WO2007058326A1 - 特定の塩基配列の標的核酸類を検出する方法、及び検出のための核酸類セット - Google Patents

特定の塩基配列の標的核酸類を検出する方法、及び検出のための核酸類セット Download PDF

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WO2007058326A1
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WO
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nucleic acid
group
photoligating
formula
photoligated
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PCT/JP2006/323031
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French (fr)
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Kenzo Fujimoto
Yoshinaga Yoshimura
Shinzi Ogasawara
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Japan Science And Technology Agency
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6862—Ligase chain reaction [LCR]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a method for specifically detecting a target nucleic acid having a specific base sequence present in a sample mixture using photoligation, and a nucleic acid set for the detection.
  • nucleic acids include nucleic acids and peptide nucleic acids
  • Detection includes identification and quantification.
  • Detection includes identification and quantification.
  • Detection includes identification and quantification.
  • Cells can be selected, or genetic diagnosis can be used to detect and predict human genetic defects and changes that cause disease, so that diagnosis and prediction can be performed before and at the early stages of the disease. It becomes possible.
  • nucleic acids are extracted from cells or the like to be investigated to obtain a sample mixture solution. If necessary, cleave with an appropriate restriction enzyme, perform electrophoresis, and blot the resulting gel to the membrane.
  • a nucleic acid probe having a base sequence complementary to the specific base sequence is prepared for nucleic acids having the specific base sequence to be detected. Then, this and the plotted nucleic acids are formed into hybrids.
  • This nucleic acid probe is pre-labeled so that it can be detected. For example, label with a radioisotope. In this way, the band of the nucleic acid hybridized with the nucleic acid probe is detected by autoradiography, and the presence of the nucleic acid having the target specific base sequence is confirmed.
  • DNA chip DNA microarray force is used to detect nucleic acids having a specific base sequence.
  • DNA probes of various base sequences are immobilized in each of a number of sections and arranged in an array.
  • the DNA mixture derived from the subject is labeled with a strong label, for example, with a fluorescent dye.
  • the subject DNA mixture is dropped onto the DNA chip to allow hybridization.
  • DNA containing a base sequence complementary to the DNA probe is immobilized on the substrate of the DNA chip by hybridization.
  • the immobilized DNA derived from the subject is detected, for example, by labeling with the fluorescent dye described above.
  • the discrimination by hybridization utilizes the difference in thermal stability, and the difference between perfect hybridization and incomplete hybridization is only the difference in thermal stability. . Therefore, the appropriate conditions for distinguishing between the two depend on the target base sequence. Unlike, even under appropriate conditions, the conditions that change the thermal stability act equally on both. In other words, as long as only the difference in thermal stability of hybridization is used as the basis for distinction between the two, it is necessary to compromise on the balance between detection specificity and sensitivity and accept a certain amount of noise. .
  • Non-patent document 1 “Molecular biology of cells”, 4th edition, translated by Keiko Nakamura, edited by Kenichi Matsubara, published by Newton Press, 2004, pp. 494-500
  • Non-patent document 2 "Molecular biology of cells” 4th edition, Keiko Nakamura, translated by Kenichi Matsubara, published by Newton Press, 2004, pp. 533-535
  • An object of the present invention is to achieve both high specificity and sensitivity (SZN ratio) while utilizing hybridization of a target nucleic acid having a specific base sequence present in a sample mixture with a complementary chain. It is to provide a method for detection and nucleic acids for the detection.
  • the present inventors used optical coupling, which has been researched and developed for many years. Then, we found that the above-mentioned purpose can be achieved by combining the formation of light and hybrid with optical coupling.
  • photoligation can be used for specific photoligation only when complete hybridization is performed, and molecules of nucleic acids having a labeling moiety can be covalently immobilized on the substrate. It was.
  • the molecule with the labeling moiety to be detected is then immobilized on the substrate without relying on the maintenance of hybridization, so that thorough washing is performed under conditions where the complementary duplex is dissociated. Became possible. This made it possible to achieve both high specificity and sensitivity (SZN ratio).
  • Z represents O or NH
  • at least one of X and Y is selected from the group consisting of a carboxy group, a lower alkoxycarbonyl group, a substituted amide group, and a cyan group.
  • R is a hydrogen atom
  • At least one of R and R is a carboxyl group, a lower alkoxycarbo group, a lower group
  • R is a hydrogen atom or a lower alkyl group
  • At least one of R and R is a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a lower group
  • R is a hydrogen atom or a lower alkyl group
  • At least one of R and R is a carboxyl group, a lower alkoxycarbo group, a lower group
  • R is a hydrogen atom or a lower alkyl group
  • At least one of R 1 and R 2 is a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a low group
  • a photoligating nucleic acid comprising a nucleic acid having a group represented by: 5 ′ terminal or 3 ′ terminal (however, the nucleic acid includes a nucleic acid and a peptide nucleic acid);
  • At least one of the photoligating nucleic acid and the photoligated nucleic acid has a labeling moiety
  • One of the photoligating nucleic acid and the photoligating nucleic acid that does not have a labeling portion is fixed to the base material.
  • nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence of the target nucleic acid having a specific base sequence can be generated.
  • Nucleic acids that can be generated by photoligation of photoligating nucleic acids and photoligated nucleic acids are target nucleic acids of a specific base sequence that can be washed under washing conditions that dissociate complementary duplexes. In the set of nucleic acids to detect the class.
  • the base moiety is a group represented by Formula I.
  • Z is O
  • X is a hydrogen atom
  • Y is a carboxyl group, a lower alkoxycarbo group, a substituted amide group. Or a cyan group.
  • the base moiety is a group represented by the formula VII, and in formula II, at least one of R and R is a carboxyl group or a lower alkoxy carbo group.
  • R and the remaining groups of R are hydrogen atoms.
  • the base moiety is a group represented by the formula ⁇ , and in the formula ⁇ , at least one of R and R is a carboxyl group, a lower alkoxy carbo
  • the base moiety is a group represented by formula IV, and in formula IV, at least one of R and R is a carboxyl group, a lower alkoxy carbo A group selected from the group consisting of a group, a substituted amide group, an amide group, a cyano group and a hydrogen atom, and the remaining groups of R and R are hydrogen atoms.
  • the base moiety is a group represented by the formula V, and in the formula V, at least one of R 1 and R 2 is a carboxyl group, a lower alkoxy carbo
  • any label selected from the group consisting of a piotin label, a dye label (including a fluorescent dye label), an RI label, and an enzyme label (including a chromogenic enzyme label) as a label of the label portion.
  • a piotin label as the labeling part.
  • one of the nucleic acids previously immobilized on the substrate is preferably immobilized on the substrate via a linker portion.
  • Linker partial force It is preferable to include polyethylene glycol or alkanes. Linker partial force It is particularly preferable to contain polyethylene glycol.
  • the substrate is preferably any one selected from the group consisting of a glass plate, CPG, and polystyrene beads. It is particularly preferred that the substrate is a glass plate.
  • cleaning conditions 80 ⁇ : It is preferable to be washable at a cleaning temperature in the range of LOO ° C. As washing conditions, 95 ⁇ : It is particularly preferred to be washable at washing temperatures in the range of LOO ° C V. It is preferable that the cleaning can be performed with a cleaning solution containing a denaturing agent.
  • An example of the modifier is urea.
  • a cleaning condition it is preferable that cleaning is possible with a cleaning solution containing a surfactant.
  • the surfactant include sodium dodecyl sulfate.
  • the base having a carbon-carbon double bond is preferably cytosine, thymine or uracil.
  • the photoligating nucleic acid is preferably an oligonucleotide.
  • the photoligating nucleic acid is preferably DNA or RNA.
  • the photoligating nucleic acid is preferably a peptide nucleic acid.
  • the photoligated nucleic acids are oligonucleotides. Photocoupled nucleus It is preferred that the acids are DNA or RNA.
  • the photoligated nucleic acid is preferably a peptide nucleic acid.
  • the photoligating nucleic acid and the photoligated nucleic acid are preferably the same type of nucleic acid.
  • the target nucleic acid is preferably an oligonucleotide.
  • the target nucleic acids are DNA or RNA.
  • the target nucleic acids are preferably peptide nucleic acids.
  • the present invention is one in which one of the above-mentioned photoligating nucleic acid and photoligated nucleic acid that does not have a labeling portion is immobilized on a substrate in advance,
  • a DNA microarray used as a photoligating nucleic acid or photoligated nucleic acid having a labeling moiety (as a molecule immobilized on a substrate, a nucleic acid other than DNA, and a peptide nucleic acid Is also included).
  • the present invention also provides a step of hybridizing the above-mentioned photoligating nucleic acid and photoligated nucleic acid with target nucleic acids having a specific base sequence contained in the nucleic acid mixture.
  • the photoligated nucleic acid and the photoligated nucleic acid adjacent to each other so as to be photocoupled are irradiated with light to be photoligated and labeled.
  • Nucleic acids having a labeled moiety that are immobilized on a substrate by photoligation are washed under washing conditions that dissociate the complementary complementary duplexes, so that they cannot be immobilized on the substrate by photoligation. Removing a nucleic acid having a labeling portion;
  • the step of hybridizing and the step of photoligating and immobilizing a nucleic acid having a labeled moiety on a substrate are preferably performed at a temperature of 20 to 30 ° C.
  • Hybridization process, and photoligating nucleic acids having a labeling moiety as a base material Process force for fixation It is preferable that the reaction is carried out in a reaction solution containing a salt having a buffering action.
  • the pH of the reaction solution is preferably in the range of 6.5 to 8.5.
  • the concentration of the buffering salt is preferably in the range of 5 to 250 mM. It is preferable that the salt having a buffering action is force codylate.
  • the reaction solution contains a water-dispersible organic solvent. It is preferable that the reaction solution contains 20 to 60% (volume ratio) of a water-dispersible organic solvent! /. A water-dispersible organic solvent force acetonitrile is preferred.
  • the reaction solution preferably contains an alkali metal salt and a salt of Z or alkaline earth metal, and the concentration of the salt is optimized with respect to the concentration of the target nucleic acid.
  • Preferred salts of alkali metals and Z or alkaline earth metals include, for example, sodium chloride and Z or magnesium salt.
  • the cleaning conditions are preferably cleaning at a cleaning temperature in the range of 80 to 100 ° C. It is particularly preferred that the washing conditions are washing at a washing temperature in the range of 95 to 100 ° C.
  • the washing condition is preferably washing with a washing solution containing a denaturant. It is particularly preferable that the cleaning condition is cleaning with a cleaning solution containing a surfactant.
  • the light irradiation is performed by irradiation with light having a wavelength of 330 nm or more.
  • the target nucleic acid is preferably an oligonucleotide.
  • the target nucleic acid is preferably DNA.
  • the target nucleic acid is preferably RNA.
  • the target nucleic acids are preferably peptide nucleic acids.
  • the label of the label moiety is a fluorescent dye label
  • the step of detecting the labeled portion includes a step of measuring fluorescence using a laser scanner! /.
  • the label of the label moiety is a piotin label
  • the method includes a step of performing a piotin-avidin binding reaction with a fluorescent dye-labeled avidin and a step of performing a fluorescence measurement using a laser scanner.
  • the present invention provides the method according to the above method, wherein a nucleic acid having a sequence in which one base is substituted from a base sequence complementary to the base sequence of a target nucleic acid having a specific base sequence is a photoligating nucleic acid.
  • the base of the target nucleic acid can be obtained by using the photoligating nucleic acid and the photoligated nucleic acid having a base sequence that is generated by photoligation of the nucleic acid and the photoligated nucleic acid.
  • target nucleic acids having a specific base sequence present in a sample mixture can be detected while achieving both high specificity and sensitivity while using hybridization with a complementary chain as a detection principle. That is, since the photoligation can be performed only when complete hybridization is performed, only the molecule having the detected label moiety can be covalently immobilized on the substrate. This allowed thorough washing under conditions where the complementary duplex was dissociated. For this reason, noise can be greatly reduced by completely removing unreacted substances. This is done without breaking the covalent bond and therefore does not reduce detection sensitivity. That is, high specificity and sensitivity are compatible by completely removing such incomplete hybridization.
  • the method for detecting a target nucleic acid having a specific base sequence according to the present invention, and the nucleic acid set for the detection can be applied to all methods based on the principle of hybridizing with a complementary base sequence. It provides both high specificity and sensitivity.
  • photoligation is a photoreaction and does not require delicate conditions such as an enzyme reaction. Furthermore, the bond produced is a stable covalent bond. For this reason, the present invention realizes the ease and efficiency of the experimental operation that the optimum conditions can be selected from a very wide range of reaction conditions.
  • the high specificity and sensitivity of the present invention are useful for DNA typing and are expected to be used in the medical diagnostic field.
  • the high specificity and sensitivity of the present invention is effective in detecting single base substitutions.
  • the application of the present invention to a DNA chip is not limited to the detection method based on normal or hybrid formation, or the advantage of high specificity and sensitivity compared to the invader method using an enzyme. Setting the temperature with a large degree of freedom in selecting the conditions has the advantage that management with a large degree of freedom is easy and opens up the use of DNA chips for a wider range of applications.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram showing the flow of one embodiment of the present invention.
  • ODN2 ( GV U) is shown as a photoligating nucleic acid.
  • This ODN2 ( CV U) is an oligonucleotide having 5 carboxybulle 2′-deoxyuridine (denoted as GV U) as the base moiety of formula I having photoligation properties.
  • piotin-ODN (T) is shown as a photoligated nucleic acid.
  • This biotin-ODN is an oligonucleotide having thymine (denoted as T) as a base having a carbon-carbon double bond, which is a base moiety that can be photoligated to photoligating nucleic acids. It is.
  • This Piotin I ODN has piotin as a labeling moiety at one end! This piotin is represented as a circle at one end of Piotin-ODN (T) in FIG.
  • target (Target) RNA (A) is shown as target nucleic acids having a specific base sequence! /.
  • Target RNA (A) which is the target nucleic acid
  • ODN2 ( CV U) which is a photoligating nucleic acid
  • a nucleic acid set that also has a Piotin-ODN (T) force which is a photoligating nucleic acid.
  • the target nucleic acids that are no longer in the shape of the target is a hybrid type
  • washing is then performed under conditions that allow the complementary duplex to dissociate due to hybridization.
  • the present invention dissociates not only incomplete complementary duplexes due to unintentional incomplete hybridization, but also complete complementary duplexes due to the formation of the desired complete hybrid, Even if it is washed away, it has no effect on the subsequent detection in principle. In other words, it is possible to wash under conditions that dissociate complete complementary duplexes.
  • the incomplete hybridization to such an extent that photoligation does not occur causes a label moiety weakly immobilized on the substrate via a base sequence similar to the specific base sequence of the target RNA (A).
  • A specific base sequence of the target RNA
  • noise reduction by washing under washing conditions that also dissociate the target complementary duplex due to the formation of a hybrid contributes to the high sensitivity (SZN ratio) of the present invention.
  • Fig. 1 shows the detection by binding streptavidin Cy3 to piotin-ODN (T). Streptavidin binds strongly to the labeling moiety piotin, and detection is performed by, for example, reading the fluorescence of the fluorescent dye Cy3 immobilized on the substrate with a laser scanner.
  • FIG. 8 is an explanatory view showing one embodiment of a different embodiment of the present invention.
  • ODN P1 is shown as a photocoupled nuclear acid.
  • This ODN P1 is an oligonucleotide having 5-carboxyvinyl-2′-deoxyuridine (denoted as ev U) as a photocatalytic base moiety of formula I.
  • One end of this ODN2 ( cv U) is immobilized on the surface of the base material via hexaethyleneglycol (S).
  • S35 force is shown as photoligated nucleic acids.
  • This ODN S35 is an oligonucleotide having cytosine (denoted as C) as a base having a carbon-carbon double bond, which is a base moiety capable of photoligation with photoligating nucleic acids.
  • This ODN S35 has piotin (Biotin: B) as a labeling moiety at one end.
  • the ODN P1 and ODN S35 and the target oligonucleotide are already adjacent to each other in a photoligated state by hybridization. It is in a state of being arranged. By performing light irradiation in this state, optical coupling occurs.
  • the present invention it has been clarified that by using a water-dispersible organic solvent such as acetonitrile, the hybridization and photoligation steps can be performed very rapidly.
  • the fluorescence intensity exceeding 10 times that of the conventional method can be obtained stably by using force codylate buffer.
  • the photoligating nucleic acids have the following formula I as the base moiety:
  • Z represents O or NH
  • at least one of X and Y is selected from the group consisting of a carboxy group, a lower alkoxycarbonyl group, a substituted amide group, and a cyan group.
  • alkyl group in the alkoxycarbonyl group examples include lower alkyl groups having 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 5 carbon atoms.
  • the substituents X and ⁇ may be the same or different electron withdrawing groups at the same time, or only one of the substituents X and ⁇ may be an electron withdrawing group and the other may be a hydrogen atom.
  • ⁇ is ⁇
  • X is a hydrogen atom
  • ⁇ is a carboxyl group, a lower alkoxycarbo yl group, a substituted amide group or a cyano group.
  • Particularly preferred base moieties include 5-vinyl-2′-deoxyuridine, and 5-carboxyvinyl-2′-deoxyuridine. In particular, 5-carboxyvinyl-2′-deoxyuridine is preferable.
  • the photoligating nucleic acids have the following formula II:
  • R is a hydrogen atom
  • At least one of R and R is a carboxyl group, a lower alkoxycarbo group, a lower group
  • the carboxyl group is preferably a carboxyl group and water.
  • a combination of elementary atoms is preferable as a combination of R and R.
  • a lower alkoxycarbo group is a preferred lower alkyl group.
  • Examples of the alkyl moiety in the alkoxycarbonyl group include lower alkyl having 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, and particularly preferably 1 carbon. That is, preferred examples of the lower alkoxy carbo yl group include a methoxy carbo ol group, an ethoxy carbo ol group, a propoxy carbonyl group, a butoxy carbo ol group, and the like. A carbonyl group and a propoxycarbonyl group are more preferable, and a methoxycarbonyl group in which a methoxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group are more preferable is particularly preferable. A combination of a lower alkoxycarbonyl group and a hydrogen atom, particularly a combination of a methoxycarbonyl group and a hydrogen atom is preferred as the combination of R and R.
  • the lower alkenyl group is preferably lower alkenyl.
  • Examples of the group include lower alkenyl groups having 2 to 10 carbon atoms, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably 2 carbon atoms.
  • the combination of lower alkenyl group and hydrogen atom, especially the combination of vinyl group and hydrogen atom, is a combination of R and R.
  • the lower alkynyl group is preferably lower alkynyl.
  • the group includes a lower alkenyl group having 2 to carbon atoms: L0, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably 2 carbon atoms.
  • L0 lower alkenyl group having 2 to carbon atoms: L0, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably 2 carbon atoms.
  • the combination of lower alkyl group and hydrogen atom, especially the combination of ethynyl group and hydrogen atom is the combination of R and R.
  • a substituted amide is a preferred substituted amide.
  • N-substituted amides can be mentioned, and preferred examples include N-alkylamides and N-aminoalkylamides.
  • Such N-alkylamides and N-aminoalkylamides have 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 5 carbon atoms, and more preferably carbon atoms. 1 to 3, particularly preferably those having 3 carbon atoms, and N-aminoalkylamide is particularly preferred.
  • a combination of elementary atoms is preferable as a combination of R and R.
  • an amide group is preferable, and a combination of an amide group and a hydrogen atom
  • R and R are preferable.
  • the cyan group is a preferred combination of a cyan group and a cyan group.
  • R and R combinations are preferred as R and R combinations.
  • a hydrogen atom has at least one preferred hydrogen atom
  • the combination of hydrogen atoms and hydrogen atoms is a combination of R and R
  • the photoligating nucleic acids are represented by the following formula III
  • R is a hydrogen atom or a lower alkyl group
  • At least one of R and R is a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a lower group
  • a hydrogen atom is particularly preferable.
  • R is preferably a lower alkyl group, preferably a lower alkyl group having 1 to 5 carbon atoms,
  • Examples of such a lower alkyl group include a methyl group, an ethyl group, and a propyl group. The methyl group and the ethyl group are preferable, and a methyl group is particularly preferable.
  • the carboxyl group is preferably a carboxyl group and water.
  • a combination of elementary atoms is preferable as a combination of R and R.
  • a lower alkoxycarbo group is a preferred lower alkyl group.
  • Examples of the alkyl moiety in the alkoxycarbonyl group include lower alkyl having 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, and particularly preferably 1 carbon. That is, preferred examples of the lower alkoxy carbo yl group include a methoxy carbo ol group, an ethoxy carbo ol group, a propoxy carbonyl group, a butoxy carbo ol group, and the like. A carbonyl group and a propoxycarbonyl group are more preferable, and a methoxycarbonyl group in which a methoxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group are more preferable is particularly preferable. A combination of a lower alkoxycarbonyl group and a hydrogen atom, particularly a combination of a methoxycarbonyl group and a hydrogen atom is preferred as the combination of R and R.
  • the lower alkenyl group is preferably lower alkenyl.
  • Examples of the group include lower alkenyl groups having 2 to 10 carbon atoms, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably 2 carbon atoms.
  • the combination of lower alkenyl group and hydrogen atom, especially the combination of vinyl group and hydrogen atom, is a combination of R and R.
  • the lower alkynyl group is preferably lower alkynyl.
  • the group includes a lower alkenyl group having 2 to carbon atoms: L0, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably 2 carbon atoms.
  • L0 lower alkenyl group having 2 to carbon atoms: L0, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably 2 carbon atoms.
  • the combination of lower alkyl group and hydrogen atom, especially the combination of ethynyl group and hydrogen atom is the combination of R and R.
  • a substituted amide is a preferred substituted amide.
  • N-substituted amides can be mentioned, and preferred examples include N-alkylamides and N-aminoalkylamides.
  • Such N-alkylamides and N-aminoalkylamides have 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 5 carbon atoms, and more preferably carbon atoms. 1 to 3, particularly preferably those having 3 carbon atoms, and N-aminoalkylamide is particularly preferred.
  • a combination of elementary atoms is preferable as a combination of R and R.
  • an amide group is preferable, and a combination of an amide group and a hydrogen atom
  • R and R are preferable.
  • the cyan group is a preferred combination of a cyan group and a cyan group.
  • R and R combinations are preferred as R and R combinations.
  • a hydrogen atom has at least one preferred hydrogen atom
  • the combination of hydrogen atoms and hydrogen atoms is a combination of R and R
  • the photoligating nucleic acids are represented by the following formula IV
  • R is a hydrogen atom or a lower alkyl group
  • At least one of R and R is a carboxyl group, a lower alkoxycarbo group, a lower group
  • a hydrogen atom is particularly preferable.
  • R is preferably a lower alkyl group, preferably a lower alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, Preferably, it has 1 to 3 carbon atoms, more preferably 1 to 2 carbon atoms, and particularly preferably 1 carbon atom.
  • Examples of such a lower alkyl group include a methyl group, an ethyl group, and a propyl group. The methyl group and the ethyl group are preferable, and a methyl group is particularly preferable.
  • the carboxyl group is preferably a carboxyl group and water.
  • a combination of elementary atoms is preferable as a combination of R and R.
  • a lower alkoxycarbo group is a preferred lower alkyl group.
  • Examples of the alkyl moiety in the alkoxycarbonyl group include lower alkyl having 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, and particularly preferably 1 carbon. That is, preferred examples of the lower alkoxy carbo yl group include a methoxy carbo ol group, an ethoxy carbo ol group, a propoxy carbonyl group, a butoxy carbo ol group, and the like. A carbonyl group and a propoxycarbonyl group are more preferable, and a methoxycarbonyl group in which a methoxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group are more preferable is particularly preferable. A combination of a lower alkoxycarbonyl group and a hydrogen atom, particularly a combination of a methoxycarbonyl group and a hydrogen atom is preferred as the combination of R and R.
  • the lower alkenyl group is preferably lower alkenyl.
  • Examples of the group include lower alkenyl groups having 2 to 10 carbon atoms, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably 2 carbon atoms.
  • the combination of lower alkenyl group and hydrogen atom, especially the combination of vinyl group and hydrogen atom, is a combination of R and R.
  • the lower alkynyl group is preferably lower alkynyl.
  • the group includes a lower alkenyl group having 2 to carbon atoms: L0, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably 2 carbon atoms.
  • L0 lower alkenyl group having 2 to carbon atoms: L0, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably 2 carbon atoms.
  • the combination of lower alkyl group and hydrogen atom, especially the combination of ethynyl group and hydrogen atom is the combination of R and R.
  • a substituted amide is a preferred substituted amide.
  • N-substituted amides can be mentioned, and preferred examples include N-alkylamides and N-aminoalkylamides.
  • Such N-alkylamides, N-aminoal The kill amide has 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 5 carbon atoms, more preferably 1 to 3 carbon atoms, particularly preferably 3 carbon atoms, and N-aminoalkylamide is particularly preferable.
  • a combination of elementary atoms is preferable as a combination of R and R.
  • an amide group is preferable, and a combination of an amide group and a hydrogen atom
  • R and R are preferable.
  • the cyan group is preferably a combination of a cyan group and a cyan group.
  • R and R combinations are preferred as R and R combinations.
  • the hydrogen atom has at least one preferred hydrogen atom
  • the combination of hydrogen atoms and hydrogen atoms is a combination of R and R
  • the photoligating nucleic acid is represented by the following formula V:
  • R is a hydrogen atom or a lower alkyl group
  • At least one of R 1 and R 2 is a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a low group
  • R 1 a hydrogen atom is particularly preferable.
  • R 1 is preferably a lower alkyl group, preferably a lower alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, Preferably, it has 1 to 3 carbon atoms, more preferably 1 to 2 carbon atoms, and particularly preferably 1 carbon atom.
  • Examples of such a lower alkyl group include a methyl group, an ethyl group, and a propyl group. The methyl group and the ethyl group are preferable, and a methyl group is particularly preferable.
  • a carboxyl group is a preferred carboxyl group
  • a combination of hydrogen atoms is preferable as a combination of R 1 and R 2.
  • a lower alkoxycarbonyl group is a preferred lower group.
  • Examples of the alkyl moiety in the alkoxycarbonyl group include lower alkyl having 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, and particularly preferably 1 carbon. That is, preferred examples of the lower alkoxy carbo yl group include a methoxy carbo ol group, an ethoxy carbo ol group, a propoxy carbonyl group, a butoxy carbo ol group, and the like. A carbonyl group and a propoxycarbonyl group are more preferable, and a methoxycarbonyl group in which a methoxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group are more preferable is particularly preferable. A combination of a lower alkoxycarbonyl group and a hydrogen atom, particularly a combination of a methoxycarbonyl group and a hydrogen atom is preferred as the combination of R 1 and R 2.
  • a lower alkenyl group is preferably a lower alkenyl group.
  • Examples of the group include lower alkenyl groups having 2 to 10 carbon atoms, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably 2 carbon atoms.
  • a combination of a lower alkenyl group and a hydrogen atom, particularly a combination of a vinyl group and a hydrogen atom, is a combination of R and R.
  • the lower alkynyl group is preferably lower alkynyl.
  • the group includes a lower alkenyl group having 2 to carbon atoms: L0, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably 2 carbon atoms.
  • L0 lower alkenyl group having 2 to carbon atoms: L0, preferably 2 to 5 carbon atoms, more preferably 2 to 3 carbon atoms, and particularly preferably 2 carbon atoms.
  • the combination of lower alkyl group and hydrogen atom, especially the combination of ethynyl group and hydrogen atom, is a combination of R and R.
  • a substituted amide is a preferred substituted amide.
  • a substituted N-substituted amide can be mentioned, and preferred examples include N-alkylamide and N-aminoalkylamide.
  • N-alkylamides, N-aminoamides The alkyl amide has 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 5 carbon atoms, more preferably 1 to 3 carbon atoms, particularly preferably 3 carbon atoms, and N-aminoalkylamide is particularly preferable.
  • an amide group is preferable, and a combination of an amide group and a hydrogen atom
  • the combination is preferable as a combination of R 1 and R 2.
  • a cyano group is a preferred combination of a cyano group and a cyano group.
  • a cyano group and a hydrogen atom is a combination of R and R.
  • the hydrogen atom has at least one preferred hydrogen atom.
  • the combination including and the combination of hydrogen atom and hydrogen atom is R
  • Suitable structural formulas for such a base are exemplified below.
  • the base groups that can be used in the present invention are not limited to the following examples.
  • the photoligating nucleic acid has a group represented by the formula I as a base moiety at the 5 'end or 3' end.
  • the photoligated nucleic acids are carbon-carbon divalent as a base moiety capable of photoligation at the 3 ′ end or 5 ′ end so that the photoligated nucleic acids can be photocoupled with the photoligated nucleic acids correspondingly.
  • Nucleic acids of photoligating nucleic acids include nucleic acids and peptide nucleic acids (PNA).
  • Nucleic acids include DNA and RNA, and oligonucleotides other than these. These may be natural or synthetic, but not so much. Any one capable of forming a complementary duplex by hybridization in the present invention can be used.
  • the photoligating nucleic acid can be produced according to a normal nucleic acid production method.
  • a DMdation of 5-substituted bururidine can be amidated by allowing an amididizing agent to act, and then the protecting group can be cleaved, which can be converted into an oligonucleotide by a conventional DNA synthesis method.
  • the 5-substituted vinylcytosine derivatives or 5-substituted bururacil derivatives may be produced by the methods shown in the following specific examples, but also by other ordinary organic synthesis methods. can do.
  • the photoligating nucleic acids have a base having a carbon-carbon double bond at the 3 'end or 5' end as a base moiety that can be photoligated with the photoligating nucleic acids.
  • a base having a carbon-carbon double bond a carbon-carbon double bond forming a condensed ring is not preferable, and a monocyclic carbon-carbon double bond or a carbon-carbon double bond substituted on a ring is preferable. I like it.
  • Preferred bases having a carbon-carbon double bond include cytosine, thymine, uracil and the like in the natural form.
  • Nucleic acids of photoligated nucleic acids include nucleic acids and peptide nucleic acids (PNA).
  • Nucleic acids include DNA and RNA, and oligonucleotides other than these. These may be natural or synthetic, misaligned. Any one capable of forming a complementary duplex by hybridization in the present invention can be used.
  • the nucleic acid of the photoligated nucleic acid can be produced in the same manner as the photoligating nucleic acid according to the usual method for producing nucleic acid.
  • the photoligating nucleic acid and the photoligated nucleic acid may be the same type of nucleic acid or different types of nucleic acid.
  • Either one of the photoligating nucleic acid and the photoligating nucleic acid has a labeling moiety
  • One of the photoligating nucleic acid and the photoligated nucleic acid that does not have a labeling portion is fixed to the base material.
  • Various labels can be used as the label of the labeling part, for example, use of a piotin label, a dye label (including a fluorescent dye label), an RI label, and an enzyme label (including a chromogenic enzyme label). can do.
  • a label that can be washed under the strong washing conditions enabled by the present invention is preferred.
  • Piotin labeling or fluorescent dye labeling is preferred because of ease of handling and resistance to strong washing conditions.
  • Piotin labeling can be detected by piotin-avidin binding using a variety of labels that additionally have an avidin moiety.
  • Photoligated nucleic acids or photoligated nucleic acids usually have a labeling moiety near the end that is not photoligated, but they do not affect or influence photoligation and hybridization. In a range, In addition, it is possible to have a labeling portion at a shift site.
  • a substrate on which the photoligating nucleic acid or photoligated nucleic acid is immobilized various forms such as beads and substrates can be used.
  • DNA chip DNA microarray
  • a substrate in the form of a substrate As the base material, various materials such as those used as solid phase carriers in the biochemical field can be used. Examples thereof include inorganic substances such as glass and porous glass, greaves such as polystyrene (PS), and metals such as gold.
  • Preferable examples include a solid phase carrier having an adenosine residue (oligophilic support (OAS) and the like), aldehyde-modified glass and the like. Glass plates, CPG, polystyrene beads, etc. are preferred.
  • a normal material used as the base material of the DNA chip can be suitably used.
  • one of the nucleic acids previously immobilized on the substrate may be directly bound and immobilized on the substrate.
  • the linker part may be any molecular species that is inert to the chemical reaction of nucleic acids and has 5 or more, preferably 10 or more atoms, and preferably a linear molecular species.
  • nucleic acids such as DNA, RNA, PNA, polyethylene glycol, alkanes and the like are preferable.
  • hexane ethylene glycol
  • hexane ethylene glycol
  • it can be produced by binding a phosphate group at the end of the nucleic acid to a part of the linker.
  • the linker portion and the nucleic acid may be bound and then bound to the substrate, or conversely, the substrate and the linker portion may be bound first, and then the linker portion and the nucleic acid are bound.
  • the photoligating nucleic acid and the photoligated nucleic acid are photoligated to generate a nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence of the target nucleic acid having a specific base sequence. It is produced as follows. Then, the photoligating nucleic acid and the photoligated nucleic acid are arranged adjacent to each other so as to be photocoupled by forming a target nucleic acid as a trapezoid. [0040]
  • This hybridization can be performed under conditions of normal temperature, pH, salt concentration, buffer solution, etc., but by making it possible to select the conditions for hybridization and photoligation with a high degree of freedom. It is an advantage of the present invention that detection with higher specificity and sensitivity (SZN ratio) is possible. Examples of the conditions include temperature, solvent (solute), salt type, and concentration.
  • the force that can be used if the temperature is a temperature at which hybridization can be performed.
  • the temperature is a temperature at which hybridization can be performed.
  • Hybridization is preferably performed in a reaction solution containing a salt having a buffering action.
  • the ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ of the reaction solution is preferably in the range of 6.5 to 8.5, particularly in the range of ⁇ 6.7 to 7.7. It is preferable that the concentration of the buffering salt is in the range of 5 to 250 mM. Particularly, it is preferable that the concentration is in the range of 10 to LOOmM.
  • the salt having a buffering action include cacodylate, phosphate, and tris salt.
  • a salt having a buffering action is particularly preferable from the viewpoint of increasing the intensity of fluorescence intensity. It is preferably a strong codylate salt.
  • the reaction solution preferably contains a water-dispersible organic solvent.
  • the reaction solution contains 20 to 60% (volume ratio) of a water-dispersible organic solvent. I was strong.
  • this water-dispersible organic solvent is preferably acetonitrile.
  • the concentration of the salt is optimal for the concentration of the target nucleic acid. The present invention has found that there is a value. In other words, it is preferable that these are optimized for these two conditions by examining the conditions.
  • Preferred salts of alkali metals and Z or alkaline earth metals include, for example, sodium chloride and sodium chloride or magnesium.
  • the photoligation of the photoligating nucleic acid and the photoligated nucleic acid is performed by a photochemical reaction by light irradiation.
  • the light to be irradiated may be any light having a wavelength having energy necessary for the reaction, but ultraviolet light is preferable.
  • the wavelength is 330 nm or more, preferably 350 nm As described above, more preferably one containing a wavelength of 360 nm or more.
  • a particularly preferred wavelength is 366 nm.
  • This optical connection is reversible based on the principle. Therefore, it can be cleaved by irradiating light having a relatively short wavelength.
  • the wavelength for cleavage is 32 Onm or less, preferably 3 lOnm or less.
  • a particularly preferred wavelength for cleavage is 302 nm.
  • the labeling moiety is immobilized on the substrate by photoligation
  • washing is performed under washing conditions that dissociate complementary duplexes due to hybridization.
  • the label partial force immobilized on the base material should be used under any conditions so long as the complementary double-strand dissociation action is strong so long as it is not released by the breaking of a covalent bond in the middle. Can do.
  • the washing conditions are complementary. The dissociation action of the target double strand should be strong.
  • a temperature in the range of 80 to 100 ° C, preferably 90 to 100 ° C, particularly preferably 95 to 100 ° C can be used.
  • the temperature should be as high as the boiling point value can be achieved if it does not break the covalent bonds.
  • the pH is not particularly limited as long as it does not degrade the covalent bond, but is preferably near neutral because it is difficult to cause hydrolysis of the covalent bond.
  • the type of salt and salt concentration are not particularly limited as long as precipitation of the sample unfavorable for operation does not occur.In general, the presence of an appropriate salt concentration (for example, about 0.1 M NaCl) Convenient to promote dissociation.
  • urea can be added as a denaturing agent in order to promote dissociation of complementary double strands.
  • a surfactant to promote the dissociation of complementary duplexes examples for example, sodium dodecyl sulfate can be added.
  • conditions known to contribute to the dissociation of complementary duplexes can be used.
  • the detection of the labeled portion after washing can be performed using a usual method according to the principle of each label.
  • autoradiography can be performed for RI labels, or laser scanners can be used for fluorescent dye labels.
  • laser scanners can be used for fluorescent dye labels.
  • a usual method according to the labeling principle can be used.
  • nucleic acid sets and detection methods thereby are also included within the scope of the present invention.
  • an embodiment in which one or more nucleic acid fragments are linked by hybridization and photoligation between a nucleic acid having a labeling moiety and a nucleic acid immobilized on a substrate is also according to the present invention. It is possible.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram showing a flow of one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram of photoligation of nucleic acids using RNA as a cage.
  • FIG. 3 is an HPLC chart showing photoligation of nucleic acid having RNA as a cage.
  • FIG. 4 shows the detection results of RNA point mutations according to the present invention.
  • FIG. 5 is an HPLC chart showing reversibility of photoligation of nucleic acids.
  • FIG. 6 is an HPLC chart showing reversibility of photoligation of nucleic acids.
  • FIG. 7 is a result of detection of RNA point mutation according to the present invention.
  • FIG. 8 is an explanatory view showing another embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is an explanatory view showing one embodiment of detection of SNPs according to the present invention.
  • FIG. 10 is an explanatory view showing an example of preparation of the photoligating nucleic acids of the present invention.
  • FIG. 11 is a detection result of SNPs according to the present invention.
  • FIG. 13 is an experimental result showing the influence of NaCl concentration.
  • FIG. 17 shows SZN ratios detected for various single nucleotide polymorphisms according to the present invention.
  • FIG. 19 is an explanatory diagram illustrating the synthesis route of DNA having a cytosine derivative as the base moiety.
  • FIG. 20 shows the experimental results showing that reversible photoligation is possible using cytosine derivatives.
  • FIG. 21 is an explanatory diagram illustrating the synthesis route of DNA having a guanine derivative as the base moiety.
  • FIG. 22 is an explanatory diagram illustrating the synthesis route of DNA having a guanine derivative as the base moiety.
  • FIG. 23 shows the experimental results showing that photoligation is possible using a guanine derivative.
  • FIG. 24 shows experimental results showing that a photoligated product using a guanine derivative can be photocleavable.
  • FIG. 25 is an explanatory diagram illustrating the synthesis route of DNA having an adenine derivative as the base moiety.
  • FIG. 26 is an explanatory diagram illustrating the synthesis route of DNA having an adenine derivative as the base moiety.
  • FIG. 27 is an experimental result showing that photoligation is possible using an adenine derivative.
  • FIG. 28 shows the experimental results showing that photoligation can be achieved using an adenine derivative.
  • FIG. 29 shows experimental results showing that photoligation of a product photoligated with an adenine derivative is possible.
  • RNA-type-directed photoligation by ODN1 was confirmed as follows.
  • ODN1 (CV U) and ODN (T) 5 1 d (TGTGCT) -3 are irradiated for 30 minutes at 366 nm in the presence of RNA (A) 5, r (CACGCA AGCACA) -3 '( The appearance of O DN ( CV UT) peak in 98% yield was confirmed by HPLC with the disappearance of ODN ( CV U) and ODN (T) (FIG. 3).
  • MALDI-TOF-MS shows that the isolated ODN ( CV UT) obtained from HPLC purification is a photoligated product of ODN ( CV U) and ODN (T) (calcd.
  • RNA-type-directed photoligation can be used by incorporating it into a platform suitable for DNA chip technology, amino-labeled ODN, including ev u, ODN2 ( cv U) 5, -d ( cv UGCGTG )-SSSS- NH -3, where S is hexa
  • the DNA chip was constructed by adding (ethylene glycol) linker fragment)) onto the aldehyde-modified glass surface.
  • RNA-linked photoligation was confirmed by ODN2 ( CV U) on the DNA chip. Spot 2 ⁇ target RNA ( ⁇ ) and piotin-labeled ODN (T), 5, 1 piotin and 1 TGTGC T-3, in 50 mM sodium codylate buffer (pH 7.0) and lOOmM sodium chloride Then, irradiation was performed at 366 nm for 10 minutes. After washing with deionized water at 98 ° C for 5 minutes, a PBS solution of streptavidin-Cy3 conjugate was added to the surface and washed twice with PBS buffer. The fluorescent signal was detected using a microarray scanner. As shown in FIG.
  • RNA ⁇ directed photoligation by ev U Irradiation of ODN containing ev U at the 5 'end with ODN containing pyrimidine base at the 3' end in the presence of a truncated RNA efficiently formed photoligation without any by-product formation. happensed.
  • mismatches at various positions can be distinguished well by using DNA chip analysis based on RNA-type-directed photoligation. Therefore, this system can be widely used for specific detection of RNA sequences.
  • ODN was synthesized by a conventional phosphoramidite method using an Applied Biosystems 3400 DNA synthesizer. Binding efficiency was monitored with a trityl monitor. The coupling efficiency of cv u cyanophosphoramidite was 97% yield. The binding time of CV U cyanophosphoramidite was 999 seconds. These were deprotected by incubation with 28% ammonia for 4 hours at 65 ° C and purified by reverse phase HPLC on a Chemcobond 5-ODS-H column (4.6 x 150 mm); elution was 3-20 Linear gradient (30 minutes), flow rate 1. OmLZ minutes, 30 ° C. with 0.05M ammonium formate containing% acetonitrile. Oligonucleotide purification was confirmed by MALDI-TOF-MS analysis.
  • the amino-labeled ODN probe containing CV U was diluted at a concentration of 2 ⁇ 10 5 M in lOOmM sodium cacozate buffer (pH 7.0). Spotting was performed using 5 L each from a standard micropipette. Amino-labeled ODN probe containing ev U was bound to the surface for 12 hours at room temperature inside the desiccator. After immobilization of the probe, the glass surface
  • a probe ODN having an amine terminal and a photoresponsive base was immobilized on an aldehyde-treated microarray slide (Nunc) by the following procedure.
  • the probe ODN was adjusted to 0.2 ⁇ 1 in a buffer solution (sodium phosphate buffer pH 8.5, 0.01% SDS).
  • ODN P1 is an oligonucleotide that is immobilized on a substrate via hexaethyleneglycol (S), and has a photoligating base moiety (GV U).
  • ODN S35 is an oligonucleotide having a biotin (B) at its end as a labeling moiety, and has a photoligated base moiety (C in the figure).
  • this ODN P1, ODNS35, and oligonucleotide (Template ODN) as a force target are arranged adjacent to each other in a photoligable state by hybridization.
  • the experiment was performed by forming a noble dot at room temperature under the conditions of ODN S 35 (2 ⁇ M), template-ODN (2 ⁇ M), Nacaco. (50 mM), NaCl (25 mM). Photoligation was performed by irradiating with a wavelength of 366 nm for 10 minutes.
  • FIG. 9 is an explanatory diagram thereof.
  • Probe A, probe C, probe 0, and probe T, shown on the left, are each fixed at one end to the substrate and have a photolinkable base moiety ( ev U) at one end. The third base is different from A, C, G, and T, respectively.
  • These probes were adjusted as detailed in FIG.
  • target DNA ⁇
  • biotin-DNA Biotin-DNA
  • the optimum salt concentration exists in the range of 80 to 150 mM centered on lOOmM, and the target nucleic acid (detection target) In the case of ODN) concentration ⁇ , the optimum salt concentration (maximum value) exists between 400 and 700 mM, centered on 500 mM.
  • the two concentrations were also optimized for changes in the concentration of the target nucleic acids (detection target ODN).
  • FIG. 18 is an explanatory diagram showing that reversible photoligation is possible by using a uracil derivative as a base moiety (upper part of FIG. 18).
  • a uracil derivative as a base moiety
  • FIG. 18 As the left side of the upper part of FIG. 18, in the presence of a ⁇ 12 base long DNA strand (Template), 3 'end to a 6-base long DNA strand having a pyrimidine base (3' Py- DNA) And a 6-base long DNA strand ( V U-DNA) having a uracil derivative ( vinyl U) at the 5 'end are photocoupled by irradiation with light at 366 nm (reaction indicated by an arrow pointing to the right) ), As shown on the left side of the upper part of Fig.
  • the 12-base long DNA strand on the right side of the upper part of Fig. 18 is photocleavaged by irradiating it with light at 302 nm (reaction indicated by the arrow pointing to the left).
  • a DNA strand with a base length is generated again.
  • Such a reversible photoligation is suitably possible in having a base (uracil derivative) in the left-hand structural formula in the lower part of FIG. 18.
  • pyrimidine base derivatives that is, uracil derivatives, thymine derivatives, and cytosine derivatives
  • a photoligating base moiety that does not modify the heterocyclic structure is obtained. I was able to. In order to realize a more free reversible photoligation, it was necessary to obtain a photoligating base moiety using a purine base derivative, but this was extremely difficult.
  • the present inventors modified the heterocyclic structure of the purine base, thereby using the purine base derivative (that is, the guanine derivative and the adenine derivative) that can be used as the base moiety in the present invention. Succeeded in getting. This modification of the heterocyclic structure of the purine base is characterized by 7-deaza.
  • FIG. 21 and FIG. 22 illustrate the structure of a guanine derivative that can be used as a base moiety in the present invention and a synthesis route for DNA having a guanine derivative as a base moiety.
  • the present invention is not limited to these examples.
  • a DNA having a guanine derivative that can be used as a base moiety in the present invention can also be produced by a known method.
  • Figure 23 shows a 6-base long DNA strand ( zve G—DNA: ODN2) having a guanine derivative thus obtained at the 5 ′ end and a 6-base long DNA strand having T at the 3 ′ end ( ODN1)
  • ODN3 6-base long DNA strand
  • Example 5 In order to confirm that reversible photoligation of DNA is possible with the base used in the present invention, the following experiment was further conducted.
  • purine base derivatives that is, guanine derivatives and adenine derivatives
  • This modification of the purine base complex ring structure is characterized by 7-deaza.
  • FIG. 25 and FIG. 26 exemplify the structure of an adenine derivative that can be used as a base moiety in the present invention and a synthesis route of DNA having an adenine derivative as a base moiety.
  • the present invention is not limited to these examples.
  • a DNA having an adenine derivative that can be used as a base moiety in the present invention can also be produced by a known method.
  • Figure 27 shows a 6-base long DNA strand ( ZVA A-DNA: ODN4) with the adenine derivative thus obtained at the 5 'end and a 6-base long DNA strand with T at the 3' end ( ODN1)
  • photoligation is performed by irradiation with light at 366 nm for 5 minutes, preferably 15 minutes to form a 12-base long DNA strand (ODN5).
  • Fig. 28 shows a 6-base long DNA strand ( Zve A—DNA: ODN6) with the adenine derivative thus obtained at the 5 'end and a 6-base long DNA strand with T at the 3' end ( ODN1)
  • photoligation is performed by light irradiation at 366 nm for 1 minute, preferably 5 minutes, to generate a 12-base long DNA strand (ODN7).
  • ODN7 12-base long DNA strand
  • FIG. 30 shows the structure of 7-carboxybutyl-7-daza-2, -deoxyadenosine, a deoxynucleoside ( ZVC A) having a particularly suitable adenine derivative as the base moiety. uv absorption characteristics are shown.
  • Figure 1 shows the strategy for detecting RNA point mutations on DNA chips!
  • Figure 2 shows the RNA ⁇ oriented reversible photoligation of ODN by ev U.
  • Figure 3 shows an HPLC analysis of irradiated ODN1 ( CV U) and ODN (T) in the presence of truncated RNA (A). Before irradiation (a); 30 minutes irradiation at 366 nm (b), 98% yield.
  • Figure 4 shows the photoligation products on matched and single mismatched target RNAs.
  • FIG. 5 shows an HPLC analysis of irradiated ODN ( ev U—T). Before irradiation (a); irradiated at 312 ⁇ m for 4 minutes (b).
  • FIG. 6 shows the HPLC analysis of irradiated ODN1 ( ev U). Before irradiation (a); irradiated at 312 nm for 2 minutes (b).
  • Figure 7 shows the fluorescence intensity (top) and image (bottom) for the ODN2 (CV U) photoligation product.
  • Figure 8 shows photoligation on the DNA chip.
  • Figure 9 shows the detection of genetic polymorphisms (SNPs) on a DNA chip.
  • Figure 10 shows the adjustment of the probe ODN.
  • FIG. 11 shows the detection of single base substitution at high, SZN ratio.
  • FIG. 12 shows the effect of adding acetonitrile to the reaction solvent.
  • Figure 13 shows the optimization of the NaCl concentration.
  • Figure 14 shows the optimization combining the two conditions of target nucleic acid (detected ODN) concentration and salt concentration.
  • Figure 15 shows the optimization of the MgCl concentration.
  • FIG. 16 shows the discrimination against single nucleotide polymorphisms and deletions to four bases.
  • Figure 17 shows the single nucleotide polymorphism to the four bases and the discriminating SZN ratio for the deletion.
  • FIG. 18 is an explanatory diagram showing reversible photoligation using a uracil derivative.
  • Figure 19 illustrates a synthesis route for DNA with a cytosine derivative as the base moiety.
  • FIG. 20 shows the experimental results showing that reversible photoligation is possible using cytosine derivatives.
  • FIG. 21 is an explanatory diagram illustrating the synthesis route of DNA having a guanine derivative as the base moiety.
  • FIG. 22 is an explanatory diagram illustrating the synthesis route of DNA having a guanine derivative as the base moiety.
  • FIG. 23 shows the experimental results showing that photoligation is possible using a guanine derivative.
  • FIG. 24 shows the experimental results indicating that a product photoligated with a guanine derivative can be photocleavable.
  • FIG. 25 is an explanatory diagram illustrating the synthesis route of DNA having an adenine derivative as the base moiety.
  • FIG. 26 is an explanatory diagram illustrating the synthesis route of DNA having an adenine derivative as the base moiety.
  • FIG. 27 is an experimental result showing that photoligation is possible using an adenine derivative.
  • FIG. 28 is an experimental result showing that photoligation is possible using an adenine derivative.
  • FIG. 29 is an adenine derivative. This is an experimental result showing that photocleavage of the product photoligated using is possible.
  • Figure 30 shows the experimental results showing the UV absorption characteristics of 7-force noroxyvininole 7 dither-2 and -deoxyadenosine.
  • Table 1 shows the fluorescence intensity normalized to the photoligated product of ODN2 ( ev U) correctly base-paired to eight different RNA targets at a single nucleotide position. .
  • [b] Each experiment was performed at least 4 times.
  • Table 1 Comparison of point-mutated target RNA Fluorescence Intensity [table 1]
  • Table 2 shows the fluorescence intensity normalized for the photoligated product of ODN2 U). [a] Underlined letters indicate mismatch bases. [b] Each experiment was performed at least four times.

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Description

明 細 書
特定の塩基配列の標的核酸類を検出する方法、及び検出のための核酸 類セット
技術分野
[0001] 本発明は、試料混合物中に存在する特定の塩基配列の標的核酸類を、光連結を 使用して特異的に検出する方法、及び該検出のための核酸類セットに関する。
背景技術
[0002] 遺伝子工学にお 、て重要な基本的手段の一つとして、試料混合物中に存在する 特定の塩基配列の核酸類 (核酸類には、核酸、及びペプチド核酸が含まれる）の検 出（検出には、同定、及び定量を含む）がある。特定の塩基配列の核酸類あるいは遺 伝子の存在を検出することで、着目する遺伝子の発現を解明して新規に創薬するこ とが可能となったり、遺伝子組み換えにおいて目的の遺伝子が導入された細胞や個 体を選択することが可能になり、あるいは、遺伝子診断を行って病気の原因となるヒト の遺伝子欠陥や変化を検出することで病気の発症前やその初期段階で診断や予測 が可能となったりする。
[0003] このように、試料混合物中に存在する特定の塩基配列の核酸類の検出は、遺伝子 工学において広く使用されている基本的な手段であり、例えば次のような方法が知ら れている。
最初に、調査したい細胞等カゝら核酸類を抽出して試料混合物溶液を得る。必要が あれば、適当な制限酵素で切断した後、電気泳動を行い、得られたゲルからメンブレ ンへブロッテイングを行う。次に、検出の目的とする特定の塩基配列を有する核酸類 に対して、特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸プローブを用意する。 そして、これとプロットされた核酸類とをノ、イブリツド形成させる。この核酸プローブは、 検出可能となるようにあら力じめ標識をしておく。例えばラジオアイソトープにより標識 をしておく。これによつて核酸プローブとハイブリッド形成した核酸類のバンドを、ォー トラジオグラフィーにより検出し、標的とする特定の塩基配列を有する核酸類の存在 を確認する。この方法は、 RNAについてはノザンブロッテイング、 DNAについてはサ ザンブロッテイングと呼ばれ、種々の変形をなされつつ、今なお使用されている（例え ば、「細胞の分子生物学」第四版、中村桂子'松原謙一監訳、ニュートンプレス刊、 2 004年、 494〜500頁【こ記載されて!ヽる）。
また、特に最近の遺伝子診断技術においては、 DNAチップ (DNAマイクロアレイ） 力 特定の塩基配列の核酸類の検出に使用されている。 DNAチップの基板上には 、多数の区画のそれぞれに種々の塩基配列の DNAプローブが固定化され、アレイ 状に配置されている。そして、被験者由来の DNAの混合物をあら力じめ標識して、 例えば蛍光色素による標識をして用意する。この被験者由来の DNA混合物を DNA チップに滴下して、ハイブリッド形成させる。被験者由来の DNA混合物中のうち、 D NAプローブと相補性のある塩基配列を含む DNAは、ハイブリッド形成により DNA チップの基板上に固定される。この固定された被験者由来の DNAを例えば先の蛍 光色素による標識で検出する。この方法では、 DNAの調整や RNAの使用、あるい はハイブリッド形成を競合的に行うことで正規ィ匕をするなどの種々の変形が行われて いる（例えば、「細胞の分子生物学」第四版、中村桂子'松原謙一監訳、ニュートンプ レス flj、 2004年、 533〜535頁【こ記載されて!ヽる）。
[0004] このように従来の方法力 最近の技術に至るまで、特定の塩基配列の核酸類の検 出には、相補的な塩基配列を有する核酸プローブとのハイブリッド形成が、相補的な 塩基配列の特異的な認識を可能にする基本的原理として永らく利用されてきている 。し力しながら、実際のハイブリッド形成の条件下においては、核酸プローブ分子との 結合は、完全な相補鎖としてハイブリッド形成する標的塩基配列の核酸類のみで生 じることは難しい。すなわち、相補鎖として不完全な非標的塩基配列の核酸類に対し ても、一定のミスマッチを含む不完全なハイブリッド形成をしてしまい、核酸プローブ 分子との結合が生じることが知られて 、る。このような核酸プローブとの意図しな 、結 合は、検出段階でノイズとして出現する。このようなノイズが出現しないように、検出の 特異性を高めようとすれば、不完全なハイブリッド形成を排除することが必要となる。
[0005] しかし、ハイブリッド形成による識別は熱的安定性の差を利用しているものであって 、完全なハイブリッド形成も不完全なハイブリッド形成もその違いは熱的安定性の違 いに過ぎない。そのために、両者を区別する適切な条件は目的の塩基配列によって 異なり、さらに適切な条件下でもなお、熱的安定性を変化させる条件は両者に均等 に作用する。すなわち、ハイブリッド形成の熱的安定性の差のみを、両者の区別の原 理として使用する限りは、検出の特異性と感度のバランスで妥協して一定のノイズを 甘受せざるを得な力つた。
さらに、近年では、新規創薬や遺伝子診断のために、一塩基置換した塩基配列を 有する核酸類を、検出することが求められている。特に、 DNAの一塩基多型をタイピ ングする技術には、医療診断の分野での期待が大きい。このためには、一塩基の置 換を検出するほどの特異性と、実用可能な感度 (SZN比）とを両立させることが特に 求められている。
[0006] 非特許文献 1：「細胞の分子生物学」第四版、中村桂子'松原謙一監訳、ニュートンプ レス刊、 2004年、 494〜500頁
非特許文献 2 :「細胞の分子生物学」第四版、中村桂子'松原謙一監訳、ニュートンプ レス刊、 2004年、 533〜535頁
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明の目的は、試料混合物中に存在する特定の塩基配列の標的核酸類を、相 補鎖とのハイブリッド形成を利用しつつ、高い特異性と感度 (SZN比）を両立させて 検出する方法、及び該検出のための核酸類を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、上記目的のために、長年にわたって鋭意研究開発を行ってきた光 連結を用いた。そして、ノ、イブリツド形成と光連結を組み合わせることで、上記目的を 達成できることを見いだした。すなわち、光連結を利用して、完全なハイブリッド形成 を行った場合にのみ特異的に光連結させ、標識部分を有する核酸類の分子を、基 材に共有結合的に固定ィ匕することができた。そして、検出されるべき標識部分を有す る分子が、もはやハイブリッド形成の維持に依存することなく基材に固定化されること によって、相補的二重鎖の解離する条件での徹底的な洗浄が可能となった。これに より、高 、特異性と感度 (SZN比）を両立させることができた。
[0009] したがって、本発明は、塩基部分として次の式 I、式 II、式 III、式 IV又は式 V： 式 I
[化 1]
Figure imgf000006_0001
(ただし、式 I〖こおいて、 Zは O又は NHを示し、 X及び Yの少なくとも一方は、カルボキ シル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基及びシァノ基カゝらなる群より選択 された電子吸引性基を示し、 X及び Υの残りの基は水素原子を示す）
式 II
[化 2]
Figure imgf000006_0002
(ただし、式 IIにおいて、 Rは、水素原子であり、
R及び Rの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボ-ル基、低級
2 3
ァルケ-ル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シァノ基及び水素原子か らなる群より選択された基を示し、 R及び Rの残りの基は水素原子又はシァノ基を示
2 3
す）
式 ΠΙ
[化 3]
Figure imgf000006_0003
(ただし、式 mにおいて、 Rは、水素原子又は低級アルキル基であり、
4
R及び Rの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級
5 6
ァルケ-ル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シァノ基及び水素原子か らなる群より選択された基を示し、 R及び ァノ基を示
5 Rの残りの基は水素原子又はシ
6
す）
式 IV
[化 4]
Figure imgf000007_0001
(ただし、式 IVにおいて、 Rは、水素原子又は低級アルキル基であり、
R及び Rの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボ-ル基、低級
8 9
ァルケ-ル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シァノ基及び水素原子か らなる群より選択された基を示し、 R及び Rの残りの基は水素原子又はシァノ基を示
8 9
す）
式 V
[化 5]
Figure imgf000007_0002
(ただし、式 Vにおいて、 R は、水素原子又は低級アルキル基であり、
10
R 及び R の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低
11 12
級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シァノ基及び水素原子 力 なる群より選択された基を示し、 R 及び R の残りの基は水素原子又はシァノ基 を示す）
で表される基を、 5'末端又は 3'末端に有する核酸類 (ただし、核酸類には、核酸、 ペプチド核酸が含まれる）からなる光連結性核酸類と、
光連結性核酸類と光連結可能な塩基部分として炭素 炭素二重結合を有する塩 基を、 3'末端又は 5'末端に有する、被光連結性核酸類と、からなり、
光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの ヽずれか一方が、標識部分を有 し、
光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの標識部分を有さな ヽ一方が、あら 力じめ基材に固定ィ匕されており、
光連結性核酸類と被光連結性核酸類とが、光連結されることによって、特定の塩基 配列を有する標的核酸類の塩基配列と相補的な塩基配列の核酸類を生成可能であ り、
光連結性核酸類と被光連結性核酸類とが光連結されることによって生成可能な核 酸類は、相補的二重鎖の解離する洗浄条件で洗浄可能である、特定の塩基配列の 標的核酸類を検出するための核酸類セットにある。
好ましい実施の態様において、塩基部分が式 Iで表される基であり、式 Iにおいて、 Zが Oで、 Xが水素原子で、 Yがカルボキシル基、低級アルコキシカルボ-ル基、置 換アミド基又はシァノ基である。
好ましい実施の別な態様において、塩基部分が式 Πで表される基であり、式 IIにお いて、 R及び Rの少なくとも一方が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボ-ル基
2 3
、置換アミド基、アミド基、シァノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、
R及び Rの残りの基が水素原子である。
2 3
好ましい実施の別な態様において、塩基部分が式 ΠΙで表される基であり、式 ΠΙに おいて、 R及び Rの少なくとも一方が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボ-ル
5 6
基、置換アミド基、アミド基、シァノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示 し、 R及び Rの残りの基が水素原子である。
5 6
好ましい実施の別な態様において、塩基部分が式 IVで表される基であり、式 IVに おいて、 R及び Rの少なくとも一方が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボ-ル 基、置換アミド基、アミド基、シァノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示 し、 R及び Rの残りの基が水素原子である。
8 9
好ましい実施の別な態様において、塩基部分が式 Vで表される基であり、式 Vにお いて、 R 及び R の少なくとも一方が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボ-ル
11 12
基、置換アミド基、アミド基、シァノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示 し、 R 及び R の残りの基が水素原子である。
11 12
標識部分の標識として、ピオチン標識、色素標識 (蛍光色素標識を含む)、 RI標識 、酵素標識 (発色酵素標識を含む)からなる群より選択された何れかの標識を有して いることが好ましい。標識部分の標識として、ピオチン標識を有していることが特に好 ましい。
光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの、あらかじめ基材に固定化された 一方の核酸類が、リンカ一部分を介して基材に固定化されていることが好ましい。 リンカ一部分力 ポリエチレングリコール又はアルカン類を含むことが好ましい。リン カー部分力 ポリエチレングリコールを含むことが特に好ましい。
基材が、ガラスプレート、 CPG、ポリスチレンビーズからなる群より選択された何れか であることが好ましい。基材が、ガラスプレートであることが特に好ましい。
洗浄条件として、 80〜： LOO°Cの範囲の洗浄温度で洗浄可能であることが好ま U、。 洗浄条件として、 95〜： LOO°Cの範囲の洗浄温度で洗浄可能であることが特に好まし V、。 洗浄条件として、変性剤を含む洗浄溶液で洗浄可能であることが好ま ヽ。変 性剤として、例えば、尿素を挙げることができる。
洗浄条件として、界面活性剤を含む洗浄溶液で洗浄可能であることが好ましい。界 面活性剤として、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムを挙げることができる。
炭素 炭素二重結合を有する塩基が、シトシン、チミン又はゥラシルであることが好 ましい。
光連結性核酸類が、オリゴヌクレオチドであることが好適である。光連結性核酸類が 、 DNA又は RNAであることが好適である。光連結性核酸類が、ペプチド核酸である ことが好適である。
被光連結性核酸類が、オリゴヌクレオチドであることが好適である。被光連結性核 酸類が、 DNA又は RNAであることが好適である。被光連結性核酸類が、ペプチド核 酸であることが好適である。
光連結性核酸類と被光連結性核酸類が、同じ種類の核酸類であることが好適であ る。
標的核酸類が、オリゴヌクレオチドであることが好適である。標的核酸類が、 DNA 又は RNAであることが好適である。標的核酸類が、ペプチド核酸であることが好適で ある。
[0010] また、本発明は、上記の光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの、標識部 分を有さない一方が、あらかじめ基材に固定化されてなり、
光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの、標識部分を有する一方とともに 使用される、 DNAマイクロアレイ (基材上に固定ィ匕される分子として、 DNA以外の核 酸、及びペプチド核酸を含む）にもある。
[0011] また、本発明は、上記の光連結性核酸類及び被光連結性核酸類と、核酸類混合 物中に含まれる、特定の塩基配列を有する標的核酸類とを、ハイブリッド形成させる 工程と、
特定の塩基配列を有する標的核酸類を铸型とするハイブリッド形成によって、光連 結可能に隣接された光連結性核酸類と被光連結性核酸類に、光照射して光連結さ せ、標識部分を有する核酸類を基材に固定化する工程と、
光連結により基材に固定化された、標識部分を有する核酸類を、ハイブリッド形成 した相補的二重鎖が解離する洗浄条件で洗浄することによって、光連結により基材 に固定化されなカゝつた、標識部分を有する核酸類を、除去する工程と、
光連結により基材に固定化された、標識部分を有する核酸類を検出するために、 標識部分を検出する工程と、
を含む、核酸類混合物中に含まれる、特定の塩基配列を有する標的核酸類を検出（ 同定及び定量を含む)する方法にもある。
ハイブリッド形成させる工程、及び光連結させて標識部分を有する核酸類を基材に 固定化する工程が、 20〜30°Cの温度で行われることが好ましい。
ハイブリッド形成させる工程、及び光連結させて標識部分を有する核酸類を基材に 固定ィ匕する工程力 緩衝作用のある塩を含む反応溶液の中で行われることが好まし い。反応溶液の pHが 6. 5〜8. 5の範囲にあることが好ましい。緩衝作用のある塩の 濃度が、 5〜250mMの範囲にあることが好ましい。緩衝作用のある塩が、力コジル酸 塩であることが好ましい。
また、反応溶液が、水分散性有機溶媒を含むことが好ましい。反応溶液が、 20〜6 0% (体積比)の水分散性有機溶媒を含んで 、ることが好まし!/、。水分散性有機溶媒 力 ァセトニトリルであることが好ましい。
また、反応溶液が、アルカリ金属及び Z又はアルカリ土類金属の塩を含み、該塩の 濃度が、標的核酸類の濃度に対して最適化されていることが好ましい。アルカリ金属 及び Z又はアルカリ土類金属の塩として、例えば塩ィ匕ナトリウム及び Z又は塩ィ匕マグ ネシゥムを含むことが好まし 、。
洗浄条件が、 80〜100°Cの範囲の洗浄温度での洗浄であることが好ましい。洗浄 条件が、 95〜100°Cの範囲の洗浄温度での洗浄であることが特に好ましい。
洗浄条件が、変性剤を含む洗浄溶液での洗浄であることが好ましい。洗浄条件が、 界面活性剤を含む洗浄溶液での洗浄であることが特に好ましい。
光照射が、 330nm以上の波長の光の照射により行われることが好ま 、。
標的核酸類が、オリゴヌクレオチドであることが好適である。また、標的核酸類が、 D NAであることが好適である。また、標的核酸類が、 RNAであることが好適である。ま た、標的核酸類が、ペプチド核酸であることが好適である。
また、上記方法において、標識部分の標識が蛍光色素標識であり、
標識部分の検出をする工程において、レーザースキャナを使用した蛍光測定を行 う工程が含まれることが好まし!/、。
さらに、上記方法において、標識部分の標識がピオチン標識であり、
標識部分の検出をする工程において、
蛍光色素標識されたアビジンによって、ピオチン アビジン結合反応を行う工程と、 レーザースキャナを使用した蛍光測定を行う工程が含まれることが好ま 、。
さらに、本発明は、上記方法において、特定の塩基配列を有する標的核酸類の塩 基配列と相補的な塩基配列から 1塩基を置換した配列の核酸類が、光連結性核酸 類と被光連結性核酸類とが光連結されることによって生成されるような塩基配列を有 する、光連結性核酸類及び被光連結性核酸類を使用することによって、標的核酸類 の塩基配列の点変異を検出する方法にもある。
発明の効果
[0013] 本発明によれば、試料混合物中に存在する特定の塩基配列の標的核酸類を、相 補鎖とのハイブリッド形成を検出原理としつつ、高い特異性と感度を両立させて検出 できる。すなわち、完全なハイブリッド形成を行った場合にのみ光連結させることを可 能としたために、検出される標識部分を有する分子のみが、共有結合的に基材に固 定ィ匕できる。これによつて、相補的二重鎖の解離する条件での徹底的な洗浄が可能 となった。このため、未反応物を完全に除去することで、ノイズを極めて低減すること ができる。これは、共有結合を切断することなく行うために、検出感度を低下させるこ とがない。すなわち、このように不完全なハイブリッド形成を完全に除去することによつ て、高い特異性と感度とが両立されている。
[0014] 従って、本発明による特定の塩基配列の標的核酸類を検出する方法、及び該検出 のための核酸類セットは、相補的塩基配列とハイブリッド形成することを原理として ヽ るあらゆる方法にぉ 、て、高 、特異性と感度とを両立して提供するものである。
また、本発明において、光連結は光反応であり、酵素反応のような微妙な条件設定 を要しない。さらに生成される結合が安定な共有結合である。そのために、反応条件 として、極めて広範な範囲の条件から、最適な条件を選択可能であるという実験操作 の容易性と効率性を、本発明は実現している。
[0015] 本発明の高い特異性と感度とは、 DNAタイピングに有用であり、医療診断分野へ の利用が期待される。特に、本発明の高い特異性と感度とは、一塩基置換の検出に 有効である。また、本発明を DNAチップへと応用することは、通常のノ、イブリツド形成 による検出法、あるいは酵素を利用するインベーダー法などと比較して、高い特異性 と感度という利点に加えて、ハイブリッド形成の条件の選択の自由度が大きぐ温度 の設定も自由度が大きぐ管理等が楽であるという利点を有し、より広範な用途に DN Aチップの使用を拓くものである。
発明を実施するための最良の形態 [0016] 本発明の実施の形態を以下に詳細に説明する。
図 1は、本発明の実施の一態様の流れを示した説明図である。
図 1の（1— 1)では、光連結性核酸類として、 ODN2 (GVU)が示されている。この O DN2 (CVU)は、光連結性のある式 Iの塩基部分として、 5 カルボキシビュル 2'— デォキシゥリジン (GVUと表記する）を有するオリゴヌクレオチドである。この ODN2 (cv U)の一端は、 N = CH を介して基材の表面上に固定ィ匕されている。また、図 1の (1— 1)では、被光連結性核酸類としてピオチン— ODN (T)が示されている。このビ ォチン (Biotin) -ODN (T)は、光連結性核酸類と光連結可能な塩基部分である炭 素 炭素二重結合を有する塩基として、チミン (Tと表記する）を有するオリゴヌクレオ チドである。このピオチン一 ODN (T)はその一端に、標識部分としてピオチンを有し て!、る。このピオチンは図 1のピオチン一 ODN (T)の一端に丸として表されて 、る。 また、図 1の（1 1)では、特定の塩基配列を有する標的核酸類として、標的 (Targe t) RNA (A)が示されて!/、る。
[0017] この標的核酸類である標的 RNA (A)と、光連結性核酸類である ODN2 (CVU)と被 光連結性核酸類であるピオチン一 ODN (T)力もなる核酸類セットとを、混合してハイ ブリツド形成をさせる。すると、あらかじめ準備された塩基配列の相補性に従って、標 的 RNA(A)を铸型として、ピオチン一 ODN (T)と ODN2 (CVU)とは、 T^CVUとが光 連結可能になるように近接して整列する。この状態で光照射を行うと、光反応により 光連結が生じて、図 1の（1— 2)に示されるように、ピオチン— ODN (T)と ODN2 (GV U)とは共有結合で 1本に連結された状態となる（光連結された状態は、 T^evUを架 橋するように <印を付して示した)。
後述するように、本発明者らの見いだした知見によれば、このように光連結するため には、塩基配列がほぼ完全に相補的にハイブリッド形成することが必要である。この 光連結は、わずか一塩基の置換によって生じる不完全なハイブリッド形成によっても 妨げられる。すなわち、本発明においては、この光連結による相補鎖の高い識別性 1S 本発明の高い特異性に寄与している。
[0018] このように光連結によって標識部分が基材上に固定化された状態（図 1の（1— 2) ) となれば、もはや铸型とされた標的核酸類（図 1の標的 RNA (A) ) )がハイブリッド形 成を維持している必要はない。そこで、次にハイブリッド形成による相補的二重鎖の 解離するような条件で、洗浄を行う。特に、本発明では、意図しない不完全なハイプリ ッド形成による不完全な相補的二重鎖のみならず、目的とする完全なハイブリッド形 成による完全な相補的二重鎖をも解離させて、洗浄除去してしまっても、その後の検 出には原理的に全く影響がない。すなわち、完全な相補的二重鎖をも解離させる条 件での洗浄が可能である。そのため、光連結が生じない程度の不完全なハイブリッド 形成によって、標的 RNA (A)の特定の塩基配列に類似した塩基配列を介して基材 上に弱く固定ィ匕された標識部分があつたとしても、これを完全に除去して、ノイズとし て出現することがないようにすることができる。すなわち、本発明においては、ハイプリ ッド形成による目的の相補的二重鎖をも解離させる洗浄条件での洗浄によるノイズの 低減が、本発明の高い感度（SZN比）に寄与している。
[0019] 次に、このように光連結によって基材上に固定ィ匕された標識部分に対して、検出を 行う。図 1の（1— 3)では、ピオチン—ODN (T)に対して、ストレプトアビジン（Strept avidin) Cy3を結合させて検出する様子が示されている。ストレプトアビジンは標識 部分であるピオチンと強く結合し、それによつて基板上へと固定化される蛍光色素 C y3の蛍光を、例えばレーザースキャナで読み取ることにより検出を行う。
[0020] 図 8は、本発明の異なる実施の一態様を示した説明図である。図 8では、説明の便 宜のために、図 1の（1 2)に相当する図のみを示してある。図 8では、光連結性核 酸類として、 ODN P1が示されている。この ODN P1は、光連結性のある式 Iの塩 基部分として、 5—カルボキシビニル— 2'—デォキシゥリジン (evUと表記する）を有 するオリゴヌクレオチドである。この ODN2 (cvU)の一端は、へキサエチレングリコー ル（Hexaethyleneglycol: S)を介して基材の表面上に固定化されている。また、図 8では、被光連結性核酸類として、 ODN S35力示されている。この ODN S35は、 光連結性核酸類と光連結可能な塩基部分である炭素 炭素二重結合を有する塩基 として、シトシン（Cと表記する）を有するオリゴヌクレオチドである。この ODN S35は その一端に、標識部分としてピオチン (Biotin： B)を有して 、る。
図 8では、既に、この ODN P1と ODN S35と力 標的となるオリゴヌクレオチド（T emplate ODN)を铸型とするハイブリッド形成によって、光連結可能な状態に隣接 して配置された状態である。この状態で光照射を行うことにより、光連結が生じる。
[0021] 本発明においては、このハイブリッド形成させ光照射する条件について詳細に検討 を行っている。この条件、すなわち、例えば、温度、溶媒 (溶質）、塩などの種類及び 濃度について、広範な検討が可能であるのは、本発明においては光連結という光反 応によって標識部分の固定ィ匕を行っているためである。いわゆるインベーダー法など の酵素を使用する方法においては、その酵素の至適反応条件などの制約があるた めに、ハイブリッド形成のみに注目した反応条件の検討を行うことがそもそもできない 。従って、ハイブリッド形成と光連結の反応条件を高い自由度で選択可能とすること により、より高い特異性、感度 (SZN比）による検出を可能としていることは、本発明 による利点である。
特に本発明においては、水分散性の有機溶媒、例えばァセトニトリルを使用するこ とにより、極めて迅速にハイブリッド形成と光連結の工程を行うことができることを明ら かにしている。また、緩衝液として力コジル酸緩衝液を使用することで従来の 10倍を 越える蛍光強度を安定して得られることを明らかにしている。また、標的核酸類と塩濃 度との間に最適条件の相関があり、それぞれ異なった極大値を有することも明らかに している。すなわち、このように高い自由度で選択された反応条件を組み合わせるこ とにより、従来力 考えられるよりも極めて高い特異性と感度（SZN比）を実現してい ることも、本発明によりもたらされた貢献である。
[0022] このようにハイブリッド形成して光連結した後に、徹底的な洗浄を行って、不完全な ノ、イブリツド形成によって付着して 、る識別部分 (未反応の核酸類)を除去する。その 後に、例えばピオチン部分に蛍光アビジンを結合させ、スキャナにより検出を行う。こ のような実施により、 1塩基置換、 2塩基置換、 3塩基置換をした配列に対して、非常 に高 、特異性と感度 (SZN比)で、完全な相補配列及びそれぞれの置換配列を識 另 Uでさることがでさる。
[0023] 本発明の実施の形態を、さらに詳細に以下に説明する。
好ましい実施の態様において、光連結性核酸類は、塩基部分として次の式 I： 式 I
[化 6]
Figure imgf000016_0001
(ただし、式 I〖こおいて、 Zは O又は NHを示し、 X及び Yの少なくとも一方は、カルボキ シル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基及びシァノ基カゝらなる群より選択 された電子吸引性基を示し、 X及び Υの残りの基は水素原子を示す）
で表される基を有している。アルコキシカルボ-ル基におけるアルキル基としては、炭 素数 1から 10、好ましくは 1から 5の低級アルキル基が挙げられる。置換基 X、 Υは、 両方が同時に同一または異なる電子吸引基であってもよぐまた置換基 X、 Υの一方 だけが電子吸引基であり、他方が水素原子であってもよい。式 Iにおいて、 Ζが Οで、 Xが水素原子で、 Υがカルボキシル基、低級アルコキシカルボ-ル基、置換アミド基 又はシァノ基であることが好ましい。特に好ましい塩基部分として、 5—ビニルー 2'— デォキシゥリジン、及び 5—カルボキシビ二ルー 2'—デォキシゥリジンをあげることが できる。特に 5—カルボキシビニル— 2'—デォキシゥリジンが好ましい。
好ましい実施の別な態様において、光連結性核酸類は、塩基部分として次の式 II： 式 II
[化 7]
Figure imgf000016_0002
(ただし、式 IIにおいて、 Rは、水素原子であり、
R及び Rの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボ-ル基、低級
2 3
ァルケ-ル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シァノ基及び水素原子か らなる群より選択された基を示し、 R及び Rの残りの基は水素原子又はシァノ基を示
2 3 す）
で表される基を有している。
R及び Rの少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましぐカルボキシル基と水
2 3
素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み合わせとして好ましい。
2 3
R及び Rの少なくとも一方として、低級アルコキシカルボ-ル基は好ましぐ低級ァ
2 3
ルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数 1〜10、好ましくは 1 〜5、さらに好ましくは 1〜3、さらに好ましくは 1〜2、特に好ましくは炭素数 1の低級 アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボ-ル基の例として は、メトキシカルボ-ル基、エトキシカルボ-ル基、プロポキシカルボニル基、及びブ トキシカルボ-ル基等を挙げることができ、メトキシカルボ-ル基、エトキシカルボ-ル 基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシ カルボニル基がさらに好ましぐメトキシカルボ-ル基が特に好ましい。低級アルコキ シカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の 組み合わせは、 R及び Rの組み合わせとして好ましい。
2 3
R及び Rの少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましぐ低級アルケニル
2 3
基としては、炭素数 2〜10、好ましくは炭素数 2〜5、さらに好ましくは炭素数 2〜3、 特に好ましくは炭素数 2の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素 原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み合
2 3 わせとして好ましい。
R及び Rの少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましぐ低級アルキニル
2 3
基としては、炭素数 2〜： L0,好ましくは炭素数 2〜5,さらに好ましくは炭素数 2〜3、 特に好ましくは炭素数 2の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルキ-ル基と水素 原子の組み合わせ、特にェチニル基と水素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み
2 3 合わせとして好ましい。
R及び Rの少なくとも一方として、置換アミドは好ましぐ置換アミドとしては、 1置換
2 3
の N—置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、 N—アルキルアミド、 N—アミ ノアルキルアミドを挙げることができる。このような N—アルキルアミド、 N—アミノアル キルアミドとしては、炭素数 1〜10、好ましくは炭素数 1〜5、さらに好ましくは炭素数 1〜3,特に好ましくは炭素数 3のものであり、 N—ァミノアルキルアミドが特に好ましい 。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特に N—ァミノ（C〜Cアルキル)アミドと水
1 3
素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み合わせとして好ましい。
2 3
R及び Rの少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合
2 3
わせは、 R及び Rの組み合わせとして好ましい。
2 3
R及び Rの少なくとも一方として、シァノ基は好ましぐシァノ基とシァノ基の組み合
2 3
わせ、及びシァノ基と水素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み合わせとして好ま
2 3
しい。
R及び Rの少なくとも一方として、水素原子は好ましぐ水素原子を少なくとも 1個
2 3
含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み合わ
2 3 せとして好ましい。
好ま 、実施の別な態様にぉ 、て、光連結性核酸類は、塩基部分として次の式 III 式 III
[化 8]
Figure imgf000018_0001
(ただし、式 mにおいて、 Rは、水素原子又は低級アルキル基であり、
4
R及び Rの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級
5 6
ァルケ-ル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シァノ基及び水素原子か らなる群より選択された基を示し、 R及び Rの残りの基は水素原子又はシァノ基を示
5 6
す）
で表される基を有している。
Rとしては、水素原子は特に好ましい。
4
Rとしては、低級アルキル基は好ましぐ低級アルキル基としては、炭素数 1〜5、
4
好ましくは炭素数 1〜3、さらに好ましくは炭素数 1〜2、特に好ましくは炭素数 1のも のである。このような低級アルキル基としては、メチル基、ェチル基及びプロピル基等 を挙げることができ、メチル基及びェチル基は好ましぐ特にメチル基が好ましい。
R及び Rの少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましぐカルボキシル基と水
5 6
素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み合わせとして好ましい。
5 6
R及び Rの少なくとも一方として、低級アルコキシカルボ-ル基は好ましぐ低級ァ
5 6
ルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数 1〜10、好ましくは 1 〜5、さらに好ましくは 1〜3、さらに好ましくは 1〜2、特に好ましくは炭素数 1の低級 アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボ-ル基の例として は、メトキシカルボ-ル基、エトキシカルボ-ル基、プロポキシカルボニル基、及びブ トキシカルボ-ル基等を挙げることができ、メトキシカルボ-ル基、エトキシカルボ-ル 基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシ カルボニル基がさらに好ましぐメトキシカルボ-ル基が特に好ましい。低級アルコキ シカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の 組み合わせは、 R及び Rの組み合わせとして好ましい。
5 6
R及び Rの少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましぐ低級アルケニル
5 6
基としては、炭素数 2〜10、好ましくは炭素数 2〜5、さらに好ましくは炭素数 2〜3、 特に好ましくは炭素数 2の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素 原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み合
5 6 わせとして好ましい。
R及び Rの少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましぐ低級アルキニル
5 6
基としては、炭素数 2〜： L0,好ましくは炭素数 2〜5,さらに好ましくは炭素数 2〜3、 特に好ましくは炭素数 2の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルキ-ル基と水素 原子の組み合わせ、特にェチニル基と水素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み
5 6 合わせとして好ましい。
R及び Rの少なくとも一方として、置換アミドは好ましぐ置換アミドとしては、 1置換
5 6
の N—置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、 N—アルキルアミド、 N—アミ ノアルキルアミドを挙げることができる。このような N—アルキルアミド、 N—アミノアル キルアミドとしては、炭素数 1〜10、好ましくは炭素数 1〜5、さらに好ましくは炭素数 1〜3,特に好ましくは炭素数 3のものであり、 N—ァミノアルキルアミドが特に好ましい 。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特に N—ァミノ（C〜Cアルキル)アミドと水
1 3
素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み合わせとして好ましい。
5 6
R及び Rの少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合
5 6
わせは、 R及び Rの組み合わせとして好ましい。
5 6
R及び Rの少なくとも一方として、シァノ基は好ましぐシァノ基とシァノ基の組み合
5 6
わせ、及びシァノ基と水素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み合わせとして好ま
5 6
しい。
R及び Rの少なくとも一方として、水素原子は好ましぐ水素原子を少なくとも 1個
5 6
含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み合わ
5 6 せとして好ましい。
好ま 、実施の別な態様にぉ 、て、光連結性核酸類は、塩基部分として次の式 IV 式 IV
[化 9]
Figure imgf000020_0001
(ただし、式 IVにおいて、 Rは、水素原子又は低級アルキル基であり、
R及び Rの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボ-ル基、低級
8 9
ァルケ-ル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シァノ基及び水素原子か らなる群より選択された基を示し、 R及び Rの残りの基は水素原子又はシァノ基を示
8 9
す）
で表される基を有している。
Rとしては、水素原子は特に好ましい。
Rとしては、低級アルキル基は好ましぐ低級アルキル基としては、炭素数 1〜5、 好ましくは炭素数 1〜3、さらに好ましくは炭素数 1〜2、特に好ましくは炭素数 1のも のである。このような低級アルキル基としては、メチル基、ェチル基及びプロピル基等 を挙げることができ、メチル基及びェチル基は好ましぐ特にメチル基が好ましい。
R及び Rの少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましぐカルボキシル基と水
8 9
素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み合わせとして好ましい。
8 9
R及び Rの少なくとも一方として、低級アルコキシカルボ-ル基は好ましぐ低級ァ
8 9
ルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数 1〜10、好ましくは 1 〜5、さらに好ましくは 1〜3、さらに好ましくは 1〜2、特に好ましくは炭素数 1の低級 アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボ-ル基の例として は、メトキシカルボ-ル基、エトキシカルボ-ル基、プロポキシカルボニル基、及びブ トキシカルボ-ル基等を挙げることができ、メトキシカルボ-ル基、エトキシカルボ-ル 基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシ カルボニル基がさらに好ましぐメトキシカルボ-ル基が特に好ましい。低級アルコキ シカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の 組み合わせは、 R及び Rの組み合わせとして好ましい。
8 9
R及び Rの少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましぐ低級アルケニル
8 9
基としては、炭素数 2〜10、好ましくは炭素数 2〜5、さらに好ましくは炭素数 2〜3、 特に好ましくは炭素数 2の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素 原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み合
8 9 わせとして好ましい。
R及び Rの少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましぐ低級アルキニル
8 9
基としては、炭素数 2〜： L0,好ましくは炭素数 2〜5,さらに好ましくは炭素数 2〜3、 特に好ましくは炭素数 2の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルキ-ル基と水素 原子の組み合わせ、特にェチニル基と水素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み
8 9 合わせとして好ましい。
R及び Rの少なくとも一方として、置換アミドは好ましぐ置換アミドとしては、 1置換
8 9
の N—置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、 N—アルキルアミド、 N—アミ ノアルキルアミドを挙げることができる。このような N—アルキルアミド、 N—アミノアル キルアミドとしては、炭素数 1〜10、好ましくは炭素数 1〜5、さらに好ましくは炭素数 1〜3,特に好ましくは炭素数 3のものであり、 N—ァミノアルキルアミドが特に好ましい 。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特に N—ァミノ（C〜Cアルキル)アミドと水
1 3
素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み合わせとして好ましい。
8 9
R及び Rの少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合
8 9
わせは、 R及び Rの組み合わせとして好ましい。
8 9
R及び Rの少なくとも一方として、シァノ基は好ましぐシァノ基とシァノ基の組み合
8 9
わせ、及びシァノ基と水素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み合わせとして好ま
8 9
しい。
R及び Rの少なくとも一方として、水素原子は好ましぐ水素原子を少なくとも 1個
8 9
含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、 R及び Rの組み合わ
8 9 せとして好ましい。
好ま 、実施の別な態様にぉ 、て、光連結性核酸類は、塩基部分として次の式 V： 式 V
[化 10]
Figure imgf000022_0001
(ただし、式 Vにおいて、 R は、水素原子又は低級アルキル基であり、
10
R 及び R の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低
11 12
級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シァノ基及び水素原子 力 なる群より選択された基を示し、 R 及び R の残りの基は水素原子又はシァノ基
11 12
を示す）
で表される基を有している。
R としては、水素原子は特に好ましい。
10
R としては、低級アルキル基は好ましぐ低級アルキル基としては、炭素数 1〜5、 好ましくは炭素数 1〜3、さらに好ましくは炭素数 1〜2、特に好ましくは炭素数 1のも のである。このような低級アルキル基としては、メチル基、ェチル基及びプロピル基等 を挙げることができ、メチル基及びェチル基は好ましぐ特にメチル基が好ましい。
R 及び R の少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましぐカルボキシル基と
11 12
水素原子の組み合わせは、 R 及び R の組み合わせとして好ましい。
11 12
R 及び R の少なくとも一方として、低級アルコキシカルボ二ル基は好ましぐ低級
11 12
アルコキシカルボ-ル基におけるアルキル部分としては、炭素数 1〜10、好ましくは 1 〜5、さらに好ましくは 1〜3、さらに好ましくは 1〜2、特に好ましくは炭素数 1の低級 アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボ-ル基の例として は、メトキシカルボ-ル基、エトキシカルボ-ル基、プロポキシカルボニル基、及びブ トキシカルボ-ル基等を挙げることができ、メトキシカルボ-ル基、エトキシカルボ-ル 基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシ カルボニル基がさらに好ましぐメトキシカルボ-ル基が特に好ましい。低級アルコキ シカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の 組み合わせは、 R 及び R の組み合わせとして好ましい。
11 12
R 及び R の少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましぐ低級アルケニル
11 12
基としては、炭素数 2〜10、好ましくは炭素数 2〜5、さらに好ましくは炭素数 2〜3、 特に好ましくは炭素数 2の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素 原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、 R 及び R の組み
11 12 合わせとして好ましい。
R 及び R の少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましぐ低級アルキニル
11 12
基としては、炭素数 2〜： L0,好ましくは炭素数 2〜5,さらに好ましくは炭素数 2〜3、 特に好ましくは炭素数 2の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルキ-ル基と水素 原子の組み合わせ、特にェチニル基と水素原子の組み合わせは、 R 及び R の組
11 12 み合わせとして好ましい。
R 及び R の少なくとも一方として、置換アミドは好ましぐ置換アミドとしては、 1置
11 12
換の N—置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、 N—アルキルアミド、 N— アミノアルキルアミドを挙げることができる。このような N—アルキルアミド、 N—アミノア ルキルアミドとしては、炭素数 1〜10、好ましくは炭素数 1〜5、さらに好ましくは炭素 数 1〜3,特に好ましくは炭素数 3のものであり、 N—ァミノアルキルアミドが特に好まし い。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特に N—ァミノ（C〜Cアルキル)アミドと
1 3
水素原子の組み合わせは、 R
11及び R
12の組み合わせとして好ましい。
R 及び R の少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み
11 12
合わせは、 R 及び R の組み合わせとして好ましい。
11 12
R 及び R の少なくとも一方として、シァノ基は好ましぐシァノ基とシァノ基の組み
11 12
合わせ、及びシァノ基と水素原子の組み合わせは、 R 及び R の組み合わせとして
11 12
好ましい。
R 及び R の少なくとも一方として、水素原子は好ましぐ水素原子を少なくとも 1個
11 12
含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、 R
11及び R
12の組み合 わせとして好ましい。
このような塩基の好適な構造式を以下に例示する。本発明において使用可能な塩 基は以下の例示に限定されるものではない。
[化 11]
Figure imgf000025_0001
[0029] 光連結性核酸類は、塩基部分として式 Iで表される基を、 5 '末端又は 3 '末端に有 している。この場合に、被光連結性核酸類は、これに対応して光連結性核酸類と光 連結可能であるように、 3'末端又は 5 '末端に、光連結可能な塩基部分として炭素 炭素二重結合を有する塩基を有する。
[0030] 光連結性核酸類の核酸類には、核酸、ペプチド核酸 (PNA)が含まれる。核酸には 、 DNA、 RNAが含まれ、これら以外のオリゴヌクレオチドが含まれる。これらは天然 又は合成の 、ずれのものであってもよ 、。本発明におけるハイブリッド形成による相 補的二重鎖を形成可能なものであれば使用することができる。
光連結性核酸類は、通常の核酸の製造方法に準じて製造することができる。例え ば、 5 -置換ビュルゥリジンの DMTr体にアミダイド化剤を作用させてアミダイド化し、 次いで保護基を切断して、これを通常の DNA合成法によりオリゴヌクレオチドとする ことができる。 5—置換ビニルシトシン誘導体又は 5—置換ビュルゥラシル誘導体は、 以下に示す具体例の方法によってもよいが、他の通常の有機合成法によっても製造 することができる。
[0031] 被光連結性核酸類は、光連結性核酸類と光連結可能な塩基部分として、炭素 炭 素二重結合を有する塩基を、 3'末端又は 5'末端に有している。炭素 炭素二重結 合を有する塩基としては、縮合環を形成している炭素 炭素二重結合は好ましくなく 、単環式の炭素 炭素二重結合又は環に置換している炭素 炭素二重結合が好ま しい。好ましい炭素 炭素二重結合を有する塩基としては、天然のものではシトシン 、チミン又はゥラシルなどが挙げられる。
[0032] 被光連結性核酸類の核酸類には、核酸、ペプチド核酸 (PNA)が含まれる。核酸に は、 DNA、 RNAが含まれ、これら以外のオリゴヌクレオチドが含まれる。これらは天 然又は合成の 、ずれのものであってもよ 、。本発明におけるハイブリッド形成による 相補的二重鎖を形成可能なものであれば使用することができる。
[0033] 被光連結性核酸類の核酸類は、光連結性核酸類と同様に、通常の核酸の製造方 法に準じて製造することができる。
[0034] 光連結性核酸類と被光連結性核酸類は、同じ種類の核酸類であってもよぐ異なる 種類の核酸類であってもよ 、。
[0035] 光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの!ヽずれか一方が、標識部分を有 し、
光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの標識部分を有さな ヽ一方が、あら 力じめ基材に固定ィ匕されている。
[0036] 標識部分の標識としては、種々の標識を使用することができ、例えば、ピオチン標 識、色素標識 (蛍光色素標識を含む)、 RI標識、酵素標識 (発色酵素標識を含む)を 使用することができる。本発明で可能になっている強い洗浄条件での洗浄が可能で ある標識が好ましい。取り扱いの容易性と強い洗浄条件への耐性から、ピオチン標 識又は蛍光色素標識が好ましい。ピオチン標識は、さらにアビジン部分を有する種 々の標識を使用して、ピオチン一アビジン結合により検出することができる。これらの 標識部分の付カ卩は、通常の製造方法によって行うことができる。光連結性核酸類又 は被光連結性核酸類は、通常は光連結しない側の末端付近に、標識部分を有する ことが好ま 、が、光連結とハイブリッド形成に望ましくな 、影響を与えな 、範囲で、 他の 、ずれの部位に標識部分を有することもできる。
[0037] 光連結性核酸類又は被光連結性核酸類が固定化される基材としては、ビーズ状、 基板状などの種々の形態のものを使用可能である力 DNAチップ（DNAマイクロア レイ)などによる好適な使用のために、基板状の基材を使用することが好ましい。 基材の材料としては、生化学分野の固相担体として使用されるような種々の材質の 材料を使用することができる。例えば、ガラス、多孔質ガラスなどの無機物質類、ポリ スチレン (PS)などの榭脂類、金などの金属類などが挙げられる。好ましいものとして 、アデノシン残基を有する固相担体 (オリゴァフィ-ティーサポート（OAS)など）、ァ ルデヒド修飾ガラスなどが挙げられる。ガラスプレート、 CPG、ポリスチレンビーズなど は好ましい。 DNAチップの基材として使用される通常の材料は、好適に使用可能で ある。
[0038] 光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの、あらかじめ基材に固定化された 一方の核酸類は、基材上に直接に結合して固定ィ匕されていてもよいが、良好なハイ プリッド形成のためには、リンカ一部分を介して基材上に固定化されていることが好ま しい。リンカ一部分としては、核酸類の化学反応に不活性で、 5個以上、好ましくは 1 0個以上の原子を有する、好ましくは直鎖状の分子種であればよい。リンカ一部分と しては、 DNA、 RNA、 PNAなどの核酸や、ポリエチレングリコール、アルカン類など が好ましい。特にポリエチレングリコールが好ましぐへキサ（エチレングリコール）を好 適に使用できる。基材に固定化された核酸類を製造する方法としては、核酸類の末 端のリン酸基をリンカ一部分に結合させて製造することができる。リンカ一部分と核酸 類を結合させて、次いで基材に結合してもよいし、逆に先に基材とリンカ一部分を結 合させて、次いでリンカ一部分と核酸類とを結合させてもよい。核酸類と結合する位 置は、通常は末端のリン酸基を用いるのが好ましいが、これに限定させるものではな い。例えば、核酸類の途中の塩基部分の官能基と結合させてもよい。
[0039] 光連結性核酸類と被光連結性核酸類とは、光連結されることによって、特定の塩 基配列を有する標的核酸類の塩基配列と相補的な塩基配列の核酸類を生成するよ うに作製される。そして、光連結性核酸類と被光連結性核酸類は、標的核酸類を铸 型としてノ、イブリツド形成することによって、光連結可能に隣接して配置される。 [0040] このハイブリッド形成は、通常の温度、 pH、塩濃度、緩衝液等の条件下で行うこと ができるが、ハイブリッド形成と光連結の条件を高い自由度で選択可能とすることによ り、より高い特異性、感度 (SZN比）による検出を可能としていることは、本発明によ る利点である。この条件としては例えば、温度、溶媒 (溶質）、塩などの種類及び濃度 を挙げることができる。
[0041] ノ、イブリツド形成の条件として、本発明では、温度は、ハイブリッド形成可能な温度 であれば使用することができる力 極めて迅速にハイブリッド形成と光連結の工程を 行うためには、 20〜30°Cの温度で、特に室温で行われることが好ましいことを見いだ した。
[0042] また、ハイブリッド形成は、緩衝作用のある塩を含む反応溶液の中で行われることが 好ましい。反応溶液の ρΗが 6. 5〜8. 5の範囲、特に ρΗ6. 7〜7. 7の範囲にあるこ とが好ましい。緩衝作用のある塩の濃度が 5〜250mMの範囲にあることが好ましぐ 特に 10〜： LOOmMの範囲に有ることが好ましい。緩衝作用のある塩としては、カコジ ル酸塩、リン酸塩、トリス塩をあげることができるが、本発明においては、特に、蛍光強 度の強度増大の観点から、緩衝作用のある塩が、力コジル酸塩であることが好ましい 。上記条件の力コジル酸塩の使用によって、 PBS緩衝液などと比較して、蛍光強度 を 10倍程度にまで高めることができることを見いだしている。また、反応溶液が、水分 散性有機溶媒を含むことが好ましぐ特に反応の迅速性の観点から、 20〜60% (体 積比）の水分散性有機溶媒を含んでいることが好ましいことがわ力つた。特に、この水 分散性有機溶媒は、ァセトニトリルであることが好ましい。また、反応溶液が、アルカリ 金属及び Z又はアルカリ土類金属の塩を含むことが好ましぐ高い SZN比の達成の ためには、該塩の濃度は標的核酸類の濃度に対して、それぞれ最適値があることを 本発明では見いだした。すなわち、これらは条件検討により、この 2条件に対して最 適化されて 、ることが好まし 、。アルカリ金属及び Z又はアルカリ土類金属の塩とし て、例えば塩ィ匕ナトリウム及び Z又は塩ィ匕マグネシウムを含むことが好まし 、。
[0043] 光連結性核酸類と被光連結性核酸類との光連結は、光照射による光化学反応によ り行われる。照射する光としては、反応に必要なエネルギーを有する波長を含むもの であればよいが、紫外線が好ましい。波長としては、 330nm以上、好ましくは 350nm 以上、より好ましくは 360nm以上の波長を含むものが好ましい。特に好ましい波長と しては、 366nmが挙げられる。
[0044] なお、この光連結は、その原理にお!、て可逆性を有する。従って、比較的短波長 側の光を照射して、開裂させることが可能である。開裂させるときの波長としては、 32 Onm以下、好ましくは 3 lOnm以下の波長が好ましい。開裂に特に好ましい波長とし ては、 302nmが挙げられる。図 1には示さないが、光連結した核酸類を開裂するェ 程をさらに行った後に、基材上力 遊離した溶液中の標識部分を検出をすることも可 能である。このような工程をさらに行えば、本発明の高い特異性と感度とを生力しつ つ、多様な検出方法を使用することができる。本発明者らは、この光連結の原理に関 して、すでに出願を行っており、特願 2000— 67519、特願 2000— 256068、特願 2 000— 382283、特願 2001— 750に記載の内容は、本願に取り込んで使用すること ができる。
[0045] 光連結によって標識部分が基材上に固定ィ匕された後には、ハイブリッド形成による 相補的二重鎖の解離するような洗浄条件で、洗浄を行う。基材上に固定化された標 識部分力 途中の共有結合の破壊によって遊離してしまわないような条件であれば、 相補的二重鎖の解離作用がどのように強 、条件でも使用することができる。不完全 な相補性のために光連結しな 、ままに、不完全なハイブリッド形成によって弱く基材 上に結合しているような標識部分を、完全に除去するためには、洗浄条件は、相補 的二重鎖の解離作用が強 、ものであったほうがよ 、。
[0046] 好適な洗浄条件としては、例えば、温度は、 80〜100°C、好ましくは 90〜100°C、 特に好ましくは 95〜100°Cの範囲の温度を使用することができる。温度は、共有結 合を分解しな 、ならば、沸点の値力も達成可能な範囲で高 、ものであるほうがよ 、。 pHは、共有結合を分解しない範囲で特に制限はないが、共有結合の加水分解をも たらしにくいことから中性付近が好ましい。塩の種類及び塩濃度には、操作に不都合 な試料の沈殿が生じない範囲で特に制限はなぐ一般には適当な濃度の塩 (例えば 約 0. 1M NaCl)の存在は、相補的二重鎖の解離を促すために好都合である。また 、相補的二重鎖の解離を促進するために、変性剤として、例えば、尿素を添加するこ とができる。さらに、相補的二重鎖の解離を促進するために、界面活性剤として、例 えば、ドデシル硫酸ナトリウムを添加することができる。その他、相補的二重鎖の解離 に寄与するとして知られる条件を使用することができる。
[0047] 洗浄の後に行われる標識部分の検出は、それぞれの標識の原理に応じた通常の 方法を使用して行うことができる。例えば、 RI標識に対しては、オートラジオグラフィー を行うことができ、あるいは蛍光色素標識に対しては、レーザースキャナでの読み取り が可能である。また、ピオチン標識に対しては、アビジンを有する別な標識を用意し て、アビジン—ピオチン結合により新しい標識を付した後に、その標識の原理に応じ た通常の方法を使用することができる。
[0048] また、光連結を一度だけ使用して標識部分を固定ィ匕する態様について説明をした 力 光連結を複数回使用して標識部分を固定ィ匕する実施の態様 (該態様に使用す る核酸類セット、及びそれによる検出の方法)もまた、本発明の範囲に含まれる。例え ば、標識部分を有する核酸類から、基材に固定化された核酸類までの間に、 1個以 上の核酸類の断片がハイブリッド形成と光連結により連結される態様も本発明によつ て可能である。
本発明の実施を実施例によって以下に詳細に説明する。特に明示的な記載のな い実験操作は、当業者の行う通常の条件下 (例えば、大気圧下、室温）において行 つた o
図面の簡単な説明
[0049] [図 1]本発明の実施の一態様の流れを示した説明図である。
[図 2]RNAを铸型とした核酸の光連結の説明図である。
[図 3]RNAを铸型とした核酸の光連結を示す HPLCチャートである。
[図 4]本発明による RNAの点変異の検出結果である。
[図 5]核酸の光連結の可逆性を示す HPLCチャートである。
[図 6]核酸の光連結の可逆性を示す HPLCチャートである。
[図 7]本発明による RNAの点変異の検出結果である。
[図 8]本発明の別な実施の一態様を示した説明図である。
[図 9]本発明による SNPsの検出の一態様を示した説明図である。
[図 10]本発明の光連結性核酸類の調整の一例を示した説明図である。 [図 11]本発明による SNPsの検出結果である。
[図 12]ァセトニトリルの影響を示す実験結果である。
[図 13]NaCl濃度の影響を示す実験結果である。
圆 14]標的核酸類の濃度に対する最適 NaCl濃度を示す実験結果である。
圆 15]MgCl濃度の影響を示す実験結果である。
2
圆 16]本発明による各種一塩基多型に対する検出結果である。
[図 17]本発明による各種一塩基多型に対する検出の SZN比である。
圆 18]ゥラシル誘導体を使用した可逆的光連結を示す説明図である。
[図 19]塩基部分としてシトシン誘導体を有する DNAの合成経路を例示する説明図で ある。
[図 20]シトシン誘導体を用いて可逆的な光連結が可能であることを示す実験結果で ある。
[図 21]塩基部分としてグァニン誘導体を有する DNAの合成経路を例示する説明図 である。
[図 22]塩基部分としてグァニン誘導体を有する DNAの合成経路を例示する説明図 である。
[図 23]グァニン誘導体を用いて光連結が可能であることを示す実験結果である。
[図 24]グァニン誘導体を用いて光連結した生成物は、光開裂が可能であることを示 す実験結果である。
[図 25]塩基部分としてアデニン誘導体を有する DNAの合成経路を例示する説明図 である。
[図 26]塩基部分としてアデニン誘導体を有する DNAの合成経路を例示する説明図 である。
[図 27]アデニン誘導体を用いて光連結が可能であることを示す実験結果である。
[図 28]アデニン誘導体を用いて光連結が可能であることを示す実験結果である。
[図 29]アデニン誘導体を用いて光連結した生成物は、光開裂が可能であることを示 す実験結果である。
[図 30] 7 カルボキシビニル - 7-デァザ 2 ' デォキシアデノシンの UV吸光特性 を示す実験結果である。
実施例 1
[0050] RNAを標的とした実験を以下のように行った。
[光連結性オリゴヌクレオチドの合成]
5—カルボキシビュル— 2，—デォキシゥリジン (CVU)を含む ODN、 ODN1 (CVU) 5 ， -d (cvUGCGTG)—3，を、 CVUのシァノエチルホスホラミダイトを使用して、通常の DN A合成によって合成した。 ODNl (CVU)を、ヌクレオシド組成および MALDI— T OF— MS (calcd. 1876.3381 for [M- H]- ; found 1876.3477)によって同定した。
[0051] [ODN1 (CVU)による RNA铸型指向型光連結]
ODN1 (CVU)による RNA铸型指向型光連結の実行可能性を次のように確認した。 ODN1 (CVU)および ODN (T) 5，一 d (TGTGCT)— 3，に、 RNA(A) 5，— r(CACGCA AGCACA)-3' の存在下、 366nmで 30分間照射したときに（図 2)、 98%の収率で O DN (CVU-T)のピークが出現することを、 ODN (CVU)および ODN (T)の消失で、 HPLCによって確認した（図 3)。 MALDI—TOF— MSは、 HPLC精製から得られ た単離 ODN (CVU-T)が ODN (CVU)および ODN (T)の光連結生成物であることを 示している （calcd. 3677.51 for [M+H] +; found 3677.82)。 ODN (cvU)および ODN ( T)に、 ODN(A) 5' -d(CACGCAAGCACA)- 3'の存在下、 366nmで 30分間照射した ときに、 74%の収率で ODN (CVU-T)のピークが出現することを HPLCで確認した 。他方で、 RNA铸型を光連結に使用したときに、 3'末端 Cが光励起した evUと反応 して、光連結された ODN (CVU— C)を 3 '末端丁と同じくら 、効率よく生成する。
[0052] [光可逆性の確認]
連結した生成物の光可逆性を確認するために、光連結 ODN (evU— T)に 312nm で照射を行って試験した。単離した ODN (evU— T)に 312nmで 4分間の照射をした ときに、 49%収率での ODNl (CVU)と ODN (T)のピークの出現を、 ODN (CVU— T) の消失とともに HPLCによって確認した。従って、 evUを 5'末端に含む ODNは光可 逆性を有している。
[0053] [RNA点変異の検出]
RNA点変異の検出には、 DNAチップ上に共有結合して配置された ODNの铸型 指向型光連結を利用した（図 1)。 RNA铸型指向型光連結は、 DNAチップ技術に適 したプラットフォームに組み込んで使用可能であることを実証するために、 evuを含む ァミノ標識 ODN、 ODN2(cvU) 5，- d(cvUGCGTG)- SSSS- NH -3，（ただし、 Sはへキサ
2
(エチレングリコール)リンカ一フラグメントに対応する）を、アルデヒド修飾ガラス表面 上に付加することによって、 DNAチップを構築した。
DNAチップ上の ODN2 (CVU)によって RNA铸型指向型光連結の利用可能性を 確認した。 2 μ Μ標的 RNA (Α)とピオチン標識 ODN (T)、 5，一ピオチン一 TGTGC T— 3，をスポットして、 50mM力コジル酸ナトリウム緩衝液（pH7. 0)および lOOmM 塩ィ匕ナトリウム中で、 366nmで 10分間照射した。脱イオン水で 98°C5分間洗浄した 後に、ストレプトアビジン— Cy3コンジュゲートの PBS溶液を表面に加えて、 PBS緩 衝液で二回洗浄した。蛍光シグナルはマイクロアレイスキャナを使用して検出した。 図 4に示したように、完全に相補鎖形成をした場合に、光連結生成物の強い蛍光シ グナルを検出した。配列識別の一般性を確かめるために、種々の位置でミスマッチを 持つ 5つの標的 RNAを構築した。その結果、 RNAの場合に第 9番目の位置でのシ ングルミスマッチ力 ほとんど光連結生成物を生じず、測定された蛍光シグナルは完 全な相補性がある場合と比較して 33分の 1であった (表 1)。次に、第 9番目の位置で の 1個の塩基を変化させた (A、 U、 Gまたは C) 4つの非常に類似した標的 RNAのセ ットを構築した。ほとんどのミスマッチは、正しくマッチした場合と比較して、相対的に 1 0%またはそれより小さい蛍光シグナルを生じた。
以上から、 evUによる RNA铸型指向型光連結を実証した。 5'末端に evUを含む O DNに、铸型 RNAの存在下で、 3'末端にピリミジン塩基を含む ODNとともに光照射 すると、全く副生成物形成が見られずに、効率よく光連結が起こった。さらに、種々の 位置でのミスマッチは、 RNA铸型指向型光連結に基づく DNAチップ分析を使用す ることによって、良好に区別可能である。従って、この系は、 RNA配列の特異的な検 出に広範に使用可能である。
[ODNの光連結の HPLCによる検出]
ODN1 (CVU)および ODN (T) (各 20 μ Μ、鎖濃度 (strand concn) )を含む反応混 合物（全体積 60 μ L)に、 50mMカコジン酸ナトリウム緩衝液 (ρΗ7. 0)および 100m M塩ィ匕ナトリウム中で铸型 RNA (A) (24 /z M、鎖濃度）の存在下で、 0°Cで 30分間、 25Wトランスイルミネーター（366nm)で照射した。照射の後に、光反応の進行を、 C osmosil5C18ARカラム（4. 6 X 150mm, pH7. 0、 30分間で 6%〜10%ァセ卜-卜 リルの直線勾配、流速 0. 5mLZ分、 50mMギ酸アンモ-ゥム溶媒混合物での溶出 )により、 HPLCで検出した。
[0055] [オリゴヌクレオチドの調整]
ODNは、 Applied Biosystems 3400DNA合成装置を使用して、通常のホスホ ラミダイト法によって合成した。結合効率は、トリチルモニターでモニターした。 cvuの シァノエチルホスホラミダイトの結合効率は、 97%収率であった。 CVUのシァノエチル ホスホラミダイトの結合時間は、 999秒であった。これらを、 28%アンモニアで 4時間 6 5°Cで保温することにより脱保護し、逆相 HPLCによって Chemcobond 5— ODS— H カラム (4. 6 X 150mm)で精製した;溶出は、 3〜20%ァセトニトリルを含む 0. 0 5Mギ酸アンモ-ゥムで、直線勾配（30分間）、流速 1. OmLZ分、 30°Cで行った。 オリゴヌクレオチドの精製は、 MALDI— TOF— MS分析によって確認した。
[0056] [光連結生成物の光開裂の HPLCによるモニター]
光連結した ODN (CTU— T) (20 /z M、鎖濃度）を含む 50mMカコジン酸ナトリウム 緩衝液 (PH7. 0)および lOOmM塩化ナトリウムの溶液（全体積 60 L)に、 25°Cで 4分間、 15Wトランスイルミネーター（312nm)で照射した。照射後に、光反応の進行 を、 Cosmosil 5C18ARカラム（4. 6 X 150mm, 50mMギ酸アンモ-ゥム溶媒混 合物による溶出、流速 0. 8mLZ分での 30分間の 6%〜12%ァセトニトリル直線勾 配）での HPLCにより、モニターした（図 5)。 ODNl， (CVU)は、 ODNl (CVU)のシス 異性体であった。
光連結した ODN (cvU) (20 /z M、鎖濃度）を含む 50mMカコジン酸ナトリウム緩衝 液 (pH7. 0)および lOOmM塩ィ匕ナトリウムの溶液 (全体積 60 L)に、 25。Cで 2分 間、 15Wトランスイルミネーター（312nm)で照射した。照射後に、光反応の進行を、 Cosmosil 5C18ARカラム（4. 6 X 150mm、 50mMギ酸アンモ-ゥム溶媒混合物 による溶出、流速 0. 5mLZ分での 30分間の 6%〜11%ァセトニトリル直線勾配）で の HPLCにより、モニターした（図 6)。 [0057] [DNAプローブ固定化]
CVUを含むアミノ標識 ODNプローブを、 lOOmMカコジン酸ナトリウム緩衝液 (pH7 . 0)中で 2 X 105Mの濃度で希釈した。スポッティングを、標準マイクロピペットから 5 Lずつ使用して行った。 evUを含むアミノ標識 ODNプローブを、デシケータ内部で 室温下で 12時間かけて表面へ結合させた。プローブの固定化の後に、ガラス表面を
0. 1.SDSと脱イオン水で洗浄した。この表面を NaBH (3. 75mg)、PBS (l. 5m
4
L)、及びエタノール（375 μ L)の溶液で 5分間、不活性化した。次にこの表面を脱ィ オン水で洗浄して乾燥した。
[0058] [DNAチップ上での RNA铸型指向型光連結]
50mMカコジン酸ナトリウム緩衝液（pH7. 0)と lOOmM塩化ナトリウム中の 2 μ Μ 標的 RNA (A)とピオチン標識 ODN (T)の溶液 (5 μ L)をスポットしたガラスチップに 、 366nmで 10分間照射した。 98°Cの脱イオン水で 5分間洗浄した後に、ストレプトァ ビジン— Cy3 コンジュゲート（20 μ g/mL)の PBS溶液を、表面に添加して、 PBS 緩衝液で二回洗浄した。蛍光測定は、励起波長 532nmのレーザーを備えたマイクロ アレイスキャナ CRBIO lie (日立）を使用して行った。次に、第 6番目の位置で 1塩 基を変えた (A、 U、 Gまたは C) 4つの非常に関連した標的 RNAのセットを構築した（ 表 2)。ほとんどのミスマッチでは、正しくマッチした場合と比較して、相対的蛍光シグ ナルが 8%またはそれよりも低くなつた（図 7)。
実施例 2
[0059] DNAを標的とした実験を以下のように行った。
[プローブ ODNの固定化]
アルデヒド処理されたマイクロアレイスライド (Nunc社製）に対してァミン末端及び光 応答性塩基を有するプローブ ODNを次の手順で固定ィ匕した。
1. 緩衝液（リン酸ナトリウム緩衝液 pH8. 5、0. 01%SDS)にプローブ ODNが 0 . 2 μ μ 1となるよう〖こ調整した。
2. この溶液 10 μ 1を滴下して、室温で 24時間乾燥させて固定した。
3. 固定後、室温で 0. 15%SDSで 2回、超純水で 2回洗浄した。
4. NaBHの PBSZエタノール溶液を滴下した。 5. 超純水で洗浄した。
この手順によって、 1. 5〜1. δ Χ ΙΟ11/^!!2の密度で固定することができた。
[0060] [DNAチップ上での光連結]
DNAチップ上での光連結を図 8に示すような態様となるように行った。 ODN P1 は、へキサエチレングリコール（Hexaethyleneglycol: S)を介して基材に固定化さ れているオリゴヌクレオチドであり、光連結性の塩基部分 (GVU)を有している。 ODN S35は、標識部分として末端にピオチン (Biotin: B)を有するオリゴヌクレオチドであ り、被光連結性の塩基部分（図では C)を有している。図 8では、この ODN P1と OD N S35と力 標的となるオリゴヌクレオチド (Template ODN)を铸型とするハイブリ ッド形成によって、光連結可能な状態に隣接して配置されている。実験は、 ODN S 35 ( 2 ^ M) , template - ODN ( 2 ^ M) , Nacaco . (50mM)、 NaCl(25mM)の条 件で、室温でノヽイブリツド形成をすることにより行った。光連結は、 366nmの波長を 1 0分間照射することにより行った。
上記の铸型 ODNの XX〜XX部分について、 ODN P1に対応する相補的な配列 から、 1塩基置換、 2塩基置換、 3塩基置換をした 33個の配列に対してこのような光連 結を行って標識部分の検出を行ったところ、非常に高 、特異性と感度 (SZN比)で 完全な相補配列を識別できることがわ力つた。
また、このノ、イブリツド形成の温度を、 0°C、 10°C、室温と変えて最適な温度を探索 したところ、室温が最も適していることがわ力 た。
[0061] [DNAチップ上での遺伝子多型（SNPs)検出]
ガン抑制遺伝子 P53の多型部を標的として、 DNAチップ上での遺伝子多型（SNP s)検出を行った。図 9はその説明図である。左側に示すプローブ A、プローブ C、プロ 一ブ0、プローブ Tは、それぞれ一端を基板に固定され、一端に光連結性の塩基部 分 (evU)を有し、光連結性の塩基部分から 3番目の塩基がそれぞれ A、 C、 G、 Tと異 なっている。これらのプローブは、図 10に詳細を示したように調整した。この固定化さ れた各プローブに対して、標的 DNA (target DNA) (ΙΟηΜ)、ビォチン—DNA( Biotin-DNA) (1 μ Μ)を、室温においてァセトニトリルを含む反応溶液中でハイブ リツド形成させて、 366nmの波長で 20分間の照射を行うことにより、光連結を行った 。次にピオチン部分に蛍光アビジンを結合させ、スキャナにより検出を行った。
この結果、極めて高い SZN比で、この一塩基置換を検出することができた。この結 果を図 11に示す。蛍光強度のグラフからわ力るように、プローブ C、プローブ G、プロ ーブ Tに対するプローブ Aの蛍光強度は、 102〜103倍の値となっている。
[0062] [反応溶媒へのァセトニトリルの添加効果の検討]
ノ、イブリツド形成の反応溶媒に対して、ァセトニトリルを添加することの効果を検討し て、図 12に示す結果を得た。時間と蛍光強度のグラフ力もわ力るように、機構の詳細 は不明であるが、ァセトニトリルの添カ卩が多いほど、反応時間を短縮する効果がある。 すなわち、 25〜50% (体積比）のァセトニトリルの添カ卩は、反応時間を 1Z2〜： LZ5 程度に短縮しており、ァセトニトリル 0〜5%では不可能な 20〜30分程度の所要時間 で、十分な蛍光強度での検出を可能としている。
[0063] [NaCl濃度の最適化の検討]
図 13に示すように NaCl濃度の最適化の検討を行った。さらに広範囲で同様に検 討を行い、また標的核酸類 (検出対象 ODN)の濃度も変化させて、この 2条件を組み 合わせた変化に対する最適化の検討を行った。この結果を図 14に示す。これによつ て、ハイブリッド形成での塩濃度には最適な濃度が存在すること、この最適な濃度は 標的核酸類 (検出対象 ODN)の濃度に対応して変化すること、標的核酸類 (検出対 象 ODN)の濃度が大きいほど最適な塩濃度は減少する傾向にあることがわ力つた。 図 14では、標的核酸類 (検出対象 ODN)濃度 ΙΟΟηΜの場合には、最適な塩濃度（ 極大値）は lOOmMを中心とする 80〜150mMの範囲の間に存在し、標的核酸類（ 検出対象 ODN)濃度 ΙΟηΜの場合には、最適な塩濃度 (極大値）は 500mMを中心 とする 400〜700mMの間に存在している。
[0064] [MgCl濃度の最適化の検討]
2
MgCl濃度についても最適化の検討を行った。この結果を図 15に示す。グラフは
2
、標的 ODN濃度 ΙΟΟηΜの実験結果を示している。この場合には 2〜6mMの間に 最適濃度 (極大値)が存在している。また、この MgCl
2濃度についても標的核酸類（ 検出対象 ODN)の濃度変化に対する最適化を行った。
[0065] [最適条件による多型の識別] 最適条件を使用して、全て (4種)の塩基への一塩基多型および欠失に対して、識 別する実験を行った。前述のプローブ A、プローブ C、プローブ G、プローブ T、およ びプローブ χ(—塩基部分の欠失したプローブ)を使用し、さらに前述の標的 ODNに っ 、ても対応する多型を有する相補的塩基配列を使用して、この組み合わせに対し て実験を行った η標的 ODN (Target ODN) (ΙΟΟηΜ)、 NaCl(lOOmM)、 MgCl
2
(5mM)の条件を使用した。この結果を図 16に示す。図 16からわ力るように、あらゆ るタイプの一塩基置換および欠失による多型について、極めて明瞭に多型を識別す ることができた。図 17に、この結果を改めて S/N比として整理した。どの多型につい ても、 102を超える SZN比で多型が明瞭に識別可能であることが示された。
実施例 3
本発明で使用される塩基によって、 DNAの可逆的光連結が可能であることを確認 するために、以下の実験を行った。
図 18は、ゥラシル誘導体を塩基部分として使用することによって可逆的光連結が可 能であること（図 18の上段）を示す説明図である。図 18の上段の左側にあるように、 铸型となる 12塩基長の DNA鎖 (Template)の存在下で、 3'末端にピリミジン塩基を 有する 6塩基長の DNA鎖 (3'Py— DNA)と 5 '末端にゥラシル誘導体 (vinylU)を有す る 6塩基長の DNA鎖 (VU— DNA)とに、 366nmにて光照射することによって光連結 して（右方向への矢印の反応）、図 18の上段の左側にあるように3 Py— DNAの Pyと VU— DNAの VUとが連結した 12塩基長の DNA鎖が生じる。この図 18の上段の右 側にある 12塩基長の DNA鎖に 302nmにて光照射することによって光開裂して (左 方向への矢印の反応）、図 18の上段の左側にあるように 6塩基長の DNA鎖が再び 生じる。このような可逆的光連結は、図 18の下段の左側の構造式の塩基 (ゥラシル誘 導体)を有するにおいて好適に可能である力 これを図 18の下段の右側の構造式の 塩基 (シトシン誘導体)を使用した場合にも好適に可能であることを、以下の実験によ つて確認した。
この実験に塩基部分として使用するシトシン誘導体は公知の方法によって合成可 能である力 以下の実験では、図 19に示す経路によって塩基部分としてシトシン誘 導体を有する DNAを合成して使用した。 図 20に示すように、このようにして得られたシトシン誘導体を用いて、可逆的な光連 結が可能である。
図 20の上段の矢印左側にあるように、铸型となる 12塩基長の DNA鎖 (Template )の存在下で、シトシン誘導体 (vinylC)を 5，末端に有する 6塩基長の DNA鎖 (VC-D NA)と、放射性同位体である32 Pを 5，末端に有しチミン (T)を 3，末端に有する 6塩基 長の DNA鎖（3'T—DNA)とに、 366nmにて 3時間の光照射（UV照射）をすること によって光連結して (右方向への矢印の反応）、図 20の上段の左側にあるように3 'T DNAの Tと VC— DNAの VCとが連結した 12塩基長の DNA鎖が生じた。この図 20 の上段の右側にある 12塩基長の DNA鎖に 302nmにて 1時間の光照射（UV照射） をすることによって光開裂して (左方向への矢印の反応）、図 20の上段の左側にある ように 6塩基長の DNA鎖が再び生じた。
このような結果力 S3'T— DNA、 VC— DNA、及び Templateの存在、及び 366nm、 302nm、及び 366nmの UV照射操作の存在によって生じたことを明確にするために 、それぞれの存在の有無（ +：有及び ：無）の組み合わせを変えて得られた生成物 を各レーンに分けて電気泳動しオートラジオグラフィを行った。図 20の中段にはこの 組み合わせを示し、図 20の下段にはこのようにして得られたオートラジオグラムを示 す。レーン 1及び 2は、比較のための 12塩基長及び 6塩基長の DNAのみをそれぞれ 流したレーンである。図 20の下段のレーン番号 3〜8は、それぞれ図 20の中段の 3 〜8の番号を付された組み合わせに対応して!/、る。レーン 6とレーン 3〜5の対比から 、光連結生成物（12塩基長の DNA鎖： 12mer)が生じるためには、 3'T—DNA、 VC -DNA,及び Templateと 366nmの光照射の 4要素が必要であることが示されてい る。またレーン 6とレーン 7の対比から、いったん生じた光連結生成物（12塩基長の D NA鎖： 12mer)は、 302nmの光照射によって再び 6塩基長の DNA鎖（6mer)に開 裂することが示されて 、る。さらにこのように開裂して生じた 6塩基長の DNA鎖 (6me r)に 366nmの光照射を行えば、再び 12塩基長の DNA鎖（12mer)が生成すること が示されている。
すなわち、塩基部分としてシトシン誘導体を使用して、可逆的な光連結が可能であ ることが示されている。 実施例 4
本発明で使用される塩基によって、 DNAの可逆的光連結が可能であることを確認 するために、さらに以下の実験を行った。
本発明で使用される塩基部分として、ピリミジン塩基誘導体 (すなわち、ゥラシル誘 導体、チミン誘導体、及びシトシン誘導体)を使用した場合には、複素環構造を改変 することなぐ光連結性の塩基部分を得ることができた。より自由な可逆的光連結の 実現のためには、プリン塩基誘導体を使用して、光連結性の塩基部分を得ることが 必要であつたが、これは極めて困難であった。本発明者等は、独自の試行錯誤の結 果、プリン塩基の複素環構造を改変することによって、本発明における塩基部分とし て使用可能な、プリン塩基誘導体 (すなわち、グァニン誘導体、及びアデニン誘導体 )を得ることに成功した。このプリン塩基の複素環構造の改変は、 7—デァザ（7— dea za)を特徴とするものである。
図 21及び図 22に、本発明における塩基部分として使用可能なグァニン誘導体の 構造と、塩基部分としてグァニン誘導体を有する DNAの合成経路を例示する。本発 明はこれらの例示に限定されるものではな 、。本発明における塩基部分として使用 可能なグァニン誘導体を有する DNAは、公知の方法によっても製造することができ る。
図 23には、このようにして得られたグァニン誘導体を 5 '末端に有する 6塩基長の D NA鎖（zveG— DNA: ODN2)と 3'末端に Tを有する 6塩基長の DNA鎖（ODN1) 力 铸型 (template)の存在下で、 366nmで 2時間、好ましくは 5時間の光照射によ つて光連結して 12塩基長の DNA鎖（ODN3)を生成すること力 クロマトグラフィー の結果によって示されて!/ヽる。
図 24には、図 23のようにして得られた 12塩基長の DNA鎖（ODN3)力 312nm で 15分間の光照射によって光開裂して再び 6塩基長の DNA鎖（ODN1及び ODN 2)を生成することが示されて!/ヽる。
すなわち、塩基部分としてグァニン誘導体を使用して、可逆的な光連結が可能であ ることが示されている。
実施例 5 本発明で使用される塩基によって、 DNAの可逆的光連結が可能であることを確認 するために、さらに以下の実験を行った。
本発明者等は、独自の試行錯誤の結果、プリン塩基の複素環構造を改変すること によって、本発明における塩基部分として使用可能な、プリン塩基誘導体 (すなわち 、グァニン誘導体、及びアデニン誘導体)を得ることに成功した。このプリン塩基の複 素環構造の改変は、 7—デァザ（7— deaza)を特徴とするものである。
図 25及び図 26に、本発明における塩基部分として使用可能なアデニン誘導体の 構造と、塩基部分としてアデニン誘導体を有する DNAの合成経路を例示する。本発 明はこれらの例示に限定されるものではな 、。本発明における塩基部分として使用 可能なアデニン誘導体を有する DNAは、公知の方法によっても製造することができ る。
図 27には、このようにして得られたアデニン誘導体を 5'末端に有する 6塩基長の D NA鎖（ZVAA— DNA: ODN4)と 3'末端に Tを有する 6塩基長の DNA鎖（ODN1) 力 铸型（template)の存在下で、 366nmで 5分間、好ましくは 15分間の光照射に よって光連結して 12塩基長の DNA鎖 (ODN5)を生成すること力 クロマトグラフィー の結果によって示されて!/ヽる。
図 28には、このようにして得られたアデニン誘導体を 5'末端に有する 6塩基長の D NA鎖（ZveA— DNA: ODN6)と 3'末端に Tを有する 6塩基長の DNA鎖（ODN1) 力 铸型（template)の存在下で、 366nmで 1分間、好ましくは 5分間の光照射によ つて光連結して 12塩基長の DNA鎖（ODN7)を生成すること力 クロマトグラフィー の結果によって示されて!/ヽる。
図 29には、図 28のようにして得られた 12塩基長の DNA鎖（ODN7)力 312nm で 15分間の光照射によって光開裂して再び 6塩基長の DNA鎖（ODNl及び ODN 6)を生成することが示されて!/ヽる。
すなわち、塩基部分としてアデニン誘導体を使用して、可逆的な光連結が可能で あることが示されている。
図 30には、塩基部分として特に好適なアデニン誘導体を有するデォキシヌクレオ シド (ZVCA)である、 7 -カルボキシビュル— 7—デァザ— 2，—デォキシアデノシンの uv吸光特性を示す。
[図表の説明]
図 1は、 DNAチップ上での RNA点変異の検出の戦略を示して!/、る。
図 2は、 evUによる ODNの RNA铸型指向型可逆的光連結を示している。
図 3は、铸型 RNA (A)の存在下で、照射を受けた ODN1 (CVU)および ODN (T) の HPLC分析を示している。照射前 (a) ; 366nmでの 30分間照射 (b)、収率 98%。 図 4は、マッチした及びシングルミスマッチの標的 RNA上での光連結生成物につ
V、て、マイクロアレイスキャナで得られた蛍光強度（上）とイメージ（下）を示して 、る。 図 5は、照射した ODN (evU— T)の HPLC分析を示している。照射前 (a)； 312η mで 4分間照射 (b)。
図 6は、照射した ODN1 (evU)の HPLC分析を示している。照射前（a)； 312nm で 2分間照射 (b)。
図 7は、 ODN2 (CVU)の光連結生成物に対する蛍光強度（上)及びイメージ（下）を 示している。
図 8は、 DNAチップ上での光連結を示している。
図 9は、 DNAチップ上での遺伝子多型（SNPs)検出を示している。
図 10は、プローブ ODNの調整を示している。
図 11は、高 、SZN比での一塩基置換の検出を示して 、る。
図 12は、反応溶媒へのァセトニトリルの添加効果を示している。
図 13は、 NaCl濃度の最適化を示している。
図 14は、標的核酸類 (検出対象 ODN)の濃度と塩濃度の 2条件を組み合わせた最 適化を示している。
図 15は、 MgCl濃度の最適化を示している。
2
図 16は、 4種の塩基への一塩基多型および欠失に対する識別を示している。 図 17は、 4種の塩基への一塩基多型および欠失に対する識別の SZN比を示して いる。
図 18は、ゥラシル誘導体を使用した可逆的光連結を示す説明図である。
図 19は、塩基部分としてシトシン誘導体を有する DNAの合成経路を例示する説明 図である。
図 20は、シトシン誘導体を用いて可逆的な光連結が可能であることを示す実験結 果である。
図 21は、塩基部分としてグァニン誘導体を有する DNAの合成経路を例示する説 明図である。
図 22は、塩基部分としてグァニン誘導体を有する DNAの合成経路を例示する説 明図である。
図 23は、グァニン誘導体を用いて光連結が可能であることを示す実験結果である。 図 24は、グァニン誘導体を用いて光連結した生成物は、光開裂が可能であること を示す実験結果である。
図 25は、塩基部分としてアデニン誘導体を有する DNAの合成経路を例示する説 明図である。
図 26は、塩基部分としてアデニン誘導体を有する DNAの合成経路を例示する説 明図である。
図 27は、アデニン誘導体を用いて光連結が可能であることを示す実験結果である 図 28は、アデニン誘導体を用いて光連結が可能であることを示す実験結果である 図 29は、アデニン誘導体を用いて光連結した生成物は、光開裂が可能であること を示す実験結果である。
図 30は、 7—力ノレボキシビニノレー 7 デァザ 2，ーデォキシアデノシンの UV吸光 特性を示す実験結果である。
[0070] 表 1は、単一のヌクレオチド位置で異なる 8つの RNA標的に対して正しく塩基対形 成した、 ODN2 (evU)の光連結生成物に正規ィ匕された蛍光強度を示している。 [a] : 下線の付いた文字はミスマッチした塩基を示す。 [b] :各実験は少なくとも 4回ずつ 行った。
[0071] 表 1：点変異させた標的（Target) RNAの蛍光強度（Fluorescence Intensity)の 比較 [表 1]
Target RNAfaI Fluorescence Intensity'"1
RNA(A) 5'-r(CACGCAAGCACA)-3' 1.0 ± 0.02
RNA(7U) 5'-r(CACGCAUGCACA)-3! 0.04 ± 0.009
RNA(8U) 5f-r(CACGCAAUCACA)-3' 0.07 ± 0.03
RNA(9U) 5'-r(CACGCAAGUACA)-3' 0.03 ± 0.01
RNA(10U) 5'-r(CACGCMGCLiCA)-3' 0.05土 0.007
RNA(1 1 U) 5 -r(CACGCAAGCAUA)-3' 0.10 ± 0.03
RNA(9A) 5'-r(CACGCAAGAACA)-3' 0.03 ± 0.02
RNA(9G) 5'-r(CACGCMGGACA)-3' 0.09 ± 0.005
[0072] 表 2は、 ODN2 U)の光連結生成物に対して正規ィ匕された蛍光強度を示してい る。 [a] 下線付きの文字はミスマッチ塩基を示す。 [b] 各実験は少なくとも 4回行つ た。
[0073] 表 2：点変異させた標的（Target) RNAの蛍光強度（Fluorescence Intensity)の 比較
[表 2]
()(丫. NA6U 5rCACGCGCACAA 30.04 ± 0.02.-- ()()£ F?NA6C 5rCACGCAGCACA30.04 ±0.01---_
<())¾NA6G 5rCACGC AGCACA30.08 ± 0.009---- (>() _¾NAA 5 rCACGCMGCACA3.0 ± 05-- g Taret ΡΪΝΑ Intensit^

Claims

請求の範囲
[1] 塩基部分として次の式 I、式 II、式 III、式 IV又は式 V：
式 I
[化 12]
Figure imgf000046_0001
(ただし、式 I〖こおいて、 Zは O又は NHを示し、 X及び Yの少なくとも一方は、カルボキ シル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基及びシァノ基カゝらなる群より選択 された電子吸引性基を示し、 X及び Yの残りの基は水素原子を示す）
式 II
[化 13]
Figure imgf000046_0002
(ただし、式 IIにおいて、 Rは、水素原子であり、
R及び Rの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボ-ル基、低級
2 3
ァルケ-ル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シァノ基及び水素原子か らなる群より選択された基を示し、 R及び Rの残りの基は水素原子又はシァノ基を示
2 3
す）
式 ΠΙ
[化 14]
Figure imgf000047_0001
(ただし、式 mにおいて、 Rは、水素原子又は低級アルキル基であり、
4
R及び Rの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級
5 6
ァルケ-ル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シァノ基及び水素原子か らなる群より選択された基を示し、 R及び 原子又はシァノ基を示
5 Rの残りの基は水素
6
す）
式 IV
[化 15]
Figure imgf000047_0002
(ただし、式 IVにおいて、 Rは、水素原子又は低級アルキル基であり、
R及び Rの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボ-ル基、低級
8 9
ァルケ-ル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シァノ基及び水素原子か らなる群より選択された基を示し、 R及び Rの残りの基は水素原子又はシァノ基を示
8 9
す）
式 V
[化 16]
Figure imgf000047_0003
(ただし、式 Vにおいて、 R は、水素原子又は低級アルキル基であり、
10
R 及び R の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低
11 12
級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シァノ基及び水素原子 力 なる群より選択された基を示し、 R 及び R の残りの基は水素原子又はシァノ基
11 12
を示す）
で表される基を、 5'末端又は 3'末端に有する核酸類 (ただし、核酸類には、核酸、 ペプチド核酸が含まれる）からなる光連結性核酸類と、
光連結性核酸類と光連結可能な塩基部分として炭素 炭素二重結合を有する塩 基を、 3'末端又は 5'末端に有する、被光連結性核酸類と、からなり、
光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの ヽずれか一方が、標識部分を有 し、
光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの標識部分を有さな ヽ一方が、あら 力じめ基材に固定ィ匕されており、
光連結性核酸類と被光連結性核酸類とが、光連結されることによって、特定の塩基 配列を有する標的核酸類の塩基配列と相補的な塩基配列の核酸類を生成可能であ り、
光連結性核酸類と被光連結性核酸類とが光連結されることによって生成可能な核 酸類は、相補的二重鎖の解離する洗浄条件で洗浄可能である、特定の塩基配列の 標的核酸類を検出するための核酸類セット。
[2] 塩基部分が式 Iで表される基であり、式 Iにおいて、 Zが Oで、 Xが水素原子で、 Yが カルボキシル基、低級アルコキシカルボ-ル基、置換アミド基又はシァノ基である、請 求項 1に記載の核酸類セット。
[3] 塩基部分が式 Πで表される基であり、式 IIにおいて、 R及び Rの少なくとも一方が、
2 3
カルボキシル基、低級アルコキシカルボ-ル基、置換アミド基、アミド基、シァノ基及 び水素原子からなる群より選択された基を示し、 R及び Rの残りの基が水素原子で
2 3
ある、請求項 1に記載の核酸類セット。
[4] 塩基部分が式 IIIで表される基であり、式 IIIにおいて、 R及び Rの少なくとも一方が
5 6
、カルボキシル基、低級アルコキシカルボ-ル基、置換アミド基、アミド基、シァノ基及 び水素原子からなる群より選択された基を示し、 R及び Rの残りの基が水素原子で
5 6
ある、請求項 1に記載の核酸類セット。
[5] 塩基部分が式 IVで表される基であり、式 IVにお 、て、 R及び Rの少なくとも一方
8 9
力 カルボキシル基、低級アルコキシカルボ-ル基、置換アミド基、アミド基、シァノ基 及び水素原子からなる群より選択された基を示し、 R及び Rの残りの基が水素原子
8 9
である、請求項 1に記載の核酸類セット。
[6] 塩基部分が式 Vで表される基であり、式 Vにおいて、 R 及び R の少なくとも一方
11 12
力 カルボキシル基、低級アルコキシカルボ-ル基、置換アミド基、アミド基、シァノ基 及び水素原子からなる群より選択された基を示し、 R 及び R の残りの基が水素原
11 12
子である、請求項 1に記載の核酸類セット。
[7] 標識部分の標識として、ピオチン標識、色素標識 (蛍光色素標識を含む)、 RI標識 力 なる群より選択された何れかの標識を有している、請求項 1〜6の何れかに記載 の核酸類セット。
[8] 光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの、あらかじめ基材に固定化された 一方の核酸類が、リンカ一部分を介して基材に固定ィ匕されている、請求項 1〜7の何 れかに記載の核酸類セット。
[9] リンカ一部分力 ポリエチレングリコール又はアルカン類を含む、請求項 8に記載の 核酸類セット。
[10] 基材が、ガラスプレート、 CPG、ポリスチレンビーズからなる群より選択された何れか である、請求項 1〜9の何れかに記載の核酸類セット。
[11] 洗浄条件として、 80〜： LOO°Cの範囲の洗浄温度で洗浄可能である、請求項 1〜： L0 の何れかに記載の核酸類セット。
[12] 洗浄条件として、 95〜： L00°Cの範囲の洗浄温度で洗浄可能である、請求項 1〜： L0 の何れかに記載の核酸類セット。
[13] 洗浄条件として、変性剤を含む洗浄溶液で洗浄可能である、請求項 1〜12の何れ かに記載の核酸類セット。
[14] 洗浄条件として、界面活性剤を含む洗浄溶液で洗浄可能である、請求項 1〜13の 何れかに記載の核酸類セット。 [15] 炭素 炭素二重結合を有する塩基が、シトシン、チミン又はゥラシルである請求項 1
〜 14の何れかに記載の核酸類セット。
[16] 光連結性核酸類が、オリゴヌクレオチドである請求項 1〜15の何れかに記載の核酸 類セット。
[17] 光連結性核酸類が、 DNAである請求項 1〜15の何れかに記載の核酸類セット。
[18] 光連結性核酸類が、 RNAである請求項 1〜15の何れかに記載の核酸類セット。
[19] 光連結性核酸類が、ペプチド核酸である請求項 1〜15の何れかに記載の核酸類 セット。
[20] 被光連結性核酸類が、オリゴヌクレオチドである請求項 1〜19の何れかに記載の核 酸類セット。
[21] 被光連結性核酸類が、 DNAである請求項 1〜19の何れかに記載の核酸類セット。
[22] 被光連結性核酸類が、 RNAである請求項 1〜19の何れかに記載の核酸類セット。
[23] 被光連結性核酸類が、ペプチド核酸である請求項 1〜19の何れかに記載の核酸 類セット。
[24] 光連結性核酸類と被光連結性核酸類が、同じ種類の核酸類である請求項 1〜23 の何れかに記載の核酸類セット。
[25] 請求項 1〜24の何れかに記載の光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの
、標識部分を有さない一方が、あらかじめ基材に固定化されてなり、
光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの、標識部分を有する一方とともに 使用される、 DNAマイクロアレイ (基材上に固定ィ匕される分子として、核酸、及びべ プチド核酸を含む)。
[26] 請求項 1〜25の何れかに記載の光連結性核酸類及び被光連結性核酸類と、核酸 類混合物中に含まれる、特定の塩基配列を有する標的核酸類とを、ハイブリッド形成 させる工程と、
特定の塩基配列を有する標的核酸類を铸型とするハイブリッド形成によって、光連 結可能に隣接された光連結性核酸類と被光連結性核酸類に、光照射して光連結さ せ、標識部分を有する核酸類を基材に固定化する工程と、
光連結により基材に固定化された、標識部分を有する核酸類を、ハイブリッド形成 した相補的二重鎖が解離する洗浄条件で洗浄することによって、光連結により基材 に固定化されなカゝつた、標識部分を有する核酸類を、除去する工程と、
光連結により基材に固定化された、標識部分を有する核酸類を検出するために、 標識部分を検出する工程と、
を含む、核酸類混合物中に含まれる、特定の塩基配列を有する標的核酸類を検出（ 同定及び定量を含む)する方法。
[27] ハイブリッド形成させる工程、及び光連結させて標識部分を有する核酸類を基材に 固定化する工程が、 20〜30°Cの温度で行われる、請求項 26に記載の方法。
[28] ハイブリッド形成させる工程、及び光連結させて標識部分を有する核酸類を基材に 固定化する工程が、緩衝作用のある塩を含む反応溶液の中で行われる、請求項 26 又は請求項 27に記載の方法。
[29] 反応溶液の pHが 6. 5〜8. 5の範囲にある、請求項 28に記載の方法。
[30] 緩衝作用のある塩の濃度力 5〜250mMの範囲にある、請求項 28又は請求項 29 に記載の方法。
[31] 緩衝作用のある塩が、力コジル酸塩である、請求項 28〜30の何れかに記載の方 法。
[32] 反応溶液が、水分散性有機溶媒を含む、請求項 28〜31の何れかに記載の方法。
[33] 反応溶液が、 20〜60% (体積比)の水分散性有機溶媒を含んで!/、る、請求項 32 に記載の方法。
[34] 水分散性有機溶媒が、ァセトニトリルである、請求項 32又は請求項 33に記載の方 法。
[35] 反応溶液が、アルカリ金属及び Z又はアルカリ土類金属の塩を含み、
該塩の濃度が、標的核酸類の濃度に対して最適化されている、請求項 28〜34の 何れかに記載の方法。
[36] アルカリ金属及び Z又はアルカリ土類金属の塩として、塩化ナトリウム及び Z又は 塩ィ匕マグネシウムを含む、請求項 35に記載の方法。
[37] 光照射が、 330nm以上の波長の光の照射により行われる、請求項 26〜36の何れ かに記載の方法。 [38] 洗浄条件が、 80〜100°Cの範囲の洗浄温度での洗浄である、請求項 26〜37に記 載の方法。
[39] 洗浄条件が、 95〜100°Cの範囲の洗浄温度での洗浄である、請求項 26〜37に記 載の方法。
[40] 洗浄条件が、変性剤を含む洗浄溶液での洗浄である、請求項 26〜39の何れかに 記載の方法。
[41] 洗浄条件が、界面活性剤を含む洗浄溶液での洗浄である、請求項 26〜40の何れ かに記載の方法。
[42] 標的核酸類が、オリゴヌクレオチドである請求項 26〜41の何れかに記載の方法。
[43] 標的核酸類が、 DNAである請求項 26〜41の何れかに記載の方法。
[44] 標的核酸類が、 RNAである請求項 26〜41の何れか〖こ記載の方法。
[45] 標的核酸類が、ペプチド核酸である請求項 26〜41の何れかに記載の方法。
[46] 標識部分の標識が蛍光色素標識であり、
標識部分の検出をする工程において、レーザースキャナを使用した蛍光測定を行 う工程が含まれる、請求項 26〜45の何れかに記載の方法。
[47] 標識部分の標識がピオチン標識であり、
標識部分の検出をする工程において、
蛍光色素標識されたアビジンによって、ピオチン アビジン結合反応を行う工程と、 レーザースキャナを使用した蛍光測定を行う工程が含まれる、請求項 26〜46の何 れかに記載の方法。
[48] 特定の塩基配列を有する標的核酸類の塩基配列と相補的な塩基配列から 1塩基 を置換した配列の核酸類が、光連結性核酸類と被光連結性核酸類とが光連結され ることによって生成されるような塩基配列を有する、光連結性核酸類及び被光連結性 核酸類を使用することによって、標的核酸類の塩基配列の点変異を検出する、請求 項 26〜47の何れかに記載の方法。
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