JP7084968B2 - 脂肪及び糖分の吸収抑制剤、インスリン抵抗性指数降下剤、アディポネクチン分泌促進剤、肝臓中性脂肪(tg)濃度降下剤、胆汁酸吸着剤、これらの剤の製造方法、並びにこれらの剤を有する飲料物 - Google Patents
脂肪及び糖分の吸収抑制剤、インスリン抵抗性指数降下剤、アディポネクチン分泌促進剤、肝臓中性脂肪(tg)濃度降下剤、胆汁酸吸着剤、これらの剤の製造方法、並びにこれらの剤を有する飲料物 Download PDFInfo
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Description
週間飼育した。
更に、反応時間を1時間以上とした場合には、分子量が10,000未満のものをほぼ確保することができる利点がある。そして、反応時間を3時間以下とすることにより、分子量が1,000未満となるものの割合を抑えることができ、収量の低減を抑制することができるからである。
そして、反応時間を約2時間とすることにより、分子量が1,000近辺のものを十分に確保し、かつ収量の向上を図ることができる。
(1)加水分解の対象:トビコ:15g
(2)加水分解の条件:
(i)触媒:塩化鉄(III)(FeCl3)
濃度:10mMの塩化鉄(III)水溶液500mL
(ii)加水分解温度及び時間:
(a)115℃で2時間
(b)145℃で2時間
(c)160℃で2時間
(3)実験装置及び試薬類:
(i)実験装置:
(a)反応装置:耐圧硝子株式会社 TEM-D型
(b)遠心分離器:株式会社コクサン H-105FN
(c)凍結乾燥機:東京理化器械株式会社 FDU-1100
(d)恒温槽:株式会社生田産業 A0602
(e)pH測定器:東亜ディーケーケー株式会社 HM-30G
(f)電子天秤:株式会社島津製作所 AEX-2008
(g)透析膜(精製用):フナコシ株式会社 FED-132105
FED-132105:スペクトラ/ポア 7,MWCO 1,000,
φ29mm×45mm×5m
(ii)試薬類:
(a)クロロホルム:和光純薬工業株式会社 和光一級
(b)エタノール:純正化学株式会社 純正一級
(c)炭酸ナトリウム:純正化学株式会社 試薬特級
(d)塩化鉄(III)(無水):和光純薬工業株式会社 和光一級
(SP1)まず、実験に使用するトビコを乾燥処理する。即ち、トビコをあらかじめ恒温槽(60℃/0.1MPa)に放置し、トビコの水分を完全に除去する。水分量の同定は以下に示す要領で行う。恒温槽内に収容したトビコ約100gについて、重量を一定の時間間隔で測定し、時間の経過に伴う重量の変化をグラフ化し、当該重量が0.1g単位で一定になった時点でトビコの含水率がほぼ0重量%(恒量)と判断する方法をとった。
(SP3)加水分解後、低分子化した低分子コンニャク粉を凍結乾燥機で乾燥する。
(SP4)乾燥後の低分子コンニャク粉を純水に投入し、透析により塩化鉄(III)を除去する。透析は、分子量が1,000未満の物質を通す分画分子量1,000の透析膜による容器の内側に低分子コンニャク粉の含有水を挿入し、その透析膜の容器の外側にバッファーとしての純水を満たして行った。バッファー水は2回交換することで、低分子コンニャク粉から塩化鉄(III)を完全に除去した。この結果、透析膜による容器の内側には、分子量が1,000以上の低分子コンニャク粉が残ることになる。
(SP5)水を含む低分子コンニャク粉を乾燥させることにより、塩化鉄(III)が除去された乾燥した低分子コンニャク粉を得る。この透析膜による低分子コンニャク粉の精製は、同一工程を3回繰り返し、分子量1,000未満の成分を完全に除去した。
(SP1)まず、2gのコール酸ナトリウムを純水200mLに溶解する。
(SP2)そして、コール酸ナトリウムの溶解水を分画分子量1,000の透析膜による容器の内側に挿入し、かつその透析膜の容器の外側にバッファーとしての純水を満たすことで行う。透析開始から2時間後及び4時間後にバッファー水を交換し、その2時間後、4時間後及び24時間後のそれぞれのバッファー水を回収する。
(SP3)2時間、4時間、24時間をそれぞれ経過した後のバッファー水を蒸発させて乾燥させることにより、分子量が1,000未満の乾燥したコール酸ナトリウムを得る。なお、コール酸ナトリウムの分子量は、430.55である。
(SP3)その溶解水については、振とう器付き恒温槽で温度37.0℃を保ちながら、振とう速度80RPMで2時間振とうする。この場合、ビーカー側を旋回することにより、溶解水を振とうする。
1を考慮すると、この反応時間としては0.5~10時間(好ましくは1~3時間)としてもよい。この場合、反応時間を0.5時間以上としたのは、0.5時間未満にすると分子量が1,000に近い分布とならず、例えば分子量が10,000超える分布のものが含まれるおそれが生じてくるからである。一方、反応時間を10時間以下としたのは、10時間を超えると分子量が1,000未満のものが相当多くなり、収量が低下してしまうからである。
(1)実験場所
和洋女子大学、明治大学、株式会社下仁田物産の本社及び工場
(2)精粉、低分子精粉及びトビコの調整方法
精粉及びトビコは、株式会社下仁田物産の提供によるものである。
マウスに与える精粉及びトビコは、株式会社下仁田物産から提供された精粉及びトビコに対して乾燥処理、エタノール沈殿による精製処理を行ったものである。これらの乾燥処理、及びエタノール沈殿による精製処理の方法については更に後述する。
マウスに与える低分子精粉は、株式会社下仁田物産から提供された精粉に対して上記精製処理をした上で、上述した製造方法を用いて製造したものである。この低分子精粉の製造方法についても更に後述する。
株式会社下仁田物産提供の精粉及びトビコは、50℃における真空減圧下で、48時間の乾燥処理を行った。この乾燥処理により得た物質収支の結果を表3に示す。なお、表3において、「トビコ」はトビコを示し、「コンニャク」は精粉を示す。この表3によると、乾燥前の株式会社下仁田物産から提供されたトビコ及び精粉には、それぞれ3.47質量%及び2.59質量%の水分が含まれることが分かる。
乾燥処理後の精粉及びトビコは、80%エタノール水溶液中で48時間撹拌しアミン系化合物の除去などの精製処理を行った。表4は、上記50℃真空減圧下での48時間の乾燥処理から80%エタノール水溶液中での48時間撹拌の精製処理までの乾燥精製処理により得た物質収支の結果を示す。なお、この表4において、「トビコ」はトビコを示し、「コンニャク」は精粉を示す。この表4によると、乾燥精製処理がなされた後の質量減少量(質量減少率)がトビコで7.60質量%であり、精粉で5.5質量%である。これらの質量減少率には上記表3で示した水分が含まれているので、この水分を控除した水分補正後の質量減少率を計算すると、トビコについては4.13質量%であり、精粉については2.91質量%である。即ち、トビコについての4.13質量%及び精粉についての2.91質量%は、株式会社下仁田物産から提供された精製処理前の精粉及びトビコに含まれていたアミン系化合物の含有率に相当すると推定される。上記乾燥精製処理で得られた精粉及びトビコを後述の動物実験におけるマウスに与えている。
(i)予備加水分解による低粘度下
コンニャクの主成分であるグルコマンナンの分子量(Da)が上述のように100万~200万であり、その溶液は高粘度を示すことから、当該グルコマンナンの加水分解の際に行う撹拌などの操作が困難となり、均一な反応条件を維持するのが甚だしく難しくなる。そ
こで、本試験においては、予めグルコマンナンを温浴中で撹拌可能になるまで低粘度化し、更に液面が波立つまで高温状態で加水分解した後、所定の温度での加水分解反応を行った。
上記乾燥精製処理後の精粉(40g)に水(1500mL(1500g))と酢酸(AcOH)(30mL(30g))を添加し、95℃の湯浴中で6時間(360分間)撹拌することで、低粘度化(やっと撹拌可能な状態(反応装置TV1000により撹拌可能な状態)まで低粘度化)した。この操作を予備加水分解と称する。この予備加水分解における精粉と水と酢酸の質量比は、精粉:水:酢酸=1:37.5:0.75である。即ち、水は精粉の37.5質量倍であり、酢酸は精粉の0.75質量倍である。
ガラス製耐熱反応装置(耐圧ガラス社製:TV1000)に上記予備加水分解を施した精粉含有の溶液750mLを投入し、反応温度を95℃まで上昇し、この反応温度を1時間(60分間)保持(撹拌してもよい)した。(なお、上記95℃の反応温度は、90~100℃としてもよく、更に好ましくは92.5~97.5℃としてもよい。また、上記60分間の反応時間は、50~70分間としてもよく、更に好ましくは55~65分間としてもよい。)
精粉含有の反応溶液は、5%-炭酸ナトリウム溶液で、pH≒8.0付近になるまで中和を行った。
で約70℃に加温し、5%亜塩素酸ナトリウム溶液を少しずつ添加することで、溶液の色が薄い黄色を示すまで溶液を添加することで脱色反応を行った。脱色反応後の溶液は、5%-炭酸ナトリウム溶液でPHが8.0付近となるように中和を行い、透析膜による精製を行った。透析膜による精製は、排除限界:1000Da(スペクトラ/ポアRC透析用チューブ(再生セルロース製)スペクトラ/ポア7)の透析膜を用い、2時間後、4時間後、6時間後に膜外の純水を交換し24時間連続で行った。
Agilent製 1100バイナリーポンプ
Agilent製 1100デガッサ
RI検出器:JASCO製 示差屈折計 2031 plus
カラム:SHODEX製 KS-804(排除限界:400000)、
SHODEX製 KS-802(排除限界:10000)、
SHPDEX製 KS-G(ガドカラム)
サンプルループ:PHEOMYNE 500μLループ
溶離液:0.1mol/L NaCl
流速:0.700mL/分
カラム温度:40.0℃
重量平均分子量計算ソフトウエア:Chromato-PRO-GPC(ランタイムインスツルメント社製)
低分子精粉のグルコマンナンの分子量測定結果を図5に示す。この図において、「精製低分子化グルコマンナン」及び「コンニャク」は低分子精粉のグルコマンナンを意味する。即ち、低分子精粉のグルコマンナンについての質量平均分子量(Mw)は12、300(Da)であり、数平均分子量(Mn)は11、000(Da)である。
以上より、後述の動物実験におけるマウスに与える低分子精粉は、質量平均分子量(Mw)が12300(Da)のものとなる。
I.実験方法
(1)実験動物、飼料および飼育条件
4週齢のKK-Ay/Ta Jcl雄性マウス(日本クレア)を、市販固形飼料(CE-2、日本クレア)にて1週間の予備飼育を行い、1群8~9匹として、対照群、高分子コンニャク群(精粉群)、低分子コンニャク群(低分子精粉群)、トビコ群(トビコ群)の4群に群分けを行った。
ショ糖食に5%の割合で混餌したものを、それぞれ3週間摂取させた。
投与終了時、絶食8~10時間後に、イソフルラン吸引麻酔下で腹部大動脈から全採血し、安楽死させた。採取した血液は、遠心分離(3000rpm、10min)を行い、得られた血清中のグルコース濃度を生化学自動分析装置(富士ドライケム4000、富士フィルムメディカル)および検体スライド(富士フィルムメディカル)を用いて測定した。血清インスリン濃度の測定は、市販の測定キット(レビスRインスリン-マウス(Uタイプ)、シバヤギ)を用いて測定した。
インスリン抵抗性指数(HOMA-R)は、血清グルコースおよび血清インスリン値を用いて以下の計算式で算出した。
血清アディポネクチン値(濃度)の測定は、市販の測定キット(レビスR高分子アディポネクチン-マウス/ラット、シバヤギ)を用いて測定した。
上記(1)で示した全採血後、肝臓を摘出し、生理食塩水で洗浄した後、湿重量を測定した。摘出した肝臓の脂肪の抽出はFolchらの方法を用い、一定量の2-プロパノールにて溶解した。市販の測定キット(トリグリセライドE-テストワコー、和光純薬)を用い測定した。
投与3週目に1日の糞を個別採取し、凍結乾燥後糞中脂質の抽出を行った。Hashimotoらの方法で抽出した後、一定量のエタノールにて溶解した。市販の測定キット(総胆汁酸-テストワコー、和光純薬)を用い測定した。
実験結果は各群の平均値±標準誤差(Mean±SE)で示した。差の検定は、p<0.05を統計的に有意であると判断し、p<0.1を傾向があると判断した。高分子コンニャク群(M1群)に対する低分子コンニャク群(M2群)、トビコ群の3群(M3群)の検定は、Dunnettの検定を行い、高分子コンニャク群に対する低分子コンニャク群の2群の検定は、unpaired t-検定を行った。
(1)飼料摂取量
飼料投与期間中の一匹当たりの飼料の摂取量の変化と、一匹当たりの総摂取量を図6に示した。高分子コンニャク群(M1群、n=9)の摂取量は、他の2群に比べて有意に低値を示した。そこで、摂取量の少なかったマウスを解析から除外した結果、図7に示したとおり高分子コンニャク群(M1群、n=4)の1週目の摂取量のみ低値となったが、2週目以降の摂取量および総摂取量に有意差は見られなかった。これ以降の結果において摂取量の少なかったマウスを解析から除外することとした。
投与終了後の血清グルコース値を表6及び図8に示した。血清グルコース値は、トビコ群(M3群)では、高分子コンニャク群(M1群)に比べて低値を示した。また、表6及び図8に示したとおり、低分子コンニャク群(M2群)の血清グルコース値は、高分子コンニャク群(M2群)に比べて有意に低値を示した(p<0.05)。
投与終了後の血清インスリン値を表7及び図9に示した。血清インスリン値は、トビコ群(M3群)は、高分子コンニャク群(M1群)に比べて低値を示した。図9に示したとおり、低分子コンニャク群(M2群)の血清インスリン値は、高分子コンニャク群(M1群)に比べて低値傾向を示した(p<0.1)。
投与終了後の (HOMA-R)値を表8及び図10に示した。HOMA-R値は、トビコ群(M3群)は、高分子コンニャク群(M1群)に比べて低値を示した。図10に示したとおり、低分子コンニャク群(M2群)のHOMA-R値は、高分子コンニャク群(M1群)に比べて有意に低値を示した(p<0.05)。即ち、低分子精粉又はトビコを用いた脂肪及び糖分の吸収抑制剤はインスリン抵抗性指数降下剤としての特徴も有する。
投与終了後の血清アディポネクチン値を表9及び図11に示した。血清アディポネクチン値は、トビコ群は、高分子コンニャク群に比べて高値を示した。図11に示したとおり、低分子コンニャク群の血清アディポネクチン値は、高分子コンニャク群に比べて有意に高値を示した(p<0.05)。低分子精粉又はトビコにはアディポネクチン分泌促進剤としての特徴も有する。
投与終了時(後)の肝臓TG濃度を表10及び図12に示した。低分子コンニャク群およびトビコ群の肝臓TG濃度は、高分子コンニャク群に比べて低値を示した。低分子精粉又はトビコを用いた脂肪及び糖分の吸収抑制剤は肝臓TG濃度降下剤進剤としての特徴も有する。
投与3週目の乾燥糞重量を表11に示した。低分子コンニャク群及びトビコ群の乾燥糞重量は、高分子コンニャク群に比べて低値を示した。低分子コンニャク群の乾燥糞重量は、高分子コンニャク群に比べて有意に低値を示した(p<0.01)。
投与3週目の糞中TG排泄量を表12に示した。低分子コンニャク群およびトビコ群は
高分子コンニャク群と比べて低値を示した。特に、低分子コンニャク群の糞中TG排泄量は、高分子コンニャク群に比べて有意に低値を示した(p<0.01)。
投与3週目の糞中総胆汁酸排泄量を表13に示した。トビコ群の糞中総胆汁酸排泄量は、高分子コンニャク群に比べて有意に高値を示した(p<0.05)。即ち、トビコは胆汁酸の吸着効果が最も高いことが確認できた。即ち、低分子精粉又はトビコを用いた脂肪及び糖分の吸収抑制剤は胆汁酸吸着剤としての特徴も有する。
本研究では、2型糖尿病モデルマウスであるKK-Ayマウスを用いて高分子コンニャクを対照群として、低分子コンニャクおよびトビコの抗糖尿病作用を検討した。
、高分子コンニャクについても、相対的な数値を実験データとして示していないが、HOMA-Rが低値となる効果がある。従って、低分子コンニャク、トビコの摂取によって、高分子コンニャクを摂取させた場合よりさらにインスリン抵抗性の悪化が軽減されたと考えられる。
Claims (7)
- 植物の球茎であるコンニャクの粉砕によって得た精粉から得られる低分子精粉、
及び植物の球茎であるコンニャクの粉砕によって得たトビコの少なくとも一方を含む脂肪及び糖分の吸収抑制剤であって、
前記低分子精粉は、精粉に含まれる食物繊維であるグルコマンナンを酸加水分解により分子量10,000~50,000に低分子化した低分子精粉であることを特徴とする脂肪及び糖分の吸収抑制剤。 - 請求項1に記載の脂肪及び糖分の吸収抑制剤を含むことを特徴とするインスリン抵抗性指数降下剤。
- 請求項1に記載の脂肪及び糖分の吸収抑制剤を含むことを特徴とするアディポネクチン分泌促進剤。
- 請求項1に記載の脂肪及び糖分の吸収抑制剤を含むことを特徴とする肝臓TG濃度降下剤。
- 請求項1に記載の脂肪及び糖分の吸収抑制剤を含むことを特徴とする胆汁酸吸着剤。
- 請求項1に記載の脂肪及び糖分の吸収抑制剤の製造方法であって、
前記球茎のコンニャクの粉砕によって得た精粉と、この精粉の35~40質量倍の水と、前記精粉の0.5~1.0質量倍の酢酸との混合物を90~100℃で350~370分間撹拌した後、
当該90~100℃で前記混合物を50~70分間保持してから、
前記混合物を105~115℃に加熱し、
その105~115℃の温度状態で50~70分保持した後、
前記混合物を更に130~140℃に加熱し、
その130~140℃の温度で170~190分間加水分解を継続してから、
前記混合物を室温まで冷却することで、
前記グルコマンナンを低分子化した低分子精粉とすることを特徴とする脂肪及び糖分の脂肪及び糖分の吸収抑制剤の製造方法。 - 請求項1に記載の脂肪及び糖分の吸収抑制剤を含有することを特徴とする
脂肪及び糖分の吸収抑制用飲料物。
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