of a surface-insoluble substance (for example trypsin), in which case a sufficient exposure time of the surface-opacifying substance is awaited in a step S9.
  • a surface-insoluble substance for example trypsin
  • the cells loaded in the field cage cells are then fixed to the field cage again in a step S1O, in order to prevent the cells from being unwound by the carrier current.
  • the Feldkafige be electrically controlled in a suitable manner.
  • a further step Sil the previously added surface-liberating substance is then ejected from the microfluidic system with simultaneous fixation of the cells in the field cages.
  • specific field cages which contain the previously selected cells are then switched off in a selective manner. This selective deactivation of the field cage causes the cells contained therein to be reeled out of the microfluidic system by the carrier current in a further step S13, while the other cells remain fixed in the still connected other field cage.
  • the cells are selectively ejected from the microfluidic system, which have previously shown a certain interaction with the carrier substance.
  • a last step S14 the cells selected and extracted in this way are then collected outside the microfluidic system for further use.
  • the microfluidic system has further channels and the particles are first subjected to manipulation (for example sorting) before the particles are then collected.
  • FIG. 8 shows a further exemplary embodiment of a field box for use in the microfluidic system according to the invention.
  • This exemplary embodiment is largely identical to that described above and shown in Figures IA and IB Darge ⁇ presented exemplary embodiment uberein, so reference is made to avoid repetition of the foregoing description, reference numerals are used for corresponding parts the same reference numerals.
  • a special feature of this exemplary embodiment is that within the inner ring electrode 3, two measuring electrodes The or manipulation electrodes 10, 11 angeordni an impedance spectroscopic examination of i inner ring electrode 3 adharwholesome particles 5 and 6 allow.
  • manipulation electrodes 10, 11 allow cell fusion.
  • one of the two manipulation electrodes 10, 11 is held to ground, while the other manipulation electrode 10 or 11 is acted upon by short DC or AC pulses.
  • the two measuring electrodes 10, 11 are arranged symmetrically on the opposite side of the middle point of the field box 1.
  • the Feldkafig 1 in this exemplary embodiment an intake opening 12, via which in the Feldkafig 1, a negative pressure can be generated, which sucks the particles 5 and 6 and thereby supports the loading of Feldkafigs 1 with the particles 5 and ⁇ .
  • the Ansaugo réelle 12 is in this case arranged between the two measuring electrodes 10, 11, so that the particles 5, 6 are fixed in the loading of Feldkafigs 1 between the two measuring electrodes 11, 12, which is advantageous for a subsequent measurement.
  • FIG. 9A shows the field distribution E 2 within the field cage 1 according to FIG. 8, wherein the inner ring electrode 3 and the outer ring electrode 2 are driven with opposite-phase electrical signals of the same voltage U, while the two measuring electrodes 10, 11 are grounded.
  • FIG. 9B shows the field distribution E 2 in the field cage 1 according to FIG. 8, wherein the inner ring electrode 3 and the outer ring electrode 2 are connected in phase opposition with the same voltage U. be controlled while the two Meßelektroi are driven in phase with the inner ring electrode 3 with Vietnamese of 0.26 "U.
  • FIGS. 10A to 10C show an alternative exemplary embodiment of a field cage 13, which is arranged in a microfluidic system according to the invention and is impinged by a carrier flow in the direction of the arrow.
  • the field cage 13 has eight cage electrodes 14, with the cage electrodes 14 being arranged cubically, as described, for example, in Muller, T. et al .: "A 3D microelectrode for handling and caging single cells and particles", biosensors and Bioelectronics 14, 247-256 (1999).
  • the Kafigelektroden 14, whose electrical control is modified, for example, by switching off, attenuation or control with a changed phase position are reproduced without hatching, while the Kafigelektroden 14 whose drive remains unchanged, here are shown hatched.
  • FIG. 10A shows the state after the loading of the field cage 13 with a particle 15 of a first particle type.
  • the Feldkafig 13 generates a trapping field, which fixes the particle 15 in the Feldkafig 13 and hold other particles 16 of a second particle type outside the Feldkafigs 13.
  • FIG. 10B shows the loading of the field cage 13 with the particles 16 by modifying the activation of the upstream cage electrodes so that the particles 16 of FIG can be the carrier flow in the direction of arrow in the Feldkafii.
  • FIG. 10C shows a state in which the various particles 15, 16 are fixed together in the field cage 13 by a capture field in order, for example, to investigate the interaction between the particles 15, 16.
  • FIGS. 11A to 11C show an alternative control of the field cage 13 for loading with the particles 16.
  • the cage electrodes 14 are activated in accordance with the loading of the particle 15 shown in FIG Figure HB is shown and described for example in WO 2005/110605 Al.
  • These turbulences then carry the particles 16 into the field cage 13, where they are finally fixed together with the particle 15 by a conventional trapping field, as shown in Figure HC.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Betriebsverfahren für ein mikrofluidisches System, mit folgenden Schritten: Zuführen eines Trägerstroms mit darin suspendierten Partikeln (5) eines ersten Partikeltyps in das mikrofluidische System; Beladen von mehreren elektrischen Feldkäfigen (1', 1'') in dem mikrofluidischen System mit den zugeführten Partikeln (5) des ersten Partikeltyps; Zuführen eines Trägerstroms mit darin suspendierten Partikeln (6) eines zweiten Partikeltyps in das mikrofluidische System; sowie Beladen der Feldkäfige (1', 1'') in dem mikrofluidischen System mit den zugeführten Partikeln (6) des zweiten Partikeltyps, so dass sich in mindestens einem der Feldkafige (1', 1'') ein Partikel (5) des ersten Partikeltyps und ein Partikel (6) des zweiten Partikeltyps befindet. Weiterhin umfasst die Erfindung ein entsprechendes mikrofluidisches System.

Description

BESCHREIBUNG
Mxkrofluidisches System und zugehöriges Betriebsverfahren
Die Erfindung betrifft ein Betriebsverfahren für ein mikrofluidisches System und ein entsprechend ausgestaltetes mikrofluidisches System gemäß den Nebenanspruchen.
Mikrofluidische Systeme mit dielektrophoretischen Elektrodenanordnungen zur Manipulation von suspendierten Partikeln sind beispielsweise bekannt aus Muller, T. et al . : "A 3D-Micro- electrode for handling and caging smgle cells and partic- les", Biosensors and Bioelectronics 14, 247-256 (1999) . Bei den dielektrophoretischen Elektrodenanordnungen kann es sich beispielsweise um Feldkafige (engl. "Cages") zur Fixierung der suspendierten Partikel handeln. Die herkömmlichen mikro- fluidischen Systeme ermöglichen eine gezielte Untersuchung von suspendierten Partikeln, indem diese in das mikrofluidische System eingespult und dort in einem Feldkafig fixiert werden. Im fixierten Zustand können die suspendierten Partikel dann beispielsweise impedanzspektroskopisch oder optisch untersucht werden.
Nachteilig an den vorstehend beschriebenen bekannten mikro- fluidischen Systemen ist die Tatsache, dass die interessierenden Partikel jeweils nur einzeln untersucht werden können. Es ist dagegen oftmals wünschenswert, die chemische oder bio- chemische Wechselwirkung zwischen verschiedenen Partikeln zu untersuchen, was mit den herkömmlichen mikrofluidischen Systemen nur mit großem Aufwand möglich ist. Beispielsweise besteht ein Interesse an der Untersuchung der Differenzierung von Stammzellen oder Immunzellen in Abhängigkeit von einer bestimmten Zellstimulierung durch chemische oder Triggersubstanzen. Eine weiteres Beispiel ist die chung von Zell-Zell-Interaktionen.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, die bekannten mikrofluidischen Systeme dahingehend zu verbessern, dass auch die Wechselwirkung verschiedener Partikel untersucht werden kann. Weiterhin liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein entsprechendes Betriebsverfahren für ein mikro- fluidisches System anzugeben.
Diese Aufgabe wird durch ein erfmdungsgemaßes mikrofluidi- sches System bzw. ein entsprechendes Betriebsverfahren gemäß den Nebenanspruchen gelost.
Die Erfindung umfasst die allgemeine technische Lehre, die Feldkafige m einem mikrofluidischen System nacheinander mit Partikeln verschiedener Partikeltypen zu beladen, so dass sich anschließend m mindestens einem der Feldkafige Partikel verschiedener Partikeltypen befinden, was eine partikelspezi- fische Wechselwirkung der verschiedenen Partikeltypen ermöglicht.
Zum einen ermöglicht die Erfindung damit eine gezielte Unter- suchung der Wechselwirkung zwischen verschiedenen Partikeln, mit denen die Feldkafige beladen werden, was beispielsweise m der Pharmaforschung interessant ist. Auf diese Weise kann eine Vielzahl von Partikel-Partikel-Wechselwirkungen studiert werden, um beispielsweise pharmakologisch wirksame Substanzen zu ermitteln.
Zum anderen ermöglicht die Erfindung eine gezielte Stimulation von Partikeln mit bestimmten Triggersubstanzen, um eine Reaktion auszulosen, was beispielsweise in der Stammzellfor- schung interessant ist. Beispielsweise können Sta den Feldkafigen bestimmten Triggersubstanzen ausc den, um eine bestimmte Zelldifferenzierung zu erreichen und zu beobachten.
Vorzugsweise werden die einzelnen Feldkafige selektiv mit den Partikeln eines ersten Partikeltyps beladen, indem die einzelnen Feldkafige beim Beladen selektiv elektrisch angesteuert werden.
Die selektive elektrische Ansteuerung der einzelnen Feldkafige kann hierbei repulsiv wirken, so dass die betroffenen Feldkafige die eingespulten Partikel abstoßen und dadurch eine Beladung der betroffenen Feldkafige mit dem jeweiligen Partikel verhindern. Es besteht jedoch alternativ auch die
Möglichkeit, dass die selektive Ansteuerung der Feldkafige so erfolgt, dass die betroffenen Feldkafige die jeweiligen Partikel fixieren. Vorteilhaft ist hierbei, dass die Ansteuerung der einzelnen Feldkafige unabhängig voneinander erfolgen kann, so dass bestimmte Feldkafige gezielt mit den gewünschten Partikeln beladen werden können.
Weiterhin besteht die Möglichkeit, dass die Feldkafige zur Beladung mit den Partikeln des ersten Partikeltyps so ange- steuert werden, dass Stromungswirbel entstehen, welche die
Partikel des ersten Partikeltyps in die Feldkafige befordern.
Nach dem Beladen der Feldkafige mit den suspendierten Partikeln adharieren die suspendierten Partikel vorzugsweise in den jeweiligen Feldkafigen, d.h. die Partikel haften in dem
Feldkafig an, so dass die anhaftenden Partikel unabhängig von der elektrischen Ansteuerung des betroffenen Feldkafigs nicht mehr " ausgespult werden. Der Begriff der Adhäsion wird hier in einem veral Sinn Verwender und umfasst sowohl die eigentliche als aktiven Prozess lebender Zellen als auch das passive Anhaften, welches sowohl bei lebenden Zellen als auch bei ande- ren Partikeln vorkommen kann.
Das Adharieren der Partikel in den Feldkafigen ist jedoch im Rahmen der Erfindung nicht zwingend erforderlich. Vielmehr reicht es u.U. auch aus, wenn die suspendierten Partikel in dem jeweiligen Feldkafig mittels negativer Dielektrophorese kurz über der Kanalwand des Tragerstromkanals gehalten werden .
Die in den Feldkafigen adharierten Partikel können dann wie- der abgelost werden, indem eine oberflachenlosende Substanz in das mikrofluidische System eingeführt wird. Die oberfla- chenlosende Substanz zum Ablosen der adharierten Partikel kann beispielsweise enzymatisch wirken. Beispiele derartiger oberflachenlosender Substanzen sind Trypsin, Versen, Accumax, Accutase oder Chelatbilder, insbesondere EDTA (Ethylendiamin- tetraessigsaure) . Weiterhin ist zu erwähnen, dass die ober- flachenlosende Substanz vorzugsweise die Oberflachenspannung der Tragerflussigkeit ändert und dadurch das Ablosen der adharierten Partikel bewirkt. Die Erfindung ist jedoch hin- sichtlich der oberflachenlosenden Substanz nicht auf die vorstehenden Beispiele beschrankt, sondern grundsatzlich auch mit anderen Substanzen realisierbar.
Die oberflachenlosende Substanz wird dann nach einer Einwirk- zeit vorzugsweise aus dem mikrofluidischen System ausgespult, wobei die abgelösten Partikel durch eine elektrische Ansteuerung der Feldkafige in den Feldkafigen fixiert werden und deshalb zunächst nicht mit ausgespult werden. Die Ablösung der adharierten Partikel kann jedocl" eine Temperaturanderung der Haftflache (z.B. der des Tragerstromkanals) erreicht werden, wobei die Haftflache aufgrund der Temperaturanderung ihre Oberflacheneigenschaft ändert, beispielsweise von hydrophil in hydrophob oder umgekehrt. Die Temperaturanderung der Haftflache kann beispielsweise durch eine Heizung (z.B. eine Widerstandsheizung) oder eine Kühlung (z.B. mittels Peltierelementen) bewirkt werden, die in das mikrofluidisches System integriert sind.
Die bereits vorstehend erwähnte Beladung der Feldkafige mit den Partikeln des zweiten Partikeltyps erfolgt vorzugsweise, indem die einzelnen Feldkafige beim Beladen selektiv elektrisch angesteuert werden, um die Partikel entweder abzustoßen oder anzuziehen.
Alternativ besteht die Möglichkeit, dass die Feldkafige zur Beladung mit den Partikeln des zweiten Partikeltyps so angesteuert werden, dass Stromungswirbel entstehen, welche die Partikel des zweiten Partikeltyps in die Feldkafige befordern .
Nach der Beladung der einzelnen Feldkafige mit den Partikeln der beiden Partikeltypen erfolgt dann vorzugsweise eine Un- tersuchung einer Reaktion zwischen den gemeinsam in den FeId- kafigen befindlichen Partikeln. Diese Untersuchung kann beispielsweise impedanzspektroskopisch oder optisch erfolgen, jedoch sind im Rahmen der Erfindung grundsatzlich auch andere Untersuchungsverfahren einsetzbar.
In Abhängigkeit von dem Ergebnis dieser Untersuchung können dann bestimmte Partikel in den zugehörigen Feldkafigen selektiert werden. Bei den selektierten Partikeln handelt es sich vorzugsweise um die Partikel, mit denen die Feldkafige zuerst beladen wurden. Es ist jedoch alternativ auch mo< es sich bei den selektierten Partikeln um die Pa. delt, mit denen die Feldkafige zuletzt beladen wurden.
Hierbei ist zu erwähnen, dass die Partikel der verschiedenen Partikeltypen eine Reaktion eingehen können, was beispielsweise zu einer dauerhaften Verbindung der Partikel fuhren kann. Wenn es sich bei dem einen Partikel um eine Stammzelle handelt, so kann diese Stammzelle aufgrund der Wechselwirkung mit dem anderen Partikel eine bestimmte Zelldifferenzierung erfahren. Bei einer solchen Stammzelldifferenzierung ermöglicht die Erfindung eine Echtzeit-Beobachtung bzw. eine Echtzeit-Untersuchung des Prozesses der Zelldifferenzierung. Die Selektion kann dann in Abhängigkeit davon erfolgen, ob und ggf- wie die Zelldifferenzierung stattfindet.
Die auf diese Weise selektierten Partikel können dann aus dem mikrofluidischen System entfernt werden, beispielsweise durch Ausspulen der Partikel.
Vorzugsweise wird zur selektiven Beladung der Feldkafige negative Dielektrophorese verwendet. So wirkt negative Die- lektrophorese je nach Abstand vom Feldkafig generell auf die Partikel abstoßend. Allerdings gelangen Partikel, die nah ge- nug sind, bevorzugt nur ein Partikel, in das Potentialminimum des Feldkafigs, wobei die anderen Partikel nur die abstoßenden Kräfte erfahren. Werden die Partikel, Zellen nun dicht genug an die Kanal-/Gefaßwand herangeführt, adharieren sie. Eine einmal adharierte Zelle ist unabhängig vom Feld stabil gebunden und kann nur durch "Losemittel" abgeloßt werden. Ein zweites Partikel gelangt bevorzugt unter Abschalten des Feldes zu dem ersten Partikel. Bleibt das Feld angeschaltet, so überwiegen die abstoßenden Kräfte und der zweite Partikel gelangt nicht in den Feldkafig. Im Rahmen der vorstehend erwähnten selektiven Be Feldkafige mit den Partikeln können die Feldkafige also so angesteuert werden, dass die Partikel mittels negativer Di- elektrophorese von den Feldkafigen aufgenommen werden. Die zu beladenden Feldkafige werden dann beim Beladen angeschaltet, wahrend die anderen Feldkafige abgeschaltet werden können.
Alternativ besteht auch die Möglichkeit, dass die Partikel mittels positiver Dielektrophorese von den Feldkafigen angezogen werden. Bei den im Rahmen der Erfindung bevorzugten planaren Ringstrukturen werden die. Partikel hierbei jedoch am Rand der Ringelektroden abgelegt. Bei einem Fixieren der suspendierten Partikel mittels positiver Dielektrophorese ist es deshalb vorteilhaft, wenn innerhalb der Ringelektroden, z.B. in der Mitte der Ringstruktur, eine punktförmige Elektrode angeordnet ist.
Es besteht jedoch auch die Möglichkeit, dass die Feldkafige zur selektiven Beladung so angesteuert werden, dass die suspendierten Partikel mittels Dielektrophorese selektiv von den Feldkafigen abgestoßen werden. Die zu beladenden Feldkafige können dann beim Beladen abgeschaltet werden, wahrend die anderen Feldkafige angeschaltet werden und dann repulsiv wir- ken.
Ferner besteht die Möglichkeit, dass beim Beladen der Feldkafige sowohl die zu beladenden Feldkafige elektrisch angesteuert werden als auch die Feldkafige, die nicht beladen werden sollen. Die zu beladenden Feldkafig werden dann so angesteuert, dass die Partikel angezogen werden. Die anderen Feldkafige werden dagegen repulsiv angesteuert, so dass die Partikel abgestoßen werden. Darüber hinaus besteht im Rahmen der Erfindung d keit, dass die einzelnen Feldkafige bei der Belac Partikeln des zweiten Partikeltyps unterschiedlich lang und/oder unterschiedlich stark angesteuert werden, so dass sich zwischen den Feldkafigen ein Gradient der Partikel des zweiten Partikeltyps ausbildet. Bei einer räumlich verteilten Anordnung einer Vielzahl von Feldkafigen lassen sich so innerhalb des mikrofluidischen Systems nahezu beliebige räumliche Konzentrationsverteilungen der Partikel des zweiten Par- tikeltyps erreichen.
Darüber hinaus ist die Erfindung nicht auf eine Beladung der einzelnen Feldkafige mit Partikeln von zwei verschiedenen Partikeltypen beschrankt. Es besteht im Rahmen der Erfindung vielmehr auch die Möglichkeit, dass die einzelnen Feldkafige mit mehr als zwei Partikeln oder mit Partikeln von mehr als zwei Partikeltypen beladen werden. So ermöglicht die Beladung der Feldkafige mit drei verschiedenen Partikeln eine Untersuchung der Wechselwirkung zwischen diesen drei Partikeln.
Ferner besteht im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit, die suspendierten Partikel zu markieren, beispielsweise durch eine Fluoreszenzmarkierung oder durch eine radioaktive Markierung. Dies erleichtert vorteilhaft die Verfolgung der Parti- kelreaktionen oder der Partikel selbst.
Weiterhin ist zu erwähnen, dass es sich sowohl bei den Partikeln des ersten Partikeltyps als auch bei den Partikeln des zweiten Partikeltyps um verschiedenste Partikel handeln kann. Beispielhaft sind biologische Zellen, Stammzellen und Immunzellen zu nennen. Es besteht jedoch auch die Möglichkeit, dass es sich bei den Partikeln um magnetische oder magneti- sierbare Partikel, insbesondere Partikel mit einem magnetischen oder magnetisierbaren Kern handelt. Ferner kommen als Partikel auch Antigene, Antikörper, Hormone, Vir* technisch modifizierte Viren in Frage. Darüber h auch möglich, Bakterien, sogenannte Latex beads, Vesikel oder Antigen-prasentierende Zellen als Partikel zu untersuchen. Allgemein kann es sich bei den zu untersuchenden Partikeln im Rahmen der Erfindung auch um biologische Zellen, Makromoleküle, insbesondere Immunglobulin, Partikel mit einer umhüllten Zielsubstanz im Partikelinneren, z.B. RNA, siRNA, DNA, oder um Partikel handeln, die an ihrer Partikeloberflache eine Zielstruktur aufweisen, insbesondere in Form von Molekülen, wie beispielsweise biologischen Zellen, Stammzellen oder Na- nostrukturen .
Weiterhin besteht im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit, dass es sich bei den Partikeln um 2-Phasen-Systeme handelt, wie beispielsweise Tropfchen. Beispielsweise können derartige 2-Phasen-Systeme eine wassrige Phase und eine Olphase aufweisen oder eine Olphase und eine Wasserphase oder eine Wasserphase und eine Losungsmittelsmittelphase, wobei es sich bei dem Losungsmittel beispielsweise um Perfluortripentylamin (FC70) handeln kann. Ferner kann ein derartiges 2-Phasen- System eine Gasphase und eine Wasserphase aufweisen. Außerdem ist es möglich, dass ein Partikel aus mehreren Bereichen/Phasen besteht (inhomogen) . Beispielsweise konnte sich eine Zelle in einem Tropfen wassrigen Mediums befinden, das seinerseits beispielsweise in FC70 suspendiert ist. Anwendung kann dieses System in der kombinatorischen Chemie finden und zum Einstellen (im Array verschiedener) definierter Konzentrationen. Dazu wird zunächst beispielsweise ein Tropfen eines wassrigen Mediums in einer FC70-Losung im Feldkafig gefangen und anschließend mit weiteren Tropfchen bekannter Große beladen, in denen eine chemische Substanz (Compound) in bekannter Konzentration gelost ist. Nach dem Verschmelzen liegt in dem nun gefangenen Tropfen die chemische Substanz in bekannter verdünnter Konzentration vor. Diese Tropfen könne und im Chip an anderer Stelle mit einem weiteren, weise eine Zelle enthaltenen Tropfen verschmolzen werden. Dies kann für Kinetik-Untersuchungen verwendet werden, bei- spielsweise zur IC 50-Bestimmung . Besonders vorteilhaft ist es aber, wenn die Beladung direkt im Array erfolgt und sich dort erste Partikel/wassrige Tropfen mit Zellen befinden.
Die Erfindung ist jedoch hinsichtlich der zu verwendenden Partikel nicht auf die vorstehend genannten Partikeltypen beschrankt, sondern grundsatzlich auch mit anderen Partikeltypen realisierbar. Darüber hinaus ist zu erwähnen, dass die Erfindung die Untersuchung einer Wechselwirkung beliebiger Kombinationen der vorstehend genannten Partikeltypen ermog- licht.
In einer Variante der Erfindung sind die zuerst eingespulten Partikel des ersten Partikeltyps großer als die anschließend eingespulten Partikel des zweiten Partikeltyps. Es ist jedoch im Rahmen der Erfindung auch möglich, dass die zuerst eingespulten Partikel des ersten Partikeltyps kleiner sind als die anschließend eingespulten Partikel des zweiten Partikeltyps. Darüber hinaus besteht auch die Möglichkeit, dass die Partikel der verschiedenen Partikeltypen gleich groß sind.
Ferner besteht im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit, dass die Partikel der verschiedenen Partikeltypen durch magnetische Kräfte relativ zueinander bewegt werden. Beispielsweise können die Partikel der verschiedenen Partikeltypen von den magnetischen Kräften beim Beladen der Feldkafige aufeinander zu bewegt werden, damit die Feldkafige mit Partikeln unterschiedlicher Partikeltypen beladen werden. Weiterhin besteht die Möglichkeit, dass die Partikel der verschiedenen Partikeltypen von den magnetischen Kräften beim Ausspulen der Par- tikel aus dem mikrofluidischen System voneinande werden .
Hierbei besteht im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit, dass die magnetischen Kräfte beim Beladen der Feldkafige geringer eingestellt werden als die dielektrophoretischen Kräfte der Feldkafige, so dass die von den Feldkafigen erzeugten dielektrophoretischen Kräfte über die externen magnetischen Kräfte dominieren.
Darüber hinaus besteht im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit, dass die magnetischen Kräfte beim Ausspulen der Partikel aus dem mikrofluidischen System geringer eingestellt werden als die Bindungskrafte zwischen den Partikeln der ver- schienen Partikeltypen.
Es wurde bereits vorstehend erwähnt, dass vorzugsweise die Wechselwirkung der verschiedenen Partikeltypen in den Feldkafigen untersucht wird. Beispielsweise kann diese Untersuchung mittels Messelektroden erfolgen, die beispielsweise eine im- pedanzspektroskopische Untersuchung durchfuhren.
Die suspendierten Partikel können hierbei direkt auf den Messelektroden abgesetzt werden, was insbesondere bei der so- genannten Patch-Clamp-Technik vorteilhaft ist. Hierzu werden die Messelektroden vorzugsweise bei der Frequenz des Fangfeldes auf ein Potenzialniveau eingestellt, das dem Potenzialniveau entspricht, das auch ohne die Messelektroden an deren Ort herrschen wurde. Das Absetzen der zu untersuchenden Par- tikel direkt auf den Messelektroden bietet den Vorteil, dass elektrische Messungen wesentlich empfindlicher ausgeführt werden können. Die Messelektroden können im Rahmen der Erfindung Manipulationselektroden eingesetzt werden, beisp Partikelfusion, Zelle-Zelle-Fusion oder zur Partikelporation .
Darüber hinaus besteht im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit, dass die Feldkafige wahrend der Untersuchung elektrisch nicht angesteuert werden, um eine Verfälschung der elektrischen Untersuchung durch die Ansteuerung der Feldkafige zu vermeiden. Hierbei ist also das Fangfeld abgeschaltet, wah- rend das Messfeld angeschaltet ist.
Es besteht jedoch auch die Möglichkeit, dass das Fangfeld wahrend der Messung angeschaltet bleibt. Der störende Em- fluss des Fangfeldes muss dann durch geeignete signalverar- beitungstechnische Maßnahmen unterdruckt werden, wie beispielsweise Filter oder Chopper.
Darüber hinaus besteht im Rahmen der Erfindung auch die Möglichkeit, durch die Elektroden Stromungswirbel zu erzeugen, welche die Strömung der Partikel zu den Elektroden wesentlich beschleunigen. Diese Technik ist in der Patentanmeldung WO 2005/110605 Al ' beschrieben, so dass der Inhalt dieser Patentanmeldung der vorliegenden Beschreibung in vollem Umfang zuzurechnen ist. Die Anwendung dieser Technik ermöglicht es, dass Partikel aus einem größeren Einzugsbereich in den FeId- kafig gelangen können.
Darüber hinaus ist zu erwähnen, dass die Erfindung nicht nur das vorstehend beschriebene Betriebsverfahren für ein mikro- fluidisches System betrifft, sondern auch ein entsprechend gestaltetes mikrofluidisches System selbst.
Der im Rahmen der Erfindung verwendete Begriff eines mikro- fluidischen Systems ist jedoch allgemein zu verstehen und nicht auf mikrofluidische Systeme beschrankt, di< Chip integriert sind, einen geschlossenen Träger: sowie Zuleitungen und Ausgangsleitungen aufweisen. Vielmehr umfasst der Begriff eines mikrofluidischen Systems auch eine ebene oder gebogene Platte, auf der mindestens ein Feldkafig angeordnet ist. Ein weiteres Beispiel für ein mikrofluidisches System in dem erfindungsgemaßen Sinne ist eine (Mik- ro-) Titerplatte . Die Beladung der einzelnen Feldkafige kann hierbei auch durch Pipetieren erfolgen, so dass die Trager- stromzufuhrung durch eine Pipetierungseinrichtung gebildet wird.
Vorzugsweise sieht das erfindungsgemaße mikrofluidische System als Tragerstromzufuhrung jedoch einen Tragerstromkanal vor, über den ein Tragerstrom mit darin suspendierten Partikeln zugeführt werden kann. Der im Rahmen der Erfindung verwendete Begriff eines Tragerstromkanals ist allgemein zu verstehen und nicht auf schmale Kanäle mit einem eckigen Querschnitt beschrankt. Vielmehr kann der Tragerstromkanal auch eine flachige Erstreckung aufweisen, damit in dem Tragerstromkanal in einer gemeinsamen Ebene eine Vielzahl von FeId- kafigen angeordnet werden kann.
Darüber hinaus weist das mikrofluidische System mehrere die- lektrische Feldkafige auf, die in dem Tragerstromkanal raumlich getrennt voneinander angeordnet sind und in Abhängigkeit von ihrer elektrischen Ansteuerung die suspendierten Partikel entweder fixieren oder abstoßen. Durch eine entsprechende e- lektrische Ansteuerung der Feldkafige können diese dann se- lektiv mit den Partikel der verschiedenen Partikeltypen beladen werden.
Die einzelnen Feldkafige können beispielsweise dreidimensional sein, wie in der bereits eingangs zitierten Veroffentli- chung von Muller T. et al.: "A 3D-microelectrode and caging Single cells and particles" beschrieb dass der Inhalt dieser Veröffentlichung der vorliegenden Beschreibung hinsichtlich der konstruktiven Ausgestaltung und der Funktionsweise der Feldkafige in vollem Umfang zuzurechnen ist. In einem Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung können die einzelnen Feldkafige also jeweils acht Kafigelektroden aufweisen, die kubisch angeordnet sind.
Die einzelnen Feldkafige können jedoch auch planar sein, wie in der deutschen Patentanmeldung 10 2006 002 462 beschrieben ist, so dass der Inhalt dieser Patentanmeldung der vorliegenden Beschreibung ebenfalls in vollem Umfang zuzurechnen ist.
Darüber hinaus kann das erfindungsgemaße mikrofluidische System mindestens eine Hilfselektrodenanordnung aufweisen, die in dem Tragerstromkanal stromaufwärts vor oder stromabwärts hinter zumindest einem der Feldkafige für die Fixierung bzw. Abstoßung der Partikel angeordnet ist. Bei derartigen Hilfs- elektroden kann es sich beispielsweise um trichterförmige
Zentrierelektroden (engl. "Funnel"), Ablenkelektroden, Halteelektroden (engl. "Hook") oder Partikelweichen (engl. "Switch") handeln, wie sie in der eingangs beschriebenen Veröffentlichung von Müller, T. et al . : "A 3D-microelectrode for handling and caging Single cells and particles" beschrieben sind. Der Inhalt dieser Veröffentlichung ist deshalb hinsichtlich der konstruktiven Gestaltung und der Funktionsweise der Hilfselektrodenanordnung der vorliegenden Beschreibung in vollem Umfang zuzurechnen.
In einem bevorzugten Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung sind die einzelnen Feldkafige auf einem Trager angeordnet, der beispielsweise plattenformig ist. Vorzugweise besteht der Trager im wesentlichen aus Glas, Keramik, einem Halbleiter, insbesondere Silizium, oder aus Kunststoff. Die 1 jedoch hinsichtlich des Materials für den Trager fige nicht auf die vorstehend genannten Materialien beschrankt, sondern auch mit anderen Materialien realisierbar.
Vorzugsweise bildet der Trager für die Feldkafige hierbei Begrenzungsflachen für den Tragerstromkanal . Beispielsweise können die Elektroden der einzelnen Feldkafige an der oberen bzw. unteren Kanalwand des Tragerstromkanals angebracht sein. Es besteht jedoch alternativ auch die Möglichkeit, dass die Elektroden der Feldkafige an den gegenüber liegenden seitlichen Kanalwanden des Tragerstromkanals angebracht sind, wobei sich die raumlichen Orientierungsangaben auf das Schwerefeld der Erde beziehen.
In einem Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung sind die einzelnen Feldkafige jeweils ringförmig und/oder geschlossen, wobei die Feldkafige stromabwärts eine Schwächung aufweisen können, die beispielsweise aus einer Passivierungsschicht bestehen kann, was an sich bekannt ist. Die Passivierungsschicht erlaubt dann das Auskoppeln des Fangfeldes für die Fixierung der suspendierten Partikel, wohingegen die Passivierungsschicht für Messsignale (z.B. Gleichstrom-Messsignale oder niederfrequente Messsignale wie bei Patch-Clamp-Messungen oder Membranim- pedanzmessungen) abschirmend wirkt.
Weiterhin besteht im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit, dass die Feldkafige Elektroden aufweisen, die entgegen der Stromungsrichtung gekrümmt sind. Beispielsweise können die Elektroden der Feldkafige jeweils halbkreisförmig oder bogenförmig sein, wobei die Elektrodenenden gegen die Stromungsrichtung weisen. Vorzugsweise sind die einzelnen Feldkafige matri Zeilen und Spalten angeordnet, wobei die einzeln vorzugsweise durch Zeilen-Steuerleitungen und Spalten-Steuerleitungen selektiv angesteuert werden können. Eine derartige matrixformige Anordnung einer Vielzahl von Feldkafigen ist beispielsweise in der deutschen Patentanmeldung 10 2006 002 462 beschrieben, so dass der Inhalt dieser Patentanmeldung der vorliegenden Beschreibung hinsichtlich der matrixformigen Anordnung der Feldkafige in vollem Umfang hinzuzurechnen ist.
Weiterhin ist in einem bevorzugten Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung vorgesehen, dass das mikrofluidische System Anschlusskontakte aufweist, die eine losbare elektrische Verbindung der Feldkafige mit einer separaten Treiberschaltung (Generator) ermöglichen. Beispielsweise kann eine solche losbare elektrische Kontaktierung durch Federkontakte realisiert werden .
In einer Variante der Erfindung weisen die Feldkafige eine äußere Ringelektrode und eine innere Ringelektrode auf, wobei die äußere Ringelektrode die innere Ringelektrode vorzugsweise konzentrisch umgibt.
Die beiden Ringelektroden können jeweils planar sein. Hierbei besteht die Möglichkeit, dass die planaren Ringelektroden in einer gemeinsamen Elektrodenebene angeordnet sind. Es besteht jedoch alternativ auch die Möglichkeit, dass die planaren Ringelektroden in parallelen, aber zueinander versetzten E- lektrodenebenen angeordnet sind.
Weiterhin besteht im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit, dass innerhalb der inneren Ringelektrode mindestens eine Messelektrode angeordnet ist, um die in dem Feldkafig fixierten Partikel zu vermessen. Vorzugsweise sind jedoch hierbei innerhalb der inneren Ringelektrode 2, 3 oder so< elektroden und/oder Manipulationselektroden angei die einzelnen Messelektroden wahlweise rund, insbesondere o- val, oder eckig, insbesondere rechteckig, sein können.
Die Anordnung der Messelektroden innerhalb der Ringelektroden bietet den Vorteil, dass sich die dielektrophoretische Barriere nach oben verringert und damit das Einfangen von Partikeln aus dem Tragerstrom erleichtert, insbesondere wenn die Partikel schwerer als die Tragerflussigkeit sind, was bei biologischen Zellen typisch ist. Außerdem ermöglicht die Verwendung von mindestens einer inneren Elektrode den Prozess des Fangens und Beiadens in nicht-adhaπertem Zustand, was für Suspensionszellen wie Blutzellen von Vorteil ist. Das ganze funktioniert auch mit nur einer inneren Elektrode
(Rmg-Rmg-Dot-Struktur) . Falls das Absetzen auf das Substrat erforderlich oder wünschenswert ist, so wird diese vorzugsweise auf das Potential gelegt, auf welchem sich der E- lektrodenbereich im Mittel auch ohne innere Elektrode bei ge- schalteten Ringelektroden befinden wurde. Messungen bzw. Manipulationen können dann zwischen der Zentralelektrode und der inneren Ringelektrode erfolgen. Ein weiterer Vorteil der inneren Elektrode besteht darin, dass sowohl positive als auch negative Dielektrophorese verwendet werden kann. Zur pDEP-Positiomerung wird etwa ein Feld entsprechender Frequenz zwischen der Zentralelektrode und dem inneren und oder dem äußeren Ring geschaltet.
Darüber hinaus können die Ringelektroden eine Passivierungs- schicht aufweisen, wobei die Passivierungsschicht vorzugsweise so stark ausgebildet ist, dass die Passivierungsschicht ein Auskoppeln eines elektrischen Feldes zur Partikelfixierung erlaubt, wohingegen die Passivierungsschicht für Gleich- stromsignale und niederfrequente Signale abschirmend wirkt. Die Fixierung der einzelnen Partikel in den Feld zusatzlich durch Unterdruck unterstutzt werden. In einem Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung weist das mikrofluidische Sys- tem deshalb einen Unterdruckanschluss auf, der in einem FeId- kafig ausmundet, um die dort befindlichen Partikel zusatzlich zu fixieren.
Bei einer Anordnung von Messelektroden kann der Unterdruckan- Schluss auch zwischen den beiden Messelektroden ausmunden, um die Partikel dort für eine Messung zu fixieren.
Weiterhin ist zu erwähnen, dass die Messelektroden in dem Feldkafig entweder symmetrisch oder unsymmetrisch angeordnet sein können.
Andere vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind m den Unteranspruchen gekennzeichnet oder werden nachstehend zusammen mit der Beschreibung der bevorzugten Ausfuhrungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnungen naher erläutert. Es zeigen :
Figur IA eine Aufsicht auf einen Feldkafig eines er- findungsgemaßen mikrofluidischen Systems,
Figur IB eine Querschnittsansicht durch den Feldkafig gemäß Figur IA entlang der Linie A-A,
Figur 2A ein erfmdungsgemaßes mikrofluidisches System mit mehreren Feldkafigen wahrend einer selektiven Beladung mit Partikeln, wobei der eine Feldkafig mit Partikeln beladen wird, wahrend der andere Feldkafig die eingespulten Partikel abstoßt, Figur 2B das mikrofluidische System gemäß nach dem Beladen der Feldkafige,
Figur 3A ein alternatives Ausfuhrungsbeispiel eines erfindungsgemaßen mikrofluidischen Systems, bei dem die Beladung der Feldkafige von oben erfolgt,
Figur 3B das mikrofluidische System gemäß Figur 3B nach der Beladung,
Figur 4A ein alternatives Ausfuhrungsbeispiel eines Feldkafigs zur Verwendung in einem erfm- dungsgemaßen mikrofluidischen System,
Figur 4B eine Querschnittsansicht des Feldkafigs gemäß Figur AA entlang der Linie A-A,
Figur 5 eine matrixformige Anordnung einer Vielzahl von Feldkafigen in einem erfindungsgemaßen mikrofluidischen System,
Figur 6A eine Aufsicht auf eine alternative Ausfuhrungsform eines Feldkafigs zur Verwendung in einem erfindungsgemaßen mikrofluidischen System,
Figur 6B eine Querschnittsansicht des Feldkafigs gemäß Figur 6A entlang der Linxe A-A,
Fig. 7A, 7B das erfindungsgemaße Betriebsverfahren für ein mikrofluidisches System in Form eines Flussdiagramms, Figur 8 ein alternatives Ausfuhrungsbeisj erfindungsgemaßen Feldkafigs mit koplanaren Ringelektroden und zwei Messelektroden inner- halb der inneren Ringelektrode,
Figur 9A die Feldverteilung E2 in dem Feldkäfig gemäß
Figur 8 in der Schnittebene A-A, wobei die innere Ringelektrode und die äußere Ring- elektrode mit der gleichen Spannung gegenpha- sig angesteuert werden, wahrend die Messelektroden auf Masse liegen,
Figur 9B die Feldverteilung E2 in dem Feldkafig gemäß Figur 8 in der Schnittebene A-A, wobei die innere Ringelektrode und die äußere Ringelektrode gegenphasig mit der gleichen Spannung angesteuert werden, wahrend die Messelektroden gleichphasig zu der inneren Ring- elektrode angesteuert werden,
Figuren 10A-10C eine perspektivische Darstellung eines Feldkafigs mit acht Kafigelektroden, wobei das Fangfeld zur Beladung mit den Partikeln des zweiten Partikeltyps modifiziert wird, sowie
Figuren 11A-11C eine perspektivische Darstellung eines Feldkafigs mit acht Kafigelektroden, wobei zur Beladung mit den Partikeln des zweiten Parti- keltyps Stromungswirbel erzeugt werden.
Die Figuren IA und IB zeigen ein Ausfuhrungsbeispiel eines dielektrophoretischen Feldkafigs 1, der in einem erfindungs- gemaßen mikrofluidischen System eingesetzt werden kann, wie es beispielsweise in den Figuren 2A und 2B bzw. 3B dargestellt ist.
Der Feldkafig 1 weist in diesem Ausfuhrungsbeispiel zwei pla- nare Ringelektroden 2, 3 auf, die in einer gemeinsamen Elektrodenebene koplanar angeordnet sind, wie aus der Querschnittsansicht in Figur IB ersichtlich ist. Die beiden Ringelektroden 2, 3 sind hierbei konzentrisch auf einem platten- formigen Trager 4 aus Glas angeordnet und elektrisch unabhan- gig voneinander ansteuerbar.
Durch eine geeignete elektrische Ansteuerung der beiden Ringelektroden 2, 3 kann ein hier nur schematisch dargestellter Partikel 5 mittels negativer Dielektrophorese in den Feldka- fig 1 gelangen und in dem Feldkafig 1 fixiert werden, wobei der Partikel 5 im fixierten Zustand an dem Trager 4 adharie- ren kann und dann auch nach einem Abschalten des Feldkafigs 1 an dem Trager 4 haften bleibt.
Der Feldkafig 1 kann jedoch elektrisch auch so angesteuert werden, dass der Partikel 5 von dem Feldkafig 1 mittels Dielektrophorese abgestoßen wird, wodurch eine Beladung des Feldkafigs 1 mit dem Partikel 5 und dadurch auch ein Adharie- ren des Partikels 5 innerhalb der inneren Ringelektrode 3 verhindert wird. Eine selektive Ansteuerung des Feldkafigs 1 ermöglicht also innerhalb des nachstehend beschriebenen er- findungsgemaßen mikrofluidischen Systems wahlweise eine Beladung des Feldkafigs 1 mit dem Partikel 5 oder ein Abstoßen des Partikels 5, um eine Beladung des Feldkafigs 1 mit dem Partikel 5 zu verhindern.
Die Figuren 2A und 2B zeigen Ausschnittsweise ein erfindungs- gemaßes mikrofluidisches System mit einer Vielzahl von FeId- kafigen 1', l'1 entsprechend den Figuren IA und IB, wobei in den Zeichnungen zur Vereinfachung nur zwei der F< ge I1, I1' dargestellt sind.
Oberhalb des Tragers 4 verlauft hierbei ein Tragerstromkanal, durch den in Pfeilrichtung ein Tragerstrom mit darin suspendierten Partikeln 6 strömt.
Figur 2A zeigt hierbei einen Zustand des mikrofluidischen Systems, in dem in den beiden Feldkafigen 1' und I1' bereits die Partikel 5 fixiert sind und dort an dem Trager 4 adharie- ren.
In diesem Zustand wird der Feldkafig 1' abgeschaltet, so dass sich die Partikel 6 an den Partikeln 5 anlagern.
Der rechte Feldkafig 1 ' ' wird dagegen in diesem Zustand e- lektrisch so angesteuert, dass er die Partikel 6 mittels Die- lektrophorese abstoßt, um eine Anlagerung der Partikel 6 an den Partikeln 5 zu verhindern.
Die beiden Partikel 5, 6 gehören hierbei verschiedenen Partikeltypen an. So handelt es sich bei dem Partikel 5 in diesem Ausfuhrungsbeispiel um eine biologische Zelle, wahrend die Partikel 6 Viren sind, die auf die Partikel 5 wirken.
Figur 2B zeigt dann einen Zustand, in dem die beiden Feldka- fige I1, l'1 abgeschaltet sind. Die Partikel 5 bleiben dann an dem Trager 4 adhariert und können spater mit einer ober- flachenlosenden Substanz wie beispielsweise Trypsin gelost und aus dem mikrofluidischen System ausgespult werden.
In dem Zustand gemäß Figur 2B erfolgt dann eine Untersuchung der Partikel 5 mit den dort angelagerten Partikeln 6, um die Wechselwirkung zwischen den Partikeln 5, 6 zu untersuchen. In Abhängigkeit von dem Untersuchungsergebnis ko stimmte Partikel 5 selektiv ausgespult und weiter verwendet werden.
Die Figuren 3A und 3B zeigen ein alternatives Ausfuhrungsbeispiel eines erfindungsgemaßen mikrofluidischen Systems, das weitgehend mit dem vorstehend beschriebenen und in den Figuren 2A und 2B dargestellten Ausfuhrungsbeispiel uberein- stimmt, so dass zur Vermeidung von Wiederholungen auf die vorstehende Beschreibung Bezug genommen wird, wobei für entsprechende Teile dieselben Bezugszeichen verwendet werden.
Eine Besonderheit dieses Ausfuhrungsbeispiels besteht darin, dass die Beladung der Feldkafige I1 und l'1 hierbei nicht parallel zur Elektrodenebene, d.h. parallel zu dem Trager 4, erfolgt, sondern rechtwinklig hierzu parallel zur Schwerkraft, wie durch die eingezeichnete Schwerkraftrichtung g verdeutlicht wird.
In dem Zustand gemäß Figur 3A ist der Feldkäfig 1 ' abgeschaltet, wohingegen der Feldkafig l'1 angeschaltet ist und die Partikel 6 mittels negativer Dielektrophorese abstoßt, wodurch eine Anlagerung der Partikel 6 in dem Feldkafig I1' verhindert wird, wohingegen sich die Partikel 6 in dem linken Feldkafig 1' ohne weiteres ablagern.
Figur 3B zeigt einen Zustand des erfindungsgemaßen mikroflui- dischen Systems nach der Beladung, wenn die beiden Feldkafi- ge 1 ' und I1' abgeschaltet sind. Im Bereich des zuvor abgeschalteten Feldkafigs 1' hat sich dann eine Vielzahl der Partikeln 6 abgelagert, was insbesondere auch für das Innere des Feldkafigs 1' gilt, wo die Partikel 5, 6 unmittelbar aneinan- der angrenzen, so dass deren Wechselwirkung unte kann .
In dem zuvor angeschalteten Feldkafig 1 ' ' haben sich dagegen aufgrund der abstoßenden Wirkung des Feldkafigs I11 keine der Partikel 6 auf dem Partikel 5 abgelagert.
Durch eine selektive Ansteuerung der einzelnen Feldkafige 1 ' und l'1 können die einzelnen Partikel 5 also gezielt mit be- stimmten Partikeln 6 zusammengebracht werden, um deren Wechselwirkung zu untersuchen.
Die Figuren 4A und 4B zeigen ein alternatives Ausfuhrungsbeispiel eines Feldkafigs zur Verwendung in dem erfindungsgema- ßen mikrofluidischen System. Dieses Ausfuhrungsbeispiel stimmt teilweise mit dem vorstehend beschriebenen und in den Figuren IA und IB gezeigten Ausfuhrungsbeispielen eines Feldkafigs uberein, so dass zur Vermeidung von Wiederholungen auf die vorstehende Beschreibung Bezug genommen wird, wobei für entsprechende Bauteile dieselben Bezugszeichen verwendet werden .
Eine Besonderheit dieses Ausfuhrungsbeispiels besteht darin, dass die Ringelektroden 2, 3 nicht ringförmig geschlossen, sondern nur halbkreisförmig sind, wobei die beiden halbkreisförmigen Ringelektroden 2, 3 entgegen der Stromungsrichtung gekrümmt sind.
Figur 5 zeigt eine matrixformige Anordnung einer Vielzahl der Feldkafige 1 gemäß den Figuren 4A und 4B, wobei die einzelnen Feldkafige 1 durch eine Vielzahl von Spalten-Steuerleitungen 7 und eine Vielzahl von Zeilen-Steuerleitungen 8 selektiv angesteuert werden können. Die Spalten-Steuerleitungen 7 sind hierbei jeweils mit der inneren Ringelektrode 3 der Feldkafige 1 der betreffenden Spalte verbunden, Zeilen-Steuerleitungen 8 jeweils mit der äußeren de 2 der Feldkäfige 1 der betreffenden Zeile verbunden sind. Durch eine geeignete Ansteuerung der einzelnen Feldkafige 1 können diese selektiv mit den Partikeln 5, 6 beladen werden, indem die einzelnen Feldkafige 1 jeweils repulsiv oder fixierend angesteuert bzw. abgeschaltet werden.
Zum initialen Beladen des Arrays gemäß Figur 5 mit Zellen geht man beispielsweise folgendermaßen vor. Zellen werden von links mittels einer Strömung eingespult. Zunächst sind die Spalten-Steuerleitung 7 und die Zeilen-Steuerleitungen 8 auf Masse bis auf die Spalten-Steuerleitungen 6 mit den Indizes imax und imax-1. Nach Füllung der Feldkafige 1 der Spalten (imax) und (imax-1) (entweder unter Beobachtung oder nach hinreichend langer Zeit) werden nachfolgend die nächsten beiden Spalten (imax-2) und (imax-3) durch zusatzlichen Aktivierung der Spalten-Steuerleitungen 7 mit den Indizes (imax-2) und (imax-3) gefüllt. Dieser Prozess kann bis zur vollstandi- ge Füllung des Arrays spaltenweise fortgesetzt werden und hat den Vorteil, dass die stromaufwartsgelegenen Strukturen nicht die Beladung der abwartsgelegenen behindert. Das Beladen mit den zweiten Partikeln erfolgt mittels Strömung von rechts, wobei alle Spalten- und Zeilensteuerleitungen 7, 8 (bspw. ge- genphasig) bis auf die mit zu beladenen Zellen (1, M) aktiviert werden, Die Spalten- und Zeilensteuerleitungen 6, 7 (1, M) befinden sich auf Masse. Das optionale Ablosen von Zielzellen erfolgt durch eine analoge Ansteuerung mittels einer Strömung über einen Querkanal. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Basiselektrodenstruktur wie in Figur 1 erzeugt wurde, jedoch halbseitig mit einer Passivierungsschicht versehen wurde, die bei einer hinreichend niedrigen Frequenz die- lektrophoretisch der Struktur gemäß Figur 4 entspricht. Dann wurde man das initiale Beladen mit Zellen beispielsweise mit der niedrigeren Frequenz ausfuhren, das gezielte Triggern sowie das Entladen der Zielzellen mit d< wobei die Zellen dann auch in Kanalrichtung entlassen werden können (nach oder von links) .
Die Figuren 6A und 6B zeigen ein alternatives Ausfuhrungsbeispiel eines Feldkafigs 1 zur Verwendung in einem erfindungs- gemaßen mikrofluidischen System. Dieses Ausfuhrungsbeispiel stimmt teilweise mit dem vorstehend beschriebenen und in den Figuren IA und IB dargestellten Ausfuhrungsbeispiel uberein, so dass zur Vermeidung von Wiederholungen auf die vorstehende Beschreibung Bezug genommen wird, wobei für entsprechende Teile dieselben Bezugszeichen verwendet werden.
Eine Besonderheit dieses Ausfuhrungsbeispiels besteht darin, dass der Feldkafig 1 nicht die äußere Ringelektrode 2 aufweist, wie dies bei dem Ausfuhrungsbeispiel gemäß den Figuren IA und IB der Fall ist.
Stattdessen weist der Feldkafig 1 in diesem Ausfuhrungsbeispiel stromaufwärts vor dem Feldkafig leine trichterförmige Elektrodenanordnung 9 (engl. "Funnel") auf, durch welche die Partikel 5 gezielt in den Feldkafig 1 geleitet werden.
Eine weitere Besonderheit dieses Ausfuhrungsbeispiels besteht darin, dass die innere Ringelektrode 3 nicht geschlossen, sondern auf ihrer stromaufwärts gelegenen Seite geöffnet ist und in die trichterförmige Elektrodenanordnung 9 übergeht.
Im Folgenden wird anhand des Flussdiagramms gemäß den Figuren 7A und 7B der Ablauf des erfindungsgemaßen Betriebsverfahrens beschrieben. In einem ersten Schritt Sl wird zunächst ein Tra darin suspendierten biologischen Zellen in das m sehe System eingespult.
In einem weiteren Schritt S2 werden dann die einzelnen FeId- kafige in dem mikrofluidischen System mit den eingespulten Zellen beladen, indem die einzelnen Feldkafige selektiv angesteuert werden. Die Feldkafige, die mit den eingespulten Zellen beladen werden sollen, werden hierzu so angesteuert, dass die eingespulten Zellen mittels negativer Dielektrophorese fixiert werden. Die anderen Feldkafige, die mit den eingespulten biologischen Zellen nicht beladen werden sollen, werden dagegen elektrisch so angesteuert, dass die eingespulten biologischen Zellen mittels negativer Dielektrophorese abge- stoßen werden.
Es ist jedoch alternativ auch möglich, dass zur Partikelbeladung nur diejenigen Feldkafige eingeschaltet und mittels negativer Dielektrophorese angesteuert werden, die Partikel fi- xieren sollen, wahrend die anderen Feldkafige ausgeschaltet bleiben .
In einem weiteren Schritt S3 adhaπeren die biologischen Zellen dann m den zuvor selektiv beladenen Feldkafigen, so dass sich die adhaπerten Zellen auch nach einem anschließenden Abschalten der einzelnen Feldkafige nicht losen, sondern in den beladenen Feldkafigen verbleiben.
In einem weiteren Schritt S4 werden dann Triggerpartikel (z.B. Antigene) in den Tragerstromkanal des mikrofluidischen Systems eingespult.
Die Feldkafige werden dann m einem weiteren Schritt S5 selektiv mit den Triggerpartikeln beladen, was durch eine ent- sprechend selektive elektrische Ansteuerung der mittels positiver bzw. negativer Dielektrophores wird. Auf diese Weise werden die einzelnen Feldkafige sowohl mit biologischen Zellen als auch mit Triggerpartikeln bela- den, wobei die Wechselwirkung zwischen den zuerst zugefuhrten Zellen und den anschließend zugefuhrten Triggerpartikeln m einem weiteren Schritt S6 untersucht wird, was beispielsweise optisch oder impedanzspektroskopisch geschehen kann. Die Untersuchung kann jedoch auch durch eine Patch-Clamp-Messung bzw. durch einen Gleichstrommessung erfolgen.
In einem weiteren Schritt S7 werden dann m Abhängigkeit von der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen den biologischen Zellen und den zugegebenen Triggerpartikeln bestimmte Zellen selektiert.
Anschließend können dann in einem weiteren Schritt S8 die in den Feldkafigen geladenen Zellen durch Applikation einer o- berflachenlosenden Substanz (z.B. Trypsin) gelost werden, wo- bei in einem Schritt S9 eine ausreichende Einwirkzeit der o- berflachenlosenden Substanz abgewartet wird.
Anschließend werden die m den Feldkafigen geladenen Zellen dann m einem Schritt SlO wieder m den Feldkafigen fixiert, um ein Ausspulen der Zellen durch den Tragerstrom zu verhindern. Hierzu werden die Feldkafige in geeigneter Weise elektrisch angesteuert.
In einem weiteren Schritt Sil wird dann die zuvor zugegebene oberflachenlosende Substanz bei gleichzeitiger Fixierung der Zellen in den Feldkafigen aus dem mikrofluidischen System ausgespult . Nach dem Ausspulen der oberflachenlosenden Substc mikrofluidischen System werden dann in einem Sehn lektiv bestimmte Feldkafige abgeschaltet, welche die zuvor selektierten Zellen enthalten. Diese selektive Abschaltung der Feldkafige bewirkt, dass die darin enthaltenen Zellen in einem weiteren Schritt S13 von dem Tragerstrom aus dem mikrofluidischen System ausgespult werden, wahrend die anderen Zellen in den weiterhin angeschalteten anderen Feldkafi- gen fixiert bleiben.
Auf diese Weise werden selektiv die Zellen aus dem mikroflui- dischen System ausgespult, die zuvor eine bestimmte Wechselwirkung mit der Tragersubstanz gezeigt haben.
In einem letzten Schritt S14 werden dann die auf diese Weise selektierten und ausgespulten Zellen außerhalb des mikroflui- dischen Systems für eine weitere Verwendung aufgefangen.
Hierbei ist es möglich, dass das mikrofluidische System noch weitere Kanäle aufweist und die Partikel zunächst einer Manipulation (z.B. einer Sortierung) unterzogen werden, bevor die Partikel dann aufgefangen werden.
Figur 8 zeigt ein weiteres Ausfuhrungsbeispiel eines Feldka- figs zur Verwendung in dem erfindungsgemaßen mikrofluidischen System. Dieses Ausfuhrungsbeispiel stimmt weitgehend mit dem vorstehend beschriebenen und in den Figuren IA und IB darge¬ stellten Ausfuhrungsbeispiel uberein, so dass zur Vermeidung von Wiederholungen auf die vorstehende Beschreibung verwiesen wird, wobei für entsprechend die Teile dieselben Bezugszeichen Bezugszeichen verwendet werden.
Eine Besonderheit dieses Ausfuhrungsbeispiels besteht darin, dass innerhalb der inneren Ringelektrode 3 zwei Messelektro- den bzw. Manipulationselektroden 10, 11 angeordni eine impedanzspektroskopische Untersuchung der i inneren Ringelektrode 3 adharierten Partikel 5 bzw. 6 ermöglichen.
Darüber hinaus ermöglichen die Manipulationselektroden 10, 11 eine Zellfusion. Hierzu wird beispielsweise eine der beiden Manipulationselektroden 10, 11 auf Masse gehalten, wahrend die anderen Manipulationselektrode 10 bzw. 11 mit kurzen Gleichstrom- oder Wechselstromimpulsen beaufschlagt wird.
Die beiden Messelektroden 10, 11 sind hierbei m dem Feldka- fig 1 symmetrisch auf gegenüberliegenden Seiten des Mittelpunkts angeordnet.
Darüber hinaus weist der Feldkafig 1 in diesem Ausfuhrungsbeispiel eine Ansaugoffnung 12 auf, über die in dem Feldkafig 1 ein Unterdruck erzeugt werden kann, der die Partikel 5 bzw. 6 ansaugt und dadurch die Beladung des Feldkafigs 1 mit den Partikeln 5 bzw. β unterstutzt. Die Ansaugoffnung 12 ist hierbei zwischen den beiden Messelektroden 10, 11 angeordnet, so dass die Partikel 5, 6 bei der Beladung des Feldkafigs 1 auch zwischen den beiden Messelektroden 11, 12 fixiert werden, was für eine anschließende Messung vorteilhaft ist.
Figur 9A zeigt die Feldverteilung E2 innerhalb des Feldkafigs 1 gemäß Figur 8, wobei die innere Ringelektrode 3 und die äußere Ringelektrode 2 mit gegenphasigen elektrischen Signalen der gleichen Spannung U angesteuert werden, wahrend die beiden Messelektroden 10, 11 auf Masse liegen.
Figur 9B zeigt die Feldverteilung E2 in dem Feldkafig 1 gemäß Figur 8, wobei die innere Ringelektrode 3 und die äußere Ringelektrode 2 gegenphasig mit der gleichen Spannung U ange- steuert werden, wahrend die beiden Messelektrodei gleichphasig mit der inneren Ringelektrode 3 mit nung von 0,26"U angesteuert werden.
Die Figuren 10A bis IOC zeigen ein alternatives Ausfuhrungsbeispiel eines Feldkafigs 13, der in einem erfindungsgemaßen mikrofluidischen System angeordnet ist und von einem Tragerstrom in Pfeilrichtung angeströmt wird.
In diesem Ausfuhrungsbeispiel weist der Feldkafig 13 acht Ka- figelektroden 14 auf, wobei die Kafigelektroden 14 kubisch angeordnet sind, wie es beispielsweise in Muller, T. et al.: "A 3D-Microelectrode for handling and caging single cells and particles", Biosensors and Bioelectronics 14, 247-256 (1999) beschrieben ist.
Die Kafigelektroden 14, deren elektrische Ansteuerung modifiziert wird, beispielsweise durch Abschalten, Schwächung oder Ansteuerung mit veränderter Phasenlage, sind ohne Schraffur wiedergegeben, wahrend die Kafigelektroden 14, deren Ansteuerung unverändert bleibt, hierbei schraffiert dargestellt sind.
Figur 10A zeigt hierbei den Zustand nach der Beladung des Feldkafigs 13 mit einem Partikel 15 eines ersten Partikeltyps. In diesem Zustand erzeugt der Feldkafig 13 ein Fangfeld, das den Partikel 15 in dem Feldkafig 13 fixiert und weitere Partikel 16 eines zweiten Partikeltyps außerhalb des Feldkafigs 13 halt.
Figur 1OB zeigt die Beladung des Feldkafigs 13 mit den Partikeln 16, indem die Ansteuerung der stromaufwärts gelegenen Kafigelektroden modifiziert wird, damit die Partikel 16 von dem Trägerstrom in Pfeilrichtung in den Feldkäfii werden können.
Figur IOC zeigt schließlich einen Zustand, in dem die ver- schiedenen Partikel 15, 16 durch ein Fangfeld gemeinsam in dem Feldkäfig 13 fixiert sind, um beispielsweise die Wechselwirkung zwischen den Partikeln 15, 16 zu untersuchen.
Die Figuren IIA bis HC zeigen eine alternative Ansteuerung des Feldkäfigs 13 zur Beladung mit den Partikeln 16. Hierzu werden nach der in Figur HA dargestellten Beladung mit dem Partikel 15 die Käfigelektroden 14 so angesteuert, dass Wirbelströmungen erzeugt werden, die in Pfeilrichtung verlaufen, wie in Figur HB dargestellt ist und beispielsweise in WO 2005/110605 Al beschrieben wird. Diese Wirbelströmungungen tragen die Partikel 16 dann in den Feldkäfig 13, wo sie schließlich gemeinsam mit dem Partikel 15 durch ein herkömmliches Fangfeld fixiert werden, wie in Figur HC dargestellt ist.
Die Erfindung ist nicht auf die vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsbeispiele beschränkt. Vielmehr ist eine Vielzahl von Varianten und Abwandlungen möglich, die ebenfalls von den Erfindungsgedanken gebrauch machen und deshalb in den Schutzbereich fallen.
* * * * *
Bezugszeichenliste :
1 Feldkäfig
2 Ringelektrode
3 Ringelektrode
4 Träger
5 Partikel
6 Partikel
7 Spalten-Steuerleitungen
8 Zeilen-Steuerleitungen
9 Trichterförmige Elektrodenanordnung
10 Messelektrode
11 Messelektrode
12 Ansaugöffnung
13 Feldkäfig
14 Käfigelektroden
15 Partikel
16 Partikel

Claims

ANSPRUCHE
1. Betriebsverfahren für ein mikrofluidisches System, mit folgenden Schritten (S1-S2) : a) Zufuhren (Sl) eines Tragerstroms mit darin suspendierten Partikeln (5) eines ersten Partikeltyps in das mikroflu- idische System, b) Beladen (S2) von mindestens einem elektrischen Feldkafig (1) in dem mikrofluidischen System mit den zugefuhrten Partikeln (5) des ersten Partikeltyps, gekennzeichnet durch folgende Schritte (S4-S5): c) Zufuhren (S4) eines Tragerstroms mit darin suspendierten Partikeln (6) eines zweiten Partikeltyps in das mikrofluidische System, d) Beladen (S5) des Feldkäfigs (1) in dem mikrofluidischen System mit den zugefuhrten Partikeln (6) des zweiten Partikeltyps, so dass sich in dem Feldkafig (1) mmdes- tens ein Partikel (5) des ersten Partikeltyps und mindestens ein Partikel (6) des zweiten Partikeltyps befindet.
2. Betriebsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich- net, dass die Feldkafige (1, 1', I'1) selektiv mit den Partikeln (5) des ersten Partikeltyps beladen werden, indem die einzelnen Feldkafige (1, 1,', I1') beim Beladen selektiv e- lektrisch angesteuert werden.
3. Betriebsverfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, a) dass die einzelnen Feldkafige (1, 1', I1') jeweils ein Fangfeld erzeugen, um die Partikel (5) des ersten Par- tikeltyps in den einzelnen Feldkafigen (1, fixieren, und b) dass das Fangfeld in den Feldkafigen (1, 1', I11) zur
Beladung mit den Partikeln (5) des ersten Partikeltyps modifiziert wird.
4. Betriebsverfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Feldkafige (13) zur Beladung mit den Partikeln (15) des ersten Partikeltyps so angesteuert werden, dass Wir- belstromungen die Partikel (15) des ersten Partikeltyps m die Feldkafige (13) tragen.
5. Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Anspru- che, gekennzeichnet durch folgenden Schritt (S3) :
Adharieren der Partikel (5) des ersten Partikeltyps in den Feldkafigen (1', l'1) nach dem Beladen und vor dem Zufuhren der Partikel (6) des zweiten Partikeltyps.
6. Betriebsverfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch folgenden Schritt (S8) :
Ablosen der adharierten Partikel (5) des ersten Partikeltyps aus den Feldkafigen (I1, 1").
7. Betriebsverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die adharierten Partikel (5) aus den Feldkafigen (I1, I1') abgelost werden, indem eine oberflachenlosende Substanz in das mikrofluidische System eingeführt wird.
8. Betriebsverfahren nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch folgenden Schritt (Sil) :
Ausspulen der oberflachenlosenden Substanz aus dem mikroflui- dischen System, wobei die beladenen Partikel (5, 6) durch ei- ne elektrische Ansteuerung der Feldkafige (I1, 1 Feldkafigen (I1, I1') fixiert werden.
9. Betriebsverfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 8, da- durch gekennzeichnet, dass die oberflachenlosende Substanz enzymatisch wirkt.
10. Betriebsverfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die oberflachenlosende Substanz aus einer Gruppe ausgewählt ist, die folgende Substanzen enthalt: a) Trypsin, b) Versen, c) Äccumax, d) Accutase, e) Chelatbilder, insbesondere Ethylendiammtetraessigsaure (EDTA) .
11. Betriebsverfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die oberflachenlosende Substanz die Oberflachenspannung ändert.
12. Betriebsverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die adharierten Partikel (5) in den Feldkafigen
(I1, I1') von Haftflachen abgelost werden, indem die Tempera- tur der Haftflachen geändert wird, so dass sich die Oberfla- cheneigenschaften der Haftflache andern.
13. Betriebsverfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Oberflacheneigenschaften der Haftfla- che durch die Temperaturanderung von hydrophil in hydrophob andern oder umgekehrt.
14. Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldkafige (I1, I'1) selektiv mit den Partikeln (6) des zweiten Parti] den werden, indem die einzelnen Feldkafige (I1, laden selektiv elektrisch angesteuert werden.
15. Betriebsverfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, a) dass die einzelnen Feldkafige (I1, l'1) jeweils ein Fangfeld erzeugen, um die Partikel des zweiten Partikeltyps in den einzelnen Feldkafigen (I1, I11) zu fi- xieren, und b) dass das Fangfeld in den Feldkafigen (I1, l'1) zur Beladung mit den Partikeln des zweiten Partikeltyps modifiziert wird.
16. Betriebsverfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, die einzelnen Feldkafige (13) zur Beladung mit den Partikeln (16) des zweiten Partikeltyps so angesteuert werden, dass Wirbelstromungen die Partikel (16) des zweiten Partikeltyps in die Feldkafige (13) tragen.
17. Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch folgenden Schritt (S6) : Untersuchung einer Reaktion zwischen den gemeinsam in den Feldkafigen (I1) befindlichen Partikeln (5, 6) der beiden Partikeltypen .
18. Betriebsverfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Untersuchung durch eines der folgenden Un- tersuchungsverfahren erfolgt: a) Impedanzspektroskopie, b) Gleichstrommessung, c) Patch-Clamp-Messung, d) Mikroskopie.
19. Betriebsverfahren nach Anspruch 17 oder 18, zeichnet durch folgenden Schritt (S7):
Selektion bestimmter Partikel (5) des ersten Partikeltyps in Abhängigkeit von der Untersuchung.
20. Betriebsverfahren nach Anspruch 19, gekennzeichnet durch folgenden Schritt (S12) :
Selektive Fixierung oder Abstoßung der selektierten Partikel (5) des ersten Partikeltyps in den Feldkafigen (I1, I11), indem die Feldkafige (I1, I1') selektiv elektrisch angesteuert werden .
21. Betriebsverfahren nach Anspruch 20, gekennzeichnet durch folgenden Schritt (S13) :
Entfernen der abgelösten und nicht fixierten Partikel (5) des ersten Partikeltyps aus dem mikrofluidischen System, insbesondere durch Ausspulen der Partikel (5).
22. Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldkafige (I1, I1') zur selektiven Beladung mit den Partikeln (5) des ersten Partikeltyps und/oder mit den Partikeln (6) des zweiten Partikeltyps elektrisch selektiv so angesteuert werden, dass die Partikel (5, 6) mittels negativer Dielektrophorese selektiv von den Feldkafigen (I1, l'1) abgestoßen und/oder mittels negativer oder positiver Dielektrophorese selektiv von den Feldkafigen (I1, I1') angezogen werden.
23. Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Feldkafige (I1, l'1) bei der Beladung mit den Partikeln (5) des zweiten Partikeltyps unterschiedlich lang und/oder unterschiedlich stark angesteuert werden, so dass sich zwischen den Feldkafi- gen (1, 1', I1') ein Gradient der Partikel (6) de Partikeltyps ausbildet.
24. Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Anspru- che, dadurch gekennzeichnet, dass sequentiell unterschiedliche Partikel (6) des zweiten Partikeltyps zugeführt werden, mit denen selektiv verschiedene Feldkafige (I1, I11) beladen werden .
25. Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel (5) des ersten Partikeltyps und die Partikel (6) des zweiten Partikeltyps aus folgender Gruppe ausgewählt sind: a) Biologische Zellen, b) Stammzellen, c) Immunzellen, d) Magnetische oder magnetisierbare Partikel, insbesondere Partikel mit einem magnetischen oder magnetisierbaren Kern. e) Antigene, f) Antikörper, g) Hormone, h) Viren, i) Bakterien, j) Latex beads, k) Vesikel,
1) Antigen-prasentierende Zellen, m) biologische Zellen, n) Makromoleküle, insbesondere Immunglobuline, o) Partikel mit einer umhüllten Zielsubstanz im Partikelinneren, p) Partikel mit einer Zielstruktur an der Partikeloberflache, insbesondere in Form von Molekülen, insbesondere biologischen Zellen oder Stammzellen, oder ren, q) Magnetische oder magnetisierbare Partikel, insbesondere
Partikel mit einem magnetischen oder magnetisierbaren Kern, r) Trofpchen, s) 2-Phasen-Systeme, bestehend aus einer wassrigen Phase und einer Olphase oder aus einer Wasserphase und einer
Olphase oder aus Gasphase und einer Wassserphase oder aus einer Wasserphase und einer Losungsmittelphase.
26. Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel (6) des zweiten Partikeltyps kleiner als die Partikel (5) des ersten Par- tikeltyps sind.
27. Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch folgenden Schritt: Bewegen der Partikel (5, 6) der verschiedenen Partikeltypen relativ zueinander durch magnetische Kräfte.
28. Betriebsverfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel (5, 6) der verschiedenen Parti- keltypen von den magnetischen Kräften a) beim Beladen der Feldkafige (1, 1', l'1) aufeinander zu bewegt werden und/oder b) beim Ausspülen der Partikel (5, 6) voneinander weg bewegt werden.
29. Betriebsverfahren nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass a) dass die magnetischen Kräfte beim Beladen der Feldkafige (1, 1', I1') geringer eingestellt werden als die die- lektrophoretischen Kräfte der Feldkäfige (1, und/oder b) dass die magnetischen Kräfte beim Ausspülen der Partikel (5, 6) geringer eingestellt werden als die Bindungskräf- te zwischen den Partikeln (5, 6) der verschiedenen Partikeltypen.
30. Betriebsverfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Untersuchung durch Mess- elektroden (10, 11) erfolgt, wobei die Messelektroden (10, 11) auf ein Potentialniveau eingestellt werden, das dem Potentialniveau entspricht, das auch ohne die Messelektroden (10, 11) an deren Ort herrschen würde.
31. Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, a) dass die Feldkäfige (1, 1', I1') während der Untersu¬ chung elektrisch nicht angesteuert werden, um eine Verfälschung der Untersuchung zu vermeiden, und/oder b) dass die Feldkäfige (1, 1', I1') abgeschirmt sind, ins¬ besondere durch eine Passivierungsschicht .
32. Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden An¬ sprüche, gekennzeichnet durch folgenden Schritt: Manipulation der Partikel (5, 6) in dem Feldkäfig (1, 1', 1'') durch Manipulationselektroden (10, 11).
33. Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, dadurch gekennzeichnet, a) dass die Partikel der beiden Partikeltypen Stammzellen und Triggersubstanzen sind, um eine bestimmte Zelldiffe¬ renzierung anzutriggern, und b) dass die Zelldifferenzierung der Stammzellen im fixierten Zustand in den Feldkäfigen erfolgt.
34. Mikrofluidisches System mit a) einer Tragerstromzufuhrung zur Zufuhrung eines Tragerstroms mit darin suspendierten Partikeln (5, 6) , gekennzeichnet durch b) mindestens einen Feldkafig (1, 1', I1'), der in Abhän¬ gigkeit von seiner elektrischen Ansteuerung die suspendierten Partikel (5, 6) fixiert oder abstoßt.
35. Mikrofluidisches System nach Anspruch 34, gekennzeichnet durch mehrere Feldkafige (1, 1', I1'), die in dem mikrofluidischen System raumlich getrennt voneinander angeordnet sind.
36. Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 34 bis
35, dadurch gekennzeichnet, dass die Tragerstromzuführung ein Tragerstromkanal ist.
37. Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 34 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektroden der einzelnen
Feldkafige (1, 1', l'1) jeweils dreidimensional oder planar angeordnet sind.
38. Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 34 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Feldkafige (1,
1', l'1) jeweils dielektrophoretische Feldkafige sind.
39. Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 34 bis 38, gekennzeichnet durch mindestens eine Hilfselektrodenan- Ordnung (9), die in dem Tragerstromkanal stromaufwärts vor oder stromabwärts hinter einem der Feldkafige (1) für die Fixierung bzw. Abstoßung der Partikel (5, 6) angeordnet ist.
40. Mikrofluidisches System nach Anspruch 39, c kennzeichnet, dass die Hilfselektrodenanordnung Trichter oder als Deflektor wirkt.
41. Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 34 bis 40, gekennzeichnet durch einen Trager (4), auf dem die FeId- kafige (1, I1, I1') angebracht sind.
42. Mikrofluidisches System nach Anspruch 41, dadurch ge- kennzeichnet, dass der Trager (4) im Wesentlichen aus Glas,
Keramik, einem Halbleiter, insbesondere Silizium, oder Kunststoff besteht.
43. Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 34 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Feldkafige (1,
1', l'1) jeweils ringförmig und/oder geschlossen sind und/oder stromabwärts eine Schwächung aufweisen.
44. Mikrofluidisches System nach Anspruch 43, dadurch ge- kennzeichnet, dass die Schwächung aus einer Passivierungs- schicht besteht.
45. Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 34 bis 44, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Feldkafige je- weils sechs oder acht 3-dimensional, insbesondere kubisch, angeordnete Kafigelektroden aufweisen.
46. Mikrofluidisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Feldkä- fige (1) entgegen der Stromungsrichtung gekrümmt sind.
47. Mikrofluidisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Feldkafige matrixformig in Zeilen und Spalten angeordnet sind.
48. Mikrofluidisches System nach Anspruch 47, c kennzeichnet, dass die Feldkäfige (1) durch Zeilen-Steuerleitungen (8) und Spalten-Steuerleitungen (7) selektiv an- steuerbar sind.
49. Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 34 bis 48, gekennzeichnet durch Anschlusskontakte, die eine lösbare elektrische Verbindung der Feldkäfige (1, I1, I'1) mit einem separaten Generator ermöglichen.
50. Mikrofluidisches System einem der Ansprüche 34 bis 49, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der Feldkäfige
(1, 1', l'1) eine äußere Ringelektrode (2) und eine innere Ringelektrode (3) aufweist.
51. Mikrofluidisches System nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, dass die Ringelektroden (2, 3) planar und/oder in einer gemeinsamen Elektrodenebene angeordnet sind.
52. Mikrofluidisches System nach Anspruch 50 oder 51, dadurch gekennzeichnet, dass innerhalb der inneren Ringelektrode (3) mindestens eine Messelektrode (10, 11) angeordnet sind, um die in dem Feldkäfig (1) fixierten Partikel (5, 6) zu vermessen.
53. Mikrofluidisches System nach Anspruch 50 oder 52, dadurch gekennzeichnet, dass innerhalb der inneren Ringelektrode (3) mindestens eine weitere Manipulationselektrode (10, 11) angeordnet sind, um die in dem Feldkäfig (1) fixierten
Partikel (5, 6) zu verändern, insbesondere elektrisch zu po- rieren oder zu fusionieren.
54. Mikrofluidisches System nach Anspruch 53, c kennzeichnet, dass innerhalb der inneren Ringele eine, zwei, drei oder vier Messelektroden (10, 11) angeordnet sind.
55. Mikrofluidisches System nach Anspruch 53 oder 54, dadurch gekennzeichnet, dass die Messelektroden (10, 11) a) rund, insbesondere oval, oder b) eckig, insbesondere rechteckig, sind.
56. Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 34 bis 55, dadurch gekennzeichnet, dass die Ringelektroden (2, 3) eine Passivierungsschicht aufweisen, wobei die Passivierungs- schicht ein Auskoppeln eines elektrischen Feldes zur Parti- kelfixierung erlaubt, wohingegen die Passivierungsschicht für Gleichstromsignale und niederfrequente Signale abschirmend wirkt .
57. Mikrofluidisches Systems nach einem der Ansprüche 34 bis 56, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einen der
Feldkäfige (1, 1', I11) ein Unterdruckanschluss (12) mündet, um die Partikel zusätzlich durch Unterdruck zu fixieren.
58. Mikrofluidisches System nach Anspruch 57, dadurch ge- kennzeichnet, dass der Unterdruckanschluss (12) zwischen den beiden Messelektroden (10, 11) ausmündet.
59. Mikrofluidisches Systems nach einem der Ansprüche 34 bis 58, dadurch gekennzeichnet, dass die Messelektroden (10, 11) in dem Feldkäfig (1) entweder symmetrisch oder unsymmetrisch angeordnet sind.
60. Mikrofluidisches System nach einem der Ansj 59, gekennzeichnet durch eine Platte, auf der die angeordnet sind.
* * * * *
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