WO2007037560A1 - Ｓｇｋ２遺伝子の治療的又は診断的用途 - Google Patents

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WO2007037560A1
WO2007037560A1 PCT/JP2006/320146 JP2006320146W WO2007037560A1 WO 2007037560 A1 WO2007037560 A1 WO 2007037560A1 JP 2006320146 W JP2006320146 W JP 2006320146W WO 2007037560 A1 WO2007037560 A1 WO 2007037560A1
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protein
antibody
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inhibitor
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Shinichirou Niwa
Yasutaka Makino
Tomoki Ikuta
Kazuya Arai
Takayuki Shindou
Hiromichi Ogura
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Link Genomics, Inc.
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a gene that is amplified to specific W in canna gene, its therapeutic or diagnostic use, and background art
  • non-small cell pulmonary canal GFR epidermal growth factor receptor
  • tyrosine kinase inhibitor generic name: Kehuitinif
  • WO 9 6 Z 3 3 9 8 0 tyrosine kinase inhibitor
  • the present inventors have found that there is a G K2 gene that is frequently amplified or frequently occurs in cancer (especially large intestine).
  • the present inventors have completed that the proliferation of cancer cells can be suppressed by injuring S G K 2 tan-ha in a cervical cane cell line, particularly in a cervical cane cell line. That is, the present invention provides a screening method for a candidate substance having an inhibitory activity described below, and a diagnostic method for diagnosing kinotocan.
  • a substance that inhibits the activity of S GK 2 protein is an active ingredient and a therapeutic agent, including a substance selected from the group consisting of
  • test compound in cells expressing S GK 2 gene (a) Test compound in cells expressing S GK 2 gene (a) contacting S GK 2 protein with test compound
  • a cannula containing the antibody described in (9) above (1 1) A radioisotope, a medicine containing a small molecule, a low molecular weight drug, and a hector carrying a gene .
  • a diagnostic agent comprising the antibody according to (9) above.
  • a diagnostic agent that can be hyfletized under a high hyphenation condition under the S GK 2 gene or a part of the base sequence thereof.
  • S GK 2 gene or a part of its base sequence can be hyfletized under high hyphenation conditions 9) Method described in the above.
  • (2 7) A method of treating the patient with an S GK 2 gene expression inhibitor.
  • An S GK 2 gene expression-inhibiting substance as an active ingredient and a therapeutic agent, containing a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 No. 8 according to the present invention (for example, A novel drug quinoto and method useful for the treatment of large intestine) provides a method for screening candidate compounds.
  • 01 is a histogram showing the frequency of the S GK 2 gene relative to the degree of amplification of the gene of Y. coli.
  • Fig. 02 shows a photograph (phase contrast image) of the results of RNA i analysis when S GK 2 gene was transfected into the colon colorectal cell line RKOE 6.
  • 03 is a graph showing the results of an evaluation of the effect of live cell N A 1 when transfecting the s 1 RNA of the colon cane cell lines C a c o 2 and RKO E 6
  • 04 is an optical micrograph (fluorescence image) of a part (6 cells) of a sample group derived from a colorectal cancer patient analyzed by FISH method.
  • SGK2 is expressed as a serum or Glucocorticoid or is excellent.
  • SGK Webster MK et al (1993) Mo 13 2013-2040) was identified as a gene homologous to T et al (1999) Biochem J 344. 189-197).
  • SGK1 (Serum / glucocorticoid-regulated kinase 1) is a differential RNA finger printing ass gene during time and non-isotonicity. Control of cell volume and response during non-isotonicity. Liver node such as response to substrate stress hormone hormone. (Waldegger S et al (1997) Proc Na 94 4440-4445). SGK1 is Rat2 fibroblast, and the expression level of mRNA is increased 5 to 10 times by serum and G (Webster
  • SGK1 is conserved in the phosphorylation site necessary for protein kinase B (PKB c-Akt) and (54%) PKB activation, and PKB is innoline in the activity of Phosphatidyl inositol (PI) 3-kinase.
  • Phosphoinos 11 ide— dependent protein kinase— 1 (PDK1) is known to be activated (Alessi DR et al (1997 7 261-269 Alessi DR (1997) Curr Biol 7 7
  • SGKl like PKB, is stimulated to cells by insulin-like g 1 (IGF1) serum oxidative stress (Kobayashi T et al (1999) Biochem J 34 Park J et al (1999) EMBO J 18 3024-3033). Like PKB, it was verified whether it was phosphorylated by PDK1 or not (Kobayashi T et al (199 344 189-197). Therefore, P is also present in the noctal transmission system to SGKl. It is believed that.
  • IGF1 insulin-like g 1
  • SGK2 is highly homologous to SGK1 and is high (80%). Similarly, the active site of PKB is conserved and phosphorylated by PDK1. SGK2 is activated in the same way as SGK1 by stimulation with the tres (H 2 0 2 ). Abnormal expression was observed (Kobayashi T et al (1999 344 189-197)).
  • SGK1 function is known to control ion channel and is activated to activate Na + channel in renal epithelial cells (Alvares RD et al (1999) J Biol Chem 274 Bohmer C et al (2000) Cell Physiol Biochem Chen SY et al (1999) Proc Natl Acad Sci 2519 Wagner CA et al (2001) Cell Physiol 209-218) Activation against K + channel (Gamper N Pf lugers Arch 443 625-634 Warntges S et Pflugers Arch 443 617-624) and SGK2 has been reported to be active against the problem (Gampe (2002) Pflugers Arch 445 60-66).
  • the present invention further provides (1) a therapeutic agent for an epilepsy which contains an expression inhibitor of S GK 2 gene and (2) a therapeutic agent for epilepsy which contains S GK 2 protein as an active ingredient.
  • “High string condition” is, for example, the condition of 5 XSSC 5 X Tenhard solution 0 50% formamide 50 ° C. It is possible to effectively obtain a DNA having a high degree of homology to overcome these conditions. However, it is possible that there are multiple factors, such as temperature, flow concentration, flow time, salt concentration, etc., as appropriate. Yes.
  • the Hori Nucleotide that can be used as a hybrid the base sequence of SEQ ID NO: 1 or higher when calculated using Tefol with FAST homology search software 7 5% or more 80% or more 8 5% or more 9 0% or less 9 2% or more 9 3% or more 9 4% or more 9 5% or more 9 7% or more 9 8% or more 9 9% or more
  • inhibitor of gene expression refers to a gene that inhibits any one of a series of events (including transcription (mRNA generation) quality generation) from the gene. Inhibits the production of coated hazelnut.
  • S GK 2 tanker means NC A mutant protein consisting of a non-acid sequence.
  • the number of mutations is generally good.
  • mutant protein is SEQ ID NO: 2 and about 70% or more 75% or more 80% or more 85% or more 9 1% or more 9 2% or more 93% or more 9 4% or more 9 6% 9 7% or more 9 8% or more 9 9% or more having the same nonacid sequence and containing substantially the same quality of the original protein as the homology value generally increases as the above S GK
  • the 2 tanks include S GK 2 tans.
  • S GK is located in the part of 2 protein, and part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 2), and preferably has the same activity as that of the previous protein.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 20 preferably, at least 50, more preferably 0, more preferably at least 1 0 0, most preferably 2 0 0 amino acid residues.
  • the amino acid sequence is composed of a group.
  • these horiheito are
  • the SGK 2 protein used in the present invention can be prepared from the cells and tissues of the protein. They can also be synthesized by these well-known heptito synthesizers, or can be transformed using appropriate host cells selected from prokaryotic organisms. They are derived from S GK 2 protein used in the present invention. Preferably, it is derived from human.
  • Substantially the same quality of activity indicates their activity or quality. Therefore, it should be active (e.g., phosphorylation of natural protein) or equivalent (for example, about 0 0 1 to 100 0 times preferred to 2 0 times more preferably about 0 5 to 2 times) Quantitative requirements such as the degree of active life and the molecular weight of porphyry are also acceptable. These activities are measured by detecting radioisotopes [ 32 P] (Alessi Dre "l (1996) EMBO J 15). Measure according to the Leinck method.
  • the identity of the amino acid sequence and nucleotide sequence is based on the alcoholic B LA ST (proc N at 1 S cl USA 8 7 2 2 6 4-2 2 6 8 1 9 9 0 at 1 A cad S ci USA 9 0 5 8 7 3 Based on BLAST alcoholism N and B LA S TX, a floclam called hul SF eta 1 JM o 1 B iol 0 3 , 1 9 90)) Use BLASTN to resolve the nucleotide sequence. Cancer cell photosis-inducing agent Cancer cell growth inhibitor Cancer agent Anti-cancer agent, etc.
  • cancer and “tumor” in this application have the same meaning.
  • the present invention provides a therapeutic agent containing an S GK2 gene as an active ingredient.
  • S GK 2 gene expression inhibitor is not limited as long as it inhibits the expression of a child. For example, it inhibits transcription from 2 genes to S GK 2 mRNA 1)
  • S GK 2 Includes conversion from mRNA to S GK 2 protein.
  • RNA i refers to the phenomenon that the introduction of a double-stranded RNA that is identical or similar to the target gene sequence into cells inhibits the expression of the introduced foreign endogenous gene.
  • 19- to 30-base long double-stranded RNA A for example, ds RNA (double RNA) sl RNA (sma 1 1 interfer A) or sh RNA (shorthairpin R) It is also possible to reach the area of the 0-2 44 Nature S pe 2 1 4 0 7
  • R N A 1 used for the present invention Double-strand RN having an effect of R N Always 19 to 30 bases, preferably 20 to 27 bases
  • antisense nucleic acid or “antisense NA single »DNA double-stranded RNA — real ⁇ RNA or NA hyphen j
  • Modified nucleic acid materials Sulfur derivatives of nucleic acids Conductor phosphate derivatives Furthermore, the ability to resist degradation of orinucleonucleotidamine is not limited to them.
  • designing an antisense sequence near the 5 'end of the mRNA of the SGK 2 gene results in a sequence complementary to the translational inhibition coat region or the 3' end untranslated region of the gene.
  • Effective expression of the target gene The length of the antisense nucleic acid is at least about 10 bases (about 40), preferably 15 bases or more, more than 100 bases, more preferably about It is necessary to design a antisense nucleic acid having a base length of 500 or less with reference to known literature. Press 1 9 9 3)
  • the agent for treating epilepsy of the present invention can effectively produce a nucleic acid having a rehothyme activity that specifically cleaves SKK2.
  • rehothyme activity refers to site-specific cleavage of mRNA, which is a transcription product of the gene.
  • Some rehosyms have an active domain of 40 nu, which is called a hammer-type or hea-hin type, such as a proof I intron type or an RNA RNA that is RN, which is greater than 400 nucleotito. Tancho Nucleic Acid Fermentation 3 5 p 2 1 9 1).
  • the present invention can use a compound that inhibits the transcriptional activity of S GK 2 gene as an active ingredient. It is linked to a factor involved in the expression and transcription of the S GK 2 gene.
  • the present invention provides a therapeutic agent for a can containing a harmful substance.
  • antibody means the full length of a protein or an antibody.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it binds to S GK protein.
  • Antibody antibodies Further antibody fragments and modified antibodies are also included by genetic recombination.
  • An antibody that binds S GK 2 (anti-S GK 2 antibody) may be a method known to those skilled in the art. Details of anti-S GK 2 antibody
  • S GK 2 protein mutant having the property of Tomifu to S GK 2 protein refers to the endogenous wild type by expressing the gene. Tanhaku, Kunihiro, who has the function of eliminating or reducing the activity of SG. Gene activity inhibition experiment method.
  • the above-mentioned antibody that binds to S GK protein as an active material of S GK protein can be used as a cancer treatment.
  • the present invention also provides a screen for candidate compounds having an anti-cane activity.
  • One preferred embodiment is a method of using S GK protein and test finger. Usually, it has an effect of inhibiting the activity of S GK 2 protein and ligated S GK 2 protein.
  • the compound is preferable for the active site of S GK 2 protein.
  • the S GK 2 protein may be, for example, an intracellular or extracellular form of S GK 2 protein or an affini-bound form in response to a finger to be a test compound.
  • the test compounds used in this method can be used with appropriate knowledge. As knowledge, for example, fluorescent knowledge can be given.
  • the next step is to detect S GK 2 protein and contamination.
  • test compound that inhibits S GK 2 protein and ligation is then selected.
  • the compounds separated by this method have an anti-epileptic effect and are useful as therapeutic agents.
  • Another embodiment of the screening method of the present invention is a method using S GK 2 fingers.
  • a compound that expresses more S GK 2 gene is contacted.
  • the reason for the “cells” used is not limited to their origins, such as whether they are livestock, etc.
  • cells that undergo S GK either an endogenous S GK 2 gene is expressed or an exogenous S GK 2 gene is introduced and the gene is used.
  • the exogenous S GK 2 gene is usually generated by introducing the S GK 2 gene or the inserted expression hector. It can be produced by the gene engineering technology that expresses the expression.
  • test compounds used in this method.
  • Compounds Organic compounds to organic compounds In the case of a protein, etc., it is possible to “contact” by introducing it into a DNA hex expressing the protein.
  • the S GK2 gene is then expressed.
  • gene expression transcriptional and translational bigene expression levels are measured by methods known to those skilled in the art.
  • the Hell can be measured by extracting from the cells expressing the SGK2 gene, and carrying out the Nosan Hi-Yon method or RT_PCR method using this mRNA as a saddle type.
  • S GK 2 is located in the same manner as the conventional method, and whether it is a gene that can be detected in the downstream of the fluorescent gene such as wisdom gene Ferrase GFP galactonease, etc. It is also possible to measure the inheritance by observing the activity of the marker gene.
  • the genetic fraction can be measured by collecting the S GK 2 gene protein fraction and detecting it using an electric peristaltic method such as PAGE.
  • the Western frontoink method can be performed using S GK 2 tanks, and gene translational reherence can be achieved by detecting protein expression. Is there any particular limitation on the antibodies that can be used for detection of S GK 2 protein? For example, use both monoclonal and polyclonal antibodies. In this method, do not contact the test compound.
  • the present invention also provides an anti-SGK2 antibody comprising this antibody.
  • One preferred embodiment of the present invention is used for the above-mentioned cocoonization therapy or cocoonization.
  • anti-S GK 2 antibody is specifically contained in S GK 2 fragment (including partial hepthito) or a salt thereof.
  • the anti-S GK 2 antibody used in the present invention may be an antibody or a monoclonal antibody, and the lath is particularly limited. Antibody having any isotype such as IgGIgMIgAIgE Ig G or IgM which also includes Ig G in consideration of the ease of purification.
  • the term “antibody” used herein is meant to include a fragment or derivative, for example, F 2 C OR humanized antibody multifunctional antibody single antibody (Sc).
  • the antibody of the present invention is produced by a known method. In particular, antibody production methods are well known in the art (for example, preparation of Har 1 L ane DA ntibody C old S arbor Laboratory Pres (1 9 8 (1) antigen)
  • a tanhakaku GK 2 or a salt thereof used as a sensitizing antigen there is a tanhakaku GK 2 or a salt thereof used as a sensitizing antigen.
  • the above S GK 2 part includes a frame, which is limited to a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example 2 0 There may be.
  • the salt of S GK 2 protein used here include inorganic acids (for example, hydrochloric acid or organic acids (for example, acetic acid, quinic acid, fluoric acid), etc.
  • the present invention used as a sensitizing antigen for antibody acquisition The fungus is not limited to the animal species from which it is derived or is preferably an octaoctane derived from mammals, particularly preferably human.
  • the description of the antibody is collectively referred to as a chemical.
  • an antigen to mammals such as Rasaki.
  • the dose of antigen per animal is 0 l to 100 mg when no sputum is used, and l to 100 g when ashes are used.
  • Examples of the hunt include Ashhan ⁇ (F CA) Freund's incomplete euhane aluminum hydroxide hanhunt.
  • Immunization It is performed by inserting into the subcutaneous or intraperitoneal cavity. The interval is not particularly limited. The immunization is performed every several days to several weeks, preferably 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times. 1 to 60 days after the disease, preferably 1 to 14 days after the antibody.
  • Spleen cells or lymph node cells are preferred as antibody-producing cells. Spleen cells or local lymph node cells are preferred. The property of surviving only when fused with antibody-producing cells is preferable. For example, X 6 3 ANSI / 1—Ag 4— 1 NS 0/1, mouse mye YB 2Z0, and myeloma cell line are listed next.
  • Cell fusion is clot-free DMEM R PM I — 1 6 4 0 1 1 0 6 to 1 1 0 7 in cell culture medium 111 1 and 2 X 1 0 ⁇ 2 X 10 6 cell ratio of myeloma cells of Zml to producer cells and myeoma cells 2 1 to 3 1 Perform fusion reaction in the presence of cell fusion promoter.
  • Cell fusion-promoting molecular weight 1 0 0 0-6 0 0 0 Tarton polyethylenic can be used.
  • commercially available cell fusion devices using electrical stimulation (for example, electon) can be used to bind antibody-producing cells. You can also merge them.
  • a normal cell culture method or ascites formation method or the like is used as a method for monochromating from the thus obtained high-freatoma.
  • RPMI-1 6 40 0 medium containing hyphritoma 10 medium Culture medium medium or phlebo culture medium Culture conditions (for example, 3 7 ° C 5% 7 to 14 days) obtaining the antibody from the supernatant.
  • ascitic fluid is taken approximately 1 X 1 0 7 or administered Haifuri Tomah re Thoma mammalian the same species animal-derived myeloma cells to atmospheric and 1 after 2 weeks.
  • the antibody If it is necessary to purify the antibody, the ammonium sulfate salting-out method, ion raffiel filtration, affinity chromatography method can be selected appropriately, or these can be combined.
  • the antibody that reacts with S GK (column adsorbed fraction) is collected on an affinity column fixed with a monoclonal antibody in anti-clot.
  • the reactivity of monoclonal antibodies in anti-clots against S GK 2 can be determined by E L I.
  • F ab or F ab ' 2 fragments can be prepared by digestion using conventional methods such as hefsin or hahain.
  • Humanized antibodies are exemplified by Riec hma nn et al. (R in J o 1 B iol Oct 5 2 0 3 (3)
  • the antibody SGK2 antibody is also produced using a bioluminescent ft compound as well as fluorescein trophomin phycoerythrin and fluore.
  • the presence of bioluminescence protein is measured by the presence of fluorescence.
  • Bioluminescent ferrin / lenferase and aequorin are important for this knowledge purpose.
  • the antibody of the present invention should be used to specifically detect 2 proteins in a sample of body fluids such as Sauori.
  • the anti-SGK 2 antibody used in the present invention may be an agent or an agent that weakens the activity of the antigen itself or in the diagnostic agent.
  • the present invention provides, in another embodiment, a complex of two antibodies and other drugs used for, for example, sexualization therapy or sexualization, and the like.
  • another drug that exhibits a therapeutic effect using the GK 2 antibody or Examples of "radioisotope" in the present invention is iodine - 1 2 5 (1 25 1) Oyohi iodine - eclipsed 1 3 1 Do the emission element or elevation.
  • these radiohalogen elements can be widely used as radiotherapeutic diagnostic agents by knowing about antibodies and hepthito.
  • the 1 25 I or 1 bets of the Tekiru either be an antibody or binding by a known method chloramine-T method.
  • tech-m indium- 1 1 1 and calcium 1 6 7 for 6 7 G treatment, indium 1900 ( 9 0 Y) rhenium 6 R e) or rhenium — 1 8 8 ( 1 88 Re)
  • metal chelating agents such as EDTA D nonotic compound cyclam and DOT A are known to bind to the antibody in advance, and then bind to the antibody after forming a radioactive metal chelate.
  • a cytokine that activates is suitable.
  • the linonyanov toxin it is possible to use the linonyanov toxin to directly kill colonic canal cells.
  • the antibody or antibody fragment is coated on the cDNA. It is.
  • An example of a “small molecule drug” is Nitronoen Cyclophasphamin.
  • Alkylating agent 5 Flul meso trexase Antimetabolic agent Yunomainon Mai Tomainon C Yuno Hinhin Toxorhinone Hinkristine Hinfrastin Hintesin Such as ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Oncology (Japanese Clinical Oncology Study 1 9 9 6) Steroid agent Immunomodulatory agent with gold thiolaminana Immunosuppressant with cyclophosphatamine Chlorfenamiramine maleate Anti-inflammatory agent, such as antihistamine (Inflammation and anti-inflammatory therapy, Shoyaku Shuppan Co., Ltd.) For example, Yuma Yuma can be combined as Kurtar al. Is opened or the like down the antibody between amino Te method water resistance Karuho to couple evening amino group and antibodies of Karuhokinru group Unomain'n of through human
  • viruses hectares include those that have been modified so as to be anti-S G of the present invention.
  • Retrovirus Hector (NRK eta 1 (1 9 9 6) JV ir Or incorporated. Viruses that bind to anti-SGK 2 antibodies are administered to those who need gene therapy together with GK 2 antibodies, and the antigens that recognize GK 2 antibodies (ie, SGK 2) will become available.
  • the anti-S G K2 antibody and the other drug can be chemically or conjugated.
  • chemical bonds are ionic bonds, covalent bonds, bonds by intermolecular forces, and hydrophobic interactions.
  • genetic engineering bonds for example, a fusion protein consisting of a protein is transformed into a gene. The binding mode between the antibody and the therapeutic protein when manufactured with NATO shall be used.
  • K2 agent containing an inhibitor of activity of the K2 protein K2 antibody-containing therapeutic agent or used in the present invention.
  • Antibody or radioisotope Therapeutic protein Therapeutic agents that are chemically linked to either a viral hector or non-viral carrying a low molecular drug gene, or any combination thereof, are based on known techniques.
  • Examples of the dosage form of the therapeutic agent of the present invention include oral powders, pills, powders, granules, abducts, soft cuffs, softeners, helenotos, sublinguals, herbs, etc.
  • Agents Plasters For topical solutions, use the optimal dosage form according to the route of administration and subject of administration. S GK 2 protein activity (and molecular expression) inhibitory substance as an active ingredient is added in an amount of 0 1 to 99 9 wt.
  • Oral administration Generally (as 60 kg) About 10 to: More preferably about 1 LO Omg.
  • the single dose differs depending on the organ symptom administration method. For example, usually the victim (for 6 O kg) About 3 Omg per day, preferably about 0 About 1 to 2 Omg About 0 1 to 1 Omg is administered by intravenous vaginal discharge
  • the type of dosage form Administration method ⁇ Consider the symptoms of the deaf, etc.
  • the drug of the present invention contains SGK 2 protein ft inhibitory substance gene expression inhibitory substance as an active ingredient Metastasis inhibitor Cancer cell aphotone inducer Cell or tissue Organ or type of cancer
  • the agent of the present invention may contain both an inhibitor of SGK protein activity inhibition and a K2 gene expression inhibitor.
  • Antisense nucleic acid using antisense nucleic acid in the therapeutic agent of the present invention is administered alone or after being inserted into a retrovirus hector factor, atenovirus associateno virus vector, or by a known means. Alternatively, it can be formulated with physiological recognition and administered via a gene gun or a hypertrole catheter.
  • the combination of recombinant fatenovirus particles and anti-SGK2 antibody may be used alone for cancer therapy, or generally used together with pharmaceuticals.
  • a carrier it is already preferable to use water, physiological saline, kurcose or hyalphine solution.
  • pharmaceutically commonly used additives Is it preferable to administer kidnap? Disease state may be changed depending on the target cell.
  • the frequency of administration may be from 1 to several times a day, may be from 1 day to several months or more, and 1 to several times of injection is long-term. Multiple cenotes may be administered intermittently throughout. Viral hectares or viruses used in detection of specific cells and Z or tissues can be used.
  • a viral hecta nuclear marker gene is integrated into a suitable host cell, and the viral hecta is used to detect and diagnose tumor cells with anti-S GK 2
  • anti-SGK 2 antibodies can be combined with detectable knowledge and used for tumor cells.
  • the present invention also provides a diagnostic agent.
  • One preferred diagnostic agent of the present invention is (a) S GK 2 tank or (b) S GK 2 gene or a part of its nucleotide sequence. Contains holy nucleo rice cake
  • the antibody against S GK protein can be recognized by S GK protein.
  • the anti-S GK 2 antibody of the present invention can be detected. Detection and z or quantified.
  • subject-derived biological test includes subject-related or body fluid (eg, blood (including whole blood, plasma, serum, etc.), fluid, saliva, sweat, semen, etc.).
  • a “subject” is a human subject who is or is suspected of receiving or desired to receive a human subject. Examples of such cans include large intestine, stomach, and lungs. Gland tract Esophageal tract Liver tract Bile tract spleen cervix uterine tract (eg cervical cervix uterine tract) Testis or knee sac
  • the test for immunity for SGK 2 in the subject's unexplained biological test is a condition that causes body binding in a biological test taken from a subject at risk of having a can (eg, a large intestine) Including determining the amount of immunospecific binding by contacting with an anti-SGK 2 antibody below, and using this binding to detect the presence of SGK 2 protein and the presence of Z in this case increased SGK 2 Tan haku When used as a guide to the disease state Compare the S quality reher in the biological test with that of a healthy person who does not have a cane.
  • Imanoanose enzyme Imanoanose
  • ELISA Estrogen Adsorbent A ssay 1 9 gnostic H orizons 2 1 ⁇ 7 M icogical A ssociates Qu arterllcation Wa lkersvi 1 le MD
  • RIA race
  • FIA immunometric assay method
  • RFIA Time-resolved fluorescence
  • EIA Enzyme immunoassay
  • ECLIA Luminescence immunoassay
  • ELIA Electrochemiluminescence immunoassay
  • the anti-SGK 2 antibody of the present invention may be in vivo.
  • the preparation of antibody preparations that can be used here is well known in the art.
  • antibody-chelating agent c 1 M ed Biol 1 9 9 0 1 7 24 7 An antibody having a neutral ion used for magnetic resonance imaging is described in, for example, Magnetonancein Medicine 1 9 9 1 2 2 4 2.
  • the base of the S GK 2 gene can be used, such as a flow or a flymer.
  • a diagnostic method is, for example: (a) the base sequence of a raw K 2 gene or a fragment thereof unrelated to the subject.
  • Z or the process of quantifying Medium or high stringent conditions may be used.
  • the base sequence of the S GK 2 gene or a fragment thereof that can be hyphenated under the conditions of string free hybridization is also complementary to the base sequence of the GK 2 gene or a fragment thereof.
  • the method of flow hyphenation is known to those skilled in the art, and the publication of publication No. 8 9 Z 0 6 6 9 8 EP—A 0 2 0 0 3 6 2 9 1 5 0 8 2 EP -A 0 0 6 3 8 7 9 EP -AEP -A 0 1 2 8 0 1 8
  • a known target sequence can be detected or quantified by using a Creochloh flow or flymer for the S GK 2 gene.
  • An example of this is Sasan Haifuri Yusei Noyon Nosan Noyon RT—PCR method PCR—SSCP method (Ge pp. 5 74-8 7 9 (1 9 8 9)) P roceofthe National Acad emy ofcesofthe Un ited Stateslca, Vol. 86, pp. 2 7 6-6 pp. 2 7 70 (1 9 8 9) Method DNA chinoff or array C GH (Com araen omic Hybrldizat ⁇ on) method. Quantitative detection is performed by quantitative RT—PCR.
  • Array C GH method is chromosomal C GH method (K allionieta 1 (1 9 9 2) Science 2 5 8 eta 1 (1 9 9 8) N at Genet 2 0, 1).
  • the mRNA of the cell's S GK 2 e.g., a house key Hink gene (e.g.
  • the presence of a fragment or a fragment thereof in a test sample is determined using a mass spectrometer (MS).
  • MS mass spectrometer
  • MS There are various methods such as phase method (EICI) field desorption (FD) method.
  • the ionization method and the ion content with good tt For example, in the case of MALD I, the time-of-flight type (ti me ght T o F) Mass spectrometer In the case of ESI, the quadruple ion tranov type magnetic field type Some mass spectrometers or mass spectrometers can be used in tandem, for example IMS / MSQ-TOF MS MALD I-TO. Other amino acid sequence determination methods may be used, for example, determination of amino acid sequences by one (eg, gas phase sequencer).
  • the present invention also provides a quinoto for quantifying a GK 2 protein or a fragment thereof of a subject containing an anti-S GK 2 antibody as a marker.
  • S GK 2 contains a nucleotide sequence that can be hyphenated under a stringinoen-like high-flyty state in a part of its base sequence. Also provide. It is used to detect by these key immunological techniques or high-definition method. Such as cans, stomachs, lungs, milking, prostate, esophageal, spleen, kidney, bladder, uterus (example) Or something that suggests the presence of the molecule in the tissue.
  • the quinoto of the first embodiment contains a component to be quantified in a body fluid test +4 from a subject (including S G K 2 protein and its edge). For example, when detected and / or quantified by S G K 2 tan S A, it can be used to determine or quantify S G K in such a lobe section or body fluid sample such as blood or urine. It may be labeled with such fluorescent colorimetric or enzyme knowledge, and the note may contain a recognized secondary antibody.
  • the quinoto of the above second embodiment contains the S G K2 gene or a holinonucleotide consisting of a base sequence that can be used under conditions of hyphenation conditions that are stringent.
  • a light quino can have the above holinium immobilized on a DNA chinoff.
  • the quinoto of the present invention may be used as a container in addition to a base sequence that can be stratified in the base sequence of the anti-S G K 2 antibody S G K 2 gene.
  • the lahel on or associated with the container may indicate that it is used to detect drugs or large. Also, for example, an instruction manual may be included.
  • the S GK 2 gene was found to be amplified in 5 75% of 20 0 testers, and the degree of amplification was 6. The maximum value was 27, which was very frequent.
  • Example 2 Verification of gene amplification in large intestine-derived cultured cell lines This example shows high frequency in colonic epilepsy. Kenome DNA was extracted according to the protocol.
  • Table 3 shows the values of the SGK2 gene in the cell lines that have not been colonized. As shown in the figure, it was found that the colon located in the large intestine-derived cell line was amplified in a child located at C C lone RP 1 1-6 9 I 10.
  • Table 4 shows the relative values of the S GK 2 gene for the large intestine cell line compared to the normal DNA. In the intestinal cannid cell line, S GK 2 gene region was found to increase.
  • RNA 1 analysis using colorectal canine cell line This example shows the S GK 2 gene frequently observed in 20 patients with colorectal epilepsy. RNA i analysis was performed using the recognized cell line (C a E 6) and the phenotype was observed ⁇ RNA 1 analysis>
  • siRNA sl RNA of two siRNAs is introduced into Caco 2 cells using 0 igine (I nvltrogen) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ KO E 6 was introduced into cells using Lipofectamine 2 0 0 0 (Invitr, and 1 0 0 n M sl RNA was added to the cell.
  • Controlsharmacon 4 days after introduction into cells Take a differential mirror / step image of the same field of view under a microscope and perform detailed quantitative RT-PCR analysis>
  • the expression level of G A P D H is obtained using G l y c e r e— 3— p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s H) C o n t r o r R e a g e n ts (A p p i i s t e m s).
  • Example 4 For RN A 1 analysis using a normal cell line derived from the large intestine
  • a cell line derived from a normal tissue of the large intestine was used to verify the target gene's inhibitory effect.
  • the cell line used was CCD 18 CO, which was cleared from AT CC.
  • a quantity of 0 7 g of heftito fragments was separated by -Precolumn cartridge (C 5 xm 300A 300 ⁇ idx 5 mm LC PACKINGS 163589) and nano-column (C18 PepMap 3 ⁇ 100 A 75 ⁇ mid PACKINGS 160321).
  • Ulti PACKINGS was used as the HPLC apparatus.
  • the flow rate was 200nL / nnn.
  • 0% 1% oxalic acid Wak-containing 2% acetonitrile (MERCK 1287229) and 0% 1% oxalic acid-containing concentration gradient, or 0 57% / ⁇ linear clone.
  • the isolated test tube was introduced by ion tranof type mass spectrometry directly connected through PicoTip (New Object 10-D-20)
  • the mass spectrometer was HCT Plus (Bruker Dal tonics) + ionization of the Dow was for the Hilarie voltage 1500V and the Entreflare 500V Tricus flow rate 12 L / min Tricus temperature 250 ° C
  • the ion troffoff was set to MS / MS analysis with 2 Da before and after the target m / z. We analyzed the existence of ion hekes with the mass to do. result
  • 05 A and 05 B show (A) serum derived from a person with colorectal erosion and (B) serum derived from a healthy person as analyzed and shown above.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for cans, a diagnostic agent, a diagnostic method, and a treatment method.

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Abstract

本発明は、ＳＧＫ２タンパク質の発現阻害物質または活性阻害物質を含有するがん治療剤；そのような治療剤の有効成分として使用し得る化合物のスクリーニング方法；ＳＧＫ２タンパク質に対する抗体；その抗体などを用いるがん診断剤・がん診断方法などを提供する。

Description

明細書
S G K 2遺伝子の冶療的又は診断的用途 技術分野
本発明は かんにおいて特異 Wに増幅している遺伝子 遺伝子 その治療的又は診断的用途なとに関する 背景技術
悪 腫瘍 （かん） の特徴として 増殖 浸潤 転移を ことによる致死かあけられる。 外科的な切除または放射 局所療法ては 転移性再発かんに対して十分な対処はて てある薬物療法の発展か 今後のかん冶療成績の向上に かん薬物療法の現在の中心てある化学療法は 直接か あよひ Zまたは R N Aに作用し 細胞を死に至らせる殺 る場合か多いか かん細胞以外の 例えは 骨髄細胞 細胞 消化管上皮細胞なと分裂かさかんな正常細胞に対 強い副作用をもたらしていた 一方 近年の分子細胞生 り かん細胞の浸潤 増殖 転移なとにかかわるメカニ そのかん細胞の特定メカニスムに特異的に作用する分子 注目されている。 代表例として 非小細胞肺かんの治療 G F R (上皮成長因子受容体） チロシンキナーセ阻害 サ （一般名 ケフイチニフ） （W O 9 6 Z 3 3 9 8 0 ) んに次いて 3位になっている。 年齢別ては 6 0歳代か一 5 0歳代 7 0歳代の順てある 大腸かんの増加の原因 因 環境的要因なとか考えられるか 食生活の西欧化 の取りすきか原因てはないかと指摘されている。 大腸か 檸的薬の開発か待たれている。 また 診断に用いられて 一 （C E A C A 1 9 — 9 ) は 進行大腸かんてあつて を示すのみて 臓器特異性も組く より高性能な診断薬 ている。 発明の開示
上記のような状況下て かんを治療あよひノまたは診 たな薬剤または方法か求められている。
特に かんに対して特異 ttの高い冶療薬およひノまた られている。
上記のような状况に鑑み 本発明者らは 鋭意研究を ん （特に 大腸かん） において高頻度に増幅か起きてい G K 2遺伝子てあることを見出した。 本発明者らはさら 胞株ならひに子宮頸かん細胞株において S G K 2タンハ 害することによって 癌細胞の増殖を抑制し得ることを を完成するに至った。 すなわち 本発明は 以下に記載 かん抑制作用を有する候補物質のスクリ一ニンク方法 ん診断用キノ ト かんの診断方法なとを提供する。
( 1 ) S G K 2遺伝子の発現阻害物質を有効成分として (c ) S GK 2遺伝子またはその一部に対するテコィ
(d) S GK 2遺伝子またはその一部に対してトミナ に作用する S GK 2遺伝子変異体
(e ) S GK 2遺伝子の転写産物を特異的に切断する を有する核酸
およひ
( f ) S GK 2遺伝子の転写または S GK 2 mRN する化合物 （上記核酸を除く）
からなる群から選択される物質を含む 上記 （ 1 ) に記 (3) S GK 2タンハク質の活性阻害物質を有効成分と ん冶療剤。
(4) 上記 S GK 2タンハク質の活性阻害物質か
(a) 該 S GK 2夕ン八ク質に対する抗体
(b) 該 S GK 2タンハク質に対してトミナント不カ 有する S GK 2タンハク質変異体 およひ
( c ) 該 S GK 2タンハク質に結合する化合物 （上記 体を除く）
からなる群から選択される物質を含む 上記 （ 3) に記 ( 5 ) 上記かんか 大腸かんまたは子宮頸かんてある (4) のいずれかに記載のかん冶療剤。
( 6 ) S GK 2遺伝子の発現阻害物質をスクリーニンク て
(a) S GK 2遺伝子を発現する細胞に 被検化合物 ( a ) S GK 2タンハク質と被検化合物とを接触させ
(b) 該 S GK 2タンハク質と被検化合物との結合活 程 およひ
(c ) 該 S GK 2タンハク質と結合する化合物を選択 する スク リーニンク方法。
(8) 上記かんか 大腸かんまたは子宮頸かんてある は （7 ) に記載の方法。
(9) S GK 2タンハク質に対する抗体。
( 1 0 ) 上記 （9 ) に記載の抗体を含有するかん冶療剤 ( 1 1 ) 放射性同位元素 冶療夕ンハク質 低分子の薬 遺伝子を担持したヘクターをさらに含有する 上記 （ 1 0 ん治療剤。
( 1 2 ) 上記かんか 大腸かんまたは子宮頸かんてある または （ 1 1 ) に記載のかん冶療剤。
( 1 3 ) 上記 （9 ) に記載の抗体を含有するかん診断剤。
( 1 4) S GK 2遺伝子またはその一部の塩基配列にス なハイフリ夕イセーンョ ン条件下てハイフリタイス可能 有するかん診断剤。
( 1 5 ) 上記かんか大腸かんてある 上記 （ 1 3 ) また 載のかん診断剤。
( 1 6 ) 上記 （ 9 ) に記載の抗体を含有するかん診断用
( 1 7 ) S GK 2遺伝子またはその一部の塩基配列にス なハイフリ夕イセーンョ ン条件下てハイフリタイス可能 9 ) に記載の方法。
( 2 1 ) 質量分析装置を用いて S GK 2タンハク質を たは定量する 上記 （ 1 9 ) または （ 2 0 ) に記載の方
( 2 2 ) 抗 S GK 2抗体を用いて S GK 2タンハク質 または定量する 上記 （ 1 9) 〜 （2 1 ) のいずれかに
( 2 3 ) ( a) 被験者由未の生体試 と S GK 2タン 抗体とを接触させる工程 およひ
(b) 上記試 中ての上記抗体と S GK 2タンハク 出およひ Zまたは定量する工程
を包含する 上記 （2 2) に記載の方法。
( 2 4) ( a) 被験者由来の生体試 4と S GK 2遺伝 片の塩基配列にス ト リンノエン 卜なハイフリタイセーンョ ィフリタイス可能な塩基配列からなるホリヌクレオチト 工程 およひ
(b) 上記試 中ての上記ホリヌクレオチトと S G はその断片とのハイフリ夕イセーノョ ンを検出およひ Z 工程
を包含する 上記 （ 1 9) または （ 2 0 ) に記載の方法。
(2 5 ) かんの診断に用いるための上記 （ 1 9 ) 〜 （2 4 に記載の方法。
(2 6 ) 前記かんか 大腸かんてある 上記 （ 2 5 ) に
(2 7 ) S GK 2遺伝子の発現阻害物質を患者に投与す る かん冶療方法。 ( 3 1 ) 配列番号 5 配列番号 6 配列番号 7 または 基配列を有する ホリヌクレオチト。
( 3 2 ) S GK 2遺伝子の発現阻害物質を有効成分とし 冶療剤てあって 配列番号 5 配列番号 6 配列番号 7 号 8の塩基配列を有するホリヌクレオチトを含有する 本発明により かん （例えは 大腸かん） の治療およ に有用な新規な薬剤 キノ トおよひ方法 ならひにかん る候補化合物のスクリ一ニンク方法か提供される。
0面の簡単な説明
01は S GK 2遺伝子の大腸かん崈者由未の 2 0 0 伝子増幅度に対する頻度を示すヒス トクラムてある。
02は 大腸かん細胞株 RKOE 6に S GK 2遺伝 を トランスフエク トした場合の RNA i解析の結果を 写真（位相差像）てある。
03は 大腸かん細胞株 C a c o 2およひ RKO E 6 子の s 1 R NAを トランスフエク トした場合の 生細胞 N A 1 効果を評価した結果を示すクラフてある
04は FISH 法て解析した大腸癌崈者由来の検体組 一部 （ 6細胞分） の光学顕微鏡写真（蛍光像）てある。
05 Aおよひ Bは 質量分析により解析した （A) 大 の血凊およひ （B) 健常者由来の血清についての結果を 08は 07の実験を時系列に従い 顕微鏡下て撮影 詳細に観察した結果を示す光学顕微鏡写真（微分干涉像） 発明を実施するための最良の形態 本発明者らは 大腸かん崈者由来の検体を用いてアレ る増幅遺伝子の検証を行い 大腸かん特異的な遺伝子増 た。 検体において高頻度に増幅か起きている領域のうち ( s e r u m/ g 1 u c o c o r t i c o i d r e g k i n a s e 2 ) 遺伝子か大腸かん崈者由未の検体に あることを見出した
SGK2 は 血清や Glucocorticoid て発現か 秀導される て見出された SGK Webster M K et al (1993) Mo 13 2013-2040 ) と相同 のある遺伝子と して同定され T et al (1999) Biochem J 344 189-197 )。
t
SGK1 (Serum/glucocorticoid-regulated kinase 1) は 時と非等張時の Differential RNA finger printing ass れた遺伝子て 細胞容積の制御や非等張時の応答 基質 化ス トレス ホルモンノクナルに対する応答といった肝 節に関与する （Waldegger S et al (1997) Proc Na 94 4440-4445 )。 SGK1 は Rat2 fibroblast て血清や G により mRNA の発現量か 5〜10 倍に増加する （Webster
(1993) J Biol Chem 268 11482- 11485 ) 0 さらに ン （Richards J S et al (1995) Hormone Res 50 12414-14222)にも発現か誘導される。
さ らに SGK1 は Protein kinase B (PKB c-Akt) と (54%) PKB の活性化に必要なリ ン酸化部位か保存されて PKB は Phosphatidyl inositol (PI) 3-kinase の活性に インノユリ ンに誘導されるクリコーケンゃタンハク質の シスによる細胞死機構への誘導防止といった 細胞内の 伝達を調節している （Alessi D R & Cohen P (1998 Genet Dev 8 55-62 Cohen P (1999) Philos T London B 354 485-495 ) そ の 活 性 化 に お Phosphoinos 11 ide— dependent protein kinase— 1 (PDK1) に されることか知られている （Alessi D R et al (1997 7 261-269 Alessi D R (1997) Curr Biol 7 7
SGKl は PKB 同様に イ ンノュリ ン Insulin-like g 1 (IGF1) 血清 酸化ス 卜 レスにより細胞か刺激を受け す る （Kobayashi T et al (1999) Biochem J 34 Park J et al (1999) EMBO J 18 3024-3033 )。 そ PKB同様に PDK1 により リ ン酸化を受けることか検証さ 酸化されることか示された（Kobayashi T et al (199 344 189-197) よって SGKl へのノクナル伝達系には P も存在していると考えられている。
SGK2 は SGK1 と相同 I生か高く （80%) 同様に PKB の活 ン酸化部位か保存され PDK1 により リ ン酸化を受ける。 トレス （H202)による刺激により SGK2 は SGK1 同様に活 異的に発現か認められた （Kobayashi T et al (1999 344 189-197 )。
SGK1 の機能としてイオンチャン不ルの制御か知られて 活性化によ り 腎臓の上皮細胞の Na+ チャ ン不ルに (Alvares R D et al (1999) J Biol Chem 274 Bohmer C et al (2000) Cell Physiol Biochem Chen S Y et al (1999) Proc Natl Acad Sci 2519 Wagner C A et al (2001) Cell Physiol 209-218) K+チャ ン不ルに対する活性化 （Gamper N Pf lugers Arch 443 625-634 Warntges S et Pflugers Arch 443 617-624)の報告かあり SGK2 にお ン不ルに対する活 化かあると報告されている （Gampe (2002) Pflugers Arch 445 60-66 )。
SGK2 については PKB 同様の GSK3 のリ ン酸化（不活性 の促進と PM1 による活 ft化 API TCF4 NF-kB の転 FKHR のリ ン酸化 CREB リ ン酸化の調節 Calyculin A による活性化について報告かある （W002/24947)。
SGK1 と相同 I生のある遺伝子として SGK2以外に SGK3 る （Kobayashi T et al (1999) Biochem J 344 18 SGK2 とかんとの関連については 肝かん 大腸かん患 昇について報告かある (W002/24947)
SGK1 については HeLa細胞において Taxol と SGK1 のノ 相乗効果によ り ァホトーンスか増加する報告かあり とによってかんの診断を行うことも可能となる。
以下 本発明のかん治療剤 スクリーニンク方法 診 て詳細に説明する。 1 かん抑制作用を有する薬剤
ます 本発明は （ 1 ) S GK 2遺伝子の発現阻害物 して含有するかん治療剤 及ひ （ 2 ) S GK 2タンハク 質を有効成分として含有するかん治療剤を提供する。
本明細書中 「S GK 2遺伝子」 という場合 N C B I テ一夕へースにおいて A c c e s s i o n N o
9 3て登録されている 1 8 6 2塩基からなるヒ ト S GK 2 番号 1 ) を意味する （Kobayashi T et al (1999) Bio 189- 197 )か これに限定されず 例えは 当該遺伝子 いて 1つ以上の塩基の置換 欠失 付加 または挿入な によって変化している変異体のような 当該遺伝子の塩 の相補配列にス トリ ンンェン卜なハイフリ夕イセーノョ フリタイス可能な塩基配列からなるホリヌクレオチトか 本明細書中て使用する 「S GK 2遺伝子」 に含まれるも ハイフリ夕イセーシヨ ンは 公知の方法あるいはそれ 例えは モレキュラー クロ一ニンク （M o l e c u l a l n g T h i r d E d i t i o n J S a m b r a 1 C o l d S p r i n g H a r b o r L a b s 2 0 0 1 ) に記載の方法なとに従って行う ことか は 例えは 5 X S S C 5 Xテンハルト溶液 0 5 0 %ホルムァミ ト 4 2 °Cの条件てある。 「高ス ト リ ン 件」 は 例えば 5 X S S C 5 Xテンハルト溶液 0 5 0 %ホルムァミ ト 5 0°Cの条件てある。 これらの条 度を上けるほと高い相同性を有する DN Aか効本的に得 待てきる。 たたし ハイフリ夕イセーノヨ ンのス トリ ン 響する要素としては温度 フローフ濃度 フローフの長 時間 塩濃度なと複数の要素か考えられ 当業者てあれ 適宜選択することて同様のス ト り ンンェンノーを実現す ある。
ハイフリ夕イス可能なホリヌクレオチトとしては F A S Tなとの相同性検索ソフ トウェアにより テフオル 一を用いて計算したときに 配列番号 1の塩基配列と 以上 7 5 %以上 8 0 %以上 8 5 %以上 9 0 %以 9 2 %以上 9 3 %以上 9 4 %以上 9 5 %以上 9 7 %以上 9 8 %以上 9 9 %以上の同一性を有するホリ をあけることかてきる。
本明細書中 「遺伝子の発現阻害」 とは 遺伝子から まての一連の事象 （例えは 転写 （mRNAの生成） 質の生成） を含む） のうちのいすれかの事象を阻害する の遺伝子によってコー卜されるタンハク質の生成を阻害 するものとする。
本明細書中 「S GK 2タンハク質」 という場合 N C ノ酸配列からなる変異タンハク質をいう。
上記変異タンハク質における アミノ酸の変異部位あ 異夕ンハク質か元のタンハク質と実質的に同質の活性を り特に制限はないか 変異個数は 例えば 1〜 5 0個 1〜3 0個 1〜 2 5個 1〜 2 0個 1〜 1 5個 1 9個 1〜 8個 1〜 7個 1〜 6個 （ 1〜数個） 1 個 1〜 3個 1〜 2個 1個てある。 変異個数は一般 ましい。 また このような変異タンハク質は 配列番^ 2 列と約 7 0 %以上 7 5 %以上 8 0 %以上 8 5 %以 9 1 %以上 9 2 %以上 9 3 %以上 9 4 %以上 9 6 %以上 9 7 %以上 9 8 %以上 9 9 %以上の同一 ノ酸配列を有し かつ元のタンハク質と実質的に同質の ンハク質を含む 上記相同性の数値は一般的に大きい程 上記 S GK 2タンハク質には S GK 2タンハク質の ト」 も含まれる。 S GK 2タンハク質の部分へフチトと 2タンハク質のアミノ酸配列 （配列番号 2) の一部の連 の配列からなる部分へフチ卜てあって 好ましくは 前 ンハク質の活性と同様の活性を有するものてあれはいす レ 例えは 配列番号 2て表されるアミノ酸配列におい 2 0個 好ましくは少なく とも 5 0個 さらに好ましく 0個 より好ましくは少なく とも 1 0 0個 最も好ましく 2 0 0個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する とか挙けられる。 好ましくは これらのホリへフチトは 本発明て用いる S GK 2タンハク質は そのタンハク る細胞や組織から調製することかてきる。 また これら 公知のへフチト合成機によっても合成てきるし 原核生 生物から選択される適当な宿王細胞を用いた袓換え方法 することかてきる 本発明て用いる S GK 2タンハク質 由来のものてもよいか 好ましくはヒ ト由来てある。
「実質的に同質の活性」 とは それらの活性か 質的 とを示す。 したかって 活性 （檸的タンハク質のリ ン酸 化なと） か同等 （例えは 約 0 0 1〜 1 0 0倍 好ま 〜 2 0倍 より好ましくは約 0 5〜 2倍） てあること これらの活 I生の程度や夕ンハク質の分子量なとの量的要 てもよい。 これらの活性の測定は 放射性同位体 [32P] を検出する （Alessi D R e"l (1996) EMBO J 15 なとの文献に記載の公知の方法に準して行うことかてき 後に記載するスク リーニンク方法に従って測定すること なお アミノ酸配列や塩基配列の同一性は カーリ ン ールによるアルコリスム B LA S T (p r o c N a t 1 S c l U S A 8 7 2 2 6 4 - 2 2 6 8 1 9 9 0 a t 1 A c a d S c i U S A 9 0 5 8 7 3 を用いて决定てきる。 B L A S Tのアルコリスムに基つ Nや B LA S TXと呼はれるフロクラムか開発されてい h u l S F e t a 1 J M o 1 B i o l 0 3， 1 9 9 0 ) 。 B L A S T Nを用いて塩基配列を解 癌細胞のァホトーシス誘導剤 癌細胞の増殖抑制剤 癌 剤 かん予防剤等を含む意味て使用される。 なお 本願 「癌 （または かん） 」 と 「腫瘍」 とは同し意味を有す 用される。
1 1 S GK 2遺伝子の発現阻害物質を含有するが 本発明は 1つの実施形態において S GK 2遺伝子 を有効成分として含有するかん治療剤を提供する。
本明細書中 「S GK 2遺伝子の発現阻害物質」 には 子の発現を阻害するものてあれは制限はないか 例えは 2遺伝子から S GK 2 mRNAへの転写を阻害する物 1 ) S GK 2 mRNAから S GK 2タンハク質への翻 質か含まれる。
S GK 2遺伝子から S GK 2 mR N Aへの転写を阻 としては
(a) S GK 2遺伝子またはその一部に対するアンチセ
(b) S GK 2遺伝子またはその一部に対するテコィ核
( c ) S GK 2遺伝子またはその一部に対して トミナン 作用する S GK 2遺伝子変異体 あるいは
(d) その他の転写阻害化合物
なとか含まれる。
また S GK 2 mR N Aから S GK 2タンハク質へ る物質の例としては (h) その他の翻訳阻害化合物
なとか含まれる。
本明細書中 「核酸」 とは RNAまたは DN Aを意味 う 「核酸」 は フリ ンおよひヒリ ミ ノン塩基を含有する 飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含ん こう した修飾物は メチル化されたフリ ンおよひヒリミ されたフリ ンおよひヒリ ミ ノン ァンル化されたフリン ン あるいはその他の複素環を含むものてあって良い。 レオントおよひ修飾されたヌクレオチトはまた 糖部分 て良く 例えば 1個以上の水酸基かハロゲンとか 脂 換されているか あるいはエーテル アミンなとの官能 いてよい。
本発明のかん治療剤にあいては S GK 2遺伝子の発 果により阻害する作用を有する核酸を有効成分として用 る。 RNA i とは 檸的遺伝子配列と同一もしくは類似 る二重鎖 RN Aを細胞内に導入すると 導入した外来遺 内在性遺伝子の発現かいすれも阻害される現象のことを いられる RNAとしては 例えは 1 9〜 3 0塩基長の する二重鎖 RN A 例えは d s RNA (d o u b l e RNA) s l R N A ( s m a 1 1 i n t e r f e r A) 又は s h RNA ( s h o r t h a i r p i n R れる。 このような RNAは リホソームなとの迗達ンス の部位に局所迗達させることも可能てあり また上記二 0 - 2 44 N a t u r e S p e 2 1 4 0 7
9 - 2 0 G e n e s & D e v V o 1 1
Ap r 1 6 94 8 - 9 5 8 P r o c N a t 1
S c l U S A ， 9 9 ( 8 ) ， 1 6 Ap r
2 0 S C l e n c e 2 9 6 ( 5 5 6 7 ) 1
5 5 0一 5 5 3 P r o C N a t 1 A c a d
S A A P r 3 0， 9 9 9 6 04 7 - 6 0 5 2 r e B 1 O t e c h n o 1 o g y Vo l 2 0 y 4 9 7一 5 0 0 N a t u r e B l o t e C h
Figure imgf000017_0001
A c l d s R e s M a y 1 5なと） 。
本発明て用いられる R N A 1 効果を奏する二重鎖 R N 常 1 9〜 3 0塩基 好ましぐは 2 0〜 2 7塩基 より
〜 2 5 最も好ましくは 2 1〜 2 3塩基てある o 本 具体的には 下記 s 1 R N A (実施例 3て使用） を用い
(表 1 )
Figure imgf000017_0002
本明細書中 「アンチセンス核酸」 または 「アンチ N A 一本 » D N A 二本鎖 R N A —本 ^ R N A さ N Aハイフ リ j 卜てあってもよい。 修飾された核酸の具 核酸の硫黄^導体ゃチォホスフエ一 ト誘導体 さらには トアミ トゃオリコヌクレオチトアミ 卜の分解に抵抗性を か挙けられるか それらに限定されるものてはない。
使用されるアンチセンス核酸は 適当なフ口モーター れ 好ましくは 3 ' 側に転写終結ノクナルを含む配列か のようにして調製された核酸は 公知の方法を用いるこ 物へ形質転換てきる。 アンチセンス核酸の配列は 形質 か持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列てあ いか 遺伝子の発現を有効に抑制てきる限りにおいて なくてもよい。
例えは S G K 2遺伝子の m R N Aの 5 ' 端近傍の非 的なアンチセンス配列を設計すれは 遺伝子の翻訳阻害 コート領域もしくは 3 ' 側の非翻訳領域に相補的な配列 かてきる。 遺伝子の翻訳阻害に効果的なアンチセンス核 子の転写産物に対して杓 7 0 %以上 好ましくは約 8 0 ましくは約 9 0 %以上 最も好ましくは約 9 5 %以上の アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的 アンチセンス核酸の長さは少なく とも約 1 0塩基以上 （ 4 0個程度） 好ましくは杓 1 5塩基以上てあり より 0 0塩基以上てあり さ らに好ましくは約 5 0 0塩基以 チセンス核酸は公知の文献を参昭して設計することかて P r e s s 1 9 9 3なと参昭） 。
また 本発明のかん治療剤においては S G K 2遺伝 特異的に切断するリホサイム活性を有する核酸を有効成 ことかてきる。 ここていう 「リホサイム活 」 とは 夕 遺伝子の転写産物てある mRN Aを部位特異的に切断す いう。 リホサイムには クルーフ Iイン トロン型や R N れる M l RNAのように 40 0ヌクレオチト以上の大 るか ハンマーへノ 卜型やへァヒン型と呼はれる 4 0ヌ の活性トメインを有するものもある （タンハク質核酸酵 3 5 p 2 1 9 1 ) 。 ノ、ンマーへノ ト型リホサイムに は F E B S L e t t 1 9 8 8 , 2 2 8 , p 2 2 L e t t 1 9 8 8 2 3 9 p 2 8 5 タンハク質 9 0 3 5 p 2 1 9 1 Nu c l A c i d s R 1 7 p 7 0 5 9なとを参昭することかてきる。 また ホサイムについては 例えは N a t u r e 1 9 8 6 3 4 9 N u c 1 A c i d s R e s 1 9 9 1 1 1 菊池洋， 化学と生物 1 9 9 2 3 0 p 1 1 2 ことかてきる。 このようなリホサイムを用いて本発明に 遺伝子の転写産物を特異的に切断することて 該遺伝子 ることかてきる。
さらに 本発明は S GK 2遺伝子の転写活性を阻害 化合物を有効成分として用いることかてきる。 そのよう えは S GK 2遺伝子の発現 転写に関与する因子に結
Figure imgf000019_0001
害物質を含有するかん治療剤を提供する。
本明細書中 「S GK 2タンハク質の活 I生阻害物質」
(a) S GK 2タンハク質に結合する抗体
(b) S GK 2タンハク質に対してトミナン ト不カテ する S GK 2タンハク質変異体 あるいは
(c ) S GK 2タンハク質に結合する化合物 （上記抗 を除く）
なとか含まれる
本明細書における 「抗体」 とはタンハク質の全長又は 抗体を意味する 本発明の抗体の形態には 特に制限は S GK 2夕ン八ク質に結合する限り 上記ホリ クローナ ローナル抗体のほかに ヒ ト抗体 遺伝子組み換えによ さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。 S GK 2 合する抗体 （抗 S GK 2抗体） は 当業者に公知の方法 ことか可能てある。 なお 抗 S GK 2抗体の詳細につい 本明細書における 「S GK 2タンハク質に対して トミ フの性質を有する S GK 2タンハク質変異体」 とは そ 遺伝子を発現させることによって 内在性の野生型 S G の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンハク 邦博著 遺伝子の活性阻害実験法 多比良和誠編 羊土 2 6— 3 2なと参昭） 。
さらに 本発明においては S GK 2夕ンハク質の活 物質として S GK 2夕ンハク質に結合する 上記抗体 ん治療剤として使用することかてきる。
2 S GK 2タンハク質の活性もしくは発現を阻害する 一二ング方法
本発明は かん抑制作用を有する候補化合物のスクリ も提供する。
一つの好ましい態様は S GK 2夕ンハク質と被検化 指檸とする方法てある。 通常 S GK 2タンハク質と結 S GK 2夕ンハク質の活性を阻害する効果を有すること ここて 該化合物は S GK 2タンハク質の活 部位に 好ましい。 本方法においては まず S GK 2タンハク とを接触させる。 S GK 2タンハク質は 被検化合物と るための指桴に応して 例えば S GK 2タンハク質の 細胞内または細胞外に発現した形態 あるいはァフィ二 結合した形態てあり得る。 この方法に用いる被検化合物 適宜檸識して用いることかてきる。 檸識としては 例え 蛍光檸識等を挙けることかてきる。
本方法にあいては 次いて S GK 2タンハク質と被 合を検出する。
本方法に用いる被検化合物としては 特に制限はない。 化合物 有機化合物 無機化合物 タンハク質 へフチ 合物 並ひに 化合物ライフラリー 遺伝子ライフラリ 細胞抽出物 細胞培養上凊 発酵微生物産生物 海洋生 は 公知の手法によって測定することかてきる （例えは 測定のための方法としては 抗リ ン酸化抗体ゃリ ン酸の
(P32Pや P33なと） を利用した ELISA法 免疫沈降法 ウ ト法ゃそれらの組み合わせなとか挙けられるか これ い。 ） 。
本方法においては 次いて S GK 2タンハク質と結 を阻害する被検化合物を選択する。
本方法により卓離される化合物は かん抑制作用を有 され かん治療剤として有用てある。
本発明のスク リーニンク方法の他の態様は S GK 2 指檸とする方法てある。
本方法においては ます S GK 2遺伝子を発現する 合物を接触させる。 用いられる 「細胞」 の由未としては 不コ ィヌ ウノ ヒソン トリなと へノ ト 家畜等 か挙けられるか これら由来に制限されない。 「S GK する細胞」 としては 内因性の S GK 2遺伝子を発現し たは外因性の S GK 2遺伝子か導入され 該遺伝子か発 を利用することかてきる。 外因性の S GK 2遺伝子か発 通常 それそれ S GK 2遺伝子か挿入された発現ヘクタ 導入することにより作製することかてきる。 該発現へク な遺伝子工学技術によって作製することかてきる。
本方法に用いる被検化合物としては 特に制限はない 化合物 有機化合物 to機化合物 タンハク質 へフ ク質等の場合には 該夕ンハク質を発現する DNAヘク へ導入することにより 「接触」 を行う ことかてきる
本方法においては 次いて 該 S GK 2遺伝子の発現 る。 ここて 「遺伝子の発現」 には 転写およひ翻訳の双 遺伝子の発現レヘルの測定は 当業者に公知の方法によ てきる。 例えは S GK 2遺伝子を発現する細胞から m 従って抽出し この mR N Aを铸型としたノーサンハイ ヨ ン法または R T _ P C R法を実施することによつて該 ヘルの測定を行う ことかてきる。 あるいは S GK 2遺 夕一領域を常法に従って卓離し その下流に檸識遺伝子 フェラ一セ G F P カラク トノ夕ーセ等の発光 蛍光 檸に検出可能な遺伝子か挙けられるか これらに限定さ け その標識遺伝子の活性を見ることによっても該遺伝 の測定を行うことかてきる。 また S GK 2遺伝子を発 タンハク質画分を回収し それそれ S GK 2タンハク質 一 PAGE等の電気冰動法て検出することにより 遺伝 の測定を行うこともてきる。 さらに S GK 2タンハク を用いて ウエスタンフロ ノティ ンク法を実施すること ク質の発現を検出することにより 遺伝子の翻訳レヘル とも可能てある。 S GK 2タンハク質の検出に用いる抗 出可能な抗体てあれは 特に制限はないか 例えはモノク またはホリクローナル抗体の両方を利用することかてき 本方法においては 次いて 被検化合物を接触させな 本発明はまた 抗 S GK 2抗体 この抗体を含有する を提供する。 本発明の 1つの好ましい態様ては 上記か んの桴的化療法または檸的化葉物迗達のために使用され
3 1 抗 S GK 2抗体
本明細書中 「抗 S GK 2抗体」 には S GK 2タン 片 （部分へフチト） もしくはその塩を含む） に特異的に 含まれる。 本発明にあいて使用する抗 S GK 2抗体は 抗体てあってもよいし モノクローナル抗体てあっても ラスは 特に限定されす I g G I g M I gA I g E等のいすれのアイソタイフを有する抗体をも包含す I g Gまたは I gMてあり 精製の容易性等を考慮する くは I g Gてある。 また ここていう 「抗体」 という用 体断片または誘導体を含む意味て用いられ 例えは F 2 C OR ヒ ト化抗体 多機能抗体 単^抗体 （ S c む。 本発明の抗体は 公知の方法て製造することかてき 抗体の製造法は当該分野て周知てある （例えは H a r 1 L a n e D A n t i b o d y C o l d S a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s ( 1 9 8 ( 1 ) 抗原の調製
本発明にあいて 感作抗原として使用されるタンハク GK 2夕ンハク質またはその塩てある。 上記 S GK 2タ その部分へフチトも含まれ これは 限定されることは 配列番号 2のアミノ酸配列の断片てあって 例えは 2 0 あってもよい。 ここて用いられる S GK 2タンハク質ま フチトの塩としては 例えは 無機酸 （例えは 塩酸 あるいは有機酸 （例えは 酢酸 キ酸 フロヒオン酸） いられる。 抗体取得の感作抗原として使用される本発明 ハク質は その由来となる動物種に制限されないか哺乳 ウス ヒ ト由来の夕ン八ク質か好ましく 特にヒ ト由来 好ましい。
( 2) S GK 2タンハク質に対するモノクローナル抗体
( I ) 抗体産生細胞の採取
上記のような S GK 2タンハク質 その部分へフチ卜 明細書中 抗体に関する説明ては これらをまとめて ハク質」 という。 ） を抗原として 哺乳動物 例えはラ ゥサキなとに投与する。 抗原の動物 1匹当たりの投与量 卜を用いないときは 0 l〜 1 0 0mgてあり ァシュ ときは l〜 1 0 0 gてある。 アンュハントとしては ァシュハン 卜 （F CA) フロイント不完全アンュハン 水酸化アルミニウムァノュハン ト等か挙けられる。 免疫 脈内 皮下又は腹腔内等に汪入することにより行われる。 間隔は特に限定されす 数日から数週間間隔 好ましく 隔て 1〜 1 0回 好ましくは 2〜 5回免疫を行う。 そ 疫曰から 1〜 6 0 日後 好ましくは 1〜 1 4日後に抗体 する 抗体産生細胞としては 脾臓細胞 リ ンハ節細胞 か挙けられるか 脾臓細胞又は局所リ ンハ節細胞か好ま ず 抗体産生細胞と融合した状態てのみ生存てきる性質 好ましい。 ミエローマ細胞としては 例えは X 6 3 A N S I / 1— Ag 4— 1 N S 0 / 1なとのマウスミエ YB 2Z0なとのラ ノ トミエローマ細胞株か挙けられ 次に 上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融 融合は 血凊を含まない DMEM R PM I — 1 6 4 0 細胞培養用培地中て 1 1 06〜 1 1 07個 111 1 と 2 X 1 0。〜 2 X 1 06個 Zm l のミエローマ細胞と 産生細胞とミエ口一マ細胞との細胞比 2 1〜 3 1か 胞融合促進剤存在のもとて融合反応を行う。 細胞融合促 均分子量 1 0 0 0〜 6 0 0 0タルトンのホリエチレンク 用するこ とかてきる また 電気刺激 （例えはエレク ト ン） を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細 細胞とを融合させることもてきる。
( i l l ) ハイフリ トーマの選別及ひクローニンク 細胞融合処理後の細胞から目的とするハイフリ トーマ の方法として 細胞懸濁液を例えはゥン胎児血凊含有 R 0培地なとて適当に希釈後 マイクロ夕イタ一フレー ト 個/ we 1 1程度まき 各ゥエルに選択培地を加え 以 地を交換して培養を行う。 その結果 選択培地て培養開 後から生育してく る細胞をハイフリ トーマとして得るこ 次に 増殖してきたハイフリ トーマの培養上凊中に ク質に反応する抗体か存在するか否かをスクリーニンク る
( I V ) モノクローナル抗体の採取
上記のようにして得たハイフリ トーマからモノクロー する方法として 通常の細胞培養法又は腹水形成法等を てきる。 細胞培養法においては ハイフリ トーマを 1 0 含有 R P M I - 1 6 4 0培地 MEM培地又は舰血凊培 培養培地中て 通常の培養条件 （例えば 3 7 °C 5 % 7〜 1 4日間培養し その培養上清から抗体を取得する。 場合は ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の リ トーマを約 1 X 1 0 7個投与し ハイフリ トーマを大 そして 1〜 2週間後に腹水を採取する。 上記抗体の採 抗体の精製か必要とされる場合は 硫安塩析法 イオン ラフィー ケル濾過 ァフィ二ティ一クロマトクラフィ 方法を適宜選択して 又はこれらを祖み合わせることに とかてきる。
( 3 ) S GK 2夕ンハク質に対するホリクローナル抗体 まず 上記した抗原を哺乳動物 例えぱラ ノ ト マウ に投与する 抗原の動物 1匹当たりの投与量は アンュ いときは 0 l〜 1 0 0mgてあり アンュハントを用 〜 1 0 0 0 gてある。 アンュハントとしては フロイ ハント （F CA) フロイント不完全ァノュハント （F I アルミニウムァノュハン ト等か挙けられる。 免疫は 王 皮下又は腹腔内等に/王入することにより行われる。 また の抗体価を示した日に採血し 抗血凊を得る。
次いて 例えは 抗血凊中のホリクローナル抗体を ク質て固定されたァフィ二ティーカラムにかけて S GK 反応する抗体 （カラム吸着画分） を採取する。 S GK 2 する抗血凊中のホリクローナル抗体の反応性は E L I 定することかてきる。
(4) 抗体の断片なと
F a bまたは F a b ' 2断片は 従耒の方法によるフ えは へフシンまたはハハイン） を用いた消化により作 きる。 ヒ ト化抗体は 例えは R i e c hma n nら （R i n J o 1 B i o l O c t 5 2 0 3 (3 )
1 9 8 8 ) およひ J o n e s ら （ J o n e s ら N a t
1 5 2 2 - 5 2 5 , 1 9 8 6 ) に記載のような方法の 1 することかてきる。
また キメラ抗体は 例えは 「実験医学 （臨時増刊
1 6 N o 1 0 1 9 8 8」 特公平 3 _ 7 3 2 8 0 ヒ ト化抗体は 例えは 「 N a t u r e G e n e t i c 1 5 , p 1 4 6 - 1 5 6 1 9 9 7」 「 N a t u r e I C S V o l 7 p 1 3 - 2 1 1 9 9 4」 特 3 6 5号公報 国際出願公開 W〇 9 4 2 5 5 8 5号公 ィエンス 6月号 第 4 0〜第 5 0頁 1 9 9 5年」 V o l 3 6 8 p 8 5 6 - 8 5 9 , 1 9 9 4」 特
2 3 3号公報等を参考にそれそれ製造することかてきる 必要に応して 放射性物質 蛍光化合物なとにより標識 る。 最も慣用の蛍光稃識化合物の中には フルォレセイ 不一 ト ロー夕ミン フィコエリ ト リンおよひフルォレ 同様に 生体発光 ft化合物を用いて 抗体 S G K 2抗体 もてきる。 生体発光 タンハク質の存在は 蛍光の存在 によって測定される。 この檸識目的に重要な生体発光性 フェリ ン /レンフェラーセおよひイエクオリ ンてある。
なお 本発明の抗体は 体液ゃ祖織なとの被検体中に 2タンハク質等を特異的に検出するために使用すること S G K 2夕ンハク質等を精製するために使用する抗体カ 製時の各分画中の S G K 2夕ンハク質等の検出 被検細 G K 2夕ンハク質の挙動の分析なとのために使用するこ
3 2 抗 S G K 2抗体を含有する複合体なと
また 本発明にあいて使用する抗 S G K 2抗体は 本 たは診断剤において それ自体か 抗原の活性を减弱さ 活性を有する薬剤 （ a g e n t ) てあり得るか 必要に 果を奏するための他の薬剤と組み合わせて用いることか つて 本発明は もう一つの態様において かん （例え の檸的化療法または稃的化ィメーノンク等に使用するた 2抗体と他の薬剤との複合体 そのような複合体を含有 をも提供する。 このような態様によれは 本発明におい G K 2抗体を用いて 冶療効果を奏する他の薬剤または 本発明において 「放射性同位元素」 の例としては ヨウ素— 1 2 5 (1 25 1 ) およひヨウ素— 1 3 1なと ン元素か挙けられる。 これらの放射性ハロゲン元素も上 元素と同様に抗体やへフチトに檸識して 放射性治治療 性診断剤として広く利用し得る。 例えは 1 25 Iまたは1 ト化は クロラミン T法等の公知の方法により 抗体ま 結合させることかてきる。 さらに 診断用としてはテク m イ ンノウムー 1 1 1およひカ リ ウム一 6 7 (6 7 G 治療用と してはイ ノ トリ ウム一 9 0 ( 9 0 Y) レニウム 6 R e ) またはレニウム— 1 8 8 (1 88R e ) なとか使 射性同位元素を用いて抗体に檸識する場合には 通常 か用いられる。 金属キレート剤としては EDTA D ノ ンチォ化合物 サイクラム およひ DOT Aなとか知 れらのキレート剤は抗体に予め結合しておき その後放 する場合と 放射 金属キレートを形成後 抗体に結合 法力ゝある。
本発明において 「冶療タンハク質」 の例としては を活性化するサイ トカインか好適てあり 例えは ヒ ト ン 2 ヒ ト顆拉球ーマク口ファーン一コロニ一刺激因子 ァーンコロニー刺激因子 ヒ トインターロイキン 1 2等 また 大腸かん細胞を直接殺傷するため リ ノンゃノフ の毒素を用いることかてきる。 例えは 冶療夕ン八ク質 ついては 抗体または抗体断片をコー卜する c DNAに れる。 「低分子の薬剤」 の例としては ナイ トロノエン サイクロファスフアミ 卜なとのアルキル化剤 5—フル メソ トレキセー 卜なとの代謝拮抗剤 夕ウノマイノン マイ トマイ ノン C 夕ウノルヒノン トキソルヒノンな ヒンク リスチン ヒンフラスチン ヒンテシンのような 卜 夕モキンフェン テキサメ夕ソンなとのホルモン剤 床腫瘍学 （日本臨床腫瘍研究会編 1 9 9 6年 癌と化 またはハイ ト口コーチソン フレトニソンなとのステロ リ ン イントメ夕ノンなとの非ステロイ ト剤 金チォマ ラミンなとの免疫調節剤 サイクロフォスファミ ト ア との免疫抑制剤 マレイン酸クロルフエ二ラミン クレ な抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤 （炎症と抗炎症療法 昭 薬出版株式会社） なとかあけられる。 例えは 夕ウノマ 結合させる方法としては クルタールアルテヒ トを介し ンと抗体のアミノ基間を結合させる方法 水 性カルホ て夕ウノマインンのアミノ基と抗体のカルホキンル基を 等かあけられる
「ウィルスヘクター」 の例としては 本発明の抗 S G し得るように改変されたウィルスへクタ一か使用し得る ノウイルスへクタ一 （Wa n g P e t a 1
S om a t i c C e l l a n d Mo l e c G e 1 4 2 9 - 44 1 ) レ トロウイルスヘクター （N R K e t a 1 ( 1 9 9 6 ) J V i r か組み込まれる。 抗 S G K 2抗体に結合するウィルスヘ G K 2抗体と共に遺伝子治療を必要とする崈者に投与さ G K 2抗体か認識する抗原 （すなわち S G K 2 ) か存 的化することかてきる。
抗 S G K 2抗体と上記他の薬剤とは 化学的または遺 合され得る。 ここて 「化学的な結合」 には イオン結 共有結合 分子間力による結合 疎水性相互作用による れるものとし 「遺伝子工学的な結合」 には 例えは ハク質とからなる融合タンハク質を遺伝子祖換えなとの 製した場合の 抗体と治療タンハク質との間の結合様式 ものとする。
4 製剤化およひ製剤の投与方法
本発明の S G K 2遺伝子の発現阻害物質を含有するか K 2夕ンハク質の活性阻害物質を含有するかん冶療剤 K 2抗体を含有する治療剤 または本発明において使用 抗体か 放射性同位元素 治療タンハク質 低分子の薬 遺伝子を担持したウィルスヘクターもしくは非ウィルス のいずれか またはこれらの任意の組み合わせと化学的 学的に結合されている治療剤は 公知の手法に基ついて かてきる。
本発明の冶療剤の製剤化にあたっては 常法に従い 学的に許容される担体を 加することかてきる 例えは 二ルァセタールノエチルアミノアセテート ホリ ヒニル ラチン 中鎖脂肪酸卜リクリセライ 卜 ホリオキノエチ 油 6 0 白糖 カルホキノメチルセルロース コーンス 類等を挙けることかてきる。
本発明の治療剤の剤型の種類としては 例えば 経口 粉末剤 丸剤 散剤 顆粒剤 細拉剤 軟 硬カフセル ーテイ ンク剤 ヘレノ ト剤 舌下剤 へ一ス ト剤等 非 射剤 坐剤 経皮剤 軟膏剤 硬膏剤 外用液剤等か挙 においては投与経路や投与対象等に応した最適の剤型を る。 有 ¾成分としての S GK 2タンハク質の活性 （また 子の発現） 阻害物質は 製剤中 0 1から 9 9 9重量 かてきる。
本発明の葉剤の有効成分の投与量は 投与対象 対象 与方法なとにより差はあるか 経口投与の場合 一般的 (6 0 k gとして） に対して一日につき約0 l mg〜 l 好ましくは約 1 0〜： L O Omg より好ましくは約 1 てある。 非経口的に投与する場合は その一回投与量は 臓器 症状 投与方法なとによっても異なるか 例えは は通常例えは 害者 （6 O k gに対して） 一日につき 3 Omg程度 好ましく は約 0 1から 2 Omg程度 約 0 1〜 1 Omg程度を静脈汪射により投与するのか しかしなから 最終的には 剤型の種類 投与方法 崈 崈者の症状等を考慮して 医師または獣医師の判断により ん 前立腺かん 食道かん 肝臓かん 胆道かん 脾臓 膀胱かん 子宮かん （例 子宮頸かん 子宮体かん） 腺かん fl萃臓かん 卯巣かん 脳腫瘍 血液腫瘍なと） 好ましくは 大腸かんの予防 冶療に用いられる。
本発明の薬剤は S G K 2タンハク質の活 ft阻害物質 遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有しているた 転移阻害剤 癌細胞のァホトーンス 導剤等として使用 なる細胞 祖織 臓器 または癌の種類は特定のものに また 本発明の薬剤は S G K 2夕ンハク質の活性阻害 K 2遺伝子の発現阻害物質の両方を含んていても良い。
本発明の冶療剤にあいて ァンチセンス核酸を用いる センス核酸を単独あるいはレ トロウィルスヘクター ァ クタ一 ァテノウィルスァソシエーテノ 卜ウィルスヘク なヘクターに挿入した後 公知の手段に従って投与する アンチセンス核酸は 卓独て あるいは生理学的に認め もに製剤化し 遺伝子銃やハイ トロケルカテーテルのよ によって投与することかてきる。
また 本発明において組換えァテノウィルス粒子のよ クタ一と抗 S G K 2抗体との祖み合わせを癌冶療のため は これら単独て使用してもよいか 一般には製薬的に と共に使用される。 そのような担体としては 既に上記 ならひに水 生理食塩水 クルコース ヒ トアルフミン 液か好ましい。 更に 製薬的に通常使用される 加剤 拉子を投与するのか好ましいか 疾病の状態ゃ檸的細胞 よって変更してよい 投与回数は 1 日 1回〜数回てよ 1 日〜数ケ月以上にわたってもよく 1〜数回の投入を 1 長期にわたって断続的に多数セノ トを投与してもよい。 おいて使用されるウィルスヘクター拉子またはウィルス 子は 特定の細胞およひ Zまたは組織の検出 または疾 使用することかてきる。 例えは ウィルスヘクターの核 能なマーカー遺伝子を組込み これを適切な宿主細胞に ショ ンして得られたウィルスへクタ一拉子は 抗 S GK 2 わせて腫瘍細胞を検出診断するために使用することかて 抗 S GK 2抗体に検出可能な檸識を結合させて腫瘍細胞 ために使用することかてきる。
5 かんの診断剤及び診断方法
本発明はまた かんの診断剤を提供する。 1つの好ま て 本発明のかんの診断剤は （a) S GK 2タンハク 又は （b) S GK 2遺伝子またはその一部の塩基配列に トなハイフ リ夕イセーノョン条件下てハイフリ夕イス可 らなるホリヌクレオチ卜を含有する
5 1 抗 S GK 2抗体を用いる診断剤及び診断方法
S GK 2夕ンハク質に対する抗体は S GK 2夕ンハ に認識することかてきるのて 被検液中の S GK 2夕ン ることかてきる 具体的には 本発明の抗 S GK 2抗体 か検出およひ zまたは定量される。
本明細書中 「被験者由来の生体試 」 は 被験者由 または体液 （例えは 血液 （全血 血漿 血清等を含む） 液 唾液 汗 精液等） を含む。 また 「被験者」 は を受ける または受けることか望まれるヒ ト被験体てあ しているか または罹崈していると疑われるヒ ト被験体 このようなかんの例としては 大腸かん 胃かん 肺か 立腺かん 食道かん 肝臓かん 胆道かん 脾臓かん ん 子宮かん （例 子宮頸かん 子宮体かん） 精巣か 膝臓かん 卯巣かん 腫瘍 血液腫瘍なとか含まれる 大腸かんか好ましい。
上記のような被験者由未の生体試^における S G K 2 るための免疫判定は かん （例えは 大腸かん） を有す かんの危険 を有する被験体から採取した生体試 を 体結合を生しさせる条件下て抗 S G K 2抗体と接触させ による免疫特異的結合量を冽定することを包含する こ 結合を使用して S G K 2タンハク質の存在およひ Zま 現か検出される この場合 増大した S G K 2タンハク 疾病状態の指檸となる 必要に応して 生体試 中の S 質のレヘルを かんを有しない健常者のレヘルと比較し 上記免疫測定法の 1つの態様ては 例えは 血凊試 W を 試^中に存在する全部のタンハク質を固定する目的 ロースなとの固相支持体または担体と接触させる。 次い を 酵素 例えは 酵素ィムノアノセィ （E I A) に使 ような酵素に結合させる [Vo 1 1 e r A による 「 疫吸着ァノセィ」 （ T h e E n z yme L i n k n o s o r b e n t A s s a y) (E L I S A) 1 9 g n o s t i c H o r i z o n s 2 1〜 7 M i c o g i c a l A s s o c i a t e s Qu a r t e r l l c a t i o n Wa l k e r s v i 1 l e MD
A による J C l i n P a t h o l 3 1 5 0 7 9 7 8 B u t l e r J E による Me t h E n z 7 3 4 8 2〜 5 2 3 1 9 8 1 ] 。 抗体に結合する酵 光光度^定により 可視手段による蛍光冽定により検出 る化学分子か生成されるような方法て 適当な基質 好 性基質と反応させる。 抗体に検出可能な檸識を付けるた とかてきる酵素は ヘルォキノ夕ーセおよひアルカリ 性 を包含するか これらに限定されない。 この検出はまた 色素原性基質を用いる比色法により達成することかてき その他 本発明において使用し得る方法としては ラ セィ （R I A) サントイ ノチ免疫測定法 ィムノメ トリ ロメ ト リー 蛍光免疫測定法 （F I A) 時間分解蛍光 R F I A) 酵素免疫測定法 （E I A) 発光免疫測定 電気化学発光免疫測定法 （E C L I A) ラテノクス凝 ァノセィ 沈降素反応法 ケル拡散沈降素反応法 免疫 集素検定法 補体結合検定法 免疫放射分析検定法 蛍 連する各種疾患の診断をすることかてきる。 例えは S 質の濃度増加か検出された場合は 例えは S GK 2夕 発現に起因する疾崈 （例えは かん （例 大腸かん） ） 高いまたは捋耒罹崈する可能性か高いと診断することか なお 本発明の抗 S GK 2抗体は i n v i v oて こともてきる。 ここて使用し得る抗体調製物の調製およ 該分野てよく知られている。 例えは 抗体—キレート剤 c 1 M e d B i o l 1 9 9 0 1 7 24 7 載されている。 また 磁気共鳴ィメーンンクて用いる檸 性イオンを有する抗体については 例えば M a g n e t o n a n c e i n M e d i c i n e 1 9 9 1 2 2 4 2に記載されている。
5 2 ホリヌクレオチト （例えば DNA) プロー 断剤及ひ診断方法
本発明の診断方法においては S GK 2遺伝子の塩基 設計されるフローフ又はフライマーを用いることかてき そのような診断方法は 例えは （ a) 被験者由未の生 K 2遺伝子またはその断片の塩基配列にス トリ ンンェント イセーショ ン条件下てハイフリ夕イス可能な塩基配列から レオチト （フローフ） とを接触させる工程 およひ （b) の前記ホリヌクレオチトと S GK 2遺伝子またはその リタイセーンョ ンを検出およひ Zまたは定量する工程を 中又は高ス ト リ ンンェン 卜な条件を使用し得る。 なお
「S GK 2遺伝子またはその断片の塩基配列にス ト リン フリ夕イセーノヨ ン条件下てハイフ リ夕イス可能な塩基 GK 2遺伝子またはその断片の塩基配列に相補的な塩基 ンスホリヌクレオチ卜） も含まれるものとする。 フロー ハイフリ夕イセーンョ ンの方法は当業者に知られており 開公報第 8 9 Z 0 6 6 9 8号 E P— A 0 2 0 0 3 6 2 9 1 5 0 8 2号 E P - A 0 0 6 3 8 7 9 E P -A E P -A 0 1 2 8 0 1 8に記載されている。
本発明の診断方法においては S GK 2遺伝子に対す クレオチ卜フローフまたはフライマーを用いて 公知の 的配列を検出または定量することかてきる。 そのような て 例えは ササンハイフリ夕イセーノヨン ノーサン ーノヨ ン RT— P C R法 P C R— S S C P法 （G e 第 5卷 8 74〜 8 7 9頁 （ 1 9 8 9年） ） P r o c e o f t h e N a t i o n a l A c a d emy o f c e s o f t h e Un i t e d S t a t e s l c a 第 8 6巻， 2 7 6 6〜 2 7 7 0頁 （ 1 9 8 9年） 法 DNAチノフあるいはアレイ C GH (C omp a r a e n om i c H y b r l d i z a t ι o n ) 法なとを きる。 定量的な検出は 定量 R T— P C Rによって実施 アレイ C GH法は 染色体 C GH法 （K a l l i o n i e t a 1 ( 1 9 9 2 ) S c i e n c e 2 5 8 e t a 1 ( 1 9 9 8 ) N a t G e n e t 2 0， 1 ) 。
なお 本発明においては S GK 2遺伝子の発現か上 否かを検出するために 細胞の S GK 2の mR N Aレヘ (ハウスキーヒンク遺伝子 （例えは S h a p e r，
M amm a r y G l a n d B i o l N e o p l ( 1 9 9 8 ) 3 1 5 - 3 2 4 Wu Y Y およひ L A c t a D e r m V e n e r e o l 8 2— 3 ) の mRNAレヘルと 好ましくは R T— P C R ることもてきる。
上記のような手法によって檸的配列 （D NA mR 出 定量し S GK 2遺伝子の発現過多か確認された場 S GK 2の過剰発現に起因する疾砉 （例えは かん （例 てある可能性か高い あるいは^未罹砉する可能性か高 とかてきる。
5 3 質量分析装置を用いる診断方法
本発明の診断方法の別の実施形態ては 被検試料中の またはその断片の存在を 質量分析装置 （M S ) を用い かてきる。 すなわち 質量分析装置を用いることによっ ク質またはその断片のアミノ酸配列の決定を行うことか 来の生体試 W "中に S GK 2夕ンハク質か存在するか否か かてきる。 質量分析法は M Sを用いてタンハク質やへ 相法 （E I C I ) 電界脱離 （FD) 法なと種々の方 る。 イオン分離には イオン化法と相 ttのよいイオン分 例えは MALD Iの場合には 飛行時間型 （ t i me g h t T〇F) 質量分析計 E S Iの場合には 四重 イオン トラ ノフ型 磁場型なとの質量分析計かそれそれ 量分析装置は タンテムて用いられることもある 例え I M S /M S Q - T O F MS MALD I - TO けられる。 なお その他のアミノ酸配列决定法 例えは 一 （例 気相ノークェンサ一） によるアミノ酸配列决定 もよい。
5 4 診断用キノ ト
本発明はまた 抗 S GK 2抗体を含有する 被験者の GK 2夕ンハク質またはその断片をかんマーカーとして たは定量するためのキノ トを提供する。 さらに S GK 2 その一部の塩基配列にス トリンノエン卜なハイフリタイ 下てハイフリタイス可能な塩基配列を含有する 被験者 中の S GK 2遺伝子またはその断片をかんマ一カーとし または定量するためのキノ トをも提供する。 これらのキ 免疫学的手法またはハイフリ夕イセーンョン法等により を検出するために用いられる。 このようなかんとしては かん 胃かん 肺かん 乳かん 前立腺かん 食道かん 道かん 脾臓かん 腎かん 膀胱かん 子宮かん （例 もしくは組織中にあける当該分子の存在かかんの存在を 唆するものをいう。
上記第一の態様のキノ トは 被験者からの体液試 +4中 ( S G K 2 タンハク質およひその部分へフチ卜を含む） または定量する成分を含有する。 例えは S G K 2タン S Aて検出およひ/または定量される場合 このような 祖織切片 または血液や尿のような体液試料中の S G K 出おょひノまたは定量するために使用され得る。 このよ 能 蛍光 比色 または酵素檸識て標識されていてもよ ノ トは 檸識された二次抗体を含有していてもよい。
上記第二の態様のキノ トは S G K 2遺伝子またはそ 列にス トリ ンノエン 卜なハイフリ夕イセーンョ ン条件下 ス可能な塩基配列からなるホリヌクレオチトを含有する。 明のキノ トは D N Aチノフ上に固定された上記ホリヌ 有し得る。
本発明のキノ トは 抗 S G K 2抗体 S G K 2遺伝子 の塩基配列にス トリ ンノエン卜なハイフリ夕イセ一ノョ フリタイス可能な塩基配列等の他に 容器おょひラヘル よい。 容器上のまたは容器に伴うラヘルには 薬剤か大 の検出に使用されることか示されていてもよい。 また 例えは 使用説明書等かさらに含まれていてもよい
以下 本発明を実施例を用いてより具体的に説明する 囲は これらの実施例によって限定されない。 その結果 大腸かん検体において高頻度に増幅か起き 公共 D Bての遺伝子情報 （N C B I h t t p //w n 1 m n i h g o vZ) を利用し 精査した結果 C l o n e R P 1 1 — 6 9 I 1 0に位置している S um g l u c o c o r t i c o i a r e g u l a t s e 2 ) (N C B I A c c e s s i o n N o 9 3 ) 遺伝子か大腸かん崈者において高頻度て高値てあ た （01 表 2 ) 。 01は S GK 2遺伝子の大腸かん ての増幅度に対する頻度を示すヒス トクラムてある。 ま は S GK 2遺伝子の大腸かん害者 2 0 0検体ての増幅 およひ頻度を示す。 平均値は G R値か 1 2以上の を示している。
表 2に示されるように S GK 2遺伝子は 2 0 0検 者の 5 7 5 %にあいて増幅か認められ その増幅度の 6てあつた。 最大値は 2 7てあり 非常に高頻度て顕 つていた。
(表 2 )
Figure imgf000043_0001
実施例 2 大腸由来培養細胞株ての遺伝子増幅度の検証 本実施例ては 大腸かん崈者において高頻度て高値な トコ一ルに従い ケノム DNAを抽出した。
<アレイ C GH>
遺伝子領域の増幅を確認するために アレイ C GHを の詳細は実施例 1 と同様に実施した。 結果
表 3に S GK 2遺伝子の大腸かん由未の細胞株ての 値） を示した。 示されるように 大腸かん由来細胞株に C C l o n e R P 1 1— 6 9 I 1 0に位置している 子て増幅か起きていることを見出した。
(表 3 )
Figure imgf000044_0001
ぐ定量的 P C R>
S GK 2遺伝子領域の増幅を確認するために 定量的 P た 定量的 P C Rは S YB R G r e e n RT— P C e n t s ( A p p 1 l e d B i o s y's t ern s ) を のフロ トコールに従い 7 5 0 0 R e a l -T i me s t e m ( A p p 1 l e d B i o s y s t erns ) を フライマーは 以下の配列を合成し （〇 P E RONに合 た。 結果
表 4に S GK 2遺伝子の大腸かん由未の細胞株ての 値は対昭 DNA (正常） との相対値を示している。 示さ 腸かん由未細胞株においても S GK 2遺伝子領域に増 ことを見出した
(表 4)
Figure imgf000045_0001
これらの結果により 大腸かん由来の細胞株 （C a c 6 ) においても S GK 2遺伝子か増幅していることか つて かんにおける S GK 2遺伝子の機能解析に使用可 選択された。 実施例 3 大腸かん細胞株を用いた RN A 1解析による 本実施例ては 大腸かん患者 2 0 0検体において高頻 られた S GK 2遺伝子について 大腸かん由耒の細胞株 ケノムレヘルて遺伝子の増幅か認められた細胞株 （C a E 6 ) を用いて RNA i解析を行い その表現型を観 <R N A 1解析 >
細胞株は AT C Cより購入し ^付のフロ トコールに (表 5 )
s l R N A
Figure imgf000046_0001
さらに 2つの s i RNA ( s i R NA 1 およひ s i ついては 巿販 （ I n v i t r o g e n ) の s i R N A s l RNAの C a c o 2細胞内への導入は 〇 1 i g i n e ( I n v l t r o g e n ) を使用し Ι Ο Ο η Μ 付のフロ トコールに従い細胞に導入した。 R KO E 6 は L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 ( I n v i t r 使用し 1 0 0 n Mの s l RNAを 付のフ口 トコール 入した。 対昭には N e g a t i v e C o n t r o l s h a r m a c o n) を使用した。 細胞に導入後 4 日間 微鏡下て同視野の微分干/步像を撮影し その動態を詳細 く定量的 R T— P C R解析 >
定量的 R T— P C R法を用いて s 1 RNAの効果を て検証する。 s 1 R N A導入後 2 4時間の細胞から M 1 —M i d i T o t a l RNA P u r i f i c a t i t e rn ( I n v i t r o g e n ) を使用して 付のフ (A p p l i e d B i o s y s t e m s ) を使用して コールに従い 7 5 0 0 R e a l -T i me P C R
(A p p l i e d B i o s y s t e m s ) を用いて実 マーは 以下の配列を合成し （O P E RONに合成委託） フライマー配列
5， — GAGC G C AGTGT GC TT C T GAAG— 9 )
5 ' 一 TT GACATAGT C GAGC AC GAAGT (配列番号 1 0 )
相対比を算出するための檸準遺伝子には G l y c e r e— 3— p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s H ) C o n t r o l R e a g e n t s (A p p l i y s t e m s ) を用いて G A P D Hの発現量を求め 相
<生細胞数の測定 >
s 1 R N A導入後の生細胞数を A 1 am a r B l u u r c e ) を用いて 付のフロ トコールに従い Wa l 2 0 Mu l t l l a b e l / L um i n e s c e n c e r AR VO (P e r k i n E l m e r ) により 定 腿
大腸かん由来の細胞株てある C a c o 2およひ RKO S GK 2遺伝子の RN A 1解析を実施した。
02に RKOE 6細胞に S GK 2遺伝子の s l RN 03 Aおよひ 03 Bには それそれ C a c o 2およひ に S GK 2遺伝子の s i RNAを T r a n s f e c t i の細胞を用いて測定試薬により生細胞数を測定した結果 は NCに対する相対量を示した。 示されるように 生細 つた結果 C a c o 2における S G K 2遺伝子の s 1 R c 1 m) について それそれ 3 5 % 2 2 % 3 8 殖抑制効果か認められた。 RKO E 6にあける S GK 2 N A 4種 （ b c 1 m) について 表現型同様 N C o n t r o l (N C) と比較して顕著に細胞数か減少 れも t検定において有意 （ p < 0 0 1 ) てあつた。
よって RNA 1 効果により S GK 2遺伝子の発現か C a c o 2およひ R KO E 6において 顕著にかん細胞 れることか見出された。 実施例 4 大腸由来正常細胞株を用いた RN A 1 解析に 本実施例ては 大腸の正常組織由来の細胞株を用いて 実施することにより 標的遺伝子の抑制効果かかん特異 検証した。
く RNA 1解析〉
細胞株は AT C Cより晴入した C C D 1 8 C Oを使用 は ^付のフロ トコールに従った。 使用した s 1 RNA a配列を使用した s i RNAの細胞内への導入は L i am i n e 2 0 0 0 ( I n v i t r o g e n) を使用 実施例 3の記載方法と同様に実施した。 実施例 5 遺伝子増幅の評価
検体組織のかん細胞において S GK 2遺伝子領域て遺 ていることを 当該技術分野て公知の FISH法により評価 アレイ CGH法により 遺伝子増幅度（G/R)か 1 2 以上 織 （大腸癌崈者由来） を用いて S GK 2遺伝子か位置 RP11-69I10の DNA Probeてハイフリ夕イセーンヨ ンを実 ϋ
04は 各検体祖織（Α〜； 0て観察したかん細胞の一部（ 学顕微鏡写真 （蛍光像） を示す。 示されるように かん クナルか 3スホノ ト以上見出された。 アレイ CGH法によ (G/R)か 1 2以上てあった 10検体において S GK 2遺 していることか確認された また 病態ステーノの初期 遺伝子増幅か起きていることか示された。 このことは 領域か かん治療薬の分子標的としてたけてなく FISH 診断に応用てきることを示している。 実施例 6 質量分析による血中 S GK 2夕ン八ク質の検 1 ) 血液検体の前処理
大腸癌崈者の血清検体 10 L及ひ健常者血清検体 IO L フ ァ溶液 （ 10mM Tns HC1 ph 7 4+150mM NaCl) 500 状態て行った。 反応終了後 反応液の 4 倍量の冷アセ ト 08681 - 20°C) を加え — 80°Cに 1 時間静置した後に 30 分間遠心してタンハク質を沈殿として回収した。 回 質は 80 L の 2M尿素 + lOOmM重炭酸アンモニゥム溶液 解後に一部を BCA法によるタンハク質濃度測定に供した。 質と 1/50 (w/w)となるように ト リ フノン （Promega V5 37°Cて 16時間/肖化反応を行った
2 ) Nano-HPLC直結質量分析装置による解析
へフチト断片 0 7 g 量を -Precolumn cartridge (C 5 xm 300A 300 ΠΙ i d x 5 mm LC PACKINGS 163589) ナ ノ カ ラ ム （C18 PepMap 3 πι 100 A 75 ^ m i d PACKINGS 160321) によ り分離した。 HPLC 装置は Ulti PACKINGS)を用いた。 流速は 200nL/nnn 0 1%キ酸 （Wak 含有 2%ァセ トニトリル （MERCK 1287229) と 0 1%キ酸含 トリルの濃度勾配か 0 57%/ππηの直線クランェントを設 つた。 Nino-HPLCて分離した試 斗は PicoTip (New Object 10-D-20) を通して直結したイオン トラ ノフ型質量分析 導入した。 質量分析装置は HCT Plus (Bruker Dal tonics) +斗のイオン化はキヤヒラリー電圧 1500V ェントフレー 500V トライカス流量 12 L/min トライカス温度 250°C イオントラ ノフの設定は檸的 m/z の前後 2 Da の取り込 ートての MS/MS解析を行った。 する質量を持つイオンヒークの有钿を解析した。 結果
05 Aおよひ 05 Bは （A) 大腸かん崈者由来の (B) 健常者由来の血清について 上記の方法て解析し れ示す。
06 A〜Cは MS/MS 解析によって决定された 05 アミノ酸 （またはアミノ酸配列） との対応関係を示す。
05およひ 06に示されるように 檸的分子のフラク 相当するイオンヒ一クか 大腸かん害者由来の血清中に た。 すなわち 06 Bに示すように 少なく とも C末端 という部分配列か决定され これは S GK 2タンハク 列 （配列番号 2 ) 中の 2 8 1位〜 2 8 4位のアミノ酸配 よって 06 Aに示すように アミノ酸配列 2 8 1位〜 2 へフチトフラクメン ト （配列番号 1 1 ) か同定された。 配列に対応する有意なイオンヒークは健常者血凊を用い られなかった （06 Cを参昭） よって この檸的分子 GK 2タンハク質） は癌特異的に血中存在量か増加して く示唆された 実施例 7 子宮頸かん由来株 HeLa細胞株ての RNAi効果 大腸かん細胞株ては S GK 2遺伝子のノ ノクタウン 制効果か認められたか 子宮頸かん細胞株においてとの N) を使用した 結果
07は HeLa 細胞に S GK 2遺伝子の s l RNAを c t l o n後 4 日 目の細胞を用いて測定試薬により (MTT assay) した結果を示す。 ク ラ フ は N C (Neg siRNA(Qiagen 社製））に対する相対量を示した。 0に示 S GK 2遺伝子の S 1 RNA4種 （ b c 1 m) の cにおいて 1 1 % s i RNA 1 において 3 2 % s i おいて 6 5 %の増殖抑制効果か認められた （p〈0 01 の t 有 ¾)。
さらに 時系列に従い 顕微鏡下て微分千涉像を撮影 詳細に観察した 具体的には HeLa 細胞に siRNA (b トランスフエク ンヨ ン後 1 3 4 日後の同視野の 察した。 その結果を 08に示す。 NCは Negative control 社製） を使用した。 8中 b c 1 あよひ mはそれそ RNA b s l RNA c s l RNA l あよひ s l RN 増殖抑制か認められた c 1 mにおいて細胞死の誘導か この結果より S GK 2遺伝子機能の阻害か大腸かん 宮頸かんにおいても抗腫瘍性効果を示すことか示唆され 産業上の利用可能性
本発明は かんの治療剤 診断剤 診断方法 治療方

Claims

請 *の範囲
1 S GK 2遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含 剤
2 前記 S GK 2遺伝子の発現阻害物質か
( a ) S GK 2遺伝子の発現を R N A i効果により阻 する核酸
(b ) S GK 2遺伝子の転写産物またはその一部に対 ス核酸
およひ
(c ) S GK 2遺伝子の転写産物を特異的に切断するリ を有する核酸
からなる群から選択される物質を含む 請求項 1に記載 3 S GK 2夕ンハク質の活 ft阻害物質を有効成分とし 治療剤。
4 前記 S GK 2タンハク質の活性阻害物質か
該 S GK 2夕ンハク質に対する抗体
を含む 請求項 3に記載のかん冶療剤。
5 前記かんか 大腸かんまたは子宮頸かんてある 請 すれかに記載のかん冶療剤。
6 S GK 2遺伝子の発現阻害物質をスク リーニンクす
( a ) S GK 2遺伝子を発現する細胞に 被検化合物 程 (b) 該 S GK 2タンハク質と被検化合物との結合活 程 およひ
( c ) 該 S GK 2タンハク質と結合する化合物を選択 する スク リーニンク方法。
8 前記かんか 大腸かんまたは子宮頸かんてある 請 に記載の方法。
9 S GK 2夕ンハク質に対する抗体。
1 0 請求項 9に記載の抗体を含有するかん治療剤。 1 1 放射 同位元素 治療タンハク質 低分子の薬剤 伝子を担持したヘクターをさらに含有する 請求項 1 0 療剤。
1 2 前記かんか 大腸かんまたは子宮頸かんてある は 1 1 に記載のかん冶療剤。
1 3 請求項 9に記載の抗体を含有するかん診断剤。 1 4 S GK 2遺伝子またはその一部の塩基配列にス 卜 ハイフリ夕イセーショ ン条件下てハイフリ夕イス可能な するかん診断剤
1 5 前記かんか大腸かんてある 請求項 1 3または 1 診断剤。
1 6 請求項 9に記載の抗体を含有するかん診断用キノ
1 7 S GK 2遺伝子またはその一部の塩基配列にス ト ハイフリタイセーショ ン条件下てハイフ リタイス可能な るホリヌクレオチトを含有するかん診断用キノ ト 2 1 質量分析装置を用いて S GK 2タンハク質を検 は定量する 請 *項 1 9または 2 0に記載の方法。
2 2 抗 S GK 2抗体を用いて S GK 2タンハク質を たは定量する 請 *項 1 9〜 2 1のいすれかに記載の方 2 3 (a) 被験者由来の生体試 と S GK 2タンハ 体とを接触させる工程 およひ
(b) 前記試 W中ての前記抗体と S GK 2タンハク 出およひ Zまたは定量する工程
を包含する 請求項 2 2に記載の方法。
24 (a) 被験者由来の生体試 と S GK 2遺伝子 の塩基配列にス トリ ンノエン卜なハイフリ夕イセーノョ フリタイス可能な塩基配列からなるホリヌクレオチトと 程 およひ
(b) 前記試^中ての前記ホリヌクレオチトと S G はその断片とのハイフリ夕イセーンヨ ンを検出およひ Z 工程
を包含する 請求項 1 9または 2 0に記載の方法
2 5 かんの診断に用いるための請求項 1 9〜 24のい 方法。
2 6 前記かんか 大腸かんてある 請 *項 2 5に記載
2 7 配列番号 5 配列番号 6 配列番号 7 または配 配列を有する ホリヌクレオチト。
2 8 S GK 2遺伝子の発現阻害物質を有効成分として
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