WO2007072971A1 - 緑藻由来の硫酸化多糖を含有する血管障害改善剤及びその製造方法 - Google Patents

緑藻由来の硫酸化多糖を含有する血管障害改善剤及びその製造方法 Download PDF

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WO2007072971A1
WO2007072971A1 PCT/JP2006/325693 JP2006325693W WO2007072971A1 WO 2007072971 A1 WO2007072971 A1 WO 2007072971A1 JP 2006325693 W JP2006325693 W JP 2006325693W WO 2007072971 A1 WO2007072971 A1 WO 2007072971A1
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WO
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sulfated polysaccharide
salt
platelet aggregation
mass
aggregation reaction
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PCT/JP2006/325693
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Inventor
Koji Suzuki
Masakatsu Nisikawa
Joji Otani
Shigeo Tanaka
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Konan Chemical Manufacturing Co., Ltd.
Mie University
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to a vascular disorder ameliorating agent, and in particular, a vascular disorder ameliorating agent comprising a sulfated polysaccharide comprising rhamnose derived from a green algal plant as a main component of a monosaccharide, a composition for improving disease, and It relates to its use.
  • a vascular disorder ameliorating agent comprising a sulfated polysaccharide comprising rhamnose derived from a green algal plant as a main component of a monosaccharide, a composition for improving disease, and It relates to its use.
  • Acidic polysaccharides such as sulfated polysaccharides extracted from seaweed are known to have various physiological activities such as anticoagulant activity (JP-A 63-235301) and cholesterol lowering action (patents). No. 3634721) is known.
  • JP-A 63-235301 anticoagulant activity
  • patents cholesterol lowering action
  • No. 3634721 is known.
  • a hydrolysis method using acidified potassium is known (Japanese Patent Laid-Open No. 7_215990).
  • disclosure also been tried are (JP ⁇ 1 1-Nos sixty thousand five hundred ninety) b invention to confer bioactivity desorbed sulfate group from the sulfated polysaccharide...
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a sulfated polysaccharide derived from green algae having excellent vascular disorder-improving properties, a sulfated polysaccharide, a vascular disorder ameliorating agent, a pharmaceutical composition and a food composition. .
  • a method for producing a sulfated polysaccharide or a salt thereof comprising rhamnose as a main component of a constituent monosaccharide the step of preparing green cocoon or a fragment thereof, And an extraction step of extracting a sulfated polysaccharide or a salt thereof by heating in an acidic aqueous medium from the green algae or a fine piece thereof.
  • the acidic aqueous medium may contain an organic acid.
  • the sulfate group content of the sulfated polysaccharide to be extracted and converted into punoleran by gel filtration chromatography It is also possible to control the weight average molecular weight.
  • a sulfated polysaccharide or a salt thereof having platelet aggregation inhibition and cholesterol lowering activity may be produced.
  • the amount of the organic acid added to the acidic medium is 0: 3% by mass or more and 1% by mass. / 0 or less.
  • the extraction step can be performed by heating the aqueous medium to 90 ° C. or higher and 130 ° C. or lower.
  • the extraction step may be a step of extracting a sulfated polysaccharide or a salt thereof having a pullulan-converted weight average molecular weight of 200,000 or less by gel filtration chromatography.
  • the pullulan-converted weight average molecular weight may be 1 million or less.
  • the sulfated polysaccharide or a salt thereof can have the following features (a) and (b).
  • the rhamnose ratio in the constituent polysaccharide is 70% by mass or more, and the glucose content is 1% by mass or more and 30% by mass. /.
  • the xylose content is 1 mass% or more and 10 mass% or less
  • the sulfate group content is 10 mass. /. More than 40 mass. /. Less than
  • a method for producing a sulfated polysaccharide or a salt thereof comprising rhamnose as a constituent monosaccharide and comprising a green alga or a fragment thereof An extraction step of extracting the sulfated polysaccharide or a salt thereof by heating the green algae or a fragment thereof in an aqueous medium; and deionizing the extracted sulfated polysaccharide by ion exchange; And a neutralizing step, and a production method comprising:
  • the extraction step may be a step of extracting the green algae or the fine pieces thereof using an acidic aqueous medium.
  • the green algae can be a monkey (Mo no s tr oma nit i d um) or hirono s no oma ti s d i um (Mono s troma 1 at s s i m um).
  • a sulfated polysaccharide or a salt thereof obtained by any one of the above-described production methods and containing rhamnose as a main component of a constituent monosaccharide. . '
  • the rhamnose ratio in the constituent polysaccharide is 70 mass% or more, the glucose content is 1 mass% or more and 30 mass% or less, and the xylose content is 1 mass% or more and 10 mass% or less.
  • the sulfate group content is 10 mass. /. More than 40 mass. /. Less than
  • a sulfated polysaccharide or a salt thereof which has a platelet aggregation reaction inhibitory activity.
  • the platelet aggregation reaction is one or two selected from the listetine-induced human platelet aggregation reaction, the collagen-induced platelet aggregation reaction, and the thrombin-induced platelet aggregation reaction of human platelets. It is preferable that this is the case.
  • the platelet aggregation reaction It may be a platelet aggregation reaction.
  • the platelet aggregation reaction may be human platelet ristocetin-induced human platelet aggregation reaction, collagen-induced platelet aggregation reaction, and thrombin-induced platelet aggregation reaction.
  • the sulfated polysaccharide may be a sodium salt or a potassium salt. 9 In addition, it is preferable that the sulfated polysaccharide has a blood cholesterol lowering action in an animal containing human.
  • an agent for preventing or ameliorating a vascular disorder comprising the sulfated polysaccharide described in any of the above.
  • a food composition comprising the sulfated polysaccharide according to any one of the above, wherein the preventive sentence for vascular disorder is a food composition for improvement.
  • the food composition may be used for beverages or beverages, and may be used for beverages containing tea leaves or drinking powder and the sulfated polysaccharide.
  • it may be for the prevention of hypercholesterolemia, which contains a clinically effective amount of rhamnan sulfate derived from human edasa or a salt thereof for humans at risk for hypercholesterolemia.
  • a human who is at risk for hypercholesterolemia has a total cholesterol level of 2 Omg / d1 or higher or LD L 'cholesterol level of 14Omg / d1 or higher. It is a human.
  • a pharmaceutical composition comprising the sulfated polysaccharide according to any one of the above, for preventing a disease requiring improvement of a vascular disorder or A therapeutic pharmaceutical composition.
  • a pharmaceutical composition comprising the sulfated polysaccharide according to any one of the above, for preventing a disease requiring improvement of a vascular disorder or A therapeutic pharmaceutical composition.
  • it is possible to contain a clinically effective amount of the sulfated polysaccharide for humans in a disease requiring improvement of vascular disorders.
  • it can be an oral preparation for the prevention of hypercholesterolemia containing a clinically effective amount of rhamnan sulfate polysaccharide derived from hitodasa for humans at risk for hypercholesterolemia.
  • the vascular disorder is hypercholesterolemia, and can be prepared as an oral administration preparation.
  • FIG. 1 is a graph showing the inhibitory activity of platelet aggregation reaction in Production Examples 1 to 7 when ristocetin is used as an inducer.
  • FIG. 2 is a graph showing the inhibitory activity of platelet aggregation reaction in Production Examples 1 to 7 when thrombin is used as an inducer. .
  • FIG. 3 is a graph showing the inhibitory activity of platelet aggregation reaction in Production Examples 1 to 7 when collagen is used as an inducer.
  • FIG. 4 is a graph showing the inhibitory activity of platelet aggregation reaction in Production Examples 8 to 10 when ristocetin is used as an inducer.
  • FIG. 5 is a graph showing the inhibitory activity of blood clot agglutination reaction in Production Examples 8 to 10 when thrombin is used as an inducer. '
  • Fig. 6 shows production examples 8 to 1 when collagen is used as the inducing substance.
  • FIG. 7 is a graph showing the transition of the total blood cholesterol level during human ingestion. '
  • FIG. 8 is a graph showing the transition of the blood LDL-cholesterol level during human ingestion. , 'Best mode for carrying out the invention,
  • a method for producing a sulfated polysaccharide having rhamnose derived from a green algal plant as a main constituent monosaccharide comprises a step of preparing a pre-green alga or a fragment thereof, and an acid treatment of the green alga or a fragment thereof.
  • a sulfated polysaccharide having an excellent inhibitory activity on the platelet aggregation reaction can be obtained by extracting the sulfated polysaccharide under acidic conditions.
  • This sulfated polysaccharide prevents or treats undesired blood vessels caused by excessive or enhanced platelet aggregation, especially foods that improve the impaired state of the vascular endothelium, and diseases and conditions that require such improved vascular disorders. Can be used for medicine. ..
  • the sulfated polysaccharide produced by the method for producing a sulfated polysaccharide of the present invention also has a good cholesterol-lowering action. For this reason, this manufacturing method According to the sulfated polysaccharide obtained by this method, blood sterol can be reduced, the damage to the vascular endothelium caused by cholesterol can be reduced, and the platelet aggregation reaction can be suppressed. Can prevent, improve and maintain the integrity of vascular endothelium. Therefore, the sulfated polysaccharide produced by the present production method can be used as a food effective for the prevention and treatment of vascular disorders, particularly vascular endothelial disorders, and as a drug effective for the prevention or treatment of such injuries.
  • animal includes human and non-human animals, and non-human animals include domestic animals such as sushi, pigs> Hedges, goats and horses, Includes poultry such as chickens and turkeys, and pets such as dogs and cats.
  • the green algae used in the present invention are not particularly limited, but such algae: As for the species, the mosquitoes Mo nostroma, P rot omo nostroma, / Ossa B lindingia, En ter omo rpha ⁇ va r'i a. More specifically, Mo nostr oma nitid um, Mo nostroma 1 atissimum, Mo nostr oma.
  • Green algae can be used in the raw state, but are usually distributed in a dry state with a moisture content of about 10% or less.
  • the dried green algae is preferably first immersed in water to absorb water.
  • the water absorption method is not particularly limited, but it may be immersed in an amount of water or warm water enough for green algae to swell for about 30 minutes to 1 hour. After water absorption, the water on the surface can be drained appropriately.
  • the green algae plant may be cut into small pieces with a blender or a cutter as appropriate.
  • the extraction step is preferably carried out by heating the absorbed green algae or the fine pieces thereof in a sufficient amount of an acidic aqueous medium.
  • a sulfite polysaccharide having an activity of suppressing platelet aggregation by an inducer selected from ristocetin, collagen and thrombin can be obtained.
  • an inducer selected from ristocetin, collagen and thrombin can be obtained.
  • sulfuric acid has a higher anti-ristocetin-induced platelet aggregation-inhibiting activity.
  • a modified polysaccharide can be obtained.
  • This extraction step is carried out so that the sulfated polysaccharide content of the resulting sulfated polysaccharide is 15% or more, more preferably '20% or more of the type of aqueous medium, heating It is preferable to set the temperature, pH, acid type, concentration and extraction time.
  • the aqueous medium in the acidic aqueous medium preferably contains water as a main component, and more preferably, only water is used as the medium. It may be a mixed solution with an organic solvent such as ethanol which is compatible with water.
  • the heating temperature may be 75 ° C or higher, preferably 90 ° C or higher. More preferably, it is conducted at 95 ° C. or higher, more preferably in a boiled state.
  • the heating temperature is preferably 130 ° C. or lower. This is because when the temperature is 1 30 ° C. or lower, molecular weight reduction is easily controlled. More preferably, it is 1 21 ° C or less.
  • the amount of the acidic aqueous medium for the green algae is not particularly limited. It is preferably 10 parts by weight or more and 30 parts by weight or less with respect to 1 part by weight of the green algal plant in a dry state (water content of about 10% or less). More preferably, it is 18 to 28 parts by weight.
  • the pH of the acidic aqueous medium is preferably 3 or more and 5 or less.
  • the pH is less than 3, the decomposition of the sulfate group tends to occur, and when the pH exceeds 5, the low molecular weight becomes slow.
  • These acidic conditions are formed by the addition of an inorganic acid and / or an organic acid to an aqueous medium.
  • inorganic acids include hydrochloric acid, sulfuric acid, and -nitric acid
  • organic acids include succinic acid, succinic acid, malic acid, fumaric acid, citric acid, formic acid, acetic acid, lactic acid, and ascorbic acid.
  • an organic acid is preferably used, and among them, citrate, malic acid, fumaric acid, and ascorbic acid can be preferably used.
  • the acid concentration relative to the aqueous medium is 0.3 mass. / 0 or more 10 mass. / 0 or less is preferable. More preferred is 0,5% to 5% by mass.
  • the acid may be added prior to heating the aqueous medium, or may be added after the start of heating or when the temperature is close to the intended extraction temperature. .
  • Extraction time can be 1 hour or more and 20 hours or less.
  • the extraction time can be appropriately set according to the heating temperature, the acid to be added, and its concentration.
  • the extraction time is about 0.7% by mass of the addition amount, and the extraction temperature is the boiling point at normal pressure 100 ° In that case, preferably 4 hours More preferably, it is 5 hours or more, and more preferably about 6 hours.
  • the molecular weight distribution of the high molecular weight degradation reaction of the extract by acid addition proceeds from 3 million to 1 million but without sulfate group decomposition and removal in 6 hours.
  • the molecular weight distribution of the distribution of 300,000 or more and 100,000 or less is lost, and the molecular weight distribution of hundreds of thousands increases.
  • the extraction time can be shortened by increasing the amount of citrate added or raising the extraction temperature to 10 ° C or higher. [0 0 4 1]
  • the concentration, extraction temperature, and extraction time of acids such as organic acids
  • the weight average molecular weight in terms of pullulan is controlled from 2 million to around 10,000 while suppressing the decrease in sulfate group content.
  • the molecular weight can be lowered step by step.
  • the pH at the time of extraction is preferably 3 or more and 5 or less.
  • a solid-liquid separation step is performed in which the extract is subjected to solid-liquid separation to collect a liquid fraction.
  • the solid-liquid separation step can be performed using a conventionally known solid-liquid separation method such as natural sedimentation, centrifugation, filtration, filter press, and addition of a flocculant.
  • diatomaceous earth is used as a filter aid.
  • Use filtration or centrifugation preferably 5 OOOX g or more). Algae is easily separated by filtration or centrifugation when mixed with diatomaceous earth.
  • Solid-liquid separation may be performed by combining two or more of various operations. Since the liquid fraction thus obtained contains added acid, if it is preferable to consider the acid, it can be removed by ultrafiltration membrane, ion exchange, dialysis or the like. it can.
  • the liquid fraction thus obtained contains sulfated polysaccharide, and this liquid fraction can be used as a solution-like sulfated polysaccharide. It can also be obtained as a solid or semi-solid sulfated polysaccharide.
  • drying step conventionally known drying methods such as freeze drying and spray drying can be employed. In this way, a sulfated polysaccharide such as powder can be obtained.
  • the sulfated polysaccharide of the present invention obtained by the production method of the present invention contains a sulfated polysaccharide containing rhamnose as a main component of a constituent monosaccharide or a salt thereof.
  • the sulfated polysaccharide in the present invention include sulfated polysaccharides in which the 3-position or 4-position of the constituent sugar is sulfated.
  • the sulfated polysaccharide may be a free acid in its sulfate group or a salt such as a metal salt. Examples of such salts include alkali metal salts such as sodium and potassium, and alkaline earth metals such as calcium and magnesium.
  • the monosaccharide composition of the sulfated polysaccharide in the present invention is mainly composed of rhamnose 'and 50 masses of the constituent monosaccharide. / 0 or more is rhamnois.
  • Rhamnose molar ratio in sulfated polysaccharide is preferably 60 mass. / 0 or more, more preferably 70 mass. /. That's it.
  • the relationship with the rhamnose ratio is not necessarily clear and does not restrict the present invention.
  • the polysaccharide is decomposed to the constituent monosaccharide, the free acid is separated and removed, and the monosaccharide component is quantified by HPLC. Can be obtained.
  • the acid hydrolysis method can be performed, for example, as follows.
  • the sulfated polysaccharide of the present invention may contain glucose and / or xylose as a constituent monosaccharide other than rhamnose.
  • it contains glucose and further contains xylose. If it contains glucose, its content is 1 mass. More than 30 mass. / 0 or less is preferable.
  • xylose is contained, the content is preferably 1% by mass or more and 10% by mass or less.
  • the weight average molecular weight of pullulan converted by gel permeation chromatography (GPC) of the sulfated polysaccharide of the present invention is not particularly limited as long as it has platelet aggregation activity and activity of lowering cholesterol or cholesterol, but pullulan converted weight average molecular weight Is preferably 2 million or less. Further, it is preferable to use a pullulan having a weight average molecular weight of 100,000 or more and 1200,000 or less. In particular, the cholesterol lowering action is more preferably more than 100,000 and less than 1 million, and still more preferably more than 300,000 and less than 1 million. ,.
  • the sulfuric acid content in the sulfated polysaccharide of the present invention is not particularly limited as long as it has platelet aggregation activity and activity of lowering cholesterol or cholesterol. It is preferable that it is mass% or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but is preferably 40% by mass or less. More preferably 35 mass. /. It is as follows.
  • the sulfate group content can be determined by the combustion flask method and the rosin acid method. For the combustion flask method, for example, the combustion flask method described in Analytical Chemistry, 15 5 ⁇ , pages 689 to 691, (1966) ', Volume 17, pages 1322 to 1324, (1968) is adopted.
  • the sulfur content in the sample can be calculated by quantifying the elemental sulfur in the sample by the combustion flask method and multiplying the content of the sulfur atom in the obtained sample (% by mass). Further, as the Logison method, for example, the method described in An a.lytica 1 Biotech, 41 ⁇ , pp. 471 to 476 (19.71) can be adopted.
  • the extraction step of the sulfated polysaccharide from the green algae or the fine pieces thereof may be performed by heating the neutral aqueous medium to extract the sulfated polysaccharide.
  • the aqueous medium, the extraction temperature, and the extraction time can be carried out in the same ranges as described above.
  • the resulting sulfated polysaccharide is cation-exchanged by cation exchange chromatography or the like and weakened by thionation, and then is neutralized by the desired metal alkali, preferably by sodium and / or force-rich aluminum.
  • a salt of a hydrated sulfated polysaccharide 'These alkali metal salts can exhibit a preferable platelet aggregation inhibitory activity.
  • the sulfated polysaccharide or salt thereof of the present invention has platelet aggregation inhibitory activity in animals containing human. 'By having platelet aggregation inhibitory activity, it can improve and prevent vascular injury and vascular endothelial injury. Among them, the sulfated polysaccharide of the present invention has an activity of inhibiting the platelet aggregation reaction of human platelets induced by listcetin. It was found that ristocetin specifically binds to blood vWF (von Willebrand factor) and platelets.
  • vWF von Willebrand factor
  • ristocetin binds to vWF and is activated by changing the three-dimensional structure of vWF, and this activated vWF binds easily to platelets and induces platelet aggregation. Therefore, ristocetin-induced platelet aggregation of human platelets is a major aggregation form of platelet aggregation in blood turbulence tubes, specifically, arteries with fast blood flow, branching sites of blood vessels, and sites with complex blood vessel morphology. It is thought that there is. Therefore, ristocetin-induced platelet aggregation It is considered that thrombus and arteriosclerosis in arteries can be effectively suppressed by suppressing the collecting reaction.
  • the sulfated polysaccharide of the present invention has a cholesterol-reducing action in animals containing humans. By having a cholesterol-lowering action, it can itself improve and prevent vascular injury and vascular endothelial injury.
  • the sulfated polysaccharide of the present invention has excellent platelet aggregation reaction inhibitory activity. For this reason, it is effective in preventing and improving vascular disorders, particularly vascular endothelial disorders. Therefore, it is possible to prevent the formation of thrombus and to improve such a condition. Further, the sulfated polysaccharide of the present invention has a cholesterol lowering action. For this reason, it is possible to prevent and ameliorate vascular disorders caused by the accumulation of cholesterol, especially vascular endothelial disorders.
  • the sulfated polysaccharide of the present invention which has an inhibitory activity on platelet aggregation and a cholesterol-lowering effect, prevents and improves vascular endothelial damage caused by cholesterol and further suppresses thrombus formation. Can effectively prevent and ameliorate vascular endothelium disorders that cause infectious diseases. As a result, these sulfated polysaccharides can effectively prevent arteriosclerosis and thrombosis.
  • the sulfated polysaccharide of the present invention can take various forms such as a solid such as a powder, a solution, and a suspension. Generally, it is distributed and provided in a solid state such as powder.
  • the present composition may optionally contain additives in order to enhance the stability of the sulfated polysaccharide.
  • it may contain proteins derived from raw materials for extraction.
  • the vascular disorder improving agent of the present invention contains the sulfated polysaccharide of the present invention as an active ingredient. From the above, the sulfated polysaccharide of the present invention can be used as a vascular disorder ameliorating agent as a research reagent, and has a pharmaceutical composition used for the prevention or treatment of vascular disorder-related diseases or such diseases. It can be used in food compositions that are taken by individuals at risk or healthy individuals.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the sulfated polysaccharide of the present invention, and is used for diseases related to vascular disorders, that is, diseases requiring improvement of vascular disorders. It can be used as a prophylactic or 'therapeutic pharmaceutical composition.
  • diseases or conditions that require improvement of vascular disorders particularly vascular endothelial disorders, include arteriosclerosis, thrombosis, diabetes, and pulmonary airway diseases. It should be noted that the disease or condition targeted by this drug composition is not limited to these.
  • the sulfated polysaccharide in the pharmaceutical composition may be an acid your Keru liberated sulfuric ester group, a pharmaceutically acceptable a salt which may ⁇ way to / “Examples of this salt include alkali metal salts such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as calcium and magnesium, and the like.
  • the present pharmaceutical composition may contain other pharmaceutical agents effective for the above-mentioned diseases other than the present composition.
  • examples include other platelet aggregation inhibitors and cholesterol lowering agents.
  • This pharmaceutical composition may also be provided as a pharmaceutical composition sed that can be administered in combination with other drugs effective for the above-mentioned diseases.
  • the present pharmaceutical composition contains at least the vascular disorder ameliorating agent of the present invention as an active ingredient, and includes various pharmaceutically acceptable forms including a pharmaceutically acceptable known pharmaceutical carrier. It can.
  • a pharmaceutically acceptable known pharmaceutical carrier is well known in the art, and a known drug carrier used in a pharmaceutical form that may be applied to the present m ⁇ u composition may be appropriately selected and used.
  • Examples of the dosage form of this pharmaceutical composition include powders, powders, granules, tablets, capsules, solids such as chewables, solutions such as solutions, suspensions, emulsions, injections, suppositories, Examples include film agents and gel agents.
  • Examples of the drug carrier used in such a pharmaceutical form include glucose, lactose, sachet, starch, mannitol, dextrin, fatty acid glyceride, polyethylene glycol, hydroxyethylene starch, ethylene glycol, and polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester. Amino acids, gelatin, albumin, water, physiological saline and the like. Furthermore, additives such as stabilizers, wetting agents, emulsifying agents, binders, tonicity agents and the like may be included as necessary.
  • Such a drug and an ancestor can be prepared by known conventional means corresponding to various preparation forms.
  • the present pharmaceutical composition can be administered by oral, sublingual, subcutaneous or intravenous injection, transdermal, rectal administration, etc., and a necessary formulation form is appropriately selected. It is preferably provided as a solid or liquid oral preparation.
  • the pharmaceutical composition may be used as a topical application agent for balloon treatment sites or blood vessel stenosis sites.
  • This pharmaceutical composition includes, in particular, a film agent, a gel agent and the like as such a preparation form for topical application.
  • the pharmaceutical composition can be delivered transluminally or percutaneously using an endoscope, a catheter, a tube or the like.
  • the present pharmaceutical composition may be provided in the form of a medical device having a blood contact surface containing various indwelling materials such as a balloon stent. Moreover, you may provide as a surface treating agent with respect to such a blood contact surface. Examples of such medical devices include balloons and stents that are indwelling materials. Other medical devices include catheters, blood collection syringes, artificial organs, infusion packs, and infusion tubes.
  • the surface treatment method is not particularly limited as long as it does not impair the inhibitory activity of the sulfated polysaccharide on the platelet aggregation reaction.
  • the effective dosage of the pharmaceutical composition is appropriately selected and determined according to the dosage form, administration method, subject's age, weight, symptoms, administration schedule, etc.
  • sulfuric acid The dose of the conjugated polysaccharide is preferably 1 mg to 5000 mg or less per day for adults, more preferably 100 mg to 200 Omg. These may be administered in several divided doses per day.
  • the dosage varies depending on the dosage form, administration method, purpose of use, and age, weight, and symptoms of the patient to whom the drug is administered.
  • the dose of the active ingredient is human (for example, adult) 0.
  • the content of sulfated polysaccharide in the pharmaceutical composition is, for example, 0.001% to 100% by weight, preferably 0.1% to 100% by weight in 100% by weight of the pharmaceutical composition. 90% by weight, more preferably 1.0% by weight to 800% by weight.
  • the preventive or therapeutic method of the present invention comprises the step of administering the pharmaceutical composition to an individual having a disease or condition requiring improvement of a vascular disorder or an individual who is at risk for the disease or condition.
  • the dosage form can be administered orally to these individuals, or can be administered locally to the site of such a disease or a site at risk for the occurrence of such a disease.
  • the food composition of the present invention contains the sulfated polysaccharide of the present invention, and is a food composition for preventing or improving a vascular disorder or for preventing or prognosing a disease requiring improvement of a vascular disorder (hereinafter referred to as the present invention). It is called a food composition.
  • the disease requiring improvement of the vascular disorder is the same as that in the pharmaceutical composition.
  • it may be a free acid at a sulfate ester group in the sulfated polysaccharide contained in the food composition, for example, an alkali metal salt such as sodium or potassium, or an alkaline earth metal such as calcium or magnesium. And the like.
  • the food composition can be a general food such as processed foods, confectionery, seasonings, palatability foods and beverages containing the sulfated polysaccharide of the present invention.
  • Specific forms are not particularly limited, but solid or semi-solid taste foods such as woodpecker, biscuits, candy, gum, jelly, fruit juices, tea, coffee, soft drinks, etc. It can be used as staple foods such as foods, soup, curry, stew, and other foods such as various sauces, as well as various flavors and seasonings.
  • dietary supplements, functional foods, foods for specified health use, tube nutrients, etc. can also be used.
  • the food composition is preferably used for beverages or drinks because of its ease of ingestion and solubility. Specifically, it can be used for beverages containing tea leaves or drinking powder and the sulfated polysaccharide.
  • the effective intake of this food composition depends on the age, weight, and situation of the subject, but the intake of sulfated polysaccharide is roughly 1 mg or more per 1 500 mg The following degree is preferable, and more preferably, 100 mg to 20 O mg. These may be taken in several divided doses per day.
  • the content of the sulfated polysaccharide in the food composition is not particularly limited, but for example, it is preferably about 0.01% by mass to 20% by mass in terms of dry weight, and more preferably, 0 It is 1 mass% or more and 5 mass% or less.
  • this vascular disorder ameliorating agent can also be used as a pharmaceutical composition or a feed composition for non-human animals.
  • Non-human animals include livestock, poultry and pets. Even in non-human animals, this vascular disorder ameliorating agent can be administered or ingested to prevent or treat diseases that require vascular disorder improvement and maintain health. It is easy for those skilled in the art to produce various forms of pharmaceutical compositions and feed compositions for non-small animals containing the present vascular disorder ameliorating agent.
  • the total amount of the supernatant was lyophilized to obtain 15 3 g of powder.
  • a 2 w / v aqueous solution of the powder obtained in Production Example 1 was prepared using distilled water. 'This solution was equilibrated with 2N hydrochloric acid and then passed through a cation exchange resin column SK104 (Mitsubishi Chemical Corporation, column size diameter 3 Omm, length 50 Omm). (PHl. 9 to 2.4) was neutralized with NaOH and freeze-dried to obtain a powder.
  • a 2 w / v% aqueous solution of the powder obtained in Production Example 1 was prepared with distilled water. This aqueous solution was equilibrated with 2 N hydrochloric acid and then passed through a cation exchange resin column SK104 (Mitsubishi Chemical Corp., column size diameter 3 Omm length 50 Omm), which was passed through, and the weak thiol solution obtained. (PHl. 9 to 2.4) was neutralized with CaOH and freeze-dried to obtain a powder. '
  • a 2 w / v aqueous solution was prepared from the powder obtained in Production Example 1 with distilled water. This aqueous solution was equilibrated with 2 N hydrochloric acid, and then passed through a cation exchange resin column SK104 (Mitsubishi Chemical Corporation, column size diameter 3 Omm length 50 Omm). pHl. 9-2.4) was neutralized with KOH and freeze-dried to obtain a powder.
  • a 2 w / v aqueous solution of the powder obtained in Production Example 1 was prepared using distilled water. This aqueous solution was dialyzed against Wako Dialysis Membrane 27, desalted and lyophilized. This powder Next, it was passed through a DE 52 packed column (Wattman, column size diameter 30 mm, length 500 mm), separated and purified, and dialyzed with Wako Dialysis Membrane 27 for desalting and freeze-dried. A powder was obtained.
  • Mie prefecture-grown aquaculture hitodasa (240 g) was added to 61 water and immersed for 30 minutes, then the wash water was separated and water was added again to make a total amount of 6.24 kg. This was subjected to hot water extraction for 2 hours while maintaining the liquid temperature at 60 ° C to 65 ° C. Centrifugation yielded 3.79 kg of hot water extract and solids (hereinafter referred to as “recovered fish”). To 300 g of this collected edetasa, 3 1 water and 10 Omg citrate were added, and hot water extraction was performed while adding water at 95 ° C to 100 ° C for 6 hours. The hot water extract was filtered, and the entire amount of the filtrate was lyophilized to obtain a powder (3 g).
  • G.PC was performed on the various fractions under the same conditions as the GPC performed on Sample 1, and the fractions having a retention time (RT) of approximately 14.5 minutes as the main peak were collected as the recovered fraction.
  • the whole amount was dialyzed for 4 to 5 'days using a dialysis tube, and the concentrate was freeze-dried to obtain a powder.
  • the weight average molecular weight in terms of punoreran was 1.89 million.
  • 3 g of powder was obtained by freeze-drying 550 g of the hot water extract from the hot water extract obtained in the production of Production Example 8. 3 g of this powder is dissolved in 200 ml of 0. ImM Tris buffer (pH 8.7), and 0.14 g of proteolytic enzyme (Actinase E, manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) is added. After incubating for a while, inject into DE 52-filled column (equilibrated with 7M urea 0.15MKC 1), and pass through 71 ⁇ 1 urea 0.15MK C 1 3 1 or more, then KC 1 concentration 0.15M ⁇ 2M Until about 1 hour The solution was allowed to flow through, and each eluted fraction was collected with a fraction collector.
  • proteolytic enzyme Actinase E, manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the fraction with a retention time (RT) of about 15.5 minutes under the GPC conditions for sample 1 is collected as the main fraction, and this total amount is collected using a dialysis tube.
  • the mixture was dialyzed for 5 days and the concentrate was freeze-dried to obtain a powder (sample 7).
  • the weight average molecular weight in terms of pullulan was 620,000.
  • a platelet aggregation reaction was performed using ristocetin, thrombin and collagen as inducers, and the inhibitory activity of the sulfated polysaccharides obtained in Production Examples 1 to 10 was evaluated.
  • the platelet aggregation reaction was performed as follows. The results are shown in Figs.
  • Measurement method 4-concentration continuous suction measurement with filter tip
  • sulfated polysaccharides differ greatly in their reactivity to platelet aggregation reaction due to differences in their production methods, and the sulfated polysaccharides of Production Example 3 are the same as the production examples of Aya 5. It was found that the obtained sulfated polysaccharide has a high level and inhibitory activity on the ristocetin-induced platelet aggregation reaction, and also has a good inhibitory activity on torombin-induced and collagen-induced platelet aggregation. In addition, it was found that the platelet-aggregation inhibitory activity was also good when the ion exchange was replaced with a potassium salt or a sodium salt.
  • Production Example 10 showed stable and high inhibitory activity as compared to Production Examples 8 and 9.
  • FIG. 5 in the thrombin-induced platelet aggregation activity reaction, Production Examples 9 and 10 showed higher inhibitory activity than Production Example 8, but Production Example 10 was the best. It was.
  • FIG. 6 in the collagen-induced platelet aggregation activity reaction, Production Example 9 and .10 showed higher inhibitory activity than Production Example 8, but Production Example 10 was the highest.
  • the weight average molecular weight in terms of pullulan exceeds 200,000, it cannot be said that it has good platelet aggregation inhibitory activity, but the molecular weight is 10 million.
  • the platelet aggregation has a good inhibitory activity on platelet aggregation at about 60,000 or less, and that at least the amount of the fraction is 20 million or more and 20 or more. It was found to be suitable for the aggregation inhibitory activity.
  • Example 1 1 The sulfated polysaccharide (Production Example 1 1) obtained in Example 5 and Example 4 was orally administered to humans and blood was collected at regular intervals to examine blood lipids and the like.
  • the test conditions were as follows. The results are shown in Table 1, and the changes in total cholesterol and LDL cholesterol are shown in FIGS. 4 and 5, respectively.
  • Subject A man who is not suspected of having liver or kidney damage and who is not taking drugs or supplements that have lipid effects. Age is 37.1 ⁇ 10. 1 years (21 to 54 years) The total blood cholesterol level was 230 ⁇ 23.8 mg / .d 1 at the start of feeding.
  • Blood sampling conditions 7 days after the start of intake, 2 weeks after intake, 4 weeks after, 6 weeks after, and 4 weeks after rest. : .
  • the eight types of acids (organic acids and inorganic acids) shown in Table 2 were used for cultured Mito fern in Mie Prefecture, and conditions such as addition amount (concentration), extraction temperature, and extraction time shown in Table 2 were used.
  • the obtained sulfated polysaccharide was subjected to GPC and the sulfate group content was measured. Detailed operation and GPC conditions are shown below.
  • the sulfate group content was measured by the following method. [0094] After swelling 400 g (water content: about 7%). Of cultured Miocha japonica produced in Mie Prefecture for 30 minutes, it was drained for 10 minutes.
  • Each of the sulfated polysaccharides obtained in Production Example 1 and Production Example 1 1 was administered to rats fed a high fat diet, and various blood fat parameters (total cholesterol, triglyceride, HDL cholesterol, LDL Cholesterol was measured, and the test conditions were as follows: Table 3 shows the results.
  • Test animals 6-week-old Sprague-Dawley-type SF rats (Crj: C (SD) I GS, 6 males per group;).
  • High fat diet basic powder CRF-1 plus 1% cholesterol, cholic acid 0 ⁇ 20 mass 0 /. Olive oil 2.5 mass 0 /. To which is added.
  • Rats were allowed to eat a high-fat diet freely for 28 days, and the sulfated polysaccharides of Production Example 1 1 were forced to 2.5 g / kg, 1, 0 g / kg, 0. SgZkg once a day Orally. '
  • Blood collection conditions Blood should be collected from the jugular vein via a syringe 2 days before, 13 days, and 27 days after the start of administration (note that the first day of administration is the first day of administration and the next day after the first day of administration). The measurement was performed after separating the serum (3000 rpm, 1600 X g, 10 minutes).
  • Elemental analysis of sulfur atom was performed by the combustion flame method described in Analytical Chemistry, 15 pp. 689-691, (1966), 17, 1322-: 1324, (1968)
  • the sulfate group content was calculated by multiplying the sulfur atom content (wt%) in the sample by 3.
  • each of Samples 8 to 11 is composed of rhamnose as a main component of monosaccharide, and the mass ratio ranges from 68 mass% to 93 mass%. 92% by mass to 97% by mass with the main component, glucose. /. Furthermore, when the mass ratio of xylose was further added, it was 97 mass% to 1.00 mass%. The sulfate group content is 18-23 mass. The range was / 0 .

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Abstract

本発明は、優れた血小板凝集反応の抑制活性を有する硫酸化多糖を提供することを目的とする。この目的のため、本発明は、緑藻植物又はその細片を酸性下90℃以上の水で抽出し、その抽出液を固液分離し、乾燥することにより得られる緑藻植物来のラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖を提供する。この硫酸化多糖は、優れた血小板凝集反応の抑制活性を有している。

Description

' 明細書
緑藻由来の硫酸化多糖を含有する血管障害改善剤及びその製造方法 技術分野
[0001] 本発明は、'血管障害改善剤に関し、 特に、 緑藻植物由来のラムノ ースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖を含有する血管障害改善剤、 疾患改 善用組成物及びその利用等に関する。 - 背景技術
[0002] 海藻から抽出される硫酸化多糖などの酸性多糖については、 種々 の生理活性が知られており、 例えば、 抗凝血活性 （特開昭 63— 235301 号）や、 コレステロール低下作用 （特許第 3634721号）が知られている。 ' まだ、 硫酸化多糖の低分子化製法として、 酸添カ卩による加水分解法が知られて いる （特開平 7_215990号） 。 さらに、 硫酸化多糖から硫酸基を脱離さ せて生理活性を付与することも試みられている（特開 ¥1 1— 60590号) b 発明の開示 . . .
. [0003] しかしながら、 こうした天然由.来の成分については、 おおよそ一 般の抽出法で抽出した成分について同等の生理活性が認められる場合もあるが、 抽出方法によってその生理活性が大きく異なる場合がある。 したがって、 抽出 法による生理活性の変化の有無や変化の大きさを予測するのは極めて困難であ る。 また、 抽出後に低分子化したりあるいは硫酸基含有量を調節することより も、 抽出方法自体が重要となる。 一方、 近年、 血管障害、 血管内皮における障 害による種々の前疾患状態や疾患が問題となってきている。 なかでも、 動脈硬 化症など動脈における障害が問題となっている。
[0004] 本発明は、 優れた血管障害改善性を有する緑藻由来の硫酸化多糖 の製造方法、 硫酸化多糖、 血管障害改善剤、.薬剤組成物及び食品組成物を提供 することを目的とする。 [ 0 0 0 5 ] 本発明者らは、 緑藻植物のァォサ藻綱に属するヒ トェダサからラ ムナン硫酸を主成分とする硫酸化多糖の抽出方法を種々検討した結果、 高脂血 症予防活性 （コレステロール、 中性脂肪低下） や血小板凝集反応の抑制活性に '優れる硫酸化多糖を得られる抽出方法を見出した。 さらに本製法により低分子 化さ—れたラムナン硫酸を主成分とする抽出物に、 ヒ トの経口摂取による臨床試 験において有意にコレステロール低下作用を有していることを見いだし本発明 を完成するに至った。 すなわち、 本発明によれば、 以下の手段が提供される。
[ 0 0 0 6 ] 本発明の一つの形態によれば > ラムノースを構成単糖の主成分と する硫酸化多糖又はその塩の製造方法であって、 緑龕又はその細片を準備する 工程と、 前記緑藻又はその細片から酸性水性媒体中で加熱して硫酸化多糖又は その塩を抽出する抽出工程とを備える製造方法が提供される。
[ 0 0 0 7 ] この形態においては、 前記抽出工程は、 前記酸性水性媒体は有機 酸を含有することができる。 また、 前記抽出工程において、 前記酸性媒体にお ' ける酸濃度、 抽出温度及び抽出時間を調整することにより、 抽出'される前記硫 酸化多糖の硫酸基含量及びノ又はゲルろ過クロマトグラフィ一によるプノレラン 換算重量平均分子量を制御するようにすることもできる。 さらに、 この形態'に おいては、 血小板凝集抑制及ぴコレステロール低下活性を有する硫酸化多糖又 はその塩を製造するものとしても い。 '
. [ 0 0 0 8 ] また、 前記抽出工程において有機酸を用いる場合、 前記酸性媒体 における前記有機酸の添加量 0 : 3質量％以上 1質量。 /0以下とすることができ る。 '
[ 0 0 0 9 ] さらに、 前記抽出工程は前記水性媒体を 9 0 °C以上 1 3 0 °C以下 に加熱して行うことができる。 さらにまた、 前記抽出工程は、 ゲルろ過クロマ トグラフィ一によるプルラン換算重量平均分子量が 2 0 0万以下である硫酸化 多糖又はその塩を抽出する工程としてもよい。 この態様においては、 前記プル ラン換算重量平均分子量は 1 0 0万以下であってもよい。
[ 0 0 1 0 ] また、 'この形態においては、 前記硫酸化多糖又はその塩は、 以下 の特徴 （a ) 及び （b ) を備えることができる。 (a) 構成多糖におけるラムノース比率が 70質量％以上、 グルコース含量が 1質量％以上 30質量。/。以下、 キシロース含量が 1質量％以上 10質量％以下
(b) 硫酸基含量が 10質量。/。以上 40質量。/。以下
[001 1] 本発明の他の一つの形態によれば、 ラムノースを構成単糖のま 5 成分'とする硫酸化多糖又はその塩の製造方法であって、 緑藻又はその細片を準 備する工程と、 前記緑藻又はその細片を水性媒体中で加熱して硫酸化多糖又は その塩を抽出する抽出工程と、 抽出した前記硫酸化多糖をイオン交換により脱 、 カチオン化後、 所望の金属アルカリで中和する工程と、 を備える、 製造方法が 提供される。
10 [0012] この形態においては、 前記抽出工程は、 前記緑藻又はその細片を 酸性の水性媒体を用いて抽出する工程とすることができる。
[0013] これらの形態においては、 前記緑藻はヒトェグサ （Mo n o s t r oma n i t i d um) 又はヒロノヽノヒ ドエグサ ( (Mo n o s t r oma 1 a t i s s i mum) とすることができる。
15 [0014] 本発明の他の一つの形態によれば、 上記いずれかに記載の製造方 法により得られ、 ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖又ほその塩 が提供される。 '
[0015] 本発明の他の一つの形態によれば、 以下の特徴 （a) 〜 （c) ： . (a) ゲルろ過クロマトグラフィーによるプルラン換算重量平均分子量が 20 20 0万以下
(b) 構成多糖におけるラムノース比率が 70質量％以上、 グルコース含量が 1質量％以上30質量％以下、 キシロース含量が 1質量％以上 10質量％以下
(c) 硫酸基含量が 10質量。/。以上 40質量。/。以下
を有し、 血小板凝集反応の抑制活性を有する、 硫酸化多糖又はその塩が提供さ 25 れる。
[0016] この形態においては、 前記血小板凝集反応は、 ヒ ト血小板のリス トセチン惹起ヒ ト血小板凝集反応、 コラーゲン藜起血小板凝集反応及びトロン • ビン惹起血小板凝集反応から選択される 1種又は 2種以上であることが好まし い。 また、 この態様においては、 前記血小板凝集反応は、 リストセチン惹起ヒ ト血小板凝集反応であってもよい。 さらに、 この態様においては、 前記血小板 凝集反応は、 ヒ ト血小板のリストセチン惹起ヒ ト血小板凝集反応、 コラーゲン 惹起血小板凝集反応及びトロンビン惹起血小板凝集反応であってもよい。また、 前記硫酸化多糖は、 ナトリウム塩又はカリウム塩であってもよい 9 さらに、 前 記硫酸化多糖は、 ヒ トを含む動物における血中コレステロール低下作用を有す ることが好ましい態様である。
[ 0 0 1 7 ] 本発明の他の一^ 3の形態によれば、 上記いずれかに記載の硫酸化 多糖を含有する、 血管障害の予防又は改善用剤が提供される。
[ 0 0 1 8 ] 本発明の他の一つの形態によれば、 食品組成物であって、 上記い ずれかに記載の硫酸化多糖を含有する、 血管障害の予防文は改善用食品組成物 が提供される。 この形態において、 前記食品組成物は、 飲料又は飲料用であつ てもよく、 さらに、 茶葉又は飲用粉末と前記硫酸化多糖とを含有する飲料用と することができる。 ざらにまた、 高コレステロール血症のリスクのあるヒ トに ' 対して臨床上有効量のヒトェダサ由来のラムナン硫酸又はその塩を含有する、 高コレステロール血症の予防用であってもよい。 なお、 ここで高コレステロ一 ル血症のリスクがあるヒ トとは、 血中の総コレステロール量が 2 2 O m g / d 1以上又は L D L'コレステロール量が 1 4 O m g / d 1以上のヒ トである。
[ 0 0 1 9 ] 本発明の他の一つの形態によれば、 薬剤組成物であって、 上記い ずれかに記載の硫酸化多糖を含有する、 血管障害の改善を要する疾患の予防用 又は治療用の薬剤組成物が提供'される。 この形態においては、 血管障害の改善 を要する疾患にあるヒ トに对して臨床上有効量の前記硫酸化多糖を含有するこ とができる。 また、 高コレステロール血症のリスクのあるヒ トに対して臨床上 有効量のヒ トェダサ由来のラムナン硫酸多糖体を含有する高コレステロール血 症の予防用の経口投与製剤とすることができる。 さらに、 前記血管障害は高コ レステロール血症であり、 経口投与製剤とすることもできる。 また、 前記疾患 とは、 動脈硬化症、 血栓症、 糖尿病、 及び肺気道疾患から選択されるいずれか とすることもできる。 図面の簡単な説明 [0020] 図 1は、 惹起物質としてリストセチンを用いた場合の製造例 1〜 7の血小板凝集反応の抑制活性を示すグラフ図である。
[0021] 図 2は、 '惹起物質としてトロンビンを用いた場合の製造例 1〜7 の血小板凝集反応の抑制活性を示すグラフ図である。 .
[0022] 図 3は、 惹起物質としてコラーゲンを用いた場合の製造例 1〜7 の血小板凝集反応の抑制活性を示すグラフ図である。
[0023] 図 4は、 惹起物質としてリストセチンを用いた場合の製造例 8〜 10の血小板凝集反応の抑制活性を示すグラフ図である。
[0024] 図 5は、 惹起物質としてトロンビンを用いた場合の製造例 8〜1 0の血小钣凝集反応の抑制活性を示すグラフ図である。 '
[0025] 図 6は、 惹起物質としてコラーゲンを用いた場合の製造例 8〜1
0の血小板凝集反応の抑制活性を示すグラフ図である。
[0026] 図 7は、 ヒ ト摂取時における血中総コレステロール量の推移を示 すグラフ図である。 '
[0027] 図 8は、 ヒ ト摂取時における血中 LDL—コレステロール量の推 移を示すグラフ図である。 ， ' 発明を実施するための最良の形態，
[0028] 本発明の緑藻植物由来のラムノースを主たる構成単糖として有す る硫酸化多糖の製造方法は、 前己緑藻又はその細片を準備する工程と、 前記緑 藻又はその細片を酸性水性媒体中で加熱して硫酸化多糖又はその塩を抽出する 抽出工程と、 を備えている。 本発明の製造方法によれば、 硫酸化多糖の抽出を 酸性下で行うことにより、 血小板凝集反応の抑制活性に優れる硫酸化多糖を得 ることができる。 この硫酸化多糖によれば、 過度の又は亢進された血小板凝集 によって引き起こされる望ましくない血管、 特に血管内皮の障害状態を改善す る食品やこうした血管障害の改善を要する疾患や状態を予防又は治療する薬剤 に用いることがでぎる。 ..
[0029] また、 本発明の硫酸化多糖の製造方法によって製造される硫酸化 多糖は、 良好なコレステロール低下作用も有している。 このため、 本製造方法 によって得られる硫酸化多糖によれば、 血中これステロールを低下させ、 コレ ステロ ルによる血管内皮への障害を低減するとともに、 血小板凝集反応を抑 制できるため、 血管内皮の障害状態を効果的に予防し、 改善し、 血管内皮の健 全性を維持することができる。 .したがって、 本製造方法によって製造される硫 酸化多糖によれば、 血管障害、 特に血管内皮障害の予防、 改善に有効な食品や こうした傷害の予防又は治療に有効な薬剤として用いることができる。
[0030] なお、 本明細書において、 動物とは、 ヒ ト及び非ヒ ト動物を含ん でお 、 非ヒ ト動物としては、 ゥシ、 ブタ > ヒッジ、-ャギ、 ゥマなどの家畜、 ニヮトリ、 七面鳥等の家禽、 ィヌ、 ネコ等のペットが含まれる。
[0031] 以下、 本発明の硫酸化多糖の製造方法、 硫酸化多糖、 血管障害改 善剤、 食品組成物及び薬剤組成物について詳細に説明する。
[0032] (硫酸化多糖の製造方法）
緑藻又はその細片を酸性水性媒体を加 して硫酸化多糖を抽出する抽出工程 を有している。 本発明で用いる緑藻としては、 特に限定しないが、 こうした藻 ： 類としては、 ヒビミ ドロ目 Mo n o s t r o m a、 P r o t omo n o s t r o m aや、 /ォサ目 B l i n d i n g i a、 En t e r omo r p h a^ U 1 v a、 U 1 v a r'i aが挙げられる。 具体的には、 Mo n o s t r oma n i t i d um (ヒ 卜ェク、、サ) 、 Mo n o s t r o m a 1 a t i s s i m u m (ヒ ロハノヒ トェグサ） ， Mo n o s t r oma. S r a v i l l e i (ウスヒ トェ グサ) 、 Mo n o s t r oma a n g i c a v a (ェゾヒ トェクサ) 、 P r o t omo n o s t r oma u n d u 1 a t urn (シヮヒ トェグサ) 、 E n t e r omo r p h a p r o 1 ι f e r a スンァオノ リノ 、 En t e r omo r p h a i n t e s t i n a l i s (ボウァォノリ) 、 En t e r omo r p h a c omp r e s s a (ヒフ /オノリ) 、 En t e r omo r p h a 1 i n z a (ウスバァオノリ） 、 U l v a p e r t u s a (アナァォサ） 、 U 1 v a r i a f u s c a (クロヒ トェグサ) 、 B l i n d i n g i a m i n i ma) ヒメァォノリ） が挙げられる。 なかでも、 ヒ トェダサ、 ヒロハノヒ トェダサな どが好ましく用いられる。 なお、 ヒ トェダサとヒロハノヒ トェグサは類 して おり、 両者を区別することは必ずしも容易でない。 したがって、 ある藻類が両 者のいずれかであると明確に分類できる場合を除いて、 当該藻類をヒ トェダサ 又はヒロハノヒ トェダサとして取り扱うことができる。
[ 0 0 3 3 ] 緑藻は生の状態で用いることもできるが、 通常、 水分 1 0 %程度 以下に乾燥した状態で流通されている。 乾燥状態の緑藻は、 まず、 水に浸漬し て吸水させることが好ましい。 吸水方法は特に限定しないが、 緑藻が十分膨潤 する程度の量の水や温水に 3 0分〜 1時間程度浸漬させればよい。 吸水させた 後は、 表面の水を適宜水切りしておくことができる。 緑藻植物は適宜プレンダ 一やカッター等により細片としてもよい。
[ 0 0 3 4 ] 抽出工程は、 吸水した緑藻又はその細片に十分量の酸性水性媒体 中で加熱して行うことが好ましレ、。 酸性下で抽出を行うことにより、 リストセ チン、 コラーゲン及びトロンビンから選択される惹起物質による血小板凝集を 抑制する活性を有する硫酸ィヒ多糖を得ることができる。 なかでも、 コラーゲン 誘発性やリストセチン誘発性の血小板凝集抑制活性を有する硫酸化多糖を得る • ことができ、 さらには、 他の抽出方法に比して抗リストセチン誘発性血小板凝 集抑制活性の高い硫酸化多糖を得ることができる。 酸を添加しない抽出によれ ば、 その後硫酸化多糖の精製度を高めても高い抗リストセチン誘発性血小板凝 集活性を得られにくい。 また、 こうした抽出工程によれば、 同時にヒトにおけ るコレステロール低下作用を有する硫酸化多糖を得ることができる。
. [ 0 0 3 5 ] 本抽出工程は、 得られる硫酸化多糖の硫酸基の含量が 1 5 %以上 となるように、.より好ましくは' 2 0 %以上となるよう水性媒体の種類、 加熱温 度、 p H、 酸の種類、 濃度及び抽出時間を設定することが好ましい。
[ 0 0 3 6 ] 酸性水性媒体における水性媒体は、 水を主成分とすることが好ま しく、 より好ましくは媒体としては水のみを用いる。 なお、 水と相溶するエタ ノール等の有機溶媒との混液であつてもよい。
[ 0 0 3 7 ] 加熱温度は、 7 5 °C以上であればよいが、 好ましくは 9 0 °C以上 である。 また、 より好ましくは 9 5 °C以上、 より好ましくは沸騰させた状態で 行う。 また、 加熱温度は 1 3 0 °C以下であるこ .が好ましい。 1 3 0 °C以下で あると低分子化がコントロールされやすいからである。 より好ましくは 1 2 1 °C以下である。緑藻に対する酸性水性媒体の量は特に限定しないが、例えば、 乾燥状態 （水分 1 0 %以下程度） の緑藻植物 1重量部に対して、 1 0重量部以 上 3 0重量部以下とすることが好ましい。 より好ましくは、 1 8重量部以上 2 8重量部以下である。
[ 0 0 3 8 ] 酸性水性媒体の p Hは 3以上 5以下であることが好ましい。 酸の 強さが高いほど分解速度は高まるが、 P Hが 3未満では硫酸基の分解脱離が発 生しやすく、 p Hが 5を超えると低分子ィヒが緩慢になるからである。
[ 0 0 3 9 ] こうした酸性条件は、 無機酸及び/又は有機酸の水性媒体への添 加により形成される。 無機酸としては、 塩酸、 硫酸、 -硝酸等が挙げられ、 有機 酸としては、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 フマル酸、 シユウ酸、 ギ酸、 酢 酸、 乳酸、 ァスコルビン酸等が挙げられる。 硫酸基の脱離を抑制する観点から は、 好ましくは有機酸を用い、 なかでもクェン酸、 リンゴ酸、 フマル酸、 ァス コルビン酸を好ましく用いることができる。 これらの有機酸は、 抽出時間、 抽 出温度及び添加量をコントロールすることにより、 硫酸基の脱離を効果的に抑 制するとともに、 多糖を穩やかに分解し、'硫酸基含量の低下を抑制しながら目 的の低分子量の硫酸多糖が得られるからである。水性媒体に対する酸の濃度は、 0 . 3質量。 /0以上 1 0質量。 /0以下であることが好ましい。 より好ましぐは 0,. 5質量％以上5質量％以下でぁる。 酸は、 水性媒体の加熱に先だって添加して もよいし、 加熱開始後または温度が意図する抽出温度近傍になった時点で添加 してもよい。 .
[ 0 0 4 0 ] 抽出時間 1時間以上 2 0時間以下とすることができる。 抽出時間 は、 加熱温度と添加する酸やその濃度に応じて適宜設定することができる。 例 えば、 有機酸としてクェン酸を用いる場合には、 抽出時間は、 添加量が 0 . 7 質量％程度であり、 抽出温度が常圧での沸点 1 0 0その場合には、 好ましくは 4時間以上、 より好ましくは 5時間以上であり、 さらに好ましくは約 6時間で ある。 酸添加による抽出物の高分子の低分子化分解反応は、 3 0 0万以上 1 0 0 0万の分布範囲である分子量分布が、硫酸基分解脱離をともなわずに進行し、 6時間で 3 0 0万以上 1 0 0 0万以下の分布の分子量分布が無くなり数十万の 分子量分布が増加してくる。 クェン酸の添カ卩量を增加させるかあるいは抽出温 度を 1 0 o °c以上に上げれば抽出時間を短縮することができる。 [ 0 0 4 1 ] また、 有機酸など酸の種類 濃度、 抽出温度、 抽出時間をコント ロールすることにより硫酸基含量の低下を抑制しながらプルラン換算重量平均 分子量を 2 0 0万から 1万前後まで段階的に低分子化がさせることができる。 このためには、 抽出時における p Hは、 3以上 5以下であることが好ましい。 酸の'強さが高いほど又抽出温度が高いほど分解速度は高まるが、 P Hが 3以下 の強酸性下では硫酸基の分解脱離が発生しゃすい。 ただ硫酸基の分解脱離のし やすさは、添加する酸の種類により特性が大きく異なり、無機酸の塩酸の場合、 P H 5 . 2の弱酸性下であっても硫酸基の脱離が確認された。
[ 0 0 4 2 ] 次に、 抽出液を固液分離して液体画分を採取する固液分離工程を 実施する。 固液分離工程は、 自然沈降、 遠心分離、 ろ過、 フィルタープレス、. 凝集剤の添加等の従来公知の固液分離方法を用いて実施することができるが、 好ましくは、 ろ過助剤として珪藻土を用いてろ過又は遠心分離■ (好ましくは 5 O O O X g以上） する.ことが好ましい。 藻体は、 珪藻土と混合することにより ろ過又は遠心分離操作により分離されやすくなる。 固液分離は、 各種操作を 2 種以上組み合わせて行ってもよい。 なお、 こうして得られた液体画分には、 添 加した酸が含まれているため、酸を除考した方が好ましい場合は、限外ろ過膜、 イオン交換、 又は透析等により除去することができる。
[ 0 0 4 3 ]· こうして得られた液体画分は、 硫酸化多糖を含有しており、 この 液体画分を溶液状の硫酸化多糖として用いることができるが、 さらにこの液体 画分を乾燥して固形あるいは半固形の硫酸化多糖として得ることもできる。 乾 燥工程は、凍結乾燥、噴霧乾燥等従来公知の乾燥方法を採用することができる。 こうして、 粉末状等の硫酸化多糖を得る-ことができる。
[ 0 0 4 4 ] 本発明の製造方法によって得られる本発明の硫酸化多糖は、 ラム ノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖又はその塩を含有している。 本発 明における硫酸化多糖としては、 例えば、 構成糖の 3位又は 4位が硫酸エステ ル化されている硫酸化多糖が挙げられる。 硫酸化多糖は、 その硫酸基において 遊離の酸であってもよいし、 金属塩などの塩であ.つてもよい。 こうした塩とし ては、 例えば、 ナトリウム、 カリウム等のアルカリ金属塩、 カルシウム及ぴマ グネシゥムなどのアル力リ土類金属等が挙げられる。 [0045] 本発明における硫酸化多糖の単糖組成は、 ラムノースを主成分と しており'、 構成単糖の 50質量。 /0以上がラムノ一スである。 硫酸化多糖におけ るラムノースモル比率ほ、 好ましくは、 60質量。 /0以上であり、 さらに好まし くは 70質量。 /。以上である。 ラムノース比率との関係は必ずしも明らかではな く本発明を拘束するものではない。 なお、 硫酸ィヒ多糖における構成単糖の組成 については、 例えば、 酸加水分解法によ.り多糖を構成単糖まで分解後、 遊離酸 を分離除去し、 単糖成分を H P L Cで定量することにより得ることができる。 酸加水分解法は、 例えば、 以下のようにして行うこ.とができる。 糖類含有試料 を、 加水分解〈多糖試料 （約 20 m g ) を 2 N硫酸（10m l ) に溶解させ、 沸騰水浴中で 2時間加熱〉 後、 高速液体クロマトグラフィー （カラム： As a h i p a c k NH2P— 50 4E、 カラム温度： 35°C、 移動相：水/ァセ トニトリル = 25Z75、 流量： lm 1 i n、 検出器： R I ) により決定 することができる。 . .
[0046]また、 本発明の硫酸化多糖は、'ラムノース以外の構成単糖として、 グルコース及び 又はキシロースを含むことができる。 好ましくはグルコース を含有し、 さらにキシロースを含んでいる。 グルコースを含有する場合、 その 含量は 1質量。ん以上 30質量。 /0以下であることが好ましい。 また、 キシロース を含有する場合は、 その含量は 1質量％以上 10質量％以下であることが好ま しい。 なお、 これらの構成単糖についても、 'ラムノース含量と同 ¾にして算出 することができる。
[0047] 本発明の硫酸化多糖のゲルパーミエーシヨンクロマ グラフィー (GPC) によるプルラン換算重量平均分子量は、 血小板凝集活性及びノ又は コレステロール低下作用を有する限り特に限定しないが、 プルラン換算重量平 均分子量が 200万以下であることが好ましい。 また、 プルラン重量平均分子 量が 10万以上 1 20万以下のものを用いることが好ましい。 特に、 コレステ ロール低下作用については、 より好ましくは、 10万超 100万以下であり、 さらに好ましくは 30万超 100万以下である。， .
[0048] 本発明の硫酸化多糖における硫酸含有量は、 血小板凝集活性及び ノ又はコレステロール低下作用を有する限り特に限定しないが、 おおむね 15 質量％以上であることが好ましい。また、上限も特に限定しないが、 40質量％ 以下であることが好ましい。 より好ましくは 35質量。 /。以下である。 なお、 硫 酸基含有量は、 燃焼フラスコ法、 ロジソン酸法により求めることができる。 燃 焼フラスコ法は、 例えば、 分析化学、 1 5卷„、 689〜 691頁、 （1966 年） '、 1 7巻、 1322〜1324頁、 （ 1 968年） に記載の燃焼フラスコ 法を採用することができる。燃焼フラスコ法により試料中の硫黄元素を定量し、 得られた試料中の硫黄原子の含有量 （質量％) 〖こ 3を乗ずることにより硫酸基 含有量を算出することができる。 また、 ロジソン法は、 例えば、 An a .l y t i c a 1 B i o c h em、 41卷、 471〜 476頁、 （1 9.71年） に記載 の方法を採用することができる。
[0049] なお、 緑藻又はその細片からの硫酸化多糖の抽出工程は、 中性の 水性媒体を加熱して硫酸化多糖を抽出するようにしてもよレ、。 抽出工程におけ ,る水性媒体、抽出温度、抽出時間は上記と同様の範囲で実施することができる。 ' この場合には、 得られる硫酸化多糖をカチオン交換クロマトグラフィー等によ りカチオン交換して脱力チオンした上、 所望の金属アルカリ、-好ましくはナト リゥム及び/又は力リゥムのアル力リにより中和しだ硫酸化多糖の塩を用いる ことが好ましい。 'こうしたアルカリ金属塩は、 好ましい血小板凝集抑制活性を 発揮することができる。 ·
[0050] 本発明の硫酸化多糖又はその塩は、 ヒ トを含む動物における血小 板凝集抑制活性を有している。 '血小板凝集抑制活性を有していることにより、 それ自体血管傷害、血管内皮障害を改善し、予防することができる。なかでも、 本発明の硫酸化多糖は、 ヒ ト血小板のリ-ストセチン惹起血小板凝集反応の抑制 活性を有している。 リストセチンは、 血中の vWF (フォン ' ビレブランド因 子） や血小板に特異的に結合することが判った。 リストセチンは vWFに結合 して、 vWF の立体構造を変化させて活性化し、 この活性化 vWFが血小板に容 易に結合して血小板凝集を誘発することが判った。 したがって、 ヒ ト血小板の リストセチン誘発性血小板凝集は、 血液の乱流筒所、 具体的には、 血流の速い 動脈、 血管の分岐部位及び血管形態が複雑な部位における血小板凝集の主たる 凝集形態であると考えられている。 したがって、 リストセチン誘発性血小板凝 集反応を抑制することで、 動脈における血栓や動脈硬化を効學的に抑制するこ とができると考えられる。
[ 0 0 5 1 ] また、 本発明の硫酸化多糖は、 ヒ トを含む動物におけるコレステ ロール低下作用を有している。 コレステロール低下作用を有していることによ り、 それ自体血管傷害、 血管内皮障害を改善し、 予防することができる。
[ 0 0 5 2 ] 以上説明したように、 本発明の硫酸化多糖は、 優れた血小板凝集 反応の抑制活性を有している。 このため、 血管障害、 特に血管内皮障害を予防 し、 改善するのに有効であり、 このため、 血栓の形成を予防し、 またそうした 状態を改善することができる。 また、 本発明の硫酸化多糖は、 コレステロール 低下作用を有している。 このため、 コレステロールの蓄積による血管障害、 特 に、 血管内皮障害を予防し、 改善することができる。 また、 血小板凝集反応の 抑制活性とコレステロール低下作用とを有する本発明の硫酸化多糖は、 コレス テロールによる血管内皮障害を予防し、 改善し、 さらに血栓の形成を抑制する ' ため、 動脈硬化や血栓症を生じるような血管内皮障害を効果的に予防し、'改善 できる。 この結果、 こうした硫酸化多糖は.、 動脈硬化症や血栓症などを効果的 に予防することができる。
[ 0 0 5 3 ] 本発明の硫酸化多糖は、 粉末などの固体、 溶液、 懸濁液等の各種 の形態を取ることができる。 一般的には粉末等の固体状態で流通され、 提供さ れる。 本組成物には、 硫酸化多糖以外に硫酸化多糖の安定性等を高めるために 適宜添加剤を含んでいてもよい。 また、 硫酸化多糖以外に、 抽出原料由来のタ ンパク質等を含んでいる場合もある。
[ 0 0 5 4 ] (血管障害改善剤） - 本発明の血管障害改善剤は、 本発明の硫酸化多糖を有効成分として含有して いる。 以上のことから、 本発明の硫酸化多糖は、 研究用試薬としての血管障害 改善剤として用いることができるほか、 血管障害に関連する疾患の予防や治療 に用いる薬剤組成物やこうした疾患を有する若しくはリスクを有する個人や健 常人に摂取させる食品組成物に用いることができる。
[ 0 0 5 5 ] (薬剤組成物） 本発明の薬剤組成物 （以下、.本薬剤組成物という。 ） は、 本発明の硫酸化多 糖を含有しており、 血管障害に関連する疾患、 すなわち、 血管障害の改善を要 する疾患の予防用又は'治療用の薬剤組成物として使用できる。 本薬剤組成物に 'おいて、血管障害、特に、血管内皮障害の改善を要する疾患又は状態としては、 動脈硬化症、 血栓症、 糖尿病、 及び肺気道疾患などが挙げられる。 なお、 本薬 剤組成物が対象とする疾患又は状態はこれらに限定されるものではなレ、。
[ 0 0 5 6 ] なお、 本薬剤組成物における硫酸化多糖は、 硫酸エステル基にお ける遊離の酸であってもよいし、 医薬的に許容される塩であってもよい ώ こう し /"こ塩としては、 例えば、 ナトリウム、 カリウム等のアルカリ金属塩、 カルシ ゥム、 マグネシウムなどのアルカリ土類金属等が挙げられる。
[ 0 0 5 7 ] また、 本薬剤組成物は、 本組成物以外の上記疾患に有効な他の薬 剤を含有することができる。 例えば、 他の血小板凝集抑制剤、 コレステロール 低下剤などが挙げられる。 本薬剤組成物は、 また、 上記疾患の有効な他の薬剤 ' と併用して投与可能に組み合わせられた薬剤組成物セッドとして提供されても よレヽ。 -
[ 0 0 5 8 ] 本薬剤組成物は、 少なく ,とも本発明の血管障害改善剤を有効成分 として含むほか、 医薬上許容される公知の薬剤担体を含んで、 各種の製剤形態 を備えることができる。.こうした率剤担体は、 当該分野において周知であり、 本 m^u組成物に適用される可能性のある製剤形態に用いられる公知の薬剤担体 を適宜選択して用いればよい。 本薬剤組成物の製剤形態としては、 例えば、 粉 • 末、 散剤、 顆粒、 錠剤、 カプセル剤、 チユアブル剤等の固形剤、 溶液剤、 懸濁 剤、 乳剤等の液剤、 注射剤、 坐剤、 フイルム剤、 ゲル剤が挙げられる。 また、 こうした製剤形態に用いられる薬剤担体としては、例えば、グルコース、乳糖、 ショ糠、 澱粉、 マンニトール、 デキストリン、 脂肪酸グリセリ ド、 ポリエチレ ングルコール、 ヒ ドロキシエチレンデンプン、 エチレングリコール、 ポリオキ シエチレンソルビタン脂肪酸エステル、 アミノ酸、ゼラチン、 アルブミン、水、 生理食塩水等が挙げられる。 さらに、 必要に応じて、 安定化剤、 湿潤剤、 乳化 剤、 結合剤、 等張化剤等の添加剤を含んでいてもよい。 こうした本薬剤,祖成物 は、 各種製剤形態に応じた公知の常套手段により調製することが可能である。 [0059] 本薬剤組成物は、 経口、 舌下、 皮下又は静脈内注射、 経皮、 直腸 投与などの投与方法でき、 そのための必要な製剤形態が適宜選択される。 好ま しくは固形又は液体の経口剤として提供される。 また、 本薬剤組成物は、 バル ーン処置部位や血管の狭窄部位への局所適用剤としてもよい。本薬剤組成物は、 こう'した局所適用の製剤形態として、 特に、 フィルム剤、 ゲル剤などが挙げら れる。 また、 内視鏡、 カテーテル、 チュ.一ブ等を用いて経管的又は経皮的に本 薬剤組成物を送達することもできる。
[0060] さらに、 本薬剤組成物は、 バルーンゃステントなどの各種の体内 留置材料を含む血液接触面を有する医療用具などの形態で提供されてもよい。 また、 こうした血液接触面に対する表面処理剤として提供されてもよい。 この ような医療用具としては、 体内留置材料であるバルーン、 ステントが挙げられ る。 また、 他の医療用具としては、 カテーテル、 採血用注射器、 人工臓器、 輸 液パック、 輸液チューブが挙げられる。 表面処理の方法としては特に限定しな レ、で、硫酸化多糖の血小板凝集反応の抑制活性を損なわないものであればよレ、。
[0061] 本薬剤組成物の有効投与量は、 剤型、 投与方法、 対象者の年齢、 体重、 症状、 投与スケジュール等により、 適宜選択決定されるが、 例えば、 '経 口用の場合、 硫酸化多糖の投与量は、 成人で、 1日あたり lmg〜5000m g以下であることが好ましく、 より好ましくは 100mg〜200 Omgであ る。 これらは、 1 日に数回に分けて投与しても良い。 また、 経口摂取以外につ いて投与量は、.その製剤形態、 '投与方法、 使用目的及び当該医薬の投与対象で ある患者の年齢、 体重、 症状により異なり適宜選択決定されるが、 一般には、 前記有効成分の投与量で、 ヒ ト （例えば成人） 0. O O O lmg 体重〜 10 0 Omgノ体重、 好ましくは 0. 01 m g Z体重〜 100 m g 体重、 より好 ましくは、 0. 0 lmg/体重〜 3 Omg/体重である。 また、 局所適用する 場合には、 薬剤組成物における硫酸化多糖の含有量は、 例えば薬剤組成物 10 0重量％中、 通常 0. 001重量％〜100重量％、 好ましくは 0. 1重量％ 〜90重量％、 より好ましくは、 1. 0重量％〜800重量％である。
[0062] (予防又は治療方法） 本発明の予防又は治療方法は、 本薬剤組成物を血管障害の改善を要する疾患 若しくは状態を有する個体又は該疾患若しくは該状態対してリスクを有する個 体に対して投与する工程を備えている。 また、 投与形態としては、 これらの個 体に経口投与することもできるし、 こうした疾患部位又はこうした疾患の発生 についてのリスクを有する部位に対して局所投与することもできる。
[ 0 0 6 3 ] (食品組成物）
本発明の食品組成物は、 本発明の硫酸化多糖を含有しており、 血管障害の予 防若しくは改善用又は血管障害の改善を要する疾患の予防又は予後用の食品組 成物 （以下、 本食品組成物という。 ） として利用できる。 本食品組成物におい て、 血管障害の改善を要する疾患とは、 本薬剤組成物におけるものと同様であ る。 また、 本食品組成物に含まれる硫酸化多糖における硫酸エステル基におけ る遊離の酸であってもよいし、 例えば、 ナトリウム、 カリウム等のアルカリ金 属塩、 カルシウム、 マグネシウムなどのアルカリ土類金属等の塩とすることが できる。
[ 0 0 6 4 ] 本食品組成物は、 例えば、 本発明の硫酸化多糖を含有する加工食 品、菓子類、調味料、嗜好性食品、飲料等の一般的な食品とすることができる。 具体的形態としては、特に限定しないが、 クツキ一、.ビスケット-、キャンディ、 ガム、 ゼリー等の固形又は半固形嗜好食品類、 果汁、 茶、 コーヒー、 清涼飲料 等の嗜好飲料類、パン、麵類等の主食系の食品類、スープ、カレー、 シチュー、 各種ソースなどの副食系食品類、 各種の風味 ·調味料類とすることができる。 このほか、 栄養補助食品、 機能性食品、 特定保健用食品、 経管栄養剤等とする こともできる。 栄養補助食品等としては'、 上記した薬剤組成物の経口投与形態 と同様の製剤形態を採ることもできる。 特に、 本食品組成物は、 摂取の容易性 及び溶解性等から飲料又は飲料用であることが好ましい。 具体的には、 茶葉又 は飲用粉末と前記硫酸化多糖とを含有する飲料用とすることができる。
[ 0 0 6 5 ] 本食品組成物の有効な摂取量は、 対象者の年齢、 体重、 状況等に もよるが、 おおよそ硫酸化多糖の摂取量は、 1 あたり l m g以上〜 5 0 0 0 m g以下程度が好ましく、 より好ましくは 1 0 0 m g〜2 0 0 O mgである。 こ れらは、 1日に数回に分けて摂取してもよい。 [0066] 本食品組成物における硫酸化多糖の含有量は特に限定されるもの ではないが、 例えば、 乾燥重量換算で 0. 0 1質量％以上 20質量％以下程度 が好ましく、 より好ましくは、 0. 1質量％以上5質量％以下でぁる。
[006 7] (非ヒ ト動物用薬剤組成物等）
さらに、 本血管障害改善剤は、 非ヒ ト動物用の薬剤組成物や餌料組成物とし ても使用できる。 非ヒ ト動物としては、 家畜、 家禽、 ペット等が挙げられる。 非ヒ ト動物においても、本血管障害改善剤を投 4し又は摂取させることにより、 血管障害の改善を要する疾患の予防又は治療が可能であり、 健康の維持が可能 とな.る。 なお、 本血管障害改善剤を含有する種々の形態の非ヒ小動物用の薬剤 組成物や餌料組成物を製造することは当業者において容易である。 実施例
[0068] 以下に実施例を挙げて、 具体的に説明するが、 これに限定される ' ものではない。
[0069] (実施例 1 )
(ヒ トェダサからの硫酸化多糖の製造例 1〜1 0) - (製造例 1 )
三重県産養殖ヒ トェダサ約 500 g (水分約 7 %) を 1 2 1の水に 30分間 '浸漬させて膨潤させた後、 1 0分間水切りを行った。 この藻体に水を加えて 1 2. 5 k gとし、 沸騰させて 9 5 °C〜 1 00。Cで 6時間熱水抽出した。 この熱 水抽出液に水を加えて総量を 1 2. 5 k gとした上、 珪藻土 300 gを添加し 混合して遠心分離して上澄み液を得た。 この
上澄み液の全量を凍結乾燥して粉体 1 5 3 gを得た。
[00 70] (製造例 2)
三重県産養殖ヒ トェダサ約 500 g (水分約 7 %) を 1 2 1の水に 30分間 浸漬させて膨潤させた後、 1 0分間水切りを行った。 この藻体に水を加えて 1 2. 5 k gとし、 6' 5 °Cで 2時間加熱して温水抻出した。 この温水抽出液に水 を加えて総量を 1 2. 5 k gとした上、 珪藻土 300 gを添加し混合して遠心 ' 分離して上澄み液を得た。 この上澄み液の全量を凍結乾燥して粉体 96 gを得 た。 '
[0071] (製造例 3)
三重県産養殖ヒ トェダサ約 500 g (水分約 7 %) を 12 1の水に 30分閛 浸漬させて膨潤させた後、 10分間水切りを行った。 この藻体に水を加えて 1 2. 5 k gとし、 クェン酸 3. 6 gを加えて沸縢下 （95°C〜： 100°C) で 6 時間熱水抽出した。この熱水抽出液に水を加えて総量を 12.5 k gとした上、 珪藻土 300 gを添加し混合して遠心分離して上澄み液を得た。 この上澄み液 の全量を噴霧乾燥して粉体 215 gを得た。
[0072] (製造例 4)
製造例 1で得た粉体を蒸留水で 2 w/v 水溶液を調製した。' この水溶液を 2N の塩酸で平衡化後、 通水したカチオン交換樹脂カラム SK104 (三菱化学株 式会社製、 カラムサイズ直径 3 Omm長さ 50 Omm) に通液して得た脱力チ ' オン液 （pHl. 9〜2. 4) を N a OHで中和して凍結乾燥して、 粉体を得 た。
[0073] (製造例 5 ) ' '
. 製造例 1で得た粉体を蒸留水で 2 w/v%水溶液を調製した。 この水溶液を 2 N の塩酸で平衡化後、 通水したカチオン交換樹脂カラム SK104 (三菱化学株 . 式会社製、 カラムサイズ直径 3 Omm長さ 50 Omm) に通液して得た脱力チ オン液 （pHl. 9〜2. 4) を C a OHで中和して凍結乾燥して、 粉体を得 た。 '
[0074] (製造例 6 ) '
製造例 1で得た粉体を蒸留水で 2 w/v水溶液を調製した。 この水溶液を 2 N の塩酸で平衡化後、 通水したカチオン交換樹脂カラム SK104 (三菱化学株 式会社製、 カラムサイズ直径 3 Omm長さ 50 Omm) に通液して得た脱力チ オン液（pHl. 9〜2. 4) を KOHで中和して凍結乾燥して、粉体を得た。
[0075] (製造例 7 ) .
製造例 1で得た粉体を蒸留水で 2 w/v 水溶液を調製した。 この水溶液を和光 ダイァライシスメンブラン 27で透析して脱塩して凍結乾燥した。 この粉末を 次に、 DE 52充填カラム （ワットマン社製、 カラムサイズ径 30mm、 長さ 500 mm) に通液し分離精製した上、 さらに和光ダイァライシスメンブラン 27で透析して脱塩したものを凍結乾燥して、 粉体を得た。
[0076] (製造例 8)
三重県産養殖ヒ トェダサ 240 gを 6 1の水に加え 30分間浸漬後、 洗浄水 を分離し再度水を加え全量 6.24 k gとした。このものを液温 60°C〜65°C に維持しながら 2時間温水抽出を行った。 遠心分離により温水抽出液 3. 79 k gと固形分 （以下、 回収ヒ トェダサという。 ） 1·. 23 k gを得た。 この回 収ヒ トェダサ 300 gに、 水 3 1 とクェン酸 10 Omgを加えて、 95°C〜1 00 °Cで 6時間適時加水しながら熱水抽出した。 この熱水抽出液をろ過し、 ろ 液の全量を凍結乾燥して粉体 （ 3 g ) を得た。 この粉体を 0. 1 mMトリス緩 衝液 （pH8. 7) 2.0 Om lに溶解し、 タンパク貧分解酵素 （科研製薬株式 会社製ァクチナゼー E) 約 0. 14 gを加えて 50°Cで 1 5時間インキュベー ト後、 DE 52充填カラム（7M尿素 0. 15M KC 1で平衡化）に注入して、 71^尿素.0. 15MKC 1 3 1以上通液後、 K C 1濃度を 0. 15M〜2Mま で約 1 1時間かけてグラジェント通液し、 フラクションコレクタ一にて各溶出 画分を回収した。 各種の画分について、 試料 1について行った GPCと同様の 条件にて G.PCを行い、 保持時間 （RT) が約 14. 5分となるピークを、 主 ピークとして有するフラクションを回収フラクションとしてまとめ、 この全量 を、 透析チューブ用いて 4〜 5 '日透析し、 濃縮液をフリーズドライして粉体を 得た。 こうして得られた粉末について、 G PCを行ったところ、 プノレラン換算 重量平均分子量は 189万であった。 ·
[0077] (製造例 9)
製造例 8の製造時に得られたヒ トェダサ温水抽出液 550 gを凍結乾燥によ り粉体 3 gを得た。 この粉体 3 gを 0. ImMトリス緩衝液 （pH8. 7) 2 00m lに溶解し、タンパク質分解酵素（科研製薬株式会社製ァクチナゼー E) 約 0. 14 gを加えて 50°Cで 1 5時間インキュベート後、 DE 52充填カラ ム （7M尿素 0. 15MKC 1で平衡化） に注入して、 71^1尿素0. 15MK C 1 3 1以上通液後、 KC 1濃度を 0. 15M~ 2Mまで約 1 1時間かけてグ ラジェント通液し、 フラクションコレクタ一にて各溶出画分を回収した。 各種 の画分について、試料 1についての G PC条件にて保持時間（RT)が約 15. 5分となるピークを、 主ピークとして有するフラクションを回収フラクション としてまとめ、 この全量を、 透析チューブを用いて 5日間透析し、 濃縮液をフ リ一.ズドライして粉体 （試料 7 ) を得た。 こうして得られた製造例 9の試料に ついて G P Cを行ったところ、プルラン換算重量平均分子量は 62万であった。
[0078] (製造例 10 )
三重県産養殖ヒ トェダサ 750 g (水分約 7 %) を 18 1の水に 30分間浸 漬 せて膨潤させた後、 10分間水切りを行った。 この藻体に水 18 1を加え て沸騰させてクェン酸 5. 4 gを添加し、 95°C〜100°Cで 6時間熱水抽出 した。 この熱水抽出液に水を加えて総量を 18. 8 k gとした上、 珪藻土 54 0 gを添カ卩し混合して遠心分離して上澄み液 （15. 9 k g) を得た。 この上 澄み液 1. 5 1にさら.に珪藻土 5 gを添加して減圧ろ過処理を行った。 この操 作を繰り返して上澄み液の全量を減圧ろ過し、 得られたろ液の総量に水を加え て 16 k gとした。 このろ液を次に、 限外ろ過膜 （分画分子量 1万） でろ過し た。 限外ろ過処理は、 膜透過液が 50%の時点で終了させる。 この濃縮液に対 して減量分 （透過液量分） を補充して全量で 16 k gとした。 この処理を合計 3回繰り返した。 最終的に得られた 16 k gの濃縮液をスプレードライして粉 体を得た。 この粉体 3 gを 0. lmMトリス緩衝液 （pH8. マ） 200ml に溶解し、 タンパク質分解酵素 （科研製薬株式会社製ァクチナーゼ E) 約 0. 14 gを加えて 50°Cで 15時間インキュベート後、 DE 52充填カラム （7 M尿素 0. 1 5M KC 1で平衡化） に注入して、 7M尿素0. 15MKC 1 3 1以上通液後、 K C 1濃度を 0. 15 M〜 2 Mまで約 1 1時間かけてグラジェ ント通液し、 フラクションコレクタ一にて各溶出画分を回収した。 各種の画分 について、 試料 1についての GP C条件にて保持時間 （RT) が約 17分とな るピークを、 主ピークとして有するフラクションを回収フラクションとしてま とめ、 この全量を、 透析チューブを用いて 5日間透析し、 濃縮液をフリーズド ライして粉体を得た。 こうして得られた製造例 10の試料について、 GPCを 行ったところ、 プルラン換算重量平均分子量は 21万であった。 [00 79] なお、 以上の実施例のうち、 製造例 3、 4、 6、. 1 0が本発明の 実施例に相当している。
[0080] (実施例 2 )
'次に、 惹起物質としてリストセチン、 トロンビン及びコラーゲンを用いて血小 板凝集反応を行って、 製造例 1〜 1 0で得られた硫酸化多糖の抑制活性を評価 した。 なお、 血小板凝集反応は以下のようにして行った。 結果を図 1〜6に示 す。
[008 1] 評価は、 サンプルに対して、 攪拌しながら惹起物質を添カ卩した後 に、 WBANeo全血血小板凝集能測定装置 （細口吸引圧検知方式） の 30/xmX 30 mの角型開口の二ッケル製マイクロメッシュフィルターメッシュを通して吸 引し、 その血液吸引量の時間経過を自動的に記録した。 なお、 詳細な条件は以 下の通りであった。 .
[0082] 測定方法：フィルターチップによる 4濃度連続吸引測定
センサー：半導体蒸着型デジタルセンサー '
解析方法：容量反応曲線 ED50を応用レた評価法
サンプル：全血 （クェン酸ナトリゥム加血液） ―
サンプル量：、200μ1 X 4濃度
攪拌速度： 800 rpra 5 %
. [0083] 図 1に示すように、 リストセチン惹起血小板凝集反応では、 製造 · 例 3が安定して高い抑制活性を示した。 製造例 3を除く製造例のものでは、 コ ントロールよりも凝集反応も促進するものがあつたが、 製造例 4及 6におい ては、 高濃度試料 （2. 5mg/m 1 ) でリストセチン惹起血小板凝集反応を 抑制する傾向が見られた。
[00 84] 図 2に示すように、 トロンビン惹起血小板凝集反応では、 製造例 4が安定して高い抑制活性を示し、製造例 3及び 6も良好な抑制活性を示した。 他の製造例にあっては、 凝集反応を促進する傾向が見られた。
[0085] 図 3に示すように、 コラーゲン惹 血小板凝集反応では、 製造例 3及び 6が安定して高い抑制活性を示し、 次いで製造例 4が良好であった。 他 の製造例にあっては、 製造例 2においてやや抑制活性が認められたもののその 他の製造例では凝集反応を促進する傾向が見られた。
[ 0 0 8 6 ] 以上のことから、 硫酸化多糖は、 その製造方法の相違により血小 板凝集反応に対する反応性が大きく異なること、 製造例 3の硫酸化多糖は、 也 5 の製造例で得られる硫酸多糖においてリストセチン惹起血小板凝集反応につい て高レ、抑制活性を有し τいるともに、 ト.ロンビン惹起及びコラーゲン惹起血小 板凝集の抑制活性についても良好であることがわかった。 また、 イオン交換に ， よりカリゥム塩又はナトリゥム塩に置換したものも血小板凝集の抑制活性が良 好であることがわかった。
0 [ 0 0 8 7 ]また、 図 4に示すように、 リストセチン惹起血小板凝集反応では、 製造例 1 0が製造例 8， 9に比較して安定して高い抑制活性を示した。 また、 図 5に示すように、 ト ンビン惹起血小板凝集活性反応では、 製 例 9、 1 0 が製造例 8に比較して高い抑制活性を示したが、 製造例 1 0が最も良好であつ ' た。 'さらに、 図 6に示 "ように、 コラーゲン惹起血小板凝集活性反応では、 製 15 造例 9、 .1 0が製造例 8に比較して高い抑制活性を示したが、 製造例 1 0が最 も良好であった。 以上のことから、 プルラン換算重量平均分子量が 2 0 0万を 超えると良好な血小板凝集の抑制活性を有しているとはいえないが、 当該分子 量が 1 0 0万以下、 より好ましくは、 6 0万以下程度で良好な血小板凝集の抑 .制活性を有していることがわかった。 また、 少なくとも当該分芋量が 2 0万以 20 上であることが血小板凝集抑制活性に適切であることがわかった。
[ 0 0 8 8 ] (実施例 4 )
(ヒ トェダサからの硫酸化多糖の製造例 1 1 )
三重県産養殖ヒ トェダサ 7 5 0 g (水分約 7 %) を 1 8 1の水に 3 0分間浸 潰させて膨潤させた後、 1 0分間水切りを行った。この藻体に水 1 8 1を加え、 25 クェン酸 5 . 4 gを加えて沸騰下（ 9 5 °C〜 1 0 0 °C)で 6時間熱水抽出した。
この熱水抽出液に水を加えて総量を 1 8 . 8 k gとした上、 珪藻土 5 4 0 gを 添加し混合して遠心分離して上澄み液を得た。 この上澄み液 （1 5 . 9 k g ) から 1 . 5 1を分取し、 珪藻土 5 gを添加し、 減圧ろ過処理を行う。 この操作 を繰り返して全量処理して、 得られたろ液全量に水を加えて 1 6 k gに調整し た。 得られたろ液について限外ろ過 （分画分子量 10000). を行い、 透過液 が 50%となった時点で終了させる。 濃縮液に減量分に相当する水を新たに加 え全量を 16 k gとし、 この液を噴霧乾燥して粉体 270 gを得た。
[0089] (実施例 5 ) , 実施例 4で得られた硫酸化多糖 （製造例 1 1) について、 ヒトに経口投与し て一定期間毎に採血して血中脂質等について検査した。 なお、 試験条件は以下 のとおりとした。 結果を表 1に示し、 総コレステロール量及び LDLコレステ ロール量の推移について図 4及ぴ図 5にそれぞれ示す。
[0090] 被験者：肝障害及び腎障害の疑いがなく、 脂質系の影響のある薬 物及びサプリメントを服用していない男性であり、 年齢が 37. 1 ± 10. 1 歳 （21〜54歳） であり、 血中総コレステロール値が摂食開始時において 2 30±23. 8mg/.d 1であった。
摂取条件： 6週間にわたり一日一回食後に製造例 8による硫酸化多糖一包（ 1. 5 g) を摂取させた。
採血条件'：摂取開始日、 摂取 2週後、 同 4週後、 同 6週後及び 4週休食後に採 血し 7こ。 :.
[0091]
[表 1]
Figure imgf000024_0001
[0092] 表 1、 図 7及び図 8に示すように、 総コレステロール及び LDL 一コレステロールは、 被験食摂取後 4週間後および 6週間後に有意に減少した (図中の P値は摂食開始前との paired t検定による。 ） 。 この減少は摂取終 了後 4週休食後には元に復したことから、 被験食の作用であると判断された。
[0093] (実施例 6 )
本実施例では、 三重県産養殖ヒ トェダサについて、 表 2に示す 8種類の酸 （有 機酸及び無機酸） を用い、 表 2に示す添加量 （濃度） 、 抽出温度、 抽出時間等 の条件で抽出を行い、 得られた硫酸化多糖について G PCを行い、 硫酸基含量 を測定した。 詳細な操作及び G PC条件を以下に示す。 また、 硫酸基含量は以 下の方法で測定した。 [0094] 三重県産養殖ヒ トェグサ 400 g (水分約 7 %) .を 10 1の水に 30分間浸漬させて膨潤させた後、 10分間水切りを行った。 この藻体に水 1 0 1を加えて沸騰させて表 2に示す酸の表示される量を添加し、 表 2に記載の +温度及び時間で抽出を行った。 この熱水抽出液に水を加えて総量を 10 k gに 調整後、 その 2. 5 k gを珪藻土ろ過により固.液分離した。 得られた清澄液 3 00 gを透析チューブにて脱塩精製後、 凍結乾燥を行った。 また、 GPCは、 以下の条件で行った。 結果を併せて表 2に示す。
HPLC条件： - カラム： S h o d e x OH P a k SB— 806M HQ2本
溶離液： 0. 1 M N a C 1
カラム温度： 40°C
検出器： R I .
流速： 1m l /分 .
[0095] ·硫酸基含有量の測定方法
(燃焼フラスコ法）
硫黄原子の元素分析を、 分析化学、 15巻、 689~691頁、 （1 966 年） 、 1 7卷、 1' 322〜1324頁、 （ 1 968年） に記載の燃焼フラスコ 法により行い、 得られた試料中の硫黄原子の含有量 （重量％) に ·3を乗ずるこ .とにより硫酸基含有量を算出した。
[0096]
[表 2]
Figure imgf000026_0001
[0097] 表 2に示すように、 酸の種類、 濃度、 抽出温度及び抽出時間により、 得られ る硫酸化多糖のプルラン換算重量平均分子量及び硫酸基含量を調整できること がわかった。 また、 クェン酸、 リンゴ酸、 フマル酸及びァスコルビン酸を用い ることにより、 プルラン換算重量平均分子量を制御しやすいとともに、 硫酸基 含量'を維持しやすいことがわかった。
[0098] (実施例 7 )
製造例 1及び製造例 1 1で得た硫酸化多糖を、 高脂肪食を摂取させたラット に対してそれぞれ投与して各種の血中脂肪パラメータ （総コレステロール、 ト リグリセリ ド、 HDLコレステロール、 · LDLコレステロールを測定した。 な お、 試験条件は以下のとおりとした。 結果を表 3に示す。
試験動物： 6週令 Sprague- Dawley系 S Fラット （Crj :C (SD) I GS、 1 群あたり雄 6匹；） . ' 高脂肪食：粉末基礎資料 C R F— 1にコレステロール 1質量％、 コール酸 0 · 20質量0 /。、 ォリーブオイル 2. 5質量0 /。を添加したもの。
摂取条件'： ラットに 28日間自由に高脂肪食を摂取させるとともに、 製造例 1 1の硫酸化多糖を 2. 5 g/k g, 1, 0 g/k g, 0. SgZkgを 1日 1 回強制的に経口投与した。 '
採血条件：採血は、 投与開始 2日前、 13日後、 27日後 （なお、 投与開始日 を投与 0日とし、 投与開始翌日を投与開始一日後とする。 ） に頸静脈から注射 筒で採取することにより行い、血清を分離後（3000 r pm、 1600X g、 10分間） に測定を行った。
その他：投与前及び投与期間中 1日 1回一般状態を観察した。 また、 投与開始 日、 投与開始 4、 7、 1 1、 14、 18、 21、 25及び 28日後に体重を測 定した。 さらに、 PT、 ΑΡΤΤについて投与開始 1日前、 投与開始 14、 1 8日後に採血し、 測定した。 なお、 硫酸化多糖を投与しない以外は同様の条件 で飼育したラットを対照例とした。
[0099] ,
ほ 3]
Figure imgf000028_0001
* Pく 0.05(13曰以 からの parid t- testに ί ナ 意 )
[0100] 表 3に示すように、 製造例 1 1の硫酸化多糖においては、 投与 1 3日後かち 27日後にかけて、 総コレステロール量及び LDLコレステロール 量の有意な減少が認められた。 また、 製造例 1 1には体重の増加抑制効果が認 められた。 なお、 血液学的検査値や血液化学検査値に異常は認められないこと, から、' 毒性作用によるものではないと考えられた。 一方、 製造例 1の硫酸化多 糖においては、 総コレステロール量、 LDLコレステロール量について、 製造 例 1 1のような効果は認められなかった。
[0101] (実施例 8 ) - 製 例 8〜1 1について硫酸含有量と構成単糖の成分比率を測定した。 なお、 それぞれ以下の方法により測定した。 結果を表 4に示す。
[0102] (1) 硫酸基含有量の測定方法
(燃焼フラスコ法） .
硫黄原子の元素分析を、 分析化学、 15卷、 689〜 691頁、 （1966 年） 、 17巻、 1322〜： 1324頁、 （1968年） に記載の燃焼フラス.コ 法により行い、 得られた試料中の硫黄原子の含有量 （重量％) —に 3を乗ずるこ とにより硫酸基含有量を算出した。 （2) 構成単糖の測定方法 試料を酸加水 分解 〈試料 （約 20mg) を 2N硫酸 （10ml ) に溶解させ、 沸騰水浴中で 2時間加熱〉後、高速液体ク口マトグラフィー（カラム： A s a h i p a c k N ■ H 2' P - 50 4 E、 カラム温度： 35 °C、 移動相：水/ァセトニトリノレ = 25 /75、 流量： lm 1 i n、 検出器： R I) にて各種単糖を同定し定量し
,た。
[0103] - 4]
Figure imgf000030_0001
N.T.:
N.D.:検出せず
[0104] 表 4に示すように、 試料 8〜1 1は、 いずれもラムノースを構成 単糖の主成分としており、 その質量比率は、 68質量％から 93質量％にわた つており、 第 2の主成分であるグルコースの質量比率との和では、 92質量％ から 97質量。 /。にわたり、さらにキシロースの質量比率を加えると、 97質量％ 〜1·00質量％であった。 また、 硫酸基含量は、 18〜23質量。 /0の範囲であ つた。

Claims

請求の範囲
1 . ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖又はその塩の製造方法で あって、
緑藻又はその細片を準備する工程と、 .
前記緑藻又はその細片から酸性水性媒体中で加熱して硫酸化多糖又はその塩 を抽出する抽出工程と、 .
を備える製造方法。
2 . 前記抽出工程は、 前記酸性水性媒体は有機酸を含有する、 請求の範囲 1 に記載の製造方法。
3 . 前記抽出工程において、 前記酸性媒体における酸濃度、 抽出温度及び抽 出時間を調整することにより、 抽出される前記硫酸化多糖の硫酸基含量及び/ 又はゲルろ過クロマトグラフィーによるプルラン換算重量平均分子量を制御す る、 請求の範囲 1又は 2に記載の製造方法。.
4 . 血小板凝集抑制及びコレステロール低下活性を有する硫酸化多糖又はそ , の塩を製造する、 '請求の範囲 1〜 3のいずれかに記載の製造方法。
5 . 前記酸性媒体における前記有機酸の添加量 0 . 3質量％以上 1質量％以 下である、 請求の範囲 2〜4のいずれかに記載の製造方法。
6 . 前記抽出工程は前記水性媒体を 9 0 °C以上 1 3 0 °C以下に加熱して行う、 請求の範囲 1〜 5のいずれかに記載の製造方法。
7 . 前記抽出工程は、 ゲルろ過クロマ小グラフィ一によるプルラン換算重量 平均分子量が 2 0 0万以下である硫酸化多糖又はその塩を抽出する工程である、 請求の範囲 1〜 6のいずれかに記載の製造方法。
8 . 前記プルラン換算重量平均分子量は 1 0 0万以下である、 請求の範囲 7 に記載の製造方法。
9 . 前記硫酸化多糖又はその塩は、 以下の特徴 （a ) 及び （b ) を備える、 請求の範囲 1〜 8のいずれかに記載の製造方法。 (a) 構成多糖におけるラムノ.ース比率が 70質量。/。以上、 グルコース含量が 1質量％以上 30質量％以下、 キシロース含量が 1質量。/。以上 10質量％以下
( b ) 硫酸基含量が 10質量％以上 40質量％以下
10. ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖又はその塩の製造方 法であって、
緑藻又はその細片を準備する工程と、 .
前記緑藻又はその細片を水性媒体中で加熱して硫酸化多糖又はその塩を抽出 する抽出工程と、
抽出した前記硫酸化多糖をイオン交換により脱力チオン化後、 所望の金属ァ ル力リで中和する工程と、
を備える、 製造方法。
1 1. 前記抽出工程は、 前記緑藻又はその細片を酸性の水性媒体を用いて抽 出する工程である、 請求の範囲 10に記載の製造方法。
1 2. 前記緑藻はヒ トェグサ （M o n o s t r o m a n i t i d u m) 又は ヒロノヽノヒトェグサ ((Mo n o s t r oma l a t i s s imum)である、 請求の範囲 1〜 1 1のいずれかに記載の製造方法。 · '
1 3. 請求の範囲 1〜12いずれかに記載の製造方法により得られ、 ラムノ ースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖又はその塩。
14, 以下の特徴 （a) 〜 （c) ：
(a) ゲルろ過クロマトグラフィーによる重量平均分子量が 200万以下
(b) 構成多糖におけるラムノース比率が 70質量％以上、 グルコース含量が 1質量。 /。以上 30質量％以下、 キシロース含量が 1質量。 /。以上 10質量％以下
( c ) 硫酸基含量が 10質量。/。以上 40質量。/。以下
を有し、 血小板凝集反応の抑制活性を有する、 硫酸化多糖又はその塩。
15. 前記血小板凝集反応は、 ヒ ト血小板のリストセチン惹起ヒ ト血小板凝 集反応、 コラーゲン惹起血小板凝集反応及びトロンビン惹起血小板凝集反応か ら選択される 1種又は 2種以上である、 請求の範.囲 13又は 14に記載の硫酸 化多糖又はその塩。
1 6 . 前記血小板凝集反応は、 リストセチン惹起ヒ ト血小板凝集反応である、 請求の範囲 1 5に記載の硫酸化多糖又はその塩。
1 7 . 前記血小板凝集反応は、 ヒ ト血小板のリストセチン惹起ヒ ト血小板凝 '集反応、 コラーゲン惹起血小板凝集反応及びトロンビン惹起血小板凝集反応で ある'、 請求の範囲 1 5に記載の硫酸化多糖又はその塩。
1 8 . ナトリゥム塩又は力リゥム塩である、 請求の範囲 1 3〜1 7のいずれ かに記載の硫酸化多糖又はその塩。
1 9 . ヒトを含む動物における血中コレステロール低下作用を有する、. 請求 の範囲 1 3〜 1 8のいずれかに記載の硫酸化多糖又はその塩。 '
2 0 . 請求の範囲 1 3〜 1 9のいずれかに記載の硫酸化多糖を含有する、 血 管障害の予防又は改善用剤。
2 1 . 食品組成物であって、 ' 請求の範囲 1 3〜 1 .9のいずれかに記載の硫酸化多糖を含有する、 血管障害 の予防又は改善用食品組成物。 '
2 2 . 前記食品組成物は、 飲料又は飲料用である、 請求の範囲 2 1に記載の 組成物。 . '
2 3 . 茶葉又は飲用粉末と前記硫酸化多糖とを含有する飲料用である、 請求 の範囲 2 2に記載の組成物。
, 2 4： 高コレステロール血症のリスクのあるヒ トに対して臨床上有効量のヒ トェダサ由来のラムナン硫酸又はその塩を含有する、 高コレステロール血症の 予防用である、 請求の範囲 2 1〜 2 3のいずれかに記載の組成物。 '
2 5 . 薬剤組成物であって、 - 請求の範囲 1 3〜1 9のいずれかに記載の硫酸化多糖を含有する、 血管障害 の改善を要する疾患又は状態の予防用又は治療用の薬剤組成物。
2 6 . 血管障害の改善を要する疾患又は状態にあるヒ トに対して臨床上有効 量の前記硫酸化多糖を含有する、 請求の範囲 2 5に記載の薬剤組成物。
2 7 . 高コレステロール血症のリスクのある ΐ ,卜に対して臨床上有効量のヒ トェダサ由来のラムナン硫酸多糖体を含有する高コレステロール血症の予防用 の経口投与製剤である、 請求の範囲 2 5又は 2 6に記載の薬剤組成物。
2 8 . 前記血管障害は高コレステロール血症であり、 経口投与製剤である、 請求の範囲 2 5又は 2 6に記載の薬剤組成物。
2 9 . 前記疾患又は状態は、 動脈硬化症、 血栓症、 糖尿病、 及び肺気道疾患 から選択される、 請求の範囲 2 5又は 2 6に記載の薬剤組成物。
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