KR20080080595A - Ｐｐａｒ 아고니스트 함유 의약 - Google Patents

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센주 세이야꾸 가부시키가이샤
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Abstract

마이봄선 상피 세포 또는 각막 상피 세포의 증식 촉진제가 개시된다. 또한 마이봄선 기능 부전 및 눈물-증발성 건성안과 같은 안질환에 대한 치료제가 개시된다. 상기 증식 촉진제는 PPARα 또는 δ 아고니스트를 활성 성분으로 함유한다. 상기 안질환 치료제는 PPARα 또는 δ 아고니스트를 활성 성분으로 함유한다.
PPAR, 마이봄선, 각막, 상피 세포, 건성안, 증식 촉진제

Description

ＰＰＡＲ 아고니스트 함유 의약 {PHARMACEUTICAL COMPRISING PPAR AGONIST}
본 발명은, PPAR (Peroxisome Proliferator Activated Receptor; 페록시좀 증식자 활성화 수용체) α 또는 δ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 마이봄선 (meibomian gland) 상피 세포 또는 각막 상피 세포의 증식 촉진제에 관한 것이다.
마이봄선은 상·하의 눈꺼풀에 내포된 지질-생성 선이며, 눈꺼풀의 속눈썹으로부터 결막 측에 위치하는 개구부를 통해 지질을 분비한다. 누액을 구성하는 지질층은, 마이봄선으로부터 공급되는 지질을 성분으로 함유하여, 눈 표면으로부터의 누액의 증발을 막는다. 마이봄선 기능 부전이나 마이봄선염 환자에 있어서는, 마이봄선의 기능이 저하하여 지질의 분비량이 감소되어, 과다증발성 (hyperevaporative) 건성안, 건성안에 수반되는 각결막 상피 장해, 각막 상피 미란 및 각막 궤양 등을 일으키는 것이 알려져 있다.
또한, 각막은, 외배엽 상피 및 중배엽 전경계판 (보우만막; Bowman's membrane)/실질 (stroma)/후경계판 (데스메막; Descemet's membrane)/내피로 이루어져 있다. 각막은 안구의 맨 앞부분이기 때문에, 외부 환경의 영향을 받기 쉽고, 그 결과, 각종 장해가 발생된다. 각막 상피 세포의 손상 또는 결손에 수반 되는 질환의 예로서는, 안구 건조증, 각막 궤양, 표층 점상 각막염, 각막 상피 미란, 춘계 카타르 및 아토피성 각결막염 등의 각막 병변을 수반하는 눈 알레르기성 질환 등을 들 수 있다.
한편, PPAR 은 대부분의 척추동물에서 발현되는 핵내 수용체의 일종이며, 세포내의 당-지질 대사 및 세포 분화에 밀접하게 관여하고 있는 전사 인자군으로도 불린다. 아형으로서는,α, δ 및 γ 가 알려져 있다. PPARδ는 일부 경우 PPARβ 로 표기된다(비특허 문헌 1).
안조직에서의 PPAR 의 분포로서는, PPARα 및 β 가 토끼의 각막 상피 세포에서 발현되고 있는 것이 알려져 있다(비특허 문헌 2).
이전에, PPAR 활성화 작용을 갖는 5-[4-(6-메톡시-1-메틸-1H-벤즈이미다졸-2―일메톡시)벤질]티아졸리딘-2,4―디온이 각결막 장해의 치료제로서 이용될 수 있는 것 (특허 문헌 1 및 2) 및 안질환 (결막염, 안구 건조증, 각막염 등) 의 치료 에 PPARα, δ 또는 γ 아고니스트가 투여되는 것 (특허 문헌 3) 이 보고되었다. 또한, PPARα 가 간, 신장 등에 분포하여, 지질 대사/수송에 작용하는 것이 알려져 있고, 더욱이 이의 아고니스트는 각막 질환의 치료제로서 이용될 수 있는 것도 보고되었다(특허 문헌 4). PPARδ 아고니스트에 대해서는, 상기 아고니스트가 래트 피지선 상피 세포의 증식 및 분화를 촉진하고(비특허 문헌 3), 피부 창상의 치유를 촉진한다는 것(비특허 문헌 4)이 이전에 보고되었다. 그 외에도, 비(非)-티아졸리딘디온 PPAR 리간드 및 GLP-1 유도체를 투여함으로써 β-세포의 증식을 자극하는 방법(특허 문헌 5), 및 PPARγ 아고니스트인 피오글리타존이 백혈병 세포 및 전립선 암 세포의 증식을 저해한다는 것(특허 문헌 6)이 알려져 있다.
그러나, 각 동물종 및 각 조직 또는 세포에 있어서의 PPARα, δ 및 γ 의 발현 및 기능은 규명되어야 할 많은 의문점을 포함하고 있으며, 어느 PPAR 아고니스트가 인간 안질환에 유용한지도 알려져 있지 않다.
[특허 문헌 1] WO 2005/039574
[특허 문헌 2] 일본 특허 출원 공개공보 (JP-A) 제 2001-39976 호
[특허 문헌 3] WO 2002/076177
[특허 문헌 4] JP-A 제 2005-008570 호
[특허 문헌 5] WO 2002/69994
[특허 문헌 6] WO 1998/25598
[비특허 문헌 1] J Med Chem 2000, 43: 527-550
[비특허 문헌 2] J Biol Chem 2000, 275: 2837
[비특허 문헌 3] Molecular Genetic and Metabolism 2001, 74: 362-369
[비특허 문헌 4] Am J Clin Dermatol 2003, 4(8): 523-530
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명의 목적은, 건성안 등의 안질환의 근본적인 치료가 될 수 있는 마이봄선 상피 세포 및 각막 상피 세포의 증식을 촉진할 수 있는 제제, 및 상기 촉진제를 함유한, 마이봄선 기능 부전, 과다증발성 건성안 등의 안질환에 대한 치료제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 해결하기 위한 수단
상기 과제의 관점에서, 본 발명자들은 예의 연구를 수행한 결과, PPARα 또는 δ 아고니스트가 마이봄선 상피 세포 및 각막 상피 세포의 증식 촉진 작용을 갖는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 적어도 이하의 내용을 포함한다.
(1) PPARα 또는 δ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진제.
(2) PPARα 또는 δ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 각막 상피 세포의 증식 촉진제.
(3) PPARα 또는 δ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 마이봄선 기능 부전 치료제.
(4) PPARα 또는 δ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 각막 상피 장해 치료제.
(5) PPARα 또는 δ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 과다증발성 건성안 치료제.
(6) PPARδ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진제.
(7) PPARδ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 각막 상피 세포의 증식 촉진제.
(8) PPARδ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 마이봄선 기능 부전 치료제.
(9) PPARδ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 각막 상피 장해 치료제.
(10) PPARδ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 과다증발성 건성안 치료제.
(11) (1) 내지 (5) 중의 어느 하나에 있어서, PPARα 또는 δ 아고니스트가 하기 화학식 (I) 로 표시되는 화합물 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염인 제제:
[화학식 1]
Figure 112008046546322-PCT00001
[식 중,
A 는 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이고,
B 는 -CO-, -NH-, -(CH2)n-S-, -(CH2)n-O- 및 -O-(CH2)n-O- (이 때, n 은 1 내지 3 의 정수임) 로 이루어지는 군에서 선택되는 링커이고,
X 및 Y 는 동일 또는 상이하고, 각각 탄소 원자 또는 질소 원자이고,
Z 는 산소 원자, 황 원자 또는 -CH2- 이고,
Ar1 은 1 내지 3 개의 치환기를 임의로 갖는 5- 내지 6-원 방향족 고리기이고,
R1 및 R2 는 동일 또는 상이하고, 각각 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이고,
R3 은 수소, 할로겐 원자 또는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이다].
(12) (6) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, PPARδ 아고니스트가 하기 화학식 (II) 으로 표시되는 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염인 제제:
[화학식 2]
Figure 112008046546322-PCT00002
[식 중,
A 는 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이고,
B 는 -(CH2)n-S- 및 -O-(CH2)n-O- (이때, n 은 1 내지 3 의 정수임) 로 이루어진 군에서 선택되는 링커이고,
X 및 Y 는 동일 또는 상이하고, 각각 탄소 원자 또는 질소 원자이고,
Z 는 산소 원자, 황 원자 또는 -CH2- 이고,
Ar1 은 1 내지 3 개의 치환기를 임의로 갖는 5- 내지 6-원 방향족 고리기이고,
R1 및 R2 는 동일 또는 상이하고, 각각 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이고,
R3 은 수소, 할로겐 원자 또는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이다].
(13) (11) 또는 (12) 에 있어서, PPARδ 아고니스트가 (4-(3-(4-아세틸-3-히드록시-2-프로필)페녹시)프로폭시페녹시)아세트산, (2-메틸-4-(((4-메틸-2-(4-(트리플루오로메틸)페닐)-5-티아졸릴)메틸)티오)페녹시)아세트산 또는 (4-(((2-(3-플루오로-(4-(트리플루오로메틸)페닐)-4-메틸-5-티아졸릴)메틸)티오)-2-메틸페녹시)아세트산, 또는 이들의 약리학적으로 허용가능한 염인 제제.
(14) (11) 에 있어서, PPARα 아고니스트가 1-메틸에틸 2-(4-(4-클로로벤조일)페녹시)-2-메틸프로피오네이트 또는 ((4-클로로-6-((2,3-디메틸페닐)아미노)-2-피리미디닐)티오)아세트산, 또는 이들의 약리학적으로 허용가능한 염인 제제.
(15) 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진제의 제조를 위한, PPARα 또는 δ 아고니스트의 용도.
(16) 각막 상피 세포의 증식 촉진제의 제조를 위한, PPARα 또는 δ 아고니스트의 용도.
(17) 마이봄선 기능 부전의 치료제의 제조를 위한, PPARα 또는 δ 아고니스트의 용도.
(18) 각막 상피 장해 치료제의 제조를 위한, PPARα 또는 δ 아고니스트의 용도.
(19) 과다증발성 건성안 치료제의 제조를 위한, PPARα 또는 δ 아고니스트의 용도.
(20) 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진제의 제조를 위한, PPARδ 아고니스트의 용도.
(21) 각막 상피 세포의 증식 촉진제의 제조를 위한, PPARδ 아고니스트의 용도.
(22) 마이봄선 기능 부전 치료제의 제조를 위한, PPARδ 아고니스트의 용도.
(23) 각막 상피 장해 치료제의 제조를 위한, PPARδ 아고니스트의 용도.
(24) 과다증발성 건성안 치료제의 제조를 위한, PPARδ 아고니스트의 용도.
(25) 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진을 필요로 하는 대상에, 유효량의 PPARα 또는 δ 아고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진 방법.
(26) 각막 상피 세포의 증식 촉진을 필요로 하는 대상에, 유효량의 PPARα 또는 δ 아고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 각막 상피 세포의 증식 촉진 방법.
(27) (25) 에 있어서, 마이봄선 기능 부전의 치료를 위해 수행되는 방법.
(28) (26) 에 있어서, 각막 상피 장해의 치료를 위해 수행되는 방법.
(29) 과다증발성 건성안을 앓고 있는 환자에게, 유효량의 PPARα 또는 δ 아고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 과다증발성 건성안의 치료 방법.
(30) 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진을 필요로 하는 대상에, 유효량의 PPARδ 아고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진 방법.
(31) 각막 상피 세포의 증식 촉진을 필요로 하는 대상에, 유효량의 PPARδ 아고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 각막 상피 세포의 증식 촉진 방법.
(32) (30) 에 있어서, 마이봄선 기능 부전의 치료를 위해 수행되는 방법.
(33) (31) 에 있어서, 각막 상피 장해의 치료를 위해 수행되는 방법.
(34) 과다증발성 건성안을 앓고 있는 환자에게, 유효량의 PPARδ 아고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 과다증발성 건성안의 치료 방법.
발명의 효과
본 발명에 따르면, 신규의 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진제 또는 신규의 각막 상피 세포의 증식 촉진제가 제공되며, 상기 촉진제는 마이봄선 상피 세포 및 각막 상피 세포의 증식을 촉진한다. 또한, 본 발명의 치료제는 마이봄선 기능 부전, 각막 상피 장해 및 과다증발성 건성안 등의 질환의 치료 또는 개선에 유효하게 사용될 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1 은, 배양된 인간 각막 상피 세포 (상단), 배양된 토끼 각막 상피 세포 (중단), 및 배양된 원숭이 마이봄선 상피 세포 (하단) 에서의 PPARα, δ 또는 γ 의 mRNA 의 발현을 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명은, PPARα 또는 δ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진제를 제공한다. 상기 촉진제는 마이봄선 상피 세포의 증식을 촉진한다. 또한, 본 발명은, PPARα 또는 δ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 각막 상피 세포의 증식 촉진제를 제공한다. 상기 촉진제는 각막 상피 세포의 증식을 촉진한다. 본 발명에서, 세포 증식 촉진제는, 세포 분열을 촉진하여 세포수를 증가시키는 작용을 갖는 제제, 및 세포 사멸을 억제하여 세포수를 증가시키는 작용을 갖는 제제 둘 다를 의미한다.
본 발명의 촉진제는, PPARα 또는 δ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유한다. PPARα 아고니스트란, PPARα에 결합하여 이를 활성화하는 작용을 갖는 물질을 지칭한다. 또한, PPARδ 아고니스트란, PPARδ에 결합하여 이를 활성화하는 작용을 갖는 물질을 지칭한다.
PPARα 또는 δ 아고니스트로서는, 각종의 공지된 PPARα 또는 δ 아고니스트를 언급할 수 있다. PPARα 또는 δ 아고니스트의 구체예로서는, 예를 들어 하기에 기재된 물질들을 들 수 있다: WO2001/00603, WO99/62872, WO2002/100813, WO97/28149, WO2004/022551, WO2001/79197, WO2003/099793, WO2005/105736, WO2005/105726, WO2005/085235, WO2005/113600, WO2005/105754, WO2005/049606, WO2004/111020, WO2006/055187, WO2006/084176, WO2005/060958, WO2005/097786, WO2004/092117, WO2005/037763, WO2005/030694, WO2005/016335, WO2003/074495, WO2004/058174, JP2003-171275A, JP2005-179281A, WO2006/031969, WO2005/097763, WO2004/063165, WO2002/050048, WO2005/090966, WO2003/099793, WO2002/076959, WO2002/053547, WO2001/00603, WO97/28149, WO2004/063184, WO2006/090920, WO2006/059744, WO2006/041197, WO2003/033493, WO2003/016291, WO2002/076957, WO2002/046176, WO2002/046154, WO2002/014291, WO2001/079197 등.
PPARα 또는 δ 아고니스트 화합물의 구체예로서는 하기를 들 수 있다: 1-메틸에틸 2-(4-(4-클로로벤조일)페녹시)-2-메틸프로피오네이트 (페노피브레이트(fenofibrate); CAS 등록 번호 49562-28-9), ((4-클로로-6-((2,3-디메틸페닐)아미노)-2-피리미디닐)티오)아세트산 (WY-14643; CAS 등록 번호 50892-23-4), (4-(3-(4-아세틸-3-히드록시-2-프로필)페녹시)프로폭시페녹시)아세트산 (L-165041; CAS 등록 번호 79558-09-1), (2-메틸-4-(((4-메틸-2-(4-(트리플루오로메틸)페닐)-5-(티아졸릴)메틸)티오)페녹시)아세트산 (GW-501516; CAS 등록 번호 317318-70-0), (4-(((2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐)-4-메틸-5-티아졸릴)메틸)티오)-2-메틸페녹시)아세트산 (GW-0742; CAS 등록 번호 317318-84-6), 2-메틸-4-((2R)-2-(3-메틸-5-(4-(트리플루오로메틸)페닐)-2-티에닐)프로폭시)-벤젠프로피온산 (CAS 등록 번호 728038-95-7), 2-에틸-2-(4-(4-(4-(4-메톡시페닐)-피페라진-1-일)-2-(4-트리플루오로메틸-페닐)-티아졸-5-일메틸술파닐)-페녹시)부티르산 (GSK-677954; CAS 등록 번호 884324-15-6), (4-(3-(3-페닐-7-프로필-벤조푸란-6-일옥시)-프로필술파닐)-페닐)아세트산 (L-796449; CAS 등록 번호 194608-80-5), 및 2-(4-(3-(1-(2-(2-클로로-6-플루오로-페닐)-에틸)-3-(2,3-디클로로-페닐)-우레이도)-프로필)-페녹시)-2-메틸프로피온산 (GW-2433; CAS 등록 번호 227941-61-9).
본 발명에서는, 또한, PPARα 또는 δ 아고니스트인 것으로 알려지지 않은 물질들의 군으로부터 PPARα 또는 δ를 활성화하는 물질(화합물)을 스크리닝에 의해 수득할 수 있고, 그러한 물질(화합물)을 본 발명의 활성 성분으로서 사용할 수도 있다. PPARα 또는 δ 아고니스트는, 각각, PPARα 또는 δ 의 리간드 결합 도메인 (LBD) 에 결합하여, 당해 수용체를 활성화하고, PPAR 표적 유전자의 전사를 조절하는 것으로 알려져 있다. 이 특성을 이용함과 함께, 포유동물의 세포에 존재하는 다른 핵 수용체의 영향을 제외하기 위해, LBD 와 효모의 GAL4 와의 키메라 수용체 및 리포터 유전자를 사용한 스크리닝 방법에 의해 신규의 PPARα 또는 δ 아고니스트를 선택할 수 있다.
상기 스크리닝 방법으로서는, PPAR-GAL4 검정 (참고 문헌, T. M. Willson 등, Journal of Medicinal Chemistry, 2000, vo1. 43, No. 4, p. 528-550 및 J. M. Lehmann 등, The Journal of Biological Chemistry, 1995, vo1. 270, No. 22, p. 12953-12956) 이 예시된다. 구체적으로, 하기 단계를 포함하는 방법을 예로 들 수 있다: (a) 효모 전사 인자 GAL4 의 DNA 결합 도메인 (DBD) 과 PPARα 또는 δ 의 LBD 와의 융합 단백질을 발현시키는 벡터 및 GAL4 의 DNA 결합 요소와 리포터 유전자를 포함한 리포터 플라스미드를 세포에 도입하는 단계,
(b) 상기 세포와 시험 물질을 접촉시켜, 상기 세포에 있어서의 리포터 유전자의 발현량을 측정하고, 상기 발현량을 시험 물질과 접촉되지 않은 대조군 세포 에서의 발현량과 비교하는 단계, 및
(c) 상기 (b) 의 비교 결과에 기초하여, PPARα 또는 δ를 활성화하는 물질을 선택하는 단계.
상기 언급한 방법에서의 단계 (a) 에서, 사용되는 세포는 GAL4 를 내재적으로 발현하지 않는 세포, 바람직하게는, 포유동물 세포이다. 리포터 유전자는, 검출 가능한 단백질 또는 효소를 인코딩하는 유전자일 수 있고, 그의 예로서는, LUC (루시페라아제) 유전자, SPAP (분비형 태반 알칼라인 포스파타제) 유전자, CAT (클로람페니콜 아세틸 트랜스페라제) 유전자 등을 들 수 있다.
상기 융합 단백질 발현 벡터 및 리포터 플라스미드의 제조, 및 당해 벡터 및 플라스미드의 세포 내로의 도입은, 상기 언급한 참고 문헌의 방법 또는 자체 공지된 방법에 의해 실시될 수 있다.
상기 언급한 방법의 단계 (b) 에 있어서, 시험 물질은, 임의의 공지된 화합물 또는 신규 화합물일 수 있고, 이의 예로서는, 핵산, 당, 지질, 단백질, 펩티드, 유기 저분자 화합물, 조합 화학 기술을 이용하여 제조된 화합물 라이브러리, 고상 합성법 또는 파아지 디스플레이법에 의해 제조된 랜덤 펩티드 라이브러리, 또는 미생물, 동식물, 해양 생물 등에서 유래한 천연 성분을 들 수 있다.
또한, 단계 (b) 에서는, 이른바 리포터 검정에 의해 시험 물질의 유무에 의한 PPARα 또는 δ 의 전사 활성을 조사한다. 리포터 검정은, 사용되는 리포터 유전자에 따라 자체 공지된 방법에 의해 실시할 수가 있다.
상기 언급한 방법의 단계 (c) 에서, 시험 물질의 존재하에서의 리포터 활성이 그의 부재하에서의 리포터 활성보다 유의하게 더 높은 경우, 상기 시험 물질은 PPARα 또는 δ 아고니스트 활성을 갖는 화합물로 결정될 수 있다.
본 발명에 사용되는 PPARα 아고니스트의 인간 PPARα에 대한 활성은, EC50 값으로 표현하여, 50 μM 이하, 바람직하게는 10 μM 이하, 더욱 바람직하게는 5 μM 이하이다. 본 발명에 사용되는 PPARδ 아고니스트의 인간 PPARδ에 대한 활성은, EC50 값으로 표현하여, 1O μM 이하, 바람직하게는 1 μM 이하, 더욱 바람직하게는 0.1 μM 이하이다. EC50 값은 인간 PPARα 또는 δ를 사용한 PPAR-GAL4 검정 (T. M. Willson 등, Journal of Medicinal Chemistry, 2000, vo1. 43, No. 4, p. 527-550 참조) 에 의해 측정한 값이다.
바람직한 PPARα 또는 δ 아고니스트의 예로서는 하기 화학식 (I) 로 표시되는 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 들 수 있다:
[화학식 3]
Figure 112008046546322-PCT00003
[식 중,
A 는 수소 원자, 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이고,
B 는 -CO-, -NH-, -(CH2)n-S-, -(CH2)n-O- 및 -O-(CH2)n-O- (이때, n 은 1 내지 3 의 정수임) 로 이루어진 군에서 선택되는 링커이고,
X 및 Y 는 동일 또는 상이하고, 각각 탄소 원자 또는 질소 원자이고,
Z 는 산소 원자, 황 원자 또는 -CH2- 이고,
Ar1 은 1 내지 3 개의 치환기를 임의로 갖는 5- 또는 6-원 방향족 고리기이고,
R1 및 R2 는 동일 또는 상이하고, 각각 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이고,
R3 은 수소, 할로겐 원자 또는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이다].
상기 언급한 화학식 (I) 에서, A 에 있어서의 "탄소수 1 내지 6 의 알킬기"의 예로서는, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 1,2-디메틸프로필, 헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필 등을 들 수 있다. 탄소수 1 내지 6 의 알킬기는 바람직하게는 이소프로필이다.
상기 언급한 화학식 (I) 에서, B 에 대한 링커는 바람직하게는 -CO-, -NH-, -CH2-S- 또는 -O-(CH2)3-O-, 더욱 바람직하게는 -CH2-S- 또는 -O-(CH2)3-O- 이다.
상기 언급한 화학식 (I) 에서 Ar1 에 대한 5- 또는 6-원 방향족 고리기의 예로서는, 페닐, 푸릴, 티에닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,3,4-옥사디아졸릴, 푸라자닐, 1,2,3-티아디아졸릴, 1,2,4-티아디아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 테트라졸릴, 피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트리아지닐 등을 들 수 있다. 상기 방향족 고리기는 바람직하게는 페닐 또는 티아졸릴이다.
상기 언급한 화학식 (I) 에서 치환기 Ar1 의 예로서는 할로겐 원자, 히드록시기, 탄소수 1 내지 6 의 알킬기, 탄소수 1 내지 6 의 할로알킬기, 탄소수 2 내지 7 의 아실기 및 탄소수 1 내지 6 의 알킬기 또는 탄소수 1 내지 6 의 할로 알킬기를 임의로 갖는 페닐기를 들 수 있다. 바람직한 치환기는, 염소 원자, 히드록시기, 메틸기, 아세틸기, 4-트리플루오로메틸페닐기 및 3-플루오로-4-메틸페닐기이다.
상기 언급한 화학식 (I) 에서 R1 또는 R2 에 대한 "탄소수 1 내지 6 의 알킬기"의 예로서는, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 1,2-디메틸프로필, 헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필 등을 들 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 6 의 알킬기는 바람직하게는 메틸이다.
상기 언급한 화학식 (I) 에서 R3 에 대한 "할로겐 원자"의 예로서는, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 등을 들 수 있다. 상기 할로겐 원자는 바람직하게는 염소 원자이다.
상기 언급한 화학식 (I) 에서 R3 에 대한 "탄소수 1 내지 6 의 알킬기"의 예로서는, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 1,2-디메틸프로필, 헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필 등을 들 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 6 의 알킬기는 바람직하게는 메틸이다.
화학식 (I) 로 표시되는 화합물의 약리학적으로 허용가능한 염으로서는, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 질산, 인산 등의 광산; 포름산, 아세트산, 프로피온산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 말산, 타르타르산, 메탄술폰산, 에탄술폰산 등의 유기 산; 아스파르트산, 글루탐산 등의 산성 아미노산 등과의 산 부가염 등을 들 수 있다. 이들 염에는 또한 이들의 용매화물도 포함된다. 화학식 (I) 로 표시되는 화합물은 비대칭 탄소 원자 또는 이중 결합을 가질 수도 있고, 이러한 화합물은 광학 이성질체, 기하 이성질체를 포함할 수 있다. 이러한 이성질체들 역시 본 발명의 범위 내에 포함되며, 자체 공지된 방법에 의해 단리 및 정제될 수 있다. 본 발명에서는, 이들의 임의의 혼합물 및 단리된 형태가 사용될 수 있다.
본 발명에서, 화학식 (I) 로 표시되는 화합물 중에서 바람직한 PPARα 아고니스트로서는, 1-메틸 에틸 2-(4-(4-클로로벤조일)페녹시)-2-메틸프로피오네이트 (페노피브레이트; CAS 등록 번호 49562-28-9), ((4-클로로-6-((2,3-디메틸페닐)아미노)-2-피리미디닐)티오)아세트산 (WY-14643; CAS 등록 번호 50892-23-4) 등을 들 수 있다. 바람직한 PPARδ 아고니스트로서는, 4-(3-(4-아세틸-3-히드록시-2-프로필)페녹시)프로폭시페녹시아세트산 (L-165041; CAS 등록 번호 79558-09-1), (2-메틸-4-(((4-메틸-2-(4-(트리플루오로메틸)페닐)-5-티아졸릴)메틸)티오)페녹시)아세트산 (GW-501516; CAS 등록 번호 317318-70-0), (4-(((2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐)-4-메틸-5-티아졸릴)메틸)티오)-2-메틸페녹시)아세트산 (GW-0742; CAS 등록 번호 317318-84-6) 등을 들 수 있다.
바람직한 δ 아고니스트로서는 하기 화학식 (II) 로 표시되는 화합물 및 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 들 수 있다:
[화학식 4]
Figure 112008046546322-PCT00004
[식 중,
A 는 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이고,
B 는 -(CH2)n-S- 및 -O-(CH2)n-O- (이때, n 은 1 내지 3 의 정수임) 으로 이루어진 군에서 선택되는 링커이고,
X 및 Y 는 동일 또는 상이하고, 각각 탄소 원자 또는 질소 원자이고,
Z 는 산소 원자, 황 원자 또는 -CH2- 이고,
Ar1 은 1 내지 3 개의 치환기를 임의로 갖는 5- 또는 6-원 방향족 고리기이고,
Rl 및 R2 는 동일 또는 상이하고, 각각 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이고,
R3 은 수소, 할로겐 원자 또는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이다].
상기 언급한 화학식 (II) 에서의 A 에 있어서 "탄소수 1 내지 6 의 알킬기"의 예로서는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 1,2-디메틸프로필, 헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필 등을 들 수 있다.
상기 언급한 화학식 (II) 에서 B 에 있어서의 링커는 바람직하게는 -CH2-S- 또는 -O-(CH2)3-O- 이다.
상기 언급한 화학식 (II) 에서 Ar1 에 있어서의 5- 또는 6-원 방향족 고리기의 예로서는 페닐, 푸릴, 티에닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,3,4-옥사디아졸릴, 푸라자닐, 1,2,3-티아디아졸릴, 1,2,4-티아디아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 테트라졸릴, 피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트리아지닐 등을 들 수 있다. 상기 방향족 고리기는 바람직하게는 페닐 또는 티아졸릴이다.
상기 언급한 화학식 (II) 에서, 치환기 Ar1 의 예로서는, 할로겐 원자, 히드록시기, 탄소수 1 내지 6 의 알킬기, 탄소수 1 내지 6 의 할로알킬기, 탄소수 2 내지 7 의 아실기 및 탄소수 1 내지 6 의 알킬기 또는 탄소수 1 내지 6 의 할로알킬기를 임의로 갖는 페닐기를 들 수 있다. 상기 치환기는, 바람직하게는 염소 원자, 히드록시기, 메틸기, 아세틸기, 4-트리플루오로메틸페닐기 및 3-플루오로-4-메틸페닐기이다.
상기 언급한 화학식 (II) 에서 Rl 또는 R2 에 있어서의 "탄소수 1 내지 6 의 알킬기"의 예로서는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 1,2-디메틸프로필, 헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필 등을 들 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 6 의 알킬기는 바람직하게는 메틸이다.
상기 언급한 화학식 (II) 에서 R3 에 있어서의 "할로겐 원자"의 예로서는 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 등을 들 수 있다. 상기 할로겐 원자는 바람직하게는 염소 원자이다.
상기 언급한 화학식 (II) 에서 R3 에 있어서의 "탄소수 1 내지 6 의 알킬기"의 예로서는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 1,2-디메틸프로필, 헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필 등을 들 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 6 의 알킬기는 바람직하게는 메틸이다.
화학식 (II) 로 표시되는 화합물의 약리학적으로 허용가능한 염의 예로서는, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 질산, 인산 등의 광산; 포름산, 아세트산, 프로피온산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 말산, 타르타르산, 메탄술폰산, 에탄술폰산 등의 유기 산; 아스파르트산, 글루탐산 등의 산성 아미노산 등과의 산 부가염 등을 들 수 있다. 이들 염에는 이들의 용매화물도 포함된다. 화학식 (II) 로 표시되는 화합물은 비대칭 탄소 원자 또는 이중 결합을 가질 수도 있고, 이러한 화합물은 광학 이성질체 또는 기하 이성질체를 포함할 수 있다. 이러한 이성질체들 역시 본 발명의 범위 내에 포함되며, 자체 공지된 방법에 따라 단리 및 정제될 수 있다. 본 발명에서는, 이들의 임의의 혼합물 및 단리된 형태가 사용될 수 있다.
본 발명에서, 화학식 (II) 로 표시되는 화합물 중에서 바람직한 PPARα 아고니스트로서는, 4-(3-(2-프로필-3-히드록시-4-아세틸)페녹시)프로필옥시페녹시아세트산 (L-165041; CAS 등록 번호 79558-09-1), (2-메틸-4-(((4-메틸-2-(4-(트리플루오로메틸)페닐)-5-티아졸릴)메틸)티오)페녹시)아세트산 (GW-501516; CAS 등록 번호 317318-70-0), (4-(((2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐)-4-메틸-5-티아졸릴)메틸)티오)-2-메틸페녹시)아세트산 (GW-0742; CAS 등록 번호 317318-84-6) 등을 들 수 있다.
본 발명의 촉진제에 있어서, PPARα 또는 δ 아고니스트의 함량은, 통상 0.000001 - 1 중량%, 바람직하게는 O.00001 - 1 중량%, 가장 바람직하게는 O.0001 - 0.1 중량%이다.
본 발명의 촉진제는, 상기 언급한 활성 성분에 더하여 임의의 담체를 포함할 수 있다. 이러한 담체의 예로서는, 용매 (예컨대, 물, 알코올 등), 완충제 (예컨대, 인산 완충액, 아세트산 완충액, 붕산 완충액, 탄산 완충액, 시트르산 완충액, 트리스 완충액, 글루탐산, 엡실론 아미노카프로산 등), 보존제 (예컨대, 염화 벤즈알코늄, 염화 벤제토늄, 글루콘산 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 벤질 알코올, 데히드로아세트산나트륨, 파라옥시벤조에이트, 에데트산나트륨, 붕산 등), 등장화제 (예컨대, 염화나트륨, 염화칼륨, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 붕산, 글루코오스, 프로필렌 글리콜 등) 등을 들 수 있다.
본 발명의 촉진제는, 의약 또는 시험용 시약으로서, 생체내 또는 시험관내에서 이용될 수 있다.
본 발명의 촉진제를 시험용 시약으로서 사용하는 경우, 이를 생리학 및 생화학 분야에 있어서의 시험용 시약으로서 각종 양태로 이용 가능하다.
의약으로서 사용하는 경우, 본 발명의 촉진제는, 마이봄선 상피 세포의 증식을 촉진하므로, 마이봄선 상피 세포의 손상 또는 위축을 수반하는 질환, 및 마이봄선 상피 세포의 기능 저하에 의해 발생하는 질환의 치료제로서 유용하다. 상기 질환의 예로서는 마이봄선 기능 부전을 들 수 있다. 나아가, 마이봄선 상피 세포는 누액 중의 지질 성분을 분비하고, 상기 지질은 누액의 증발을 막아, 누액층을 안정화하기 때문에, 본 발명의 치료제는 누액 중의 지질 이상 (분비량 감소, 성분 변화) 을 동반하는 질환에 대해 유용하다. 상기 질환의 예로서는, 과다증발성 건성안을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 촉진제는 건성안, 각막 궤양, 표층 점상 각막염, 각막 상피 미란 등의 치료에도 유용하다.
또한, 본 발명의 촉진제는, 각막 상피 세포의 증식을 촉진하기 때문에, 각막 상피 세포의 손상 (즉, 창상 또는 결손) 을 수반하는 질환의 치료제로서도 유용하다. 본 발명의 촉진제는, 각막 상피 장해, 구체적으로는, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 증후군 또는 건성 각결막염 (건성안) 등의 내인성 질환에 수반되는 각막 상피 장해; 수술후, 약물 사용, 외상 또는 콘택트 렌즈 사용의 경우에서의 외인성 질환에 수반되는 각막 상피 장해; 또는 각막 궤양, 또는 각막 병변, 춘계 카타르 또는 아토피성 각결막염을 수반하는 눈 알레르기성 질환에 수반되는 각막 상피 장해의 치료제로서 유용하다. 본 발명의 촉진제는 또한, 표층 점상 각막염 및 각막 상피 미란의 치료에도 유용하다. 나아가, 본 발명의 촉진제는 각막 창상 치유 촉진제로서도 유용하다.
또한, 본 발명의 촉진제는 각막 상피 세포 증식 촉진 작용 및 마이봄선 상피 세포 증식 작용을 겸비하므로, 각막 조직에 직접 작용하는 효과와 마이봄선 세포에 작용하는 것에 의해 누액의 기능을 개선하는 효과를 발휘한다. 그 결과, 특히 과다증발성 건성안의 치료제로서 매우 유용하다.
본 발명의 치료제에 있어서, PPARα 또는 δ 아고니스트의 함량은, 통상 0.000001 내지 1 중량%, 바람직하게는 0.00001 내지 1 중량%, 가장 바람직하게는 0.0001 내지 0.1 중량%이다.
본 발명의 촉진제 또는 치료제의 투여 대상의 예로서는, 포유동물 (예컨대, 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 소, 양, 원숭이 등) 을 들 수 있다.
본 발명의 치료제는, 점안제, 첩부제, 연고제, 로션제, 크림제, 경구제 등의 투여 형태로 이용될 수 있고, 상기 언급한 활성 성분에 더하여 약학적으로 허용가능한 담체와 같은 임의의 담체를 함유할 수 있다.
본 발명의 치료제에 있어서, 투여 경로는 상기 언급한 치료 효과를 발휘하는 한 특별히 한정되지 않지만, 상기 치료제는 바람직하게는 눈으로 국소 투여된다. 눈 국소 투여용 투여 형태의 예로서는, 점안제 및 안연고제를 들 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 치료제를 점안제 또는 안연고제로서 사용하는 경우, 안정화제 (예컨대, 아황산수소나트륨, 티오황산나트륨, 에데트산나트륨, 시트르산나트륨, 아스코르브산, 디부틸히드록시톨루엔 등), 가용화제 (예컨대, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 마크로골, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 등), 현탁화제 (예컨대, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 등), 유화제 (예컨대, 폴리비닐피롤리돈, 대두 레시틴, 난황 레시틴, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리소르베이트 80 등), 완충제 (예컨대, 인산 완충액, 아세트산 완충액, 붕산 완충액, 탄산 완충액, 시트르산 완충액, 트리스 완충액, 글루탐산, ε-아미노카프로산 등), 증점제 (예컨대, 메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 또는 카르복시메틸셀룰로오스 등의 수용성 셀룰로오스 유도체, 콘드로이틴 황산 나트륨, 히알루론산나트륨, 카르복시비닐 중합체, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 마크로골 등), 보존제 (예컨대, 염화 벤즈알코늄, 염화 벤제토늄, 글루콘산 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 벤질 알코올, 데히드로아세트산 나트륨, 파라옥시벤조산 에스테르류, 에데트산나트륨, 붕산 등), 등장화제 (예컨대, 염화나트륨, 염화칼륨, 글리세린, 만니톨, 소르비톨, 붕산, 글루코오스, 프로필렌 글리콜 등), pH 조정제 (예컨대, 염산, 수산화나트륨, 인산, 아세트산 등), 청량화제 (예컨대, 1-멘톨, d-캠퍼(camphor), d-보르네올, 박하유 등), 연고 기제 (백색 바셀린, 정제 라놀린, 유동 파라핀, 식물성유 (올리브유, 동백 기름, 낙화생유 등) 등) 를 첨가제로서 첨가할 수 있다. 이들 첨가제의 첨가량은, 첨가되는 첨가제의 종류, 용도 등에 따라 다르지만, 상기 첨가제는 그의 목적을 달성하기에 충분한 농도로 첨가될 수 있다.
본 발명의 치료제를 점안제 또는 안연고제로 제형화하는 경우, 이들은 제약 분야에서 통상 이용되고 있는 방법에 따라 제조될 수 있고, 예를 들어, Japanese Pharmacopoeia 제 14 개정판, 제제 총칙, 점안제 항목 및 안연고제 항목에 기재된 방법에 근거하여 제조할 수 있다.
본 발명은, 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진을 필요로 하는 대상에 유효량의 PPARα 또는 δ 아고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진 방법을 제공한다. 당해 방법은, 마이봄선 기능 부전의 치료를 위해 수행되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은, 각막 상피 세포의 증식 촉진을 필요로 하는 대상에, 유효량의 PPARα 또는 δ 아고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 각막 상피 세포의 증식 촉진 방법을 제공한다. 당해 방법은, 각막 상피 장해의 치료를 위해 수행되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은, 과다증발성 건성안을 앓고 있는 환자에게, 유효량의 PPARα 또는 δ 아고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 과다증발성 건성안의 치료 방법을 제공한다.
PPARα 또는 δ 아고니스트의 유효량은 무조건적으로 규정될 수는 없고, 화합물의 종류, 투여 대상의 연령, 체중 및 상태, 치료 목적 등에 따라 다르다. 본 발명의 촉진제 또는 치료제를 인간에 투여하는 경우에는, 예를 들어, PPARα 또는 δ 아고니스트를 통상 0.000001 내지 1 중량%, 바람직하게는 0.00001 내지 1 중량%, 가장 바람직하게는 0.0001 내지 0.1 중량%로 함유한 용액을, 1일 1회 내지 8회, 1회 투여당 한쪽 눈에 1 또는 2 방울, 즉, 1회 투여당 약 50 내지 200 ㎕ 로 투여한다. 상기 범위 내의 농도 및 용량을 가진 용액에 함유되는 PPARα 또는 δ 아고니스트의 양이 유효량으로서 예로서 제시될 수 있다.
이하에, 하기 시험예들을 참조하여 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 전혀 제한되지 않는다.
(시험예 1)
각막 상피 세포를 사용한 세포수의 증가에 대한 PPAR 아고니스트의 효과
1. 사용된 동물
수컷 토끼 (일본 백색종, KITAYAMA LABES Co., Ltd.) 가 사용되었다. 실험동물은 International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals 에 따라 사용하였다.
2. 각막 상피 세포의 제조
각막 상피 세포는 토끼 안구로부터 제조되었다. 분리한 안구로부터 각막을 적출하여, 둘베코 인산염 완충 식염수 (D-PBS; Invitrogen) 에 보관하고, 이를 무균 작업대로 옮겼다. 이하의 세포 제조 절차는 모두 무균적으로 수행되었다.
적출된 각막편을 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Indtrogen) 이 첨가된 D-PBS 로 3회 세정하고, 최소 필수 배지 (MEM; Invitrogen) 로 옮겼다. MEM 중에 침지된 각막편의 각막 상피 세포 및 데스메막을 안과 수술용 나이프 (Alcon) 로 박리 하고, 박리 후의 각막편 (각막 실질 및 각막 상피) 을, 디스파제 II (Roche Diagnostics) 가 2.4 U/mL 이 되도록 첨가된 MEM 으로 옮겼다. 이를 37 ℃로 1시간 인큐베이션하고, 그 후, 디스파제 II-처리된 각막편을 MEM 으로 옮겼다. MEM 중에 침지된 각막편의 각막 상피를 안과 수술용 나이프로 박리하고, 각막편 잔여물 (각막 실질) 을 MEM 으로부터 제거하였다. 박리된 각막 상피 세포 및 이를 함유한 MEM 을 50 mL 원심분리 튜브 내로 회수하고, 실온에서 5 분간 1,500 rpm 으로 원심분리하였다. 상청액을 따라내어 각막 상피 세포층을 수득하였다. 각막 상피 세포층에 1 mL 의 트립신-EDTA (Invitrogen) 를 첨가하고, 철저히 혼합한 후, 상기 세포를 37 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션하여 세포간의 접착을 분리시켰다. 이것에 10% 의 소태아혈청 (FBS; Invitrogen) 이 함유된 MEM 을 9 mL 첨가하여 효소 반응을 정지시키고, 이를, 실온에서 5 분간 1,500 rpm 으로 다시 원심분리하여 각막 상피 세포층을 수득하였다. 결과적인 각막 상피 세포층에 1 mM 의 정상 토끼 각막 상피 세포 증식용 무혈청 액체 배지 (RCGM2; Kurabo Industries LTD.) 를 첨가하여 세포를 현탁시키고, 이를 9 mL 의 RCGM2 가 첨가된 직경 10 cm 의 세포 배양용 배양 접시 (IWAKI) 내로 시딩(seeding)하였다. 시딩된 세포는 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 (SANYO) 내에서 배양되었다. 시험 당일까지 48 시간 마다 배양 배지를 새로운 배양 배지로 교환하였다.
3. 시험 물질 및 제조 방법
시험 물질로서 하기의 화합물을 사용하였다.
PPARα 아고니스트: WY-14643 (Calbiochem) 및 페노피브레이트 (Sigma-Aldrich)
PPARδ 아고니스트: L-165041 (Sigma-Aldrich)
각 시험 물질은, 배양 배지 중에서의 최종 농도의 200 배 농도가 되도록 에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 에 용해하고, 사용 직전까지 -80 ℃ 로 보관하였다.
각 시험 물질에 의한 세포 증식 촉진 효과를 연구하기 위해, RCGM2 에 부착된 마우스 유래 상피 성장 인자 (mEGF) 를 제거하여 제조한 배양 배지를 기초 배지로 이용하는 한편, 세포 증식 촉진 효과의 확인을 위한 양성 대조군으로서 mEGF 가 첨가된 배지 (기초 배지 + 10 ng/mL mEGF) 를 RCGM2 제조 프로토콜의 지시에 따라 사용하였다.
4. 시험 방법
1) 배양 접시의 콜라겐 처리
세포 증식 촉진 시험을 위한 배양 접시로서는 조직 배양용 96-웰 배양 접시 (Corning) 를 사용하였다. 시험 전날, 배양 접시의 각 웰에 0.01% 의 I형 콜라겐 (Nitta Gelatin Inc.) 을 50 ㎕ 씩 분주하고, 시험 직전까지 4 ℃ 로 코팅을 수행하였다. 시험 당일, I형 콜라겐 용액을 제거한 후, 배양 접시 바닥을 D-PBS를 이용해 3 회 세정하고, 시험에서 이를 콜라겐-처리된 배양 접시로서 사용하였다.
2) 세포 배양 및 시험 물질의 첨가
시험에서는, 직경 10 cm 의 배양 접시에서 서브콘플루엔트 (subconfluent) 가 될 때까지 배양한 토끼 각막 상피 세포를 사용하였다. 배양 배지를 제거한 후, 배양 접시 바닥을 D-PBS 를 이용하여 2 회 세정하고, 이것에 1 mL 의 트립신-EDTA를 첨가하고, 이를 37 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션함으로써, 세포를 배양 접시 바닥으로부터 박리시켰다. 인큐베이션 후, 배양 접시에 10%의 FBS 를 함유한 MEM 9 mL 를 첨가하여 효소 반응을 정지시킨 후, 실온에서 5 분간 1,500 rpm 으로 원심분리하여 각막 상피 세포층을 수득하였다. 수득된 세포에 대해, 세포 농도가 2×105 세포/mL 가 되도록 적당량의 RCGM2 를 첨가하여 세포를 현탁시켰다. 상기 세포 현탁액을, 콜라겐 처리한 조직 배양용 96-웰 배양 접시의 바닥 면적 (O.32 cm2) 당 세포수가 4×104 세포/cm2 이 되도록, 각 웰에 64 ㎕ 씩 분주하였다. 세포 시딩 완료 후, 배양 접시를 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 내로 옮겨, 이를 24시간 동안 배양하였다. 세포 시딩 24 시간 후, 배양 배지를 따라버리고, 상기 배양 접시의 각 웰에 하기의 배양 배지를 100 ㎕ 씩 분주하였다.
[1] 기초 배지만 (무첨가군)
[2] 기초 배지 + mEGF (최종 농도: 10 ng/mL; 양성 대조군)
[3] 기초 배지 + WY-14643 (최종 농도: 0.1 μM 및 1 μM)
[4] 기초 배지 + 페노피브레이트 (최종 농도: 1 μM 및 10 μM)
[5] 기초 배지 + L-165041 (최종 농도: 0.1 μM 및 1 μM)
모든 배양 배지 중의 에탄올 농도를 0.5% 로 균등화하기 위해, 배양 배지 [1] 및 [2] 각각에 1 mL 당 5 ㎕ 의 에탄올을 첨가하였다.
3) 세포수 측정
배양 배지 교환 48 시간 후, 각 웰의 배양 상청액을 제거하고, 그 후 각 웰에 10% 의 Cel1 Counting Kit-8 (DOJINDO) 이 첨가된 기초 배지를 100 ㎕ 씩 분주하였다. 분주 후, 배양 접시를 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 내로 옮겨 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간의 인큐베이션 후, 마이크로플레이트 리더 (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하고, 이것을 세포수 증가의 지표로 사용하였다.
5. 통계적 분석
무첨가군의 흡광도의 평균치를 100% 로 가정하여, 무첨가군, 각 시험 물질 첨가군 및 양성 대조군의 각 군의 값을 산출하고, 무첨가군과 각 시험 물질 첨가군 및 양성 대조군과의 비교를 Dunnett 다중 비교 검정법 (양측) 을 이용하여 수행하였다. 검정의 결과, 유의 수준 5% 미만을 유의한 것으로 판정하였다.
6. 시험 결과
각 군의 세포수 증가 효과를 표 1 에 나타내었다. 무첨가군의 세포 증식을 100% 로 가정할 때, 시험 물질 첨가군 및 양성 대조군 모두에서의 세포 증식은 무첨가군에서보다 유의하게 (p < 0.01) 더 높았고, 세포 증식이 향상된 것으로 나타났다. 이 시험 결과로부터, PPARα 아고니스트 및 PPARδ 아고니스트가 각막 상피 세포의 수를 증가시키는 것이 명백해졌다.
군 세포 증식(%) (무첨가군에 대한) 유의차
무첨가군 100.0±5.2
양성 대조군 (mEGF) 144.1±23.1 **
10-7M WY-14643 148.9±15.0 **
10-6M WY-14643 155.5±9.4 **
10-6M 페노피브레이트 147.3±11.8 **
10-5M 페노피브레이트 147.0±3.2 **
10-7M L-165041 163.3±8.2 **
10-6M L-165041 182.2±13.0 **
배양된 토끼 각막 상피 세포에 PPARα 아고니스트 또는 PPARδ 아고니스트 또는 mEGF (양성 대조) 를 첨가했을 때의 세포수의 변화를, 무첨가군의 평균치를 100% 로 했을 때의 값으로서 나타내었다(평균치±표준 편차, N = 5). 표 중의 **은 무첨가군과 비교한 유의차 (p < 0.01) 를 나타낸다.
(시험예 2)
각막 상피 세포를 사용한 세포수의 증가에 대한 PPARδ 아고니스트의 효과
1. 사용된 동물
수컷 토끼 (일본 백색종, 체중: 약 1.5 kg, KITAYAMA LABES Co., Ltd.) 를 사용하였다. 실험 동물은, International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals 에 따라 사용하였다.
2. 각막 상피 세포의 조제
토끼 각막 상피 세포는 (시험예 1)의 것과 동일한 방법을 이용하여 조제하였다.
3. 시험 물질 및 조제 방법
시험 물질로서는 하기의 화합물을 사용하였다.
PPARδ 아고니스트: L-165041 (Sigma-Aldrich) 및 GW-501516 (Alexis)
각 시험 물질은, 배양 배지 중에서의 최종 농도의 200 배 농도가 되도록 에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 에 용해시키고, 이를 사용 직전까지 -80 ℃로 보존하였다.
각 시험 물질에 의한 세포 증식 촉진 효과를 연구하기 위해, RCGM2 로부터 이에 부착된 마우스-유래 상피 성장 인자 (mEGF) 를 제거하여 제조된 배양 배지를 기초 배지로서 이용하는 한편, 세포 증식 촉진 효과의 확인을 위한 양성 대조로서는 mEGF 가 첨가된 배지 (기초 배지 +10 ng/mL mEGF) 를 RCGM2 조제 프로토콜의 지시에 따라 사용하였다.
4. 시험 방법
1) 배양 접시의 콜라겐 처리
배양 접시의 콜라겐 처리는 (시험예 1) 과 동일한 방법을 이용해 실시하였다.
2) 세포 배양 및 시험 물질의 첨가
시험에는, 직경 10 cm 의 배양 접시에서 서브콘플루언트가 될 때까지 배양된 토끼 각막 상피 세포를 사용하였다. 배양 배지를 제거한 후, 배양 접시 바닥을 D-PBS 를 이용하여 2 회 세정하고, 이것에 1 mL 의 트립신-EDTA 를 첨가하여 37 ℃로 5 분간 인큐베이션함으로써, 세포를 배양 접시 바닥으로부터 박리시켰다. 인큐베이션 후, 상기 배양 접시에 10% FBS 가 함유된 MEM 을 9 mL 첨가하여 효소 반응을 정지시키고, 이를 실온에서 5 분간 1,500 rpm 으로 원심분리하여 각막 상피 세포층을 수득하였다. 수득된 세포에 대해, 세포 농도가 1×105 세포/mL 가 되도록 적당량의 RCGM2 를 첨가하여 세포를 현탁시켰다. 상기 세포 현탁액을, 콜라겐-처리된 조직 배양용 96-웰 배양 접시의 바닥 면적 (0.32 cm2) 당 세포수가 2×104 세포/cm2 가 되도록, 각 웰에 64 ㎕ 씩 분주하였다. 세포 시딩 완료 후, 배양 접시를 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 내로 옮기고, 이를 24 시간 동안 배양하였다. 세포 시딩 24시간 후, 배양 배지를 따라버리고, 새롭게 배양 접시의 각 웰에 하기의 배양 배지를 100 ㎕ 씩 분주하였다.
[1] 기초 배지만 (무첨가군)
[2] 기초 배지 + mEGF (최종 농도: 10 ng/mL; 양성 대조군)
[3] 기초 배지 + L-165041 (최종 농도: 0.1 μM 및 1 μM)
[4] 기초 배지 + GW-501516 (최종 농도: 0.01 μM 및 0.1 μM)
모든 배양 배지 중의 에탄올 농도를 0.5% 로 균등화하기 위해, 배양 배지 [1] 및 [2] 각각에 1 mL 당 5 ㎕ 의 에탄올을 첨가하였다.
3) 세포수 측정
시험 물질을 함유한 배양 배지 교환 후 48 시간 마다, 각 웰의 배양 상청액을 제거하고, 각 웰에 새롭게 조제된 배양 배지를 100 ㎕ 씩 분주하였다. 시험 물질을 함유한 배양 배지에 대한 첫 회의 교환으로부터 120 시간 후, 각 웰의 배양 상청액을 제거하고, 그 후 각 웰에 10%의 Cel1 Counting Kit-8 (DOJINDO) 이 첨가된 기초 배지를 100 ㎕ 씩 분주하였다. 분주 후, 배양 접시를 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 내로 옮겨 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 2 시간의 인큐베이션 후, 마이크로플레이트 리더 (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 를 이용하여 450 nm 에서의 흡광도를 측정하고, 이것을 세포수 증가의 지표로 사용하였다.
5. 통계적 분석
무첨가군의 흡광도의 평균치를 100% 로 가정하여, 무첨가군, 각 시험 물질 첨가군 및 양성 대조군의 각 군의 값을 산출하고, 무첨가군과 각 시험 물질 첨가군 및 양성 대조군과의 비교를 Dunnett 다중 비교 검정법 (양측) 을 이용하여 수행하였다. 검정의 결과, 유의 수준 5% 미만을 유의한 것으로 판정하였다.
6. 시험 결과
각 군의 세포수 증가 효과를 표 2 에 나타내었다. 무첨가군의 세포 증식을 100% 로 가정하여, 시험 물질 첨가군 및 양성 대조군 모두에서의 세포 증식은 무첨가군에서보다 유의 (p < 0.01) 하게 더 높았고, 세포 증식이 향상된 것으로 나타났다. 이 시험 결과로부터, PPARδ 아고니스트 활성을 가진 화합물이 각막 상피 세포의 수를 증가시키는 것이 명백해졌다.
군 세포 증식(%) (무첨가군에 대한) 유의차
무첨가군 100.0±19.4
양성 대조군 (mEGF) 222.1±50.9 **
10-7 M L-165041 242.5±36.2 **
10-6 M L-165041 198.6±26.7 **
10-8 M GW-501516 223.9±24.1 **
10-7 M GW-501516 213.2±34.0 **
배양된 토끼 각막 상피 세포에 PPARδ 아고니스트 또는 mEGF (양성 대조) 를 첨가했을 때의 세포수의 변화를, 무첨가군의 평균치를 100% 로 한 값에 대한 상대치로 나타내었다(평균치±표준 편차, N = 5). 표 중의 ** 는 무첨가군과 비교한 유의차 (p < 0.01) 를 나타낸다.
(시험예 3)
마이봄선 상피 세포를 사용한 세포수의 증가에 대한 PPAR 아고니스트의 효과
1. 사용된 동물
암컷 사이노몰거스 (cynomolgus) 원숭이 (Environmental Biological Life Science Research Center) 를 사용하였다. 상기 실험 동물은, International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals 에 따라 사용되었다.
2. 마이봄선 상피 세포의 조제
마이봄선 상피 세포는 원숭이 눈꺼풀로부터 조제하였다. 눈꺼풀을 분리하여, 둘베코 인산염 완충 식염수 (D-PBS; Invitrogen) 중에 저장하고, 이것을 무균 작업대로 옮겼다. 이하의 세포 조제 절차는 모두 무균적으로 수행되었다.
적출한 눈꺼풀을 80% 에탄올 중에 30 초간 침지한 후, 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Invitrogen) 이 첨가된 D-PBS 로 3 회 세정하고, 최소 필수 배지 (MEM; Invitrogen) 로 옮겼다. 입체 현미경 하에서 마이봄선 조직을 둘러싸는 지방조직 및 근조직을 제거하고, 이것을 0.475 U/mL 의 콜라게나제 A (Roche Diagnostics) 및 2.4 U/mL 이 디스파제 II (Roche Diagnostics) 를 함유한 MEM 으로 옮겨 37 ℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 인큐베이션 완료 후, 효소 처리한 조직을 다시 입체 현미경 하에 두고, 속눈썹 및 눈꺼풀 결합 조직을 제거하고, 마이봄선 조직을 단리 하였다. 상기 단리한 선 조직에 1 mL 의 트립신-EDTA (Invitrogen) 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 이것에 10% FBS 를 함유한 MEM 9 mL 를 가하여 효소 반응을 정지시키고, 그 후, 10 mL 피펫을 이용하여 5 회, 또한 21G 주사바늘이 장치된 주사 시린지로 5 회 흡인 및 배출을 반복하여 조직 구성 세포를 분산시켰다. 세포 분산액은, 100 μm, 그 후, 40 μm 의 나일론 필터 (Cell Strainer; Falcon) 에 적용하여, 상기 분산액 중에 함유된 효소 처리되지 않은 세포 덩어리들을 제거하였다. 필터를 통과시킨 세포 현탁액을 50 mL 원심분리 튜브에 회수하여, 실온에서 5 분간 1,500 rpm 으로 원심분리하였다. 원심분리에 의해 수득한 목적 세포를 함유한 세포층에, 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA; Sigma-Aldrich) 을 함유한 D-PBS 80 ㎕ 를 첨가하여 세포를 충분히 현탁시킨 후, 이것에, 20 ㎕ 의 Anti-Fibroblast Microbeads (Militenyi Biotec) 를 가하여 실온에서 30 분간 방치하였다. 항체와의 반응 완료 후, 이것에 0.5% BSA 를 함유한 D-PBS 2 mL 를 첨가하고, 이를 다시 실온에서 5 분간 1,500 rpm 으로 원심분리하였다. 원심분리에 의해 수득한 목적 세포를 함유한 세포층에, 0.5% BSA 를 함유한 D-PBS 1 mL 를 첨가하여 세포를 충분히 현탁시키고, 이를, 칼럼 세정액 (2 mM EDTA (Dojindo Laboratories) 및 0.5% BSA 를 함유한 D-PBS) 을 이용하여 미리 평형화시킨 LD 칼럼 (Militenyi Biotec) 에 적가하였다. 그 후, 2 mL 의 칼럼 세정액을 LD 칼럼에 적가하였다. 세포 현탁액 적가 직후부터 칼럼 세정액 적가 완료까지, 칼럼에 흡착되지 않은 항체로 표지되지 않은 목적 세포 (비-섬유아세포) 를 50 mL 원심분리 튜브에 회수하였다. 원심분리 튜브에 회수한 세포를, 한번 더, 실온에서 5 분간 1,500 rpm 으로 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 이 침전물에, 1 mL 의 케라티노사이트-무혈청 제한배지 (DK-SFM;Defined Keratinocyte-Serum Free Medium; Invitrogen) 를 첨가하여 세포를 현탁시켜, 마이봄선 상피 세포 현탁액을 조제하였다. 조제한 세포는, 미리 I형 콜라겐 용액 (Nitta Gelatin Inc.) 으로 코팅시키고 3 mL DK-SFM 을 첨가한 직경 3.5 cm 의 세포 배양용 배양 접시(IWAKI) 에 시딩하였다. 시딩된 세포를 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 (SANYO) 내에서 배양하고, 배양 배지는 시험 당일까지 48 시간 마다에 새로운 배양 배지로 교환하였다.
3. 시험 물질 및 제조 방법
시험 물질로서 하기의 화합물을 사용하였다.
PPARα 아고니스트: 페노피브레이트 (Sigma-Aldrich)
PPARδ 아고니스트: L-165041 (Sigma-Aldrich)
PPARγ 아고니스트: 트로글리타존 (Calbiochem)
각 시험 물질은, 배양 배지 중에서의 최종 농도의 200 배 농도가 되도록 에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 에 용해시키고, 사용 직전까지 이를 -80 ℃ 로 보존하였다.
각 시험 물질에 의한 세포 증식 촉진 효과를 연구하기 위해, DK-SFM 에 부착된 보충물 (supplement) 을 제거하여 수득된 배양 배지를 기초 배지로서 이용하는 한편, 세포 증식 촉진 효과의 확인을 위한 양성 대조로서는 보충물이 첨가된 배지 (기초 배지 + 보충물) 를 DK-SFM 조제 프로토콜의 지시에 따라 사용하였다.
4. 시험 방법
1) 배양 접시의 콜라겐 처리
세포 증식 촉진 시험을 위한 배양 접시로서 조직 배양용 96-웰 배양 접시 (Corning) 를 사용하였다. 시험 전날, 배양 접시의 각 웰에 0.01% 의 I형 콜라겐 (Nitta Gelatin Inc.) 을 50 ㎕ 씩 분주하고, 시험 직전까지 4 ℃ 로 코팅을 수행하였다. 시험 당일, I형 콜라겐 용액을 제거한 후, 배양 접시 바닥을 D-PBS를 이용해 3 회 세정하고, 시험에서 이를 콜라겐-처리된 배양 접시로서 사용하였다.
2) 세포 배양 및 시험 물질의 첨가
시험에는, 직경 3.5 cm 의 배양 접시에서 서브콘플루언트가 될 때까지 배양되dj 액체 질소 중에서 동결 보존된 원숭이 마이봄선 상피 세포를 사용하였다. 셀 뱅커 (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) 에서 현탁하여 동결 보존해 둔 세포를 해동한 후, 50 mL 원심분리 튜브로 옮기고, 10 배량의 DK-SFM 을 첨가하였다. 이를 실온에서 5 분간 1,500 rpm 으로 원심분리하여 세포층을 회수한 후, 수득된 세포 농도가 3×106 세포/mL 가 되도록 적당량의 DK-SFM 을 첨가하여 세포를 현탁시켰다. 이 세포 현탁액을, 콜라겐-처리된 조직 배양용 96-웰 배양 접시의 바닥 면적 (O.32 cm2) 당 세포수가 6×104 세포/cm2 가 되도록, 각 웰에 64 ㎕ 씩 분주하였다. 세포 시딩 완료 후, 배양 접시를 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 내로 옮기고, 이를 24 시간 배양하였다. 세포 시딩 24시간 후, 배양 배지를 따라버리고, 새롭게 배양 접시의 각 웰에 하기의 배양 배지를 100 ㎕ 씩 분주하였다.
[1] 기초 배지만 (무첨가군)
[2] 기초 배지 + 보충물 (양성 대조군)
[3] 기초 배지 + 페노피브레이트 (최종 농도: 1 μM 및 10 μM)
[4] 기초 배지 + L-165041 (최종 농도: 0.1 μM 및 1 μM)
[5] 기초 배지 + 트로글리타존 (최종 농도: 0.1 μM 및 1 μM)
모든 배양 배지 중의 에탄올 농도를 0.5% 로 균등화하기 위해, 배양 배지 [1] 및 [2] 각각에 1 mL 당 5 ㎕ 의 에탄올을 첨가하였다.
3) 세포수 측정
첫 회 배양 배지 교환 48 시간 후, 배양 배지를 새롭게 조제한 상기 언급한 [1] 내지 [4] 각각의 배양 배지로 교환하였다. 또한, 그 후 48 시간 후에, 각 웰의 배양 상청액을 제거하고, 그 후 각 웰에 10% 의 Cel1 Counting Kit-8 (DOJINDO) 이 첨가된 DK-SFM 을 100 ㎕ 씩 분주하였다. 분주 후, 배양 접시를 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 내로 옮겨 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간의 인큐베이션 후, 마이크로플레이트 리더 (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하고, 이것을 세포수 증가의 지표로 사용하였다.
5. 통계적 분석
무첨가군의 흡광도의 평균치를 100% 로 가정하여, 무첨가군, 각 시험 물질 첨가군 및 양성 대조군의 각 군의 값을 산출하고, 무첨가군과 각 시험 물질 첨가군 및 양성 대조군과의 비교를 Dunnett 다중 비교 검정법 (양측) 을 이용하여 수행하였다. 검정의 결과, 유의 수준 5% 미만을 유의한 것으로 판정하였다.
6. 시험 결과
각 군의 세포수 증가 효과를 표 3 에 나타내었다. 무첨가군의 세포 증식을 100% 로 가정하여, PPARα 아고니스트인 페노피브레이트 첨가군 및 PPARδ 아고니스트인 L-165041 첨가군, 및 양성 대조군에서의 세포 증식은 무첨가 군에서보다 유의하게 (p < 0.01) 더 높았고, 세포 증식이 향상되는 것으로 나타났다. 한편, PPARγ 아고니스트인 트로글리타존은 세포 증식 촉진 활성을 나타내지 않았다. 이 시험 결과로부터, PPARα 아고니스트 및 PPARδ 아고니스트가 마이봄 상피 세포의 수를 증가시키는 것이 명백해졌다.
군 세포 증식(%) (무첨가군에 대한) 유의차
무첨가군 100.0±4.7
양성 대조군 (보충물) 131.4±5.7 **
10-6 M 페노피브레이트 114.5±4.5 **
10-5 M 페노피브레이트 127.8±5.2 **
10-7 M L-165041 136.1±4.7 **
10-6 M L-165041 142.8±5.4 **
10-7 M 트로글리타존 101.6±4.0
10-6 M 트로글리타존 99.9±1.9
배양된 원숭이 마이봄선 상피 세포에 PPARα 아고니스트, PPARδ 아고니스트 또는 PPARγ 아고니스트 또는 보충물 (양성 대조) 을 첨가했을 때의 세포수의 변화를, 무첨가군의 평균치를 100% 로 했을 때의 값으로서 나타내었다(평균치±표준 편차, N = 5). 표 중의 **은 무첨가군과 비교한 유의차 (p < 0.01) 를 나타낸다.
(시험예 4)
각막 상피 세포 및 마이봄선 상피 세포에서의 PPAR들의 발현
1. 사용된 세포
토끼 각막 상피 세포로서는, (시험예 1) 과 동일한 방법으로 조제 및 배양된 세포를 사용하였다. 원숭이 마이봄선 상피 세포로는 (시험예 3) 과 동일한 방법으로 조제 및 배양된 세포를 사용하였다. 인간 각막 상피 세포 (Kurabo Industries LTD.) 는 정상 인간 각막 상피 세포 증식용 무혈청 기초 배지 (EpiLife; Kurabo Industries LTD.) 를 이용하여 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 내에서 배양된 세포를 사용하였다.
2. 시험 방법
1) 세포로부터의 총 RNA (total RNA) 의 추출
TRizol Reagent (Invitrogen) 의 통상적인 방법에 따라 각 세포로부터 총 RNA 를 추출하였다.
2) 추출된 RNA 로부터의 cDNA 제조
DNA-free (Ambion) 의 통상적인 방법에 따라 추출한 총 RNA 의 DNase 처리를 37 ℃ 에서 30 분간 수행하여, 게놈 DNA 를 제거하였다.
추출한 RNA 로부터의 cDNA 제조는 Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) 의 통상적인 방법에 따라 수행하였다. 즉, 랜덤 프라이머 (Invitrogen) 를 이용하여, DNase 처리한 1 μg 의 총 RNA 로부터 이들에 상보하는 cDNA 를 제조하였다.
3) PPAR들의 유전자의 증폭 (중합효소 연쇄 반응; PCR)
PPAR들의 유전자의 PCR 은 Platinum PCR SuperMix (Invitrogen) 의 통상적인 방법에 따라 수행하였다. PPAR들의 프라이머는, 공지의 인간, 침팬지, 사이노몰거스 원숭이, 소 및 마우스의 서열을 참고하여, PCR 산물이 약 200 bp 가 되도록 설계하였다.
PPARα: GTAGAATCTGCGGGGACAAG (센스) (서열번호: 1)
: GTTGTGTGACATCCCGACAG (안티센스) (서열번호: 2)
PPARδ: TTCCTTCCAGCAGCTACACA (센스) (서열번호: 3)
: GATCGTACGACGGAAGAAGC (안티센스) (서열번호: 4)
PPARγ: CTCCGTGGATCTCTCCGTAA (센스) (서열번호: 5)
: GATGCAGGCTCCACTTTGAT (안티센스) (서열번호: 6)
PCR 반응은, 94 ℃ 에서 2 분 15 초간 반응시킨 후, 94 ℃ 에서 30 초간, 55 ℃ 에서 30 초간, 72 ℃ 에서 30 초간의 3 단계의 반응을 35 회 반복함으로써 완료되었다. PCR 반응 후의 시료를 2 % 아가로오스 겔을 사용한 전기 영동에 적용하고, 그 후 상기 겔 내에서 분리된 DNA 를 SYBR Gold (Molecular Probes) 를 이용해 염색하였다. 염색된 DNA 를 UV 투사기 (transilluminator) 상에서 발광시키고, 이 영상을 디지털 데이터로서 보존하였다.
3. 시험 결과
영동 후의 염색된 DNA 의 밴드를 도 1 에 나타내었다. 본 시험의 결과, 인간 각막 상피 세포 및 원숭이 마이봄선 상피 세포에는 PPARα, PPARδ 및 PPARγ 모두가 발현되고 있는 것이 확인되었다. 또한, 토끼 각막 상피 세포에서는 PPARδ 의 발현만이 확인되었다. Bonazzi 등은 토끼 각막 상피 세포에는 PPAR들 중 PPARα 및 PPARβ(=δ) 가 발현되는 것으로 보고하였지만(Bonazzi A. 등, J. Biol. Chem. (2000); 275 (4): 2837-2844), 이들의 보고에서, 그들은 PPARα의 검출을 위해 특수한 방법을 이용하고 있다. 시험예 1 에 나타낸 바와 같이, PPARα 아고니스트가 토끼 각막 상피 세포의 증식을 촉진시키는 것은 분명하지만, Bonazzi 등에 의한 보고에서도 PPARα이 특수한 검출 방법을 이용해 검출되기 때문에, 토끼 각막 상피 세포에서의 PPARα 의 발현량은 매우 적은 것으로 추측된다.
(시험예 5)
정상 인간 각막 상피 세포를 사용한 세포수의 증가에 대한 PPARδ 아고니스트의 효과
1. 사용된 세포
정상 인간 각막 상피 세포 (KURABO) 를 사용하였다.
2. 시험 물질 및 조제 방법
시험 물질로서 하기의 화합물을 사용하였다.
PPARδ 아고니스트: L-165041 (Sigma-Aldrich), GW-501516 (Alexis)
각 시험 물질은, 배양 배지 중에서의 최종 농도의 200배 농도가 되도록 에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 에 용해시켜, 사용 직전까지 -80 ℃ 로 보존하였다.
각 시험 물질에 의한 세포 증식 촉진 효과를 연구하기 위해, 세포 배양 배지로서 HCGS 증식 첨가제 세트 (KURABO) 에 함유된 인슐린, 하이드로코르티손 및 트랜스페린을 EpiLife (KUMBO) 에 첨가한 배지 (기초 배지) 를 사용하였다. 또한, 세포 증식 촉진 효과의 확인을 위한 양성 대조로서는 기초 배지에 HCGS 증식 첨가제 세트 (KUMBO) 에 함유된 마우스 유래 상피 성장 인자 (mEGF) 를 첨가한 배지 (기초 배지 + 1 ng/mL mEGF) 를 사용하였다.
3. 시험 방법
1) 세포 배양 및 시험 물질의 첨가
액체 질소 중에 동결 보존된 정상 인간 각막 상피 세포를 해동하여, 세포수를 계수한 후, 그 전체량을, HCGS 증식 첨가제 세트 (인슐린, 마우스-유래 상피 성장 인자, 하이드로코르티손, 트랜스페린, 소 뇌하수체 추출물) 의 모두가 첨가된 4 mL 의 EpiLife (완전 배지) 중으로 옮겨 충분히 현탁하였다. 상기 세포 현탁액을, 피프로넥틴-코팅된 멀티웰 플레이트 (24 웰, BECTON DICKINSON) 에, 세포수가 2×104 세포/500 ㎕/웰이 되도록 시딩하였다(바닥 면적이 2 cm2 이기 때문에, 세포수는 1×104 세포/cm2).
세포 시딩 완료 후, 배양 접시를 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 내에서 24 시간 동안 배양하고, 그 후 배양 배지를 각 400 ㎕ 의 기초 배지로 교환하였다. 나아가, 그 후 24 시간 후, 배양 배지를 하기의 배양 배지 각 400 ㎕ 로 교환하였다.
[1] 기초 배지만 (무첨가군)
[2] 기초 배지 + mEGF (최종 농도: 1 ng/mL; 양성 대조군)
[3] 기초 배지 + L-165041 (최종 농도: 0.01 μM 및 0.1 μM)
[4] 기초 배지 + GW-501516 (최종 농도: 0.001 μM 및 0.01 μM)
모든 배양 배지 중의 모든 에탄올 농도를 0.5% 로 균등화하기 위해, 배양 배지 [1] 및 [2] 각각에 1 mL 당 5 ㎕ 의 에탄올을 첨가하였다.
3) 세포수 측정
시험 물질에 의한 자극 개시로부터 24 시간 후, 각 웰의 배양 상청액을 제거하고, 그 후 각 웰에 10% 의 Cel1 Counting Kit-8 (DOJINDO) 이 첨가된 기초 배지를 200 ㎕ 씩 분주하였다. 분주 후, 배양 접시를 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 내로 옮겨 2 시간 동안 인큐베이션하고, 반응 완료후의 상청액으로부터 각 100 ㎕ 를 취하여 조직 배양용 96-웰 배양 접시 (Corning) 에 넣었다. 96-웰 배양 접시로 옮긴 반응액의 450 nm 에서의 흡광도를 마이크로 플레이트 리더 (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical Co., Ltd.) 를 이용해 측정하고, 이것을 세포수 증가의 지표로 이용하였다.
4. 통계적 분석
무첨가군의 흡광도의 평균치를 100% 로 했을 때의, 무첨가군, 각 시험 물질 첨가군 및 양성 대조군의 각 군의 값을 산출하여, 무첨가군과 각 시험 물질 첨가군 및 양성 대조군과의 비교를 Dunnett 의 다중 비교 검정법 (한쪽 편) 을 이용해 수행하였다. 검정의 결과, 유의 수준 5% 미만을 유의한 것으로 판정하였다.
5. 시험 결과
각 군의 세포수 증가 효과를 표 4 에 나타내었다. 무첨가군의 세포 증식을 100% 로 했을 경우, 시험 물질 첨가군 (p < 0.01) 및 양성 대조군 (p < 0.05) 에서의 세포 증식은 무첨가 군에서보다 유의하게 더 높았고, 세포 증식이 향상된 것으로 나타났다. 이 시험 결과로부터, PPARδ 아고니스트는 정상 인간 각막 상피 세포의 수를 증가시키는 것이 명백해졌다.
군 세포 증식 (%) (무첨가군에 대한) 유의차
무첨가군 100.0±7.9
양성 대조군 (mEGF) 112.1±1.5 *
10-8 M L-165041 128.1±5.3 **
10-7 M L-165041 127.8±6.0 **
10-9 M GW-501516 133.1±3.7 **
10-8 M GW-501516 125.7±2.3 **
배양된 정상 인간 각막 상피 세포에 PPARδ 아고니스트 또는 mEGF (양성 대조) 를 첨가했을 때의 세포수의 변화를, 무첨가군의 평균치를 100% 로 했을 때의 값으로서 나타내었다(평균치±표준 편차, N = 3 내지 4). 표 중의 *은 무첨가군에 대한 유의차 (p < 0.05) 를 나타내고, 표 중의 **는 무첨가군에 대한 유의차 (p < 0.01) 를 나타낸다.
(시험예 6)
정상 인간 각막 상피 세포를 사용한 세포수의 증가에 대한 PPARδ 아고니스트의 효과
1. 사용된 세포
정상 인간 각막 상피 세포 (KURABO) 를 사용하였다.
2. 시험 물질 및 조제 방법
시험 물질로서 하기의 화합물을 사용하였다.
PPARδ 아고니스트: GW-501516 (Alexis), GW-0742 (Sigma-Aldrich)
각 시험 물질은, 배양 배지 중에서의 최종 농도의 200 배 농도가 되도록 에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 에 용해하고, 사용 직전까지 -80 ℃ 로 보관하였다.
각 시험 물질에 의한 세포 증식 촉진 효과를 연구하기 위해, 세포 배양 배지로서는, HCGS 증식 첨가제 세트 (KURABO) 에 함유된 인슐린, 하이드로코르티손 및 트랜스페린을 EpiLife (KURABO) 에 첨가한 배양 배지 (기초 배지) 를 사용하였다.
3. 시험 방법
1) 세포 배양 및 시험 물질의 첨가
액체 질소 중에 동결 보존된 정상 인간 각막 상피 세포를 해동하고, 세포수를 계수한 후, 그 전체량을, HCGS 증식 첨가제 세트 (인슐린, 마우스-유래 상피 성장 인자, 하이드로코르티손, 트랜스페린, 소 뇌하수체 추출물) 의 모두가 첨가된 4 mL의 EpiLife (완전 배지) 중으로 옮겨, 충분히 현탁하였다. 이 세포 현탁액을 조직 배양용 96-웰 배양 접시 (Corning) 에, 세포수가 1.28×104 세포/100 ㎕/웰이 되도록 시딩하였다(바닥 면적이 O.32 cm2 이기 때문에, 세포수는 4×104 세포/cm2).
세포 시딩 완료 후, 배양 접시를 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 내에서 24시간 배양하고, 그 후 배양 배지를 100 ㎕ 의 기초 배지 (HCGS 증식 첨가제 중 인슐린, 하이드로코르티손 및 트랜스페린이 첨가된 EpiLife) 로 교환하였다.
나아가, 그 후 24 시간 후, 배양 배지를 하기의 배양 배지 각 100 ㎕ 로 교환하였다.
[1] 기초 배지만 (무첨가군)
[2] 기초 배지 + GW-501516 (최종 농도: 0.01 μM)
[3] 기초 배지 + GW-0742 (최종 농도: 0.01 μM)
모든 배양 배지 중의 모든 에탄올 농도를 0.5% 로 균등화하기 위해, 배양 배지 [1] 에 1 mL 당 5 ㎕ 의 에탄올을 첨가하였다.
3) 세포수 측정
시험 물질에 의한 자극 개시로부터 48 시간 후, 각 웰의 배양 상청액을 제거하고, 그 후 각 웰에 10% 의 Cel1 Counting Kit-8 (DOJINDO) 을 첨가한 기초 배지를 100 ㎕ 씩 분주하였다. 분주 후, 배양 접시를 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 내로 옮겨 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰의 450 nm 에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더 (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical Co., Ltd.) 를 이용해 측정하고, 이것을 세포수 증가의 지표로 이용하였다.
5. 통계적 분석
무첨가군의 흡광도의 평균치를 100% 로 가정하여, 무첨가군 및 각 시험 물질 첨가군의 값을 산출하고, 무첨가군과 각 시험 물질 첨가군 및 양성 대조군과의 비교를 Dunnett 다중 비교 검정법 (한쪽 편) 을 이용하여 수행하였다. 검정의 결과, 유의 수준 5% 미만을 유의한 것으로 판정하였다.
6. 시험 결과
각 군의 세포수 증가 효과를 표 5 에 나타내었다. 무첨가군의 세포 증식을 100% 로 가정할 때, 양 시험 물질 첨가군에서의 세포 증식은 무첨가 군에서보다 유의하게 더 높았고, 세포 증식이 향상된 것으로 나타났다(p < 0.01). 이 시험 결과로부터, PPARδ 아고니스트가 정상 인간 각막 상피 세포의 수를 증가시키는 것이 명백해졌다.
군 세포 증식 (%) (무첨가군에 대한) 유의차
무첨가군 100.0±8.3
10-8 M GW-501516 129.2±7.5 **
10-8 M GW-0742 124.1±13.5 **
배양된 정상 인간 각막 상피 세포에 PPARδ 아고니스트를 첨가했을 때의 세포수의 변화를, 무첨가군의 평균치를 100% 로 했을 때의 값으로서 나타내었다(평균치±표준 편차, N = 4 내지 5). 표 중의 **은 무첨가군에 대한 유의차 (p < 0.01) 를 나타낸다.
(시험예 7)
정상 인간 각막 상피 세포를 사용한 세포수의 증가에 대한 PPARγ 아고니스트의 효과
1. 사용된 세포
정상 인간 각막 상피 세포 (KURABO) 를 사용하였다.
2. 시험 물질 및 조제 방법
시험 물질로서, 하기 화합물을 사용하였다.
PPARγ 아고니스트: 트로글리타존 (Calbiochem)
상기 시험 물질을, 배양 배지 중에서의 최종 농도의 200배 농도가 되도록 에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 에 용해시켜, 사용 직전까지 -80 ℃ 로 보존하였다.
정상 인간 각막 상피 세포에 대한 각 시험 물질의 영향을 연구하기 위해, 세포 배양 배지로서, HCGS 증식 첨가제 세트 (KURABO) 에 함유된 첨가제 중 마우스-유래 상피 성장 인자 (mEGF) 를 제외하는, 인슐린, 하이드로코르티손 및 트랜스페린이 EpiLife (KUMBO) 에 첨가된 배지 (EpiLife 기초 배지) 를 사용하였다.
3. 시험 방법
1) 세포 배양 및 시험 물질의 첨가
정상 인간 각막 상피 세포
액체 질소 중에 동결 보존된 정상 인간 각막 상피 세포를 해동하여, 세포수를 계수한 후, 그 전체량을 mEGF 가 함유된 HCGS 증식 첨가제 세트 모두가 첨가된 EpiLife (완전 배지) 중으로 옮겨, 충분히 현탁하였다. 이 세포 현탁액을, 시험예 1 에서와 같이 콜라겐-코팅 처리를 한 멀티웰 플레이트 (96-웰, Costar) 에, 세포수가 1.28×104 세포/64 ㎕/웰이 되도록 시딩하였다(바닥 면적이 0.32 cm2 이기 때문에, 세포수는 4×104 세포/cm2).
세포 시딩 완료 후, 배양 접시를 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 내에서 24 시간 동안 배양하고, 그 후, 배양 배지를 하기의 시험 물질이 함유된 배양 배지 각 100 ㎕ 로 교환하여 배양을 계속 하였다.
[1] EpiLife 기초 배지만 (무첨가군)
[2] EpiLife 기초 배지 + 트로글리타존 (최종 농도: 0.1 μM)
모든 배양 배지 중의 모든 에탄올 농도를 0.5% 로 균등화하기 위해, 배양 배지 [1] 에 1 mL 당 5 ㎕ 의 에탄올을 첨가하였다. 시험 물질 첨가 개시일과 세포수 계수일 사이에, 2일 마다 배양 배지를 상기 언급한 시험 물질을 함유한 배양 배지로 교환하였다.
2) 세포수 측정
시험 물질에 의한 자극 개시로부터 6 일 후, 각 웰의 배양 상청액을 제거하고, 그 후 각 웰에 10% 의 Cel1 Counting Kit-8 (DOJINDO) 이 첨가된 EpiLife 기초 배지를 100 ㎕ 씩 분주하였다. 분주 후, 배양 접시를 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 내로 옮겨 2 시간 동안 인큐베이션하고, 상기 반응 완료 후의 상기 배양 접시의 각 웰의 흡광도 (450 nm) 를 마이크로플레이트 리더 (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical Co., Ltd.) 를 이용해 측정하고, 이것을 세포수 증가의 지표로 이용하였다.
5. 통계적 분석
무첨가군의 흡광도의 평균치를 100% 로 가정하여, 무첨가군 및 각 시험 물질 첨가군의 값을 산출하고, 무첨가군과 각 시험 물질 첨가군과의 비교를 Dunnett 다중 비교 검정법 (한쪽 편) 을 이용하여 수행하였다. 검정의 결과, 유의 수준 5% 미만을 유의한 것으로 판정하였다.
6. 시험 결과
정상 인간 각막 상피 세포에 대한 PPARγ 아고니스트의 영향을 표 6 에 나타내었다. 상기 시험 결과로부터, 각막 상피 세포의 수를 증가시키는 효과는 PPARγ 아고니스트에서는 인정되지 않았다.
군 세포 증식(%)
무첨가군 100.0±6.6
10-7 M 트로글리타존 74.1±5.1
배양된 정상 인간 각막 상피 세포에 PPARγ 아고니스트를 첨가했을 때의 세포수를, 무첨가군의 평균치를 100% 로 했을 때의 값으로서 나타내었다(평균치±표준 편차, N = 3 내지 4). 표 중의 ** 은 무첨가군에 대한 유의차 (p < 0.01) 를 나타낸다.
(시험예 8)
마이봄선 상피 세포의 세포수 증가에 대한 PPARδ 아고니스트의 효과
1. 원숭이 마이봄선 상피 세포의 조제
시험예 3 에서와 마찬가지로 원숭이 눈꺼풀로부터의 마이봄선 상피 세포의 조제를 수행하였다. 상기 세포는 케라티노사이트-무혈청 제한 배지 (DK-SFM; Invitrogen, 첨부된 보충물은 조제 프로토콜에 따라 첨가됨) 을 이용하여, 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 (SANYO) 내에서 배양되었고, 배양 배지는 세포가 서브콘플루언트에 이를 때까지 48 시간 마다 새로운 것으로 교환하였다.
2. 시험 물질 및 조제 방법
시험 물질로서, 하기 화합물이 사용되었다.
PPARδ 아고니스트: L-165041 (Sigma-Aldrich) 및 GW-501516 (Alexis)
각 시험 물질은, 배양 배지 중에서의 최종 농도의 200배 농도가 되도록 에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 에 용해시켜, 사용 직전까지 -80 ℃ 로 보존하였다.
각 시험 물질에 의한 세포 증식 촉진 효과를 연구하기 위해, DK-SFM 으로부터 이에 부착된 보충물을 제거하여 제조된 배양 배지를 기초 배지로서 이용하는 한편, 세포 증식 촉진 효과의 확인을 위한 양성 대조로서는 상기 보충물이 첨가된 배양 배지 (기초 배지 + 보충물) 를 DK-SFM 조제 프로토콜의 지시에 따라 사용하였다.
3. 시험 방법
1) 배양 접시의 콜라겐 처리
세포 증식 촉진 시험을 위한 배양 접시는, 시험예 3 에서와 마찬가지로, I형 콜라겐 (Nitta Gelatin Inc.) 을 이용해 코팅하였다.
2) 세포 배양 및 시험 물질의 첨가
시험에는, 서브콘플루언트가 될 때까지 배양하여 셀 뱅커 (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) 중에 현탁해 액체 질소 중에서 동결 보존시킨 원숭이 마이봄선 상피 세포가 사용되었다. 동결 보존해 둔 세포를 해동한 후, 50 mL 원심분리 튜브으로 옮겨 거기에 10 배량의 DK-SFM 를 첨가하였다. 실온에서 5 분간 1,500 rpm 으로 원심분리하여 세포층을 회수한 후, 수득된 세포 농도가 2×106 세포/mL 가 되도록 적당량의 DK-SFM 를 첨가해 세포를 현탁시켰다. 이 세포 현탁액을, 콜라겐-처리한 조직 배양용 96-웰 배양 접시의 바닥 면적 (0.32 cm2) 당 세포수가 4×104 세포/cm2 가 되도록 각 웰에 64 ㎕ 씩 분주하였다. 세포 시딩 완료 후, 배양 접시를 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 내로 옮기고, 이를 24 시간 동안 배양하였다. 세포 시딩 24 시간 후, 배양 배지를 따라버리고, 배양 접시의 각 웰에 새롭게 하기의 배양 배지를 100 ㎕ 씩 분주하였다.
[1] 기초 배지만 (무첨가군)
[2] 기초 배지 + 보충물 (양성 대조군)
[3] 기초 배지 + L-165041 (최종 농도: 0.1 μM 및 1 μM)
[4] 기초 배지 + GW-501516 (최종 농도: 0.01 μM 및 0.1 μM)
모든 배양 배지 중의 에탄올 농도를 0.5% 로 균등화하기 위해, 배양 배지 [1] 및 [2] 각각에 1 mL 당 5 ㎕ 의 에탄올을 첨가하였다.
3) 세포수 측정
첫 회 배양 배지 교환 48 시간 후, 배양 배지를 새롭게 조제한 상기 언급한 [1] 내지 [4] 각각의 배양 배지로 교환하였다. 또한, 그로부터 48 시간 후, 상기 배양 배지를 새롭게 조제한 [1] 내지 [4] 각각의 배양 배지로 다시 교환하였다. 또한, 그 후 48 시간 후에, 각 웰의 배양 상청액을 제거하고, 그 후 각 웰에 10% 의 Cel1 Counting Kit-8 (DOJINDO) 이 첨가된 기초 배지를 100 ㎕ 씩 분주하였다. 분주 후, 배양 접시를 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 습도로 설정된 인큐베이터 내로 옮겨 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간의 인큐베이션 후, 마이크로플레이트 리더 (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하고, 이것을 세포수 증가의 지표로 사용하였다.
4. 통계적 분석
무첨가군의 흡광도의 평균치를 100% 로 가정하여, 무첨가군, 각 시험 물질 첨가군 및 양성 대조군의 각 군의 값을 산출하고, 무첨가군과 각 시험 물질 첨가군 및 양성 대조군과의 비교를 Dunnett 다중 비교 검정법 (한쪽 편) 을 이용하여 수행하였다. 검정의 결과, 유의 수준 5% 미만을 유의한 것으로 판정하였다.
5. 시험 결과
각 군의 세포 증식 촉진 효과를 표 7 에 나타내었다. 무첨가군의 세포 증식을 100% 로 가정했을 때, PPARδ 아고니스트인 L-165041 (10-6 M) 의 첨가군 및 역시 PPARδ 아고니스트인 GW-501516 (10-7 M) 의 첨가군, 및 양성 대조군에서의 세포 증식은, 무첨가군에서보다 유의하게 더 높았고, 세포 증식이 향상된 것으로 나타났다. 이 시험 결과로부터, PPARδ 아고니스트가 마이봄선 상피 세포의 수를 증가시키는 것이 명백해졌다.
군 세포 증식 (%) (무첨가군에 대한) 유의차
무첨가군 100.0±23.9
보충물 149.6±57.7 *
10-7 M L-165041 142.9±22.3
10-6 M L-165041 169.1±19.6 **
10-8 M GW-501516 133.3±7.4
10-7 M GW-501516 156.1±18.9 *
배양된 원숭이 마이봄선 상피 세포에 PPARδ/β 아고니스트 또는 보충물 (양성 대조) 을 첨가했을 때의 세포수의 변화를, 무첨가군의 평균치를 100% 로 했을 때의 값으로서 나타내었다(평균치 ± 표준 편차, N = 5). 표 중의 *은 무첨가군에 대한 유의차 (p < 0.05) 를 나타내고, 표 중의 **는 무첨가군에 대한 유의차 (p < 0.01) 를 나타낸다.
(시험예 9)
PPARδ 아고니스트에 의한 각막 상피 창상에 대한 치유 촉진 활성에 대한 연구
1. 사용된 동물
수컷 토끼 (일본 백색종, KITAYAMA LABES Co., Ltd.) 를 사용하였다. 상기 실험 동물은, International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals 에 따라 사용되었다.
2. 시험 물질 및 점안액의 제조 방법
시험 물질로서 PPARδ 아고니스트 GW-501516 (Alexis Biochemicals) 을 사용하였다. GW-501516 을 0.05% 가 되도록 하기의 비히클에 현탁시킨 용액을 점안액으로서 사용하였다.
인산 이수소나트륨 탈수화물 0.05 g
염화나트륨 0.45 g
초순수 (ultrapure water) 적당량
폴리소르베이트 80 0.05 mL
NaOH 적당량
전체량 50 mL (pH 7.0)
시험 물질 투여군의 대조로서, 약물을 함유하지 않는 상기 언급한 비히클 투여군을 설정하였다.
3. 실험 방법
1) 각막 상피 스크래핑 (scraping)
셀락타르 (selactar) (2% 자일라진 (xylazine); Bayer): 케탈라르 (ketalar) (5% 케타민 (ketamine); Sankyo) = 0.5 : 1 혼합액의 근육내 주사 (0.9 mL/kg) 로 동물에 전신 마취를 실시한 후, 염산 옥시부프로카인 점안액 (Benoxil 점안액 0.4%; Santen Pharmaceutical Co., Ltd.) 을 투여하고, 안구를 적출하였다. 직경 6 mm 의 원형절제기 (trephine) 를 이용하여 각막 중앙부의 각막 상피 상에 직경 6 mm 의 스탬프를 찍고, 입체 현미경 하에서, 핸디 루터 (handy rooter) 를 이용하여 스탬프가 찍힌 원주 내의 전체 각막 상피층을 스크래핑하였다. 스크래핑 후, 생리 식염수 (Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.) 를 이용해 각막 표면을 세정하고, 안구를 안와에 복위시켜 각막 상피 스크래핑 처치를 완료하였다.
2) 투여
각막 상피 스크래핑 당일은 1 일 2 회, 다음날 및 그 이후 시험 종료까지는 1 일 4 회, 처치된 눈에 대해 시험 물질 점안액 또는 점안액 비히클을 1회당 50 ㎕씩, 마이크로피펫을 이용해 투여하였다.
3) 평가
모든 개체의 양쪽 눈의 각막 상피 스크래핑이 완료된 시점을 시험 개시 시간 (0 시간) 으로 정의하고, 그 후 24, 38 및 48 시간째의 각막 상피 결손 면적을 정량함으로써, 각막 상피의 수복을 평가하였다. 즉, 각 시점에서, 처치된 눈에 0.1% 플르오레세인 나트륨 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 용액을 10 ㎕ 투여하여, 즉시 코발트 필터가 장치된 슬릿 램프를 이용해 동물의 전방 안구 부분의 사진을 촬영함으로써, 염색된 각막 상피 결손 영역을 기록하였다. 현상된 사진을 컴퓨터에 디지털 영상으로서 저장하여, 영상 분석 소프트웨어 (Image-Pro Plus) 를 이용해 염색된 각막 상피 결손 부분의 면적을 측정하였다.
4. 통계적 분석
각 시점에서 측정된 각막 상피 결손 면적에 대해, 각 개체의 초기치를 100% 로 했을 때의 각 개체에 대한 값을 산출하여, 이것을 잔존하는 각막 상피 결손의 비율로 택하였다. 각 시점에서의 잔존 각막 상피 결손의 비율에 대해, 비히클 투여군 및 시험 물질 투여군과의 비교를 t-검정에 의해 실시하고, 유의 수준 5% 미만을 유의한 것으로 판정하였다.
5. 시험 결과
비히클 투여군 및 0.05% GW-501516 투여군의 각 측정 시점에서의 잔존하는 각막 상피 결손의 비율이 표 8 에 나타나 있다. 각막 상피 스크래핑 24 시간 후 및 38 시간 후에, 각막 상피 결손의 비율이 0.05% GW-501516 투여군에서 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 48 시간 후에는 모든 개체에서 각막 상피 결손이 사라졌다. 이 시험 결과로부터, 눈에의 PPARδ 아고니스트의 투여에 의해, 결손 각막 상피의 수복이 촉진되는 것이 명백해졌다.
군 기제 투여군(%) 0.05% GW-501516 투여군 (%)
0 시간 (초기 값) 100.0±4.9 100.0±6.5
24 시간 후 33.6±3.8 25.3±3.1 *
38 시간 후 3.6±1.2 0.2±0.2 **
각 개체에 있어서, 토끼 눈에 대해 각막 상피 스크래핑 처치를 실시한 후, 잔존하는 각막 상피 결손의 비율(%)을, 초기 값을 100% 로 가정하여 산출한 값이 나타나 있다(평균치 ± 표준 편차, N = 4). 표 중의 *은 비히클 투여군과 비교한 유의차 (p < 0.05) 를 나타내고, **는 비히클 투여군과 비교한 유의차 (p < 0.01) 를 나타낸다.
본 발명에 따르면, 신규한 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진제 또는 신규한 각막 상피 세포의 증식 촉진제가 제공되고, 상기 촉진제는, 마이봄선 상피 세포 및 각막 상피 세포의 증식을 촉진한다. 또한, 본 발명의 치료제는, 마이봄선 기능 부전, 각막 상피 장해, 또는, 과다증발성 건성안 등의 질환의 치료/개선에 유효하게 사용될 수 있다.
본 발명은, 2005 년 11 월 28 일 출원된 일본 특허 출원 제 2005-342025 호를 기초로 하고 있으며, 그 내용은 모두 본 명세서에 참조로서 포함된다.
<110> Senju Pharmaceutical Co., Ltd. <120> PHARMACEUTICAL COMPRISING PPAR AGONIST <130> 09996 <150> JP 2005-342025 <151> 2005-11-28 <160> 6 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtagaatctg cggggacaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gttgtgtgac atcccgacag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttccttccag cagctacaca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gatcgtacga cggaagaagc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ctccgtggat ctctccgtaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gatgcaggct ccactttgat 20

Claims (34)

  1. PPARα 또는 δ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진제.
  2. PPARα 또는 δ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 각막 상피 세포의 증식 촉진제.
  3. PPARα 또는 δ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 마이봄선 기능 부전 치료제.
  4. PPARα 또는 δ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 각막 상피 장해 치료제.
  5. PPARα 또는 δ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 과다증발성 건성안 치료제.
  6. PPARδ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진제.
  7. PPARδ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 각막 상피 세포의 증식 촉진제.
  8. PPARδ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 마이봄선 기능 부전 치료제.
  9. PPARδ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 각막 상피 장해의 치료제.
  10. PPARδ 아고니스트를 활성 성분으로서 함유하는, 과다증발성 건성안의 치료제.
  11. 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서, PPARα 또는 δ 아고니스트가 하기 화학식 (I) 로 표시되는 화합물 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염인 제제:
    Figure 112008046546322-PCT00005
    [식 중,
    A 는 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이고,
    B 는 -CO-, -NH-, -(CH2)n-S-, -(CH2)n-O- 및 -O-(CH2)n-O- (이 때, n 은 1 내 지 3 의 정수임) 로 이루어지는 군에서 선택되는 링커이고,
    X 및 Y 는 동일 또는 상이하고, 각각 탄소 원자 또는 질소 원자이고,
    Z 는 산소 원자, 황 원자 또는 -CH2- 이고,
    Ar1 은 1 내지 3 개의 치환기를 임의로 갖는 5- 내지 6-원 방향족 고리기이고,
    R1 및 R2 는 동일 또는 상이하고, 각각 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이고,
    R3 은 수소, 할로겐 원자 또는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이다].
  12. 제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, PPARδ 아고니스트가 하기 화학식 (II) 으로 표시되는 화합물, 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염인 제제:
    Figure 112008046546322-PCT00006
    [식 중,
    A 는 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이고,
    B 는 -(CH2)n-S- 및 -O-(CH2)n-O- (이때, n 은 1 내지 3 의 정수임) 로 이루어진 군에서 선택되는 링커이고,
    X 및 Y 는 동일 또는 상이하고, 각각 탄소 원자 또는 질소 원자이고,
    Z 는 산소 원자, 황 원자 또는 -CH2- 이고,
    Ar1 은 1 내지 3 개의 치환기를 임의로 갖는 5- 내지 6-원 방향족 고리기이고,
    R1 및 R2 는 동일 또는 상이하고, 각각 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이고,
    R3 은 수소, 할로겐 원자 또는 탄소수 1 내지 6 의 알킬기이다].
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, PPARδ 아고니스트가 (4-(3-(4-아세틸-3-히드록시-2-프로필)페녹시)프로폭시페녹시)아세트산, (2-메틸-4-(((4-메틸-2-(4-(트리플루오로메틸)페닐)-5-티아졸릴)메틸)티오)페녹시)아세트산 또는 (4-(((2-(3-플루오로-(4-(트리플루오로메틸)페닐)-4-메틸-5-티아졸릴)메틸)티오)-2-메틸페녹시)아세트산, 또는 이들의 약리학적으로 허용가능한 염인 제제.
  14. 제 11 항에 있어서, PPARα 아고니스트가 1-메틸에틸 2-(4-(4-클로로벤조일)페녹시)-2-메틸프로피오네이트 또는 ((4-클로로-6-((2,3-디메틸페닐)아미노)-2-피리미디닐)티오)아세트산, 또는 이들의 약리학적으로 허용가능한 염인 제제.
  15. 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진제의 제조를 위한, PPARα 또는 δ 아고니스 트의 용도.
  16. 각막 상피 세포의 증식 촉진제의 제조를 위한, PPARα 또는 δ 아고니스트의 용도.
  17. 마이봄선 기능 부전 치료제의 제조를 위한, PPARα 또는 δ 아고니스트의 용도.
  18. 각막 상피 장해 치료제의 제조를 위한, PPARα 또는 δ 아고니스트의 용도.
  19. 과다증발성 건성안 치료제의 제조를 위한, PPARα 또는 δ 아고니스트의 용도.
  20. 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진제의 제조를 위한, PPARδ 아고니스트의 용도.
  21. 각막 상피 세포의 증식 촉진제의 제조를 위한, PPARδ 아고니스트의 용도.
  22. 마이봄선 기능 부전 치료제의 제조를 위한, PPARδ 아고니스트의 용도.
  23. 각막 상피 장해 치료제의 제조를 위한, PPARδ 아고니스트의 용도.
  24. 과다증발성 건성안 치료제의 제조를 위한, PPARδ 아고니스트의 용도.
  25. 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진을 필요로 하는 대상에, 유효량의 PPARα 또는 δ 아고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진 방법.
  26. 각막 상피 세포의 증식 촉진을 필요로 하는 대상에, 유효량의 PPARα 또는 δ 아고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 각막 상피 세포의 증식 촉진 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 마이봄선 기능 부전의 치료를 위해 수행되는 방법.
  28. 제 26 항에 있어서, 각막 상피 장해의 치료를 위해 수행되는 방법.
  29. 과다증발성 건성안을 앓고 있는 환자에게, 유효량의 PPARα 또는 δ 아고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 과다증발성 건성안의 치료 방법.
  30. 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진을 필요로 하는 대상에, 유효량의 PPARδ 아고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 마이봄선 상피 세포의 증식 촉진 방법.
  31. 각막 상피 세포의 증식 촉진을 필요로 하는 대상에, 유효량의 PPARδ 아고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 각막 상피 세포의 증식 촉진 방법.
  32. 제 30 항에 있어서, 마이봄선 기능 부전의 치료를 위해 수행되는 방법.
  33. 제 31 항에 있어서, 각막 상피 장해의 치료를 위해 수행되는 방법.
  34. 과다증발성 건성안을 앓고 있는 환자에게, 유효량의 PPARδ 아고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 과다증발성 건성안의 치료 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140082451A (ko) * 2012-12-24 2014-07-02 서울대학교산학협력단 ＰＰＡＲδ 활성물질의 항생제, 화상 및 창상 치료제, 당뇨성 족부궤양 치료제로서의 용도

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090043365A1 (en) 2005-07-18 2009-02-12 Kolis Scientific, Inc. Methods, apparatuses, and systems for reducing intraocular pressure as a means of preventing or treating open-angle glaucoma
US7981095B2 (en) 2005-07-18 2011-07-19 Tearscience, Inc. Methods for treating meibomian gland dysfunction employing fluid jet
US7981146B2 (en) 2006-05-15 2011-07-19 Tearscience Inc. Inner eyelid treatment for treating meibomian gland dysfunction
US8083787B2 (en) 2005-07-18 2011-12-27 Tearscience, Inc. Method and apparatus for treating meibomian gland dysfunction
WO2013003594A2 (en) 2011-06-28 2013-01-03 Tearscience, Inc. Methods and systems for treating meibomian gland dysfunction using radio-frequency energy
US7981145B2 (en) 2005-07-18 2011-07-19 Tearscience Inc. Treatment of meibomian glands
US8950405B2 (en) 2006-05-15 2015-02-10 Tearscience, Inc. Treatment of obstructive disorders of the eye or eyelid
US20070060988A1 (en) 2005-07-18 2007-03-15 Grenon Stephen M Melting meibomian gland obstructions
US20080114423A1 (en) 2006-05-15 2008-05-15 Grenon Stephen M Apparatus for inner eyelid treatment of meibomian gland dysfunction
WO2007114315A1 (ja) * 2006-03-30 2007-10-11 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. 角結膜障害治療剤
US8137390B2 (en) 2006-05-15 2012-03-20 Tearscience, Inc. System for providing heat treatment and heat loss reduction for treating meibomian gland dysfunction
US8128673B2 (en) 2006-05-15 2012-03-06 Tearscience, Inc. System for inner eyelid heat and pressure treatment for treating meibomian gland dysfunction
US7976573B2 (en) 2006-05-15 2011-07-12 Tearscience, Inc. Inner eyelid heat and pressure treatment for treating meibomian gland dysfunction
US8128674B2 (en) 2006-05-15 2012-03-06 Tearscience, Inc. System for outer eyelid heat and pressure treatment for treating meibomian gland dysfunction
US7981147B2 (en) 2006-05-15 2011-07-19 Tearscience, Inc. Outer eyelid heat and pressure treatment for treating meibomian gland dysfunction
US9314369B2 (en) 2006-05-15 2016-04-19 Tearscience, Inc. System for inner eyelid treatment of meibomian gland dysfunction
US8007524B2 (en) 2006-05-15 2011-08-30 Tearscience, Inc. Heat treatment and heat loss reduction for treating meibomian gland dysfunction
JP5247686B2 (ja) * 2007-05-21 2013-07-24 千寿製薬株式会社 ＰＰＡＲδアゴニスト含有医薬
KR101633449B1 (ko) * 2007-07-26 2016-06-24 아자드 파르마 아게 전기화학적으로 활성화된 치아염소산염 용액을 포함하는 약제학적 제제
USD617443S1 (en) 2008-02-06 2010-06-08 Tearscience, Inc. Eye treatment goggles
USD613408S1 (en) 2008-02-06 2010-04-06 Tearscience, Inc. Eye treatment head gear
CA2716418A1 (en) * 2008-02-25 2009-09-03 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Agent for enhancing corneal epithelial barrier function
WO2010064633A1 (ja) * 2008-12-01 2010-06-10 田辺三菱製薬株式会社 チアゾール環を含むカルボン酸誘導体およびその医薬用途
USD638128S1 (en) 2009-10-06 2011-05-17 Tearscience, Inc. Ocular device design
WO2011105643A1 (ko) * 2010-02-25 2011-09-01 서울대학교산학협력단 퍼록시솜 증식자 활성화 수용체 리간드 셀레나졸 유도체, 이의 제조방법 및 이들 화합물의 용도
HUE037564T2 (hu) * 2011-07-21 2018-09-28 Peter Takacs Hüvelyszövet fiatalító készítmények és módszerek
US10842670B2 (en) 2012-08-22 2020-11-24 Johnson & Johnson Vision Care, Inc. Apparatuses and methods for diagnosing and/or treating lipid transport deficiency in ocular tear films, and related components and devices
US9763827B2 (en) 2013-04-30 2017-09-19 Tear Film Innovations, Inc. Systems and methods for the treatment of eye conditions
WO2014179356A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Tear Film Innovations Llc Systems and methods for the treatment of eye conditions
US10974063B2 (en) 2016-06-30 2021-04-13 Alcon Inc. Light therapy for eyelash growth
ES2919779T3 (es) 2017-06-20 2022-07-28 Imbria Pharmaceuticals Inc Derivado de 1-[(2,3,4-trimetoxifenil)metil]-piperazina, composiciones del mismo y métodos para aumentar la eficiencia del metabolismo cardíaco
EP3866794A4 (en) 2018-10-17 2022-07-20 Imbria Pharmaceuticals, Inc. METHODS OF TREATING RHEUMATIC DISEASES USING TRIMETAZIDINE COMPOUNDS
US11780811B2 (en) 2020-06-30 2023-10-10 Imbria Pharmaceuticals, Inc. Methods of synthesizing 2-[4-[(2,3,4-trimethoxyphenyl)methyl]piperazin-1-yl]ethyl pyridine-3-carboxylate
US11530184B2 (en) 2020-06-30 2022-12-20 Imbria Pharmaceuticals, Inc. Crystal forms of 2-[4-[(2,3,4-trimethoxyphenyl)methyl]piperazin-1-yl]ethyl pyridine-3-carboxylate
EP4247367A1 (en) 2020-11-23 2023-09-27 Sight Sciences, Inc. Formulations and methods for treating conditions of the eye
US11883396B2 (en) 2021-05-03 2024-01-30 Imbria Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating kidney conditions using modified forms of trimetazidine

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69739828D1 (de) 1996-12-11 2010-05-12 Dana Farber Cancer Inst Inc Methoden und pharmazeutische Zusammensetzungen zur Inhibition des Tumorwachstums
US6242196B1 (en) * 1997-12-11 2001-06-05 Dana-Farber Cancer Institute Methods and pharmaceutical compositions for inhibiting tumor cell growth
JP2001039976A (ja) 1999-05-24 2001-02-13 Sankyo Co Ltd 縮合複素環化合物の塩酸塩
TWI284533B (en) 1999-05-24 2007-08-01 Sankyo Co Pharmaceutical composition for treating hyperglycemia, impaired glucose tolerance, diabetes complications and for improving insulin resistant
EP1949908A1 (en) 2001-03-07 2008-07-30 Novo Nordisk A/S Combined use of derivatives of GLP-1 analogs and PPAR ligands
US20020187926A1 (en) 2001-03-07 2002-12-12 Knudsen Liselotte Bjerre Combined use of derivatives of GLP-1 analogs and PPAR ligands
AU2002303156A1 (en) 2001-03-23 2002-10-08 Bethesda Pharmaceuticals, Inc. Design and synthesis of optimized ligands for ppar
US6562783B2 (en) * 2001-05-30 2003-05-13 Neurologic, Inc. Phosphinylmethyl and phosphorylmethyl succinic and glutauric acid analogs as β-secretase inhibitors
US6709746B2 (en) * 2002-06-05 2004-03-23 Arteva North America S.á.r.l. Reducing concentration of organic materials with substituted cyclodextrin compound in polyester packaging materials
US20040076695A1 (en) * 2002-07-08 2004-04-22 Advanced Vision Research EPA and DHA enriched omega-3 supplement for the treatment of dry eye, meibomianitis and xerostomia
JP2005008570A (ja) 2003-06-19 2005-01-13 Santen Pharmaceut Co Ltd 角膜疾患治療剤
TWI343256B (en) * 2003-10-24 2011-06-11 Santen Pharmaceutical Co Ltd Cornea-conjunctiva disorder treating agent
AU2005231358A1 (en) * 2004-04-01 2005-10-20 Aventis Pharmaceuticals Inc. Use of PPR delta agonists for treating demyelinating diseases

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140082451A (ko) * 2012-12-24 2014-07-02 서울대학교산학협력단 ＰＰＡＲδ 활성물질의 항생제, 화상 및 창상 치료제, 당뇨성 족부궤양 치료제로서의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
US8148389B2 (en) 2012-04-03
US20120220612A1 (en) 2012-08-30
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CN101336113A (zh) 2008-12-31
KR101409705B1 (ko) 2014-07-14

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