WO2023110944A1 - REAKTIONSGEFÄßEINHEIT, VERFAHREN ZUM SELEKTIVEN ENTFERNEN EINER FLÜSSIGKEIT SOWIE ZUM EINBRINGEN EINER EINEN ZIELSTOFF ENTHALTENDEN FLÜSSIGKEIT AUS EINEM BZW. IN EIN REAKTIONSGEFÄß EINER REAKTIONSGEFÄßEINHEIT - Google Patents

REAKTIONSGEFÄßEINHEIT, VERFAHREN ZUM SELEKTIVEN ENTFERNEN EINER FLÜSSIGKEIT SOWIE ZUM EINBRINGEN EINER EINEN ZIELSTOFF ENTHALTENDEN FLÜSSIGKEIT AUS EINEM BZW. IN EIN REAKTIONSGEFÄß EINER REAKTIONSGEFÄßEINHEIT Download PDF

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Wolfgang Mann
Konstantin Mann
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Definitions

  • Reaction vessel unit method for selectively removing a liquid and for introducing a liquid containing a target substance from or into a reaction vessel of a reaction vessel unit
  • the present invention relates to a reaction vessel unit having at least one reaction vessel, a method for selectively removing a liquid from a reaction vessel of a reaction vessel unit, and a method for introducing a liquid containing a target substance into a reaction vessel of a reaction vessel unit.
  • a well-known phenomenon in laboratory work is that small volumes remain or are retained when reaction vessels are emptied.
  • Pipetting devices and pipetting robots are familiar with the problem of the so-called residual volume.
  • residual volume There is often a desire to define the residual volume precisely. If, for example, there are cells in microtiter plates, and recently also organoids or spheroids as a cell compound, the phenomenon of the residual volume when changing the culture medium poses a particular challenge. In these cases, the cellular structure should usually remain in the reaction vessel while the supernatant is removed and is replaced by fresh medium, for example.
  • flow cytometry In series tests such as flow cytometry methods (flow cytometry), it is necessary to purify the cells suspended in a nutrient liquid before they are tested, so that metabolites, dyes, markers or the like, which are present or have accumulated in the nutrient liquid, the testing do not bother.
  • flow cytometry fluorescently labeled molecules in suspension format are fed through a fluidic system to multiparametric analysis, where cells pass through a laser beam and qualitative/quantitative data is obtained from the detection of light scatter and excitation bands.
  • EP 3633022 A1 discloses the structure of an intermediate part in a microtiter plate, which serves as a mechanical barrier for an organoid located on the bottom of the plate. So that's one The culture medium can be removed using a pipette without the risk of removing the organoid, i.e. sucking it off.
  • US 2008/0003670 A1 discloses a two-sided microtiter plate with cylindrical wells which can retain fluid due to surface tension, capillary action or suitable treatment, coating or texturing of the walls.
  • US 2011/0278304 A1 shows suspension vessels in microtiter plates that can serve as a natural barrier.
  • US Pat. No. 8,602,958 B1 discloses a microtiter plate in which the outwardly directed reaction vessels release their liquid during centrifugation and the reaction vessels are emptied accordingly.
  • An object of the invention is to create a reaction vessel unit with at least one reaction vessel which enables reliable separation of two volumes contained in the reaction vessel and also enables a defined residual volume to remain in the reaction vessel when the reaction vessel is washed by centrifuging.
  • a further object of the invention is to specify a method for removing a liquid from a reaction vessel of a reaction vessel unit, which is selective in that a defined volume of fluid remains in the reaction vessel during washing by centrifugation.
  • a further object of the invention is to specify a method for introducing a liquid containing a target substance into a reaction vessel of a reaction vessel unit, which makes it possible for a defined volume of fluid, which contains at least the target substance, to remain in the reaction vessel when the reaction vessel unit is washed by centrifugation.
  • a further object of the invention is to provide a method for purifying a target substance distributed or suspended in a liquid, in particular cells, cell clusters, cell aggregates or Provide organisms that is efficient, inexpensive and fast and in which the target substance is treated gently, in particular cells or organisms are not activated.
  • a further object of the invention is to provide a method for carrying out a test on a target substance distributed or suspended in a liquid, in particular cells, cell clusters, cell aggregates or organisms, in which the target substance is treated gently, efficiently, inexpensively and quickly and in which the target substance is treated gently, in particular cells, cell clusters, cell aggregates or organisms are not activated.
  • One aspect of the invention relates to a reaction vessel unit with at least one reaction vessel which has an accommodation space for accommodating a liquid.
  • the receiving space has a retention area, which has such a surface quality and/or shape that due to an adhesive force between the liquid and the retention area and a cohesion within the liquid, the retention area exerts an increased retention effect on the liquid compared to the surrounding area, so that when Removing the liquid from the receiving space by centrifuging a predetermined amount of liquid, which is particularly small compared to the receiving space, is retained on or in the retention area.
  • a reaction vessel is understood to be a container that can be used in laboratory environments and in which a chemical reaction or a biological or microbiological process can take place or be carried out.
  • a reaction vessel unit can have a single reaction vessel or combine several reaction vessels in a fixed arrangement.
  • Liquid can be any non-gaseous fluid, which can also include gelatinous or gel-like fluids. A small amount is particularly small in comparison with the accommodation space.
  • the retention area Since the retention area is provided, which has such a surface finish and/or shape that due to an adhesive force between the liquid and the retention area and a cohesion within the liquid, the retention area exerts an increased retention effect on the liquid compared to the surrounding area, so that when removed of the liquid from the receiving space, a predetermined small amount of liquid can be retained on or in the retention area, a precisely defined residual volume can also be retained on or in the retention area when the reaction vessel is emptied.
  • the liquid and the retention area can be viewed as a system with regard to the retention effect, i.e. the properties of the liquid (e.g. density, surface tension, polarity or non-polarity) and the properties of the retention area (e.g.
  • the retention area can be specifically adapted to the fluid used and the desired application. Since for a given system of containment area and liquid the limit value for one of The acceleration acting away from the retention area can be determined, below which the retention effect predominates, the invention is particularly well suited for the use of a centrifuge device for emptying the reaction vessel while maintaining the residual volume in or on the retention area by setting the speed of the centrifuge device to a value , which is safely below the limit.
  • the invention is also suitable for other manual, machine or semi-machine methods for removing the liquid in the receiving space, such as by means of a pipetting device or by simply overturning the reaction vessel unit by hand or in a tilting device.
  • the gravitational acceleration can be sufficient for emptying, or controlled catching or impact on a surface to generate a defined acceleration below the limit value can support the emptying of the receiving space.
  • the receiving space can be delimited by a peripheral side wall and a bottom wall, and the retention area can be formed in or on the bottom wall of the receiving space.
  • the side wall may have a single side wall with a circular or oval or elliptical or other curved cross-section or multiple side walls forming a polygonal, for example square or rectangular or diamond-shaped or hexagonal cross-section with sharp or rounded edges, with rounded edges facilitating emptying of the accommodation space can.
  • the bottom wall can be flat or conical or U-shaped with sharp or rounded edges to the side wall, with rounded edges making it easier to empty the storage space.
  • the retention area can have a capillary cavity which opens into the receiving space, the walls of the capillary cavity being spaced so closely from one another that a liquid is held in the capillary cavity by capillary action.
  • a capillary cavity there is a large surface area between the liquid and the capillary cavity, which leads to a correspondingly high adhesive force due to the interfacial tension.
  • the cohesion within the liquid due to the surface tension also holds the liquid molecules together so tightly that they are not entrained when the rest of the receiving space is emptied.
  • the capillary effect thus results in accordance with the specific adhesion and cohesion forces.
  • the liquid volume in the receiving space above the capillary cavity will separate from the liquid volume in the capillary cavity and the atmosphere will flow into the receiving space, so that the interface forms at the opening of the capillary cavity and the surface tension at this interface contributes significantly to the holding effect.
  • the limit value for an acceleration acting away from the mouth of the capillary cavity can be determined for a specific system of capillary cavity and liquid, below which the capillary effect predominates, the invention is particularly well suited for the use of a centrifuge device for emptying the reaction vessel while maintaining the residual volume in the capillary cavity by setting the speed of the centrifuge device to a value that is safely below the limit value.
  • the capillary cavity can be designed as an indentation in a bottom or side wall of the receiving space.
  • the mouth of the capillary cavity can be in the middle of the bottom wall or off-centre with sharp or rounded Be formed edges to the bottom wall of the receiving space, sharp edges can facilitate retention of the liquid in the capillary cavity by capillary action.
  • the capillary cavity can also open into a side wall of the receiving space, which allows a higher speed when the receiving space is emptied. However, the handling of the liquid volumes can be easier if the capillary cavity opens into the bottom wall of the receiving space.
  • capillary cavity there is only a single capillary cavity, which simplifies access for pipetting or rinsing and also ensures that a given amount of a target substance in the liquid can be reliably associated with a given capillary volume.
  • capillary cavities can also be present, which can be flushed out individually in order to be able to remove a target substance collected therein, such as cells, in a targeted manner.
  • the capillary cavity is essentially free of intermediate walls, so that the contents of the capillary cavity can be completely removed or flushed out of the capillary cavity by introducing a fluid jet.
  • Baffles or other upstanding structures are lateral barriers that can create dead zones where a target can remain when flushing the capillary cavity. Such dead zones are a hindrance when emptying the capillary cavity and should therefore be avoided.
  • a conical or pyramidal central elevation can be formed at the bottom of the capillary cavity, which can act as a jet splitter or jet deflector for a fluid jet, but does not form a lateral barrier.
  • the capillary cavity can have a rectangular, round, or oval cross-section.
  • a wall spacing between opposing side walls or wall sections of the wall of the capillary cavity may be sized to retain liquid between the opposing side walls or wall sections of the wall of the capillary cavity by capillary action.
  • the wall distance can, for example, be no more than 2.0 mm or no more than 1.8 mm or no more than 1.6 mm or no more than 1.4 mm or no more than 1.2 mm or no more than 1.0 mm or no more than 0, be 8mm.
  • the distance from the wall can be at least 0.1 mm or 0.3 mm or 0.5 mm or 0.8 mm, for example.
  • the wall distance can be advantageously dimensioned in relation to a distance between side walls of the receiving space if the wall distance is no more than 30% or no more than 25% or no more than 20% or no more than 15% or no more than 10% or no more than 5% of the wall distance between the Side walls of the receiving space is.
  • the capillary cavity has a depth that is at least 0.5 times or at least 1 times or at least 1.5 times or at least 2 times the wall spacing between opposite side walls or wall sections of the capillary cavity.
  • the side walls of the capillary cavity are vertical or essentially vertical with a deviation of at most 5° or at most 3° or at most 2° or at most 1° or at most 0.5° from the vertical.
  • a bottom wall of the receiving space can drop conically towards an opening of the capillary cavity or can be U-shaped.
  • the bottom wall of the receiving space can form an insertion funnel for a target substance that is intended to get into the capillary cavity. Obstacles acting perpendicularly to the centrifugal force are thus avoided, particularly during centrifugation, and the target substance, such as cells, can slide along the bottom wall into the capillary cavity.
  • Such a shape also makes it easier to remove the liquid from the receiving space and to tear it away from the volume in the capillary cavity.
  • the steeper the insertion funnel the more pronounced this beneficial effect becomes. This must be coordinated with other effects.
  • the steeper the bottom wall the larger its area.
  • the volume of the receiving space that is available as a reaction volume also becomes smaller as the slope increases.
  • an ideal helix angle must be determined between these effects, which can depend, for example, on parameters such as the viscosity of the liquid or the target substance, a surface condition of the bottom wall, an adhesion potential of the target substance or the like.
  • the helix angle of the bottom wall can be at least 5° or at least 15° or at least 25° or at least 35° or at least 45° and/or at most 75° or at most 65° or at most 55° or at most 45°.
  • the helix angle is measured relative to the level of an opening of the capillary cavity. If the retention area is not a capillary cavity, the helix angle is measured to a tangential plane of a wall area in which the retention area is formed.
  • a side wall of the receiving space can also be designed to widen towards the opening with a deviation of at least 2° or at least 3° or at least 5° or at least 10° from the vertical.
  • the capillary cavity can have two opposite side walls, the distance between which is dimensioned for exerting the capillary effect, and a bottom wall running between the side walls, with the bottom wall being continuously curved or with two end walls running between the side walls, which extend from the bottom wall to an edge of the capillary cavity obliquely, in particular at a flat angle, or concavely curved.
  • Such a design makes it possible to easily flush out the fluid volume held in the capillary cavity by capillary action by means of a jet of liquid or compressed air along the bottom wall or one of the sloping end walls.
  • the walls of the capillary cavity can have a widening towards the mouth of the capillary cavity.
  • the expansion makes it possible to control the volume removed from the cavity via the centrifugal force during centrifugation, since a force balance between centrifugal force and holding force depends on the distance from the wall and the angle of separation between the walls.
  • the widening can be conical/wedge-shaped/funnel-shaped and with in particular straight or curved shape in a vertical section. A similar effect can be achieved if the walls of the capillary cavity have a coating with decreasing hydrophilic or lipophilic effect towards the mouth of the capillary cavity.
  • the balance of forces between centrifugal force and holding force depends on the distance from the wall and the hydrophilic/lipophilic effect, so that it is also possible to control the volume removed from the cavity via the centrifugal force during centrifugation.
  • An opening angle at the mouth is preferably not more than 10°, or not more than 5°, or not more than 2°, or not more than 1°, or not more than 0.5°.
  • the two variants, widening and decreasing hydrophilic/lipophilic effect, can also be used in combination.
  • the reaction vessel unit can have a plurality of reaction vessels and the capillary cavities can extend from a line, which is in particular a center line, which divides the reaction vessel unit or the arrangement of the reaction vessels into two halves, opposite a perpendicular on a plane in which the reaction vessels are arranged, increasingly angled away from the center.
  • a line which is in particular a center line, which divides the reaction vessel unit or the arrangement of the reaction vessels into two halves, opposite a perpendicular on a plane in which the reaction vessels are arranged, increasingly angled away from the center.
  • the retention area can have a surface structure increasing an adhesion effect on the liquid and a size such that due to the cohesion within the liquid, the molecules are held together so that a predetermined quantity of the liquid is retained on or in the retention area.
  • a retention area can also be formed on a flat surface, ie it is independent of capillary cavities, but can also be combined with such.
  • the retention area should not be too large because a droplet covering the entire retention area should form on the retention area due to cohesion (surface tension), so that a defined amount of liquid is retained. If the retention area is too large, then the drop extending over the retention area due to cohesion will be too large and heavy for it to be retained by the cohesive and adhesive forces.
  • the retention area with such a surface structure can also be trough-shaped. The more pronounced the depression, the better the relationship between the adhesion and the weight of the drop, so that you retain the drop.
  • the retention area may be hydrophilically coated to improve retention.
  • the receiving space be hydrophobically coated to facilitate emptying of the receiving space.
  • a combination of both measures can be particularly effective, with the hydrophobic coating of the receiving space being complementary to the hydrophilic coating of the retention area.
  • the capillary cavity can be lipophilically coated and/or the receiving space can be lipophobicly coated, optionally with a complementary coating.
  • a retention area can also be defined solely by the chemical nature of the surface compared to the surrounding area (hydrophilic/hydrophobic, lipophilic/lipophobic, rough/smooth, etc.), also independent of shape or capillarity. This makes it possible to achieve the same effect, for example using a two-dimensional spot on the flat bottom of a plate, namely retaining a defined volume for the subsequent reaction.
  • reaction vessels within the meaning of the invention are microvessels, which are often combined in the form of microtiter plates (MTP).
  • MTP microtiter plates
  • the individual reaction vessels of a microtiter plate are also referred to as wells, which are usually arranged in a predetermined grid of rows and columns, which specifies a staggering of the number and thus determines the possible filling volume.
  • wells which are usually arranged in a predetermined grid of rows and columns, which specifies a staggering of the number and thus determines the possible filling volume.
  • cells are grown individually or in cell clusters.
  • the cellular structure in the reaction vessel should generally remain undamaged when washing the microtiter plates, while the supernatant is removed and replaced with fresh medium, for example.
  • the reaction vessel unit according to the invention is particularly well possible by providing a microtiter plate in which a retention area according to the invention is formed in the bottom of each well.
  • reaction vessels have an opening on a top side of the microtiter plate. This allows easy filling and emptying of the receiving space.
  • the reaction vessel unit can advantageously be made of plastic such as polystyrene (PS), polypropylene (PP), polyolefin carbonate (POC), cyclo-olefin copolymers (COC) or polyvinyl chloride (PVC).
  • PS polystyrene
  • PP polypropylene
  • POC polyolefin carbonate
  • COC cyclo-olefin copolymers
  • PVC polyvinyl chloride
  • This enables particularly simple production true to shape and size using production processes known per se, such as injection molding, injection blow molding, thermoforming or the like, in combination with properties that enable an optical analysis of the cavity or capillary.
  • other materials are also possible, in particular glass.
  • the use of photosensitive glasses or glass ceramics is known, for example, for the production of picotiter plates.
  • the reaction vessel unit can have several reaction vessels and the retention effects of the retention areas of at least two reaction vessels can be different.
  • the differences can preferably be pronounced in such a way that the holding effect increases from a line, which is in particular a center line, which divides the reaction vessel unit or the arrangement of the reaction vessels into two halves, so that a holding force of the retention area increases when the reaction vessel unit is rotated about an axis , which is parallel to the center line and whose radius through the center line perpendicular to a plane in which the reaction vessels are arranged, is constant or approximately constant across the reaction vessels remains.
  • reaction vessel assembly e.g., microtiter plate
  • the centrifugal forces increase from the center line toward the edge of the plate because the distance from the axis of rotation increases.
  • This can be compensated for by adjusting the holding effect of the restraint areas.
  • the wall spacing of a capillary cavity can become narrower towards the edge of the plate and/or the capillary cavities can be increasingly angled towards the center and/or the hydrophilic/lipophilic effects of a coating can increase.
  • variable holding effects can also be advantageous for different separation volumes or special test arrangements. For example, test arrangements are conceivable in which the volume from the retention area is only to be removed for some of the reaction vessels in order to realize a time series in a single plate.
  • a concentration series can be realized if a defined volume of a target liquid is repeatedly held in the retention area while removing the residual volume in the receiving space, then a defined volume of a diluting liquid is added (dispensed) to the receiving space and the receiving space is emptied after the target liquid has mixed with the dilution liquid.
  • the defined volume of the now diluted target liquid then remains in the retention area. For example, if the retention area has a volume of 1% compared to the receiving space, the target liquid initially located in the retention area is diluted by 1:100 during dispensing in the first step.
  • the method is particularly advantageous for displaying a concentration series in a microtiter plate without the using up pipette tips or other consumables, but simply by repeatedly evacuating the recording space.
  • the dilution can also be adjusted very precisely due to the defined volumes, in particular the retention area, so that lower requirements can be placed on the dosing accuracy when dispensing the liquids.
  • the dispensing process can be carried out in such a way that the target liquid mixes directly with the dilution liquid during the dispensing, for example by the dispensing being combined with a rinsing of the retention area with the dilution liquid.
  • the target liquid in the retention area can be centrifuged into the receiving space with the diluting liquid so that the two liquids mix in the receiving space, and if necessary, can then be centrifuged in the opposite direction to reliably close the retention area with the diluted target liquid again to fill.
  • the reverse case is also conceivable, namely that the dilution liquid is forced into the retention area by centrifugation.
  • a catching device can be provided, which is arranged opposite an opening of the receiving space or openings of the receiving spaces of the at least one reaction vessel and is designed to collect liquid escaping or expelled from the receiving space or the receiving spaces.
  • the catching device can have one or more compartments, preferably in the form of a microtiter plate, with an opening of the compartment or openings of the compartments of the catching device facing the opening of the receiving space or the openings of the receiving spaces of the at least one reaction vessel.
  • the number of compartments of the capture device can be equal to, greater than or less than a number of reaction vessels.
  • a second plate can be mounted as a catching device on the first plate (the reaction vessel unit) and the supernatant from the second plate can be caught.
  • the collected fluid can be reused, which can allow for a significant saving on the often expensive fluids that are used.
  • the catching device can be compartmentalized like the reaction vessel unit itself. If the reaction vessel unit has, for example, a microtiter plate with 96 or 384 or another number of reaction vessels, the catching device can also be designed as a microtiter plate with 96 or 384 or the other number of compartments. The catching device can also have more or fewer compartments than there are reaction vessels. For example, the catching device can also be designed as just a simple shell. Then the supernatants are pooled and an aliquot can be analyzed e.g. by NGS (next generation sequencing). The catcher plate can also have a number of compartments that differs from the number of reaction vessels in the reaction vessel unit, either up or down.
  • Another aspect of the invention is a method for selectively removing a liquid from a reaction vessel of a reaction vessel unit.
  • the liquid is in a reaction vessel unit as described above, and the method comprises the steps:
  • the reaction vessel unit can be arranged in a centrifuge device, for example, in a position in which the openings of all reaction vessel units point away from the centrifuge axis.
  • the centrifuge device can then be controlled with a time-speed profile which is suitable for centrifuging out the liquid in the receiving space, but the liquid in or on the retention area, for example in the capillary cavity, remains there.
  • This method is suitable both for emptying reaction vessels of nutrient or reaction liquid while preserving a target substance, such as an array of cells, and for separating any liquid volumes.
  • the procedure also avoids the use of special devices inside the centrifugation device, such as magnetic devices capable of holding a substance loaded with magnetic beads or the like at the bottom of the reaction vessel during centrifugation. Although this is possible in principle, it requires a higher outlay in terms of equipment with structural changes to the centrifuge device and the movement of additional mass within the centrifuge device, because such a magnet device must of course rotate with the reaction vessel unit.
  • the remaining liquid is collected in a catching device, in particular as described above. This allows the remaining volume removed to be used for other purposes, which can help reduce costs and save resources.
  • a further aspect of the invention is a method for introducing a liquid containing a target substance into a reaction vessel of a reaction vessel unit, comprising the steps of:
  • the guidance system having:
  • an electrostatically charged adjuvant or property of the target substance and an electrode device arranged to interact with the electrostatically charged magnetic adjuvant or property.
  • a target substance can be any substance, including chemical and biological substances, that is part of a liquid solution and that is to be selectively separated from most of the liquid solution.
  • the target substance is a substance whose reaction in the reaction vessel is to be caused or observed.
  • a guidance system is a system which is designed to move the target substance in a desired direction, primarily towards the retention area, for example into the capillary cavity.
  • the guidance system can react to the target substance itself and/or a matrix in which the target substance is embedded in order to form a target substance system, or to auxiliary substances contained therein.
  • Centrifugation is particularly suitable for target substances or target substance systems that have a higher density than the liquid. If the retention area is a capillary cavity, the method can be carried out in such a way that the mouth of the capillary cavity points radially to the centrifugation axis. Thus, due to the centrifugal acceleration acting towards the mouth of the capillary cavity, they are reliably guided to the mouth of the capillary cavity and pressed into the capillary cavity.
  • Magnetic auxiliaries can be magnetic beads, for example.
  • Electrostatically charged auxiliary substances can be any charge carrier.
  • Certain target substances, such as DNA molecules, can be electrically charged so that they can be attracted to an electrode device.
  • the electrode device may be provided in the reaction vessel unit, in the single reaction vessel, or externally.
  • the target substance or target substance system can then also be reliably separated from the remaining liquid.
  • this can be achieved by centrifuging the reaction vessel unit with the retention area located radially on the inside or essentially on the inside with respect to the centrifugation axis in relation to the rest of the receiving space, at a speed that is less than a limit speed at which the retention effect of the retention area is just overcome, so that an in or partial volume of the liquid, which is directed to the retention area and contains the target substance, remains there and the liquid remaining in the receiving space is removed.
  • the remaining liquid can be caught in a catching device, in particular as described above.
  • a catching device such as a catcher plate, is arranged “overhead” before centrifugation opposite the openings of the receiving spaces of the reaction vessels.
  • a further aspect of the invention is a method for purifying a target substance distributed in a liquid, such as cells, cell clusters, cell aggregates or organisms, in a reaction vessel of a reaction vessel unit, the liquid being located in a reaction vessel unit as described above, with the steps:
  • the mixing may include at least one of the following:
  • the receiving space can have a volume of about 200 to 400 pl, wherein the retention area is a capillary cavity at the bottom of the receiving space and has a volume of about 5 pl, and wherein the collection of the target substance is carried out by centrifugation with at least 2 g or at least 5g or at least 10g or at least 20g and/or at most 1000g or at most 500g or at most 200g or at most 100g or at most 50g or at most 40g or at most 30g or at most 20g for a time of at least 1 s or at least 2 s or at least 5 s or at least 10 s or at least 10 s or at least 30 s or at least 60 s or at least 90 s or at least 2 minutes or at least 5 minutes and/or for a maximum of 60 minutes or a maximum of 30 minutes or a maximum of 20 minutes or a maximum of 15 minutes or a maximum of 10 minutes or a maximum of 5 minutes or a maximum of 2 minutes or a maximum of 1 minute or
  • the volume of the receiving area of about 200 to 400 ⁇ l is typical for a reaction vessel unit in a 96-well microtiter plate format. It turns out that the load can be more than an order of magnitude lower than when pelleting with approx. 300g, which reduces the stress on cells or Organisms significantly reduced.
  • the dimensions of the capillary cavity can change accordingly, and the g-forces can be higher accordingly.
  • the dimensions of the capillary cavity can change accordingly, and the g-forces can be lower accordingly.
  • the removed liquid can be collected in a catching device, as described above.
  • a further aspect of the invention is a method for performing an assay on a target substance, such as cells, cell aggregates, cell aggregates or organisms, distributed or suspended in a liquid, in a reaction vessel of a reaction vessel unit.
  • the liquid is in a reaction vessel unit as described above.
  • the procedure has the steps:
  • a test device such as a flow cytometry device.
  • This method enables testing to be carried out with the advantages of the purification method described above. Due to the protection of the cells or organisms, they do not react or react only slightly, which significantly reduces the influence of the method itself on the measurement and makes the measurements significantly more reliable and reproductive. Of course, all other test methods on a target substance that is distributed or suspended in a liquid, in which the target substance may have impurities or undesired accompanying or auxiliary substances, can benefit from the new method.
  • FIG. 1 shows a reaction vessel of a reaction vessel unit according to an embodiment of the invention in a sectional side view
  • FIG. 2 shows a reaction vessel of a reaction vessel unit according to an embodiment of the invention in a sectional side view
  • FIG. 3 shows a reaction vessel of a reaction vessel unit according to an embodiment of the invention in a plan view
  • FIG. 4 shows a reaction vessel of a reaction vessel unit according to an embodiment of the invention in a plan view
  • FIG. 5 shows a reaction vessel of a reaction vessel unit according to an embodiment of the invention in a plan view
  • FIG. 6A shows the reaction vessel from FIG. 5 in a side view cut along a line VI-VI;
  • FIG. 6B shows the reaction vessel from FIG. 5 in a modified embodiment in a side view cut along the line VI-VI;
  • FIG. 1 a reaction vessel of a reaction vessel unit according to an embodiment of the invention in a plan view
  • FIG. 8 shows a reaction vessel unit in the form of a microtiter plate according to an embodiment of the invention in a plan view
  • FIG. 9 shows a centrifuge device with two reaction vessel units as in FIG. 8 in a partially sectioned side view to illustrate methods according to exemplary embodiments of the invention
  • FIG. 10 shows a filled reaction vessel corresponding to FIG. 1 in a reaction vessel unit and a magnet device in a partially sectioned side view to illustrate a method according to an exemplary embodiment of the invention
  • FIG. 11 shows a reaction vessel of a reaction vessel unit according to an embodiment of the invention in a sectional side view
  • FIG. 12 shows a reaction vessel of a reaction vessel unit according to an embodiment of the invention in a sectional side view
  • FIGS. 13A-13C a filled reaction vessel in a sectional side view to illustrate a method according to an embodiment of the invention
  • FIG. 14 shows a reaction vessel of a reaction vessel unit according to an exemplary embodiment of the invention in a sectional side view.
  • reaction vessel unit 20 has at least one reaction vessel 1 ( Figures 1-7, 10). When used alone, the reaction vessel 1 can also be understood as a reaction vessel unit within the meaning of the invention.
  • the reaction vessel 1 has a receiving space 2 for receiving a liquid and a capillary cavity 3 which opens into the receiving space 2 .
  • the receiving space 2 has a peripheral side wall 4 and a bottom wall 5 .
  • An upper edge of the side wall 4 can form an opening 6 in the receiving space 2 .
  • the capillary cavity 3 opens into the receiving space 2 via an orifice 7 on the bottom wall 5.
  • the capillary cavity 3 has walls 8 extending from the orifice 7, which are spaced so closely from one another that a liquid which is in the capillary cavity 3 can pass through Capillary action in the capillary cavity 3 is maintained.
  • Capillary action occurs in narrow vessels and can be understood by a balance of forces between the surface tension of the liquid and an interfacial tension between the liquid and a vessel surface.
  • a liquid can rise between narrow walls by capillary action and form a concave surface if the liquid wets the material of the wall, or descend and form a convex surface if the liquid does not wet the material of the wall.
  • the capillary effect also depends on the density of the liquid, the radius or the distance from the wall of the vessel and the gravitational acceleration. For example, the height h of a liquid column in a cylindrical vessel is described by the equation
  • o is the surface tension
  • 0 is the contact angle
  • p is the density of the liquid
  • g is the gravitational acceleration
  • r is the radius of the vessel.
  • the capillary cavity 3 opens into the receiving space 2 and the walls 8 of the capillary cavity 3 are spaced so closely from one another that a liquid is held in the capillary cavity 3 by capillary action, a precisely defined residual volume can be retained in the capillary cavity 3 when the reaction vessel 1 is emptied be, while the receiving space 2 is emptied reliably. Emptying can be done, for example, by centrifugation, as will be described in more detail below, or by other means, such as aspiration/pipetting.
  • the bottom wall 5 of the receiving space 2 can be flat ( Figure 1). To facilitate the emptying of the receiving space 2 as well as the collection in the capillary cavity 3, the bottom wall 5 can also fall conically towards the mouth 7 of the capillary cavity 3 ( Figures 2, 13A-13C, 14) or be U-shaped (not shown in detail), to form a kind of funnel towards the capillary cavity 3 .
  • a helix angle ⁇ of the bottom wall 5 relative to the plane of the opening 7 of the capillary cavity 3 (this plane is perpendicular to the vertical V and thus a horizontal plane) must be matched to the application and can advantageously be between 5° and 75°.
  • An edge 9 between the bottom wall 5 and the side wall 4 of the receiving space 2 can be sharp or rounded, with rounded edges being able to make it easier for the receiving space 2 to be emptied.
  • side wall 4 of receiving space 2 forms a square cross section ( Figures 3, 4, 5, 7), i.e. it has in particular a plurality of side walls 16 which meet at edges 17 and form the side wall 4 which is closed overall (cf. Figure 3) .
  • the cross section of the receiving space 2 can also be rectangular or generally polygonal, for example rhombic or hexagonal, or round, oval, elliptical or curved in any way.
  • the edges 17 between the individual side walls 16 can be sharp or rounded, with rounded edges 17 making it easier to empty the receiving space 2 .
  • the cross section of the capillary cavity 3 can be round (FIG. 3), square (FIG. 4) or oval (FIG. 7) or have any other suitable cross-sectional shape.
  • the opening 7 of the capillary cavity 3 can be arranged in the middle of the bottom wall 5, as is the case in the exemplary embodiments shown in FIGS. In modifications, the opening 7 of the capillary cavity 3 can also be arranged eccentrically in the bottom wall 5 of the receiving space 2 .
  • An edge 10 (see FIGS. 1, 2) between the walls 8 of the capillary cavity 3 and the bottom wall 5 of the receiving space 2 can be sharp or rounded.
  • a sharp edge 10 can facilitate retention of the liquid in the capillary cavity 3 by capillary action.
  • the capillary action is determined by the wall spacing between opposite side walls 18 or wall sections 19 of the wall 8 of the capillary cavity 3, with the surface texture and the surface tension of the liquid also having a significant influence on the capillary action.
  • the wall spacing between opposite side walls 18 or wall sections 19 of the capillary cavity 3 is dimensioned such that liquid is held between the opposite side walls 18 or wall sections 19 of the capillary cavity 3 by capillary action.
  • the distance from the wall can be roughly between 0.1 mm and 2.0 mm, for example. Suitable upper and lower limits have been mentioned above, with the specific upper limit selected being determined by the expected or desired capillary action and the specific lower limit selected being determined by the application.
  • the ratio of the distance from the wall of the capillary cavity 3 to the distance from the wall of the receiving space 2 itself is also decisive for the application. If the capillary cavity 3 is too wide in relation to the receiving space, it can be difficult to realize a technically useful difference in capillary action.
  • the capillary action of the capillary action 3 is therefore always to be understood in relation to a fundamentally conceivable but then significantly smaller capillary action in the receiving space 2 .
  • the capillary effect of the receiving space 2 can also be further reduced in that the side wall 4 of the receiving space 2 widens toward the opening 6 by an opening angle ⁇ relative to the vertical V (FIG. 14).
  • the opening angle ⁇ can be between 0.5° and 5°, for example, in order to significantly reduce capillary action.
  • the capillary cavity 3 consists of two opposite side walls 18, the distance between which is dimensioned for exerting the capillary effect, and one between the side walls 18 extending bottom wall 12, the bottom wall 12 being curved and in the edge
  • the capillary cavity 3 has an elongate cross-sectional shape, particularly at the mouth 7. Sometimes it may be desirable to first empty the receiving space 2 and then also to remove the residual volume remaining in the capillary cavity 3. This is particularly easy in this exemplary embodiment, in that the fluid volume held in the capillary cavity 3 by capillary action is flushed out along the curved bottom wall 12 by means of a liquid jet or compressed air.
  • the capillary cavity 3 can have the two opposite side walls 18, the distance between which is dimensioned to exert the capillary effect, and a flat bottom wall 13 running between the side walls 18 and two sloping from the flat bottom wall 13 at an edge 15 and between the side walls 18 have running end walls 14, wherein the sloping end walls 14 end in the edge 11 at the mouth 7 in the bottom wall 5 of the receiving space 2 ( Figures 5, 6B).
  • the effect of the facilitated emptying of the capillary cavity 3 corresponds to the variant with a curved bottom wall 12, the effect being all the more pronounced the flatter the end walls 14 run.
  • the alignment of the capillary cavity 3 with respect to the direction of rotation determines whether the residual volume is held in the capillary cavity 3 or is centrifuged out as well. If the side walls 18 of the capillary cavity 3 are aligned at right angles to the direction of rotation, the residual volume in the capillary cavity 3 is held. When the side walls 18 of the capillary cavity 3 are aligned with the direction of rotation, the residual volume is ejected from the capillary cavity 3 .
  • the reaction vessel unit is therefore preferably designed in such a way that the side walls 18 of the capillary cavity are aligned transversely to the direction of rotation during centrifugation.
  • a capillary cavity can also be formed by a structure located anywhere in the receiving space, which protrudes from the bottom or the side walls.
  • a capillary cavity can be realized, for example, by a ring structure with a narrow diameter or by parallel walls that form a capillary gap.
  • a release system can thus advantageously be formed, for example, ie a system for the time-delayed release of a target substance into a liquid located in the receiving space.
  • the capillary cavity is filled as described above, and then the receiving space is filled with another liquid. Instead of immediately mixing with the liquid, the target substance can slowly migrate into the liquid, such as by diffusion.
  • One application is, for example, a series of tests on the long-term effects of a drug on a cell culture.
  • the target substance in the capillary cavity is the drug or reagent that is intended to interact with the cells and whose effect on cell growth, for example, is being tested.
  • a nutrient solution containing the cell culture fills the receiving space.
  • the cells can also be adherent, ie they adhere to the surface of the receiving space.
  • the cells can also be held in a second capillary cavity become.
  • the reagent is to be brought into contact with the cells.
  • this release system can release the reagent immediately or over a longer period of time.
  • the release system and the delivery of the reagent can be controlled.
  • the capillary cavity with the reagent is open at the top (on the outside in the radial direction), for example two vertical ribs in a side wall.
  • a cover can be provided which tightly seals the receiving space at least for this time.
  • the capillary cavity 3 can have a hydrophilic coating.
  • the receiving space can be given a hydrophobic coating. This can be, for example, by using PTFE, generally by substances that have contact angles of about 90° or greater in the presence of water.
  • FIG. 11 shows a modification of a reaction vessel 1 in which the walls 8 of the capillary cavity 3 widen towards the mouth 7 .
  • the walls 8 have a distance d2 in the area of the mouth 7 that is greater than a distance dl in the area of the bottom wall 13
  • Balance of forces between centrifugal force and holding force depends on the distance from the wall and the angle of separation between the walls.
  • the capillary cavity is preferably designed in such a way that it widens gradually or approximately uniformly from the bottom wall 13 to the mouth 7 , so that the horizontal cross-sectional area of the capillary cavity 3 becomes increasingly larger in the direction of the mouth 7 .
  • the capillary cavity can be emptied to different extents with different centrifugal forces.
  • a similar effect can be achieved if the walls of the capillary cavity have a coating with decreasing hydrophilic or lipophilic effect towards the mouth of the capillary cavity.
  • the walls 8 can be curved in order to achieve the widening (FIG. 12).
  • a radius of curvature r of the wall 8 can be constant or variable over the course of the wall 8 .
  • the capillary cavity 3 is an example of a retention area whose shape and/or surface quality is such that due to an adhesive force between the liquid and the retention area and a cohesion within the liquid, the retention area exerts an increased retention effect on the liquid compared to the surrounding area , so that a predetermined small amount of liquid can be retained when removing the liquid from the receiving space. It is also conceivable to create such a retention area on a bottom or side wall of the receiving space solely through an increased adhesive effect with the liquid compared to the surrounding area of the bottom or side wall, for example through different hydrophilic/hydrophobic or lipophilic/lipophobic Formation, through different coatings, roughening, smoothing, etc. It will be advantageous to design the size of such an area to the desired residual volume, so that a droplet of a defined size forms, which adheres to the area and remains as compact as possible, without breaking up into several partial drops.
  • the retention areas can be of the same design in order to accommodate a plurality of partial volumes of the same type, or of different types in order to accommodate or hold partial volumes or target substances of different types, for example.
  • the retention areas can be of the same design in order to accommodate a plurality of partial volumes of the same type, or of different types in order to accommodate or hold partial volumes or target substances of different types, for example.
  • An exemplary embodiment of the invention is a reaction vessel unit 20 in the form of a microtiter plate with a frame 21 which includes a large number of individual reaction vessels 1 (FIG. 8).
  • the individual reaction vessels 1 of a microtiter plate 20 are also referred to as wells, which are usually arranged in a predetermined, regular grid of rows and columns.
  • the grid specifies a staggering in the number of reaction vessels 1 and thus also determines the possible filling volume.
  • cells are cultivated individually or in cell clusters in connection with cell-based assays.As described at the beginning, when washing the microtiter plates, the cellular structure should generally remain in the reaction vessel, while the supernatant is removed and, for example, through This is particularly well possible with the reaction vessel unit according to the invention by providing a microtiter plate in which a capillary cavity is formed in the bottom of each well.
  • Microtiter plates come in different sizes and designs.
  • a microtiter plate with 24 wells is referred to as a 24-well titer plate, a microtiter plate with 384 wells as a 384-well titer plate, etc.
  • the wells can have different bottom shapes, such as F-bottom (flat bottom), C-bottom (flat bottom with minimally rounded edges), V-bottom (tapered bottom) and U-bottom (U-shaped indentation).
  • the wells can have different cross-sectional shapes, such as round, oval, elliptical, square, diamond-shaped, hexagonal, with polygonal shapes also being able to have rounded edges.
  • the reaction vessel unit 20 is a 96-well titer plate with eight rows arranged in the width B direction and twelve columns arranged in the width B direction. A distance of the reaction vessels 1 from x is the same in the length and width direction, but the invention is not limited to this.
  • the reaction vessels 1 and their receiving space 2 each have a round cross section, and the capillary cavities 3 embedded in the bottom wall of the receiving space 2 also have a round cross section.
  • the invention is not limited to this.
  • the reaction vessel unit 20 is only partially fully marked, while contours beyond a tear line are only indicated by dashed lines and reaction vessels 1 are only indicated by their center points.
  • the known centrifuges for washing microtiter plates are designed in such a way that the axis of rotation of the centrifuge is parallel to the longitudinal direction of the respective microtiter plate. It is therefore expedient that the elongated capillary cavities explained above are also aligned parallel to the longitudinal direction of the microtiter plate.
  • cells are grown in microtiter plates.
  • the cells connect on the surface (they become adherent) and sooner or later they have to be subjected to a change of medium, otherwise the nutrient medium poisons the cells or becomes otherwise unusable.
  • inventive methods that enable centrifuge-based washing of microtiter plates, such as described in US 2021/138485 A1 and US Pat. No. 11,117,142 B2 mentioned at the outset.
  • cell aggregates have been increasingly used for test purposes in the pharmaceutical industry. These are spheroids or organoids, i.e. cells in a group (up to a few hundred). These are also attracted to microtiter plates, but their smooth surface often prevents the cells from adhering.
  • matrices can be used for this, which are poured into the plate so that the cells are trapped and can grow.
  • An example is the GrowDex matrix (www.Growdex.com).
  • a well is one-third filled with matrix, and two-thirds of the culture medium above it.
  • the matrices have somewhat gel-like properties and stick to the plate, but not particularly firmly. With centrifuge-based washing, you only want to wash the medium out of the plate, without washing out the cells (including matrix). Above a certain centrifugal acceleration, however, the gel would also be thrown out of the plate.
  • the present invention can be applied very well to such a reaction vessel unit 20 in the form of a microtiter plate which is washed by means of a centrifuge.
  • a limit value for an acceleration acting away from the opening 7 of the capillary cavity 3 can be determined for a specific system of capillary cavity 3 and liquid, below which the capillary effect predominates. If the microtiter plate is used as a reaction vessel unit 20 while maintaining the residual volume in of the capillary cavity 3 is to be emptied, the speed of the centrifuge can be set to a value that is safely below the limit value.
  • the capillary cavity 3 of the reaction vessel 3 1 has an equally advantageous effect if the reaction vessel 1 is emptied in some other way, such as by means of a pipetting device.
  • Prototypes have shown that the limit speed for aqueous solutions with uncoated polycarbonate microtiter plates is typically in the range of a few 100 rpm and preferably no greater than 1000 rpm and in particular no greater than 800 rpm or 500 rpm or 300 rpm.
  • Microtiter plates as well as other types of reaction vessel units or reaction containers can advantageously be made of plastic and can be manufactured by manufacturing methods known per se, such as injection molding or the like.
  • the reaction vessel unit 20 in the form of the microtiter plate can be designed in one piece with all reaction vessels 3 .
  • the invention is neither limited to the choice of material nor to the one-piece design.
  • a method for selectively removing a liquid from the reaction vessel 1 of a reaction vessel unit 20 using a centrifuge 30 is another exemplary embodiment of the invention (FIG. 9).
  • the centrifuge 30 is only shown with the parts that are essential for understanding the invention.
  • the centrifuge 30 has a frame-shaped rotor 31 which is fastened on a shaft 32 in a rotationally fixed manner.
  • the shaft 32 can be set in rotation by a motor (not shown) in order to rotate at an angular velocity co or a corresponding speed n about a centrifuge axis 33, which can be controlled and regulated by a control unit (not shown in detail), whereby the rotor 31 rotates.
  • a cover 34 which can be designed in the form of a cylindrical tube and can be part of a housing (not shown in detail), surrounds the frame 31.
  • a carrier 35 (English: carrier) for accommodating a reaction vessel unit 20 is arranged in a accommodating section of the rotor 31.
  • the carrier 35 together with a reaction vessel unit 20 in the form of a microtiter plate can be pushed by a loading unit (not shown) from the end face of the rotor 31 into its receiving section, the receiving section receiving the carrier 35 in the manner of a rail and the reaction vessel unit 20 can hold in the manner of a clamp from radially outside.
  • the liquid is initially in a reaction vessel 1 of the reaction vessel unit 20 as described above. Then, the reaction vessel unit 20 is placed on the carrier 35 and loaded into the centrifuge 30 with the mouth 6 of the accommodating space 2 of the reaction vessel 1 facing away from the centrifuging axis 33 (upper part (A) in Figure 9). Finally, the rotor 31 is set in rotation with the reaction vessel unit 1, the speed n being regulated in such a way that it is less than a limit speed at which the capillary action of the capillary cavity 3 is just overcome. In this way it can be brought about that the liquid located in the capillary cavity 3 remains therein and the remaining liquid located in the receiving space 2 ejected, i.e. removed.
  • the centrifuge 30 can be controlled with a suitable time-speed profile.
  • the ejected liquid can be caught in the interior of the cover 34 and removed. It can also be caught in a catcher plate or other catching device, which is placed with its at least one opening on the reaction vessel unit 20 before being spun out, in order to be able to reuse the spun-out liquid.
  • the carrier 35 with the washed reaction vessel unit 20 can be removed and the reaction vessel unit 20 with the residual volume retained in the capillary cavity 3 can continue to be used.
  • the receiving space 2 can be filled with new nutrient liquid and the cells can be further attracted.
  • the method is also suitable for separating any volume of liquid.
  • a method for introducing a liquid 40 containing a target substance 41 into a reaction vessel 1 of a reaction vessel unit 20 is a further exemplary embodiment of the invention, which can also be carried out with the aid of the centrifuging device 30 (FIG. 9).
  • the reaction vessel unit 20 is first used to hold the liquid 40 together with the target substance 41 in one of the reaction vessels 1 (FIG. 10).
  • the target substance 41 can, but does not have to, be embedded in a matrix 42 .
  • An auxiliary substance 43 can, but does not have to, also be embedded in the matrix 42 .
  • the reaction vessel unit 20 is placed on the tray 35 and loaded into the centrifuge 30 with the mouth 7 of the capillary cavity 3 of the reaction vessel 1 facing radially to the centrifugation axis 33 (lower part (B) in Figure 9).
  • the rotor 31 is then set in rotation with the reaction vessel unit 1, as a result of which a centrifugal acceleration a acts in the direction of the bottom wall 5 of the receiving space 2, which separates the target substance 41, optionally together with the matrix 42 and optional auxiliary substance 43, from the rest of the liquid 40 and in the capillary cavity 3 of the reaction vessel 1 urges.
  • the speed n of the centrifuge device 30 can be regulated so that it is greater than a second limit speed at which a resistance that can result from an air or liquid volume in the capillary cavity 3 is reliably pressed out of the capillary cavity 3 can be.
  • the centrifuge device 30 can be controlled with a suitable time-speed profile.
  • the trough 35 with the reaction vessel unit 20 can then be removed and the reaction vessel unit 20 with the target substance 41 accommodated in the capillary cavity 3 can continue to be used.
  • a target substance 41 such as an array of cells
  • the reaction vessel 1 or the reaction vessel unit 20 can be used to attract the cells.
  • nutrient liquid can always be removed as required using the method described above and replaced by new nutrient liquid, with the target substance 41 reliably remaining in the capillary cavity 3 .
  • Another method for introducing a liquid 40 containing a target substance 41 into a reaction vessel 1 of a reaction vessel unit 20 is a modification of the previous exemplary embodiment of the invention, which differs therefrom in the control system used.
  • This modification uses as a guidance system an adjuvant 43 which is magnetic and a magnetic device 44 which is arranged to interact with the magnetic adjuvant 43 for carrying out the method ( Figure 10).
  • a liquid 40 containing a target substance 41 can be filled into the reaction vessel 1 of a reaction vessel unit 20 and accommodated therein.
  • the target substance 41 can be, for example, a cell assembly such as a spheroid or an organoid, but the invention is not limited to this.
  • the auxiliary substance 43 can comprise magnetic beads, for example.
  • the magnetic device 44 can have an electromagnet 45 consisting of a ferrite core 46 and a winding 47 and a power source 48 . To carry out the method, the electromagnet 45 can be arranged exactly under the capillary cavity 3 of the reaction vessel 1.
  • the magnet device 44 can also be stationary and the reaction vessel 1 can be positioned relative to the magnet device 44 in such a way that the capillary cavity 3 of the reaction vessel 1 comes to lie exactly over the electromagnet 45 .
  • the magnetic device can have a multiplicity of electromagnets 45 which are arranged exactly in the grid wells of the microtiter plate.
  • the power source 48 is switched on, the ferrite core 46 is polarized and can exert a magnetic attraction force on the magnetic additive 43 . This is thereby forced into the capillary cavity 3 and pulls the matrix 42 with the target substance 41 along with it.
  • One or more permanent magnets can also be used instead of one or more electromagnets.
  • a magnetic property of the target substance 41 or of the matrix 42 itself can also be used in order to interact with the magnetic device 44.
  • the target substance 41 could have ferritic material or biomagnetically active cells. Because biomagnetic phenomena are often very weak, appropriate design of the magnetic device 44 may be required to achieve the required interaction.
  • a further modification of the method for introducing a liquid containing a target substance into a reaction vessel 1 of a reaction vessel unit 20 differs again in the control system used.
  • This modification uses as a guidance system an adjuvant 43 which is electrostatically charged and an electrode device 49 which is arranged to interact with the adjuvant 43 for carrying out the method ( Figure 10).
  • a liquid 40 containing a target substance 41 can be filled into the reaction vessels 1 of a reaction vessel unit 20 and contained therein.
  • the target substance 41 can for example, a cell assembly such as a spheroid or an organoid, but the invention is not limited to this.
  • the auxiliary substance 43 can comprise ionized particles, for example.
  • the electrode device 49 can have an electrode 50 running under the capillary cavity 3 of the reaction vessel 1 and a power source (not shown in detail).
  • the electrode 50 can be integrated in the bottom of the reaction vessel 1 or that of the reaction vessel unit 20 or provided externally, in which case the electrode 50 must be arranged under the capillary cavity 3 of the reaction vessel 1 to carry out the method.
  • the power source is switched on, the electrode 50 exerts an attractive force on the electrostatically charged additive 43 . This is thereby forced into the capillary cavity 3 and pulls the matrix 42 with the target substance 41 along with it.
  • the electrode can have a flat extension in the area of the capillary cavity 3 , while it is thin in areas away from the capillary cavity 3 , so that the electrostatic attraction is concentrated under the capillary cavity 3 .
  • the electrode 50 can be constructed in a grid-like manner, with grid nodes being arranged exactly in the grid of the wells of the microtiter plate and optionally having the areal extent described above.
  • an electrostatic property of the target substance 41 or of the matrix 42 itself can also be used in order to interact with the electrode device 49.
  • the target substance 41 could have charged cells or molecules. Because such charges are often very weak, appropriate design of the electrode assembly 49 may be required to achieve the required interaction.
  • the supernatant ie the residual volume not accommodated in the capillary cavity
  • the supernatant can be removed from the accommodation space 2 using the method described above for separating or selectively removing.
  • a catching device can advantageously be used to catch the residual volumes, for example in order to be able to reuse expensive reactances or use them for other purposes.
  • reaction vessel unit in which the forces occur as a result of different adhesion or capillary action that the physically present gradient in the centrifugal acceleration (due to the different radius) by means of a suitable design of the Retention areas is exactly compensated and the retained partial volumes have the same size everywhere after centrifugation despite this gradient.
  • the principle of the invention can also be used to form a system for the controlled and time-delayed release of a target substance to a sample, a so-called release system protrudes from the bottom or the side walls and forms a capillary gap.
  • a capillary located somewhere in the plate is filled as described herein.
  • Reagent is a substance that is intended to interact with cells and whose effect on cell growth, for example, is tested.
  • the reagent is usually brought into contact with the cells in the receiving space.
  • the cells can also be adherent, i.e. they stick to the surface of the receiving space.
  • this release system can release the reagent immediately or over a longer period of time.
  • the release system and the delivery of the reagent can be controlled by exerting a centrifugal force.
  • a particularly advantageous application of the invention is a method for purifying cells that form a target substance 41 .
  • the target substance 41 can also equally comprise cell clusters, cell aggregates or organisms or other, in particular organic/biological substances, but in the following only cells are mentioned as an example.
  • the cells are in a reaction vessel 1 of a reaction vessel unit in suspension in a liquid 40.
  • the reaction vessel 1 has a funnel-shaped bottom wall 5 which opens into a capillary cavity 3.
  • the reaction vessel unit can be designed, for example, in the 96-well microtiter plate format.
  • the reaction vessels 1 can have a receiving space 2 with a working volume of 200 ⁇ l and a capillary cavity 3 with a receiving volume of 5 ⁇ l.
  • the cells are initially distributed largely uniformly in the receiving space 2 of the reaction vessel unit 1 ; cells can also be located in the capillary cavity, the distribution of which essentially corresponds to the distribution in the rest of the receiving space 2 .
  • the reaction vessel unit in a first step, is received in a centrifuge in such a way that the capillary cavity 3 points away from the centrifugation axis 33 (cf. arrangement (B) in Figure 9), and is rotated about a centrifugation axis 33 at an angular velocity coi .
  • an acceleration a is exerted on the suspension, as a result of which the cells, supported by the slope of the funnel-shaped bottom wall 5, collect in the capillary cavity 3 (FIG. 13A).
  • the angular velocity coi is set in such a way that the acceleration a is 10 to 30 g and the centrifugation 2 to 4 minutes last. At the end of this step, there are no or hardly any more cells in the receiving space 2 above the capillary cavity 3 .
  • the reaction vessel unit is received in the same centrifuge or in another centrifuge in such a way that the capillary cavity 3 faces the centrifugation axis 33 (cf. arrangement (A) in Figure 9), and is made to rotate about the centrifugation axis 33 at an angular velocity CÜ2.
  • the angular velocity CÜ2 is adjusted in such a way that the liquid 40 is thrown out of the receiving space 2 of the reaction vessel 1 under the effect of the acceleration a, the cells in the capillary cavity 3, which are still in suspension but in a much higher concentration , are held in the capillary cavity 3 by capillary forces K.
  • the liquid 40 in the receiving space 2 separates from the liquid 40 with the cells in the capillary cavity 3, and atmosphere 130 flows into the space above the capillary cavity 3, so that a phase boundary 131 is formed, which spans the mouth 7 of the capillary cavity 3 and its surface tension contributes to capillary action (Figure 13B).
  • the receiving space 2 above the capillary cavity 3 is completely emptied of liquid 40 and the cells are concentrated in the capillary cavity.
  • the emptying process can take about 30 seconds in the present example.
  • the receiving space 2 of the reaction vessel 1 is filled with liquid 40 again.
  • this is done by a dispensing device.
  • the liquid 40 is metered into the receiving space 2 in a dispensing nozzle 132 .
  • a liquid flow 133 has a velocity v at the outlet of the dispensing nozzle 132 .
  • the dispensing nozzle 133 is directed towards the capillary cavity 3 so that the cells (41) are washed out or flushed out of the capillary cavity 3 and are distributed in the liquid 40 throughout the receiving space 2 (FIG. 13C).
  • the speed is measured in such a way that the cells are flushed out of the capillary cavity 3 but always remain in suspension in the liquid 40 without the liquid 40 sloshing out of the reaction vessel 1 . Even if this is shown in the figure, it is not necessary for the dispensing nozzle 132 to protrude into the receiving space 2 . Rather, the dispensing nozzle 132 can also end above the opening 6 of the receiving space 2 . At the end of this step, the cells are again largely evenly distributed in the liquid 40 in the receiving space 2 . In the present example, the process of filling can take about 15 seconds (preferably for all ninety-six reaction vessels 1 in this example, which are in particular filled row by row).
  • the stress on the cells during purification can be significantly reduced compared to conventional methods, such as pelleting.
  • a loss of cells, which can occur during emptying in the second step, can be kept low (less than 10%) and can be replaced before, after or during refilling if necessary.
  • the dispensing device can be attached to the centrifuge, and the reaction vessel unit can be moved by a loading and unloading device of the centrifuge, enabling accurate and efficient positioning of the reaction vessel unit with respect to a rotation space of the centrifuge and with respect to the dispensing device.
  • the reaction vessel assembly can remain on or in the centrifuge throughout the process.
  • ti Discharge device which has a rigid displacement rod for positioning the reaction vessel unit in or for removing the reaction vessel unit from a rotor of the centrifuge, the displacement rod being arranged displaceably by means of a linear motor in such a way that it extends through the rotor in a discharge position in the rotor space and in a Loading position is at least pulled out of the area of the rotor space that is claimed by the rotor during one revolution, is described in WO 2017/125598 A1, to whose disclosure content reference is made in this respect in its entirety.
  • a centrifuge equipped with such a loading and unloading device, in which a dispensing unit is also attached to an outer wall of the centrifuge, by means of which a reagent liquid can be supplied to a reaction vessel unit located underneath in the unloading position, is described in the subsequently published DE 10 2021 124 023.9. full reference is made to the disclosure content in this regard.
  • the assembly of the cells in the capillary cavity 3 can also take place by means other than centrifugation, such as magnetically, electrostatically or the like as previously described.
  • removal of the liquid 40 can be accomplished by means other than centrifugation, such as pipetting.
  • refilling can also be done by pipetting.
  • the above method of purification can be advantageously used in the context of assays where cells are assayed in suspension.
  • a partial volume is removed from the suspension in the purified state and fed to a test device.
  • the loss of cells from testing can optionally be replaced.
  • the capillary cavity 3 is essentially free of walls in order to avoid shadowing of dispensing jets, rinsing jets or the like, which could form dead zones in which a target substance remains undesirably during rinsing.
  • a central, approximately pyramid-like or conical elevation 140 with a tip 141 can be provided on the bottom of the capillary cavity 3 (FIG. 14).
  • the rest of the base of the capillary cavity 3 around the elevation 140 can be designed with as few edges as possible in order to enable the most laminar flow possible.
  • This application discloses a reaction vessel unit (20) with at least one reaction vessel (1) which has a receiving space (2) for receiving a liquid (40), the receiving space (2) having a retention area which has such a surface finish and/or shape that due to an adhesive force between the liquid and the retention area and a cohesion within the liquid, the retention area exerts an increased retention effect on the liquid (40) compared to the surrounding area, so that a predetermined small amount of liquid when the liquid (40) is removed is retained in the receiving space (2) by centrifugation on or in the retention area.
  • a method for selectively removing a liquid (40) from a reaction vessel (1) of the reaction vessel unit (20) by centrifugation is also disclosed.
  • a method for bringing in a liquid (40) containing a target substance (41) into a reaction vessel (1) of the reaction vessel unit (20), wherein the target substance (41) is guided to the retention area by means of a guidance system by centrifugation or magnetic or electrostatic interaction also discloses a method for purifying a target substance (41) distributed or suspended in a liquid (40), such as cells, cell clusters, cell aggregates or organisms, and a method for carrying out a test on a target substance (41) distributed or suspended in a liquid (40). suspended target substance (41) with the aid of the reaction vessel unit (20) according to the invention.

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Abstract

Diese Anmeldung offenbart eine Reaktionsgefäßeinheit (20) mit wenigstens einem Reaktionsgefäß (1), welches einen Aufnahmeraum (2) zur Aufnahme einer Flüssigkeit (40) aufweist, wobei der Aufnahmeraum (2) einen Rückhaltebereich aufweist, der eine solche Oberflächenbeschaffenheit und/oder Form aufweist, dass aufgrund einer Adhäsionskraft zwischen der Flüssigkeit und dem Rückhaltebereich und einer Kohäsion innerhalb der Flüssigkeit der Rückhaltebereich gegenüber dem umgebenden Bereich eine erhöhte Haltewirkung auf die Flüssigkeit (40) ausübt, so dass eine vorbestimmte geringe Menge an Flüssigkeit beim Entfernen der Flüssigkeit (40) aus dem Aufnahmeraum (2) durch Zentrifugieren am oder im Rückhaltebereich zurückgehalten wird. Weiter wird ein Verfahren zum selektiven Entfernen einer Flüssigkeit (40) aus einem Reaktionsgefäß (1) der Reaktionsgefäßeinheit (20) durch Zentrifugation offenbart. Ferner wird ein Verfahren zum Einbringen einer einen Zielstoff (41) enthaltenden Flüssigkeit (40) in ein Reaktionsgefäß (1) der Reaktionsgefäßeinheit (20) offenbart, wobei der Zielstoffs (41) zu dem Rückhaltebereich mittels eines Leitsystems durch Zentrifugation oder magnetische oder elektrostatische Wechselwirkung geleitet wird. Die Anmeldung offenbart ferner ein Verfahren zum Aufreinigen eines in einer Flüssigkeit (40) verteilten oder suspendierten Zielstoff (41), wie etwa Zellen, Zellhaufen, Zellagregate oder Organismen, und ein Verfahren zum Durchführen einer Testung an einem in einer Flüssigkeit (40) verteilten oder suspendierten Zielstoff (41) mit Hilfe der erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßeinheit (20).

Description

Reaktionsgefäßeinheit, Verfahren zum selektiven Entfernen einer Flüssigkeit sowie zum Einbringen einer einen Zielstoff enthaltenden Flüssigkeit aus einem bzw. in ein Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reaktionsgefäßeinheit mit wenigstens einem Reaktionsgefäß, ein Verfahren zum selektiven Entfernen einer Flüssigkeit aus einem Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit sowie ein Verfahren zum Einbringen einer einen Zielstoff enthaltenden Flüssigkeit in ein Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit.
Bei Laborarbeiten ist ein bekanntes Phänomen, dass beim Leeren von Reaktionsgefäßen kleine Volumina verbleiben oder zurückgehalten werden. Pipettiervorrichtungen und Pipettierroboter kennen das Problem des sogenannten Residualvolumens. Oft besteht der Wunsch, das Residualvolumen genau festzulegen. Wenn sich beispielsweise in Mikrotiterplatten Zellen befinden, neuerdings auch Organoide oder Sphäroide als Zellverbund, so stellt das Phänomen des Residualvolumens bei Wechsel des Nährmediums eine besondere Herausforderung dar. In diesen Fällen soll in der Regel die zelluläre Struktur in dem Reaktionsgefäß verbleiben, während der Überstand abgenommen und beispielsweise durch frisches Medium ersetzt wird.
Bei Reihentestungen wie etwa durchflusszytometrischen Verfahren (flow cytometry) ist es erforderlich, die in einer Nährflüssigkeit suspendierten Zellen aufzureinigen, bevor sie getestet werden, sodass etwa Stoffwechselprodukte, Farbstoffe, Marker oder dergleichen, die in der Nährflüssigkeit vorhanden sind oder sich angesammelt haben, die Testung nicht stören. Bei der Durchflusszytometrie werden fluoreszenzmarkierte Moleküle im Suspensionsformat durch ein Fluidiksystem einer multiparametrischen Analyse zugeführt, bei der die Zellen einen Laserstrahl passieren und aus der Detektion von Lichtstreuung und Anregungsbändern qualitative/quantitative Daten ermittelt werden. Weitere Informationen können beispielsweise Fortis Life Sciences, „Flow Cytometry Protocols for Extracellular & Intracellular Targets" entnommen werden, am Anmeldetag zum Download bereitgestellt auf https://www.fortislife.com/products/documents/flow-cytometry- protocols-for-extracellular-intracellular-targets/appnote002. Zum Zweck der Aufreinigung ist es üblich, die Zellen durch Zentrifugation bei beispielsweise 300 g für eine Dauer von beispielsweise 5 Minuten zu pelletieren. Die Pelletierung stellt einen hohen Streßfaktor für die Zellen dar. So kann es zu unerwünschten Reaktionen oder auch Aktivierungen wie etwa einer Änderung der Genexpression kommen, die für die nachfolgenden Messungen nachteilig oder verfälschend sein können.
Die EP 3633022 Al offenbart den Aufbau eines intermediären Teils in einer Mikrotiterplatte, das als mechanische Barriere für ein am Boden der Platte befindliches Organoid dient. Damit ist ein Abnehmen von Nährmedium mittels Pipette möglich, ohne dass die Gefahr besteht, das Organoid mit zu entfernen, also abzusaugen.
Aus der US 2008/0003670 Al geht eine zweiseitige Mikrotiterplatte mit zylindrischen Näpfchen hervor, die Fluid aufgrund Oberflächenspannung, Kapillarwirkung oder geeignete Behandlung, Beschichtung oder Texturierung der Wände zurückhalten kann.
Die US 2011/0278304 Al zeigt Einhängegefäße in Mikrotiterplatten, die als natürlich Barriere dienen können.
Die US 8,602,958 Bl offenbart eine Mikrotiterplatte, bei deren Zentrifugation die nach außen gerichteten Reaktionsgefäße ihre Flüssigkeit abgeben und die Reaktionsgefäße entsprechend geleert werden.
Die US 2021/138485 Al und US 11,117,142 B2 offenbaren Zentrifugiervorrichtungen zum Reinigen einer Reaktionsgefäßeinheit. Mit diesen Zentrifugiervorrichtungen werden die Reaktionsgefäße mit ihren Öffnungen von der Rotationsachse wegweisend angeordnet, so dass beim Zentrifugieren die in den Reaktionsgefäßen enthaltene Flüssigkeit heraus geschleudert wird. Es hat sich gezeigt, dass so die Flüssigkeit rückstandsfrei aus den Reaktionsgefäßen entfernt werden kann und ein hoher Reinheitsgrad erzielt werden kann. Auf diese Art und Weise gereinigte Reaktionsgefäße können erneut für biologische Reaktionen verwendet werden, bei welchen ein einzelnes Molekül, insbesondere ein DNA- oder RNA-Strang, eine nicht tolerierbare Verunreinigung darstellen kann. Das Ausschleudern von Flüssigkeit aus den Reaktionsgefäßen durch Zentrifugieren wird im Folgenden auch als „Waschen durch Zentrifugieren" bezeichnet, wobei ein solcher Waschvorgang mit oder ohne Zugabe einer Waschlösung ausgeführt werden kann.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, eine Reaktionsgefäßeinheit mit wenigstens einem Reaktionsgefäß zu schaffen, welches eine zuverlässige Trennung zweier in dem Reaktionsgefäß enthaltener Volumina ermöglicht und auch ermöglicht, dass beim Waschen des Reaktionsgefäßes durch Zentrifugieren ein definiertes Residualvolumen im Reaktionsgefäß zurückbleibt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Entfernen einer Flüssigkeit aus einem Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit anzugeben, welches selektiv in der Hinsicht ist, dass bei Waschen durch Zentrifugieren ein definiertes Fluidvolumen in dem Reaktionsgefäß verbleibt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Einbringen einer einen Zielstoff enthaltenden Flüssigkeit in ein Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit anzugeben, welches es ermöglicht, dass bei Waschen der Reaktionsgefäßeinheit durch Zentrifugieren ein definiertes Fluidvolumen, welches wenigstens den Zielstoff enthält, in dem Reaktionsgefäß verbleibt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Aufreinigen eines in einer Flüssigkeit verteilten oder suspendierten Zielstoffs, insbesondere Zellen, Zellhaufen, Zellagregate oder Organismen, bereitzustellen, das effizient, kostengünstig und schnell ist und bei dem der Zielstoff schonend behandelt wird, insbesondere Zellen oder Organismen nicht aktiviert werden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Durchführen einer Testung an einem in einer in einer Flüssigkeit verteilten oder suspendierten Zielstoffs, insbesondere Zellen, Zellhaufen, Zellagregate oder Organismen, bereitzustellen, bei dem der Zielstoff schonend behandelt wird das effizient, kostengünstig und schnell ist und bei dem der Zielstoff schonend behandelt wird, insbesondere Zellen, Zellhaufen, Zellagregate oder Organismen nicht aktiviert werden.
Eine oder mehrere der Aufgaben der Erfindung werden wenigstens in Teilaspekten durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen und vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Ein Gesichtspunkt der Erfindung betrifft eine Reaktionsgefäßeinheit mit wenigstens einem Reaktionsgefäß, welches einen Aufnahmeraum zur Aufnahme einer Flüssigkeit aufweist. Erfindungsgemäß weist der Aufnahmeraum einen Rückhaltebereich auf, der eine solche Oberflächenbeschaffenheit und/oder Form aufweist, dass aufgrund einer Adhäsionskraft zwischen der Flüssigkeit und dem Rückhaltebereich und einer Kohäsion innerhalb der Flüssigkeit der Rückhaltebereich gegenüber dem umgebenden Bereich eine erhöhte Haltewirkung auf die Flüssigkeit ausübt, sodass beim Entfernen der Flüssigkeit aus dem Aufnahmeraum durch Zentrifugieren eine vorbestimmte, insbesondere im Vergleich zum Aufnahmeraum geringe Menge an Flüssigkeit am oder im Rückhaltebereich zurückgehalten wird.
Als Reaktionsgefäß wird im Sinne der Erfindung ein in Laborumgebungen verwendbares Behältnis verstanden, in dem eine chemische Reaktion oder ein biologischer oder mikrobiologischer Vorgang stattfinden oder durchgeführt werden kann. Eine Reaktionsgefäßeinheit kann ein einziges Reaktionsgefäß aufweisen oder mehrere Reaktionsgefäße in einer fixierten Anordnung zusammenfassen. Flüssigkeit kann jedes nicht gasförmige Fluid sein, wobei davon auch gallert- oder gelartige Fluide umfasst sein können. Eine kleine Menge ist insbesondere klein im Vergleich mit dem Aufnahmeraum. Da der Rückhaltebereich vorgesehen ist, der eine solche Oberflächenbeschaffenheit und/oder Form aufweist, dass aufgrund einer Adhäsionskraft zwischen der Flüssigkeit und dem Rückhaltebereich und einer Kohäsion innerhalb der Flüssigkeit der Rückhaltebereich gegenüber dem umgebenden Bereich eine erhöhte Haltewirkung auf die Flüssigkeit ausübt, so dass beim Entfernen der Flüssigkeit aus dem Aufnahmeraum eine vorbestimmte geringe Menge an Flüssigkeit am oder im Rückhaltebereich zurückgehalten werden kann, kann auch beim Leeren des Reaktionsgefäßes ein genau definiertes Residualvolumen am oder im Rückhaltebereich gehalten werden. Dabei können die Flüssigkeit und der Rückhaltebereich in Bezug auf die Haltewirkung als System betrachtet werden, das heißt, dass die Eigenschaften der Flüssigkeit (beispielsweise Dichte, Oberflächenspannung, Polarität oder Unpolarität) und die Eigenschaften des Rückhaltebereichs (beispielsweise Form, Rauigkeit, chemische Beschaffenheit, Grenzwinkel mit der Flüssigkeit) bei der Ausbildung der Adhäsions- und Kohäsionskräfte Zusammenwirken, um die Haltewirkung auszubilden. Das heißt, dass der Rückhaltebereich auf das verwendete Fluid und die gewünschte Anwendung gezielt angepasst sein kann. Da für ein bestimmtes System aus Rückhaltebereich und Flüssigkeit der Grenzwert für eine von dem Rückhaltebereich weg wirkende Beschleunigung bestimmt werden kann, unterhalb welcher die Haltewirkung überwiegt, eignet sich die Erfindung besonders gut für die Verwendung einer Zentrifugiervorrichtung zum Leeren des Reaktionsgefäßes unter Beibehaltung des Residualvolumens in oder an dem Rückhaltebereich, indem die Drehzahl der Zentrifugiervorrichtung auf einen Wert festgelegt wird, der sicher unterhalb des Grenzwertes liegt. Ebenso eignet sich die Erfindung aber auch für andere manuelle, maschinelle oder teilmaschinelle Verfahren zum Entfernen der Flüssigkeit im Aufnahmeraum, wie etwa mittels einer Pipettiervorrichtung oder durch einfaches Stürzen der Reaktionsgefäßeinheit von Hand oder in einer Kipp-Vorrichtung. Beim Stürzen kann je nach System die Gravitationsbeschleunigung zur Leerung ausreichen, oder es kann ein kontrolliertes Abfangen oder Aufstoßen auf einer Oberfläche, um eine definierte Beschleunigung unterhalb des Grenzwertes zu erzeugen, das Leeren des Aufnahmeraums unterstützen.
In Ausführungsformen kann der Aufnahmeraum durch eine umlaufende Seitenwandung und eine Bodenwandung begrenzt sein und der Rückhaltebereich in oder an der Bodenwandung des Aufnahmeraums ausgebildet sein. Die Seitenwandung kann eine einzige Seitenwand mit kreisförmigem oder ovalem oder elliptischem oder anders gekrümmten Querschnitt oder mehrere Seitenwandungen, die einen polygonalen, beispielsweise quadratischen oder rechteckigen oder rautenförmigen oder hexagonalen Querschnitt mit scharfen oder gerundeten Kanten bilden, aufweisen, wobei gerundete Kanten eine Leerung des Aufnahmeraums erleichtern können. Die Bodenwandung kann flach oder konisch oder U-förmig mit scharfen oder gerundeten Kanten zur Seitenwandung ausgebildet sein, wobei gerundete Kanten eine Leerung des Aufnahmeraums erleichtern können.
In Ausführungsformen kann der Rückhaltebereich eine Kapillarkavität aufweisen, die in den Aufnahmeraum mündet, wobei die Wandungen der Kapillarkavität so eng voneinander beabstandet sind, dass eine Flüssigkeit in der Kapillarkavität durch Kapillarwirkung gehalten wird. Bei einer Kapillarkavität liegt eine große Oberfläche zwischen der Flüssigkeit und der Kapillarkavität vor, die zu einer entsprechend hohen Adhäsionskraft aufgrund der Grenzflächenspannung führt. Auch hält die Kohäsion innerhalb der Flüssigkeit aufgrund der Oberflächenspannung die Flüssigkeitsmoleküle so fest zusammen, dass sie beim Entleeren des übrigen Aufnahmeraums nicht mitgerissen werden. Die Kapillarwirkung ergibt sich also entsprechend den spezifischen Adhäsions- und Kohäsionskräfte. Insbesondere wird sich beim Ausschleudern der Flüssigkeit das Flüssigkeitsvolumen im Aufnahmeraum oberhalb der Kapillarkavität von dem Flüssigkeitsvolumen in der Kapillarkavität trennen und Atmosphäre in den Aufnahmeraum strömen, sodass sich Grenzfläche bildet an der Öffnung der Kapillarkavität bildet und die Oberflächenspannung an dieser Grenzfläche ausgeprägt zur Haltewirkung beiträgt. Da für ein bestimmtes System aus Kapillarkavität und Flüssigkeit der Grenzwert für eine von der Mündung der Kapillarkavität weg wirkende Beschleunigung bestimmt werden kann, unterhalb welcher die Kapillarwirkung überwiegt, eignet sich die Erfindung besonders gut für die Verwendung einer Zentrifugiervorrichtung zum Leeren des Reaktionsgefäßes unter Beibehaltung des Residualvolumens in der Kapillarkavität, indem die Drehzahl der Zentrifugiervorrichtung auf einen Wert festgelegt wird, der sicher unterhalb des Grenzwertes liegt. Die Kapillarkavität kann als Eintiefung in einer Boden- oder Seitenwand des Aufnahmeraums ausgebildet sein. Die Mündung der Kapillarkavität kann in der Mitte der Bodenwandung oder außermittig mit scharfen oder gerundeten Kanten zur Bodenwandung des Aufnahmeraums ausgebildet sein, wobei scharfe Kanten ein Zurückhalten der Flüssigkeit in der Kapillarkavität durch Kapillarwirkung erleichtern können. In alternativen Ausführungsformen kann die Kapillarkavität auch in einer Seitenwand des Aufnahmeraums münden, was eine höhere Drehzahl beim Leeren des Aufnahmeraums zulässt. Die Handhabung der Flüssigkeitsvolumina kann jedoch einfacher sein, wenn die Kapillarkavität in der Bodenwandung des Aufnahmeraums mündet.
Vorzugsweise ist nur eine einzige Kapillarkavität vorhanden, was den Zugriff für Pipettierung oder Ausspülen vereinfacht und auch sicherstellt, dass eine bestimmte Menge eines Zielstoffs in der Flüssigkeit zuverlässig einem bestimmten Kapillarvolumen zugeordnet werden kann. Für andere Anwendungen können jedoch auch mehrere Kapillarkavitäten vorhanden sein, die für sich einzeln ausgespült werden können, um einen darin gesammelten Zielstoff wie etwa Zellen daraus gezielt entfernen zu können.
Ferner ist es bevorzugt, wenn die Kapillarkavität im Wesentlichen frei von Zwischenwänden ist, so dass ein Inhalt der Kapillarkavität durch Einführen eines Fluidstrahles aus der Kapillarkavität vollständig entfernt bzw. ausgespült werden kann. Zwischenwände oder andere aufragende Strukturen sind laterale Sperren, diese können Totzonen bilden, in denen ein Zielstoff beim Ausspülen der Kapillarkavität Zurückbleiben kann. Solche Totzonen sind beim Leeren der Kapillarkavität hinderlich und daher zu vermeiden. Zur Unterstützung des Ausspülens kann jedoch am Boden der Kapillarkavität eine kegel- oder pyramidenartige mittige Erhebung ausgebildet sein, welche als Strahlteiler oder Strahlumlenker für einen Fluidstrahl wirken kann, aber keine laterale Sperre bildet.
In Ausführungsformen kann die Kapillarkavität einen rechteckigen, runden oder ovalen Querschnitt aufweisen. Ein Wandabstand zwischen gegenüberliegenden Seitenwänden oder Wandabschnitten der Wandung der Kapillarkavität kann bemessen sein, um Flüssigkeit durch Kapillarwirkung zwischen den gegenüberliegender Seitenwänden oder Wandabschnitten der Wandung der Kapillarkavität zu halten. Je nach Flüssigkeit und Beschaffenheit der Wandung kann der Wandabstand beispielsweise höchstens 2,0 mm oder höchstens 1,8 mm oder höchstens 1,6 mm oder höchstens 1,4 mm oder höchstens 1,2 mm oder höchstens 1,0 mm oder höchstens 0,8 mm sein. Ferner kann der Wandabstand weiter beispielsweise mindestens 0,1 mm oder 0,3 mm oder 0,5 mm oder 0,8 mm sein. Der Wandabstand kann zur Optimierung des Kapillareffekts in Bezug auf einen Abstand zwischen Seitenwandungen des Aufnahmeraums vorteilhaft dimensioniert sein, wenn der Wandabstand höchstens 30% oder höchstens 25% oder höchstens 20% oder höchstens 15% oder höchstens 10% oder höchstens 5% des Wandabstands zwischen den Seitenwandungen des Aufnahmeraums ist.
Auch ist es im Hinblick auf den Kapillareffekt vorteilhaft, wenn die Kapillarkavität eine Tiefe aufweist, die wenigstens das 0,5-fache oder wenigstens das 1-fache oder wenigstens das 1,5-fache oder wenigstens das 2-fache eines Wandabstands zwischen gegenüberliegenden Seitenwänden oder Wandabschnitten der Kapillarkavität ist. Zur Ausbildung eines wirksamen Kapillareffekts ist es vorteilhaft, wenn die Seitenwände der Kapillarkavität vertikal oder im Wesentlichen vertikal mit einer Abweichung von höchstens 5° oder höchstens 3° oder höchstens 2° oder höchstens 1° oder höchstens 0,5° von der Vertikalen ausgebildet sind.
In Ausführungsformen kann eine Bodenwandung des Aufnahmeraums zu einer Mündung der Kapillarkavität hin konisch abfällt oder U-förmig ausgebildet sein. Dadurch kann die Bodenwandung des Aufnahmeraums einen Einführtrichter für einen Zielstoff, der in die Kapillarkavität gelangen soll, bilden. Insbesondere beim Zentrifugieren werden so Hindernisse, die senkrecht zur Zentrifugalkraft wirken, vermieden, und der Zielstoff, wie zum Beispiel Zellen, kann an der Bodenwandung entlang in die Kapillarkavität gleiten. Auch erleichtert eine solche Form das Entfernen der Flüssigkeit aus dem Aufnahmeraum und das Abreißen von dem Volumen in der Kapillarkavität. Je steiler der Einführtrichter ist, umso ausgeprägter wird dieser vorteilhafte Effekt. Dies ist mit anderen Wirkungen abzustimmen. Je steiler die Bodenwandung ist, desto größer wird auch ihre Fläche. Dadurch erhöht sich auch die Wahrscheinlichkeit einer Anhaftung des Zielstoffs, etwa Zellen, Zellhaufen, Zellagregate oder Organismen, die sich in dem Reaktionsgefäß befinden. Auch wird mit steigender Schräge der das Volumen des Aufnahmeraums, das als Reaktionsvolumen zur Verfügung steht, kleiner. Zwischen diesen Effekten ist je nach Anwendungsfall ein idealer Schrägungswinkel zu bestimmen, der beispielweise von Parametern wie Viskositäten der Flüssigkeit oder des Zielstoffs, einer Oberflächenbeschaffenheit der Bodenwandung, eines Adhäsionspotentials des Zielstoffs oder dergleichen abhängen kann. Beispielsweise kann der Schrägungswinkel der Bodenwandung wenigstens 5° oder wenigstens 15° oder wenigstens 25° oder wenigstens 35° oder wenigstens 45° und/oder höchstens 75° oder höchstens 65° oder höchstens 55° oder höchstens 45° betragen. Der Schrägungswinkel ist dabei zur Ebene einer Mündung der Kapillarkavität gemessen. Falls der Rückhaltebereich keine Kapillarkavität ist, ist der Schrägungswinkel zu einer tangentialen Ebene eines Wandungsbereichs, in dem der Rückhaltebereich ausgebildet ist, gemessen.
Zur Erhöhung der Kapillarwirkung der Kapillarkavität gegenüber dem Aufnahmeraum kann auch eine Seitenwandung des Aufnahmeraums sich zur Öffnung hin weitend mit einer Abweichung von wenigstes 2° oder wenigstes 3° oder wenigstes 5° oder wenigstes 10° von der Vertikalen ausgebildet sein.
In Ausführungsformen kann die Kapillarkavität zwei gegenüberliegende Seitenwände, deren Abstand zur Ausübung der Kapillarwirkung bemessen ist, und eine zwischen den Seitenwänden verlaufende Bodenwand aufweist, wobei die Bodenwand stetig gekrümmt ist oder wobei ferner zwei zwischen den Seitenwänden verlaufende Stirnwände vorgesehen sind, die von der Bodenwand aus zu einem Rand der Kapillarkavität schräg, insbesondere flachwinklig, oder konkav gekrümmt ansteigen. Eine solche Ausgestaltung ermöglicht es, das durch Kapillarwirkung in der Kapillarkavität gehaltene Fluidvolumen mittels eines Flüssigkeitsstrahls oder Druckluft entlang der Bodenwand oder einer der schrägen Stirnwände leicht auszuspülen.
In Ausführungsformen können die Wandungen der Kapillarkavität zur Mündung der Kapillarkavität hin eine Aufweitung aufweisen. Die Aufweitung ermöglicht eine Steuerung des entnommenen Volumens aus der Kavität über die Zentrifugalkraft beim Zentrifugieren, da ein Kräftegleichgewicht zwischen Zentrifugalkraft und Haltekraft vom Wandabstand und dem Spreizungswinkel zwischen den Wänden abhängt. Die Aufweitung kann konisch/keilförmig/trichterförmig und mit insbesondere gerader oder gekrümmter Form in einem vertikalen Schnitt sein. Eine ähnliche Wirkung kann erzielt werden, wenn die Wandungen der Kapillarkavität zur Mündung der Kapillarkavität hin eine Beschichtung mit abnehmender hydrophiler oder lipophiler Wirkung aufweisen. Hier hängt das Kräftegleichgewicht zwischen Zentrifugalkraft und Haltekraft vom Wandabstand und der hydrophilen/lipophilen Wirkung ab, sodass auch damit eine Steuerung des entnommenen Volumens aus der Kavität über die Zentrifugalkraft beim Zentrifugieren möglich ist. Ein Öffnungswinkel an der Mündung beträgt vorzugsweise nicht mehr als 10° oder nicht mehr als 5° oder nicht mehr als 2° oder nicht mehr als 1° oder nicht mehr als 0,5°. Die beiden Varianten Aufweitung und abnehmende hydrophile/lipophile Wirkung können auch kombiniert eingesetzt werden.
In Ausführungsformen kann die Reaktionsgefäßeinheit mehrere Reaktionsgefäße aufweisen und können die Kapillarkavitäten von einer Linie aus, die insbesondere eine Mittellinie ist, welche die Reaktionsgefäßeinheit oder die Anordnung der Reaktionsgefäße in zwei Hälften teilt, gegenüber einem Lot auf einer Ebene, in welcher die Reaktionsgefäße angeordnet sind, zunehmend von der Mitte weg angewinkelt sein. Wenn die Reaktionsgefäßeinheit mit Kapillarkavitäten, die parallel zueinander angeordnet sind, in einer Zentrifuge zentrifugiert wird, wirken die Zentrifugalkräfte von der Mittellinie aus zum Rand der Platte hin zunehmend auch gegen die Seitenwände der Kavitäten, weil der Winkel zum Radius von der Rotationsachse größer wird. Dadurch wird die Austreibwirkung kleiner. Das kann durch eine Anpassung der Ausrichtung der Kavitäten wie durch die oben beschriebene Anwinkelung kompensiert werden.
In Ausführungsformen kann der Rückhaltebereich eine eine Adhäsionswirkung auf die Flüssigkeit erhöhende Oberflächenstruktur und eine Größe aufweisen, so dass sich aufgrund der Kohäsion innerhalb der Flüssigkeit ein Zusammenhalt der Moleküle bildet, dass eine vorbestimmte Menge der Flüssigkeit am oder im Rückhaltebereich gehalten wird. Ein solcher Rückhaltebereich kann grundsätzlich auch an einer ebenen Oberfläche ausgebildet sein, er ist also unabhängig von Kapillarkavitäten, kann aber auch mit solchen kombiniert werden. Der Rückhaltebereich sollte nicht zu groß bemessen sein, denn auf dem Rückhaltebereich sollte sich ein den gesamten Rückhaltebereich abdeckender Tropfen aufgrund der Kohäsion (Oberflächenspannung) ausbilden, so dass eine definierte Menge an Flüssigkeit zurück gehalten wird. Ist der Rückhaltebereich zu groß, dann ist das sich aufgrund der Kohäsion über den Rückhaltebereich erstreckende Tropfen zu groß und schwer, so dass er nicht durch die Kohäsions- und Adhäsionskräfte zurück gehalten werden kann. Dies führt dazu, dass nur ein Teil des Rückhaltebereichs mit einem oder mehreren kleinen Tropfen zurück gehalten werden, deren Volumen nicht definiert ist. Dies möchte man vermeiden. Der Rückhaltebereich mit einer solchen Oberflächenstruktur kann auch muldenförmig geformt sein. Je stärker die Mulde ausgeprägt ist, desto besser ist das Verhältnis zwischen der Adhäsion und dem Gewicht des Tropfens, so dass dir Rückhaltung des Tropfens.
In Ausführungsformen für wässrige Lösungen kann der Rückhaltebereich hydrophil beschichtet sein, um die Haltewirkung zu verbessern. In weiteren Ausführungsformen kann der Aufnahmeraum hydrophob beschichtet sein, um das Leeren des Aufnahmeraums zu erleichtern. Eine Kombination beider Maßnahmen kann besonders wirksam sein, dabei kann die hydrophobe Beschichtung des Aufnahmeraums komplementär zu der hydrophilen Beschichtung des Rückhaltebereichs sein. Zur Handhabung von unpolaren Lösungen, wie fettige und ölige Lösungen, kann die Kapillarkavität lipophil und/oder der Aufnahmeraum lipophob, gegebenenfalls komplementär, beschichtet sein. Ein Rückhaltebereich kann auch allein durch die chemischen Beschaffenheit der Oberfläche im Vergleich mit dem umgebenden Bereich (hydrophil/hydrophob, lipophil/lipophob, rau/glatt etc.) definiert sein, auch unabhängig von Form oder Kapillarität. Damit ist es möglich, den gleichen Effekt beispielsweise durch einen zweidimensionalen Spot am flachen Boden einer Platte zu erreichen, nämlich ein definiertes Volumen zurückzuhalten für die nachfolgende Reaktion.
Ein Beispiel für Reaktionsgefäße im Sinne der Erfindung sind Mikrogefäße, die insbesondere oft in Form von Mikrotiterplatten (MTP) zusammengefasst sind. Die einzelnen Reaktionsgefäße einer Mikrotiterplatte werden auch als Näpfchen oder Kavitäten (engl. „wells") bezeichnet, die meist in einem vorgegebenen Raster von Zeilen und Spalten angeordnet sind, das eine Staffelung in der Anzahl vorgibt und damit das mögliche Füllvolumen bestimmt. In solchen Mikrotiterplatten werden im Zusammenhang mit zellbasierten Assays Zellen einzeln oder in Zellverbünden angezogen. Wie eingangs beschrieben, soll beim Waschen der Mikrotiterplatten in der Regel die zelluläre Struktur in dem Reaktionsgefäß unbeschadet verbleiben, während der Überstand abgenommen und beispielsweise durch frisches Medium ersetzt wird. Dies ist mit der erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßeinheit besonders gut möglich, indem eine Mikrotiterplatte bereitgestellt wird, bei der im Boden jedes Näpfchens ein erfindungsgemäßer Rückhaltebereich ausgebildet ist.
Besonders vorteilhaft ist dabei, wenn alle Reaktionsgefäße an einer Oberseite der Mikrotiterplatte eine Öffnung aufweisen. Dies ermöglicht das einfache Befüllen und Leeren des Aufnahmeraums.
Die Reaktionsgefäßeinheit kann vorteilhaft aus Kunststoff ausgebildet sein wie etwa Polystyrol (PS) Polypropylen (PP), Polyolefincarbonat (POC), Cyclo-Olefin-Copolymere (COC) oder Polyvinylchlorid (PVC). Dies ermöglicht die besonders einfache form- und maßgetreue Herstellung durch an sich bekannte Herstellungsverfahren wie etwa Spritzgießen, Spritzblasformen, Thermoformen oder dergleichen in Kombination mit Eigenschaften, die eine optische Analyse der Kavität bzw. der Kapillare ermöglichen. Andere Werkstoffe sind jedoch auch möglich, insbesondere Glas. Die Verwendung von photosensitiven Gläsern oder Glaskeramiken ist beispielsweise für die Herstellung von Picotiterplatten bekannt.
In Ausführungsformen kann die Reaktionsgefäßeinheit mehrere Reaktionsgefäße aufweisen und können die Haltewirkungen der Rückhaltebereiche wenigstens zweier Reaktionsgefäße unterschiedlich sein. Die Unterschiede können vorzugsweise derart ausgeprägt sein, dass die Haltewirkung von einer Linie aus, die insbesondere eine Mittellinie ist, welche die Reaktionsgefäßeinheit oder die Anordnung der Reaktionsgefäße in zwei Hälften teilt, zunimmt, sodass eine Haltekraft der Rückhaltebereich bei einer Rotation der Reaktionsgefäßeinheit um eine Achse, die parallel zur der Mittellinie ist und deren Radius durch die Mittellinie rechtwinklig zu einer Ebene, in welcher die Reaktionsgefäße angeordnet sind, verläuft, konstant oder in etwa konstant über die Reaktionsgefäße bleibt. Wenn die Reaktionsgefäßeinheit (bspw. Mikrotiterplatte) in einer Zentrifuge zentrifugiert wird, nehmen die Zentrifugalkräfte von der Mittellinie aus zum Rand der Platte hin zu, weil der Abstand von der Rotationsachse größer wird. Das kann durch eine Anpassung der Haltewirkung der Rückhaltebereiche kompensiert werden. Beispielsweise können zum Rand der Platte hin die Wandabstände einer Kapillarkavität enger werden und/oder die Kapillarkavitäten zunehmend zur Mitte hin angewinkelt werden und/oder hydrophile/lipophile Wirkungen einer Beschichtung zunehmen. Auch abseits dieser speziellen Ausführung können variable Haltewirkungen auch für unterschiedliche Trennvolumina oder besondere Versuchsanordnungen vorteilhaft sein. Beispielsweise sind Versuchsanordnungen denkbar, bei denen eine Entfernung des Volumens aus dem Rückhaltebereich nur für einen Teil der Reaktionsgefäße erfolgen soll, um eine Zeitreihe in einer einzigen Platte zu verwirklichen.
In ähnlicher Weise kann eine Konzentrationsreihe verwirklicht werden, wenn wiederholt ein definiertes Volumen einer Zielflüssigkeit im Rückhaltebereich unter Entfernung des Restvolumens im Aufnahmeraum gehalten wird, anschließend ein definiertes Volumen einer Verdünnungsflüssigkeit in den Aufnahmeraum gegeben (dispensiert) wird und der Aufnahmeraum geleert wird, nachdem sich die Zielflüssigkeit mit der Verdünnungsflüssigkeit gemischt hat. Dann bleibt im Rückhaltebereich wieder das definierte Volumen der nun verdünnten Zielflüssigkeit. Hat der Rückhaltebereich beispielsweise ein Volumen von 1% im Vergleich zum Aufnahmeraum, dann ergibt sich beim Dispensieren eine Verdünnung der zunächst im Rückhaltebereich befindlichen Zielflüssigkeit von 1:100 im ersten Schritt. Wird der Aufnahmeraum geleert unter Rückhaltung des definierten Volumens der nun verdünnten Zielflüssigkeit im Rückhaltebereich, dann wird nach einer Wiederholung des Vorgangs eine Verdünnung von 1:100 x 1:100 (=104) erreicht. Wird in einer Mikrotiterplatte das Verfahren beispielsweise zeilenweise unterschiedlich oft angewandt, dann ergibt sich eine Konzentrationsreihe von l:102, l:104, l:106, usw. Besonders vorteilhaft ist das Verfahren bei der Darstellung einer Konzentrationsreihe in einer Mikrotiterplatte ohne das Verbrauchen von Pipettierspitzen oder sonstigen Verbrauchsmaterialien, sondern alleine durch wiederholtes Evakuieren des Aufnahmeraums. Auch ist die Verdünnung aufgrund der definierten Volumina, insbesondere des Rückhaltebereichs, sehr genau einstellbar, so dass bei der Dispensierung der Flüssigkeiten geringere Anforderungen an die Dosiergenauigkeit gestellt werden können.
Zur praktischen Verwirklichung der Vermischung sind vielfältige Varianten denkbar. Beispielsweise kann der Dispensiervorgang so ausgeführt werden, dass sich die Zielflüssigkeit während des Dispensierens unmittelbar mit der Verdünnungsflüssigkeit vermischt, etwa indem das Dispensieren mit einem Spülen des Rückhaltebereichs durch die Verdünnungsflüssigkeit verbunden wird. Alternativ kann die im Rückhaltebereich befindliche Zielflüssigkeit durch Zentrifugation in den Aufnahmeraum mit der Verdünnungsflüssigkeit gebracht werden, sodass sich die beiden Flüssigkeiten im Aufnahmeraum vermischen, und kann, falls erforderlich, anschließend mit umgekehrter Orientierung zentrifugiert werden, um den Rückhaltebereich wieder zuverlässig mit der verdünnten Zielflüssigkeit zu füllen. Auch der umgekehrte Fall ist denkbar, nämlich dass die Verdünnungsflüssigkeit durch Zentrifugation in den Rückhaltebereich gedrängt wird. Diese Überlegungen zur Vermischung kommen besonders dann zum Tragen, wenn der Rückhaltebereich eine Kavität, insbesondere Kapillarkavität ist. Besonders einfach ist die Vermischung, wenn der Rückhaltebereich allein oder vornehmlich durch die Struktur oder Beschaffenheit der Wandoberfläche bestimmt ist, da dann durch Schütteln oder Rühren oder Einbringen eines Gases oder sogar allein durch den Dispensionsvorgang die Vermischung herbeigeführt werden kann.
In Ausführungsformen kann eine Fangvorrichtung vorgesehen sein, welche gegenüber einer Öffnung des Aufnahmeraums oder Öffnungen der Aufnahmeräume des wenigstens einen Reaktionsgefäßes angeordnet und zum Auffangen von aus dem Aufnahmeraum oder den Aufnahmeräumen austretender oder ausgetriebener Flüssigkeit ausgebildet ist. Dabei kann die Fangvorrichtung eine oder mehrere Kompartimente, vorzugsweise in der Art einer Mikrotiterplatte, aufweisen, wobei eine Öffnung des Kompartiments oder Öffnungen der Kompartimente der Fangvorrichtung zu der Öffnung des Aufnahmeraums oder den Öffnungen des der Aufnahmeräume des wenigstens einen Reaktionsgefäßes weist. Die Anzahl der Kompartimente der Fangvorrichtung kann gleich, größer oder kleiner als eine Anzahl der Reaktionsgefäße sein. So kann beispielsweise eine zweite Platte als Fangvorrichtung auf die erste Platte (die Reaktionsgefäßeinheit) montiert werden und der Überstand aus der zweiten Platte gefangen werden. Das aufgefangene Fluid kann wiederverwendet werden, was bei den oft teuren Fluiden, die verwendet werden, eine beträchtliche Einsparung ermöglichen kann. Die Fangvorrichtung kann kompartimentiert sein wie die Reaktionsgefäßeinheit selbst. Wenn die Reaktionsgefäßeinheit also beispielsweise eine Mikrotiterplatte mit 96 oder 384 oder einer anderen Anzahl von Reaktionsgefäßen aufweist, kann die Fangvorrichtung ebenfalls als Mikrotiterplatte mit 96 bzw. 384 bzw. der anderen Anzahl von Kompartimenten ausgebildet sein. Die Fangvorrichtung kann auch mehr oder weniger Kompartimente aufweisen als Reaktionsgefäße vorgesehen sind. Beispielsweise kann die Fangvorrichtung auch nur als einfache Schale ausgebildet sein. Dann werden die Überstände vereinigt und ein Aliquot davon kann z.B. durch NGS (next generation sequencing) analysisert werden. Die Fängerplatte kann auch eine Zahl von Kompartimenten haben, die von der Zahl der Reaktionsgefäße der Reaktionsgefäßeinheit nach oben oder unten abweicht.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist ein Verfahren zum selektiven Entfernen einer Flüssigkeit aus einem Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit. Dabei befindet sich die Flüssigkeit in einer Reaktionsgefäßeinheit wie oben beschrieben, und das Verfahren weist die Schritte auf:
- Zentrifugieren der Reaktionsgefäßeinheit bei radial von einer Zentrifugierachse weg weisender Öffnung des Aufnahmeraums mit einer Drehzahl, welche kleiner als eine Grenzdrehzahl ist, bei welcher die Haltewirkung des Rückhaltebereichs gerade überwunden wird, so dass ein in oder an dem Rückhaltebereich befindliches Teilvolumen der Flüssigkeit dort verbleibt und die im Aufnahmeraum befindliche übrige Flüssigkeit entfernt wird.
Hierzu kann die Reaktionsgefäßeinheit beispielsweise in einer Zentrifugiervorrichtung in einer Stellung angeordnet werden, in welcher die Öffnungen aller Reaktionsgefäßeinheiten von der Zentrifugierachse weg weisen. Sodann kann die Zentrifugiervorrichtung mit einem Zeit-Drehzahl-Profil angesteuert werden, welches geeignet ist, die im Aufnahmeraum befindliche Flüssigkeit auszuschleudern, die in oder an dem Rückhaltebereich, beispielsweise in der Kapillarkavität, befindliche Flüssigkeit aber dort verbleibt. Dieses Verfahren eignet sich sowohl zum Leeren von Reaktionsgefäßen von Nähr- oder Reaktionsflüssigkeit unter Bewahrung eines Zielstoffs wie etwa einer Anordnung von Zellen als auch zum Trennen beliebiger Flüssigkeitsvolumina. Das Verfahren vermeidet auch die Verwendung spezieller Einrichtungen im Inneren der Zentrifugiervorrichtung wie etwa von Magnetvorrichtungen, welche einen mit magnetischen Beads oder dergleichen versetzten Stoff am Boden des Reaktionsgefäßes während des Zentrifugierens zu halten vermögen. Das ist zwar grundsätzlich möglich, erfordert aber einen höheren gerätetechnischen Aufwand mit baulichen Veränderungen an der Zentrifugiervorrichtung und die Bewegung zusätzlicher Masse innerhalb der Zentrifugiervorrichtung, denn eine solche Magnetvorrichtung muss natürlich mit der Reaktionsgefäßeinheit mit rotieren.
In Ausführungsformen kann vorgesehen sein, dass die übrige Flüssigkeit in einer Fangvorrichtung, insbesondere wie sie oben beschrieben wurde, aufgefangen wird. Dadurch kann das entfernte Restvolumen für andere Zwecke verwendet werden, was zur Kostensenkung und Ressourceneinsparung beitragen kann.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist ein Verfahren zum Einbringen einer einen Zielstoff enthaltenden Flüssigkeit in ein Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit, mit den Schritten:
- Verwenden einer Reaktionsgefäßeinheit wie vorstehend beschrieben zur Aufnahme der Flüssigkeit; und
- Leiten des Zielstoffs zu dem Rückhaltebereich mittels eines Leitsystems, wobei das Leitsystem aufweist:
- eine Zentrifugiervorrichtung und eine Anordnung der Reaktionsgefäßeinheit bei radial außen oder im Wesentlichen außen bezüglich einer Zentrifugierachse im Verhältnis zum Rest des Aufnahmeraums liegendem Rückhaltebereich, oder
- einen magnetischen Hilfsstoff oder eine magnetische Eigenschaft des Zielstoffs und eine Magnetvorrichtung, welche angeordnet wird, um mit dem magnetischen Hilfsstoff oder der magnetischen Eigenschaft zu wechselwirken, oder
- einen elektrostatisch geladenen Hilfsstoff oder eine elektrostatische Eigenschaft des Zielstoffs und eine Elektrodenvorrichtung, welche angeordnet wird, um mit dem elektrostatischen geladenen magnetischen Hilfsstoff oder der elektrostatische Eigenschaft zu wechselwirken.
Zielstoff kann jeder Stoff einschließlich chemischer und biologischer Stoffe sein, der Bestandteil einer flüssigen Lösung ist und gezielt von einem Großteil der flüssigen Lösung getrennt werden soll. Insbesondere ist der Zielstoff ein Stoff, dessen Reaktion in dem Reaktionsgefäß veranlasst oder beobachtet werden soll. Ein Leitsystem ist im Sinne der Erfindung ein System, welches ausgebildet ist, um den Zielstoff in eine gewünschte Richtung, vor allem zu dem Rückhaltebereich hin, beispielsweise in die Kapillarkavität hinein, zu bewegen. Dabei kann das Leitsystem auf den Zielstoff selber und/oder eine Matrix, in welche der Zielstoff eingebettet ist, um ein Zielstoffsystem zu bilden, oder auf darin enthaltene Hilfsstoffe reagieren.
Die Zentrifugation eignet sich besonders für Zielstoffe oder Zielstoffsysteme, die eine höhere Dichte als die Flüssigkeit aufweisen. Wenn der Rückhalte Bereich eine Kapillarkavität ist, kann das Verfahren so ausgeführt werden, dass die Mündung der Kapillarkavität radial zu der Zentrifugierachse weist. Damit werden durch die zur Mündung der Kapillarkavität hin wirkende Zentrifugalbeschleunigung zuverlässig zur Mündung der Kapillarkavität geleitet und in die Kapillarkavität hinein gedrückt.
Magnetische Hilfsstoffe können beispielsweise magnetische Beads sein. Elektrostatisch geladene Hilfsstoffe können beliebige Ladungsträger sein. Bestimmte Zielstoffe, wie etwa DNA-Moleküle können elektrisch geladen werden, sodass sie von einer Elektrodenvorrichtung angezogen werden können. Die Elektrodenvorrichtung kann in der Reaktionsgefäßeinheit, in dem einzelnen Reaktionsgefäß oder extern vorgesehen sein.
Durch anschließendes Entfernen der Flüssigkeit in der dem Aufnahmeraum durch das zuvor beschriebene Verfahren kann dann auch zuverlässig eine Trennung des Zielstoffs oder Zielstoffsystems von der übrigen Flüssigkeit erreicht werden. Insbesondere kann hierzu ein Zentrifugieren der Reaktionsgefäßeinheit bei radial innen oder im Wesentlichen innen bezüglich der Zentrifugierachse im Verhältnis zum Rest des Aufnahmeraums liegendem Rückhaltebereich mit einer Drehzahl, welche kleiner als eine Grenzdrehzahl ist, bei welcher die Haltewirkung des Rückhaltebereichs gerade überwunden wird, so dass ein in oder an den Rückhaltebereich geleitetes Teilvolumen der Flüssigkeit, welches den Zielstoff enthält, dort verbleibt und die im Aufnahmeraum befindliche übrige Flüssigkeit entfernt wird.
Auch hier kann die übrige Flüssigkeit in einer Fangvorrichtung, insbesondere wie sie oben beschrieben wurde, aufgefangen werden. Dies ermöglicht es beispielsweise, gezielt ein Aliquot eines teuren Reagenzes in oder an den Rückhaltebereich, etwa in die Kapillarkavität, zu bringen, den Aufnahmeraum durch Zentrifugieren zu leeren und dabei den Rest des Reagenzes aufzufangen und für weiteres Aliquotieren zu verwenden zu können. Hierzu wird die Fangvorrichtung, etwa eine Fängerplatte, vor dem Zentrifugieren „über Kopf" gegenüber den Öffnungen der Aufnahmeräume der Reaktionsgefäße angeordnet.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist ein Verfahren zum Aufreinigen eines in einer Flüssigkeit verteilten Zielstoff wie etwa Zellen, Zellhaufen, Zellagregate oder Organismen in einem Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit, wobei sich die Flüssigkeit in einer Reaktionsgefäßeinheit gemäß vorstehender Beschreibung befindet, mit den Schritten:
- Versammeln des Zielstoffs in dem Rückhaltebereich, insbesondere durch Zentrifugieren mit einer Anordnung der Reaktionsgefäßeinheit derart, dass der Rückhaltebereich radial außen oder im Wesentlichen außen bezüglich einer Zentrifugierachse im Verhältnis zum Rest des Aufnahmeraums liegt;
- Entfernen der Flüssigkeit aus dem Aufnahmeraum durch Zentrifugieren der Reaktionsgefäßeinheit bei radial von einer Zentrifugierachse weg weisender Öffnung des Aufnahmeraums mit einer Drehzahl, welche kleiner als eine Grenzdrehzahl ist, bei welcher die Haltewirkung des Rückhaltebereichs gerade überwunden wird, so dass ein in oder an dem Rückhaltebereich befindliches Teilvolumen der Flüssigkeit dort verbleibt und die im Aufnahmeraum befindliche übrige Flüssigkeit entfernt wird;
- Einbringen einer weiteren Flüssigkeit in den Aufnahmeraum, insbesondere durch Dispensieren oder Pipettieren; und Vermischen des Zielstoffs mit der weiteren Flüssigkeit in dem Aufnahmeraum.
Mit einem solchen Aufreinigungsverfahren kann eine Pelletierung mit der damit verbundenen Belastung vermieden werden, da durch das Versammeln des Zielstoffs in der Kapillarkavität und das Austauschen der Flüssigkeit eine hinreichende Reinigung von störenden Bestandteilen erreicht werden kann.
In dem Verfahren dieses Gesichtspunkt kann das Vermischen wenigstens eine der folgenden Maßnahmen umfassen:
- Stehenlassen für eine vorbestimmte Zeit,
- Schütteln der Reaktionsgefäßeinheit,
- Einbringen der weiteren Flüssigkeit in den Aufnahmeraum durch Dispensieren oder Pipettieren derart, dass der Zielstoff von dem Rückhaltebereich ab- oder ausgeschwemmt wird,
- Abpipettieren des Zielstoffs aus dem Rückhaltebereich und Zurückpipettieren in die eingebrachte weitere Flüssigkeit außerhalb des Rückhaltebereichs.
In einer beispielhaften Ausführungsform des Verfahrens kann der Aufnahmeraum ein Volumen von etwa 200 bis 400 pl aufweisen, wobei der Rückhaltebereich eine Kapillarkavität am Boden des Aufnahmeraums ist und ein Volumen von etwa 5 pl aufweist, und wobei das Versammeln des Zielstoffs durch Zentrifugieren mit mindestens 2g oder mindestens 5g oder mindestens 10g oder mindestens 20g und/oder höchstens 1000g oder höchstens 500g oder höchstens 200g oder höchstens 100g oder höchstens 50g oder höchstens 40g oder höchstens 30g oder höchstens 20g für eine Zeit von mindestens 1 s oder mindestens 2 s oder mindestens 5 s oder mindestens 10 s oder mindestens 10 s oder mindestens 30 s oder mindestens 60 s oder mindestens 90 s oder mindestens 2 Minuten oder mindestens 5 Minuten und/oder für höchstens 60 Minuten oder höchstens 30 Minuten oder höchstens 20 Minuten oder höchstens 15 Minuten oder höchstens 10 Minuten oder höchstens 5 Minuten oder höchstens 2 Minuten oder höchstens 1 Minute oder höchstens 30 s oder höchstens 20 s oder höchstens 10 s oder höchstens 5 s oder höchstens 2 s erfolgt. Es versteht sich, dass unmögliche Zeitbereiche, bei denen die Höchstdauer niedriger als die Mindestdauer ist, ausgeschlossen sind. Es wäre z.B. denkbar, in Hochdurchsatzanwendungen mit sehr hoher Zentrifugalbeschleunigung (z.B. 1000g), aber nur mit sehr kurzer Einwirkzeit (z.B. 1 see) zu arbeiten. Dabei erfolgt eine sehr schnelle und zuverlässige Versammlung bzw. Konzentration des Zielstoffs in der Kapillarkavität. Dabei müssen sehr enge Grenzen hinsichtlich der Einwirkdauer eingehalten werden, um eine Verklumpung oder sonstige Beeinträchtigung des Zielstoffs zu vermeiden. Umgekehrt kann man für Anwendungen mit sehr empfindliche Zellen mit sehr geringer Zentrifugalbeschleunigung, z.B. 2g, zentrifugieren, dafür aber sehr lange (z.B. lh). Hier können die Grenzen für die Einwirkdauer weiter gefasst werden. Grundsätzlich sollte das Produkt aus Einwirkdauer und die Zentrifugalbeschleunigung nicht größer als 72.000 gs oder 20.000 gs und insbesondere 1000 gs sein.
Das Volumen des Aufnahmebereichs von etwa 200 bis 400 pl ist für eine Reaktionsgefäßeinheit im 96er Mikrotiterplattenformat typisch. Es zeigt sich, dass die Belastung um mehr als eine Größenordnung geringer als beim Pelletieren mit ca. 300g sein kann, was den Stress auf Zellen oder Organismen deutlich verringert. Bei Reaktionsgefäßeinheiten mit kleineren Arbeitsvolumina der Aufnahmeräume (etwa 384er Format, 1536er Format) können sich die Dimensionen der Kapillarkavität entsprechend ändern, dementsprechend können die g-Kräfte höher sein. Bei Reaktionsgefäßeinheiten mit größeren Arbeitsvolumina der Aufnahmeräume (etwa 48er Format) können sich die Dimensionen der Kapillarkavität entsprechend ändern, dementsprechend können die g-Kräfte geringer sein.
Auch bei diesem Verfahren kann die entfernte Flüssigkeit in einer Fangvorrichtung, wie vorstehend beschrieben, aufgefangen wird.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist ein Verfahren zum Durchführen einer Testung an einem in einer Flüssigkeit verteilten oder suspendierten Zielstoff wie etwa Zellen, Zellhaufen, Zellagregate oder Organismen in einem Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit. Dabei befindet sich die Flüssigkeit in einer Reaktionsgefäßeinheit gemäß vorstehender Beschreibung. Das Verfahren weist die Schritte auf:
- Aufreinigen des Zielstoffs nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren;
- Entnehmen einer vorbestimmten Menge der in dem Reaktionsgefäß befindlichen Flüssigkeit mit darin verteiltem oder suspendiertem Zielstoff; und
- Zuführen des in der vorbestimmten Menge enthaltenen Zielstoffs zu einer Testvorrichtung wie etwa einer Durchflusszytometrievorrichtung.
Dieses Verfahren ermöglicht das Durchführen einer Testung mit den zuvor beschriebenen Vorteilen des Aufreinigungsverfahrens. Aufgrund der Schonung der Zellen oder Organismen reagieren diese nicht oder nur gering, was den Einfluss des Verfahrens selbst auf die Messung deutlich verringert und die Messungen deutlich zuverlässiger und reproduktiver macht. Selbstverständlich können alle anderen Testverfahren an einem in einer Flüssigkeit verteilten oder suspendierten Zielstoff, bei denen der Zielstoff Verunreinigungen oder unerwünschte Begleit- oder Hilfsstoffe aufweisen kann, von dem neuartigen Verfahren profitieren.
Nachstehend werden ausgewählte Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung anhand der beigefügten Zeichnungen ausführlich beschrieben. Es zeigt/zeigen:
Figur 1 ein Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung in einer geschnittenen Seitenansicht;
Figur 2 ein Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung in einer geschnittenen Seitenansicht;
Figur 3 ein Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung in einer Draufsicht;
Figur 4 ein Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung in einer Draufsicht; Figur 5 ein Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung in einer Draufsicht;
Figur 6A das Reaktionsgefäß von Figur 5 in einer entlang einer Linie Vl-Vl geschnittenen Seitenansicht;
Figur 6B das Reaktionsgefäß von Figur 5 in einer abgewandelten Ausführung in einer entlang der Linie Vl-Vl geschnittenen Seitenansicht;
Figur ? ein Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung in einer Draufsicht;
Figur 8 eine Reaktionsgefäßeinheit in Form einer Mikrotiterplatte gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung in einer Draufsicht;
Figur 9 eine Zentrifugiervorrichtung mit zwei Reaktionsgefäßeinheiten wie in Figur 8 in einer teilweise geschnittenen Seitenansicht zur Veranschaulichung von Verfahren gemäß Ausführungsbeispielen der Erfindung;
Figur 10 ein befülltes Reaktionsgefäß entsprechend Figur 1 in einer Reaktionsgefäßeinheit und eine Magnetvorrichtung in einer teilweise geschnittenen Seitenansicht zur Veranschaulichung eines Verfahrens gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung,
Figur 11 ein Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung in einer geschnittenen Seitenansicht;
Figur 12 ein Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung in einer geschnittenen Seitenansicht;
Figuren 13A-13C ein befülltes Reaktionsgefäß in einer geschnittenen Seitenansicht zur Veranschaulichung eines Verfahrens gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung;
Figur 14 ein Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung in einer geschnittenen Seitenansicht.
Alle zeichnerischen Darstellungen sind schematisch zu verstehen. Größenverhältnisse können zur Verdeutlichung verzerrt sein. Richtungs- und Lagebezeichnungen beziehen sich, sofern nicht anders angegeben, auf die gewöhnliche Verwendung des Erfindungsgegenstands. Soweit nicht anders angegeben, bezieht sich die Angabe „horizontal" auf eine Ebene von Öffnungen 6, durch welche Reaktionsgefäße 1 einer Reaktionsgefäßeinheit 20 zu befüllen oder zu leeren sind, und bezieht sich die Angabe „vertikal" auf eine Richtung, die rechtwinklig zur Horizontalen steht. Eine Reaktionsgefäßeinheit 20 weist wenigstens ein Reaktionsgefäß 1 auf (Figuren 1-7, 10). Das Reaktionsgefäß 1 kann bei alleinstehender Verwendung auch als Reaktionsgefäßeinheit im Sinne der Erfindung verstanden werden. Das Reaktionsgefäß 1 weist einen Aufnahmeraum 2 zur Aufnahme einer Flüssigkeit und eine Kapillarkavität 3, die in den Aufnahmeraum 2 mündet, auf. Der Aufnahmeraum 2 weist eine umlaufende Seitenwandung 4 und eine Bodenwandung 5 auf. Ein oberer Rand der Seitenwandung 4 kann eine Öffnung 6 des Aufnahmeraums 2 bilden. Die Kapillarkavität 3 mündet über eine Mündung 7 an der Bodenwandung 5 in den Aufnahmeraum 2. Die Kapillarkavität 3 weist von der Mündung 7 abgehende Wandungen 8 auf, die so eng voneinander beabstandet sind, dass eine Flüssigkeit, die sich in der Kapillarkavität 3 befindet, durch Kapillarwirkung in der Kapillarkavität 3 gehalten wird.
Die Kapillarwirkung tritt in engen Gefäßen auf und kann durch ein Kräftegleichgewicht zwischen der Oberflächenspannung der Flüssigkeit und einer Grenzflächenspannung zwischen der Flüssigkeit und einer Gefäßoberfläche verstanden werden. Grundsätzlich kann eine Flüssigkeit zwischen engen Wandungen durch Kapillarwirkung aufsteigen und eine konkave Oberfläche bilden, wenn die Flüssigkeit das Material der Wandung benetzt, oder absteigen und eine konvexe Oberfläche bilden, wenn die Flüssigkeit das Material der Wandung nicht benetzt. Die Kapillarwirkung hängt dabei neben der Oberflächenspannung und dem Kontaktwinkel auch von der Dichte der Flüssigkeit, dem Radius oder dem Wandabstand des Gefäßes und der Schwerebeschleunigung ab. Beispielsweise wird die Steighöhe h einer Flüssigkeitssäule in einem zylindrischen Gefäß beschrieben durch die Gleichung
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Dabei ist o die Oberflächenspannung, 0 der Kontaktwinkel, p die Dichte der Flüssigkeit, g die Schwerebeschleunigung und r der Radius des Gefäßes.
Da die Kapillarkavität 3 in den Aufnahmeraum 2 mündet und die Wandungen 8 der Kapillarkavität 3 so eng voneinander beabstandet sind, dass eine Flüssigkeit in der Kapillarkavität 3 durch Kapillarwirkung gehalten wird, kann beim Leeren des Reaktionsgefäßes 1 ein genau definiertes Residualvolumen in der Kapillarkavität 3 zurück gehalten werden, während der Aufnahmeraum 2 zuverlässig geleert wird. Die Leerung kann beispielsweise durch Zentrifugieren, wie nachstehend genauer beschrieben wird, oder auf andere Weise, etwa durch Aspiration / Pipettierung erfolgen.
Die Bodenwandung 5 des Aufnahmeraums 2 kann flach ausgebildet sein (Figur 1). Zur Erleichterung der Entleerung des Aufnahmeraums 2 wie auch des Versammelns in der Kapillarkavität 3 kann die Bodenwandung 5 auch konisch zur Mündung 7 der Kapillarkavität 3 abfallen (Figuren 2, 13A-13C, 14) oder U-förmig ausgebildet sein (nicht näher dargestellt), um eine Art Trichter zur Kapillarkavität 3 hin zu bilden. Ein Schrägungswinkel y der Bodenwandung 5 gegenüber der Ebene der Mündung 7 der Kapillarkavität 3 (diese Ebene ist senkrecht zur Vertikalen V und damit eine horizontale Ebene) ist auf den Anwendungsfall abzustimmen, er kann vorteilhaft zwischen 5° und 75° liegen. Eine Kante 9 zwischen der Bodenwandung 5 und der Seitenwandung 4 des Aufnahmeraums 2 kann scharf oder gerundet sein, wobei gerundete Kanten eine Leerung des Aufnahmeraums 2 erleichtern können. Die Seitenwandung 4 des Aufnahmeraums 2 bildet im dargestellten Ausführungsbeispiel einen quadratischen Querschnitt aus (Figuren 3, 4, 5, 7), weist also insbesondere mehrere Seitenwände 16 auf, die in Kanten 17 aufeinanderstoßen und die insgesamt geschlossene Seitenwandung 4 bilden (vgl. Figur 3). Dies ist aber keine Einschränkung der Erfindung. In Abwandlungen kann der Querschnitt des Aufnahmeraums 2 auch rechteckig oder allgemein polygonalen, beispielsweise rautenförmigen oder hexagonal, oder rund, oval, elliptisch oder beliebig gekrümmt sein. Die Kanten 17 zwischen den einzelnen Seitenwänden 16 können scharf oder gerundet ausgebildet sein, wobei gerundete Kanten 17 eine Leerung des Aufnahmeraums 2 erleichtern können.
Die Kapillarkavität 3 kann im Querschnitt rund (Figur 3) oder quadratisch (Figur 4) oder oval (Figur 7) ausgebildet sein oder jede andere geeignete Querschnittsform aufweisen. Die Mündung 7 der Kapillarkavität 3 kann in der Mitte der Bodenwandung 5 angeordnet sein, wie es bei den in Fig. 1 bis 8 gezeigte Ausführungsbeispielen der Fall ist. In Abwandlungen kann die Mündung 7 der Kapillarkavität 3 auch außermittig in der Bodenwandung 5 des Aufnahmeraums 2 angeordnet sein.
Eine Kante 10 (vgl. Figuren 1, 2) zwischen den Wandungen 8 der Kapillarkavität 3 und der Bodenwandung 5 des Aufnahmeraums 2 können scharf oder gerundet ausgebildet sein. Hier kann eine scharfe Kante 10 ein Zurückhalten der Flüssigkeit in der Kapillarkavität 3 durch Kapillarwirkung erleichtern.
Die Kapillarwirkung ist durch den Wandabstand zwischen gegenüberliegenden Seitenwänden 18 oder Wandabschnitten 19 der Wandung 8 der Kapillarkavität 3 bestimmt, wobei die Oberflächenbeschaffenheit und die Oberflächenspannung der Flüssigkeit auch erheblichen Einfluss auf die Kapillarwirkung haben. Der Wandabstand zwischen gegenüberliegenden Seitenwänden 18 oder Wandabschnitten 19 der Kapillarkavität 3 ist also so bemessen, dass Flüssigkeit durch Kapillarwirkung zwischen den gegenüberliegender Seitenwänden 18 oder Wandabschnitten 19 der Kapillarkavität 3 gehalten wird. Je nach Flüssigkeit und Beschaffenheit der Wandung 8 der Kapillarkavität 3 kann der Wandabstand beispielsweise grob zwischen 0,1 mm und 2,0 mm liegen. Geeignete Obergrenzen und Untergrenzen wurden oben genannt, wobei die konkret gewählte Obergrenze von der erwarteten oder gewünschten Kapillarwirkung bestimmt sein wird und die konkret gewählte Untergrenze vom Anwendungsfall bestimmt sein wird. Für die Anwendung ist auch das Verhältnis des Wandabstands der Kapillarkavität 3 zum Wandabstand des Aufnahmeraums 2 selbst maßgeblich. Wenn die Kapillarkavität 3 zu weit im Verhältnis zum Aufnahmeraum ist, kann es schwierig sein, einen technisch nutzbaren Unterschied in der Kapillarwirkung zu verwirklichen. Die Kapillarwirkung der Kapillarwirkung 3 ist daher stets im Verhältnis zu einer grundsätzlich denkbaren, dann aber deutlich kleineren Kapillarwirkung im Aufnahmeraum 2 zu verstehen. Die Kapillarwirkung des Aufnahmeraums 2 kann auch dadurch weiter verringert werden, dass die Seitenwandung 4 des Aufnahmeraums 2 sich zur Öffnung 6 hin um einen Öffnungswinkel ß gegenüber der Vertikalen V weitet (Figur 14). Der Öffnungswinkel ß kann beispielsweise zwischen 0,5° und 5° liegen, um eine Kapillarwirkung deutlich herabzusetzen.
In einem Ausführungsbeispiel ist die Kapillarkavität 3 aus zwei gegenüberliegenden Seitenwänden 18, deren Abstand zur Ausübung der Kapillarwirkung bemessen ist, und einer zwischen den Seitenwänden 18 verlaufenden Bodenwand 12 ausgebildet, wobei die Bodenwand 12 gekrümmt ist und in der Kante
11 an der Mündung 7 in der Bodenwandung 5 des Aufnahmeraums 2 endet (Figuren 5, 6A). Die Bodenwandung bildet im Querschnitt einen glatten durchgehenden Bogen (Fig. 6A).
Somit hat die Kapillarkavität 3 in diesem Ausführungsbeispiel eine längliche Querschnittsform, insbesondere an der Mündung 7. Manchmal kann es wünschenswert sein, zunächst de Aufnahmeraum 2 zu leeren und danach auch das in der Kapillarkavität 3 verbliebene Residualvolumen zu entfernen. Dies ist in diesem Ausführungsbeispiel besonders einfach, indem das durch Kapillarwirkung in der Kapillarkavität 3 gehaltene Fluidvolumen mittels eines Flüssigkeitsstrahls oder Druckluft entlang der gekrümmten Bodenwand 12 ausgespült wird. In einem abgewandelten Ausführungsbeispiel kann die Kapillarkavität 3 die zwei gegenüberliegenden Seitenwände 18, deren Abstand zur Ausübung der Kapillarwirkung bemessen ist, und eine zwischen den Seitenwänden 18 verlaufende ebene Bodenwand 13 sowie zwei von der ebenen Bodenwand 13 an einer Kante 15 schräg abgehende und zwischen den Seitenwänden 18 verlaufende Stirnwände 14 aufweisen, wobei die schrägen Stirnwände 14 in der Kante 11 an der Mündung 7 in der Bodenwandung 5 des Aufnahmeraums 2 enden (Figuren 5, 6B). Die Wirkung der erleichterten Entleerung der Kapillarkavität 3 entspricht der Variante mit gekrümmter Bodenwand 12, wobei die Wirkung umso ausgeprägter ist, je flachwinkligem die Stirnwände 14 verlaufen.
Wenn die Leerung des Reaktionsgefäßes 1 durch Zentrifugieren erfolgt, bestimmt die Ausrichtung der Kapillarkavität 3 zur Drehrichtung, ob das Residualvolumen in der Kapillarkavität 3 gehalten wird oder mit ausgeschleudert wird. Wenn die Seitenwände 18 der Kapillarkavität 3 rechtwinklig zur Drehrichtung ausgerichtet sind, wird das Residualvolumen in der Kapillarkavität 3 gehalten. Wenn die Seitenwände 18 der Kapillarkavität 3 mit der Drehrichtung ausgerichtet sind, wird das Residualvolumen aus der Kapillarkavität 3 ausgeschleudert. Daher ist die Reaktionsgefäßeinheit bevorzugt so ausgebildet, dass die Seitenwände 18 der Kapillarkavität quer zur Drehrichtung beim Zentrifugieren ausgerichtet sind.
In einer Abwandlung kann eine Kapillarkavität auch ausgebildet werden durch eine an beliebiger Stelle in dem Aufnahmeraum befindliche Struktur, die aus dem Boden oder den Seitenwänden hervortritt. Eine solche Kapillarkavität kann beispielsweise durch eine Ringstruktur mit engem Durchmesser oder durch parallele Wände, die einen Kapillarspalt ausbilden, verwirklicht werden.
Damit kann beispielsweise vorteilhaft ein Release-System gebildet werden, also ein System zur zeitlich verzögerten Abgabe eines Zielstoffs in eine in dem Aufnahmeraum befindliche Flüssigkeit. Dabei wird die Kapillarkavität wie oben beschrieben gefüllt, anschließend der Aufnahmeraum mit einer anderen Flüssigkeit gefüllt. Anstelle sich unverzüglich mit der Flüssigkeit zu vermischen, kann der Zielstoff langsam in die Flüssigkeit übergehen, etwa durch Diffusion. Ein Anwendungsfall ist beispielsweise eine Testreihe zur Langzeitwirkung eines Medikaments auf eine Zellkultur. Zielstoff in der Kapillarkavität ist das Medikament oder Reagenz , das mit den Zellen interagieren soll und dessen Wirkung beispielsweise auf das Zellwachstum getestet wird. Eine Nährlösung mit der Zellkultur füllt den Aufnahmeraum. Die Zellen können auch adhärent sein, d.h., dass sie an der Oberfläche des Aufnahmeraums haften. Alternativ können die Zellen auch in einer zweiten Kapillarkavität gehalten werden. Bei dem Experiment soll das Reagenz mit den Zellen in Kontakt gebracht werden. Je nach Ausgestaltung der Kapillare kann dieses Release-System das Reagenz sofort freigeben oder aber über einen längeren Zeitraum. Durch Ausüben einer Zentrifugalkraft kann das Release-System und die Abgabe des Reagenz gesteuert werden. Dazu ist es vorteilhaft, wenn die Kapillarkavität mit dem Reagenz oben (in Radialrichtung außen) offen ist, etwa zwei vertikale Rippen in einer Seitenwand. Falls die Zellen in einer zweiten Kapillarkavität gehalten werden, ist es vorteilhaft, wenn die Haltewirkung dort größer ist als in der Kapillarkavität mit dem Reagenz. Um dabei ein Austreten der Nährflüssigkeit aus dem Aufnahmeraum während der Zentrifugation zu verhindern, kann ein Deckel vorgesehen sein, der den Aufnahmeraum zumindest für diese Zeit dicht verschließt.
Zur Verbesserung der Kapillarwirkung beim Handhaben von wässrigen Flüssigkeiten kann die Kapillarkavität 3 hydrophil beschichtet sein. Zur Erleichterung der Entleerung des Aufnahmeraums 2 kann der Aufnahmeraum hydrophob beschichtet. Das kann beispielsweise durch Verwenden von PTFE sein, allgemein durch Substanzen, die in Gegenwart von Wasser Kontaktwinkel von ca. 90° oder größer aufweisen.
Figur 11 zeigt eine Abwandlung eines Reaktionsgefäßes 1, bei der die Wandungen 8 der Kapillarkavität 3 zur Mündung 7 hin eine Aufweitung aufweisen. Mit anderen Worten, die Wandungen 8 weisen im Bereich der Mündung 7 einen Abstand d2 auf, der größer als ein Abstand dl im Bereich der Bodenwand 13. Die Aufweitung ermöglicht eine Steuerung des entnommenen Volumens aus der Kapillarkavität 3 über die Zentrifugalkraft beim Zentrifugieren, da ein Kräftegleichgewicht zwischen Zentrifugalkraft und Haltekraft vom Wandabstand und dem Spreizungswinkel zwischen den Wänden abhängt. Vorzugsweise ist die Kapillarkavität so ausgebildet, dass sie sich allmählich bzw. etwa gleichmäßig von der Bodenwand 13 zur Mündung 7 aufweitet, so dass die horizontale Querschnittsfläche der Kapillarkavität 3 in Richtung zur Mündung 7 zunehmend größer wird. Hierdurch kann mit unterschiedlichen Zentrifugalkräften die Kapillarkavität unterschiedlich stark entleert werden.
Eine ähnliche Wirkung kann erzielt werden, wenn die Wandungen der Kapillarkavität zur Mündung der Kapillarkavität hin eine Beschichtung mit abnehmender hydrophiler oder lipophiler Wirkung aufweisen. In einer Variante der oben genannten Abwandlung können die Wandungen 8 gekrümmt sein um die Aufweitung zu verwirklichen (Figur 12). Ein Krümmungsradius r der Wandung 8 kann dabei konstant oder im Verlauf der Wandung 8 variabel sein.
Die Kapillarkavität 3 ist ein Beispiel für einen Rückhaltebereich, der durch Form und/oder Oberflächenbeschaffenheit so beschaffen ist, dass aufgrund einer Adhäsionskraft zwischen der Flüssigkeit und dem Rückhaltebereich und einer Kohäsion innerhalb der Flüssigkeit der Rückhaltebereich gegenüber dem umgebenden Bereich eine erhöhte Haltewirkung auf die Flüssigkeit ausübt, so dass eine vorbestimmte geringe Menge an Flüssigkeit beim Entfernen der Flüssigkeit aus dem Aufnahmeraum zurückgehalten werden kann. Es ist auch denkbar, einen solchen Rückhaltebereich an einer Boden- oder Seitenwand des Aufnahmeraums allein durch eine erhöhte Haftwirkung mit der Flüssigkeit im Vergleich mit dem umgebenden Bereich der Boden- oder Seitenwand zu erzeugen, etwa durch unterschiedliche hydrophil/hydrophobe oder lipophil/lipophobe Ausbildung, durch unterschiedliche Beschichtung, Aufrauung, Glättung, etc.. Dabei wird es vorteilhaft sein, die Größe eines solchen Bereichs auf das gewünschte Residualvolumen hin auszulegen, sodass sich beispielsweise ein Tropfen definierter Größe ausbildet, der an dem Bereich haftet und möglichst kompakt bleibt, ohne in mehrere Teiltropfen zu zerfallen.
Es ist auch denkbar, mehrere Rückhaltebereiche in einem Aufnahmeraum vorzusehen. Die Rückhaltebereich können gleich ausgebildet sein, um mehrere Teilvolumina gleicher Art aufzunehmen, oder von unterschiedlicher Art, um beispielsweise Teilvolumina oder Zielstoffe unterschiedlicher Art aufzunehmen oder zu halten. Beispielsweise kann
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist eine Reaktionsgefäßeinheit 20 in Form einer Mikrotiterplatte mit einem Rahmen 21, der eine Vielzahl von einzelnen Reaktionsgefäßen 1 umfasst (Figur 8). Die einzelnen Reaktionsgefäße 1 einer Mikrotiterplatte 20 werden auch als Näpfchen oder Kavitäten (engl. „wells") bezeichnet, die meist in einem vorgegebenen, regelmäßigen Raster von Zeilen und Spalten angeordnet sind. Das Raster gibt eine Staffelung in der Anzahl der Reaktionsgefäße 1 vor und bestimmt damit auch das mögliche Füllvolumen. In solchen Mikrotiterplatten werden im Zusammenhang mit zellbasierten Assays Zellen einzeln oder in Zellverbünden kultiviert. Wie eingangs beschrieben, soll beim Waschen der Mikrotiterplatten in der Regel die zelluläre Struktur in dem Reaktionsgefäß verbleiben, während der Überstand abgenommen und beispielsweise durch frisches Medium ersetzt wird. Dies ist mit dem erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßeinheit besonders gut möglich, indem eine Mikrotiterplatte bereitgestellt wird, bei der im Boden jedes Näpfchens eine Kapillarkavität ausgebildet ist.
Mikrotiterplatten gibt es in verschiedenen Größen und Ausgestaltungsformen. Die Grundfläche entspricht dabei meist den von der Society for Biomolecular Screening (SBS) empfohlenen ANSI- Standards von L = 27,76 mm x B = 85,48 mm x H = 14,35 mm, wobei die Höhe variieren kann. Übliche Größen sind in nachstehender Tabelle angegeben:
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Die Benennung einer Mikrotiterplatte richtet sich nach der Anzahl der Näpfchen. So wird eine Mikrotiterplatte mit 24 Näpfchen etwa als 24-Well-Titerplatte bezeichnet, eine Mikrotiterplatte mit 384 Näpfchen als 384-Well-Titerplatte u.s.w. Die Näpfchen können unterschiedliche Bodenformen aufweisen, etwa als F-Boden (Flachboden), C-Boden (Flachboden mit minimal abgerundeten Kanten), V-Boden (konisch zulaufender Boden) und U-Boden (U-förmige Vertiefung). Die Näpfchen können unterschiedliche Querschnittsformen aufweisen, etwa rund, oval, elliptisch, quadratisch, rautenförmig, hexagonal, wobei mehreckige Formen auch abgerundete Kanten aufweisen können.
Im dargestellten Ausführungsbeispiel ist die Reaktionsgefäßeinheit 20 eine 96-Well-Titerplatte mit acht in Richtung der Breite B angeordneten Zeilen und zwölf in Richtung der Breite B angeordneten Spalten. Ein Abstand der Reaktionsgefäße 1 von x ist in Längen- wie in Breitenrichtung gleich, die Erfindung ist darauf aber nicht beschränkt. Im dargestellten Ausführungsbeispiel sind die Reaktionsgefäße 1 bzw. deren Aufnahmeraum 2 jeweils von rundem Querschnitt, und die in der Bodenwandung des Aufnahmeraums 2 jeweils eingelassenen Kapillarkavitäten 3 sind ebenfalls von rundem Querschnitt. Die Erfindung ist aber hierauf nicht beschränkt. Zur Vereinfachung der Darstellung ist die Reaktionsgefäßeinheit 20 nur teilweise voll ausgezeichnet, während jenseits einer Risslinie Konturen nur gestrichelt und Reaktionsgefäße 1 nur durch ihre Mittelpunkte angedeutet sind.
Die bekannten Zentrifugen zum Waschen von Mikrotiterplatten sind so ausgebildet, dass die Rotationsachse der Zentrifuge parallel zur Längenrichtung der jeweiligen Mikrotiterplatte ist. Daher ist es zweckmäßig, dass die oben erläuterten länglichen Kapillarkavitäten auch parallel zur Längenrichtung der Mikrotiterplatte ausgerichtet sind.
In Mikrotiterplatten werden im Zusammenhang mit zellbasierten Assays Zellen angezogen. Die Zellen verbinden sich auf der Oberfläche (sie werden adhärent) und müssen früher oder später einem Medienwechsel unterzogen werden, da das Nährmedium die Zellen sonst vergiftet oder anderweitig unbrauchbar wird. Es existieren erfinderische Verfahren, die ein Zentrifugen-basiertes Waschen von Mikrotiterplatten ermöglichen, wie etwa in den eingangs genannten US 2021/138485 Al und US 11,117,142 B2 beschrieben. In letzter Zeit werden in der Pharmaindustrie zunehmend Zellverbände zu Testzwecken benutzt. Das sind Sphäroide oder Organoide, also Zellen im Verband (bis einige hundert). Diese werden ebenfalls in Mikrotiterplatten angezogen, wobei deren glatte Oberfläche aber oft verhindert, dass die Zellen anhaften. Damit schweben die Sphäroide und Organoide frei in Lösung. Um Medienwechsel durchzuführen, möchte man die Zellverbände gerne fixieren, damit Medien gewechselt werden können, ohne die Zellen zu verlieren. Dazu können verschiedene Matrices eingesetzt werden, die in die Platte gegossen werden, so dass die Zellen darin gefangen sind und wachsen können. Ein Beispiel ist die Matrix GrowDex (www.Growdex.com). Ein Näpfchen ist beispielsweise ein Drittel mit Matrix gefüllt, darüber stehen zwei Drittel Nährmedium. Die Matrices haben in etwa gelartige Eigenschaften und kleben in der Platte, allerding nicht besonders fest. Beim Zentrifugen-basierten Waschen möchte man nur das Medium aus der Platte waschen, ohne die Zellen (einschließlich Matrix) mit auszuwaschen. Ab einer gewissen Zentrifugalbeschleunigung würde das Gel aber ebenfalls aus der Platte geschleudert werden.
Auf eine solche Reaktionsgefäßeinheit 20 in Form einer Mikrotiterplatte, die mittels Zentrifuge gewaschen wird, ist die vorliegende Erfindung sehr gut anwendbar. Für ein bestimmtes System aus Kapillarkavität 3 und Flüssigkeit kann ein Grenzwert für eine von der Mündung 7 der Kapillarkavität 3 weg wirkende Beschleunigung bestimmt werden, unterhalb welcher die Kapillarwirkung überwiegt. Wenn die Mikrotiterplatte als Reaktionsgefäßeinheit 20 unter Beibehaltung des Residualvolumens in der Kapillarkavität 3 geleert werden soll, kann die Drehzahl der Zentrifuge auf einen Wert festgelegt werden, der sicher unterhalb des Grenzwertes liegt. Ebenso vorteilhaft wirkt sich die Kapillarkavität 3 der Reaktionsgefäß3 1 aus, wenn das Reaktionsgefäß 1 auf andere Weise geleert wird, wie etwa mittels einer Pipettiervorrichtung.
An Prototypen hat sich gezeigt, dass die Grenzdrehzahl bei wässrigen Lösungen mit unbeschichteten Mikrotiterplatten aus Polycarbonat typischerweise im Bereich von einigen 100 U/min liegen und vorzugsweise nicht größer als 1000 U/min und insbesondere nicht größer als 800 U/min oder 500 U/min oder 300 U/min ist.
Mikrotiterplatten wie auch andere Arten von Reaktionsgefäßeinheiten oder Reaktionsbehälter können vorteilhaft aus Kunststoff ausgebildet sein und können durch an sich bekannte Herstellungsverfahren wie etwa Spritzgießen oder dergleichen hergestellt sein. Insbesondere kann die Reaktionsgefäßeinheit 20 in Form der Mikrotiterplatte mit allen Reaktionsgefäßen 3 einstückig ausgebildet sein. Die Erfindung ist jedoch weder auf die Werkstoffwahl noch auf die einstückige Ausbildung beschränkt.
Ein Verfahren zum selektiven Entfernen einer Flüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß 1 einer Reaktionsgefäßeinheit 20 unter Verwendung einer Zentrifuge 30 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung (Figur 9).
Die Zentrifuge 30 ist nur mit den für das Verständnis der Erfindung wesentlichen Teilen dargestellt. Die Zentrifuge 30 weist einen rahmenförmigen Rotor 31 auf, der auf einer Welle 32 drehfest befestigt ist. Die Welle 32 kann durch einen Motor (nicht näher dargestellt), in Drehung versetzt werden, um sich mit einer Winkelgeschwindigkeit co oder einer entsprechenden Drehzahl n um eine Zentrifugierachse 33 zu drehen, welche durch eine Steuereinheit (nicht näher dargestellt) steuerbar und regelbar ist, wobei sich der Rotor 31 mitdreht. Eine Abdeckung 34, die in Form eines Zylinderrohres ausgebildet sein kann und Teil eines nicht näher dargestellten Gehäuses sein kann, umgibt den Rahmen 31. Ein Träger 35 (engl.: Carrier) zur Aufnahme einer Reaktionsgefäßeinheit 20 ist in einem Aufnahmeabschnitt des Rotors 31 angeordnet. Insbesondere kann der Träger 35 zusammen mit einer Reaktionsgefäßeinheit 20 in Form einer Mikrotiterplatte durch eine Ladeeinheit (nicht näher dargestellt) von der Stirnseite des Rotors 31 in dessen Aufnahmeabschnitt geschoben werden, wobei der Aufnahmeabschnitt den Träger 35 in der Art einer Schiene aufnehmen und die Reaktionsgefäßeinheit 20 in der Art einer Klammer von radial außen halten kann.
Zur Anwendung des Verfahrens befindet sich die Flüssigkeit zunächst in einem Reaktionsgefäß 1 der Reaktionsgefäßeinheit 20 wie oben beschrieben. Sodann wird die Reaktionsgefäßeinheit 20 auf den Träger 35 gesetzt und in die Zentrifuge 30 geladen, wobei die Mündung 6 des Aufnahmeraums 2 des Reaktionsgefäßes 1 von der Zentrifugierachse 33 weg weist (obererTeil (A) in Figur 9). Schließlich wird der Rotor 31 mit der Reaktionsgefäßeinheit 1 in Drehung versetzt, wobei die Drehzahl n so geregelt wird, dass sie kleiner als eine Grenzdrehzahl ist, bei welcher die Kapillarwirkung der Kapillarkavität 3 gerade überwunden wird. Auf diese Weise kann bewirkt werden, dass die in der Kapillarkavität 3 befindliche Flüssigkeit darin verbleibt und die im Aufnahmeraum 2 befindliche übrige Flüssigkeit ausgeschleudert, also entfernt wird. Zu diesem Zweck kann die Zentrifuge 30 mit einem geeigneten Zeit-Drehzahl-Profil angesteuert werden. Die ausgeschleuderte Flüssigkeit kann im Innenraum der Abdeckung 34 aufgefangen und abgeführt werden. Sie kann auch in einer Fängerplatte oder sonstigen Fangvorrichtung gefangen werden, die mit ihrer wenigstens einen Öffnung vor dem Ausschleudern auf die Reaktionsgefäßeinheit 20 aufgesetzt wird, um die ausgeschleuderte Flüssigkeit wiederverwenden zu können. Der Träger 35 mit der gewaschenen Reaktionsgefäßeinheit 20 kann entnommen und die Reaktionsgefäßeinheit 20 mit dem in der Kapillarkavität 3 zurückgehaltenen Residualvolumen weiter verwendet werden. Wenn beispielsweise ein Zielstoff wie etwa eine Zellenanordnung in einer Matrix in der Kapillarkavität 3 aufgenommen ist und verbrauchte Nährflüssigkeit aus dem Aufnahmeraum 2 durch das beschriebene Verfahren entfernt wurde, kann der Aufnahmeraum 2 mit neuer Nährflüssigkeit gefüllt werden und die Zellen weiter angezogen werden.
Selbstverständlich eignet sich das Verfahren auch zum Trennen beliebiger Flüssigkeitsvolumina.
Ein Verfahren zum Einbringen einer einen Zielstoff 41 enthaltenden Flüssigkeit 40 in ein Reaktionsgefäß 1 einer Reaktionsgefäßeinheit 20 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung, das ebenfalls mit Hilfe der Zentrifugiervorrichtung 30 (Figur 9) durchgeführt werden kann.
Zur Ausführung des Verfahrens wird zunächst die Reaktionsgefäßeinheit 20 zur Aufnahme der Flüssigkeit 40 mitsamt dem Zielstoff 41 in einem der Reaktionsgefäße 1 verwendet (Figur 10). Der Zielstoff 41 kann, muss aber nicht, in einer Matrix 42 eingebettet sein. Ein Hilfsstoff 43 kann, muss aber nicht, ebenfalls in der Matrix 42 eingebettet sein. Sodann wird die Reaktionsgefäßeinheit 20 auf die Wanne 35 gesetzt und in die Zentrifuge 30 geladen, wobei die Mündung 7 der Kapillarkavität 3 des Reaktionsgefäßes 1 radial zu der Zentrifugierachse 33 weist (unterer Teil (B) in Figur 9). Dann wird der Rotor 31 mit der Reaktionsgefäßeinheit 1 in Drehung versetzt, wodurch eine in Richtung der Bodenwandung 5 des Aufnahmeraums 2 wirkende Zentrifugalbeschleunigung a wirkt, welche den Zielstoff 41, gegebenenfalls samt Matrix 42 und optionalem Hilfsstoff 43, vom Rest der Flüssigkeit 40 trennt und in die Kapillarkavität 3 des Reaktionsgefäßes 1 drängt. In diesem Fall kann die Drehzahl n der Zentrifugiervorrichtung 30 so geregelt werden, dass sie größer als eine zweite Grenzdrehzahl ist, bei welcher ein Widerstand, der sich aus einem in der Kapillarkavität 3 befindlichen Luft- oder Flüssigkeitsvolumen ergeben kann, zuverlässig aus der Kapillarkavität 3 gedrückt werden kann. Zu diesem Zweck kann die Zentrifugiervorrichtung 30 mit einem geeigneten Zeit-Drehzahl-Profil angesteuert werden. Die Wanne 35 mit der Reaktionsgefäßeinheit 20 kann dann entnommen und die Reaktionsgefäßeinheit 20 mit dem in der Kapillarkavität 3 aufgenommenen Zielstoff 41 weiter verwendet werden. Wenn beispielsweise ein Zielstoff 41 wie etwa eine Zellenanordnung in der Matrix 42 in der Kapillarkavität 3 aufgenommen ist und die restliche Flüssigkeit 40 Nährflüssigkeit, kann das Reaktionsgefäß 1 bzw. die Reaktionsgefäßeinheit 20 zum Anziehen der Zellen verwendet werden. Bis zur vollständigen Entleerung der Reaktionsgefäße 1 kann Nährflüssigkeit stets bei Bedarf unter Verwendung des zuvor beschriebenen Verfahrens entfernt und durch neue Nährflüssigkeit ersetzt werden, wobei der Zielstoff 41 zuverlässig in der Kapillarkavität 3 verbleibt. Die Zentrifuge 30 bildet zusammen mit der Anordnung der Reaktionsgefäßeinheit 1 mit radial zu der Zentrifugierachse 33 weisender Mündung 7 der Kapillarkavität 3 ein Leitsystem im Sinne der Erfindung, welches ausgebildet ist, um den Zielstoff in eine gewünschte Richtung zu bewegen.
Ein weiteres Verfahren zum Einbringen einer einen Zielstoff 41 enthaltenden Flüssigkeit 40 in ein Reaktionsgefäß 1 einer Reaktionsgefäßeinheit 20 ist eine Abwandlung des vorigen Ausführungsbeispiels der Erfindung, das sich durch das verwendete Leitsystem davon unterscheidet. Diese Abwandlung verwendet als Leitsystem einen Hilfsstoff 43, der magnetisch ist, und eine Magnetvorrichtung 44, welche zur Ausführung des Verfahrens angeordnet wird, um mit dem magnetischen Hilfsstoff 43 zu wechselwirken (Figur 10).
Wieder kann eine Flüssigkeit 40 mit einem Zielstoff 41 in die Reaktionsgefäß 1 einer Reaktionsgefäßeinheit 20 gefüllt und darin aufgenommen werden. Der Zielstoff 41 kann beispielsweise ein Zellverband wie ein Sphäroid oder ein Organoid sein, die Erfindung ist hierauf aber nicht beschränkt. Der Hilfsstoff 43 kann beispielsweise magnetische Beads umfassen. Die Magnetvorrichtung 44 kann einen Elektromagneten 45, bestehend aus einem Ferritkern 46 und einer Wicklung 47, und eine Stromquelle 48 aufweisen. Zur Ausführung des Verfahrens kann der Elektromagnet 45 genau unter der Kapillarkavität 3 des Reaktionsgefäßes 1 angeordnet werden. In der Praxis kann auch die Magnetvorrichtung 44 stationär sein und das Reaktionsgefäß 1 zu der Magnetvorrichtung 44 so positioniert werden, dass die Kapillarkavität 3 des Reaktionsgefäßes 1 genau über dem Elektromagneten 45 zu liegen kommt. Insbesondere wenn das Reaktionsgefäß 1 Teil einer Reaktionsgefäßeinheit 20 wie etwa einer Mikrotiterplatte ist, kann die Magnetvorrichtung eine Vielzahl von Elektromagneten 45 aufweisen, die genau im Raster Näpfchen der Mikrotiterplatte angeordnet sind. Bei Einschalten der Stromquelle 48 wird der Ferritkern 46 polarisiert und kann eine magnetische Anziehungskraft auf den magnetischen Hilfsstoff 43 ausüben. Dieser wird dadurch in die Kapillarkavität 3 gedrängt und zieht die Matrix 42 mit dem Zielstoff 41 mit. An Stelle eines oder mehrerer Elektromagnete können auch ein oder mehrere Permanentmagnete verwendet werden.
Anstelle des magnetischen Hilfsstoffs 43 kann auch eine magnetische Eigenschaft des Zielstoffs 41 oder der Matrix 42 selbst ausgenutzt werden, um mit der Magnetvorrichtung 44 zu wechselwirken. Beispielsweise könnte der Zielstoff 41 ferritisches Material oder biomagnetisch aktive Zellen aufweisen. Da biomagnetische Phänomene oft sehr schwach ausgeprägt sind, kann eine entsprechende Auslegung der Magnetvorrichtung 44 erforderlich sein, um die erforderliche Wechselwirkung zu erzielen.
Eine weiteren Abwandlung des Verfahrens zum Einbringen einer einen Zielstoff enthaltenden Flüssigkeit in ein Reaktionsgefäß 1 einer Reaktionsgefäßeinheit 20 unterscheidet sich erneut durch das verwendete Leitsystem. Diese Abwandlung verwendet als Leitsystem einen Hilfsstoff 43, der elektrostatisch geladen ist, und eine Elektrodenvorrichtung 49, welche zur Ausführung des Verfahrens angeordnet wird, um mit dem Hilfsstoff 43 zu wechselwirken (Figur 10).
Wieder kann eine Flüssigkeit 40 mit einem Zielstoff 41 in die Reaktionsgefäße 1 einer Reaktionsgefäßeinheit 20 gefüllt und darin aufgenommen werden. Der Zielstoff 41 kann beispielsweise ein Zellverband wie ein Sphäroid oder ein Organoid sein, die Erfindung ist hierauf aber nicht beschränkt. Der Hilfsstoff 43 kann beispielsweise ionisierte Partikel umfassen. Die Elektrodenvorrichtung 49 kann eine unter der Kapillarkavität 3 des Reaktionsgefäßes 1 verlaufende Elektrode 50 und eine Stromquelle (nicht näher dargestellt) aufweisen. Die Elektrode 50 kann im Boden des Reaktionsgefäßes 1 bzw. der der Reaktionsgefäßeinheit 20 integriert oder extern vorgesehen sein, wobei im letzteren Fall die Elektrode 50 zur Ausführung des Verfahrens unter der Kapillarkavität 3 des Reaktionsgefäßes 1 angeordnet werden muss. Bei Einschalten der Stromquelle übt die Elektrode 50 eine Anziehungskraft auf den elektrostatisch geladenen Hilfsstoff 43 aus. Dieser wird dadurch in die Kapillarkavität 3 gedrängt und zieht die Matrix 42 mit dem Zielstoff 41 mit.
Die Elektrode kann im Bereich der Kapillarkavität 3 eine flächige Ausdehnung aufweisen, während sie in Bereichen abseits der Kapillarkavität 3 dünn ist, sodass sich die elektrostatische Anziehung unter der Kapillarkavität 3 konzentriert. Insbesondere wenn das Reaktionsgefäß 1 Teil einer Reaktionsgefäßeinheit 20 wie etwa einer Mikrotiterplatte ist, kann die Elektrode 50 gitterartig ausgebildet sein, wobei Gitterknoten genau im Raster der Näpfchen der Mikrotiterplatte angeordnet sind und gegebenenfalls die oben beschriebene flächige Ausdehnung aufweisen.
Anstelle des elektrostatisch geladenen Hilfsstoffs 43 kann auch eine elektrostatische Eigenschaft des Zielstoffs 41 oder der Matrix 42 selbst ausgenutzt werden, um mit der Elektrodenvorrichtung 49 zu wechselwirken. Beispielsweise könnte der Zielstoff 41 geladene Zellen oder Moleküle aufweisen. Da derartige Ladungen oft sehr schwach ausgeprägt sind, kann eine entsprechende Auslegung der Elektrodenvorrichtung 49 erforderlich sein, um die erforderliche Wechselwirkung zu erzielen.
In diesem Ausführungsbeispiel mit allen seinen Abwandlungen kann nach dem erfolgreichen Einbringen des Zielstoffs der Überstand, also das nicht in der Kapillarkavität aufgenommene Restvolumen, mit dem oben beschriebenen Verfahren zum Trennen oder selektiven Entfernen aus dem Aufnahmeraum 2 entfernt werden. Dabei kann auch hier vorteilhaft eine Fangvorrichtung zum Auffangen der Restvolumina eingesetzt werden, um beispielsweise teure Reaktanzen wiederverwenden oder anderweitig verwenden zu können.
Für das grundsätzliche Verfahren zum Selektiven Entfernen sind auch weitere Anwendungen vorstellbar:
Wenn beispielsweise unterschiedliche g-Kräfte wirken während der Zentrifugation (das ist insbesondere bei kleinem Radius der Fall, denn radial weiter außen liegende Reaktionsgefäße werden stärker beschleunigt), dann ist es möglich, differenziell zu leeren oder einen Zielstoff differenziell in die Reaktionsgefäße einer Reaktionsgefäßeinheit einzubringen. Man kann sich auch eine Titrationsreihe entlang eines Gradienten der g-Kräfte vorstellen.
Umgekehrt ist eine Reaktionsgefäßeinheit denkbar, bei der die Kräfte durch unterschiedliche Haft- bzw. Kapillarwirkung so auftreten, daß der physikalisch vorhandene Gradient in der Zentrifugalbeschleunigung (durch den unterschiedlichen Radius) mittels geeigneter Ausbildung der Rückhaltebereiche genau ausgeglichen wird und die zurückbehaltenen Teilvolumina trotz dieses Gradienten überall das gleiche Maß aufweisen nach Zentrifugation.
Das Prinzip der Erfindung kann auch zur Bildung eines Systems zur kontrollierten und zeitlich verzögerten Abgabe eines Zielstoffs an eine Probe, ein sogenanntes Release-System, angewendet werden, zur einer Abwandlung kann auch ein Kapillarraum ausgebildet werden durch eine irgendwo im Aufnahmeraum befindliche Struktur, die aus dem Boden oder den Seitenwänden hervortritt und einen Kapillarspalt ausbildet.
Damit kann man folgendes tun: eine Kapillare irgendwo in der Platte befindlich wird gefüllt wie hierin beschrieben. Reagenz ist ein Stoff, der mit Zellen interagieren soll und dessen Wirkung beispielsweise auf das Zellwachstum getestet wird. Bei einem Zellexperiment wird in aller Regel das Reagenz mit den im Aufnahmeraum befindlichen Zellen in Kontakt gebracht. Die Zellen können auch adhärent sein, d.h., dass sie an der Oberfläche des Aufnahmeraums haften. Je nach Ausgestaltung der Kapillare kann dieses Release System das Reagenz sofort freigeben oder aber über einen längeren Zeitraum. Durch Ausüben einer Zentrifugalkraft kann das Release System und die Abgabe des Reagenzes gesteuert werden.
Eine besonders vorteilhafte Anwendung der Erfindung ist ein Verfahren zum Aufreinigen von Zellen, die einen Zielstoff 41 bilden. Der Zielstoff 41 kann auch gleichermaßen Zellhaufen, Zellaggregate oder Organismen oder andere, insbesondere organische/biologische Stoffe, umfassen, nachstehend wird beispielhaft aber nur von Zellen gesprochen. Die Zellen befinden sich in einem Reaktionsgefäß 1 einer Reaktionsgefäßeinheit in Suspension in einer Flüssigkeit 40. Das Reaktionsgefäß 1 weist eine trichterförmige Bodenwandung 5 auf, die in einer Kapillarkavität 3 mündet. In einem konkreten Beispiel kann die Reaktionsgefäßeinheit beispielsweise im 96er Mikrotiterplattenformat ausgebildet sein. Dabei können die Reaktionsgefäße 1 einen Aufnahmeraum 2 von 200 pl Arbeitsvolumen und eine Kapillarkavität 3 von 5 pl Aufnahmevolumen aufweisen. Die Zellen sind zunächst im Aufnahmeraum 2 der Reaktionsgefäßeinheit 1 weitgehend gleichmäßig verteilt, in der Kapillarkavität können sich ebenfalls Zellen befinden, deren Verteilung der Verteilung im übrigen Aufnahmeraum 2 im Wesentlichen entspricht.
In vorgegebenen Zeitabständen oder zur Durchführung einer Testung an in Suspension befindlichen Zellen ist es erforderlich die Flüssigkeit 40 gegen frische Flüssigkeit 40 oder ein andere Flüssigkeit 40 auszutauschen, ohne dass die Zellen dazu aus dem Reaktionsgefäß 1 entnommen werden. Dieser Austausch wird als Aufreinigung bezeichnet.
Beim vorliegenden Verfahren wird in einem ersten Schritt die Reaktionsgefäßeinheit in einer Zentrifuge derart aufgenommen, dass die Kapillarkavität 3 von der Zentrifugierachse 33 weg weist (vgl. Anordnung (B) in Figur 9), und mit einer Winkelgeschwindigkeit coi in Drehung um eine Zentrifugierachse 33 gebracht. Dadurch wird eine Beschleunigung a auf die Suspension ausgeübt, wodurch sich die Zellen, unterstützt durch die Schräge der trichterförmigen Bodenwandung 5, in der Kapillarkavität 3 versammeln (Figur 13A). Die Winkelgeschwindigkeit coi ist im vorliegenden Beispiel so eingestellt, dass die Beschleunigung a bei 10 bis 30 g liegt, die Zentrifugation 2 bis 4 Minuten dauern. Am Ende dieses Schritts sind keine oder kaum Zellen mehr im Aufnahmeraum 2 oberhalb der Kapillarkavität 3 vorhanden.
In einem zweiten Schritt wird die Reaktionsgefäßeinheit in derselben oder einer weiteren Zentrifuge derart aufgenommen, dass die Kapillarkavität 3 zur Zentrifugierachse 33 weist (vgl. Anordnung (A) in Figur 9), und mit einer Winkelgeschwindigkeit CÜ2 in Drehung um die Zentrifugierachse 33 gebracht. Die Winkelgeschwindigkeit CÜ2 ist dabei so eingestellt, dass die die Flüssigkeit 40 unter der Wirkung der Beschleunigung a aus dem Aufnahmeraum 2 des Reaktionsgefäßes 1 ausgeschleudert wird, die Zellen in der Kapillarkavität 3, die sich noch immer, aber in viel höherer Konzentration, in Suspension befinden, durch Kapillarkräfte K in der Kapillarkavität 3 gehalten werden. Die Flüssigkeit 40 in dem Aufnahmeraum 2 trennt sich von der Flüssigkeit 40 mit den Zellen in der Kapillarkavität 3, in den Raum oberhalb der Kapillarkavität 3 strömt Atmosphäre 130, sodass sich eine Phasengrenze 131 bildet, welche die Mündung 7 der Kapillarkavität 3 überspannt und deren Oberflächenspannung zur Kapillarwirkung beiträgt (Figur 13B). Am Ende dieses Schritts ist der Aufnahmeraum 2 oberhalb der Kapillarkavität 3 vollständig von Flüssigkeit 40 geleert, und die Zellen befinden sich konzentriert in der Kapillarkavität. Der Entleerungsvorgang kann im vorliegenden Beispiel etwa 30 Sekunden dauern.
In einem dritten Schritt wird der Aufnahmeraum 2 des Reaktionsgefäßes 1 wieder mit Flüssigkeit 40 gefüllt. Dies geschieht im vorliegenden Ausführungsbeispiel durch eine Dispensiervorrichtung. Dabei wird die Flüssigkeit 40 in eine Dispensierdüse 132 in den Aufnahmeraum 2 dosiert. Ein Flüssigkeitsstrom 133 weist am Austritt der Dispensierdüse 132 eine Geschwindigkeit v auf. Bei dem vorliegenden Verfahren ist die Dispensierdüse 133 auf die Kapillarkavität 3 gerichtet, sodass die Zellen (41) aus der Kapillarkavität 3 ausgeschwemmt oder ausgespült werden und sich in der Flüssigkeit 40 im gesamten Aufnahmeraum 2 verteilen (Figur 13C). Die Geschwindigkeit ist dabei so bemessen, dass die Zellen zwar aus der Kapillarkavität 3 ausgespült werden, aber stets in Suspension in der Flüssigkeit 40 verbleiben, ohne dass die Flüssigkeit 40 aus dem Reaktionsgefäß 1 herausschwappt. Auch wenn in der Figur so dargestellt, ist es nicht erforderlich, dass die Dispensierdüse 132 in den Aufnahmeraum 2 ragt. Vielmehr kann die Dispensierdüse 132 auch oberhalb der Öffnung 6 des Aufnahmeraums 2 enden. Am Ende dieses Schritts sind die Zellen wieder weitgehend gleichmäßig in der Flüssigkeit 40 im Aufnahmeraum 2 verteilt. Der Vorgang des Auffüllens kann im vorliegenden Beispiel etwa 15 Sekunden dauern (vorzugsweise für alle in diesem Beispiel sechsundneunzig Reaktionsgefäße 1, die insbesondere Reihe für Reihe befüllt werden).
Mit diesem Verfahren kann der Stress für die Zellen beim Aufreinigen gegenüber herkömmlichen Verfahren, die etwa eine Pelletierung vorsehen, deutlich reduziert werden. Ein Verlust an Zellen, der beim Entleeren im zweiten Schritt eintreten kann, kann gering gehalten werden (unter 10%) und kann gegebenenfalls vor, nach oder während des Wiederbefüllens ersetzt werden.
Die Dispensiervorrichtung kann an der Zentrifuge angebaut sein, und die Reaktionsgefäßeinheit kann durch eine Beladungs- und Entladungseinrichtung der Zentrifuge bewegt werden, was eine exakte und effiziente Positionierung der Reaktionsgefäßeinheit bezüglich eines Rotationsraums der Zentrifuge und bezüglich der Dispensiervorrichtung ermöglicht. Die Reaktionsgefäßeinheit kann während der gesamten Verfahrens an oder in der Zentrifuge verbleiben. Eine Zentrifuge mit einer Beladungs- und
TI Entladungseinrichtung, die eine starre Verschiebestange zum Positionieren der Reaktionsgefäßeinheit im oder zum Entfernen der Reaktionsgefäßeinheit von einem Rotor der Zentrifuge aufweist, wobei die Verschiebestange mittels eines Linearmotors derart verschiebbar angeordnet ist, dass sie sich in einer Entladestellung im Rotorraum durch den Rotor hindurch erstreckt und in einer Beladestellung zumindest aus dem Bereich des Rotorraums herausgezogen ist, der vom Rotor bei einer Umdrehung beansprucht wird, ist in der WO 2017/125598 Al beschrieben, auf deren Offenbarungsgehalt diesbezüglich vollumfänglich Bezug genommen wird. Eine mit einer solchen Beladungs- und Entladungseinrichtung ausgestattete Zentrifuge, bei der zudem eine Dispensiereinheit an einer Außenwand der Zentrifuge angebracht ist, mittels derer eine Reagenzienflüssigkeit einer darunter in der Entladestellung befindlichen Reaktionsgefäßeinheit zugeführt werden kann, ist in der nachveröffentlichten DE 10 2021 124 023.9 beschrieben, auf deren Offenbarungsgehalt diesbezüglich vollumfänglich Bezug genommen wird.
Es versteht sich, dass die Versammlung der Zellen in der Kapillarkavität 3 auch durch andere Mittel als durch Zentrifugieren, wie etwa magnetisch, elektrostatisch oder dergleichen, wie zuvor beschrieben, erfolgen kann. Auch kann das Entfernen der Flüssigkeit 40 durch andere Mittel als durch Zentrifugieren, wie etwa Pipettierung erfolgen. Auch das Wiederbefüllen kann alternativ durch Pipettierung erfolgen.
Das vorstehende Verfahren zur Aufreinigung kann vorteilhaft im Zusammenhang mit Testverfahren verwendet werden, bei denen Zellen in Suspension getestet werden. Von der Suspension im aufgereinigten Zustand wird dafür ein Teilvolumen entnommen und einer Testvorrichtung zugeführt. Der Verlust an Zellen durch die Testung kann optional ersetzt werden.
Die Kapillarkavität 3 ist im Wesentlichen frei von Wandungen, um eine Verschattung gegenüber Dispensierstrahlen, Spülstrahlen oder dergleichen, welche Totzonen bilden könnten, in welchen ein Zielstoff unerwünscht beim Spülen verbleibt, zu vermeiden. Zur Erleichterung des Ausspülens oder Pipettierens kann am Boden der Kapillarkavität 3 aber eine zentrale, etwa pyramidenartige oder konische Erhebung 140 mit einer Spitze 141 vorgesehen sein (Figur 14). Dabei kann der restliche Boden der Kapillarkavität 3 um die Erhebung herum 140 möglichst kantenfrei ausgebildet sein, um eine möglichst laminare Strömung zu ermöglichen.
Die Erfindung kann folgendermaßen kurz zusammengefasst werden:
Diese Anmeldung offenbart eine Reaktionsgefäßeinheit (20) mit wenigstens einem Reaktionsgefäß (1), welches einen Aufnahmeraum (2) zur Aufnahme einer Flüssigkeit (40) aufweist, wobei der Aufnahmeraum (2) einen Rückhaltebereich aufweist, der eine solche Oberflächenbeschaffenheit und/oder Form aufweist, dass aufgrund einer Adhäsionskraft zwischen der Flüssigkeit und dem Rückhaltebereich und einer Kohäsion innerhalb der Flüssigkeit der Rückhaltebereich gegenüber dem umgebenden Bereich eine erhöhte Haltewirkung auf die Flüssigkeit (40) ausübt, so dass eine vorbestimmte geringe Menge an Flüssigkeit beim Entfernen der Flüssigkeit (40) aus dem Aufnahmeraum (2) durch Zentrifugieren am oder im Rückhaltebereich zurückgehalten wird. Weiter wird ein Verfahren zum selektiven Entfernen einer Flüssigkeit (40) aus einem Reaktionsgefäß (1) der Reaktionsgefäßeinheit (20) durch Zentrifugation offenbart. Ferner wird ein Verfahren zum Einbringen einer einen Zielstoff (41) enthaltenden Flüssigkeit (40) in ein Reaktionsgefäß (1) der Reaktionsgefäßeinheit (20) offenbart, wobei der Zielstoffs (41) zu dem Rückhaltebereich mittels eines Leitsystems durch Zentrifugation oder magnetische oder elektrostatische Wechselwirkung geleitet wird. Die Anmeldung offenbart ferner ein Verfahren zum Aufreinigen eines in einer Flüssigkeit (40) verteilten oder suspendierten Zielstoff (41), wie etwa Zellen, Zellhaufen, Zellagregate oder Organismen, und ein Verfahren zum Durchführen einer Testung an einem in einer Flüssigkeit (40) verteilten oder suspendierten Zielstoff (41) mit Hilfe der erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßeinheit (20).

Claims

Patentansprüche
1. Reaktionsgefäßeinheit (20) mit wenigstens einem Reaktionsgefäß (1), welches einen Aufnahmeraum (2) zur Aufnahme einer Flüssigkeit (40) aufweist, wobei der Aufnahmeraum (2) einen Rückhaltebereich aufweist, der eine solche Oberflächenbeschaffenheit und/oder Form aufweist, dass aufgrund einer Adhäsionskraft zwischen der Flüssigkeit und dem Rückhaltebereich und einer Kohäsion innerhalb der Flüssigkeit der Rückhaltebereich gegenüber dem umgebenden Bereich eine erhöhte Haltewirkung auf die Flüssigkeit (40) ausübt, so dass eine vorbestimmte geringe Menge an Flüssigkeit beim Entfernen der Flüssigkeit (40) aus dem Aufnahmeraum (2) durch Zentrifugieren am oder im Rückhaltebereich zurückgehalten wird.
2. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Aufnahmeraum (2) durch eine oder mehrere umlaufende Seitenwandung/en (4) und eine Bodenwandung (5) begrenzt ist und der Rückhaltebereich in oder an der Bodenwandung (5) des Aufnahmeraums (2) ausgebildet ist.
3. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Rückhaltebereich eine und vorzugsweise eine einzige Kapillarkavität (3) aufweist, die in den Aufnahmeraum (2) mündet, wobei die Wandungen (8) der Kapillarkavität (3) so eng voneinander beabstandet sind, dass eine Flüssigkeit (40) in der Kapillarkavität (3) durch Kapillarwirkung gehalten wird.
4. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillarkavität (3) im Wesentlichen frei von Zwischenwänden ist, so dass ein Inhalt der Kapillarkavität (3) durch Einführen eines Fluidstrahles aus der Kapillarkavität vollständig entfernt werden kann.
5. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillarkavität (3) einen rechteckigen, runden oder ovalen Querschnitt aufweist, wobei ein Wandabstand (d) zwischen gegenüberliegenden Seitenwänden (8, 18) oder Wandabschnitten (19) der Kapillarkavität (3) bemessen ist, um Flüssigkeit (40) durch Kapillarwirkung zwischen den gegenüberliegender Seitenwänden (8, 18) oder Wandabschnitten (19) der Kapillarkavität (3) zu halten, wobei der Wandabstand (d) vorzugsweise höchstens 2,0 mm oder höchstens 1,8 mm oder höchstens 1,6 mm oder höchstens 1,4 mm oder höchstens 1,2 mm oder höchstens 1,0 mm oder höchstens 0,8 mm ist, wobei der Wandabstand (d) vorzugsweise höchstens 30% oder höchstens 25% oder höchstens 20% oder höchstens 15% oder höchstens 10% oder höchstens 5% eines Wandabstands zwischen Seitenwandungen (4) des Aufnahmeraums (2) ist.
6. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillarkavität (3) eine Tiefe aufweist, die wenigstens das 0,5-fache oder wenigstens das 1- fache oder wenigstens das 1,5-fache oder wenigstens das 2-fache eines Wandabstands (d) zwischen gegenüberliegenden Seitenwänden (8, 18) oder Wandabschnitten (19) der Kapillarkavität (3) ist.
7. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Seitenwände (8, 18) der Kapillarkavität (3) vertikal oder im Wesentlichen vertikal mit einer Abweichung von höchstens 5° oder höchstens 3° oder höchstens 2° oder höchstens 1° oder höchstens 0,5° von der Vertikalen ausgebildet sind.
8. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Bodenwandung (5) des Aufnahmeraums (2) zu einer Mündung (7) der Kapillarkavität (3) konisch abfällt oder U-förmig ausgebildet ist, wobei ein Schrägungswinkel (y)der Bodenwandung (5) wenigstens 5° oder wenigstens 15° oder wenigstens 25° oder wenigstens 35° oder wenigstens 45° und/oder höchstens 75° oder höchstens 65° oder höchstens 55° oder höchstens 45° beträgt.
9. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Seitenwandung (4) des Aufnahmeraums (2) sich zur Öffnung (6) hin weitend mit einer Abweichung von wenigstes 2° oder wenigstes 3° oder wenigstes 5° oder wenigstes 10° von der Vertikalen ausgebildet sind.
10. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillarkavität (3) zwei gegenüberliegende Seitenwände (18), deren Wandabstand (d) zur Ausübung der Kapillarwirkung bemessen ist, und eine zwischen den Seitenwänden verlaufende Bodenwand (12; 13) aufweist, wobei die Bodenwand (12) stetig gekrümmt ist oder wobei ferner zwei zwischen den Seitenwänden (18) verlaufende Stirnwände (14) vorgesehen sind, die von der Bodenwand (13) aus zu einem Rand der Kapillarkavität (3) schräg, insbesondere flachwinklig, oder konkav gekrümmt ansteigen.
11. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Wandungen (8) der Kapillarkavität (3) zur Mündung (7) der Kapillarkavität (3) hin eine Aufweitung und/oder eine Beschichtung mit abnehmender hydrophiler oder lipophiler Wirkung aufweisen, wobei ein Öffnungswinkel an der Mündung (7) vorzugsweise nicht mehr als 10° oder nicht mehr als 5° oder nicht mehr als 2° oder nicht mehr als 1° oder nicht mehr als 0,5° beträgt.
12. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach einem der Ansprüche 3 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsgefäßeinheit (20) mehrere Reaktionsgefäße (1) aufweist, wobei die Kapillarkavitäten (3) von einer Linie aus, die insbesondere eine Mittellinie ist, welche die Reaktionsgefäßeinheit (20) oder die Anordnung der Reaktionsgefäße (1) in zwei Hälften teilt, gegenüber einem Lot auf einer Ebene, in welcher die Reaktionsgefäße (1) angeordnet sind, zunehmend von der Mitte weg angewinkelt sind.
13. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Rückhaltebereich eine eine Adhäsionswirkung auf die Flüssigkeit (40) erhöhende Oberflächenstruktur und eine Größe aufweist, so dass sich aufgrund der Kohäsion innerhalb der Flüssigkeit ein Zusammenhalt der Moleküle bildet, dass eine vorbestimmte Menge der Flüssigkeit am oder im Rückhaltebereich gehalten wird.
14. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Rückhaltebereich hydrophil oder lipophil beschichtet ist.
15. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Aufnahmeraum (2) in dem den Rückhaltebereich umgebenden Bereich, insbesondere komplementär zum Rückhaltebereich, hydrophob oder lipophob beschichtet ist.
16. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsgefäßeinheit (20) eine Mikrotiterplatte ist oder aufweist, bei der in einem vorbestimmten Raster mehrere der Reaktionsgefäße (1) angeordnet sind.
17. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass alle Reaktionsgefäße (1) an einer Oberseite der Mikrotiterplatte eine Öffnung (6) aufweisen.
18. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsgefäßeinheit (20) mehrere Reaktionsgefäße (1) aufweist, wobei die Haltewirkungen der Rückhaltebereiche wenigstens zweier Reaktionsgefäße (1) unterschiedlich sind, und zwar vorzugsweise derart, dass die Haltewirkung von einer Linie aus, die insbesondere eine Mittellinie ist, welche die Reaktionsgefäßeinheit (20) oder die Anordnung der Reaktionsgefäße (1) in zwei Hälften teilt, zunimmt, sodass eine Haltekraft der Rückhaltebereich bei einer Rotation der Reaktionsgefäßeinheit (20) um eine Achse, die parallel zur der Mittellinie ist und deren Radius durch die Mittellinie rechtwinklig zu einer Ebene, in welcher die Reaktionsgefäße (1) angeordnet sind, verläuft, konstant oder in etwa konstant über die Reaktionsgefäße (1) bleibt.
19. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Fangvorrichtung vorgesehen ist, welche gegenüber einer Öffnung des Aufnahmeraums (2) oder Öffnungen der Aufnahmeräume (2) des wenigstens einen Reaktionsgefäßes (1) angeordnet und zum Auffangen von aus dem Aufnahmeraum (2) oder den Aufnahmeräumen (2) austretender oder ausgetriebener Flüssigkeit (40) ausgebildet ist.
20. Reaktionsgefäßeinheit (20) nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Fangvorrichtung eine oder mehrere Kompartimente, vorzugsweise in der Art einer Mikrotiterplatte, aufweist, wobei eine Öffnung des Kompartiments oder Öffnungen der Kompartimente der Fangvorrichtung zu der Öffnung des Aufnahmeraums (2) oder den Öffnungen des der Aufnahmeräume (2) des wenigstens einen Reaktionsgefäßes (1) weist, wobei eine Anzahl der Kompartimente der Fangvorrichtung gleich, größer oder kleiner als eine Anzahl der Reaktionsgefäße (1) ist.
21. Verfahren zum selektiven Entfernen einer Flüssigkeit (40) aus einem Reaktionsgefäß (1) einer Reaktionsgefäßeinheit (20), wobei sich die Flüssigkeit (40) in einer Reaktionsgefäßeinheit (20) nach einem der Ansprüche 1 bis 20 befindet, mit den Schritten: - Zentrifugieren der Reaktionsgefäßeinheit (20) bei radial von einer Zentrifugierachse (33) weg weisender Öffnung des Aufnahmeraums (2) mit einer Drehzahl, welche kleiner als eine Grenzdrehzahl ist, bei welcher die Haltewirkung des Rückhaltebereichs gerade überwunden wird, so dass ein in oder an dem Rückhaltebereich befindliches Teilvolumen der Flüssigkeit (40) dort verbleibt und die im Aufnahmeraum (2) befindliche übrige Flüssigkeit (40) entfernt wird.
22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die übrige Flüssigkeit (40) in einer Fangvorrichtung, die insbesondere nach Anspruch 19 oder 20 ausgebildet ist, aufgefangen wird.
23. Verfahren zum Einbringen einer einen Zielstoff (41) enthaltenden Flüssigkeit (40) in ein Reaktionsgefäß (1) einer Reaktionsgefäßeinheit (20), mit den Schritten:
- Verwenden einer Reaktionsgefäßeinheit (20) nach einem der Ansprüche 1 bis 20 zur Aufnahme der Flüssigkeit (40); und
- Leiten des Zielstoffs (41) zu dem Rückhaltebereich mittels eines Leitsystems, wobei das Leitsystem aufweist:
- eine Zentrifugiervorrichtung (30) und eine Anordnung der Reaktionsgefäßeinheit (20) bei radial außen oder im Wesentlichen außen bezüglich einer Zentrifugierachse (33) im Verhältnis zum Rest des Aufnahmeraums (2) liegendem Rückhaltebereich, oder
- einen magnetischen Hilfsstoff (43) oder eine magnetische Eigenschaft des Zielstoffs (41) und eine Magnetvorrichtung (44), welche angeordnet wird, um mit dem magnetischen Hilfsstoff (43) oder der magnetischen Eigenschaft des Zielstoffs (41) zu wechselwirken, oder
- einen elektrostatisch geladenen Hilfsstoff (43) oder eine elektrostatische Eigenschaft des Zielstoffs (41) und eine Elektrodenvorrichtung, welche angeordnet wird, um mit dem elektrostatisch geladenen Hilfsstoff (43) oder der elektrostatischen Eigenschaft des Zielstoffs (41) zu wechselwirken.
24. Verfahren nach Anspruch 23, weiter gekennzeichnet durch den Schritt:
- Zentrifugieren der Reaktionsgefäßeinheit (20) bei radial innen oder im Wesentlichen innen bezüglich der Zentrifugierachse (33) im Verhältnis zum Rest des Aufnahmeraums (2) liegendem Rückhaltebereich mit einer Drehzahl, welche kleiner als eine Grenzdrehzahl ist, bei welcher die Haltewirkung des Rückhaltebereichs gerade überwunden wird, so dass ein in oder an den Rückhaltebereich geleitetes Teilvolumen der Flüssigkeit (40), welches den Zielstoff (41) enthält, dort verbleibt und die im Aufnahmeraum (2) befindliche übrige Flüssigkeit (40) entfernt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die übrige Flüssigkeit (40) in einer Fangvorrichtung, die insbesondere nach Anspruch 19 oder 20 ausgebildet ist, aufgefangen wird.
26. Verfahren zum Aufreinigen eines in einer Flüssigkeit (40) verteilten oder suspendierten Zielstoff (41) wie etwa Zellen, Zellhaufen, Zellagregate oder Organismen in einem Reaktionsgefäß (1) einer Reaktionsgefäßeinheit (20), wobei sich die Flüssigkeit (40) in einer Reaktionsgefäßeinheit (20) nach einem der Ansprüche 1 bis 20 befindet, mit den Schritten:
- Versammeln des Zielstoffs (41) in dem Rückhaltebereich, insbesondere durch Zentrifugieren mit einer Anordnung der Reaktionsgefäßeinheit (20) derart, dass der Rückhaltebereich radial außen oder im Wesentlichen außen bezüglich einer Zentrifugierachse (33) im Verhältnis zum Rest des Aufnahmeraums (2) liegt;
- Entfernen der Flüssigkeit (40) aus dem Aufnahmeraum (2) durch Zentrifugieren der Reaktionsgefäßeinheit (20) bei radial von einer Zentrifugierachse (33) weg weisender Öffnung des Aufnahmeraums (2) mit einer Drehzahl, welche kleiner als eine Grenzdrehzahl ist, bei welcher die Haltewirkung des Rückhaltebereichs gerade überwunden wird, so dass ein in oder an dem Rückhaltebereich befindliches Teilvolumen der Flüssigkeit (40) dort verbleibt und die im Aufnahmeraum (2) befindliche übrige Flüssigkeit (40) entfernt wird;
- Einbringen einer weiteren Flüssigkeit (40) in den Aufnahmeraum (2), insbesondere durch Dispensieren oder Pipettieren; und
- Vermischen des Zielstoffs (41) mit der weiteren Flüssigkeit (40) in dem Aufnahmeraum (2).
27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei das Vermischen wenigstens eine der folgenden Maßnahmen umfasst:
- Stehenlassen für eine vorbestimmte Zeit,
- Schütteln der Reaktionsgefäßeinheit (2),
- Einbringen der weiteren Flüssigkeit (40) in den Aufnahmeraum (2) durch Dispensieren oder Pipettieren derart, dass der Zielstoff (41) von dem Rückhaltebereich ab- oder ausgeschwemmt wird,
- Abpipettieren des Zielstoffs (41) aus dem Rückhaltebereich und Zurückpipettieren in die eingebrachte weitere Flüssigkeit (40) außerhalb des Rückhaltebereichs.
28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, wobei der Aufnahmeraum (2) ein Volumen von etwa 200 bis 400 pl aufweist, wobei der Rückhaltebereich eine Kapillarkavität (3) am Boden des Aufnahmeraums (2) ist und ein Volumen von etwa 5 pl aufweist, und wobei das Versammeln des Zielstoffs durch Zentrifugieren mit mindestens 2g oder mindestens 5g oder mindestens 10g oder mindestens 20g und/oder höchstens 1000g oder höchstens 500g oder höchstens 200g oder höchstens 100g oder höchstens 50g oder höchstens 40g oder höchstens 30g oder höchstens 20g für eine Zeit von mindestens 1 s oder mindestens 2 s oder mindestens 5 s oder mindestens 10 s oder mindestens 10 s oder mindestens 30 s oder mindestens 60 s oder mindestens 90 s oder mindestens 2 Minuten oder mindestens 5 Minuten und/oder für höchstens 60 Minuten oder höchstens 30 Minuten oder höchstens 20 Minuten oder höchstens 15 Minuten oder höchstens 10 Minuten oder höchstens 5 Minuten oder höchstens 2 Minuten oder höchstens 1 Minute oder höchstens 30 s oder höchstens 20 s oder höchstens 10 s oder höchstens 5 s oder höchstens 2 s erfolgt.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei die übrige Flüssigkeit (40) in einer Fangvorrichtung, die insbesondere nach Anspruch 19 oder 20 ausgebildet ist, aufgefangen wird.
30. Verfahren zum Durchführen einer Testung an einem in einer Flüssigkeit (40) verteilten oder suspendierten Zielstoff (41) wie etwa Zellen, Zellhaufen, Zellagregate oder Organismen in einem Reaktionsgefäß (1) einer Reaktionsgefäßeinheit (20), wobei sich die Flüssigkeit (40) in einer Reaktionsgefäßeinheit (20) nach einem der Ansprüche 1 bis 15 befindet, mit den Schritten:
- Aufreinigen des Zielstoffs (41) nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 26 bis 29;
- Entnehmen einer vorbestimmten Menge der in dem Reaktionsgefäß (1) befindlichen Flüssigkeit (40) mit darin verteiltem oder suspendiertem Zielstoff (41); und
- Zuführen des in der vorbestimmten Menge enthaltenen Zielstoffs (41) zu einer Testvorrichtung wie etwa einer Durchflusszytometrievorrichtung.
PCT/EP2022/085722 2021-12-13 2022-12-13 REAKTIONSGEFÄßEINHEIT, VERFAHREN ZUM SELEKTIVEN ENTFERNEN EINER FLÜSSIGKEIT SOWIE ZUM EINBRINGEN EINER EINEN ZIELSTOFF ENTHALTENDEN FLÜSSIGKEIT AUS EINEM BZW. IN EIN REAKTIONSGEFÄß EINER REAKTIONSGEFÄßEINHEIT WO2023110944A1 (de)

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DE102021006144.6A DE102021006144A1 (de) 2021-12-13 2021-12-13 Reaktionsgefäßeinheit, Verfahren zum selektiven Entfernen einer Flüssigkeit sowie zum Einbringen einer einen Zielstoff enthaltenden Flüssigkeit aus einem bzw. in ein Reaktionsgefäß einer Reaktionsgefäßeinheit
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