WO2007061094A1

WO2007061094A1 - Ｐｐａｒアゴニスト含有医薬

Info

Publication number: WO2007061094A1
Application number: PCT/JP2006/323601
Authority: WO
Inventors: Yoshikuni Nakamura; Ikuko Hanano; Jun Inoue
Original assignee: Senju Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2005-11-28
Filing date: 2006-11-27
Publication date: 2007-05-31
Also published as: EP1964575A1; CA2630816C; CN101336113A; JP5186217B2; EP1964575A4; US8148389B2; CN101336113B; US9096538B2; EP1964575B1; CA2630816A1; US20090306111A1; US20120220612A1; KR101409705B1; JPWO2007061094A1; KR20080080595A

Abstract

　マイボーム腺上皮細胞および角膜上皮細胞の増殖促進剤を提供すること、並びに、マイボーム腺機能不全・涙液蒸発亢進型ドライアイ等の眼疾患の治療剤を提供すること。　ＰＰＡＲαまたはδアゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺上皮細胞または角膜上皮細胞の増殖促進剤、並びに、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺機能不全・涙液蒸発亢進型ドライアイ等の眼疾患の治療剤の提供。

Description

明細書

PPARァゴニスト含有医薬

技術分野

[0001] 本発明は、 PPAR (ペルォキシソーム増殖剤応答性受容体； Peroxisome Proliferate r Activated Receptor) αまたは δァゴ-ストを有効成分として含有する、マイボーム腺上皮細胞または角膜上皮細胞の増殖促進剤に関する。

背景技術

[0002] マイボーム腺は上下のまぶた（眼瞼）に内包された脂質産生腺であり、眼瞼のまつげ (睫毛)より結膜側に位置する開口部力も脂質を分泌する。涙液を構成する油層は、マイボーム腺から供給される脂質を成分としており、眼表面力の涙液の蒸発を防いでいる。マイボーム腺機能不全やマイボーム腺炎患者においては、マイボーム腺の機能が低下して脂質の分泌量が少なくなるため、涙液蒸発亢進型ドライアイ、ドラィアイに伴う角結膜上皮障害、角膜上皮糜爛、角膜潰瘍などを引き起こすことが知られている。

また、角膜は、外胚葉性の上皮と中胚葉性の外境界板 (ボーマン膜） '実質'内境界板 (デスメ膜） '内皮から成り立つている。角膜は眼球の最前部に位置しているので、外界の環境の影響を受けやすぐその結果として種々の障害が生じる。角膜上皮細胞の損傷または欠損を伴う疾患としては、ドライアイ症候群、角膜潰瘍、点状表層角膜症、角膜上皮糜爛、春季カタルやアトピー性角結膜炎などの角膜病変を伴う眼アレルギー性疾患などが挙げられる。

[0003] 一方、 PPARは、殆どの脊椎動物において発現している核内レセプターの一種であり、細胞内の糖'脂質代謝や細胞の分化に密接に関与している転写因子群であるとされている。サブタイプとしては、 α、 δ、 γ型が知られている。なお、 PPAR δは、 PPAR βと表記されることもある（非特許文献 1)。

PPARの眼組織における分布としては、 PPAR aおよび βがゥサギの角膜上皮細胞に発現してヽることが知られて!/ヽる (非特許文献 2)。

これまでに、 PPAR活性化作用を有する 5— [4— (6—メトキシ一 1—メチル 1H— ベンゾイミダゾールー 2—ィルメトキシ）ベンジル]チアゾリジン一 2, 4 ジオンが、角結膜障害の治療剤として利用できること (特許文献 1および 2)、眼疾患 (結膜炎、ドラィアイ症候群、角膜炎など）の治療にぉ、て PPAR a、 δまたは γァゴ-ストが投与されること (特許文献 3)が報告されている。また、 PPAR aに関しては、肝臓、腎臓などに分布し、脂質代謝'輸送に作用することが知られており、さらに、そのァゴ-ストが角膜疾患の治療剤として利用できることも報告されてヽる (特許文献 4)。 PPAR δァゴニストについては、これまで、ラット皮脂腺上皮細胞の増殖および分化を促進すること (非特許文献 3)、皮膚の創傷治癒を促進すること (非特許文献 4)につヽての報告がある。その他にも、非チアゾリジンジオン PPARリガンドと GLP— 1誘導体を投与することにより β 細胞の増殖を刺激する方法 (特許文献 5)、 PPAR γァゴ-ストであるピオグリタゾンが白血病細胞や前立腺癌細胞などの増殖を阻害すること (特許文献 6)などが知られている。

[0004] しかしながら、 PPAR a、 δまたは γの各動物種および各組織'細胞における発現や機能については不明な点が多ぐどの PPARァゴ-ストが、ヒトの眼疾患に有用であるかにっヽては知られて、な、。

特許文献 1：国際公開第 2005Z039574号パンフレット

特許文献 2 :特開 2001— 39976号公報

特許文献 3：国際公開第 2002Z076177号パンフレット

特許文献 4：特開 2005— 008570号公報

特許文献 5：国際公開第 2002Z69994号パンフレット

特許文献 6 :国際公開第 1998Z25598号パンフレット

非特許文献 1 : J Med Chem 2000, 43: 527-550

非特許文献 2 : J Biol Chem 2000, 275: 2837

非特許文献 3 : Molecular Genetic and Metabolism 2001 , 74: 362-369

非特許文献 4 : Am J Clin Dermatol 2003, 4(8): 523-530

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 本発明の課題は、ドライアイなどの眼疾患の根本的な治療となり得るマイボーム腺上皮細胞および角膜上皮細胞の増殖を促進しうる薬剤を提供すること、並びに、該促進剤を用いたマイボーム腺機能不全'涙液蒸発亢進型ドライアイ等の眼疾患の治療剤を提供することである。

課題を解決するための手段

[0006] 本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、 PPAR aまたは δァゴ- ストが、マイボーム腺上皮細胞および角膜上皮細胞の増殖促進作用を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。

したがって、本発明は以下の内容を少なくとも含む。

(1) PPAR aまたは δァゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進剤。

(2) PPAR «または δァゴニストを有効成分として含有する、角膜上皮細胞の増殖促進剤。

(3) PPAR «または δァゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺機能不全の治療剤。

(4) PPAR «または δァゴニストを有効成分として含有する、角膜上皮障害の治療剤

(5) PPAR «または δァゴニストを有効成分として含有する、涙液蒸発亢進型ドライアイの治療剤。

(6) PPAR δァゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進剤。

(7) PPAR δァゴニストを有効成分として含有する、角膜上皮細胞の増殖促進剤。

(8) PPAR δァゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺機能不全の治療剤

(9) PPAR δァゴニストを有効成分として含有する、角膜上皮障害の治療剤。

(10) PPAR δァゴニストを有効成分として含有する、涙液蒸発亢進型ドライアイの治療剤。

(11) PPAR aまたは δァゴニストが一般式 (I)

[0007] [化 1]

[0008] [式中、

Aは水素原子または炭素数 1〜6のアルキル基を示し、

Bは— CO—、— NH―、—（CH ) — S―

2 n 、—（CH ) — O および— O— (CH )

2 n 2 n O （式中、 nは 1〜3の整数を表す)からなる群力選択されるリンカ一を示し、 Xおよび Yは同一または異なって炭素原子または窒素原子を示し、

Zは酸素原子、硫黄原子または—CH を示し、

2

Arは 1〜3個の置換基を有して、てもよ、5〜6員環である芳香環基を示し、

Rおよび Rは同一または異なって水素原子または炭素数 1〜6のアルキル基を示し

1 2

Rは水素、ハロゲン原子または炭素数 1〜6のアルキル基を示す]

3

で表される化合物、またはそれらの薬理学的に許容される塩である、（1)〜（5)のいずれかに記載の剤。

( 12) PPAR δァゴニストが一般式 (II)

[0009] [化 2]

[0010] [式中、

Αは水素原子または炭素数 1〜6のアルキル基を示し、

Bは—（CH ) ― S および— O— (CH ) -0- (式中、 nは 1〜3の整数を表す）か

2 n 2 n

らなる群カゝら選択されるリンカ一を示し、

Xおよび Yは同一または異なって炭素原子または窒素原子を示し、

Zは酸素原子、硫黄原子または—CH を示し、

2

Arは 1〜3個の置換基を有して、てもよ、5〜6員環である芳香環基を示し、 Rおよび Rは同一または異なって水素原子または炭素数 1〜6のアルキル基を示し

1 2

3

で表される化合物、またはそれらの薬理学的に許容される塩である、（6)〜（10)のいずれかに記載の剤。

(13) PPAR δァゴ-ストが、（4— (3- (4 ァセチルー 3 ヒドロキシ— 2 プロピル )フヱノキシ）プロポキシフヱノキシ）酢酸、（2—メチルー 4 （（（4ーメチルー 2—（4 (トリフルォロメチル）フエ-ル） 5—チアゾリル)メチル）チォ）フエノキシ）酢酸もしくは（4— (((2— (3—フルオロー 4 (トリフルォロメチル)フエ-ル）—4—メチル—5 チァゾリル)メチル)チォ)— 2—メチルフエノキシ)酢酸、またはそれらの薬理学的に許容される塩である、（11)または（12)に記載の剤。

(14) PPAR aァゴ-スト力 2— (4— (4 クロ口べンゾィル）フエノキシ） 2—メチルプロピオン酸 1—メチルェチルエステルもしくは（（4 クロ口一 6— ( (2, 3 ジメチルフエニル)ァミノ）—2—ピリミジニル)チォ)酢酸、またはそれらの薬理学的に許容される塩である、（11)に記載の剤。

(15)マイボーム腺上皮細胞の増殖促進剤を製造するための、 PPAR o;または δァゴニストの使用。

(16)角膜上皮細胞の増殖促進剤を製造するための、 PPAR aまたは δァゴ-ストの使用。

(17)マイボーム腺機能不全の治療剤を製造するための、 PPAR o;または δァゴニストの使用。

(18)角膜上皮障害の治療剤を製造するための、 PPAR aまたは δァゴニストの使用

(19)涙液蒸発亢進型ドライアイの治療剤を製造するための、 PPAR aまたは δァゴ二ストの使用。

(20)マイボーム腺上皮細胞の増殖促進剤を製造するための、 PPAR δァゴニストの使用。

(21)角膜上皮細胞の増殖促進剤を製造するための、 PPAR δァゴ-ストの使用。 (22)マイボーム腺機能不全の治療剤を製造するための、 PPAR δァゴニストの使用

(23)角膜上皮障害の治療剤を製造するための、 PPAR δァゴニストの使用。

(24)涙液蒸発亢進型ドライアイの治療剤を製造するための、 PPAR δァゴ-ストの使用。

(25)マイボーム腺上皮細胞の増殖促進を必要とする対象に、 PPAR αまたは δァゴニストの有効量を投与することを含む、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進方法。

(26)角膜上皮細胞の増殖促進を必要とする対象に、 PPAR αまたは δァゴ-ストの有効量を投与することを含む、角膜上皮細胞の増殖促進方法。

(27)マイボーム腺機能不全の治療のために行われる、 (25)記載の方法。

(28)角膜上皮障害の治療のために行われる、 (26)に記載の方法。

(29)涙液蒸発亢進型ドライアイを患う患者に、 PPAR αまたは δァゴニストの有効量を投与することを含む、涙液蒸発亢進型ドライアイの治療方法。

(30)マイボーム腺上皮細胞の増殖促進を必要とする対象に、 PPAR δァゴ-ストの有効量を投与することを含む、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進方法。

(31)角膜上皮細胞の増殖促進を必要とする対象に、 PPAR δァゴ-ストの有効量を投与することを含む、角膜上皮細胞の増殖促進方法。

(32)マイボーム腺機能不全の治療のために行われる、 (30)記載の方法。

(33)角膜上皮障害の治療のために行われる、 (31)に記載の方法。

(34)涙液蒸発亢進型ドライアイを患う患者に、 PPAR δァゴニストの有効量を投与することを含む、涙液蒸発亢進型ドライアイの治療方法。

発明の効果

[0011] 本発明によれば、新規のマイボーム腺上皮細胞増殖促進剤または角膜上皮細胞増殖促進剤が提供され、該促進剤は、マイボーム腺上皮細胞および角膜上皮細胞の増殖を促進する。また、本発明の治療剤は、マイボーム腺機能不全、角膜上皮障害、涙液蒸発亢進型ドライアイなどの疾患の治療 '改善に有効に用いることができる。図面の簡単な説明

[0012] [図 1]図 1は、培養ヒト角膜上皮細胞 (上段)、培養ゥサギ角膜上皮細胞（中段)、および培養サルマイボーム腺上皮細胞（下段）での PPAR α、 δ、 γの mRNAの発現を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0013] 本発明は、 PPAR aまたは δァゴ-ストを有効成分として含有する、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進剤を提供する。該促進剤はマイボーム腺上皮細胞の増殖を促進するものである。また、本発明は、 PPARひまたは δァゴ-ストを有効成分として含有する、角膜上皮細胞の増殖促進剤を提供する。該促進剤は角膜上皮細胞の増殖を促進するものである。なお、本発明にいう細胞増殖促進剤とは、細胞分裂を促進し細胞数を増加させる作用を有するもの、および細胞死を抑制して細胞数を増加させる作用を有するものの両者を意味する。

[0014] 本発明の促進剤は、 PPAR aまたは δァゴニストを有効成分として含有するものである。 PPAR aァゴ-ストとは、 PPAR aと結合して PPAR aを活性化する作用を有する物質をいう。また、 PPAR δァゴ-ストとは、 PPAR δと結合して PPAR δを活性化する作用を有する物質を、う。

[0015] PPAR aまたは δァゴニストとしては、種々の公知の PPAR aまたは δァゴニストが挙げられる。具体的な PPAR αまたは δァゴ-ストとしては、例えば、 WO2001/00 603、 W099/62872, WO2002/100813, W097/28149, WO2004/02 2551、 WO2001/79197, WO2003/099793, WO2005/105736, WO20 05/105726, WO2005/085235, WO2005/113600, WO2005/10575 4、 WO2005/049606, WO2004/111020, WO2006/055187, WO2006 ,084176、 WO2005/060958, WO2005/097786, WO2004/092117, WO2005/037763, WO2005/030694, WO2005/016335, WO2003/0 74495、 WO2004/058174, JP2003 - 171275A, JP2005 - 179281A, WO 2006/031969, WO2005/097763, WO2004/063165, WO2002/050 048、 WO2005/090966, WO2003/099793, WO2002/076959, WO 20 02/053547, WO2001/00603, W097/28149, WO2004/063184, W 02006/090920, WO2006/059744, WO2006/041197, WO2003/03 3493、 WO2003/016291 , WO2002/076957, WO2002/046176, WO 2 002/046154、 WO2002/014291, WO2001/079197など【こ記載されて!ヽる物質などが挙げられる。

[0016] PPAR aまたは δァゴニストイ匕合物の具体例としては、 2—（4一（4 クロ口べンゾィル）フエノキシ）— 2—メチルプロピオン酸 1—メチルェチルエステル（fenofibrate; CAS 登録番号 49562- 28- 9)、（（4 クロロー 6—（（2, 3 ジメチルフエ-ル）ァミノ） 2— ピリミジニル）チォ）酢酸 (WY- 14643; CAS登録番号 50892- 23- 4)、（4一（3—（4ーァセチル 3 ヒドロキシ一 2 プロピル）フエノキシ）プロポキシフエノキシ）酢酸（L-165 041; CAS登録番号 79558- 09- 1)、（2—メチルー 4一（（（4ーメチルー 2—（4 （トリフルォロメチル）フエ-ル） 5 チアゾリル)メチル）チォ）フエノキシ）酢酸（GW-50151 6; CAS登録番号 317318-70-0)、（4 (((2—（3 フルオロー 4 (トリフルォロメチル）フエ-ル） 4 メチル 5 チアゾリル)メチル)チォ) 2—メチルフエノキシ）酢酸（G W-0742; CAS登録番号 317318- 84- 6)、 2-メチル -4- ((2R)- 2- (3-メチル -5- (4- (トリフルォロメチル)フエ-ル)- 2-チェ-ル)プロポキシ)-ベンゼンプロピオン酸（CAS登録番号 728038-95-7)、 2-ェチル - 2-(4- (4-(4-(4-メトキシフエ-ル)-ピぺラジン- 1-ィル) -2 -(4-トリフルォロメチル-フエ-ル)-チアゾル -5-ィルメチルスルファ -ル) -フエノキシ）酪酸（GSK-677954;CAS登録番号 884324-15-6)、（4- (3-(3-フエ-ル- 7-プロピル-ベンゾフラン- 6-ィルォキシ) -プロピルスルファ -ル) -フエ-ル)酢酸（L-796449； CAS登録番号 194608- 80- 5)、 2- (4- (3- (1- (2- (2-クロ口- 6-フルォ口-フ -ル)-ェチル )-3- (2 ,3-ジクロロ-フエ-ル)-ウレイド)-プロピル)-フエノキシ )-2-メチルプロピオン酸（GW- 2 433； CAS登録番号 227941-61-9)などが挙げられる。

[0017] 本発明においては、さらに、今までに PPAR aまたは δァゴ-ストであることが知られて、な、物質群から PPAR aまたは δを活性化する物質 (化合物）をスクリーニングにより得て、それらを本発明の有効成分として使用しても良い。 PPAR o;または δ ァゴ-ストは、それぞれ、 PPAR o;または δのリガンド結合ドメイン (LBD)に結合して、当該受容体を活性化し、 PPAR標的遺伝子の転写を調節することが知られている。この性質を利用するとともに、哺乳動物の細胞に内在する他の核受容体の影響を除外するため、 LBDと酵母 (yeast)の GAL4とのキメラ受容体と、レポーター遺伝子とを用いたスクリーニング方法により、新規な PPAR αまたは δァゴ-ストを選択することがでさる。

[0018] 前記スクリーニング方法としては、 PPAR—GAL4アツセィ（参考文献、 T.M. Willso n et al" Journal of Medicinal Chemistry, 2000, vol.43, No.4, p.528— 550および J.M丄 ehmann et al., The Journal of Biological Chemistry, 1995, vol.270, No.22, p.12953— 12956)が例示される。具体的には、

(a) yeastの転写因子GAL4のDNA結合ドメィン（DBD)と PPAR αまたは δの LB Dとの融合タンパク質を発現させるベクターおよび GAL4の DNA結合エレメントとレポーター遺伝子を含むレポータープラスミドを細胞に導入する工程、

(b)前記細胞と試験物質とを接触させ、当該細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量を試験物質を接触させな!/、対照細胞における発現量と比較する工程、および

(c)上記 (b)の比較結果に基づ!/、て、 PPAR aまたは δを活性化する物質を選択する工程

を含む方法が挙げられる。

[0019] 上記方法の工程 (a)において、用いる細胞は GAL4を内在的に発現しない細胞、好ましくは、哺乳動物細胞である。レポーター遺伝子は、検出可能なタンパクまたは酵素をコードする遺伝子であればよぐ例えば、 LUC (ルシフェラーゼ)遺伝子、 SP AP (分泌型胎盤由来アルカリホスファターゼ)遺伝子、 CAT (クロラムフエ-コルァセチルトランスフェラーゼ)遺伝子等が挙げられる。

上記融合タンパク質発現ベクターおよびレポータープラスミドの調製、ならびに当該ベクターおよびプラスミドの細胞への導入は、上記参考文献または自体公知の方法により行うことができる。

[0020] 上記方法の工程 (b)にお、て、試験物質は、 V、かなる公知化合物および新規ィ匕合物であってもよぐ例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるヽは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。

また、工程 (b)では、いわゆるレポーターアツセィにより試験物質の有無による PPA R aまたは δの転写活性を調べる。レポーターアツセィは、用いるレポーター遺伝子に応じて自体公知の方法により行うことができる。

[0021] 上記方法の工程 (c)において、試験物質存在下でのレポーター活性が非存在下でのレポーター活性よりも有意に高い場合、その試験物質は PPAR aまたは δ作動活性を有する化合物と判定され得る。

[0022] 本発明に用いられる PPAR aァゴ-ストのヒト PPAR aに対する活性は、 EC 値と

50 して、 50 μ Μ以下、好ましくは 10 μ Μ以下、さらに好ましくは 5 μ Μ以下である。本発明に用いられる PPAR δァゴ-ストのヒト PPAR δに対する活性は、 EC 値として、 1

50

0 μ Μ以下、好ましくは 1 μ Μ以下、さらに好ましくは 0. 1 μ Μ以下である。 EC 値は

50

、ヒト PPAR αまたは δを用いた PPAR— GAL4アツセィ（T.M. Willson et al , Journa 1 of Medicinal Chemistry, 2000, vol.43, No.4, p.527- 550参照）〖こより、測定した値である。

[0023] 好まし!/、PPAR aまたは δァゴニストとしては、例えば下記一般式 (I)：

[0024] [化 3]

[0025] [式中、

Αは水素原子、炭素数 1〜6のアルキル基を示し、

Bは— CO 、一 NH―、—（CH ) — S―、—（CH ) — O および— O— (CH )

2 n 2 n 2 n O （式中、 nは 1〜3の整数を表す)からなる群力選択されるリンカ一を示し、 Xおよび Yは同一または異なって炭素原子または窒素原子を示し、

Zは酸素原子、硫黄原子または—CH を示し、

2

1 2

Rは水素、ハロゲン原子または炭素数 1〜6のアルキル基を示す]で表される構造を

3

有する化合物、またはその薬理学的に許容される塩が挙げられる。 [0026] 上記一般式 (I)中、 Aで示される「炭素数 1〜6のアルキル基」としては、例えば、メチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、 sec ブチル、 tert ブチル、ペンチノレ、イソペンチル、ネオペンチル、 tert ペンチル、 1ーメチルブチル、 2—メチルブチル、 1, 2—ジメチルプロピル、へキシル、 1ーメチルペンチル、 2—メチルペンチル、 3—メチルペンチル、 4ーメチルペンチル、 1, 1ージメチルブチル、 1, 2 ージメチルブチル、 1, 3 ジメチルブチル、 2, 2 ジメチルブチル、 2, 3 ジメチルブチノレ、 3, 3 ジメチノレブチノレ、 1—ェチノレブチノレ、 2 ェチノレブチノレ、 1—ェチノレ —2—メチルプロピル、 1 , 1, 2 トリメチルプロピル等が挙げられる。該炭素数 1〜6 のアルキル基は、好ましくはイソプロピルである。

[0027] 上記一般式（I)中、 Bで示されるリンカ一は、好ましくは一CO 、一NH 、一CH

2

— S―、 -0- (CH ) — O であり、さらに好ましくは一 CH— S―、 -0- (CH )

2 3 2 2 3

—o—である。

[0028] 上記一般式 (I)中、 Arで示される 5〜6員環である芳香環基としては、フエニル、フリル、チェニル、ピロリル、ォキサゾリル、イソォキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、 1, 2, 3 ォキサジァゾリル、 1, 2, 4 ォキサジァゾリル、 1, 3, 4—ォキサジァゾリル、フラザ-ル、 1, 2, 3 チアジアゾリル、 1, 2, 4 チアジァゾリル、 1, 3, 4 チアジアゾリル、 1, 2, 3 トリァゾリル、 1, 2, 4 トリァゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリダジ -ル、ピリミジ -ル、ピラジュル、トリアジ-ルなどが挙げられる。該芳香環基は、好ましくはフエニルまたはチアゾリルである。

[0029] 上記一般式 (I)中、 Arが有していてもよい置換基としては、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 1〜6のハロアルキル基、炭素数 2〜7のァシル基、炭素数 1〜6のアルキル基または炭素数 1〜6のハロアルキル基を有していてもよいフエニル基が挙げられる。該置換基は、好ましくは塩素原子、ヒドロキシ基、メチル基、ァセチル基、 4 トリフルォロメチルフエ-ル基、 3—フルオロー 4ーメチルフ工-ル基である。

[0030] 上記一般式 (I)中、 Rおよび Rで示される「炭素数 1〜6のアルキル基」としては、例

1 2

えば、メチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、 sec ブチル、 t ert—ブチノレ、ペンチノレ、イソペンチノレ、ネオペンチノレ、 tert ペンチノレ、 1ーメチノレブチル、 2—メチルブチル、 1, 2—ジメチルプロピル、へキシル、 1ーメチルペンチル、 2—メチルペンチル、 3—メチルペンチル、 4ーメチルペンチル、 1, 1ージメチルブチル、 1, 2—ジメチルブチル、 1, 3—ジメチルブチル、 2, 2—ジメチルブチル、 2, 3 —ジメチノレブチノレ、 3, 3—ジメチノレブチノレ、 1—ェチノレブチノレ、 2—ェチノレブチノレ、 1 —ェチル一 2—メチルプロピル、 1, 1, 2—トリメチルプロピル等が挙げられる。該炭素数 1〜6のアルキル基は、好ましくはメチルである。

[0031] 上記一般式 (I)中、 Rで示される「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩

3

素原子、臭素原子等が挙げられる。該ハロゲン原子は、好ましくは塩素原子である。

[0032] 上記一般式 (I)中、 Rで示される「炭素数 1〜6のアルキル基」としては、例えば、メ

3

チル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、 sec—ブチル、 tert—ブチル、ペンチノレ、イソペンチル、ネオペンチル、 tert—ペンチル、 1ーメチルブチル、 2—メチルブチル、 1, 2—ジメチルプロピル、へキシル、 1ーメチルペンチル、 2—メチルペンチル、 3—メチルペンチル、 4ーメチルペンチル、 1, 1ージメチルブチル、 1, 2 ージメチルブチル、 1, 3—ジメチルブチル、 2, 2—ジメチルブチル、 2, 3—ジメチルブチノレ、 3, 3—ジメチノレブチノレ、 1—ェチノレブチノレ、 2—ェチノレブチノレ、 1—ェチノレ —2—メチルプロピル、 1 , 1, 2—トリメチルプロピル等が挙げられる。該炭素数 1〜6 のアルキル基は、好ましくはメチルである。

[0033] 一般式 (I)で表される化合物の製薬学的に許容される塩としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸;ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シユウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、メタンスルホン酸、ェタンスルホン酸等の有機酸；ァスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸等との酸付加塩などが挙げられる。また、これらの塩には、その溶媒和物も含まれる。一般式（ I)で表される化合物には不斉炭素原子や二重結合が存在していてもよぐそのような化合物については、光学異性体、幾何異性体が存在することがある。これらの異性体も本発明の範囲内に包含され、自体公知の方法によって単離、精製できる。本発明においては、それらの各異性体の混合物、単離されたものいずれでも使用することができる。

[0034] 本発明にお!/、て、一般式 (I)で表される化合物の中で、好まし!/、PPAR aァゴニストとしては、 2— (4— (4 クロ口べンゾィル）フエノキシ） 2—メチルプロピオン酸 1— メチルェチルエステル (fenofibrate; CAS登録番号 49562-28-9)、（（4 クロ口 6— ( (2, 3 ジメチルフエ-ル）ァミノ） 2 ピリミジ -ル）チォ）酢酸 (WY- 14643; CAS 登録番号 50892-23-4)などが挙げられる。また、好ましい PPAR δァゴ-ストとしては、 4— (3- (4 ァセチルー 3 ヒドロキシ一 2 プロピル）フエノキシ）プロポキシフエノキシ酢酸（L-165041; CAS登録番号 79558-09-1)、（2—メチルー 4一（（（4 メチル - 2- (4- (トリフルォロメチル）フエ-ル） 5—チアゾリル)メチル）チォ）フエノキシ）酢酸（GW- 501516; CAS登録番号 317318-70-0)、（4 (((2—（3 フルオロー 4一（トリフルォロメチル)フエニル） 4 メチル 5 チアゾリル)メチル)チォ) 2 メチルフエノキシ）酢酸（GW-0742; CAS登録番号 317318-84-6)などが挙げられる。

[0035] 好ま、 δァゴ-ストとしては、例えば下記一般式 (II)：

[0036] [化 4]

(Π) [式中、

Aは水素原子または炭素数 1〜6のアルキル基を示し、

Bは—（CH ) — S および— O— (CH ) -0- (式中、 nは 1

2 n 2 n 〜3の整数を表す）からなる群カゝら選択されるリンカ一を示し、

Zは酸素原子、硫黄原子または—CH を示し、

2

1 2

3

で表される化合物、またはそれらの薬理学的に許容される塩が挙げられる。

[0037] 上記一般式 (II)中、 Aで示される「炭素数 1〜6のアルキル基」としては、例えば、メチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、 sec ブチル、 tert ブチル、ペンチノレ、イソペンチル、ネオペンチル、 tert ペンチル、 1ーメチルブチル、 2—メチルブチル、 1, 2—ジメチルプロピル、へキシル、 1ーメチルペンチル、 2—メチルペンチル、 3—メチルペンチル、 4ーメチルペンチル、 1, 1ージメチルブチル、 1, 2 ージメチルブチル、 1, 3 ジメチルブチル、 2, 2 ジメチルブチル、 2, 3 ジメチルブチノレ、 3, 3 ジメチノレブチノレ、 1—ェチノレブチノレ、 2 ェチノレブチノレ、 1—ェチノレ —2—メチルプロピル、 1, 1, 2—トリメチルプロピル等が挙げられる。

[0038] 上記一般式（II)中、 Bで示されるリンカ一は、好ましくは— CH— S―、— O— (CH

2 2

) —o—である。

3

[0039] 上記一般式 (II)中、 Arで示される 5〜6員環である芳香環基としては、フエ-ル、フリル、チェニル、ピロリル、ォキサゾリル、イソォキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、 1, 2, 3 ォキサジァゾリル、 1, 2, 4 ォキサジァゾリル、 1, 3, 4—ォキサジァゾリル、フラザ-ル、 1, 2, 3 チアジアゾリル、 1, 2, 4 チアジァゾリル、 1, 3, 4 チアジアゾリル、 1, 2, 3 トリァゾリル、 1, 2, 4 トリァゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリダジ -ル、ピリミジ -ル、ピラジュル、トリアジ-ルなどが挙げられる。該芳香環基は、好ましくはフエニルまたはチアゾリルである。

[0040] 上記一般式（II)中、 Arが有していてもよい置換基としては、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 1〜6のハロアルキル基、炭素数 2〜7のァシル基、炭素数 1〜6のアルキル基または炭素数 1〜6のハロアルキル基を有していてもよいフエニル基が挙げられる。該置換基は、好ましくは塩素原子、ヒドロキシ基、メチル基、ァセチル基、 4 トリフルォロメチルフエ-ル基、 3—フルオロー 4ーメチルフ工-ル基である。

[0041] 上記一般式 (II)中、 Rおよび Rで示される「炭素数 1〜6のアルキル基」としては、

1 2

例えば、メチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、 sec ブチル、 tert—ブチノレ、ペンチノレ、イソペンチノレ、ネオペンチノレ、 tert ペンチノレ、 1ーメチルブチル、 2—メチルブチル、 1, 2—ジメチルプロピル、へキシル、 1 メチルペンチル、 2—メチルペンチル、 3—メチルペンチル、 4ーメチルペンチル、 1, 1ージメチルブチル、 1, 2 ジメチルブチル、 1, 3 ジメチルブチル、 2, 2 ジメチルブチル、 2, 3 ジメチノレブチノレ、 3 , 3 ジメチノレブチノレ、 1 ェチノレブチノレ、 2 ェチノレブチノレ、 1—ェチル 2—メチルプロピル、 1, 1, 2—トリメチルプロピル等が挙げられる。該炭素数 1〜6のアルキル基は、好ましくはメチルである。

[0042] 上記一般式 (II)中、 Rで示される「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩

3

[0043] 上記一般式 (II)中、 Rで示される「炭素数 1〜6のアルキル基」としては、例えば、メ

3

チル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、 sec ブチル、 tert ブチル、ペンチノレ、イソペンチル、ネオペンチル、 tert ペンチル、 1ーメチルブチル、

2—メチルブチル、 1, 2—ジメチルプロピル、へキシル、 1ーメチルペンチル、 2—メチルペンチル、 3—メチルペンチル、 4ーメチルペンチル、 1, 1ージメチルブチル、 1, 2 ージメチルブチル、 1, 3 ジメチルブチル、 2, 2 ジメチルブチル、 2, 3 ジメチルブチノレ、 3, 3 ジメチノレブチノレ、 1—ェチノレブチノレ、 2 ェチノレブチノレ、 1—ェチノレ —2—メチルプロピル、 1, 1, 2 トリメチルプロピル等が挙げられる。該炭素数 1〜6 のアルキル基は、好ましくはメチルである。

[0044] 一般式 (II)で表される化合物の製薬学的に許容される塩としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸;ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シユウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、メタンスルホン酸、ェタンスルホン酸等の有機酸；ァスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸等との酸付加塩などが挙げられる。また、これらの塩には、その溶媒和物も含まれる。一般式（ II)で表される化合物には不斉炭素原子や二重結合が存在していてもよぐそのような化合物については、光学異性体、幾何異性体が存在することがある。これらの異性体も本発明の範囲内に包含され、自体公知の方法によって単離、精製できる。本発明においては、それらの各異性体の混合物、単離されたものいずれでも使用することができる。

[0045] 本発明にお!/、て、一般式（II)で表される化合物の中で、好まし、PPAR δァゴニストとしては、 4— (3— (2 プロピル一 3 ヒドロキシ一 4 ァセチル）フエノキシ）プロピルォキシフヱノキシ酢酸（L-165041; CAS登録番号 79558-09-1)、（2—メチルー 4 一（（（4ーメチルー 2—（4 （トリフルォロメチル）フエ-ル） 5 チアゾリル)メチル）チォ）フノキシ）酢酸（GW- 501516; CAS登録番号 317318-70-0)、（4 (((2—（3 フルォロ 4 （トリフルォロメチル)フエ-ル） 4 メチル 5—チアゾリル)メチル）チォ) 2—メチルフエノキシ）酢酸（GW-0742; CAS登録番号 317318-84-6)などが挙げられる。

[0046] 本発明の促進剤において、 PPAR aまたは δァゴニストの含有量は、通常 0. 000 001〜1重量⁰/₀、好ましく【ま0. 00001〜1重量⁰ /₀、最も好ましく ίま 0. 0001〜0. 1重量％である。

[0047] 本発明の促進剤は、上記有効成分に加え、任意の担体を含むことができる。かかる担体としては、例えば、溶媒 (例えば、水、アルコールなど）、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クェン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸、ィプシロンアミノカプロン酸など）、保存剤（例えば、塩ィ匕ベンザルコ- ゥム、塩化べンゼトニゥム、ダルコン酸クロルへキシジン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラォキシ安息香酸エステル類、ェデト酸ナトリゥム、ホウ酸など）、等張化剤 (例えば、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、グリセリン、マン二トール、ソルビトール、ホウ酸、ブドウ糖、プロピレングリコールなど）などが挙げられる。

[0048] 本発明の促進剤は、医薬または試験用試薬などとして、インビボまたはインビトロにおいて用いられ得る。

本発明の促進剤を試験用試薬として使用する場合、生理学'生物化学分野における試験用試薬として、様々な態様で利用可能である。

[0049] 医薬として用いる場合、本発明の促進剤は、マイボーム腺上皮細胞の増殖を促進するため、マイボーム腺上皮細胞の損傷または萎縮を伴う疾患、およびマイボーム腺上皮細胞の機能が低下することによって生じる疾患の治療剤として有用である。該疾患としてはマイボーム腺機能不全などが挙げられる。さらに、マイボーム腺上皮細胞は、涙液中の脂質成分を分泌し、この脂質は涙液の蒸発を防ぎ、涙液層を安定化するものであるため、本発明の治療剤は涙液中の脂質異常 (分泌量減少、成分変化)を伴う疾患に対して有用である。該疾患としては、涙液蒸発亢進型ドライアイが挙げられる。また、本発明の促進剤は、ドライアイ、角膜潰瘍、点状表層角膜症、角膜上皮糜爛などの治療にも有用である。 [0050] また、本発明の促進剤は、角膜上皮細胞の増殖を促進するため、角膜上皮細胞の損傷 (すなわち、創傷または欠損)を伴う疾患の治療剤としても有用である。本発明の促進剤は、角膜上皮障害、具体的には、シエーダレン症候群、ステイーブンス 'ジョンソン症候群、眼球乾燥症候群 (ドライアイ)等の内因性疾患に伴う角膜上皮障害;術後、薬剤性、外傷、コンタ外レンズ装用等における外因性疾患に伴う角膜上皮障害；角膜潰瘍、春季カタルやアトピー性角結膜炎等の角膜病変を伴う眼アレルギー性疾患に伴う角膜上皮障害の治療剤として有用である。本発明の促進剤は、点状表層角膜症、角膜上皮糜爛の治療にも有用である。さらに、本発明の促進剤は、角膜創傷治癒促進剤としても有用である。

[0051] さらに、本発明の促進剤は、角膜上皮細胞増殖促進作用とマイボーム腺上皮細胞増殖作用を併せ持つことにより、角膜組織に直接作用する効果とマイボーム腺細胞に働くことにより涙液の機能を改善するという効果を発揮するため、特に涙液蒸発亢進型ドライアイの治療剤として非常に有用である。

[0052] 本発明の治療剤において、 PPAR aまたは δァゴニストの含有量は、通常 0. 000 001〜1重量⁰/₀、好ましく【ま0. 00001〜1重量⁰ /₀、最も好ましく ίま 0. 0001〜0. 1重量％である。

[0053] 本発明の促進剤または治療剤の投与対象としては、哺乳動物 (例えば、ヒト、マウス

、ラット、ノ、ムスター、ゥサギ、ネコ、ィヌ、ゥシ、ヒッジ、サル等）が挙げられる。

[0054] 本発明の治療剤は、点眼剤、貼付剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、経口剤等の剤形で用いられ得、上記有効成分に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。

[0055] 本発明の治療剤は、上述の治療効果を奏する限りその投与経路は特に限定されないが、好ましくは眼局所投与される。眼局所投与用剤形には、例えば、点眼剤や眼軟膏剤が挙げられる。

例えば、本発明の治療剤を点眼剤または眼軟膏剤として用いる場合、安定剤 (例えば、亜硫酸水素ナトリウム、チォ硫酸ナトリウム、ェデト酸ナトリウム、クェン酸ナトリウム、ァスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエンなど）、溶解補助剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）、懸濁化剤（例えば、ポリビュルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、乳化剤（例えば、ポリビュルピロリドン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート 80など）、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クェン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸、ィプシロンアミノカプロン酸など）、粘稠剤（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシェチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの水溶性セルロース誘導体、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシビュルポリマ一、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、マクロゴールなど）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニゥム、塩化べンゼトニゥム、ダルコン酸クロルへキシジン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラォキシ安息香酸エステル類、ェデト酸ナトリウム、ホウ酸など)、等張化剤 (例えば、塩ィ匕ナトリウム、塩化力リウム、グリセリン、マン-トール、ソルビトール、ホウ酸、ブドウ糖、プロピレングリコールなど）、 pH調整剤 (例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸など）、清涼化剤 (例えば、 1—メントール、 d—カンフル、 d—ボルネオール、ハツ力油など）、軟膏基剤（白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン、植物油 (オリーブ油、椿油、落花生油など）など)などを添加剤としてカ卩えることができる。これら添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途などによって異なるが、添加剤の目的を達成し得る濃度を添加すればよい。

本発明の治療剤を点眼剤または眼軟膏剤とする場合、製剤分野で通常用いられている方法に従って製造すればよぐ例えば第 14改正日本薬局方、製剤総則、点眼剤の項および眼軟膏剤の項に記載された方法に基づき製造することができる。

[0056] 本発明は、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進を必要とする対象に、 PPAR aまたは δァゴニストの有効量を投与することを含む、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進方法を提供する。当該方法は、マイボーム腺機能不全の治療のために行われることが望ましい。

[0057] また、本発明は、角膜上皮細胞の増殖促進を必要とする対象に、 PPAR aまたは

δァゴ-ストの有効量を投与することを含む、角膜上皮細胞の増殖促進方法を提供する。当該方法は、角膜上皮障害の治療のために行われることが望ましい。

[0058] また、本発明は、涙液蒸発亢進型ドライアイを患う患者に、 PPAR aまたは δァゴ- ストの有効量を投与することを含む、涙液蒸発亢進型ドライアイの治療方法を提供する。

[0059] PPAR aまたは δァゴニストの有効量は、化合物の種類、投与対象の年齢、体重、状態、治療目的等により一概に規定できないが、本発明の促進剤または治療剤をヒトに投与する場合には、 PPAR αまたは δァゴ-ストの濃度として通常 0. 000001- 1 重量⁰ /₀、好ましくは 0. 00001〜1重量⁰ /₀、最も好ましくは 0. 0001〜0. 1重量⁰ /₀の Ρ PAR o;または δァゴ-ストを含む溶液を、 1日 1回〜 8回、 1回に片眼あたり 1〜2滴、すなわち、 1回当り約 50〜200 の量が例示され、力かる濃度と容量の範囲内の溶液に含まれる PPAR aまたは δァゴ-ストの量を有効量として例示することができる。

実施例

[0060] 以下、本発明を詳細に説明するため試験例を挙げる力本発明はこれらによってなんら限定されるものではな、。

[0061] (試験例 1)

角膜上皮細胞を用いた細胞数の増加に対する PPARァゴニストの効果

1. itm

雄性日本白色種ゥサギ (北山ラベス)を用いた。実験動物の使用にあたっては、動物を用いる生物医学研究に関する原則（International Guiding Principles for Biomedi cal Research involving Animals)に従った。

2.角膜十.皮細胞の調製

角膜上皮細胞はゥサギ眼球力も調製した。摘出した眼球力も角膜を切り出して Dulb ecco ' s phosphate buffered saline (D— PBS; Invitrogen)中に保し、これをクリーンべンチ内に移した。以下の細胞調製操作は全て無菌的に行なった。

摘出角膜片を 1%の penicillin- streptomycin (Invitrogen)を添カ卩した D- PBS中で 3回洗净し、 minimum essential medium (MEM; Invitrogen)中に移した。 MEM中に浸漬した角膜片の角膜内皮細胞およびデスメ膜を眼科手術用ナイフ (Alcon)で剥離し、剥離後の角膜片 (角膜実質および角膜上皮）を 2.4U/mLとなるように dispase II (Roche Diagnostics)を添カ卩した MEMに移した。これを 37°Cで 1時間加温し、その後、 dispase II処理した角膜片を MEM中に移した。 MEM中に浸漬した角膜片の角膜上皮を眼科用手術ナイフで剥離し、角膜片残渣 (角膜実質)を MEM力も取り除いた。剥離した角膜上皮細胞は、これを含む MEMごと 50mLの遠沈管に回収し、室温， 1 ,500回転， 5分間の遠心分離に供して上清を廃棄することにより、角膜上皮細胞層を得た。角膜上皮細胞層に lmLの trypsin-EDTA (Invitrogen)を添カ卩してよく混合した後、 37°Cで 5分間加温して細胞間の接着を乖離させた。これに 10%の fetal bovine serum (FBS; Invitr ogen)を含む MEMを 9mL添加して酵素反応を停止させ、再度、室温， 1 ,500回転， 5分間の遠心分離に供して角膜上皮細胞層を得た。得られた角膜上皮細胞層に lmLの正常ゥサギ角膜上皮細胞増殖用無血清液体培地 (RCGM2;クラボウ）を添加して細胞を懸濁させ、 9mLの RCGM2を添カ卩した直径 10cmの細胞培養用培養皿（IWAKI)中に播種した。播種細胞は 37°C, 5% CO , 95% air, 100% humidityに設定した培養器（S

2

ANYO)内で培養した。培養液は試験当日まで 48時間ごとに新しいものに交換した。

[0062] 3.被,験物皙: よび調製方法

被験物質として下記の化合物を使用した。

PPAR aァゴ-スト： WY- 14643 (Calbiochem)および fenofibrate (Sigma- Aldrich) PPAR δァゴ-スト： L- 165041 (Sigma- Aldrich)

それぞれの被験物質は、培養液中での最終濃度の 200倍濃度になるようにエタノール (和光純薬）に溶解し、使用直前まで- 80°Cで保存した。

なお、各被験物質による細胞増殖促進効果の検討には、 RCGM2からこれに添付されたマウス由来上皮成長因子 (mEGF)を除、た培養液を基礎培地として用い、一方、細胞増殖促進効果確認のための陽性対照として、 RCGM2調製プロトコルの指示どおりに mEGFを添カ卩した培地（基礎培地 + lOng/mL mEGF)を用いた。

[0063] 4.試験方法

1)培養皿のコラーゲン処理

細胞増殖促進試験のための培養皿として 96穴組織培養用培養皿 (Corning)を用いた。試験の前日、培養皿の各穴に 0.01%の I型コラーゲン (新田ゼラチン）を 50 Lずつ分注して試験直前まで 4°Cでコーティングを行なった。試験当日、 I型コラーゲン溶液を除去した後、 D-PBSを用いて 3度、培養皿底面を洗浄し、これをコラーゲン処理培養皿として試験に用いた。

2)細胞培養および被験物質の添カロ

試験には、直径 10cmの培養皿でサブコンフルェントになるまで培養したゥサギ角膜上皮細胞を用いた。培養液を除去した後、培養皿底面を D-PBSを用いて 2度洗浄し、これに lmLの trypsin-EDTAを添カ卩して 37°Cで 5分間加温することにより、細胞を培養皿底面から剥離させた。加温後、培養皿に 10%の FBSを含む MEMを 9mL添カ卩して酵素反応を停止させた後、室温， 1,500回転， 5分間の遠心分離に供して角膜上皮細胞層を得た。得られた細胞に対し、その細胞濃度が 2 X 10⁵細胞 ZmLとなるように適量の RCGM2を添カ卩して細胞を懸濁させた。この細胞懸濁液を、コラーゲン処理した 9 6穴組織培養用培養皿の底面面積 (0.32 cm²)あたりの細胞数力 10⁴細胞 Zcm²となるよう、各穴に 64 Lずつ分注した。細胞播種完了後、培養皿を 37°C, 5% CO , 95%

2 air, 100% humidityに設定した培養器内に移し、 24時間培養した。細胞播種の 24時間後、培養液を廃棄し、新たに培養皿の各穴に下記の培養液を 100 Lずつ分注した。

〔1〕基礎培地のみ (無添加群）

〔2〕基礎培地 +mEGF (最終濃度： lOng/mL；陽性対照群）

〔3〕基礎培地 +WY- 14643 (最終濃度： 0.1 μ Μおよび 1 μ Μ)

〔4〕基礎培地 +fenofibrate (最終濃度： 1 μ Μおよび 10 μ Μ)

〔5〕基礎培地 + L- 165041 (最終濃度： 0.1 μ Μおよび 1 μ Μ)

なお、全ての培養液中のエタノール濃度を 0.5%に統一させるため、培養液〔1〕および〔2〕に対してはそれぞれ lmLあたり 5 μ Lのエタノールを添カ卩した。

3)細胞数測定

培養液交換の 48時間後、各穴の培養上清を除去し、ついで各穴に 10%の Cell Cou nting Kit-8 (DOJINDO)を添カ卩した基礎培地を 100 /z Lずつ分注した。分注後、培養皿を 37°C, 5% CO , 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に移して 2時間加温し

2

た。 2時間の加温後、マイクロプレートリーダー（大日本製薬）を用いて 450nmの吸光度を測定し、これを細胞数増加の指標とした。

[0064] 5.統計学的解析

無添加群の吸光度の平均値を 100%としたときの、無添加群，各被験物質添加群および陽性対照群の各群の値を算出し、無添加群と各被験物質添加群および陽性対照群との比較を Dunnettの多重比較検定法（両側）を用いて行なった。検定の結果、危険率 5%未満の場合を有意と判定した。

[0065] 6.試験結果

各群の細胞数増加効果を表 1に示した。無添加群の細胞増殖を 100%とした場合、全ての被験物質添加群および陽性対照群での細胞増殖は無添加群よりも有意 (Pく 0 .01)に高く、細胞増殖が亢進していることが示された。この試験結果より、 PPAR a T ゴニストおよび PPAR δァゴ-ストは角膜上皮細胞の細胞数を増カロさせることが明らかとなった。

[0066] [表 1]

[0067] 培養ゥサギ角膜上皮細胞に PPAR aァゴ-ストまたは PPAR δァゴ-ストあるいは mE GF (陽性対照）を添加した際の細胞数の変化を、無添加群の平均値を 100%とした際の値として示している (平均値士標準偏差， N=5)。表中の **は無添加群に対する有意差 (Pく 0.01)を示す。

[0068] (試験例 2) 角膜上皮細胞を用いた細胞数の増加に対する PPAR δァゴニストの効果

1. itm

雄性日本白色種ゥサギ (体重約 1.5kg,北山ラベス)を用いた。実験動物の使用にあたっては、動物を用いる生物医学研究に関する原則（International Guiding Princip les for Biomedical Research involving Animalsノ【こ従った。

2.角膜十.皮細胞の調製

ゥサギ角膜上皮細胞は (試験例 1)と同様の手法を用いて調製した。

[0069] 3.ネ皮,験物皙および調製方法

被験物質として下記の化合物を使用した。

PPAR δァゴ-スト： L- 165041 (Sigma- Aldrich)および GW- 501516 (Alexis)

[0070] 4.試験方法

1)培養皿のコラーゲン処理

培養皿のコラーゲン処理は (試験例 1)と同様の手法を用いて施した。

2)細胞培養および被験物質の添カロ

試験には、直径 10cmの培養皿でサブコンフルェントになるまで培養したゥサギ角膜上皮細胞を用いた。培養液を除去した後、培養皿底面を D-PBSを用いて 2度洗浄し、これに lmLの trypsin-EDTAを添カ卩して 37°Cで 5分間加温することにより、細胞を培養皿底面から剥離させた。加温後、培養皿に 10%の FBSを含む MEMを 9mL添カ卩して酵素反応を停止させた後、室温， 1,500回転， 5分間の遠心分離に供して角膜上皮細胞層を得た。得られた細胞に対し、その細胞濃度が 1 X 10⁵細胞 ZmLとなるように適量の RCGM2を添カ卩して細胞を懸濁させた。この細胞懸濁液を、コラーゲン処理した 9 6穴組織培養用培養皿の底面面積 (0.32 cm²)あたりの細胞数が 2 X 10⁴細胞 Zcm²となるよう、各穴に 64 Lずつ分注した。細胞播種完了後、培養皿を 37°C, 5% CO , 95%

〔1〕基礎培地のみ (無添加群）

〔2〕基礎培地 +mEGF (最終濃度： lOng/mL；陽性対照群）

〔3〕基礎培地 + L- 165041 (最終濃度： 0.1 μ Μおよび 1 μ Μ)

〔4〕基礎培地 + GW- 501516 (最終濃度： 0.01 Μおよび 0.1 /ζ Μ)

3)細胞数測定

被験物質等を含む培養液交換から 48時間ごとに各穴の培養上清を除去し、新たに調製した上記の培養液を各ゥエルに 100 Lずつ分注した。被験物質等を含む培養液への初回の交換から 120時間後、各穴の培養上清を除去し、ついで各穴に 10%の Cell Counting Kit-8 (DOJINDO)を添カ卩した基礎培地を 100 /z Lずつ分注した。分注後、培養皿を 37°C, 5% CO , 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に移して 2時

2

間加温した。 2時間の加温後、マイクロプレートリーダー（大日本製薬)を用いて 450η mの吸光度を測定し、これを細胞数増加の指標とした。

[0071] 5. m^ ^

[0072] 6.試験結果

各群の細胞数増加効果を表 2に示した。無添加群の細胞増殖を 100%とした場合、全ての被験物質添加群および陽性対照群での細胞増殖は無添加群よりも有意 (Pく 0 .01)に高ぐ細胞増殖が亢進していることが示された。この試験結果より、 PPAR δ作動作用を有する化合物は角膜上皮細胞の細胞数を増カロさせることが明らかとなった [0073] [表 2]

[0074] 培養ゥサギ角膜上皮細胞に PPAR δァゴ-ストあるいは mEGF (陽性対照）を添加した際の細胞数の変化を、無添加群の平均値を 100%とした際の値として示して、る (平均値士標準偏差， N=5)。表中の **は無添加群に対する有意差 (pく 0.01)を示す。

[0075] (試験例 3)

マイボーム腺上皮細胞を用いた細胞数の増加に対する PPARァゴニストの効果

1. itm

雌性力-クイザル (環境バイリス）を用いた。実験動物の使用にあたっては、動物を用いる生物医学研究に関する原則（International Guiding Principles for Biomedical Research involving Animals)に従った。

2.マイボーム腺卜.皮細胞の調製

マイボーム腺上皮細胞はサル眼瞼力も調製した。眼瞼を摘出して Dulbecco' s phos phate buffered saline (D- PBS; Invitrogen)中に保存し、これをクリーンベンチ内に移した。以下の細胞調製操作は全て無菌的に行なった。

摘出眼瞼を 80%のエタノール中に 30秒間浸漬した後、 1%の penicillin-streptomycin (I nvitrogen)を添カロした D- PBS中で 3回洗净し、 minimum essential medium (MEM; Invit rogen)中に移した。実体顕微鏡下で眼瞼のマイボーム腺組織を取り囲む脂肪組織および筋糸且織を除去し、これを、 0.475U/mL collagenase A (Roche Diagnostics)および 2.4U/mL dispasell (Roche Diagnostics)を含む MEM中に移して 37°Cで終夜加温した。加温終了後、酵素処理した組織を再度実体顕微鏡下におき、睫毛および眼瞼結合組織を除去してマイボーム腺組織を単離した。単離した腺組織に lmLの trypsin- EDTA (Invitrogen)を添カ卩して 37°Cで 5分間加温した。加温後、これに 10%の FBSを含む MEMを 9mL加えて酵素反応を停止させ、ついで、 10mLのピペットを用いて 5回、さらに、 21Gの注射針を付けた注射筒で 5回、吸引排出を繰り返して組織構成細胞を分散させた。細胞分散液は、 100 μ m、ついで、 40 μ mのナイロンフィルター（Cell Strain er; Falcon)に供し、これに含まれる酵素処理できな力つた細胞塊などを除去した。フィルターを通過させた細胞懸濁液は 50mLの遠沈管に回収し、室温， 1 ,500回転， 5分間の遠心分離に供した。遠心分離により得た目的細胞を含む細胞層に、 0.5%の bovi ne serum albumin (BSA; Sigma- Aldrich)を含む D- PBSを 80 L添カ卩して細胞を十分に懸濁させた後、これに、 20 μ Lの Anti- Fibroblast Microbeads (Militenyi Biotec)を加えて室温で 30分間静置した。抗体との反応終了後、これに 0.5%の BSAを含む D- PB Sを 2mL添加して、再度、室温， 1 ,500回転， 5分間の遠心分離に供した。遠心分離により得た目的細胞を含む細胞層に、 0.5%の BSAを含む D-PBSを lmL添カ卩して細胞を十分に懸濁させ、あらかじめ、カラム洗浄液（2mMの EDTA (同仁化学）および 0.5%の BSAを含む D- PBS)を用いて平衡化しておいた LD column (Militenyi Biotec)に、これを滴下した。ついで、 2mLのカラム洗浄液を LD columnに滴下した。細胞懸濁液滴下直後からカラム洗浄液滴下終了までの間、カラムに吸着しな力つた抗体非標識の目的細胞 (非線維芽細胞）を 50mL遠沈管に回収した。遠沈管に回収した細胞を、もう一度、室温， 1 ,500回転， 5分間の遠心分離に供して上清を除去した。この沈渣に、 1 mLの Defined Keratinocyte- Serum Free Medium (DK-SFM; Invitrogen)を添カ卩して細胞を懸濁させ、マイボーム腺上皮細胞懸濁液を調製した。調製した細胞は、予め I型コラーゲン溶液 (新田ゼラチン)でコーティングを済ませ、 3mLの DK-SFMを添カロしておいた直径 3.5cmの細胞培養用培養皿（IWAKI)に播種した。播種細胞は 37°C, 5% C 0 , 95% air, 100% humidityに設定した培養器（SANYO)内で培養し、培養液は試験

2

当日まで 48時間ごとに新、ものに交換した。

3.ネ皮,験物皙および調製方法

被験物質として下記の化合物を使用した。

PPAR ァゴ-スト： fenofibrate (Sigma- Aldrich) PPAR δァゴ-スト： L- 165041 (Sigma- Aldrich)

PPAR yァゴ-スト： troglitazone (Calbiochem)

なお、各被験物質による細胞増殖促進効果の検討には、 DK-SFM力これに添付された supplementを除いた培養液を基礎培地として用い、一方、細胞増殖促進効果確認のための陽性対照として、 DK-SFM調製プロトコルの指示どおりに supplementを添カ卩した培地（基礎培地 + supplement)を用、た。

4.試験方法

1)培養皿のコラーゲン処理

2)細胞培養および被験物質の添カロ

試験には、直径 3.5cmの培養皿でサブコンフルェントになるまで培養し、液体窒素中で凍結保存しておいたサルマイボーム腺上皮細胞を用いた。セルバンカー（日本全薬工業）に懸濁して凍結保存しておいた細胞を解凍した後、 50mL遠沈管に移して 10倍量の DK-SFMを添カ卩した。室温， 1,500回転， 5分間の遠心分離に供して細胞層を回収した後、得られた細胞濃度が 3 X 10⁶細胞 ZmLとなるように適量の DK-SFMを添加して細胞を懸濁させた。この細胞懸濁液を、コラーゲン処理した 96穴組織培養用培養皿の底面面積 (0.32 cm²)あたりの細胞数が 6 X 10⁴細胞/ cm²となるよう、各穴に 64 Lずつ分注した。細胞播種完了後、培養皿を 37°C, 5% CO , 95% air, 100% hu

2

midityに設定した培養器内に移し、 24時間培養した。細胞播種の 24時間後、培養液を廃棄し、新たに培養皿の各穴に下記の培養液を 100 Lずつ分注した。

〔1〕基礎培地のみ (無添加群）

〔 2〕基礎培地 + supplement (陽性対照群）〔3〕基礎培地 +fenofibrate (最終濃度： 1 μ Μおよび 10 μ Μ)

〔4〕基礎培地 + L- 165041 (最終濃度： 0.1 μ Μおよび 1 μ Μ)

〔5〕基礎培地 +troglitazone (最終濃度： 0.1 μ Μおよび 1 μ Μ)

3)細胞数測定

初回の培養液交換の 48時間後、培養液を新たに調製した上記〔1〕〜〔4〕の培養液に交換した。そのさらに 48時間後、各穴の培養上清を除去し、ついで各穴に 10%の C ell Counting Kit- 8 (DOJINDO)を添カ卩した DK- SFMを 100 /z Lずつ分注した。分注後、培養皿を 37°C, 5% CO , 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に移して 2時間

2

加温した。 2時間の加温後、マイクロプレートリーダー（大日本製薬)を用いて 450應の吸光度を測定し、これを細胞数増加の指標とした。

[0078] 5. m^ ^

[0079] 6.試,験結果

各群の細胞数増加効果を表 3に示した。無添加群の細胞増殖を 100%とした場合、 P PAR aァゴ-ストである fenofibrate添カ卩群および PPAR δァゴ-ストである L- 165041添加群、また、陽性対照群での細胞増殖は無添加群よりも有意 (ρく 0.01)に高ぐ細胞増殖が亢進していることが示された。一方、 PPAR yァゴ-ストである troglitazoneは、細胞増殖促進作用を示さなかった。この試験結果より、 PPAR aァゴ-ストおよび PPA R δァゴ-ストはマイボーム上皮細胞の細胞数を増カロさせることが明ら力となった。

[0080] [表 3] 群細胞増殖 (％) 有意差 (対無添加群）無添加群 100.0 ± 4.7

陽性対照群 (supplement) 131.4 ± 5.7 **

10⁶M fenofibrate 114.5 ± 4.5

10 ⁵M fenofibrate 127.8 ± 5.2

10⁷M L-165041 136.1 ± 4.7 *A

10⁶M L-165041 142.8 ± 5.4 **

10"⁷M troglitazone 101.6 ± 4.0

10⁶M troglitazone 99.9 ± 1.9

[0081] 培養サルマイボーム腺上皮細胞に PPAR aァゴェスト、 PPAR δァゴ-ストまたは ΡΡ A_R yァゴニストあるいは supplement (陽性対照）を添加した際の細胞数の変化を、無添加群の平均値を 100%とした際の値として示している (平均値土標準偏差， N=5)。表中の **は無添加群に対する有意差 (Pく 0.01)を示す。

[0082] (試験例 4)

角膜上皮細胞およびマイボーム腺上皮細胞での PPARsの発現

1.使用細胞

ゥサギ角膜上皮細胞は (試験例 1)と同様の方法で調製、培養したものを用いた。サルマイボーム腺上皮細胞は (試験例 3)と同様の方法で調製、培養したものを用いた。ヒト角膜上皮細胞 (クラボウ）は正常ヒト角膜上皮細胞増殖用無血清基礎培地 (EpiL ife-クラボウ）を用いて 37°C, 5% CO， 95% air, 100% humidityに設定した培養器内で

2

培養したものを用いた。

[0083] 2.試験方法

1)細胞からの全 RNAの抽出

TRizol Reagent (Invitrogen)の常法に従って各細胞力の全 RNAを抽出した。

2)抽出 RNAからの cDNA作製

DNA-free (Ambion)の常法に従って抽出した全 RNAの DNase処理を 37°Cで 30分間行ない、ゲノム DNAを除去した。抽出 RNAからの cDNA作製は Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen)の常法に従って行なった。すなわち、 DNase処理した 1 μ gの全 RNAから、ランダムプライマ一 (Invitrogen)を用いてこれらに相補する cDNAを作製した。

3)PPARs遺伝子の増幅（Polymerase Chain Reaction; PCR)

PPARs遺伝子の PCRは Platinum PCR SuperMix (Invitrogen)の常法に従って行なつた。 PPARsプライマーは、既知のヒト，チンパンジー、力-クイザル、ゥシ、マウスなどの配列を参考に、 PCR産物が約 200 bpsとなるように設計した。

PPAR a： GTAGAATCTGCGGGGACAAG (sense) (配列番号 1)

： GTTGTGTGACATCCCGACAG (antisense) (配列番号 2)

PPAR 6： TTCCTTCCAGCAGCTACACA (sense) (配列番号 3)

： GATCGTACGACGGAAGAAGC (antisense) (配列番号 4)

PPAR y： CTCCGTGGATCTCTCCGTAA (sense) (配列番号 5)

： GATGCAGGCTCCACTTTGAT (antisense) (配列番号 6)

PCR反応は、 94°Cで 2分 15秒間反応させた後、 94°Cで 30秒間， 55°Cで 30秒間， 72 °Cで 30秒間の 3段階の反応を 35回繰り返すことで完了させた。 PCRの反応後の試料を 2%のァガロースゲルを用いた電気泳動に供し、ついでゲル内に分離された DNAを SYBR Gold (Molecular Probes)を用いて染色した。染色された DNAを UVトランスィルミネーター上で発光させ、この画像をデジタルデータとして保存した。

3.試,験結果

電気泳動後の染色された DNAのバンドを図 1に示す。本試験の結果、ヒト角膜上皮細胞およびサルマイボーム腺上皮細胞には PPAR a、 PPAR δおよび PPAR yの全てが発現していることが確認された。なお、ゥサギ角膜上皮細胞では PPAR Sの発現のみが確認された。 Bonazziらはゥサギ角膜上皮細胞には PPARsのうち PPAR aおよび P PAR jS (= δ )が発現すると報告しているが（Bonazzi A. et al.， J. Biol. Chem. (2000);

275 (4): 2837-2844)、その報告の中で、彼らは PPAR aの検出に特殊な方法を用いている。試験例 1に示すとおり、 PPAR a作動剤がゥサギ角膜上皮細胞の増殖を促進させることは明らかであるが、 Bonazziらの報告でも特殊な検出方法を用いて PPAR a を検出していることから、ゥサギ角膜上皮細胞での PPAR a発現量は非常に少ないと推測される。

[0085] (試験例 5)

正常ヒト角膜上皮細胞を用いた細胞数の増加に対する PPAR δァゴ-ストの効果正常ヒト角膜上皮細胞 (KURABO)を用いた。

2.被,験および調去

被験物質として下記の化合物を使用した。

PPAR δァゴ-スト： L— 165041 (Sigma— Aldrich) , GW— 501516 (Alexis)

なお、各被験物質による細胞増殖促進効果の検討には、細胞培養液として、 EpiLif e (KURABO)に HCGS増殖添加剤セット（KURABO)に含まれるインスリン、ノヽイドロコ一チゾン、トランスフェリンを添加した培養液 (基礎培地)を用いた。また、細胞増殖促進効果確認のための陽性対照として、基礎培地に HCGS増殖添加剤セット（KURAB

0)に含まれるマウス由来上皮成長因子 (mEGF)を添加した培地 (基礎培地 + lng/m L mEGF)を用いた。

[0086] 3.試験方法

1)細胞培養および被験物質の添カロ

液体窒素中に凍結保存された正常ヒト角膜上皮細胞を解凍し、その細胞数を計数した後、その全量を HCGS増殖添加剤セット (インスリン、マウス由来上皮成長因子、ハイド口コーチゾン、トランスフェリン、ゥシ脳下垂体抽出物）の全てを添カ卩した 4mLの EpiLife (完全培地）中に移してよく懸濁した。この細胞懸濁液を、フイブロネクチンコートマルチウエルプレート（24穴， BECTON DICKINSON)に、細胞数力 ¾ X 10⁴ cells/ 500 μ L/穴となるように播種した (底面面積が 2cm²であるため、 1 X 10⁴ cells/cm²) ₀ 細胞播種完了後、培養皿を 37°C, 5% CO , 95% air, 100% humidityに設定した培養

2

器内で 24時間培養し、ついで培養液を 400 Lの基礎培地に交換した。

さらにその 24時間後、培養液を下記の培養液、各 400 Lに交換した。

〔1〕基礎培地のみ (無添加群）〔2〕基礎培地 + mEGF (最終濃度： Ing/mL；陽性対照群）

〔3〕基礎培地 + L- 165041 (最終濃度： 0.01 μ Μおよび 0.1 μ Μ)

〔4〕基礎培地 + GW- 501516 (最終濃度： 0.001 Μおよび 0.01 /ζ Μ)

2)細胞数測定

被験物質による刺激開始力 24時間後、各穴の培養上清を除去し、ついで各穴に 10%の Cell Counting Kit- 8 (DOJINDO)を添カ卩した基礎培地を 200 μ Lずつ分注した。分注後、培養皿を 37°C, 5% CO , 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に移し

2

て 2時間加温し、反応終了後の上清から各 100 Lを 96穴組織培養用培養皿 (Cornin g)に分取した。 96穴培養皿に移した反応液の 450nmの吸光度をマイクロプレートリーダー (大日本住友製薬)を用いて測定し、これを細胞数増加の指標とした。

[0087] 4.統 t学的解析

無添加群の吸光度の平均値を 100%としたときの、無添加群，各被験物質添加群および陽性対照群の各群の値を算出し、無添加群と各被験物質群間および陽性対照群との比較を Dunnettの多重比較検定法 (片側）を用いて行なった。検定の結果、危険率 5%未満の場合を有意と判定した。

[0088] 5.試,験結果

各群の細胞数増加効果を表 4に示した。無添加群の細胞増殖を 100%とした場合、全ての被験物質添加群 (pく 0.01)および陽性対照群 (pく 0.05)での細胞増殖は無添加群よりも有意に高ぐ細胞増殖が亢進していることが示された。この試験結果より、 P PAR δァゴニストは正常ヒト角膜上皮細胞の細胞数を増カロさせることが明らかとなった

[0089] [表 4] 群細胞増殖 (％) 有意差 (対無添加群）無添加群 100.0 ± 7.9

陽性対照群 (mEGF) 112.1 ± 1.5

10⁸ M L-165041 128.1 ± 5.3 * ft

10- ⁷ M L-165041 127.8 ± 6.0

10⁹ M GW-501516 133.1 ± 3.7

10⁸ M GW-501516 125.7士 2.3 * *

[0090] 培養正常ヒト角膜上皮細胞に PPAR δァゴ-ストあるいは mEGF (陽性対照）を添カロした際の細胞数の変化を、無添加群の平均値を 100%とした際の値として示して V、る（平均値士標準偏差， N=3〜4)。表中の *は無添加群に対する有意差 (pく 0.05)を、また、 **は無添加群に対する有意差 (pく 0.01)を示す。

[0091] (試験例 6)

2. ,験よび言周

被験物質として下記の化合物を使用した。

PPAR δァゴニスト： GW- 501516 (Alexis) , GW-0742 (Sigma- Aldrich)

なお、各被験物質による細胞数増加効果の検討には、細胞培養液として、 EpiLife ( KURABO)に HCGS増殖添加剤セット（KURABO)に含まれるインスリン、ハイドロコーチゾン、トランスフェリンを添加した培養液 (基礎培地）を用いた。

[0092] 3.試験方法

1)細胞培養および被験物質の添カロ

液体窒素中に凍結保存された正常ヒト角膜上皮細胞を解凍し、その細胞数を計数した後、その全量を HCGS増殖添加剤セット (インスリン，マウス由来上皮成長因子、ハイド口コーチゾン、トランスフェリン、ゥシ脳下垂体抽出物）の全てを添カ卩した 4mLの EpiLife (完全培地）中に移してよく懸濁した。この細胞懸濁液を 96穴組織培養用培養皿（Corning)に、細胞数が 1.28 X 10⁴ cells/100 μ L/穴となるように播種した（底面面積が 0.32cm²であるため、 4 X 10⁴ cells/cm²)。

細胞播種完了後、培養皿を 37°C, 5% CO , 95% air, 100% humidityに設定した培養

2

器内で 24時間培養し、ついで培養液を 100 Lの基礎培地（HCGS増殖添加剤のうち、インスリン、ハイド口コーチゾン、トランスフェリンを添カロした EpiLife)に交換した。さらにその 24時間後、培養液を下記の培養液、各 100 Lに交換した。〔1〕基礎培地のみ (無添加群）

〔2〕基礎培地 + GW- 501516 (最終濃度： 0.01 M)

〔3〕基礎培地 + GW- 0742 (最終濃度: 0.01 μ Μ)

なお、全ての培養液中のエタノール濃度を 0.5%に統一させるため、培養液〔1〕に対しては lmLあたり 5 μ Lのエタノールを添カ卩した。

2)細胞数測定

被験物質による刺激開始力 48時間後、各穴の培養上清を除去し、ついで各穴に 1 0%の Cell Counting Kit- 8 (DOJINDO)を添カ卩した基礎培地を 100 μ Lずつ分注した。分注後、培養皿を 37°C, 5% CO , 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に移し

2

て 2時間加温した。各穴の 450nmの吸光度をマイクロプレートリーダー（大日本住友製薬)を用いて測定して、これを細胞数増加の指標とした。

[0093] 4.統 t学的解析

無添加群の吸光度の平均値を 100%としたときの、無添加群、各被験物質添加群の値を算出し、無添加群と各被験物質群間および陽性対照群との比較を Dmrnettの多重比較検定法 (片側)を用いて行なった。検定の結果、危険率 5%未満の場合を有意と判定した。

[0094] 5.試験結果

各群の細胞数増加効果を表 5に示した。無添加群の細胞増殖を 100%とした場合、両被験物質添加群での細胞増殖は無添加群よりも有意に高ぐ細胞増殖が亢進していることが示された (Pく 0.01)。この試験結果より、 PPAR Sァゴニストは正常ヒト角膜上皮細胞の細胞数を増カロさせることが明らかとなった。 [0095] [表 5]

[0096] 培養正常ヒト角膜上皮細胞に PPAR δァゴニストを添加した際の細胞数の変化を、無添加群の平均値を 100%とした際の値として示している (平均値士標準偏差， Ν=4〜 5)。表中の **は無添加群に対する有意差 (ρく 0.01)を示す。

[0097] (試験例 7)

正常ヒト角膜上皮細胞を用いた細胞数の増加に対する PPAR yァゴ-ストの効果正常ヒト角膜上皮細胞 (KURABO)を用いた。被験物質として下記の化合物を使用した。

PPAR γァゴ-スト： troglitazone (Calbiochem)

被験物質は、培養液中での最終濃度の 200倍濃度になるようにエタノール (和光純薬）に溶解し、使用直前まで- 80°Cで保存した。

なお、正常ヒト角膜上皮細胞に対する各被験物質の影響の検討には、細胞培養液として、 EpiLife (KURABO)に HCGS增殖添加剤セット（KURABO)に含まれる添加剤のうちマウス由来上皮増殖因子（mEGF)を除ぐインスリン、ハイド口コーチゾン、トランスフェリンを添加した培養液 (EpiLife基礎培地）を用いた。

[0098] 3.試験方法

1)細胞培養および被験物質の添カロ

正常ヒト角膜上皮細胞

液体窒素中に凍結保存された正常ヒト角膜上皮細胞を解凍し、その細胞数を計数した後、その全量を mEGFを含む全ての HCGS増殖添加剤セットを添カ卩した EpiLife ( 完全培地）中に移してよく懸濁した。この細胞懸濁液を、試験例 1と同様にコラーゲンコート処理を施したマルチウエルプレート（96穴、 Costar)に、細胞数が 1.28 X 10⁴ cell s/64 L/穴となるように播種した (底面面積が 0.32cm²であるため、 4 X 10⁴ cells/cm²) 細胞播種完了後、培養皿を 37°C, 5% CO , 95% air, 100% humidityに設定した培養

2

器内で 24時間培養し、ついで、培養液を下記の被験物質を含む培養液、各 100 L に交換して培養を継続した。

〔1〕 EpiLife基礎培地のみ (無添加群）

〔2〕 EpiLife基礎培地 +troglitazone (最終濃度： 0.1 M)

なお、全ての培養液中のエタノール濃度を 0.5%に統一させるため、培養液〔1〕に対しては lmLあたり 5 μ Lのエタノールを添カ卩した。なお、被験物質添加開始日から細胞数の測定日までの間は、 2日ごとに培養液を上記の被験物質を含むものに交換した

2)細胞数測定

被験物質による刺激開始から 6日後、各穴の培養上清を除去し、ついで各穴に 10% の Cell Counting Kit- 8 (DOJINDO)を添カ卩した EpiLife基礎培地を 100 μ Lずつ分注した。分注後、培養皿を 37°C, 5% CO , 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に

2

移して 2時間加温し、反応終了後の培養皿各ゥエルの吸光度 (450nm)をマイクロプレ一トリーダー（大日本住友製薬)を用いて測定し、これを細胞数の指標とした。

[0099] 4.統 t学的解析

無添加群の吸光度の平均値を 100%としたときの、無添加群、各被験物質添加群の値を算出し、無添加群と各被験物質群間との比較を Dmrnettの多重比較検定法 (片側）を用いて行なった。検定の結果、危険率 5%未満の場合を有意と判定した。

[0100] 5.試験結果

正常ヒト角膜上皮細胞に PPAR yァゴニストが及ぼす影響を表 6に示す。この試験結果より、 PPAR yァゴ-ストは、角膜上皮細胞の細胞数を増加させる効果は認められなかった。

[0101] [表 6] 群細胞増殖 (％)

無添加群 100.0 ± 6.6

10" M troglitazone 74.1 ± 5.1

[0102] 培養正常ヒト角膜上皮細胞に PPAR γァゴニストを添加した際の細胞数を、無添カロ群の平均値を 100%とした際の値として示している (平均値士標準偏差， Ν=3〜4)。表中の **は無添加群に対する有意差 (ρく 0.01)を示す。

[0103] (試験例 8)

マイボーム腺上皮細胞の細胞数の増加に対する PPAR δァゴ-ストの効果

1.サルマイボーム腺卜.皮細胞の調製

サル眼瞼からのマイボーム腺上皮細胞の調製は、試験例 3と同様に行なった。細胞は Defined keratinocyte— ¾erum Free Medium (DK-SFM； Invitrogen,添付され 7こ Suppl ementを調製プロトコルどおりに添加）を用いて、 37°C, 5% CO , 95% air, 100% humidit

2

yに設定した培養器 (SANYO)内で培養し、培養液は細胞がサブコンフルェントに達するまで 48時間ごとに新しいものに交換した。

[0104] 2.被,験物皙および調製方法

被験物質として下記の化合物を使用した。

PPAR δァゴ-スト： L- 165041 (Sigma- Aldrich)および GW- 501516 (Alexis) それぞれの被験物質は、培養液中での最終濃度の 200倍濃度になるようにエタノール (ナカライテスタ）に溶解し、使用直前まで- 80°Cで保存した。

なお、各被験物質による細胞増殖促進効果の検討には、 DK-SFM力これに添付された supplementを除いた培養液を基礎培地として用い、一方、細胞増殖促進効果確認のための陽性対照として、 DK-SFM調製プロトコルの指示どおりに supplementを添加した培養液 (基礎培地 + supplement)を用、た。

[0105] 3.試験方法

1)培養皿のコラーゲン処理

細胞増殖促進試験のための培養皿は、試験例 3と同様に、 I型コラーゲン (新田ゼラチン）を用いてコーティングした。 2)細胞培養および被験物質の添カロ

試験には、サブコンフルェントになるまで培養し、セルバンカー（日本全薬工業）に懸濁して液体窒素中で凍結保存してお!ヽたサルマイボーム腺上皮細胞を用いた。凍結保存してお!、た細胞を解凍した後、 50mL遠沈管に移して 10倍量の DK-SFMを添カロした。室温、 1,500回転、 5分間の遠心分離に供して細胞層を回収した後、得られた細胞濃度が 2 X 10⁶細胞 ZmLとなるように適量の DK-SFMを添カ卩して細胞を懸濁させた。この細胞懸濁液を、コラーゲン処理した 96穴組織培養用培養皿の底面面積 (0.3 2cm²)あたりの細胞数力4 X 10⁴細胞 Zcm²となるよう、各穴に 64 Lずつ分注した。細胞播種完了後、培養皿を 37°C, 5% CO , 95% air, 100% humiditvに設定した培養器内

2

に移し、 24時間培養した。細胞播種の 24時間後、培養液を廃棄し、新たに培養皿の各穴に下記の培養液を 100 Lずつ分注した。

〔1〕基礎培地のみ (無添加群）

〔 2〕基礎培地 + supplement (陽性対照群）

〔3〕基礎培地 + L- 165041 (最終濃度： 0.1 μ Μおよび 1 μ Μ)

〔4〕基礎培地 + GW- 501516 (最終濃度： 0.01 Μおよび 0.1 /ζ Μ)

3)細胞数測定

初回の培養液交換の 48時間後、培養液を新たに調製した上記〔1〕〜〔4〕の培養液に交換した。その 48時間後、もう一度培養液を新たに調製した上記〔1〕〜〔4〕の培養液に交換した。さらにその 48時間後、各穴の培養上清を除去し、ついで各穴に 10%の Cell Counting Kit-8 (DOJINDO)を添カ卩した基礎培地を 100 /z Lずつ分注した。分注後、培養皿を 37°C, 5% CO , 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に移して 2時

2

4.統 f 学的解析

無添加群の吸光度の平均値を 100%としたときの、無添加群、各被験物質添加群および陽性対照群の各群の値を算出し、無添加群と各被験物質群間および陽性対照群との比較を Dunnettの多重比較検定法 (片側）を用いて行なった。検定の結果、危険率 5%未満の場合を有意と判定した。

[0107] 5.試験結果

各群の細胞増殖促進効果を表 7に示した。無添加群の細胞増殖を 100%とした場合、 PPAR δァゴ-ストである L- 165041 (10— ⁶Μ)添カ卩群および GW- 501516 (10— ⁷Μ)添カロ群、また、陽性対照群での細胞増殖は、無添加群よりも有意に高ぐ細胞増殖が亢進していることが示された。この試験結果より、 PPAR δァゴ-ストはマイボーム上皮細胞の細胞数を増カロさせることが明らかとなった。

[0108] [表 7]

[0109] 培養サルマイボーム腺上皮細胞に PPAR δ / βァゴ-ストあるいは supplement (陽性対照）を添加した際の細胞数の変化を、無添加群の平均値を 100%とした際の値として示している (平均値士標準偏差， N=5)。表中の *は無添加群に対する有意差 (pく 0.0 5)を、また、 **は無添加群に対する有意差 (pく 0.01)を示す。

[0110] (試験例 9)

PPAR δァゴニストによる角膜上皮創傷治癒促進作用の検討雄性日本白色種家兎 (北山ラベス)を用いた。実験動物の使用にあたっては、動物を用いる生物医学研究に関する原則（International Guiding Principles for Biomedica 1 Research involving Animals)に従った。

2.被,験あび点 J 液調

被験物質として PPAR δァゴ-スト GW- 501516 (Alexis Biochemicals)を用いた。 GW -501516は 0.05%になるよう、下記の基剤に懸濁したものを点眼液として使用した。りん酸二水素ナトリウム二水和物 0.05 g

塩化ナトリウム 0.45 g

超純水適量

ポリソルベート 80 0.05 mL

NaOH 谪量

全量 50 mL (pH 7.0)

なお、被験物質投与群の対照として、薬剤を含まない上記の基剤点眼群を設定した。

験方法

1)角膜上皮搔爬

セラクタール (2% xylazine；バイエル）：ケタラール（5% ketamine；三共） =0.5： 1混合液の筋肉内注射 (0.9 mL/kg)により動物に全身麻酔を施した後、塩酸ォキシブプロ力イン点眼液 (ベノキシール点眼液 0.4%;参天製薬)を点眼し、眼球を脱臼させた。直径 6 mmのトレパンを用いて角膜中央部の角膜上皮上に直径 6 mmの刻印を施し、実体顕微鏡下、ハンディルーターを用いて刻印した円周内の角膜上皮全層を搔爬した。搔爬後、生理食塩液 (大塚製薬工場)を用いて角膜表面を洗浄し、眼球を眼窩内に復位させて角膜上皮搔爬処置を完了した。

2)投与

角膜上皮搔爬当日は 1日 2回、翌日以降、試験終了までは 1日 4回、処置眼に対し、被験物質点眼液または点眼液基剤をそれぞれ 1回 50 Lずつ、マイクロピペットを用いて点眼した。

3)評価

全個体の両眼の角膜上皮搔爬が完了した時点を試験開始時間 (0時間目）とし、その 24、 38、 48時間後の角膜上皮欠損面積を定量することにより、角膜上皮の修復を評価した。すなわち、各時点で処置眼に 0.1%フルォレセインナトリウム (和光純薬)溶液を 10 L点眼し、ただちにコノレトフィルターを取り付けたスリットランプを用いて動物の前眼部写真を撮影することにより、染色された角膜上皮欠損領域を記録した。現像された写真をコンピュータにデジタル画像として保存し、画像解析ソフト (Image-Pr 0 Plus)を用いて染色された角膜上皮欠損部の面積を測定した。

[0112] 4.統 f 学的解析

各時点で測定された角膜上皮欠損面積について、各個体ごとにその初期値を 100% とした際の値を算出し、これを残存する角膜上皮欠損の割合とした。各時点での残存角膜上皮欠損の割合について、基剤点眼群と被験物質点眼群との比較を t-検定によって実施し、危険率 5%未満を有意であると判定した。

[0113] 5.試験結果

基剤点眼群および 0.05% GW-501516点眼群の測定各時点での残存する角膜上皮欠損の割合を表 8に示す。角膜上皮搔爬の 24時間後および 38時間後に、角膜上皮欠損の割合が 0.05% GW-501516点眼群で有意に小さくなつていることが示された。なお、 48時間後には全ての個体で角膜上皮欠損は消失していた。この試験結果から、 PPAR δァゴニストを点眼することにより、欠損した角膜上皮の修復が促進されることが明らかとなった。

[0114] [表 8]

[0115] ゥサギ眼に対して角膜上皮搔爬処置を施した後、残存する角膜上皮欠損の割合 (％ )を、各個体ごとにその初期値を 100%として算出した値を示している (平均値士標準偏差， N=4)。表中の *は基剤点眼群に対する有意差 (pく 0.05)を、また、 **は基剤点眼群に対する有意差 (p〈0.01)を示す。

産業上の利用可能性

[0116] 本発明によれば、新規のマイボーム腺上皮細胞増殖促進剤または角膜上皮細胞増殖促進剤が提供され、該促進剤は、マイボーム腺上皮細胞および角膜上皮細胞の増殖を促進する。また、本発明の治療剤は、マイボーム腺機能不全、角膜上皮障害、涙液蒸発亢進型ドライアイなどの疾患の治療 '改善に有効に用いることができる。本発明は、 2005年 11月 28日出願の日本国特許出願、特願 2005— 342025を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。

Claims

請求の範囲

[I] PPAR aまたは δァゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進剤。

[2] PPAR aまたは δァゴニストを有効成分として含有する、角膜上皮細胞の増殖促進剤。

[3] PPAR aまたは δァゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺機能不全の治療剤。

[4] PPAR aまたは δァゴニストを有効成分として含有する、角膜上皮障害の治療剤。

[5] PPAR aまたは δァゴニストを有効成分として含有する、涙液蒸発亢進型ドライアイの治療剤。

[6] PPAR δァゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進剤。

[7] PPAR δァゴニストを有効成分として含有する、角膜上皮細胞の増殖促進剤。

[8] PPAR δァゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺機能不全の治療剤。

[9] PPAR δァゴニストを有効成分として含有する、角膜上皮障害の治療剤。

[10] PPAR δァゴニストを有効成分として含有する、涙液蒸発亢進型ドライアイの治療剤。

[I I] PPAR aまたは δァゴニストが一般式 (I)

( I )

[式中、

Αは水素原子または炭素数 1〜6のアルキル基を示し、

Bは— CO—、— NH―、—（CH ) — S―

2 n 、—（CH ) — O および— O— (CH )

2 n 2 O （式中、 nは 1〜3の整数を表す)からなる群力選択されるリンカ一を示し、 Xおよび Yは同一または異なって炭素原子または窒素原子を示し、

Zは酸素原子、硫黄原子または—CH を示し、 Ai^は 1〜3個の置換基を有して、てもよ、5〜6員環である芳香環基を示し、

1 2

3

で表される化合物、またはそれらの薬理学的に許容される塩である、請求項 1〜5のいずれかに記載の剤。

PPAR δァゴニストが一般式（II)

[式中、

Αは水素原子または炭素数 1〜6のアルキル基を示し、

Bは—（CH ) — S および— O— (CH ) -0- (式中、 nは 1〜3の整数を表す）か

2 n 2 n

らなる群カゝら選択されるリンカ一を示し、

Zは酸素原子、硫黄原子または—CH を示し、

2

1 2

3

で表される化合物、またはそれらの薬理学的に許容される塩である、請求項 6〜： L0 のいずれかに記載の剤。

PPAR Sァゴ-ストが、（4— (3- (4 ァセチルー 3 ヒドロキシ一 2 プロピル）フエノキシ）プロポキシフヱノキシ）酢酸、（2—メチルー 4 （（（4ーメチルー 2—（4 （トリフルォロメチル）フエニル） 5—チアゾリル)メチル）チォ）フエノキシ）酢酸もしくは（ 4ー(((2—（3 フルオロー 4 (トリフルォロメチル)フエ-ル）ー4ーメチルー 5 チアゾリル)メチル)チォ) 2—メチルフエノキシ)酢酸、またはそれらの薬理学的に許容される塩である、請求項 11または 12に記載の剤。

[14] PPAR aァゴ-ストが、 2— (4— (4—クロ口べンゾィル）フエノキシ） 2—メチルプロピオン酸 1 メチルェチルエステルもしくは（（4 クロロー 6—（（2, 3 ジメチルフェニル)ァミノ） 2—ピリミジ -ル)チォ)酢酸、またはそれらの薬理学的に許容される塩である、請求項 11に記載の剤。

[15] マイボーム腺上皮細胞の増殖促進剤を製造するための、 PPAR aまたは δァゴ- ストの使用。

[16] 角膜上皮細胞の増殖促進剤を製造するための、 PPAR aまたは δァゴ-ストの使用。

[17] マイボーム腺機能不全の治療剤を製造するための、 PPAR aまたは δァゴニストの使用。

[18] 角膜上皮障害の治療剤を製造するための、 PPAR aまたは δァゴ-ストの使用。

[19] 涙液蒸発亢進型ドライアイの治療剤を製造するための、 PPAR aまたは δァゴニストの使用。

[20] マイボーム腺上皮細胞の増殖促進剤を製造するための、 PPAR δァゴニストの使用。

[21] 角膜上皮細胞の増殖促進剤を製造するための、 PPAR δァゴ-ストの使用。

[22] マイボーム腺機能不全の治療剤を製造するための、 PPAR δァゴニストの使用。

[23] 角膜上皮障害の治療剤を製造するための、 PPAR δァゴ-ストの使用。

[24] 涙液蒸発亢進型ドライアイの治療剤を製造するための、 PPAR δァゴニストの使用

[25] マイボーム腺上皮細胞の増殖促進を必要とする対象に、 PPAR aまたは δァゴ- ストの有効量を投与することを含む、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進方法。

[26] 角膜上皮細胞の増殖促進を必要とする対象に、 PPAR aまたは δァゴニストの有効量を投与することを含む、角膜上皮細胞の増殖促進方法。

[27] マイボーム腺機能不全の治療のために行われる、請求項 25記載の方法。

[28] 角膜上皮障害の治療のために行われる、請求項 26に記載の方法。

[29] 涙液蒸発亢進型ドライアイを患う患者に、 PPAR aまたは δァゴ-ストの有効量を投与することを含む、涙液蒸発亢進型ドライアイの治療方法。

[30] マイボーム腺上皮細胞の増殖促進を必要とする対象に、 PPAR δァゴ-ストの有効量を投与することを含む、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進方法。

[31] 角膜上皮細胞の増殖促進を必要とする対象に、 PPAR δァゴニストの有効量を投与することを含む、角膜上皮細胞の増殖促進方法。

[32] マイボーム腺機能不全の治療のために行われる、請求項 30記載の方法。

[33] 角膜上皮障害の治療のために行われる、請求項 31に記載の方法。

[34] 涙液蒸発亢進型ドライアイを患う患者に、 PPAR δァゴ-ストの有効量を投与することを含む、涙液蒸発亢進型ドライアイの治療方法。