WO2007063919A1 - 染色体改変方法 - Google Patents

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WO2007063919A1
WO2007063919A1 PCT/JP2006/323852 JP2006323852W WO2007063919A1 WO 2007063919 A1 WO2007063919 A1 WO 2007063919A1 JP 2006323852 W JP2006323852 W JP 2006323852W WO 2007063919 A1 WO2007063919 A1 WO 2007063919A1
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dna region
region
gene
sequence
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Kyotaro Hirashima
Hideki Tohda
Yuko Hama
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Asahi Glass Company, Limited
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    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/905—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in yeast

Definitions

  • the present invention relates to a technique for modifying a chromosome, and provides a means for efficiently removing a specific region of a long chromosome and a means for efficiently determining whether or not the specific region carries a specific gene.
  • chromosome engineering is becoming an increasingly important technology in the post-genome era.
  • the creation of organisms that have chromosomes modified as desired, such as gene disruption, insertion of foreign genes, and introduction of mutations, is an extremely important technology in various fields such as molecular biology, basic medicine, and agricultural engineering.
  • chromosome modification techniques include fly-red recombination system (Non-patent document 1), Cre / loxP system (Non-patent document 2), Flp / FRT system (Non-patent document 3), or a method using meganuclease (non-patent document 1).
  • Various methods have been developed, such as Patent Document 4).
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a method for recycling URA3 in S. cerevisae and C. albicans that has already been developed. In this method, overlapping sequences are present in the introduced modified fragment ( Figure 1).
  • the chromosome carrying the target DNA region (parental strain in Fig. 1) was replaced with a DNA fragment having a selectable marker gene capable of negative selection, and as a result, the target DNA region was deleted.
  • the selectable marker portion is URA3, and has an overlapping sequence (each sequence on the upstream and downstream sides of the selectable marker gene URA3) on the upstream and downstream sides, and the portion surrounded by a dotted line in the figure represents the introduced modified fragment. Duplicate sequences are present in the introduced modified fragment.
  • This selectable marker gene URA3 is positive Selection Both negative selections are possible, and non-required strains can be selected in a medium that does not contain uracil, and required strains can be selected in a medium containing 5-fluoroorotic acid (hereinafter also referred to as 5-FOA).
  • 5-FOA is an analog of uracil precursor, and fluorouracil, which is also synthesized with 5-FOA, strongly inhibits the growth of yeast, so it is known that uracil non-requiring strains cannot grow.
  • Non-Patent Document 1 Wong, Q. N. et al. Efficient and seamless DNA recomoineenn gusing a thymidylate synthase A selection system in Escherichia coli.Nucl.
  • Non-Patent Document 2 Ghosh, K. & Van Duyne G. D. Cre-loxP biochemistry.Methods 28,374-383 (2002).
  • Patent Document 3 Datsenko, K.A. & Wanner'B.L.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K— 12 using PCR products.Proc. Natl. A cad. Sci. USA 97, 6640-6645 (2000).
  • Non-Patent Document 4 Posfai, G., Kolisnychenko, V., Bereczki, Z. & Blattner, F. R.
  • Non-Patent Document 5 Langle- Rouault, F. & Jacobs, E. Amethod for performing preci se alterations in the yeast genome using are cyclable selectable marker. Nucl. Acids Res. 23, 3079-3081 (1995).
  • Non-Patent Document 6 Wilson, R. B., Davis, D., Enloe, B. M. & Mitchell, A. P. A recyclable Candida albicans URA3 cassette for PCR product-directed gene di sruptions. Yeast 16, 65—70 (2000).
  • Non-Patent Document 7 Grimm, C, Kohli, J "Murray, J. & Maundrell, K. Genetic en gineering of Schizosaccharomyces pombe: a system for gene disruption and replacement using the ura4 gene as a selectable marker. Mol. Gen. Genet .
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a versatile means for chromosomal modification that does not require special enzymes or sequences.
  • the present inventors have conducted more efficient chromosome modification by examining duplicate sequence introduction means in a system using a selection marker gene capable of negative selection.
  • the present invention has been completed by finding out what can be done.
  • the present invention consists of the following.
  • a sequence substantially identical to the specific sequence (A) present downstream of the target DNA region (A ′)” and a “selectable selectable marker gene (B) bound downstream of the sequence ( ⁇ ′)” Is inserted upstream of the target DNA region, so that “the selectable marker gene (B) and the presently selected marker gene (B)” exist between the two substantially identical sequences [(A) and ( ⁇ ′)].
  • the target DNA region contains a gene that compensates for auxotrophy in cell culture.
  • Chromosome power in cells A method for determining whether a target DNA region is a region containing a gene essential for growth under a desired culture condition (Z) by removing the target DNA region; Incorporates a “selectable marker gene (B) capable of negative selection” upstream or downstream of the region, and sandwiches the target DNA region and the selectable marker gene (B) between the overlapping sequences, thereby existing between the overlapping sequences. Forming a region (X) containing the selectable marker gene (B) and the target DNA region,
  • homologous recombination and negative selection are performed, and the homologous recombination and negative selection are performed under the culture conditions (Z), or cells obtained by the homologous recombination and negative selections are cultured under the culture conditions ( Z)
  • the target DNA region does not substantially exist in the chromosome, and that the target DNA region does not contain a gene essential for growth under the culture conditions (Z). Judgment method.
  • Chromosome power in a cell is a method of determining whether a target DNA region is a region containing a gene essential for growth under desired culture conditions (Z) by removing the target DNA region;
  • a sequence substantially identical to the specific sequence (A) present downstream of the target DNA region (A ′)” and a “selectable selectable marker gene (B) bound downstream of the sequence ( ⁇ ′)” Is inserted upstream of the target DNA region, so that “the selectable marker gene (B) and the presently selected marker gene (B)” exist between the two substantially identical sequences [(A) and ( ⁇ ′)].
  • homologous recombination and negative selection are performed, and the homologous recombination and negative selection are performed under the culture conditions ( ⁇ ) or the homologous recombination and negative selection are performed. Culturing the cells obtained by the rexion under the culture conditions (z),
  • the target DNA region does not substantially exist in the chromosome, and that the target DNA region does not contain a gene essential for growth under the culture conditions (Z). Judgment method.
  • the means of the present invention is characterized by the fact that the foreign sequence does not substantially remain after chromosome modification, enables chromosome modification with efficiency equal to or higher than that of conventional methods, and versatility. Is an extremely high means of chromosome modification.
  • the means of the present invention it was possible to provide an extremely easy means for confirming whether a certain gene is essential for growth, and it was possible to achieve removal of a large region DNA called lOOkbp, which was difficult with the conventional method.
  • the means of the present invention uses a mechanism common to all living organisms, and the Schizosaccharomvces pombe (hereinafter referred to as S. pombe) used in the examples is a typical model microorganism. Since the chromosome structure is similar to that of higher organisms, the chromosome modification method of the present invention can be widely applied to bacterial cells and mammalian cells.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of selective marker gene removal (recycling) using overlapping sequences.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a chromosome modification method using the ura4 gene recycling method developed in the present invention.
  • FIG. 3 Schematic diagram of chromosomal alterations that can occur when latent strain is treated with 5-FOA.
  • the black triangles indicate the primers used throughout FIG.
  • FIG. 4 Agarose gel electrophoretic observation diagram (bromide zyme stain) showing the result of confirming the presence or absence of the target DNA region by PCR. The left half is leucine in the medium and leul is not required, and the right half is leucine in the medium and leul is essential.
  • FIG. 5 is an agar medium observation diagram showing the results of confirming auxotrophy. Left is uracil-containing 'leucine-containing medium, middle is uracil-containing' leucine-free medium, and right is uracil-free 'leucine-free medium.
  • FIG. 6 Schematic diagram of the gene structure near the right arm telomere on chromosome 1 and an agarose gel electrophoresis observation showing the result of confirmation of lOOkbp removal (bromide zyme staining). Black triangles indicate primers for confirmation of removal.
  • FIG. 7 is a waveform image diagram showing the result of analyzing the nucleotide sequence of a deleteant. Indicates that the upstream (downstream) and downstream (downstream) sequences of the removed sites are combined without excess or deficiency.
  • FIG. 8 is an observation view of agarose gel electrophoresis showing the result of confirming ORF by PCR (stained bromide stain).
  • One aspect of the present invention is a method for removing a target DNA region by chromosomal force in a cell.
  • the cells are exemplified using yeast, but the nocterial power can be widely applied to mammalian cells.
  • a “selective selectable gene (B) capable of negative selection” is incorporated upstream or downstream of the target DNA region, and the target DNA region and the selectable marker gene (B) are sandwiched between overlapping sequences.
  • a “region (X) containing the selection marker gene (B) and the target DNA region” existing between the overlapping sequences is formed. Force that can be used if an overlapping sequence is originally present upstream and downstream of the target DNA region Usually forms substantially the same sequence (overlapping sequence) upstream and downstream of the target DNA region. Use.
  • a specific sequence (A) originally present downstream of the target DNA region is used, and a substantially identical sequence ( ⁇ ') is incorporated upstream of the target DNA region, and these two sequences ( Let ⁇ ) and ( ⁇ ') be duplicated sequences.
  • a specific sequence originally present upstream of the target DNA region can be used, and the downstream side and upstream side of the target DNA region are substantially the same.
  • the two desired specific sequences can be incorporated to form overlapping sequences.
  • the “negative selectable selectable marker gene (B)” is incorporated between the overlapping sequences.
  • This selectable marker gene (B) may be incorporated either upstream or downstream of the target DNA region. Further, the integration of the selection marker gene (B) and the formation of the overlapping sequence may be performed simultaneously or in any order.
  • a specific sequence (A) originally existing downstream of the target DNA region is used, and a substantially identical sequence ( ⁇ ') is selected upstream of the target DNA region.
  • ⁇ marker gene
  • the first step of removing the target DNA region is to select “a sequence substantially identical to the specific sequence ( ⁇ ) existing downstream of the target DNA region ( ⁇ )” as a “selectable marker gene ( Incorporate the DNA fragment bound upstream of “iii)” upstream of the target DNA region.
  • a selectable marker gene Incorporate the DNA fragment bound upstream of “iii)” upstream of the target DNA region.
  • the “region containing the selectable marker gene ( ⁇ ) and the target DNA region ( ⁇ ) existing between the two substantially identical sequences [(A) and ( ⁇ ')]”. is formed.
  • a cell having a chromosome whose region (X) has been removed by homologous recombination and negative selection is obtained.
  • FIGS. 1 to 3 and FIG. 5 represent the wrinkle minimal medium.
  • the minimal medium was used as the minimal medium. ⁇ See Okazaki et al. (Nucleic Acids Res. 18: 6485-6489 (1990)) for the contents of the minimal medium.
  • FIG. 2 and FIG. 3 show schematic diagrams of a chromosome modification method using the ura4 gene recycling method developed in the present invention.
  • a specific sequence (A) existing downstream of the target DNA region of parental rain is selected, and the specific sequence (A) and A DNA fragment ligated upstream of a selection gene ( ⁇ ) (indicated as ura4 in the figure) that can select negatively the substantially identical sequence ( ⁇ ') is bound upstream of the target DNA region.
  • a “region (X) containing a selection gene ( ⁇ ) and a target DNA region” existing between the identical sequences [(A) and ( ⁇ ′)] is formed.
  • the ura4 force target DNA region is sandwiched between overlapping sequences.
  • the target DNA region to be removed remains after the modified fragment is introduced.
  • a cell from which the selection marker gene “URA” has been removed (inactivated) is used. That is, a uracil-requiring strain that requires uracil in the medium is used as the parental strain. Since the transformant (latent strain) introduced with the selection marker gene “URA” (indicated as ura4 in the figure) becomes a non-uracil-requiring strain, it is selected in a medium without uracil.
  • a mutant strain is selected. Since the transformed strain (1 atent strain) introduced with the selectable marker gene “URA” cannot grow in the presence of 5-FOA (indicated as FOA in the figure), the selectable marker gene “URA” can be used in a medium containing 5-FOA. Transformant strains introduced with can not grow, and only the mutant strain (deletant or mutant) that has lost (or has become inactive) the selectable marker gene “URA” will grow (because there is no “URA”). Proliferation requires uracil).
  • the mutant strain (deletant or mutant) that has lost (inactivated) the selection marker gene “URA” again is selected in a medium containing 5-FOA (5-fluoroorotic acid) and uracil (Fig. 2 and Figure 3).
  • Figure 3 shows the possible chromosomal alterations when latent strains are treated with 5-FOA.
  • leucine labeleled leu in the figure
  • leul is an unnecessary gene, so a strain that has been removed by homologous recombination with ura4 is obtained (deletant).
  • leucine is not present in the culture medium and leul is essential, a strain in which leul remains and ura4 is mutated and becomes inactive can be obtained.
  • This leul is a gene that compensates for leucine requirement (a kind of selectable marker gene). In Fig. 3, this gene is present in the target DNA region.
  • the chromosome modification method of the present invention there is no overlapping sequence in the modified fragment (selectable marker gene URA4 and its upstream sequence ( ⁇ ') only), and for the first time in the latent strain, the overlapping sequence with the selection marker gene ura4 force target DNA region. (Specific sequence A and ⁇ ').
  • the target D ⁇ region to be removed remains at the stage when the modified fragment is introduced, which is a major difference from the conventional method.
  • the specific sequence ( ⁇ ) used in the present invention is not particularly limited. Any sequence that lies downstream of the target DNA region is sufficient.
  • the length is preferably 50 bp to 1000 bp, particularly preferably 200 bp to 400 bp. If the overlapping sequence (two substantially identical sequences A and ⁇ 'provided at both ends of the region to be removed) is of this length, it is sufficient for homologous recombination to occur. is there.
  • substantially identical means that it is sufficient to be identical to the extent necessary and sufficient for homologous recombination to occur.
  • the length of the sequence is the above length. It is preferable.
  • the target DNA region targeted in the present invention is not particularly limited. It is possible to remove target DNA having a length of 200 bp to 1000 kbp, and the target DNA region is preferably 500 bp to 500 kbp, particularly preferably lkbp to 200 kbp.
  • a feature of the present invention is that long regions can be removed, but short regions having the above lower limit can also be removed. Furthermore, a region shorter than the lower limit can be removed if desired, and even a single base can be removed. Even in such a short region, the presence or absence of the target DNA region can be confirmed by measuring the length between the overlapping sequences described later.
  • a new sequence can be incorporated outside the overlapping sequence simultaneously with the removal of the target DNA region of the present invention.
  • a DNA fragment having a new arbitrary sequence bound upstream of the sequence ( ⁇ ′) bound upstream of the selection marker gene (B), upstream of the target DNA region Chromosomes can be constructed in which regions have been removed and new arbitrary sequences have been incorporated.
  • An example of a new arbitrary sequence is a marker gene.
  • the selection marker gene (B) capable of negative selection usable in the present invention is not particularly limited, and a known selection marker gene capable of negative selection can be used.
  • a suitable selectable selectable marker gene for negative selection the “URAJ (orotidine 5'-phosphate decarboxylase) gene is exemplified.“ URA3 ”is the“ URA ”gene of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisae), “URA4” is the “URA” gene of S. pombe.
  • ⁇ -aminoadipic acid can be used in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, and the lysine biosynthesis system LYS2.LYS5 can be used in place of UR A3.
  • LYS2.LYS5 can be used in place of UR A3.
  • a marker gene which can also be used as a negative selection marker gene.
  • homologous recombination is a gene targeting means for artificially changing a specific gene on the genome, and DNA having a portion homologous to the specific gene on the genome. When this is introduced into cells, recombination occurs at this homologous part, and foreign DNA is incorporated into the genome.
  • negative selection is a negative selection and causes cells of the selected clone to die.
  • introduction of a selectable marker gene means that cells are killed under the culture conditions.
  • Cells obtained by this negative selection are either cells having a chromosome from which the selectable marker gene has been removed (the target DNA region has been removed together with the selectable marker gene), or the selectable marker gene has been mutated. A cell that has a chromosome that does not function as the selectable marker (the target DNA region remains!).
  • the downstream sequence of the specific sequence ( ⁇ ) and the upstream sequence of the specific sequence ( ⁇ ') are used as primers (the parts used as primers are shown in wedge shapes in Figs. 3 and 6). Amplify the sequence between them and measure the length of the amplified fragment.
  • the cells from which short fragments (approximately both primers + ( ⁇ ) + ( ⁇ ') length) were obtained were cells from which the target DNA region had been removed, and long fragments (almost both primers + It is determined that a cell obtained from ( ⁇ ) + ( ⁇ ') + mutation selection marker gene + target DNA region length) is a cell having a target DNA region.
  • the two types of cells have a second selection marker in the target DNA region, they can be distinguished by the presence or absence of the second selection marker. For example, if the target DNA region contains a gene that compensates for auxotrophy (second selection marker), the gene that compensates for auxotrophy is lost if it is auxotrophic during cell growth. Therefore, the cell is determined to be a cell from which the target DNA has been removed, and if the cell is not auxotrophic during cell growth, a gene that compensates for the auxotrophy remains, so that the target D It is determined that the cells remain.
  • second selection marker second selection marker
  • a gene that compensates for auxotrophy in cell culture is contained in the target DNA region. Under conditions that do not require the presence of And are preferred.
  • leul (3-isopropylmalate dehydrogenase) gene is contained in the target DNA region, and the culture power in homologous recombination and negative selection is carried out in a medium containing leucine (leu). In other words, even if the leul gene is not present, the culture is performed under conditions that ensure the culture conditions for homologous recombination and negative selection.
  • the present invention also relates to a method for determining whether or not a target DNA region is a region containing a gene essential for growth under a desired culture condition (Z) by removing the target DNA region also in the chromosomal force in the cell. is there.
  • a “selective marker gene (B) capable of negative selection” is inserted upstream or downstream of the target DNA region, and the target DNA region and the selectable marker gene (B) are sandwiched between overlapping sequences.
  • This step is performed in the same manner as the step in the removal method of the present invention.
  • a specific sequence (A) originally present downstream of the target DNA region is used and a substantially identical sequence ( ⁇ ') is selected upstream of the target DNA region ( Explain how to install together with i).
  • the incorporation of the selection marker gene ( ⁇ ) and the formation of overlapping sequences are not limited to this method! /, But this method is also preferred because of the simplicity and efficiency of the process.
  • the method described above is based on "negative selection that binds downstream of a specific sequence ( ⁇ ')" and a specific sequence ( ⁇ ') present downstream of the target DNA region.
  • ⁇ ' specific sequence
  • ⁇ ' specific sequence
  • a region containing the selection marker gene ( ⁇ ) and the target DNA region ( ⁇ ) is formed, and then homologous recombination and negative selection are performed in the above, and the homologous recombination and negative selection are performed under the above culture conditions.
  • under desired culture conditions (Z) means that the present invention also includes determination of auxotrophic strains.
  • FIG. 3 shows an outline of the determination method of the present invention.
  • the target DNA region is the leul gene
  • the selectable marker gene is the ura4 gene
  • a sequence ( ⁇ ') that is substantially identical to the specific sequence (A) is placed up and down across this,
  • the Fig. 3 The left side of the culture medium containing leu [MMA + 5-FOA + ura (uracil) + leu (leucine)] in “culture conditions (Z)” shows that the “leul” gene is “culture conditions (Z ) Below ”is not an essential gene for growth.
  • “deletant” that grows under the culture conditions (containing leu) has “leul” under the culture conditions because “the target DNA region (“ leul ”gene” is substantially absent ””. It is determined that the gene is not essential.
  • the “leul” gene is “cultured under culture conditions (Z)” using the medium [MMA + 5-FOA + ura (uracil)] without leu (leucine) on the right side of FIG. It is an essential gene for growth under the condition (Z).
  • “mutant” that grows under the culture conditions [without leucine] has “the target DNA region (“ leul ”) gene is substantially present”.
  • the “leul” gene is determined to be essential.
  • the length of the target DNA region is as described above.
  • This region may be a region containing two or more genes.
  • it may contain growth-related genes such as the “leul” gene and other genes.
  • the present invention provided in a simple manner is simple without adding any special operation, and no foreign sequence remains after removal of the target DNA sequence from the chromosome. It is possible to repeat this process. Furthermore, in the conventional methods, simplification is achieved without the need to introduce an enzyme for removing the selection marker gene, which was essential. In addition, in order to remove a very long region, in the conventional method, for example, a ⁇ sequence was separately inserted into the nick using a mouse, but in the present invention, one of them must be modified with the sequence of the chromosome as it is. It can be removed simply by modifying one end of the target gene, which is much easier and better than conventional methods.
  • the present invention is also characterized in that the target DNA region remains at the stage where the selection marker gene is incorporated, and that the efficiency of removing the target DNA sequence is extremely high. By using this, it has become possible to investigate whether a certain gene or chromosomal region is essential for cell growth.
  • the leul gene used in the examples of the present invention is an essential gene in a medium without leucine and can be regarded as a gene unnecessary for growth in a medium with leucine. That is, when the mutant of the selectable marker gene that cannot be removed by the method of the present invention (deletant cannot be obtained) and the target DNA sequence remains, the target gene region is It is determined that it is essential for growth.
  • the DNA fragment for preparing the orotidine-5'-phosphate decarboxylase gene (ura4) -removed strain of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe is shown in SEQ ID NO: 1 (DNA -3620: 5'-atgtgtgcaaagaaaatcgt-3,) and 2 (DNA-3621: 5 ttacaaaattttttcaagtt-3,) were prepared by the PCR method using a primer pair of synthetic oligo DNAs.
  • S. pombe ARC032 JY1 strain subsidized by Dr.
  • a DNA fragment for determining whether the 3-isopropylmalate dehydrogenase gene (leul) of S. pombe is essential for growth is represented by SEQ ID NO: 3 (DN ⁇ ⁇ ⁇ 47 ⁇ : 5 Synthetic oligo DNA described in -aaagaggccaaccagaagag-3 and 4 (DNA- 3477: 5 -ttattctacattaaacccta aaatttttaatgtcaaaaaa-3 ') for upstream sequence, SEQ ID NO: 5 (DNA-3478: 5 -tttcgtcaatatcacaagctcgtttactaacgtagaaagc- ⁇ ') and 6 Synthetic oligo DNA described in DNA- / 9: 5 -gttgt tgaagaagttttgtt-3 ') for downstream sequence, SEQ ID NO: 7 (DNA-3482: 5-tagggtttaatgtagaata
  • SEQ ID NO: 11 (DNA-145 o: 5—atggatgctagagtatttca— — Ttaatgctgagaaagtctttg— 3)
  • the ura4 sequence was synthesized by PCR using the synthetic oligo DNA as a primer set.
  • As a result of amplification of leul sequences by PCR using DNA-3621 as a primer set when ura4 and leu 1 sequences were removed, approximately lOOObp was amplified throughout and ORFs of both (ura4: 795 bp, leul: 1116bp) ) was not amplified (Fig.
  • the total DNA fraction was extracted from 8 colonies formed by applying the MGF375 strain to a medium containing uracil not containing leucine and 5-FOA, and the genotype thereof was expressed as DNA-3480 and This was confirmed by PCR using DNA-3481 as a primer set.
  • all 8 strains had a band with the same length as the MGF375 strain.
  • the ura4 sequence was amplified by PCR using DNA-1456 and DNA-1457 as a primer set, and the leul sequence was amplified by PCR using DNA-3620 and DNA-3 621 as a primer set.
  • ura4 and leul remain. In some cases, around 4000 bp were amplified throughout, and the ura4 and leul ORFs were also amplified (FIG. 4, mutant).
  • the total DNA fraction extracted and purified from ARC032 strain was used for the amplification type. Using the obtained amplified fragment, the ARC010 strain was transformed by the method described in Okazaki et al. And Sakurai et al., And it was possible to grow in a minimal medium containing leucine. A strain (latent strain, named MGF387 strain) was obtained.
  • the operation of the present invention is extremely simple and is completely different from conventional single gene disruption.
  • the principle is only using the very basic function of organisms, called homologous recombination, so 5-FOA can be used.
  • S. cerevisiae [Langle-Rouault, F. & Jacobs, E. A method for performing precise alterations in the yeast genome using a recyclable selectable marker.
  • C. albicans [Wilson, RB, Davis'D., Enloe, BM & Mitchell, AP A recycla ble Candida albicans URA3 cassette for PCR product-directed gene disrupti ons. Yeast 16, 65—70 (2000).]
  • P. pastoris [Nett, JH & Gerngross, TU

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Description

染色体改変方法
技術分野
[0001] 本発明は、染色体の改変技術に関し、長い染色体の特定領域を効率よく除去する 手段の提供と、特定領域が特定遺伝子を担持するかどうかを効率的に判定する手段 を提供する。
背景技術
[0002] ポストゲノム時代の現在、染色体工学はますます重要な技術となりつつある。遺伝 子破壊や外来遺伝子の挿入、変異の導入など、染色体を思い通り改変した生物を作 製することは、分子生物学、基礎医学、農業工学など、さまざまな分野で極めて重要 な技術である。これまでに染色体改変技術としてはえ- red recombination system ( 非特許文献 1)、 Cre/loxP system (非特許文献 2)、 Flp/FRT system (非特許文献 3 )、あるいは meganucleaseを用いた方法 (非特許文献 4)など、さまざまな方法が開発 されている。これらはそれぞれ固有の特徴があるが、改変後にも外来配列が残存す ることや、酵素発現の条件検討が難しいなどの欠点がある。またいずれも特殊な酵素 や配列を必要とし、目的の改変株を得るまでには、複数のステップが必要で時間も手 間もかかるという問題がある。
[0003] S. cere visae、し. albicansで URAJ、orotidine 5 -phosphate decarboxylase遺 子) 選択マーカー遺伝子として使って染色体を改変する方法が知られている（図 1) (非 特許文献 5および 6)。図 1は、既に開発されている、 S.cerevisae、 C. albicansで URA3 をリサイクルする方法の模式図である。この方法において、重複配列は導入した改変 断片内に存在している（図 1)。標的 DNA領域を担持した染色体（図 1中 parental stra in)は、ネガティヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子を有する DNA断片で置き 換えられ、結果として標的 DNA領域の削除がおこなわれていた。選択マーカー部が URA3であり、その上下流側に重複配列 (選択マーカー遺伝子 URA3の上下流側の 各配列)をもち、図中点線で囲った部分は導入した改変断片を表す。重複配列は、 導入した改変断片内に存在している。この選択マーカー遺伝子 URA3は、ポジティブ セレクション 'ネガティブセレクションのどちらも可能で、ゥラシルを含まな 、培地で非 要求性株を選抜できるとともに、要求性株は 5-fluoroorotic acid (以下、 5-FOAともい う）を含む培地で選抜できる。 5-FOAはゥラシル前駆体のアナログで、 5-FOA力も合 成されるフルォロウラシルは酵母の生育を強力に阻害するため、ゥラシル非要求性 株は生育できな 、ことが知られて 、る（非特許文献 7)。
非特許文献 1 : Wong, Q. N. et al. Efficient and seamless DNA recomoineenn gusing a thymidylate synthase A selection system in Escherichia coli. Nucl.
AcidsRes.33, e59 (2005).
非特許文献 2 : Ghosh, K. & Van DuyneG. D. Cre- loxP biochemistry. Method s 28,374-383(2002).
特許文献 3 : Datsenko, K. A. & Wanner'B. L. One-step inactivation of chr omosomal genes in Escherichia coli K— 12 usingPCR products. Proc. Natl. A cad. Sci. USA 97,6640-6645 (2000).
非特許文献 4 : Posfai, G.， Kolisnychenko, V., Bereczki, Z. & Blattner, F. R.
Markerless gene replacement in Escherichia colistimulated by a double— stra nd break in the chromosome. Nucl.Acids Res. 27, 4409-4415 (1999).
非特許文献 5 : Langle- Rouault, F. & Jacobs, E. Amethod for performing preci se alterations in the yeast genome using are cyclable selectable marker. N ucl.Acids Res. 23, 3079-3081 (1995).
非特許文献 6 : Wilson, R. B., Davis, D.， Enloe, B. M. & Mitchell, A. P. A r ecyclable Candida albicans URA3 cassette for PCR product-directed gene di sruptions. Yeast 16, 65—70(2000).
非特許文献 7 : Grimm, C, Kohli, J" Murray, J. & Maundrell, K. Genetic en gineering of Schizosaccharomyces pombe: a system for gene disruption and replacement using the ura4 gene as a selectable marker. Mol. Gen. Genet.
215, 81-86 (1988).
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0004] 本発明が解決しょうとする課題は、特殊な酵素や配列を必要としない、汎用性ある 染色体改変手段を提供することである。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らは以上の点を鑑み検討を行った結果、ネガティブセレクションできる選 択マーカー遺伝子を使用する系で、重複配列導入手段を検討することにより、より効 率的に染色体改変を行うことができることを見出し本発明を完成した。すなわち本発 明は以下よりなる。
[0006] 1.細胞中の染色体力 標的 DNA領域を除去する方法において；
標的 DNA領域の上流または下流に「ネガテイヴセレクション可能な選択マーカー遺 伝子 (B)」を組み込むとともに標的 DNA領域と該選択マーカー遺伝子 (B)を重複配列 で挟むことにより、当該重複配列の間に存在する「該選択マーカー遺伝子 (B)と標的
DNA領域とを含む領域 (X)」を形成し、
次!ヽで相同組換えとネガティヴセレクションにより前記領域 (X)が除去された染色体 を持つ細胞を得る、
ことを特徴とする標的 DNA領域を除去する方法。
2.細胞中の染色体力 標的 DNA領域を除去する方法にぉ 、て；
「標的 DNA領域の下流に存在する特定配列 (A)と実質的に同一の配列 (A')」と当該 配列 (Α')の下流に結合した「ネガテイヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子 (B)」 とを有する DNA断片を標的 DNA領域の上流に組み込むことにより、前記 2つの実質 的に同一の配列 [(A)および (Α')]の間に存在する「該選択マーカー遺伝子 (B)と標的 DNA領域とを含む領域 (Χ)」を形成し、
次!ヽで相同組換えとネガティヴセレクションにより前記領域 (X)が除去された染色体 を持つ細胞を得る、
ことを特徴とする標的 DNA領域を除去する方法。
3.特定配列 (Α)及び (Α')が、 50bp〜1000bpの長さである前項 2に記載の方法。
4.標的 DNA領域が、 500bp〜500kbpの長さである前項 1〜3のいずれか 1項に記載 の方法。
5.選択マ ~~力' ~~遺 1ZS子 (B)¾、 orotidine o -phosphate decarboxylase遺 is子（？teる 、前項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。
6.前記標的 DNA領域に細胞培養における栄養要求性を補償する遺伝子が含まれ
、当該栄養要求性を補償する遺伝子の存在を必要としない条件下で相同組換えとネ ガテイヴセレクションにおける培養を行う、前項 1〜5のいずれか 1項に記載の方法。
7.細胞中の染色体力 標的 DNA領域を除去して当該標的 DNA領域が所望の培養 条件 (Z)下での増殖に必須の遺伝子を含む領域か否かを判定する方法であって； 標的 DNA領域の上流または下流に「ネガテイヴセレクション可能な選択マーカー遺 伝子 (B)」を組み込むとともに標的 DNA領域と選択マーカー遺伝子 (B)を重複配列で 挟むことにより、当該重複配列の間に存在する「該選択マーカー遺伝子 (B)と標的 DN A領域とを含む領域 (X)」を形成し、
次いで相同組換えとネガティヴセレクションを行い、かつ、当該相同組換えとネガテ イヴセレクションを前記培養条件 (Z)下で行うかまたは当該相同組換えとネガティヴセ レクシヨンにより得られた細胞を前記培養条件 (Z)下で培養し、
さらにかかる培養条件 (Z)下で増殖する細胞中の染色体に前記標的 DNA領域が実 質的に存在するか否かを確認し、
その結果、前記標的 DNA領域が該染色体に実質的に存在しな 、ことをもって前記 標的 DNA領域が前記培養条件 (Z)下での増殖に必須の遺伝子を含まないと判定する ことを特徴とする判定方法。
8.細胞中の染色体力 標的 DNA領域を除去して当該標的 DNA領域が所望の培養 条件 (Z)下での増殖に必須の遺伝子を含む領域か否かを判定する方法であって；
「標的 DNA領域の下流に存在する特定配列 (A)と実質的に同一の配列 (A')」と当該 配列 (Α')の下流に結合した「ネガテイヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子 (B)」 とを有する DNA断片を標的 DNA領域の上流に組み込むことにより、前記 2つの実質 的に同一の配列 [(A)および (Α')]の間に存在する「該選択マーカー遺伝子 (B)と標的 DNA領域とを含む領域 (Χ)」を形成し、
次いで相同組換えとネガティヴセレクションを行い、かつ、当該相同組換えとネガテ イヴセレクションを前記培養条件 (Ζ)下で行うかまたは当該相同組換えとネガティヴセ レクシヨンにより得られた細胞を前記培養条件 (z)下で培養し、
さらにかかる培養条件 (Z)下で増殖する細胞中の染色体に前記標的 DNA領域が実 質的に存在するか否かを確認し、
その結果、前記標的 DNA領域が該染色体に実質的に存在しな 、ことをもって前記 標的 DNA領域が前記培養条件 (Z)下での増殖に必須の遺伝子を含まないと判定する ことを特徴とする判定方法。
9.前記標的 DNA領域が 2種以上の遺伝子を含む領域である前項 7又は 8に記載の 方法。
10.選択マーカー遺 子 (B)力、 orotidine 5 -phosphate decarboxylase¾fe子で ある、前項 7〜9のいずれか 1項に記載の方法。
発明の効果
[0007] 本発明の手段は、染色体改変後に外来配列が実質的に残存しないという特徴をも ち、従来の方法に比べて同等あるいはそれ以上の高い効率で染色体改変を可能に し、しかも汎用性の極めて高い染色体改変手段である。本発明の手段により、ある遺 伝子が増殖に必須かどうかを確かめる極めて容易な手段が提供でき、さらに従来法 では困難だった lOOkbpという大領域 DNAも、極めて容易に除去が達成できた。さらに 本発明の手段は、どの生物にも共通した機構を利用していること、実施例で用いたシ ゾサッカロミセス ·ボンべ (Schizosaccharomvces pombe,以下 S.pombeと ヽっリは代表 的なモデル微生物であって、その染色体構造が高等生物に類似していることから、 本発明の染色体改変法は、バクテリア力 哺乳類細胞まで広く応用することが可能 である。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]重複する配列を用いた選択マーカー遺伝子除去 (リサイクル)の模式図。
[図 2]本発明で開発した ura4遺伝子のリサイクル法を利用した染色体改変法の模式 図。
[図 3]latent strainを 5-FOA処理した時に起こりうる染色体改変の模式図。黒い三角 は図 4の throughoutで用 、たプライマーを示す。 [図 4]PCRにより標的 DNA領域の有無を確認した結果を示す、ァガロースゲル電気泳 動観察図（臭化工チジゥム染色)。左半分が培地にロイシンがあり leulが不要で、右 半分が培地にロイシンがなく leulが必須である場合である。
[図 5]栄養要求性を確認した結果を示す、寒天培地観察図。左がゥラシル含有 'ロイ シン含有培地、中央がゥラシル含有'ロイシン不含培地、右がゥラシル不含'ロイシン 不含培地。
[図 6]第一染色体右腕テロメァ付近の遺伝子構成の模式図と、 lOOkbp除去の確認結 果を示す、ァガロースゲル電気泳動観察図 (臭化工チジゥム染色)。黒い三角は除去 確認のためのプライマーを示している。
[図 7]deletantの DNA塩基配列解析結果を示す、波形イメージ図。除去した部位の 上流（upstream)と下流（downstream)の配列が過不足なく結合されて 、ることを示す
[図 8]PCRにより ORFを確認した結果を示す、ァガロースゲル電気泳動観察図（臭化 ェチジゥム染色)。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明の一は、細胞中の染色体力も標的 DNA領域を除去する方法である。細胞は 、実施例では酵母を利用して例示したが、ノ クテリア力も哺乳類細胞まで広く適用で きる。
[0010] 標的 DNA領域除去に際し、まず、標的 DNA領域の上流または下流に「ネガティヴセ レクシヨン可能な選択マーカー遺伝子 (B)」を組み込むとともに標的 DNA領域と選択 マーカー遺伝子 (B)を重複配列で挟むことにより、当該重複配列の間に存在する「選 択マーカー遺伝子 (B)と標的 DNA領域とを含む領域 (X)」を形成する。重複配列が標 的 DNA領域の上流側と下流側に本来存在すればそれを利用できる力 通常は標的 DNA領域の上流側と下流側に実質的に同一の配列 (重複配列）を形成してそれを使 用する。たとえば、標的 DNA領域の下流側に本来存在する特定配列 (A)を利用し、そ れと実質的に同一の配列 (Α')を標的 DNA領域の上流側に組み込み、これら 2つの配 列 (Α)、（Α')を重複配列とする。同様に、標的 DNA領域の上流側に本来存在する特定 配列を利用することもでき、また、標的 DNA領域の下流側と上流側とに実質的に同一 の 2つの所望の特定配列を組み込んで重複配列を形成することもできる。
「ネガテイヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子 (B)」は上記重複配列の間に組 み込まれる。この選択マーカー遺伝子 (B)は標的 DNA領域の上流側に組み込んでも よぐ下流側に組み込んでもよい。また、選択マーカー遺伝子 (B)の組み込みと重複 配列の形成は同時に行ってもよぐ任意の順に行ってもよい。
[0011] 以下具体的な例として、標的 DNA領域の下流側に本来存在する特定配列 (A)を利 用し、それと実質的に同一の配列 (Α')を標的 DNA領域の上流側に選択マーカー遺 伝子 (Β)とともに組み込む方法について説明する。上記のように選択マーカー遺伝子
(Β)の組み込みと重複配列の形成はこの方法に限られるものではな 、が、工程の簡 便性や効率からこの方法が好まし 、。
[0012] 標的 DNA領域除去の最初の工程は、「標的 DNA領域の下流に存在する特定配列（ Α)と実質的に同一の配列 (Α')」を「ネガテイヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子 (Β)」の上流に結合させた DNA断片を標的 DNA領域の上流に組み込む。これによつ て、前記 2つの実質的に同一の配列 [(A)及び (Α')]の間に存在する「選択マーカー遺 伝子 (Β)と標的 DNA領域とを含む領域 (Χ)」が形成される。そして、領域 (X)が、相同組 換えとネガティヴセレクションにより除去された染色体をもつ細胞を得る。
[0013] なお、図 1〜図 3、図 5に記載の ΜΜΑは、 ΜΜΑ最少培地を示す。後述実施例にお いても最少培地は ΜΜΑ最少培地を使用した。 ΜΜΑ最少培地の内容については Oka zaki等（Nucleic Acids Res. 18:6485-6489 (1990).)を参照。
[0014] 図 2と図 3に本発明で開発した ura4遺伝子のリサイクル法を利用した染色体改変法 の模式図を示す。本発明では、図 2に latant strainとして示されるように、 parental st rainの標的 DNA領域（図中 targetと表示）の下流に存在する特定配列 (A)を選択し、 その特定配列 (A)と実質的に同一の配列 (Α')をネガティヴセレクション可能な選択マ 一力一遺伝子 (Β) (図中 ura4と表示）の上流に結合させた DNA断片を標的 DNA領域 の上流に結合させ、実質的に同一の配列 [ (A)及び (Α') ]の間に存在する「選択マ 一力一遺伝子 (Β)と標的 DNA領域とを含む領域 (X)」が形成される。改変断片に重 複配列はなぐ latent strainで初めて ura4力 標的 DNA領域とともに重複配列に挟ま れる。除去される標的 DNA領域が、改変断片を導入した段階では残っているのが従 来法との大きな相違点である。ここで、細胞は予め選択マーカー遺伝子「URA」が除 去された (不活性化された)株を使用する。すなわち、培地にゥラシル (ura)を必要と するゥラシル要求性株を parental strainに用いる。選択マーカー遺伝子「URA」（図 中 ura4と表示）が導入された形質転 · (latent strain)はゥラシル非要求性株となる ので、ゥラシルのない培地で選択される。
[0015] 次に、変異株を選択する。選択マーカー遺伝子「URA」が導入された形質転換株 (1 atent strain)は 5- FOA (図中 FOAと表示）が存在すると増殖できないので、 5- FOAが 存在する培地では選択マーカー遺伝子「URA」が導入された形質転換株は増殖でき ず、選択マーカー遺伝子「URA」を失った (または不活性ィ匕した)変異株 (deletantま たは mutant)のみが増殖する（「URA」がな 、ので増殖にはゥラシル (ura)が必要)。し たがって、再度選択マーカー遺伝子「URA」を失った (不活性化した)変異株 (deletan tまたは mutant)は、 5-FOA (5-fluoroorotic acid)とゥラシルを含む培地で選択される（ 図 2および図 3)。図 3は latent strainを 5-FOA処理した時に起こりうる染色体改変を 示す。図 3において、培地にロイシン（図中 leuと表示）がある場合、 leulは不要遺伝子 なため ura4とともに相同組換えによって除去された株が得られる（deletant)。一方、培 地にロイシンがなく leulが必須である場合、 leulは残存したまま ura4に変異が入り活 性がなくなった株 (mutant)が得られる。なお、この leulはロイシン要求性を補償する 遺伝子 (選択マーカー遺伝子の 1種)であり、図 3ではこの遺伝子が標的 DNA領域に 存在する。
[0016] 本発明の染色体改変法では、改変断片 (選択マーカー遺伝子 URA4とその上流の 配列（Α')のみ）に重複配列はなく、 latent strainで初めて選択マーカー遺伝子 ura4 力 標的 DNA領域とともに重複配列 (特定配列 Aと Α')〖こ挟まれる。除去される標的 D ΝΑ領域が、改変断片を導入した段階では残って 、るのが従来法との大きな相違点 である。
[0017] 本発明で使用する特定配列 (Α)は特に限定されるものではな 、。標的 DNA領域の 下流側に存在する配列であれば十分である。その長さは、 50bp〜1000bpが好ましぐ 特に 200bp〜400bpが好ましい。重複配列（除去される領域の両端に設けた実質的に 同一の 2つの配列 Aと Α')がこの程度の長さであれば、相同組換えが生じるに十分で ある。ここで実質的に同一とは、相同組換えが生じるに必要十分な程度に同一であ れば十分という意味である。なお、標的 DNA領域の上流側に存在する特定配列を 利用する場合や標的 DNA領域の下流側と上流側に特定の配列を組み込んで重複 配列を形成する場合も、その配列の長さは上記長さであることが好ましい。
[0018] 本発明で標的とされる標的 DNA領域は特に限定されるものではない。 200bp〜1000 kbpの長さの標的 DNAを除去することが可能であり、標的 DNA領域は、 500bp〜500k bpの長さが好ましぐ特に lkbp〜200kbpが好ましい。長い領域を除去できるのが本発 明の特徴であるが、上記の下限程度の短いものも除去できる。さらに所望により上記 下限よりもさらに短い領域を除去することもでき、たとえ 1塩基であっても除去できる。 このような短い領域であっても後述の重複配列間の長さを測定することによって目的 標的 DNA領域の有無を確認できる。
[0019] さらに、本発明の標的 DNA領域の除去と同時に重複配列の外側に新たな配列を組 み込むこともできる。たとえば、前記選択マーカー遺伝子 (B)の上流に結合させた配 列 (Α')のさらに上流側に新たな任意の配列を結合させた DNA断片を標的 DNA領域 の上流に組み込むことにより、標的 DNA領域が除去されかつ新たな任意の配列が組 み込まれた染色体を構築することができる。新たな任意の配列としてはたとえばマー カー遺伝子などがある。
[0020] 本発明で使用可能なネガティヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子 (B)は、特 に限定されるものではなく、公知のネガティヴセレクション可能な選択マーカー遺伝 子が利用できる。好適なネガティヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子として、「 URAJ (orotidine 5 '-phosphate decarboxylase)遺伝子を例示した。なお、「URA3」は 出芽酵母サッカロミセスセレピシェ（S.cerevisae)の「URA」遺伝子であり、「URA4」は S . pombeの「URA」遺伝子である。その他にも、出芽酵母サッカロミセスセレピシェに おいて α -アミノアジピン酸が使用可能であって、リジン生合成系の LYS2.LYS5が UR A3の代わりに使用可能であり、また、大腸菌では SacBという選択マーカー遺伝子が あり、これもネガティブセレクションマーカー遺伝子として使用可能である。
[0021] 本発明において相同組換えとは、人工的にゲノム上の特定遺伝子を変化させる遺 伝子ターゲッティング手段であり、ゲノム上の特定遺伝子と相同的な部分をもつ DNA を細胞中に導入した場合、この相同部分で組み換えをおこし、外来の DNAがゲノム に取り込まれるのである。
[0022] 本発明にお 、てネガティヴセレクションとは、負の選択であり、選択されたクローン の細胞を死に至らしめる。本発明では、選択マーカー遺伝子の導入は、当該培養条 件下で細胞を死に至らしめることを意味する。このネガティヴセレクションで得られた 細胞は、当該選択マーカー遺伝子が除去された（当該選択マーカー遺伝子とともに 標的 DNA領域が除去された)染色体を有する細胞か、または、当該選択マーカー遺 伝子が変異して当該選択マーカーとして機能しな 、ものとなった (標的 DNA領域は 残存して!/ヽる）染色体を有する細胞である。
[0023] ネガティヴセレクションで得られたこれら 2種の細胞は、 PCR法等によって重複配列
(Α)、（Α')間を増幅しその長さを測定することによって区別することができる。たとえ ば、特定配列 (Α)の下流側の配列と特定配列 (Α')の上流側の配列をプライマーとし て使用し（図 3、図 6にプライマーとして使用する部分を楔型で示す）、それらの間の 配列を増幅しその増幅された断片の長さを測定する。測定の結果、短い断片（ほぼ、 両プライマー + (Α) + (Α')の長さ）が得られた細胞は標的 DNA領域が除去された細 胞であり、長い断片（ほぼ、両プライマー + (Α) + (Α') +変異選択マーカー遺伝子 +標的 DNA領域の長さ）が得られた細胞は標的 DNA領域を有する細胞である、と判 断される。
[0024] 上記 2種の細胞は、また、標的 DNA領域に第 2の選択マーカーを有して 、る場合、 その第 2の選択マーカーの有無により区別することができる。たとえば、標的 DNA領 域に栄養要求性を補償する遺伝子 (第 2の選択マーカー）が含まれて 、る場合、細 胞増殖時に栄養要求性であれば栄養要求性を補償する遺伝子が失われているので 、その細胞は標的 DNAが除去された細胞であると判断され、細胞増殖時に栄養要求 性でなければ栄養要求性を補償する遺伝子が残存して 、るので、その細胞は標的 D ΝΑが残存した細胞であると判断される。
[0025] 本発明の標的 DNA領域の除去法は、この標的 DNA領域に細胞培養における栄養 要求性を補償する遺伝子が含まれており、相同組換えとネガティヴセレクションにお ける培養を当該栄養要求性を補償する遺伝子の存在を必要としない条件下で行うこ とが好ましい。図 3では、標的 DNA領域に leul (3- isopropylmalate dehydrogenase)遺 伝子が含まれており、相同組換えとネガティヴセレクションにおける培養力 ロイシン（ leu)を含有する培地中でおこなわれている。つまり、 leul遺伝子が存在しなくとも相同 組換えとネガティヴセレクションにおける培養条件が確保された条件で培養が行われ るのである。
[0026] 本発明は、また細胞中の染色体力も標的 DNA領域を除去して当該標的 DNA領域 が所望の培養条件 (Z)下で増殖に必須の遺伝子を含む領域か否かを判定する方法 である。
[0027] 前記方法ではまず、標的 DNA領域の上流または下流に「ネガテイヴセレクション可 能な選択マーカー遺伝子 (B)」を組み込むとともに標的 DNA領域と選択マーカー遺伝 子 (B)を重複配列で挟むことにより、当該重複配列の間に存在する選択マーカー遺 伝子と標的 DNA領域とを含む領域を形成する。この工程は、前記本発明の除去方法 における工程と同じように行う。以下具体的な例として、標的 DNA領域の下流側に本 来存在する特定配列 (A)を利用し、それと実質的に同一の配列 (Α')を標的 DNA領域 の上流側に選択マーカー遺伝子 (Β)とともに組み込む方法について説明する。上記 のように選択マーカー遺伝子 (Β)の組み込みと重複配列の形成はこの方法に限られ るものではな!/、が、工程の簡便性や効率力もこの方法が好ま 、。
[0028] 前記方法は、「標的 DNA領域の下流に存在する特定配列 (Α)と実質的に同一の配 列 (Α')」と当該配列 (Α')の下流に結合した「ネガテイヴセレクション可能な選択マーカ 一遺伝子 (Β)」とを有する DNA断片を標的 DNA領域の上流に組み込むことにより、前 記 2つの実質的に同一の配列 [(A)及び (Α')]の間に存在する「選択マーカー遺伝子（ Β)と標的 DNA領域とを含む領域 (Χ)」を形成し、次 、で相同組換えとネガティヴセレク シヨンを行い、かつ、当該相同組換えとネガティヴセレクションを前記培養条件 (Ζ)下 で行うかまたは当該相同組換えとネガティヴセレクションにより得られた細胞を前記培 養条件 (Ζ)下で培養し、さらにかかる培養条件 (Ζ)下で増殖する細胞中の染色体に前 記標的 DNA領域が実質的に存在するか否かを確認し、その結果、前記標的 DNA領 域が該染色体に実質的に存在しないことをもって前記標的 DNA領域が前記培養条 件 (Ζ)下で増殖に必須の遺伝子を含まな 、と判定する、ことを特徴とする方法力もなる 。本発明の工程で使用する各文言の意味は、前記の染色体からの標的 DNA領域を 除去する方法と同一である。
[0029] 本発明にお 、て、「所望の培養条件 (Z)下で」 、う意味は、本発明によって栄養要 求性株の判定をも含むことを意味する。
[0030] 図 3は、本発明の判定方法の概略を示す。 Latent strainにおいて、標的 DNA領域 が leul遺伝子であり、選択マーカー遺伝子が ura4遺伝子であり、これらを挟んで上下 流に特定配列 (A)と実質的に同一の配列 (Α')が配置されて 、る。図 3左側の leuを含 む培地 [MMA+5- FOA+ura (ゥラシル） + leu (ロイシン）]を用いた「培養条件 (Z)下」 では、「leul」遺伝子はその「培養条件 (Z)下」で増殖に必須の遺伝子ではない。すな わち、その培養条件 (leu含有）下で増殖する「deletant」には、「標的 DNA領域（「leul 」遺伝子）が実質的に存在しない」ことにより、その培養条件下では「leul」遺伝子は 必須ではないと判定される。
[0031] 一方、図 3右側の leu (ロイシン）を含まない培地 [MMA+5- FOA+ura (ゥラシル）]を 用いた「培養条件 (Z)下」では、「leul」遺伝子はその「培養条件 (Z)下」で増殖に必須 の遺伝子である。すなわち、その培養条件 [leu (ロイシン)なし]下で増殖する「mutant 」には、「標的 DNA領域（「leul」）遺伝子が実質的に存在」していることより、その培養 条件下では「leul」遺伝子は必須と判定される。
[0032] なお、本発明において、標的 DNA領域の長さは上記のとおりである力 この領域が 2種以上の遺伝子を含む領域であってもよい。例えば、「leul」遺伝子等の生育関連 遺伝子とそれ以外の遺伝子を含んで 、てもよ 、。
[0033] カゝくして提供された本発明は、格別の操作を付け加えることなぐ簡便であり、染色 体からの標的 DNA配列除去後には全く外来配列は残らな 、ので、別部位の操作を 何度も繰り返し行うことが可能である。さらにこれまでの方法では、必須であった選択 マーカー遺伝子除去のための酵素を導入する必要なく簡便化が達成されて 、る。ま た、非常に長い領域を除去するために、従来法では例えばマウスでニケ所に ΙοχΡ配 列を別々に糸且み込んでいたが、本発明では、片方は染色体そのままの配列で改変 する必要はなぐ目的遺伝子のどちらか一端を改変するだけで除去可能な状態とな り、従来の方法に比べて遙かに容易で優れている。 [0034] 本発明は、選択マーカー遺伝子を組み込んだ段階では標的 DNA領域が残って ヽ ること、そして標的 DNA配列の除去の効率が極めて高いという点も大きな特徴である 。これを利用することで、ある遺伝子や染色体領域が細胞の生育に必須かどうかを調 ベることが可能となった。本発明の実施例で用いた leul遺伝子は、ロイシンのない培 地では必須遺伝子であり、ロイシンのある培地では生育に不要な遺伝子と見なすこと ができる。すなわち、本発明の方法で除去できず (deletantが得られず)標的 DNA配 列が残ったままの選択マーカー遺伝子に変異が入った mutantしカゝ得られない場合、 その標的遺伝子の領域は、生育に必須であることが判定されるのである。
[0035] ある遺伝子の配列を改変しその遺伝子の機能を解析することは、最も良く行われる 方法のひとつである力 S. pombeをはじめ多くの生物では、しばしば改変株の取得 が極めて困難である。特に機能未知の遺伝子を直接改変しょうとする場合、単に効 率が悪いため改変が困難なの力、それとも生育に必須なため本質的に改変ができな いのかを見極めることはできない。本発明の方法では、潜伏させた段階において標 的遺伝子は改変されな 、ので、標的遺伝子が生育に必須かどうかにかかわらず laten t strainの作製は可能である。得られた latent strainをネガティブセレクションすれば 、必ず deletant力 mutantとなり、標的遺伝子の除去株が得られるか、あるいはその領 域が生育に必須であることが判定される。
実施例
[0036] 実施例 1
< leul遺伝子がロイシン不含培地での生育に必須であることの判定 >
分裂酵母シゾサッカロミセス ·ボンべ (Schizosaccharomyces pombe)のォロチジン- 5'-リン酸脱炭酸酵素 (orotidine5 '-phosphate decarboxylase)遺伝子（ura4)除去株 を作製するための DNA断片を、配列番号 1 (DNA-3620 : 5'-atgtgtgcaaagaaaatcgt-3，） および 2 (DNA-3621： 5し ttacaaaattttttcaagtt- 3，）に記載の合成オリゴ DNAをプライマ 一組とした PCR法によって作製した。増幅の铸型には S.pombe ARC032株 (東京大 学遺伝子実験施設飯野雄一博士より供与された JY1株を継代保管したもの、遺伝子 型: h— )から抽出精製した全 DNA画分を使用した。得られた増幅断片を用いて S.pomb e ARC010株 (飯野雄一博士より供与された JY743株を継代保管したもの、遺伝子型 : h— leul— 32 ura4— D18)を Okazaki等（Nucleic Acids Res. 18:6485—6489 (1990).) に記載の方法によって形質転換し、ゥラシルを含有する最少培地で生育可能であり 、開始コドン ATGの Aを 1とした時の 137番目の Gの変異 Aが Gに復帰した、 ura4除去株 (MGF300株と命名、遺伝子型： h— ura4- D18)を取得した。
[0037] S. pombeの 3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素（3- isopropylmalate dehydrogenase )遺伝子 (leul)が生育に必須かどうかを判定するための DNA断片を、配列番号 3 (DN Α~ύ47ο： 5 -aaagaggccaaccagaagag-3ノぉよび 4 (DNA- 3477 : 5 -ttattctacattaaacccta aaatttttaatgtcaaaaaa-3')に記載の合成オリゴ DNAを上流配列用、配列番号 5 (DNA- 3478： 5 -tttcgtcaatatcacaagctcgtttactaacgtagaaagc-ύ ' )および 6 (DNA- /9 : 5 -gttgt tgaagaagttttgtt-3')に記載の合成オリゴ DNAを下流配列用、配列番号 7 (DNA- 3482： 5 - tagggtttaatgtagaataa- 3 )および 8 (DNA- 3483 : 3 - gtgggatttgtagctaagctggatgtcgta aatcaattcc-3')に記載の合成オリゴ DNAを重複配列用のそれぞれプライマー組として Sakurai等（FEMSYeast Res. 4:649-654 (2004))および Krawchuk等（Yeast.15: 1419 -1427(1999))に記載の二段階 PCR法によって、 ura4配列とともに leul下流に位置する 200bpの配列を重複配列として配置した断片を作製した。増幅の铸型には ARC032株 カゝら抽出精製した全 DNA画分を使用した。得られた増幅断片を用いて MGF300株を 前記 Okazaki等および Sakurai等（FEMSYeast Res. 4:649-654 (2004))に記載の方 法によって形質転換し、ロイシンおよびゥラシルを含有する最少培地で生育可能であ る、除去断片が染色体内に潜在した株 (latent strain, MGF375株と命名、遺伝子型 : h" ura4-D18 leul〈く ura4+)を取得した（図 3)。
[0038] MGF375株をロイシン (leu)、ゥラシル (ura)および 5-フルォロォロチン酸（5- fluoroorot ic acid、5-FOA、図では FOAと表示）を含む培地に塗布して形成されたコロニーのう ち 8個力 全 DNA画分を抽出し、その遺伝子型を、配列番号 9 (DNA-3480 : 5'-aagat gacgatgatgatttt- 3，）および 10 (DNA- 3481： 5'- gtcgcttcttctcaacgact- 3，）に記載の合 成オリゴ DNAをプライマー組とした PCR法によって確認した。結果、図 4左に示すよう に 8株全てにおいて MGF375株よりも短いバンドが得られた。配列番号 11 (DNA-145 o : 5—atggatgctagagtatttca—
Figure imgf000016_0001
— ttaatgctgagaaagtctttg— 3 ) の合成オリゴ DNAをプライマー組とした PCR法によって ura4配列を、 DNA-3620およ び DNA-3621をプライマー組とした PCR法で leul配列を増幅した結果、 ura4および leu 1配列が除去された場合、 throughoutでは約 lOOObpが増幅し、両者の ORF (ura4:795 bp、 leul:1116bp)は増幅されなかった（図 4、 deletant) 0さらに栄養要求性を確認した 結果、図 5に示すように、 latent strainでは ura4、 leul力 Sともに機能しているため、全て の培地で生育が認められた。これに対し、両者とも除去された deletantでは、 8株全て ゥラシル'ロイシンともに要求性であった（図 5、 deletant, 8株のうち 2株を示す）。
[0039] 以上の結果力 ura4と重複配列を leulの上流に組み込んだ潜在株を 5-FOA培地 に塗布するだけで、 ura4とともに標的遺伝子である leulも同時に除去された株（図 3、 deletant)力 高い効率で得られることがわかった。
[0040] 一方、 MGF375株をロイシンを含まないゥラシルおよび 5-FOAを含む培地に塗布し て形成されたコロニーのうち 8個力 全 DNA画分を抽出し、その遺伝子型を DNA-348 0および DNA- 3481をプライマー組とした PCRで確認した。その結果、図 4右に示すよ うに 8株全てにお!、て MGF375株と同じ長さのバンドが得られた。 DNA- 1456および D NA-1457をプライマー組とした PCR法によって ura4配列を、 DNA-3620および DNA-3 621をプライマー組とした PCR法で leul配列を増幅した結果、 ura4、 leulが残っている 場合、 throughoutでは約 4000bpが増幅し、 ura4および leulの ORFも増幅された（図 4、 mutant)。
[0041] さらに栄養要求性を確認したところ、図 4の PCRの結果では latent strainと同様のバ ンドが増幅された mutantも、 8株全てゥラシル要求性'ロイシン非要求性であった（図 5 、 mutant, 8株のうち 2株を示す）。以上の結果から、 ura4と重複配列を leulの上流に 組み込んだ潜在株を 5-FOA培地に塗布し、 leulが生育に必須の培養条件下では、 u ra4及び leulともに除去されない株（図 4、 mutant)力 高い効率で得られることがわか つた。さらに ura4内部の塩基配列を決定したところ、 8株全てにおいてそれぞれ、開始 メチォニンを 1とした時の 227番目のァスパラギン酸がチロシン (2株）またはァスパラギ ンに、 121番目のスレオニンがリジン（2株）またはアルギニン（2株）に、 33番目のセリン がアルギニンに変異して 、ることを確認した。
[0042] 以上の結果から、除去対象領域に必須遺伝子が含まれない場合には相同組換え によって対象領域が効率よく除去され、対象領域に必須遺伝子が含まれる場合には 点変異によって ura4の活性がなくなった変異株が得られることがわ力つた。すなわち 、得られた株の遺伝子型を PCR法によって簡便に判定することによって、対象領域に 生育に必須の部分が含まれるかどうかが容易にわ力ることが判明した。
[0043] 実施例 2
<染色体からの大規模領域（lOOkbp)の削除 >
S. pombeの第一染色体の右腕テロメァ近傍の lOOkbpの領域 (塩基番号 5413211か ら 5513210)には、既知の必須遺伝子を含まない 33個の遺伝子が位置する。この領域 を除去するために、遺伝子 SPAC186.06の lOOkbp上流（塩基番号 5413211の位置）に ura4と重複配列を組込むための DNA断片を、配列番号 13 (DNA-3350： 5'-agaattgag acggcgctgaa-3 )および 14 (DNA- 3351： o -gtccttttgttaaataaaaattaggatacactaggtagat -3')に記載の合成オリゴ DNAを上流配列用、配列番号 15 (DNA-3352 : 5'-tttcgtcaat atcacaagcttgttgcttttttatattaaa-3 ' )およひ 16 (DNA- 3353： 5 -aaacaagactaaagattagt-3 )に記載の合成オリゴ DNAを下流配列用、配列番号17 (DNA-3329 : 5'-tttttatttaacaa aaggac-3 )および 18 (DNA-33 J0： o -gtgggatttgtagctaagcttttatcgaaagaaaagaaat-3 ' ) に記載の合成オリゴ DNAを重複配列用のそれぞれプライマー組として、前記 Sakurai 等および前記 Krawchuk等に記載の二段階 PCR法によって作製した。
[0044] 増幅の铸型には ARC032株カゝら抽出精製した全 DNA画分を使用した。得られた増 幅断片を用いて ARC010株を前記 Okazaki等および前記 Sakurai等に記載の方法によ つて形質転換し、ロイシンを含有する最少培地で生育可能である、除去断片が染色 体内に潜在した株 (latent strain, MGF387株と命名 )を取得した。
[0045] この MGF387株をロイシン、ゥラシルおよび 5-FOAを含む培地に塗布して形成され たコロニーのうち 18個力も全 DNA画分を抽出し、その遺伝子型を、配列番号 19 (DN A- «3354: 5 -gacagtaaaagcattaagta-3ノぉよび 20 (DNA- 3355 : 5 -gctttaccaacttcgtcaga -3')に記載の合成オリゴ DNAをプライマー組とした PCR法によって確認した。その結 果、 latent strainでは lOOkbpと非常に長いため、 PCRによる増幅は認められなかった 力 FOA耐性となった株では、 18株全てについて lOOkbpが除去されたことが示唆さ れる 1000bpのバンドが増幅された（図 6)。さらに、この PCR産物の DNA塩基配列を解 祈した結果、 18株全てにおいて標的配列の上下流が外来配列を 1塩基も残さずに結 合していることが確認された（図 7、 18株中 1株の結果を示す)。図 7において、第一 染色体の塩基番号 5413210と塩基番号 5513211がシームレスにつながつていることを 確認した結果を示す。
[0046] さらに、第一染色体 lOOkbpの標的配列に含まれる 33個の ORFsのうち 20個の ORF s、および標的配列両隣の ORF内 500bpを増幅するプライマーで ORFの有無を確認し た。その結果、図 8に示すように latent strainでは全てについて増幅が認められた。 これに対し、 FOA処理後の deletantでは、標的領域両隣の ORF以外は増幅が認めら れず、 lOOkbpが除去されていることが明ら力となった（図 8、 deletant, MGF388株と命 名)。
産業上の利用可能性
[0047] 本発明の操作は極めてシンプルで、従来の一遺伝子破壊と全く変わないものであ る。その原理は相同組換えという、生物に備わる極めて基本的な機能を利用している だけであるので、 5- FOAを利用できる S.cerevisiae [Langle-Rouault, F. & Jacobs, E. A method for performing precise alterations in the yeast genome using a recyclable selectable marker. Nucl. Acids Res. 23, 3079—3081 (1995).] 、 C. albicans [Wilson, R.B., Davis'D., Enloe, B.M. & Mitchell, A.P. A recycla ble Candida albicans URA3 cassette for PCR product-directed gene disrupti ons. Yeast 16, 65—70 (2000).]、 P. pastoris [Nett, J.H. & Gerngross, T. U.
Cloning and disruption of the PpURA5 gene and construction of a set of integration vectors for the stable genetic modification of Pichia pastoris. Yeast 20, 1279-1290(2003).]、 K. lactis [Bai, X.,Larsen, M. & Meinhardt, F.
The URA5 gene encoding orotate— phosphoribosyltransferase of the yeast Kl uyveromyceslactis： cloning, sequencing and use as a selectable marker. Yeas t 15,1393-1398 (1999).]などのさまざまな酵母で応用できるのはもちろん、ネガティ ブセレクションが可能な Escherichia coli[Wong, Q. N. et al. Efficient and sea mless DNA recombineering using a thymidylate synthase A selection system in Escherichia coli. Nucl. Acids Res. 33, e59 (2005).]、 Arabidopsis thaliana [Xiaohui, W. H. et al. Positive-negative selection for homologous recombina tion in Arabidopsis. Gene 272, 249-255 (2001).]、 mammalian cells [Mullen, C. A., Kilstrup, M. & Blaese, R. M. Transfer of the bacterial gene for cy tosine deaminase to mammalian cells confers lethal sensitivity to 5— fluorocyt osine: a negative selection system. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89, 33-37 ( 1992).]など、非常に多くの生物で応用できる可能性が高い。
なお、 2005年 11月 29曰に出願された曰本特許出願 2005— 344749号の明細書 、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開 示として、取り入れるものである。

Claims

請求の範囲
[1] 細胞中の染色体力 標的 DNA領域を除去する方法にぉ 、て；
標的 DNA領域の上流または下流に「ネガテイヴセレクション可能な選択マーカー遺 伝子 (B)」を組み込むとともに標的 DNA領域と該選択マーカー遺伝子 (B)を重複配列 で挟むことにより、当該重複配列の間に存在する「該選択マーカー遺伝子 (B)と標的 DNA領域とを含む領域 (X)」を形成し、
次!ヽで相同組換えとネガティヴセレクションにより前記領域 (X)が除去された染色体 を持つ細胞を得る、
ことを特徴とする標的 DNA領域を除去する方法。
[2] 細胞中の染色体力も標的 DNA領域を除去する方法にぉ 、て；
「標的 DNA領域の下流に存在する特定配列 (A)と実質的に同一の配列 (A')」と当該 配列 (Α')の下流に結合した「ネガテイヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子 (B)」 とを有する DNA断片を標的 DNA領域の上流に組み込むことにより、前記 2つの実質 的に同一の配列 [(A)および (Α')]の間に存在する「該選択マーカー遺伝子 (B)と標的 DNA領域とを含む領域 (Χ)」を形成し、
次!ヽで相同組換えとネガティヴセレクションにより前記領域 (X)が除去された染色体 を持つ細胞を得る、
ことを特徴とする標的 DNA領域を除去する方法。
[3] 特定配列 (Α)及び (Α')が、 50bp〜1000bpの長さである請求項 2に記載の除去する方 法。
[4] 標的 DNA領域が、 500bp〜500kbpの長さである請求項 1〜3のいずれか 1項に記載 の除去する方法。
[¾」 選択マーカー ¾fe子 (B)力、 orotidine ΰ -phosphate decarboxylase遺伝子である、 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の除去する方法。
[6] 前記標的 DNA領域に細胞培養における栄養要求性を補償する遺伝子が含まれ、 当該栄養要求性を補償する遺伝子の存在を必要としない条件下で相同組換えとネ ガテイヴセレクションにおける培養を行う、請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の除去 する方法。
[7] 細胞中の染色体力 標的 DNA領域を除去して当該標的 DNA領域が所望の培養条 件 (Z)下での増殖に必須の遺伝子を含む領域か否かを判定する方法であって； 標的 DNA領域の上流または下流に「ネガテイヴセレクション可能な選択マーカー遺 伝子 (B)」を組み込むとともに標的 DNA領域と選択マーカー遺伝子 (B)を重複配列で 挟むことにより、当該重複配列の間に存在する「該選択マーカー遺伝子 (B)と標的 DN A領域とを含む領域 (X)」を形成し、
次いで相同組換えとネガティヴセレクションを行い、かつ、当該相同組換えとネガテ イヴセレクションを前記培養条件 (Z)下で行うかまたは当該相同組換えとネガティヴセ レクシヨンにより得られた細胞を前記培養条件 (Z)下で培養し、
さらにかかる培養条件 (Z)下で増殖する細胞中の染色体に前記標的 DNA領域が実 質的に存在するか否かを確認し、
その結果、前記標的 DNA領域が該染色体に実質的に存在しな 、ことをもって前記 標的 DNA領域が前記培養条件 (Z)下での増殖に必須の遺伝子を含まないと判定する ことを特徴とする判定方法。
[8] 細胞中の染色体力 標的 DNA領域を除去して当該標的 DNA領域が所望の培養条 件 (Z)下での増殖に必須の遺伝子を含む領域か否かを判定する方法であって；
「標的 DNA領域の下流に存在する特定配列 (A)と実質的に同一の配列 (A')」と当該 配列 (Α')の下流に結合した「ネガテイヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子 (Β)」 とを有する DNA断片を標的 DNA領域の上流に組み込むことにより、前記 2つの実質 的に同一の配列 [(A)および (Α')]の間に存在する「該選択マーカー遺伝子 (Β)と標的 DNA領域とを含む領域 (Χ)」を形成し、
次いで相同組換えとネガティヴセレクションを行い、かつ、当該相同組換えとネガテ イヴセレクションを前記培養条件 (Ζ)下で行うかまたは当該相同組換えとネガティヴセ レクシヨンにより得られた細胞を前記培養条件 (Ζ)下で培養し、
さらにかかる培養条件 (Ζ)下で増殖する細胞中の染色体に前記標的 DNA領域が実 質的に存在するか否かを確認し、
その結果、前記標的 DNA領域が該染色体に実質的に存在しな 、ことをもって前記 標的 DNA領域が前記培養条件 (Z)下での増殖に必須の遺伝子を含まないと判定する ことを特徴とする判定方法。
[9] 前記標的 DNA領域が 2種以上の遺伝子を含む領域である請求項 7又は 8に記載の 判定方法。
[10」 選択マーカー ¾fe子 (B)力、 orotidine ΰ -phosphate decarboxylase遺伝子である、 請求項 7〜9のいずれか 1項に記載の判定方法。
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