JP2002533063A - 方 法 - Google Patents

方 法

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JP2002533063A
JP2002533063A JP2000588203A JP2000588203A JP2002533063A JP 2002533063 A JP2002533063 A JP 2002533063A JP 2000588203 A JP2000588203 A JP 2000588203A JP 2000588203 A JP2000588203 A JP 2000588203A JP 2002533063 A JP2002533063 A JP 2002533063A
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フィリップ、コーエン
タカヤス、コバヤシ
マリア、ディーク
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University of Dundee
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    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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Abstract

(57)【要約】 血清および糖質コルチコイド誘導性タンパク質キナーゼ（ＳＧＫ）を活性する方法が提供され、そこではＳＧＫがリン酸化される。ＳＧＫはＰＤＫ１および／またはＰＤＫ２活性を含む調製物によってリン酸化され得る。ＳＧＫの活性を調整する化合物を同定する方法も提供され、そこでＳＧＫの活性はコンセンサス配列（Ａｒｇ／Ｌｙｓ；好ましくはＡｒｇ）−Ｘ−（Ｘ／Ａｒｇ）−Ｘ−Ｘ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）−Ｚ（ここで、Ｘはいずれかのアミノ酸を示し、Ｘ／Ａｒｇはいずれかのアミノ酸、好ましくはアルギニンを示し、Ｚはアミノ酸が好ましくは疎水性残基であることを示す）に相当するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのＳＧＫによるリン酸化を測定することによって測定される。ＳＧＫはリン酸化により活性化され得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は新規な薬剤またはリード化合物のスクリーニング法に関する。
【０００２】背景技術 タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）（ｃ−ＡｋｔまたはＲＡＣキナーゼとも呼ば
れる）はインスリンの多数の代謝作用の媒介、ならびにインスリン様増殖因子１
（ＩＧＦ−１）などの生存因子の抗アポトーシス作用（［１、２］に概説されて
いる）において鍵となる役割を果たすと考えられている。ＰＫＢはインスリンま
たは生存因子に応じてホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）３−キナー
ゼ依存性機構を介して数分内に活性化される［３〜５］。Ｔｈｒ３０８およびＳ
ｅｒ４７３のリン酸化に起因する活性化、ならびに両残基のリン酸化はＰｔｄＩ
ｎｓ３−キナーゼの阻害剤によって妨げられる［６］。３−ホスホイノシチド依
存性タンパク質キナーゼ１（ＰＤＫ１）は、in vitroでは触媒ドメインのサブド
メインVIIとVIIIの間の「活性化ループ」中に位置するＴｈｒ３０８をリン酸化
し［７〜９］、これはタンパク質キナーゼＣ関連キナーゼ−２（ＰＲＫ２）のＣ
末端配列に相当するペプチドとの相互作用に基づいて、Ｃ末端近くに位置するＳ
ｅｒ４７３、ならびにＴｈｒ３０８をリン酸化する形態に変換され得る(Balendr
an et al (1999) Curr. Biol. 9, 393-404)。しかしながら、in vivoでＰＤＫ１
によってＳｅｒ４７３がリン酸化されるかどうかはまだ証明されていない。
【０００３】 in vitroでのＰＤＫ１によるＰＫＢの活性化はＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ ３ 、すなわち、ＰｔｄＩｎｓ３−キナーゼ反応の生成物を含有する脂質小胞の存
在下でのみ起こり、これはこの「第２のメッセンジャー」のＰＫＢとＰＤＫ１双
方のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインとの相互作用に起因する［９、１０］
。
【０００４】 ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３は原形質膜の内葉と関連している。従って、
ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のインスリンまたはＩＧＦ−１誘導性増加はサ
イトゾルからそこで活性となる原形質膜へのＰＫＢの補充をともなう［１２、１
３］。膜補充はＰＤＫ１およびＰＤＫ２による活性化を容易にすると考えられて
いる［１２］。ＰＤＫ１はＰＫＢよりもはるかにより強くＰｔｄＩｎｓ（３，４
，５）Ｐ３と結合し［１０］、ＰＤＫ１の、基本条件下で存在する低レベルのＰ
ｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３との相互作用により、原形質膜とのその構造的結
合を少なくとも部分的に説明できる。ＩＧＦ−１またはＰＤＧＦに応じたＰＤＫ
１のサイトゾルから原形質膜への輸送が起こり得る［１４］。
【０００５】 ＰＫＢのＴｈｒ３０８のＣ末端に隣接するアミノ酸配列は、ｐ７０Ｓ６キナー
ゼおよびタンパク質キナーゼＣなどのシグナル伝達において重要な役割を果たす
その他のタンパク質キナーゼにおいて認められたものと同様である（図１）。Ｐ
ＤＫ１はin vitroでの同時トランスフェクション実験ではＰＫＢのＴｈｒ３０８
に相当する残基をリン酸化することによってｐ７０Ｓ６キナーゼ［１５、１６］
、ＰＫＣδおよびＰＫＣζ［１７、Chou et al (1998) Curr Biol 8, 1069-1077
］を活性化する。in vitroでのＰＤＫ１によるｐ７０Ｓ６キナーゼの活性化はＰ
ｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の影響を受けない。
【０００６】 ＰＫＢ同様、ｐ７０Ｓ６キナーゼおよびＰＫＣはＰＤＫ２と呼ばれるタンパク
質キナーゼ活性によるリン酸化に関して提案されるコンセンサス配列（Ｐｈｅ−
Ｘａａ−Ｘａａ−（Ｐｈｅ／Ｔｈｒ）−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）−（Ｐｈｅ／Ｔｈｒ
））を含んでおり、これは常にＰＤＫ１リン酸化部位の１６０〜１６５残基Ｃ末
端に位置している（図１）。これらの観察結果はＰＤＫ１およびＰＤＫ２と呼ば
れるタンパク質キナーゼ活性はいくつかのタンパク質キナーゼの活性化にともに
関係している可能性があるということを示唆する。ＰＤＫ２活性はすでに同定さ
れている(Balendran et al (1999) Curr. Biol. 9, 393-404;１９９９年３月１
９日に出願された英国特許出願第９９０６２４５．７号および１９９９年１２月
２日に出願されたAlessi et alの米国特許出願）。
【０００７】 血清および糖質コルチコイド誘導性タンパク質キナーゼ（ＳＧＫ）が糖質コル
チコイド誘導性転写物の発見に向けられたディファレンシャルスクリーニングで
最初に同定された［１８］。血清または糖質コルチコイドでの細胞刺激に続いて
、ＳＧＫｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルは双方ともＲａｔ２繊維芽細胞にお
いて３０分の半分の時間のうちに５〜１０倍上昇する［１９］。ＳＧＫはまた、
卵胞刺激ホルモン［２０］、細胞外モル浸透圧濃度の上昇［２１］、脳の損傷［
２２、２３］などのその他の刺激に応じて、ならびにｐ５３を用いる哺乳類上皮
細胞のトランスフェクション［２４］によって誘導される。しかしながら、ＳＧ
Ｋの糖質コルチコイド刺激性誘導はＲａｔ２繊維芽細胞では野生型ｐ５３によっ
て抑制されるが変異ｐ５３によっては抑制されない［２５］。
【０００８】 ＳＧＫの構造はＰＫＢと同様であるが、ＰＨドメインを欠いている。ＳＧＫの
触媒ドメインはＰＫＢと５４％同一であり、ｐ７０Ｓ６キナーゼと５０％同一で
あり、ＰＫＣと４８％同一である。
【０００９】
【発明の概要】
本発明者らは本明細書においてＳＧＫは２９３細胞中でＰｔｄＩｎｓ３−キナ
ーゼ依存性経路を介してＩＧＦ−１または酸化ストレスによって活性化されると
いうことを証明している。活性化はリン酸化に起因すると考えられる。さらに、
ＳＧＫはＰＫＢのＴｈｒ３０８に相当する位置にトレオニン残基、Ｓｅｒ４７３
に相当するセリン残基を保持し、かつ、これらの残基の周囲の配列はＰＤＫ１お
よびＰＤＫ２活性によってリン酸化される能力と一致する（図１）。活性化はＴ
ｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３に相当する残基のリン酸化に起因すると考えられ
、in vitroではＰＤＫ１によってＴｈｒ３０８に相当する残基がリン酸化されて
ＳＧＫが活性化される。ＳＧＫは好ましくはＡｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−
Ｘａａ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）−モチーフ中に位置するセリンおよびトレオニンリ
ン残基をリン酸化し、in vitroではグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳ
Ｋ３）をＰＫＢと同等の速度で不活性化する。
【００１０】 本発明者らはＳＧＫ２およびＳＧＫ３と呼ばれるＳＧＫの新規のイソ型をさら
に同定しており、これらはこれまでに同定されたＳＧＫ［１８］（本明細書では
ＳＧＫ１と呼ばれる）と同様にして活性化される。ＳＧＫ２およびＳＧＫ３の触
媒ドメインは互いにおよびＳＧＫ１と８０％のアミノ酸配列同一性を共有してい
る。
【００１１】
【発明の具体的説明】
本発明の第１の態様は、血清および糖質コルチコイド誘導性タンパク質キナー
ゼ（ＳＧＫ）を活性化する方法であり、ここではＳＧＫをリン酸化する。この方
法によって活性化されるＳＧＫは部分的にまたは完全に不活性化／脱リン酸化さ
れたＳＧＫであり得る。
【００１２】 本発明のさらなる態様は、ＳＧＫの活性を低下させる方法であり、ここではＳ
ＧＫを脱リン酸化する。その活性が低下するＳＧＫは部分的にまたは完全に活性
化／リン酸化されたＳＧＫであり得る。
【００１３】 「活性化」とはＳＧＫの酵素活性が増大することを意味する。 「活性を低下させる」とはＳＧＫの酵素活性が低下することを意味する。増大
または低下し得る酵素活性はタンパク質キナーゼ活性、好ましくはセリン／トレ
オニンタンパク質キナーゼ活性、すなわち、１個以上のセリンまたはトレオニン
残基でのタンパク質／ポリペプチドのリン酸化である。酵素活性は特定の基質に
ついてのＳＧＫのＶｍａｘまたはＫｍ（または双方）の変更によって増大または
低下し得る。例えば、Ｖｍａｘを増大するかまたはＫｍを減少させることによっ
て活性が増大し得る。ＳＧＫが活性化されているか不活性化されているかを決定
するためにＶｍａｘまたはＫｍのいずれかの値を決定することは必要ではないと
考えられる。脱リン酸化された（不活性化された）ＳＧＫはいくらかの酵素活性
を保持し得ると考えられる。
【００１４】 活性は所定の時間内にリン酸化された基質量として測定でき、従って、活性の
変化は、実施例１に記載のように、所定の時間内にリン酸化される基質量の変化
（例えば、単一濃度での）として検出できる。基質はコンセンサス配列Ａｒｇ−
Ｘ−（Ｘ／Ａｒｇ）−Ｘ−Ｘ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）−Ｚ（ここで、Ｘはいずれか
のアミノ酸を示し、Ｘ／Ａｒｇは好ましくはアルギニンであるいずれかのアミノ
酸を示し、かつ、Ｚはアミノ酸残基が好ましくは疎水性残基であるということを
示す）を含んでなるポリペプチドであり得る。かかるポリペプチドの例としては
、ペプチドクロスチド(Crosstide)（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ）がある。下線を
引いた残基がタンパク質キナーゼによってリン酸化され得る。ＳＧＫの基質であ
り得るポリペプチドのその他の例は表１および表２に示されている。グリコーゲ
ンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）は実施例１において論じられるようにＳ
ＧＫの基質であり得る。
【００１５】 ＳＧＫがすでにリン酸化されている場合には、さらなるリン酸化は起こり得ず
、かつ／または、さらなる活性化をもたらし得ないと考えられる。さらに、ＳＧ
Ｋがすでに部分的に脱リン酸化されている場合には、さらなる脱リン酸化は起こ
り得ず、かつ／または、さらなる不活性化をもたらし得ない。
【００１６】 さらに、細胞から単離されたＳＧＫ（内在性または組換えポリペプチドのいず
れかとして）はそのリン酸化／活性化状態に関して不均一であり得ると考えられ
る。例えば、完全に活性化された／リン酸化された、完全に不活性化された／脱
リン酸化された、および／または部分的に活性化された／リン酸化されたＳＧＫ
の分子が単一細胞または細胞群／培養物中に存在し得る。
【００１７】 活性が必要に応じて少なくとも２倍、好ましくは５、１０、１５、２０、２５
、３０または５０倍まで増大するまたは低下することが好ましい。
【００１８】 血清および糖質コルチコイド誘導性タンパク質キナーゼ（ＳＧＫ）はＩ．Ｍ．
Ａ．Ｇ．ＥコンソーシアムクローンＩＤ４２６６９（これはヒト血清および糖質
コルチコイド誘導性タンパク質キナーゼをコードすると同定されるヒト幼児脳ラ
イブラリー由来の全長ｃＤＮＡを含んでなる）によってコードされるポリペプチ
ド、好ましくはタンパク質キナーゼを包含する。血清および糖質コルチコイド誘
導性タンパク質キナーゼは当業者には十分に公知である（例えば、参照文献１８
〜２５参照）。ヒト血清および糖質コルチコイド誘導性タンパク質キナーゼ（本
明細書ではＳＧＫ１と呼ばれる）のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｙ１
００３２である。ラット血清および糖質コルチコイド誘導性タンパク質キナーゼ
のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ０１６２４である。線虫（カエノル
ハブジチス・エレガンス）血清および糖質コルチコイド誘導性タンパク質キナー
ゼは受託番号２８１１４０の染色体３ゲノムＤＮＡ由来の２６ｋｂの断片の一部
によってコードされ得る。
【００１９】 血清および糖質コルチコイド誘導性タンパク質キナーゼ（ＳＧＫ）はアミノ酸
配列：
【化１】 または
【化２】 または
【化３】 を有するポリペプチド（ＳＧＫ２と呼ばれる）をさらに包含する。
【００２０】 第１の配列はヒトＳＧＫ２αのものであり、第２のものはヒトＳＧＫ２βのも
のであり、第２の配列はマウスＳＧＫ２のものである。ＳＧＫ２βはＳＧＫαに
は存在しないＮ末端の６０個アミノ酸を有している。
【００２１】 血清および糖質コルチコイド誘導性タンパク質キナーゼ（ＳＧＫ）は下記アミ
ノ酸配列を有するポリペプチド（ＳＧＫ３と呼ばれる）をなおさらに包含する。
【化４】 ＳＧＫ１、２、３およびマウスＳＧＫ２の配列のアラインメントは図１３に示
されている。 本発明のさらなる態様はアミノ酸配列
【化５】 または
【化６】 または
【化７】 または
【化８】 を含んでなる実質的に純粋なポリペプチドまたはその変異体、断片、融合体、も
しくは誘導体、あるいはその変異体もしくは断片もしくは誘導体の融合物を提供
する。その変異体、断片、融合体、または誘導体は好ましくはタンパク質キナー
ゼ、より好ましくは、さらに以下に論じられるように、共通Ａｒｇ−Ｘ−（Ｘ／
Ａｒｇ）−Ｘ−Ｘ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）−Ｚを含んでなるポリペプチドをリン酸
化し得るタンパク質キナーゼであり、ＳＧＫ１、ＰＫＢα、ＰＫＣδ、ＰＫＣζ
、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、ＭＳＫ１またはＭＳＫ２またはその断片もしくは融合体
ではない。そのアミノ酸配列が前記に示されているポリペプチドは血清および糖
質コルチコイド誘導性タンパク質キナーゼであると考えられている。ＳＧＫ２ｍ
ＲＮＡは肝臓、腎臓および膵臓中に高レベルで存在し、また脳中にも存在するが
、他方、ＳＧＫ１およびＳＧＫ３をコードするｍＲＮＡのレベルは調べた総ての
組織において同様である（実施例５参照）。
【００２２】 本発明者らによれば「実質的に純粋」とはポリペプチドが実質的にその他のタ
ンパク質を含んでいないということを意味する。従って、本発明者らはポリペプ
チドとしてタンパク質含量の少なくとも３０重量％、好ましくは少なくとも５０
％、より好ましくは少なくとも７０％、いっそうより好ましくは少なくとも９０
％を含むいずれの組成物も包含するが、少なくとも９５％のタンパク質含量がポ
リペプチドであることが最も好ましい。
【００２３】 従って、本発明はまたポリペプチドおよび７０重量％未満の組成物、好ましく
は５０重量％未満の組成物、より好ましくは３０重量％未満の組成物、いっそう
より好ましくは１０重量％未満の組成物および最も好ましくは５重量％未満の組
成物を含んでなる夾雑物を含んでなる組成物を包含する。
【００２４】 本発明はまた、ex vivoでその他の成分と結合する実質的に純粋なポリペプチ
ドを包含するが、このその他の成分はポリペプチドが認められる細胞中に認めら
れる成分の必ずしも総てではない。
【００２５】 例えば、本発明の前記の方法によって得られるまたは得られ得る活性化された
または不活性化されたＳＧＫは、例えば、以下に示されるものなどのスクリーニ
ング法において有用であり得る。従って、本明細書においてＳＧＫはＳＧＫ２も
しくはＳＧＫ３の前記に示されたアミノ酸配列またはＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅコンソ
ーシアムクローンＩＤ４２６６９によってコードされるポリペプチド、好ましく
はタンパク質キナーゼまたはその変異体、断片、融合体もしくは誘導体、あるい
はその変異体もしくは断片もしくは誘導体の融合物のアミノ酸配列を含んでなる
、タンパク質キナーゼであるポリペプチドを包含すると考えられる。ポリペプチ
ドは共通Ａｒｇ−Ｘ−（Ｘ／Ａｒｇ）−Ｘ−Ｘ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）−Ｚ（ここ
で、Ｘいずれかのアミノ酸を示し、Ｘ／Ａｒｇは好ましくはアルギニンであるい
ずれかのアミノ酸を示し、かつ、Ｚはアミノ酸残基が好ましくは疎水性残基であ
るということを示す）を含んでなるポリペプチドをリン酸化し得るタンパク質キ
ナーゼであることが好ましい。かかるポリペプチドの例としてはクロスチド（Ｇ
ＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ）がある。下線を引いた残基がタンパク質キナーゼによっ
てリン酸化され得る。タンパク質キナーゼによってリン酸化され得るポリペプチ
ドのその他の例は表１に示されており、実施例１において論じられるようにＧＳ
Ｋ３を含み得る。実施例５において論じられるように、ＳＧＫ２のセリン２７９
はＳＧＫおよびＰＫＢによるリン酸化のためのコンセンサス配列に一致する配列
中に位置する。従って、ＳＧＫ２はタンパク質キナーゼ、例えばＳＧＫ２によっ
てリン酸化され得る。タンパク質キナーゼはＰＫＢ（例えば、ＰＫＢα）、ｐ７
０Ｓ６キナーゼ、タンパク質キナーゼＣ（例えば、ＰＫＣδまたはＰＫＣζ）、
ＭＡＰＫＡＰキナーゼ１(Leihgron et al (1995) FEBS Lett 375, 289-293)また
はＭＳＫ１もしくはＭＳＫ２ではないと考えられる（例えば、１９８８年８月１
０日に出願された英国特許出願第９８１７３０３．２号、および１９９８年６月
２４日に出願された第９８１３４６７．９号参照）。実施例５において論じられ
るように、例えば、ＳＧＫ３も全長ヒトＳＧＫ３のセリン７７またはセリン７９
と同等のセリン残基をリン酸化し得る。
【００２６】 ポリペプチドは、前記で定義されるタンパク質キナーゼ活性を保持しない場合
でさえも、例えば、以下に示されるいくつかのスクリーニングアッセイにおいて
有用であり得ると考えられる。かかるポリペプチドのリン酸化はポリペプチドの
特定のタンパク質キナーゼにおける酵素活性の変化を検出することによるのでは
ない本明細書に記載の手段によって検出され得るということがさらに理解されよ
う。
【００２７】 ＳＧＫはＰＤＫ１によるポリペプチドのリン酸化のためのコンセンサス配列で
あるコンセンサス配列Ｂ−Ｔ−Ｆ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−（Ｐ／Ｉ）−（Ｄ／Ｅ）−Ｙ−
（Ｌ／Ｉ／Ｍ）−Ａ−Ｐ−Ｅ（ここで、Ｂは塩基性残基である）、および／また
はＰＤＫ２タンパク質キナーゼ活性によるポリペプチドのリン酸化に関して提案
されたコンセンサス配列であるコンセンサス配列Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−（Ｐ
ｈｅ／Ｔｙｒ）−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）−（Ｐｈｅ／Ｔｙｒ）に相当するアミノ酸
配列を含んでなるのが好ましい。両コンセンサス配列が存在することが好ましい
。あるいは、いずれかのコンセンサス配列のＳｅｒ／Ｔｈｒがアスパラギン酸ま
たはグルタミン酸（すなわち酸性）残基で置換されていてもよく、ポリペプチド
のかかるコンセンサス配列の一方だけがこのように置換されているのが好ましい
。ＰＤＫ１によるリン酸化のコンセンサス配列におけるＳｅｒ／Ｔｈｒこのよう
に置換されていないのが好ましく、実施例１に記載されているようにヒトＳＧＫ
１におけるＴｈｒ２５６からＡｓｐへの置換はＳＧＫの活性化を無効にし得る。
【００２８】 ポリペプチドの「変異体」には挿入、欠失および保存的または非保存的いずれ
かの置換が含まれる。特にかかる変化がタンパク質キナーゼの活性を実質的に変
化させないポリペプチド変異体が含まれる。
【００２９】 「保存的置換」（conservative substitutions）とはＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ
、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｕ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ
、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組合せを意図したものである。
【００３０】 ＳＧＫ変異体がポリペプチド、好ましくはＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅコンソーシアム
クローンＩＤ４２６６９によってコードされるタンパク質キナーゼと少なくとも
６５％、より好ましくは少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％または７４
％、いっそう好ましくは少なくとも７５％、なおいっそう好ましくは少なくとも
８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、なおさらに好ましくは少なくとも
９０％、最も好ましくは少なくとも９５％または９７％の同一性を有するアミノ
酸配列を持つならば特に好ましい。
【００３１】 ＳＧＫ２またはＳＧＫ３変異体が上記に示されるように適当であればＳＧＫ２
またはＳＧＫ３のアミノ酸配列と少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも
７０％、７１％、７２％、７３％または７４％、いっそう好ましくは少なくとも
７５％、なおいっそう好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくと
も８５％、なおさらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも
９５％または９７％の同一性を有するアミノ酸配列を持つことが特に好ましい。
【００３２】 ＳＧＫ変異体はポリペプチド、特にＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅコンソーシアムクロー
ンＩＤ４２６６９によってコードされるタンパク質キナーゼの触媒ドメインのア
ミノ酸配列と少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、７１％、７
２％、７３％または７４％、いっそう好ましくは少なくとも７５％、なおいっそ
う好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８３または８５％
、なおさらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％ま
たは９７％の同一性を有するアミノ酸配列を持つことがなおさらに好ましい。
【００３３】 ＳＧＫ２またはＳＧＫ３変異体がその配列が適当であれば上記に示されるＳＧ
Ｋ２またはＳＧＫ３ポリペプチドの触媒ドメインのアミノ酸配列と少なくとも６
５％、より好ましくは少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％または７４％
、いっそう好ましくは少なくとも７５％、なおいっそう好ましくは少なくとも８
０％、さらに好ましくは少なくとも８３％または８５％、なおさらに好ましくは
少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％または９７％の同一性を有
するアミノ酸配列を持つことがなおさらに好ましい。
【００３４】 タンパク質キナーゼ関連ポリペプチドの触媒ドメインは、例えば以下に記載の
、またＳＧＫに関して例えばWebster et al (1993) Mol Cell Biol 13(4), 2031
-2040に記載の配列比較を用いて当業者によって容易に同定されると考えられる
。例えば実施例５に記載のように、３つのＳＧＫイソ型のアミノ酸配列はその触
媒ドメインの別のものと約８０％同一であるが、短いＣ末端非触媒ドメインは同
一性は低い（同一性４４〜６８％）。触媒ドメインの前のＮ末端の８５残基は極
めて同一性が低い。この領域ではＳＧＫ１とＳＧＫ３との間には約２５％の同一
性があるに過ぎず、ＳＧＫ２とその他のイソ型との間はほとんど同一でない（図
１３）。
【００３５】 ２つのポリペプチド間の配列同一性％は好適なコンピュータープログラム、例
えばウイスコンシン大学遺伝学コンピューティンググループのＧＡＰプログラム
を用いて決定してもよく、同一性％はその配列は最適に配列されたポリペプチド
に関して計算されると考えられる。
【００３６】 あるいはアライメントはＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム(Thompson et al., 19
94)を用いて行ってもよい。用いるパラメーターは次の通りである： 高速対合アライメントパラメーター：Ｋ組（ワード）サイズ；１、ウィンドウサ
イズ；５、ギャップペナルティー；３、トップダイアゴナル数；５、スコア表示
方法：ｘパーセント。マルチプルアライメントパラメーター：ギャップオープン
ペナルティー；１０、ギャップエクステンョンペナルティー；０．０５。スコア
リングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【００３７】 それらのアミノ酸配列によって上記で定義されたようなＳＧＫ２またはＳＧＫ
３は上記のようにＳＧＫ変異体の例であると考えられる。
【００３８】 ＳＧＫはＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．ＥコンソーシアムクローンＩＤ４２６６９によって
コードされるタンパク質キナーゼ、またはＳＧＫ２もしくはＳＧＫ３のアミノ酸
配列、上記で示されたアミノ酸配列、またはその天然に存在する対立遺伝子変異
体（スプライス変異体を含む）からなるポリペプチドであるのが好ましい。
【００３９】 ＳＧＫはまた、以下のもののうちの１つであるのが好ましい。 （１）上記で定義されたような、実施例１に記載のように全長ヒトＳＧＫ１の
Ｎ末端の６０個のアミノ酸に相当するアミノ酸を欠く（例えばΔＮ−ＳＧＫ６１
−４３１）、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．ＥコンソーシアムクローンＩＤ４２６６９によっ
てコードされるポリペプチド（ＳＧＫ１）またはＳＧＫ２もしくはＳＧＫ３、ま
たは実施例５に記載され、図１３に示されるＳＧＫα２； （２）全長ＳＧＫ、または上記のようにＮ末端の６０個のアミノ酸を欠いたＳ
ＧＫ（ここで、全長ＳＧＫ１のセリン４２２に相当する残基がアスパラギン酸ま
たはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）で置換され、かつ／または全長
ＳＧＫ１のトレオニン２５６に相当する残基がアスパラギン酸またはグルタミン
酸またはアラニンで置換されている）； （３）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と上記ＳＧＫのいず
れかの変異体の融合ポリペプチド、例えば当業者に公知のようにプラスミドｐＥ
ＢＧ２ＴのＧＳＴ配列によってコードされているＧＳＴを含んでなる融合タンパ
ク質。例としては実施例１に記載のようにＧＳＴ−ΔＮ−ＳＧＫ［Ｓ４２２Ｄ］
が挙げられる。
【００４０】 全長ＳＧＫ１のトレオニン２５６に相当する残基が例えばアラニン、グルタミ
ン酸またはアスパラギン酸残基で置換されているＳＧＫはリン酸化によって著し
く活性化されることはあり得ず、従って本発明のスクリーニング法に用いられる
その他いくつかのＳＧＫより好ましくない。従って実施例１に記載のようにＧＳ
Ｔ−ＳＧＫ［Ｔ２５６Ｄ］、ＧＳＴ−ＳＧＫ［Ｔ２５６Ｅ］、ＧＳＴ−ＳＧＫ［
Ｔ２５６Ａ］はリン酸化によって著しく活性化されることはあり得ず、従って本
発明のスクリーニング法に用いられるその他いくつかのＳＧＫより好ましくない
。
【００４１】 実施例５に記載されるように、ＳＧＫ１のセリン４２２に相当する残基はＳＧ
Ｋ２αではセリン３５６であり、ＳＧＫ３ではセリン４１９である。ＳＧＫ１の
トレオニン２５６に相当する残基はＳＧＫ２αではセトレオニン１９３であり、
ＳＧＫ３ではトレオニン２５３である。
【００４２】 全長ＳＧＫ１の４２２に相当する残基はグルタミン酸もしくはアスパラギン酸
残基（すなわち酸性残基）、または例えばアラニン残基によってリン酸化され得
る残基で置換されていてもよいＳＧＫはリン酸化によって活性化されることはあ
り得ないか、またはセリン４２２に相当する残基がそのように置換されていない
ＳＧＫよりリン酸化によって活性化される可能性が低い。
【００４３】 いずれのタンパク質キナーゼ活性も持たない変異型ＳＧＫ（「キナーゼデッド
」（kinase dead）変異体）はタンパク質キナーゼ活性を有するがタンパク質キ
ナーゼ活性の変化が識別されないＳＧＫと同様にしてリン酸化され得ると考えら
れる。かかる変異型ＳＧＫは全長ＳＧＫ１のリシン１２７に相当する残基（ＡＴ
Ｐ結合部位に存在する可能性がある）が実施例１に記載のようにアラニンで置換
されているＳＧＫであり得る。
【００４４】 ＳＧＫ（上記で定義）はホスファチジルイノシトール依存性タンパク質キナー
ゼ１（ＰＤＫ１）、またはその変異体、断片、融合体もしくは誘導体、あるいは
その変異体、断片もしくは誘導体の融合物によりリン酸化され得る。ＰＤＫ１と
は当業者に十分公知であり（例えば参照文献７〜９参照）、特に参照文献９およ
び同時係属出願ＰＣＴ／ＧＢ９８／００７７７に記載および表示されたＰＤＫ１
が挙げられる。ＰＤＫ１の変異体、断片、融合体もしくは誘導体、あるいはその
変異体、断片もしくは誘導体の融合物はタンパク質キナーゼ、好ましくはコンセ
ンサス配列Ｂ−Ｔ−Ｆ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−（Ｐ／Ｉ）−（Ｄ／Ｅ）−Ｙ−（Ｌ／Ｉ／
Ｍ）−Ａ−Ｐ−Ｅに相当するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをリン酸化
し得るタンパク質キナーゼである。かかるＰＤＫ１の変異体はＰＤＫ１の機能的
変異体であってよく、本願と同日に出願された「スクリーニング法」と題された
米国特許出願に記載されているようなサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyc es cerevisiae)由来のＰｋｈ１およびＰｋｈ２が挙げられる。
【００４５】 ＳＧＫはセリン／トレオニンタンパク質キナーゼ、例えばＰＰ１(Berndt et a
l (1987) FEBS Lett 223, 340-346)、ＰＰ２Ｃ(Mann et al (1992) Biochem et
Biophys Acta 1130, 100-104)またはタンパク質ホスホリラーゼ２Ａ(PP2A; da C
ruz E Silva (1987) FEBS Lett 221, 415-422)またはそのいずれかの変異体、断
片、融合体もしくは誘導体、あるいはその変異体、断片もしくは誘導体の融合物
によってリン酸化され得る。ＰＰ１、ＰＰ２ＣまたはＰＰ２Ａまたはそのいずれ
かの変異体、断片、融合体もしくは誘導体、あるいはその変異体、断片もしくは
誘導体の融合物はホスホリラーゼａを脱リン酸化し得る。ＰＰ１、ＰＰ２Ｃ、Ｐ
Ｐ２Ａおよびホスホリラーゼａは当業者に十分に公知である。ＰＰ２Ａは１μＭ
のミクロシスチンＬＲによって不活性化され得る。
【００４６】 本発明のさらなる態様は、ＳＧＫを不活性化および／または脱リン酸化する方
法におけるセリン／トレオニンタンパク質キナーゼ、例えばＰＰ１、ＰＰ２Ｃ、
ＰＰ２Ａまたはそのいずれかの変異体、断片、融合体もしくは誘導体、あるいは
その変異体、断片もしくは誘導体の融合物（上記で定義）の使用である。ＳＧＫ
は上記で論じられたようにリン酸化されたＳＧＫであってよい。
【００４７】 本発明のなおさらなる態様は、ＳＧＫを活性化および／またはリン酸化する方
法におけるタンパク質キナーゼ、好ましくはＰＤＫ１またはその変異体、断片、
融合体もしくは誘導体、あるいはその変異体、断片もしくは誘導体の融合物（上
記で定義）の使用である。ＳＧＫは上記で論じられたよう脱リン酸化されたＳＧ
Ｋであってよい。
【００４８】 本発明のさらなる態様はＳＧＫを活性化する方法（上記で定義）であり、ここ
ではＳＧＫが全長ヒトＳＧＫ１のＴｈｒ２５６に相当する残基でリン酸化される
。ＳＧＫ（例えば、全長ヒトＳＧＫおよびΔＮ−ＳＧＫ（６１−４３１））はＰ
ＤＫ１により全長ヒトＳＧＫ１のＴｈｒ２５６に相当する残基でリン酸化され得
る。ＳＧＫは実施例１および実施例５に記載のようにこの残基でリン酸化される
ことで活性化され得る。全長ＳＧＫ１のセリン４２２に相とする残基が酸性残基
、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸で置換されているＳＧＫは、セリン
４２２に相当する残基がそのように置換されていないＳＧＫよりもより容易にリ
ン酸化および／または活性化され得る。例えば、全長ＳＧＫ１のセリン４２２に
相当する残基が酸性残基、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸で置換され
ている組換えＳＧＫは、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞で発現された場合に全
長ヒトＳＧＫ１のＴｈｒ２５６に相当する残基で実質的にリン酸化され得る。か
かる組換えＳＧＫは、以下に記載されるように活性化されたＳＧＫが要されるス
クリーニングアッセイにおいて有用であり得る。
【００４９】 例えば実施例１に論じられているように、全長ヒトＳＧＫ１のＴｈｒ２５６に
相当する残基でＳＧＫをリン酸化し得るタンパク質キナーゼは、いずれかの特定
のタンパク質キナーゼがＳＧＫを活性化し得るかどうかを調べる、かつ／または
ＳＧＫのいずれかの残基が特定のタンパク質キナーゼによってリン酸化され得る
かどうかを調べることで同定され得ると考えられる。
【００５０】 「全長ヒトＳＧＫ１のＴｈｒ２５６に相当する残基」とは例えばヒト全長ＳＧ
Ｋ１の天然の三次元構造においてＴｈｒ２５６によって占められている位置に相
当するタンパク質キナーゼの天然三次元構造における位置を占めるアミノ酸残基
を意味するものとする。ヒト全長ＳＧＫ１のＴｈｒ２５６は触媒ドメインのサブ
ドメインVIIとVIIIの間の「活性化ループ」に位置すると考えられる。
【００５１】 Johnson et al (1996) Cell, 85, 149-158およびTaylor & Radzio-Andzelm 81
994) Structure 2, 345-355に概説されているように、タンパク質キナーゼは保
存された触媒コアを示す。このコアは主にアンチ・パラレルβシートからなる小
さなＮ末端ローブおよいび大部分αらせんである大きなＣ末端ローブに折りたた
まされている。
【００５２】 例えば全長ヒトＳＧＫ１のＴｈｒ２５６に相当する残基は、配列間の一致を最
大にするように全長ヒトＳＧＫ１のそれを含むポリペプチドの配列を配列するこ
とで同定され得る。このアライメントは目視により、かつ／またはポリペプチド
の同一性％を計算できる、例えばウイスコンシン大学遺伝学コンピューティング
グループのＧＡＰプログラムなどの好適なコンピュータープログラムの使用によ
って行えばよい。配列プログラム(Pearson (1994): Methods in Molecular Biol
ogy, Computer Analysis of Sequence Data, Part II (Griffin, AM and Griffi
n, HG eds) pp 365-389, Humana Press, Clifton)。このようにこの方法で同定
された残基も「同等な残基」である。
【００５３】 末端切断型のＳＧＫの場合、または単純なアミノ酸置換が占めている場合には
「同等な残基」を同定するのが容易であると考えられる。
【００５４】 ヒトＳＧＫ１の配列は例えばWebster et al (1993) Mol Cell Biol 13(4), 20
31-2040に示されている。
【００５５】 例えばＴｈｒ２５６に相当する残基の同定は保存されている残基を取り巻くア
ライメントに依存すると考えられる。
【００５６】 本発明のさらなる態様はＳＧＫを活性化する方法（上記で定義）であり、ここ
では全長ヒトＳＧＫのＳｅｒ４２２に相当する残基でＳＧＫがリン酸化される。
ＳＧＫ（例えば全長ヒトＳＧＫおよびΔＮ−ＳＧＫ（６１−４３１））は、ＰＤ
Ｋ２活性を含む調製物によって全長ヒトＳＧＫ１のＳｅｒ４２２に相当する残基
でリン酸化され得る。実施例１に記載のように、ＳＧＫはこの残基でリン酸化さ
れることで活性化され得る。この方法は細胞、例えばＩＧＦ−１および／または
過酸化水素によって刺激される哺乳類細胞で行える。この方法はＳＧＫをコード
する組換えポリペプチドまたは複製可能なベクターを含む宿主細胞を培養し、こ
の細胞を例えばＩＧＦ−１および／または過酸化水素で刺激し、さらにその宿主
細胞からポリペプチドを単離することを含んでなり得る。宿主細胞を培養して組
換えタンパク質を単離する方法は当技術分野で十分公知である。
【００５７】 Ｓｅｒ４２２に相当する残基または全長ヒトＳＧＫ１のその他の残基は全長ヒ
トＳＧＫ１のＴｈｒ２５６に相当する残基に関して上記されたものと同様の方法
によって同定され得る。ヒト全長ＳＧＫ１のＳｅｒ４２２はポリペプチドのＣ末
端に近くに位置している。
【００５８】 ＰＤＫ２活性を含む調製物はコンセンサス配列Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈ
ｅ／Ｔｈｒ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｈｅ／Ｔｈｒに相当するアミノ酸配列を含んで
なるポリペプチドをリン酸化し得る。
【００５９】 ＳＧＫは、例えばin vitroにおいてＰＤＫ２の生理学的特徴を持たないか、ま
たはＰＤＫ２に必要とされると思われるコンセンサス配列を必要としないと考え
られるタンパク質キナーゼによって、全長ヒトＳＧＫ１のＳｅｒ４２２に相当す
る残基でリン酸化され得る。このようにin vitroにおいてＳＧＫはin vivoでは
生理学的に適当な様式ではリン酸化されず、ＰＤＫ２として同定される活性に相
当しないタンパク質キナーゼによってリン酸化されると考えられる。これはＭＡ
ＰＫＡＰキナーゼ−２(Alessi et al (1996) EMBO J 15, 6541-6551)によるＳＧ
ＫのＳｅｒ４２２に相当する部位（Ｓｅｒ４７３）でＰＫＢαのin vitroリン酸
化と同様である。ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２はＰＤＫ２に必要とされることが確
認されているコンセンサス配列を必要としない。
【００６０】 全長ヒトＳＧＫ１のＳｅｒ４２２に相当する残基をリン酸化し得るタンパク質
キナーゼは全長ヒトＳＧＫ１のＴｈｒ２５６に相当する残基をリン酸化し得るタ
ンパク質キナーゼを同定するための上記および実施例１に記載のものと同様の方
法によって同定され得る。
【００６１】 ＳＧＫのリン酸化はＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３に依存し得る。特に例え
ばＰＤＫ２活性を含む調製物によるＳｅｒ４２２に相当する残基のリン酸化はＰ
ｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３に依存し得る。このようにin vivoではＳｅｒ４
２２に相当する残基にリン酸化はＰｔｄＩｎｓ３−キナーゼの活性に依存し得る
。
【００６２】 全長ヒトＳＧＫ１のＴｈｒ２５６に相当する残基におけるＳＧＫのリン酸化は
全長ヒトＳＧＫ１のＳｅｒ４２２に相当する残基にリン酸化に依存し得る。ある
いは、実施例１および５に記載されているようにセリン４２２がアスパラギン酸
残基で置換されているばらば例えばＰＤＫ１によるＴｈｒ２５６に相当する残基
にリン酸化は増強され得る。このようにＴｈｒ２５６のリン酸化は（すなわち増
長されるならば）Ｓｅｒ４２２に相当する残基がリン酸化されているか、または
アスパラギン酸残基で置換されている必要があると考えられる。
【００６３】 実施例５に論じられているように、ＳＧＫ２は残基Ｓｅｒ２７９および／また
はＳｅｒ３３４でリン酸化され得る。Ｓｅｒ２７９はＳＧＫ、例えばＳＧＫ２、
またはＰＫＢによってリン酸化され得る。ＳＧＫ、例えばＳＧＫ２、またはＰＫ
Ｂは例えばＰＤＫ１によるリン酸化によって活性化される必要があろう。Ｓｅｒ
３３４はＰＤＫ１によってリン酸化され得る。ＳＧＫ３は残基Ｓｅｒ７７および
／またはＳｅｒ７９においてリン酸化され得る。これらの残基はＳＧＫ、例えば
ＳＧＫ３、またはＰＫＢによってリン酸化され得る。ＳＧＫ、例えばＳＧＫ３、
またはＰＫＢは例えばＰＤＫ１によるリン酸化によって活性化される必要があろ
うが、ＳＧＫ３のＳｅｒ７７およびＳｅｒ７９のリン酸化はＰＤＫ１によるリン
酸化なしに起こり得る。
【００６４】 本発明のさらなる態様はＳＧＫの融合ポリペプチド、またはその変異体、断片
もしくは誘導体である。この融合ポリペプチドは例えばＳＧＫの断片またはその
変異体もしくは誘導体を含んでなり、ここでヒト全長ＳＧＫ１のＮ末端の約２０
個、３０個、４０個尾、５０個または６０個のアミノ酸に相当する残基が欠失し
ている。この融合ポリペプチドはさらにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
を含んでなり得る。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼはＳＧＫまたはその
断片、変異体もしくは誘導体のＮ末端またはＣ末端に融合させてもよく、例えば
実施例１および５に示されるようにＮ末端に融合させるのが好ましい。
【００６５】 この融合ポリペプチドはクロスチド（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ、実施例１参照
）のリン酸化に対して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％または
３０％のＳＧＫ、例えばＳＧＫ１酵素活性を有するのが特に好ましい。この融合
ポリペプチドはクロスチドのリン酸化に対して少なくとも５０％、好ましくは少
なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％のＳＧＫ酵素活性を有するこ
とがより好ましい。この融合ポリペプチドは全長ヒトＳＧＫ１のＴｈｒ２５６に
相当する残基および／またはＳｅｒ４２２に相当する残基を含んでなることが好
ましい。例えばそれが高い量で発現されるる、または容易に精製もしくは保存さ
れ得るならば高処理量スクリーニングをはじめとする応用には酵素活性の低い融
合ポリペプチドが有用であると考えられる。しかしながら酵素活性を欠いた融合
ポリペプチドも、例えば別のポリペプチドと相互作用させることで、または抗体
作製における抗原としてやはり有用であり、あるいはかかる変異体、融合体、誘
導体もしくは断片のリン酸化を測定してもよい。ＰＫＢα、ＰＫＣδ、ＰＫＣζ
、ｐ７０ Ｓ６キナーゼ、ＭＳＫ１およびＭＳＫ２の融合体はＳＧＫの総てまた
は一部を含まない限りは本発明のポリペプチドではないと考えられる。
【００６６】 本発明のさらなる態様は、全長ヒトＳＧＫ１のセリン４２２に相当する残基が
置換され（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸またはアラニン残基により）か
つ／または全長ヒトＳＧＫ１のトレオニン２５６に相当する残基が置換されてい
る（例えばアラニン残基により）、かつ／または全長ヒトＳＧＫ１のリシン１２
７に相当する残基が置換されている（例えばアラニン残基により）ヒトＳＧＫの
アミノ酸配列、またはその断片、変異体、誘導体もしくは融合体を含んでなるポ
リペプチドである。全長ヒトＳＧＫ１のリシン１２７に相当する残基はセリン４
２２に相当する残基に関して上記されたものと同様にして同定でき、これはＡＴ
Ｐ結合部位にあると考えられる。全長ヒトＳＧＫ１のセリン４２２に相当する残
基は負電荷を有し得る残基（例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸残基）で
置換されていてもよく、これはセリン４２２のリン酸化の作用を模倣し得る。あ
るいは、全長ヒトＳＧＫ１のセリン４２２に相当する残基はリン酸化され得ず、
負電荷を有し得ない残基、例えばアラニンで置換されていてもよく、セリンまた
はトレオニンと同じ容積のものが好ましい。全長ヒトＳＧＫ１のトレオニン２５
６に相当する残基も同様に負電荷を有し得る残基（例えばアスパラギン酸または
グルタミン酸残基）で、またはリン酸化され得ず、負電荷を有し得ない残基、例
えばアラニンで置換されていてもよく、セリンまたはトレオニンと同じ容積のも
のが好ましい。全長ヒトＳＧＫ１のリシン１２７に相当する残基は正電荷を有し
得ない残基、例えばアラニン残基で置換されていてもよい。
【００６７】 全長ヒトＳＧＫ１のセリン４２２に相当する残基はアスパラギン酸残基で置換
され、かつ、全長ヒトＳＧＫ１のトレオニン２５６およびリシン１２７に相当す
る残基は変異していない、すなわちそれぞれトレオニンおよびリシンであるのが
好ましい。全長ヒトＳＧＫ１のＮ末端の２０個、３０個、４０個、５０個または
６０個のアミノ酸に相当するアミノ酸が存在しない、すなわちＳＧＫ１、ＳＧＫ
２αまたはＳＧＫ３に関して欠損があるのがさらの好ましい。ヒトＳＧＫ２αが
全長ヒトＳＧＫ１のＮ末端の６０個のアミノ酸に相当するアミノ酸配列を有して
ないと考えられる。これは細胞成分との相互作用がその他のＳＧＫ、例えばＳＧ
Ｋ１、ＳＧＫ２βまたはＳＧＫ３に対するものとヒトＳＧＫ２αに対するものが
同じでない結果を有すると考えられる。
【００６８】 ＳＧＫ２はＳｅｒ２７９およびＳｅｒ３３４ならびにＴｈｒ１９３においてリ
ン酸化され得る。このように、代わりにまたはそれに加えて全長ＳＧＫ２のＳｅ
ｒ２７９および／またはＳｅｒ３３４に相当する残基が負電荷を有し得る残基（
例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸残基）で、またはリン酸化され得ず、
負電荷を有し得ず、好ましくはセリンまたはトレオニンと同じ容積である残基、
例えばアラニンで置換されているのが好ましい。
【００６９】 ＳＧＫ３はＳｅｒ７７およびＳｅｒ７９においてリン酸化され得る。このよう
に代わりに、またはそれに加えて全長ＳＧＫ３のＳｅｒ７７および／またはＳｅ
ｒ７９に相当する残基が負電荷を有し得る残基（例えばアスパラギン酸またはグ
ルタミン酸残基）で、またはリン酸化され得ず、負電荷を有し得ず、好ましくは
セリンまたはトレオニンと同じ容積である残基、例えばアラニンで置換されてい
るのが好ましい。
【００７０】 Ｓｅｒ３３４におけるＳＧＫ２のリン酸化、あるいはＳｅｒ７７および／また
はＳｅｒ７９におけるＳＧＫ３のリン酸化は活性または例えばＳＧＫ２もしくは
ＳＧＫ３の細胞内の局在を調節すると考えられる。
【００７１】 全長ヒトＳＧＫ１のトレオニン２５６に相当する残基がアラニン残基で置換さ
れ、かつ／または全長ＳＧＫ１のリシン１２７に相当する残基がアラニン残基で
置換されているヒトＳＧＫのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、またはそ
の断片、変異体、誘導体もしくは融合体はリン酸化により活性化され得ず、これ
らはそれぞれかつ／またはタンパク質キナーゼ活性を欠き、従って本発明のスク
リーニング法には有用でないと考えられる。
【００７２】 本発明のさらなる態様は本発明のポリペプチドをコードする、例えばＳＧＫ２
もしくはＳＧＫ３をコードする、あるいはＳＧＫ２もしくはＳＧＫ３の融合体の
変異体、断片、誘導体、あるいはその変異体、断片もしくは誘導体の融合物をコ
ードするポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチド変異体に関する好まし
いものおよび例外は、以下の発現配列タグ（ＥＳＴ）も除かれること以外は本発
明の第１の態様と同じである： このポリヌクレオチドは組換えポリヌクレオチドであってもよい。以下の発現
配列タグ（ＥＳＴ）は除かれる： ＡＡ１３０８２８(IMAGE Consortium, St Louis, MO, USA)；ＡＩ３８６３６
２；ＡＡ７９０３７０：ＡＡ１３８６６３；ＡＡ２１９１６６（ＳＧＫ２に関連
）；ＡＡ２１９１６６（ＳＧＫ３に関連）。
【００７３】 ＥＳＴは総て実施例１および５に記載のようにＧｅｎｂａｎｋ受託番号によっ
て確認される。
【００７４】 このポリヌクレオチドは哺乳類／真核細胞での複製および／またはポリヌクレ
オチドの発現に好適なベクターであればよい。
【００７５】 本発明のなおさらなる態様は本発明のポリペプチドを発現するのに好適な組換
えポリヌクレオチドである。上記に挙げたＥＳＴはいずれも上記で定義されたポ
リヌクレオチドであるとは考えられないが、誤解を避けるため、上記で除かれた
ＥＳＴは本発明の本態様からさらに除かれる。
【００７６】 このポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドはＤＮＡであってもＲＮ
Ａであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。ポリヌクレオチドはそのコード
配列にイントロンを含んでもよいし含まなくともよく、好ましくはこのポリヌク
レオチドはｃＤＮＡであるか、またはｃＤＮＡを含んでなる。
【００７７】 １つの好ましい態様では、このポリヌクレオチドは下記のヌクレオチド配列ま
たはその変異体、断片、融合体または誘導体を含む。
【化９】 または
【化１０】 第１のヌクレオチド配列はＳＧＫ２αをコードし、第２のものはＳＧＫ２βを
コードする。ヌクレオチド配列は適切なオープンリーディングフレームの翻訳と
ともに図１に示されている。
【００７８】 もう１つの好ましい態様では、このポリヌクレオチドはヌクレオチド配列また
はその変異体、断片、融合体または誘導体を含む。
【化１１】 このヌクレオチド配列はＳＧＫ３をコードし、適切なオープンリーディングフ
レームの翻訳とともに図２に示されている。
【００７９】 引用されることにより本明細書の一部とされるBotstein and Shortle, "Strat
egies and Applications of In Vitro Mutagenesis," Science, 229: 193-210 (
1985)に記載のように、位置指定突然変異誘発またはその他の技術を用いて置換
、挿入、欠失および転座などの単一または複数の突然変異を作り出すことができ
る。例えば実施例１に記載のように当業者に十分公知のポリメラーゼ連鎖反応に
基づく位置指定突然変異誘発法を用いてもよい。
【００８０】 「発現に好適な」とはそのポリペプチドが翻訳されてポリペプチド、例えばＲ
ＮＡとなり得る、または本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（
好ましくはＤＮＡ）がペプチドなどの発現ベクターに発現のために適当な方向で
正しい読み取り枠に挿入されているポリヌクレオチドであることを意味する。こ
のポリヌクレオチドはいずれかの所望の宿主によって認識される適当な転写およ
び翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結してもよく、かかる制御を発現ベクター
に組み込めばよい。
【００８１】 哺乳類／真核細胞での複製に好適なベクターの特性は当業者に十分公知であり
、以下に例が示されている。ベクター原核細胞と真核細胞の双方における複製に
好適であると考えられる。
【００８２】 ポリヌクレオチド、特にＤＮＡを例えば相補的付着端によってベクターに機能
し得る形で連結するために種々の方法が開発されている。好適な方法はSambrook
et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。
【００８３】 本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを改変する望ましい方法としては、
Saiki et al (1988) Science 239, 487-491により開示されているポリメラーゼ
連鎖反応の使用がある。この方法は、例えば好適な制限部位に操作を施すことに
よって好適なベクターにＤＮＡを導入するのに用いられるか、または当技術分野
で公知のその他の有用な方法でＤＮＡを改変するのに用いてもよい。
【００８４】 この方法において酵素的に増幅されるＤＮＡはそれ自身増幅されたＤＮＡに組
み込まれた２つの特異的プライマーによってフランクされている。これらの特異
的プライマーは当技術分野で公知の方法を用いて発現ベクターへクローニングす
るのに使用できる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでいてよい。
【００８５】 次ぎに、好適な宿主内でＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合にはＲ
ＮＡ）を発現させて本発明の化合物を含んでなるポリペプチドを生産する。この
ように本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡは、本明細書
に含まれる技術の点で適宜改変された公知の技術に従って使用して発現ベクター
を構築すればよく、次ぎにこれを用いて本発明のポリペプチドの発現および産生
のために適当な宿主細胞を形質転換する。かかる技術には１９８９年４月３日に
Rutter et alに対して発行された米国特許第４，４４０，８５９号、１９８５年
７月２３日にWeissmanに対して発行された同第４，５３０，９０１号、１９８６
年４月１５日にCrowlに対して発行された同第４，５８２，８００号、１９８７
年６月３０日にMaek et alに対して発行された同第４，６７７，０６３号、１９
８７年７月７日にGoeddelに対して発行された同第４，６７８，７５１号、１９
８７年１１月３日にItakura et alに対して発行された同第４，７０４，３６２
号、１９８７年１２月１日にMurrayに対して発行された同第４，７１０，４６３
号、１９８８年７月１２日にToole, Jr. et alに対して発行された同第４，７５
７，００６号、１９８８年８月２３日にGoeddel et alに対して発行された同第
４，７６６，０７５号、および１９８９年３月７日にStalkerに対して発行され
た同第４，８１０，６４８号に記載のものが含まれる。なお、これらは総て引用
することにより本明細書の一部とされる。
【００８６】 本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡ（またはレトロウ
イルスの場合にはＲＮＡ）は適当な宿主に導入するためのその他の多様なＤＮＡ
配列に連結すればよい。相手のＤＮＡは宿主の性質、宿主へのＤＮＡの導入方法
、およびエピソームとしての維持か組み込みのいずれが望ましいのかによって異
なる。
【００８７】 一般に、ＤＮＡはプラスミドなどの発現ベクターに発現のために適切な方向で
正しい読み取り枠に挿入される。要すればＤＮＡは所望の宿主によって認識され
る適当な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結してもよいが、かかる
制御は一般に発現ベクターにおいて得られる。次ぎにこのベクターを標準的な技
術によって宿主に導入する。一般に必ずしも総てではないが宿主はこのベクター
によって形質転換される。従って形質転換した宿主細胞を選択する必要がある。
１つの選択技術は抗生物質耐性など形質転換細胞における選択可能な性質をコー
ドするＤＮＡ配列を必要な制御エレメントとともに発現ベクターに導入すること
である。あるいは、かかる選択可能な性質に関する遺伝子は所望の宿主細胞を同
時形質転換するのに用いられるもう一方のベクターにあってもよい。
【００８８】 本発明の組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞を次ぎにポリペプチド
を発現させるため本明細書に開示される教示の点で当業者に公知の十分な時間、
適当な条件下で培養した後、そのポリペプチドを回収する。
【００８９】 実施例１または実施例５に記載のような宿主細胞、例えば２９３細胞などの哺
乳類細胞は例えば過酸化水素のＩＧＦ−１を用いて刺激し、こうして宿主細胞中
でＳＧＫポリペプチドがリン酸化および／または活性化されると考えられる。次
ぎに活性化されたＳＧＫポリペプチドを要すれば例えば実施例１に記載のように
ホスファターゼ阻害剤、例えばミクロシスチンの存在下で回収する。実施例１に
記載のように回収にはグルタチオン−セファロース上で精製が必要である。
【００９０】 ２９３細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）１
２３０１ Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776カタログ参照番号
ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３から得られるヒト形質転換胎児腎一次細胞である。
【００９１】 細菌（例えば大腸菌(E. coli)および枯草菌(Bacillus subtilis)、酵母（例え
ばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)）、糸状菌（例えば
コウジカビ属(Aspergillus)）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞をはじめ多
くの発現系が知られている。
【００９２】 これらのベクターにはたとえそのベクターが他の非原核細胞種での発現に用い
られるとしても、原核細胞の複製のためのＣｏｌＥ１ ｏｒｉなどの真核レプリ
コンが含まれる。またこれらのベクターにはそれで形質転換された大腸菌などの
細菌宿主細胞中で遺伝子の発現（転写および翻訳）を命令し得る原核プロモータ
ーなどの適当なプロモーターが含まれる。
【００９３】 プロモーターはＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にし、転写を起こさせるＤＮ
Ａ配列によりなる発現制御エレメントである。例としての細菌宿主に適合したプ
ロモーター配列は典型的には本発明のＤＮＡセグメントの挿入のための便宜な制
限部位を含むプラスミドベクター中の提供される。
【００９４】 典型的な原核ベクタープラスミドとしてはBiorad Laboratories(Richmond, CA
, USA)から入手できるｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２
９、ならびにPharmacia, Piscataway, NJ, USAから入手できるｐＴｒｃ９９Ａお
よびｐＫＫ２２３−３がある。
【００９５】 典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドとしてはPharmacia, Piscataway, NJ,
USAから入手できるｐＳＶＬがある。このベクターはクローン化された遺伝子の
発現を駆動するためにＳＶ４０後期プロモーターを用いるが、ＣＯＳ−１細胞な
どのＴ抗原産生細胞で最も高いレベルの発現が見られる。
【００９６】 誘導性哺乳類発現ベクターの例としてはこれもPharmaciaから入手できるｐＭ
ＳＧがある。このベクターはクローン化された遺伝子の発現を駆動するためのマ
ウス乳癌ウイルスの長い末端反復の糖質コルチコイド誘導プロモーターを用いる
。
【００９７】 有用な酵母プラスミドベクターとしてはｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４
１３−４１６があり、一般にStratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037
, USAから入手できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５
およびｐＲＳ４０６は酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母選択マ
ーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組み込んである。プラス
ミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐｓ）である。
【００９８】 本発明はまた本発明のポリヌクレオチドベクター構築物で形質転換された宿主
細胞に関する。この宿主細胞は原核細胞か真核細胞のいずれかであり得る。細菌
細胞は好ましい原核宿主細胞であり、典型的には例えばBethesda Resarch Labor
atories INc., Bethesda, MD, USAから入手できる大腸菌ＤＨ５株およびRockvil
le, MD, USAのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）か
ら入手できるＲＲ１（ＡＴＣＣ３１３４３）などの大腸菌株がある。好ましい真
核宿主細胞としては酵母、昆虫および哺乳類細胞が挙げられ、マウス、ラット、
サルまたはヒト繊維芽細胞系統に由来するものなどの脊椎動物細胞が好ましい。
酵母宿主細胞としてはＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１が挙げら
れ、これらは一般ににStratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA
から入手できる。好ましい哺乳類宿主細胞としてはヒト胎児腎２９３細胞（実施
例１参照）、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手できるチャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手できるＮＩＨスイ
ス、マウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、およびＡＴＣＣからＣＲＬ１６５０として入
手できるサル腎由来ＣＯＳ−１細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞としてはバ
キュウロウイルス発現ベクターでトランスフェクトされ得るＳｆ９細胞がある。
【００９９】 本発明のＤＮＡ構築物による適当な宿主細胞の形質転換は典型的には用いられ
るベクターの種類によって異なる十分公知の方法によって達成される。原核宿主
細胞の形質転換については、例えばCohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 69, 2110およびSambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laborator
y Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYを参照。
酵母細胞の形質転換はSherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A La
boratory Manual, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。Beggs (1978) Na
ture 275, 104-109の方法もまた有用である。脊椎動物細胞については、かかる
細胞のトランスフェクションに有用な試薬、例えばリン酸カルシウムおよびＤＥ
ＡＥ−デキストランまたはリポソーム製剤はStratagene Cloning Systemsまたは
Life Techmologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USAから入手できる。
【０１００】 エレクトロポレーションもまた細胞を形質転換および／またはトランスフェク
トするのに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞および脊椎動物細胞を形
質転換するため当技術分野で十分公知である。
【０１０１】 例えば、多くの細菌種が引用することにより本明細書の一部とされるuchansky
et al (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646に記載の方法によって形質転換され
得る。最大数の形質転換体が２５：ＦＤにて６２５０Ｖ／ｃｍを用いる２．５Ｘ
【０１０２】 ＰＥＢに懸濁したＤＮＡ−細胞混合物エレクトロポレーションの後に一貫して
回収される。
【０１０３】 エレクトロポレーションによる酵母の形質転換法はBecker & Guarente (1990)
Methods Enzymol. 194, 182に開示されている。
【０１０４】 上手く形質転換された細胞、すなわち本発明のＤＮＡ構築物を含む細胞は十分
公知の技術によって同定できる。例えば本発明の発現構築物の導入から得られた
細胞は増殖させて本発明のポリペプチドを産生させることができる。細胞を回収
して溶解し、Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503またはBerent et al (198
5) Biotech, 3, 208によって記載されているもののような方法を用いてそれらの
ＤＮＡ構築物をＤＮＡの存在に関して調べればよい。あるいは、上清中のタンパ
ク質の存在を以下に記載の抗体を用いて検出してもよい。
【０１０５】 組換えＤＮＡの存在を直接アッセイすることに加え、組換えＤＮＡがタンパク
質の発現を命令し得る場合には形質転換の成功は十分公知の免疫学的方法によっ
て確認できる。例えば、発現ベクターで上手く形質転換された細胞は適当な抗原
性を示すタンパク質を産生する。形質転換されたと考えられる細胞のサンプルを
回収し、適当な抗体を用いてタンパク質をアッセイすればよい。
【０１０６】 このように形質転換宿主細胞自身に加え、本発明はまた栄養培地中のそれらの
細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローンとしてホモの状態）培養物
、またはモノクローナル培養物に由来する培養物も意図する。
【０１０７】 本発明のさらなる態様は本発明のポリペプチドを作製する方法を提供し、その
方法は組換えポリヌクレオチドたはそのポリペプチドをコードする複製可能なベ
クターを含んでなる宿主細胞を培養し、その宿主細胞からポリペプチドを単離す
ることを含む。宿主細胞を培養して組換えタンパク質を単離する方法は当技術分
野で十分公知である。
【０１０８】 本発明のなおさらなる態様は本発明のポリペプチドを作製および活性化する方
法を提供し、その方法は組換えポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドをコー
ドする複製可能なベクターを含んでなる宿主細胞、好ましくは真核細胞を培養し
、例えばＩＧＦ−１および／または過酸化水素で細胞を刺激し、その宿主細胞か
らポリペプチドを単離することを含む。宿主細胞を培養して組換えタンパク質を
単離する方法は当技術分野で十分公知である。宿主細胞は例えばＩＧＦ−１およ
び／または過酸化水素によって刺激される哺乳類細胞、例えば２９３細胞であっ
てもよい。
【０１０９】 本発明のさらなる態様は本発明の上記方法によって得られるポリペプチドであ
る。
【０１１０】 本発明のなおさらなる態様はＳＧＫの活性を調整する化合物を同定する方法で
あって、ここでは活性化されたＳＧＫが用いられる。 本発明のさらなる態様は薬剤様化合物または薬剤様化合物の開発のためのリー
ド化合物のスクリーニングアッセイにおける活性化ＳＧＫの使用である。薬剤様
化合物または薬剤様化合物の開発のためのリード化合物には医薬上有用な化合物
および医薬上有用な化合物の開発に有用な化合物が含まれると考えられる。かか
るスクリーニングアッセイの例としては以下に記載の本発明の方法が挙げられる
。
【０１１１】 本発明のさらなる態様はＳＧＫの活性を調節する化合物（上記で定義）を同定
する方法であり、その方法は化合物とＳＧＫとを接触させ、そのポリペプチドの
活性が化合物の不在下でのＳＧＫの活性と比較して変化するかどうかを調べるこ
とを含んでなり、ＳＧＫの活性が、好適なリン酸供与体であるコンセンサス配列
（Ａｒｇ／Ｌｙｓ；好ましくはＡｒｇ）−Ｘ−（Ｘ／Ａｒｇ）−Ｘ−Ｘ−（Ｓｅ
ｒ／Ｔｈｒ）−Ｚ）（ここで、Ｘはいずれかのアミノ酸を示し、Ｘ／Ａｒｇはい
ずれかのアミノ酸を示し（好ましくはアルギニン）、かつ、Ｚはアミノ酸残基が
好ましくは疎水性残基であるということを示す）に相当するアミノ酸配列を含ん
でなるポリペプチドの存在下でＳＧＫによるリン酸化を測定することによって測
定される。このポリペプチドはクロスチドまたは表１または表２に記載のその他
の好適なポリペプチド、または好ましくはＳＧＫの生理学的基質（ＧＳＫ３であ
ってもよい）であってよい。ＳＧＫ２およびＳＧＫ３は自己リン酸化し得ると考
えられる。特にＳＧＫ２はＳｅｒ２７９を取り巻く上記コンセンサス配列に相当
する配列を含んでなり、従ってこのポリペプチドは、ＳＧＫ２またはＳＧＫ３、
あるいは実施例１に記載のように可能性のある自己リン酸化部位、すなわちＳＧ
Ｋ２のＳｅｒ２７９、またはＳＧＫ３のＳｅｒ７７もしくはＳｅｒ７９を含むい
ずれかの断片であってよい。
【０１１２】 本発明の上記態様に関して記載されるように、ポリペプチドのリン酸化が起こ
り得る本発明の方法では好適なリン酸供与体の存在が必要とされると考えられる
。好適なリン酸供与体は当業者に公知であり、実施例１に記載されるように例え
ばマグネシウム塩としてのＡＴＰ（ＭｇＡＴＰ）が挙げられる。
【０１１３】 本発明の少なくとも上記３つの態様については、ＳＧＫが全長ヒトＳＧＫまた
はＮ末端切断型ＳＧＫ（例えば全長ヒトＳＧＫ、例えば全長ヒトＳＧＫ１の２０
個、３０個、４０個、５０個または６０個のアミノ酸欠失していてよい、例えば
ΔＮ−ＳＧＫ（６１−４３１））または全長ヒトＳＧＫの融合体（好ましくはＧ
ＳＴ融合体）または全長ヒトＳＧＫ１のセリン４２２に相当する残基がアスパラ
ギン酸残基で置換され、全長ヒトＳＧＫ１のトレオニン２５６およびリシン１２
７に相当する残基が変異していない、すなわちぞれぞれトレオニンおよびリシン
のままであるＮ末端切断型ＳＧＫであることが好ましい。
【０１１４】 ＳＧＫは本発明の方法に従ってリン酸化により活性化されることが好ましい。
ＳＧＫが全長ヒトＳＧＫ１のセリン４２２に相当する残基がアスパラギン酸残基
で置換されているＳＧＫ、例えば上記の好ましいＳＧＫであるならば、この残基
はリン酸化されないが、ＳＧＫは全長ヒトＳＧＫ１のトレオニン２５６に相当す
る残基（好ましくはトレオニン）のリン酸化によって活性化され得ると考えられ
る。
【０１１５】 ＳＧＫは細胞において、例えばＩＧＦ−１または過酸化水素で細胞を刺激する
ことによってリン酸化および／または活性化され得ると考えられる。この細胞は
真核細胞、好ましくは組換えＳＧＫが発現される哺乳類の例えば２９３細胞であ
ってよい。ＳＧＫは実施例１に記載のように、例えば上記および実施例１および
５に記載のようにグルタチオンセファロース（ＧＳＴ−ＳＧＫ融合ポリペプチド
に関して）を用いて回収および精製すればよい。
【０１１６】 上記方法の態様では、この化合物は本発明のポリペプチドと相互作用して、例
えばＰＤＫ１および／またはＰＤＫ２活性を含む調製物またはその他の活性化タ
ンパク質キナーゼによりその活性化を阻害または増強することによって作用し得
る。
【０１１７】 in vivoでポリペプチドの活性を調整し得る化合物を同定することが望ましい
ことが理解されよう。従って本方法に用いられる試薬および条件はＳＧＫとその
活性化タンパク質キナーゼとの間の相互作用がin vivoにおけるヒトＳＧＫとそ
の活性化タンパク質キナーゼ（これはＰＤＫ１およびＰＤＫ２活性を有するポリ
ペプチドであり得る）との間のものと実質的に同じとなるように選択すればよい
。このように本アッセイで用いられる活性化タンパク質キナーゼはＳＧＫの生理
学的活性化タンパク質キナーゼ、例えばＰＤＫ１またはその機能的同等物、およ
び／またはそのＳＧＫと機能的同等物との間の相互作用がヒトＳＧＫとその生理
学的活性化タンパク質キナーゼとの間のものと実質的に同じとなるＰＤＫ２活性
を含む調製物であるのが好ましい。この化合物はＳＧＫに結合できるか、または
活性化タンパク質キナーゼに結合できると考えられる。
【０１１８】 ＳＧＫの生理学的活性化タンパク質キナーゼ、例えばＰＤＫ１の機能的同等物
とは生理学的活性化タンパク質キナーゼ、例えばＰＤＫ１と実質的に同じ基質特
異性を有する（すなわちコンセンサス配列Ｂ−Ｔ−Ｆ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−（Ｐ／Ｉ）
−（Ｄ／Ｅ）−Ｙ−（Ｌ／Ｉ／Ｍ）−Ａ−Ｐ−Ｅ（ここでＢは塩基性残基である
）の下線の残基をリン酸化し、かつ／またはその生理学的活性化タンパク質キナ
ーゼと同じ残基でＳＧＫをリン酸化し得る）タンパク質キナーゼを意味する。
【０１１９】 in vivoにおいてポリペプチドの活性を調整し得る化合物を同定するのが好ま
しいことが理解されよう。従って本方法で用いられる試薬および条件はＳＧＫと
その基質の間の相互作用がin vivoにおけるヒトＳＧＫとその基質の間のものと
実質的に同じとなるように選択すればよいと理解されよう。従って本アッセイに
用いられる基質はＳＧＫの生理学的基質またはその断片、変異体、誘導体もしく
は融合体、あるいはＳＧＫとその断片、変異体、誘導体もしくは融合体との相互
作用がヒトＳＧＫとその生理学的基質の間のものと実質的に同じその断片、変異
体もしくは誘導体の融合物（ＳＧＫに関して上記で示された定義と同じように定
義される）であるのが好ましい。ＳＧＫ、例えばＳＧＫ１の基質の一例としてＳ
ＧＫ３がある。
【０１２０】 ＳＧＫの生理学的基質には、実施例１でＰＫＢの生理学的基質と呼ばれる、例
えば過剰発現研究で同定される基質が含まれる。ＳＧＫの活性化および基質特異
性、ならびにＰＫＢの活性化および基質特異性との類似性に関して本明細書に示
される知見は、これまでにＰＫＢの生理学的基質と同定されている基質がさらに
、またはそうではなくＳＧＫ、例えばＳＧＫ１、ＳＧＫ２および／またはＳＧＫ
３の生理学的基質であり得ることを示唆していると考えられる。
【０１２１】 ＰＫＢはグルコースおよびアミノ酸の取り込み刺激、グリコーゲンおよびタン
パク質合成、心筋の解糖（［７、８］に概説）ならびに特異的遺伝子の転写調節
［９、１０］をはじめとするいくつかのインスリン作用を媒介すると考えられて
いる。第二に、著しい割合の卵巣癌および膵臓癌でＰＫＢβイソ型が［１１、１
２］、またいくつかの乳癌ではＰＫＢαイソ型が過剰発現する［２］。ＰＫＢま
たはＳＧＫ様々な経路で誘導されるアポトーシスから細胞を保護する生存シグナ
ルを与え得る（［８、１３］に概説）。従って遺伝子増幅およびその他のメカニ
ズムによるＰＫＢまたはＳＧＫの活性化は細胞内の生存シグナルの不在下で活動
できる悪性腫瘍の形成の一因となる可能性がある。
【０１２２】 ＰＫＢはＡｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ、−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−配列
にあるセリンおよびトレオニン残基でタンパク質およびペプチドをリン酸化する
［１４］。インスリンシグナル伝達においてＰＫＢの２つの生理学的基質はタン
パク質キナーゼ−グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）［１５、１
６］およびホスホフルクトキナーゼ−２の心臓イソ型（ＰＦＫ２）［８、１７］
であると考えられる。ＰＫＢによるリン酸化はＧＳＫ３活性を阻害してグリコー
ゲンシンターゼおよびタンパク質合成阻害因子ｅＩＦ２Ｂの脱リン酸化および活
性化をもたらす［１８］。発明者らは本明細書でＳＧＫはin vitroでＰＫＢ同様
ＧＳＫ３の不活性化に有効であることを示す。しかしながら適当な組織で検出さ
れたＰＫＢおよびＳＧＫの相対的レベルをはじめとする要因は、ＰＫＢはＳＧＫ
よりＧＳＫの調節により重要である可能性を示唆するものである。
【０１２３】 グリコーゲンシンターゼおよびタンパク質合成阻害因子ｅＩＦ２Ｂの脱リン酸
化および活性化［１８］はそれぞれグリコーゲン合成およびタンパク質合成のイ
ンスリン誘導性の刺激に帰因し得る。ＰＫＢは心臓のＰＦＫ２を活性化し、この
ことは心臓におけるインスリン誘導性の解糖刺激の基礎となると考えられる。ア
ポトーシスからの細胞の保護において、ＢＡＤはＰＫＢの生理学的基質の１つで
あると考えられる（従ってＳＧＫの生理学的基質でもあり得る）。このタンパク
質はその脱リン酸型でＢｃｌファミリーに属するＢｃｌＸＬと相互作用し、それ
によりいくつかの細胞でアポトーシスを誘導する。しかしながらＰＫＢはＢＡＤ
をＳｅｒ１３６でリン酸化する場合には、それはＢｃｌＸＬから解離し、代わり
に１４−３−３タンパク質と相互作用し、アポトーシスが阻害される［１９］。
従ってアポトーシスの制御に関わるポリペプチドＢＡＤはＳＧＫ、例えばＳＧＫ
１、２および／または３の生理学的基質であり得る。
【０１２４】 １つの態様では、この化合物はＳＧＫポリペプチドの活性を低下させる。例え
ばこの化合物は実質的に可逆的にまたは実質的に不可逆的にこのポリペプチドの
活性部位と結合し得る。さらなる例では、この化合物は活性部位でないポリペプ
チドの一部と結合してポリペプチドと基質の結合と相互作用し得る。なおさらな
る実施例では、この化合物はそのポリペプチドの一部と結合してアロステリック
作用によってポリペプチドの活性を低下させ得る。このアロステリック作用は、
例えばＰＤＫ１および／またはＰＤＫ２（またはＰＤＫ２活性を含む調製物）な
どの「上流アクチベーター」によるポリペプチドの活性化においてそのポリペプ
チドの活性の天然の調節に関わるアロステリック作用であり得る。
【０１２５】 さらなる態様では、この化合物はそのポリペプチドの活性を増強する。例えば
この化合物は活性部位ではないポリペプチドの一部と結合してそのポリペプチド
とその基質の結合を助けることができる。なおさらなる実施例では、この化合物
はそのポリペプチドの一部と結合してアロステリック作用によりそのポリペプチ
ドの活性を増強し得る。このアロステリック作用は、例えばＰＤＫ１および／ま
たはＰＤＫ２（またはＰＤＫ２活性を含む調製物）などの「上流アクチベーター
」によるポリペプチドの活性化においてそのポリペプチドの活性の天然の調節に
関わるアロステリック作用であり得る。
【０１２６】 便宜には本方法は実施例１に記載のようにＳＧＫがクロスチドをリン酸化する
ということを用いるが、好適ないずれかの基質、例えばＳＧＫの生理学的基質を
使用してもよい。例えばクロスチドのリン酸化は当業者に十分公知の技術を用い
て測定すればよい。
【０１２７】 便宜には本方法は実施例１に記載のものと実質的に同様のアッセイを用いる。
実施例１では、ＳＧＫによるクロスチドのリン酸化が測定される。ＳＧＫは組換
えＳＧＫであるのが好ましい。
【０１２８】 あるいは基質の活性の変化を測定してもよい。これは全細胞系で、または精製
または部分精製された成分を用いて行ってよい。従って基質のリン酸化は基質の
活性の変化を測定することで測定すればよいと考えられる。例えばこの基質はＧ
ＳＫ３であってよく、ＧＳＫ３のリン酸化は実施例１に記載のようにＧＳＫ３の
活性を測定することで測定すればよい。基質活性に対する化合物の作用は例えば
化合物を曝す場合には（１）基質をＳＧＫに曝した後、（２）基質をＳＧＫに曝
す前に、かつ／または（３）ＳＧＫに曝さずに基質の活性を測定することで決定
する必要があると考えられる。
【０１２９】 同様に、ＳＧＫの基質によって（直接的または間接的に）調節されるプロモー
ターから転写されるＲＮＡによってコードされているタンパク質の発現を測定し
てもよい。レプチンの発現はＰＫＢ(Baethel et al (1997) Endocrinol 183, 35
59-3562)および／またはＳＧＫによって作用を受け得る。脂肪組織におけるｏｂ
遺伝子の産物であるレプチンの発現はin vivoおよびvitroにおいてインスリンに
よって調節されることがこれまでに記載されている。ＰＫＢの構成的活性型はお
そらく非転写的メカニズムを介して３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞においてレプチンの
産生を誘導するものであった。従ってレプチンの発現はＰＫＢおよび／またはＳ
ＧＫによって制御され得る。
【０１３０】 ＩＧＦ−１結合タンパク質の発現はＰＫＢによって作用を受け得る(Cichy et
al (1998) J Biol Chem 273, 6482-6487)。ホスホエノールピルビン酸カルボキ
シキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）の発現もまたＰＫＢによって作用を受け得る(Sutherl
and et al (1998) J Biol Chem 273, 3198-3204)。このタンパク質はＳＧＫの基
質によって生理学的に調節されるものであるか、または当業者に十分公知のよう
に「リポーター」タンパク質であってもよい（すなわち組換え構築物を用いても
よい）。リポータータンパク質はその活性が容易にアッセイされ得るもの、例え
ばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼま
たはルシフェラーゼであってもよい（例えば、Tan et al (1996)参照）。
【０１３１】 本発明のなおさらなる態様は、上記で論じたＳＧＫの基質、好ましくは生理学
的基質（例えばＧＳＫ３またはＢＡＤであり得る）と結合し、ＳＧＫによるその
活性化および／またはリン酸化を増強か阻害するかのいずれかの化合物を同定す
る方法を提供し、その方法はその化合物が基質とＳＧＫとの相互作用を増強する
か阻害するかを調べる、あるいはその化合物がＳＧＫによる基質のリン酸化およ
び／または活性化を実質的に阻害するかどうかを調べることを含んでなる。
【０１３２】 好適なアッセイは上記のものと同様である。
【０１３３】 本発明のさらなる態様はポリペプチドと相互作用する、好ましくは上記で論じ
たＰＤＫ１などのポリペプチド、またはＰＤＫ２活性を有するポリペプチド（Ｐ
ＤＫ２活性を含む調製物として提供され得る）と生理学的に相互作用することに
よりＳＧＫの活性化を調整する（例えば阻害または増強する）化合物を同定する
方法であり、この方法は、化合物が（ａ）ＳＧＫと（ｂ）ＰＤＫ１、またはＰＤ
Ｋ２活性を含む調製物もしくはＰＤＫ１もしくはＰＤＫ２の機能的同等物などの
相互作用するポリペプチドとの間の相互作用を増強するか阻害するかを調べる、
あるいは化合物がＰＤＫ１、またはその機能的同等物またはＰＤＫ２活性を含む
調製物もしくはその機能的同等物などの相互作用するポリペプチドによるＳＧＫ
の活性化を調整する（例えば増強するまたは実質的遮断を含み阻害する）かどう
かを調べることを含んでなる。
【０１３４】 ＰＤＫ１の発現は実施例１に記載されており、ＰＤＫ１の配列を記載する参照
文献も示されている。
【０１３５】 本発明のなおさらなる態様は、活性化されたＳＧＫと相互作用するポリペプチ
ドを同定する方法を提供し、その方法は （１）（ａ）ＳＧＫと（ｂ）活性化されたＳＧＫと相互作用するポリペプチド
を含み得る組成物を接触させ、 （２）ＳＧＫおよびポリペプチドを含む複合体の存在を検出し、 （３）所望により、タンパク質キナーゼと結合したいずれものポリペプチドを
同定する ことを含んでなる。
【０１３６】 １つの態様では、その化合物は細胞に由来する材料を含んでなる。特にこれら
の細胞は以下のタイプのものから選択され得る：（１）たとえ刺激されたとして
もＳＧＫを発現しない細胞、（２）刺激に曝された後にＳＧＫを発現するが、そ
のように曝されなかった細胞、（３）刺激に曝された後のタイプ２の細胞および
（４）ＳＧＫを活性化する刺激に曝された後（例えば２９３細胞の過酸化水素ま
たはＩＧＦ−１への曝露）のタイプ３の細胞。タイプ１〜４のサブセットだけに
見られるポリペプチドが特に注目され、これをさらに同定すればよい。かかるポ
リペプチドはＳＧＫのアクチベーターであり得る。あるいはそれはＳＧＫのイン
アクチベーターであり得る。
【０１３７】 本方法は細胞内で、例えば当業者に十分公知の酵母ツー・ハイブリッド系を用
いて行えばよいと考えられる。この例では、上記の３種の細胞タイプに由来する
ｍＲＮＡからコピーされたｃＤＮＡが使用される。
【０１３８】 さらに、例えばＳＧＫの基質、例えばＳＧＫ１、ＳＧＫ２および／またはＳＧ
Ｋ３の基質を同定するにはＳＧＫ遺伝子が変更され、かつ／または組換えＳＧＫ
遺伝子が存在するトランスジェニック動物、例えば齧歯類、特にマウスが有用で
あると考えられる。各ＳＧＫ遺伝子が存在するトランスジェニック動物（例えば
少なくともＳＧＫ１、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３遺伝子が変更されているもの）は
特に有用であると考えられる。総てを含む１以上のＰＫＢ遺伝子もまた変更され
、かつ／または組換えＰＫＢ遺伝子が存在するトランスジェニック動物も有用で
あると考えられる。
【０１３９】 便宜には本発明の方法に用いられるＳＧＫは組換えＤＮＡ技術によって作製さ
れたもの、すなわち組換えＳＧＫである。同様にＰＤＫ1または本方法で用いら
れるその他の「上流アクチベーター」が組換えＤＮＡ技術によって作製されたも
のであることが好ましい。同様に必ずしも不可欠ではないが基質、例えばＧＳＫ
３またはクロスチドは当業者に公知の組換えＤＮＡ技術または自動合成技術によ
って作製するのが好ましい。あるいはＧＳＫ３はウサギ骨格筋から精製してもよ
い（実施例１およびそこに記載の参照文献を参照）。
【０１４０】 アッセイで用いる前にＳＧＫを活性化する必要があると考えられる。好ましい
態様では、実施例１および５に記載されるようにＳＧＫはin vitroにてポリペプ
チドをＰＤＫ１およびＭｇＡＴＰで処理することで活性化される。組換え体また
は内生ＳＧＫは細胞、例えば２９３細胞内で例えば実施例１および５に記載のよ
うにＩＧＦ−１または過酸化水素で細胞を刺激することで活性化され得る。この
ＳＧＫが本発明の方法に従って産生される組換えポリペプチドであれば特に好ま
しい。ＳＧＫが全長ヒトＡｇ形質転換１のセリン４２２に相当する残基がアスパ
ラギン酸残基で置換され、全長ヒトＳＧＫ１のトレオニン２５６およびリシン１
２７に相当する残基がそれぞれトレオニンおよびリシンのままであるＳＧＫであ
ればなおさらに好ましい。
【０１４１】 「好適な」とは本方法の化合物が、ＳＧＫまたはＳＧＫもしくはクロスチドも
しくはＳＧＫ３の生理学的基質またはその他の基質と実質的に同様の相互作用ま
たは活性を有するもの、あるいはＰＤＫ１のようにあり得るがアッセイにおいて
用いるのにより便宜な上流アクチベーターであることを意味するものとする。例
えば、ＳＧＫとＰＤＫ１の融合体は、その融合体を容易に精製させる部分を含ん
でいると考えられるので特に有用である。
【０１４２】 記載の方法は細胞において実施されると考えられる。「リポーター遺伝子」構
築物は本明細書の教示を用い当業者に公知の方法によって作製できる。例えばリ
ポーター遺伝子構築物はレプチン遺伝子プロモーター配列またはＩＧＦ−１結合
タンパク質遺伝子プロモーター配列またはその他のＰＫＢおよび／またはＳＧＫ
依存性プロモーター配列を用いて作製すればよい。この構築物はその親細胞系統
で公知の刺激に応答してレプチンが活性化され、かつ、内生ＳＧＫ遺伝子（およ
び所望によりＰＫＢ遺伝子）が不活性化されている細胞系統にＳＧＫ構築物をと
もに導入すればよい。あるいはリポーター遺伝子構築物はＳＧＫおよびＳＧＫの
基質が公知の刺激に応答して活性化される細胞系統に導入すればよい。リポータ
ー遺伝子の発現はＳＧＫの活性に依存するので化合物の作用は測定可能である。
さらなる例では、このリポーター遺伝子は細胞に致死的であってもよく、あるい
はまたその他の致死条件下で細胞を生存させるものであってもよい。次ぎに細胞
の生存は例えばＷＳＴ−１(Boehringer)の還元のようなミトコンドリア活性に関
する比色アッセイを用いて測定できる。ＷＳＴ−１はコハク酸デヒドロゲナーゼ
を介する受容電子に対して吸光度の変化を受けるフォルモサン色素である。さら
なる態様では酵母ツー・ハイブリッド系が用いられる。
【０１４３】 ＳＧＫと上記に定義された相互作用するポリペプチド、または適当な誘導体、
断片、融合体もしくは変異体との間の相互作用の増強または阻害はin vitroにて
生化学分野で十分公知の方法を用いて測定でき、これにはタンパク質間相互作用
をアッセイするのに使用できるいずれもの方法が含まれる。
【０１４４】 この相互作用はまた、当技術分野で十分公知であるように例えば酵母ツー・ハ
イブリッド系を用いて細胞内で測定できる。
【０１４５】 本発明はＳＧＫの活性またはその上流アクチベーターとの相互作用を調整する
、例えば増強するか阻害するかのいずれかに有用であり得る薬剤のスクリーニン
グアッセイを提供すると考えられる。本方法で同定される化合物はそれ自体薬剤
として有用であるか、またはより有効な化合物の設計および合成のためのリード
化合物を提供し得る。
【０１４６】 高処理量操作が可能なスクリーニングアッセイは特に好ましいと考えられる。
その例としては記載されている細胞に基づくアッセイおよびタンパク質−タンパ
ク質結合アッセイが挙げられる。さらなる例としては、実施例２に記載のような
ＳＰＡに基づく系（シンチレーション近接アッセイ）がある。
【０１４７】 この化合物は薬剤様化合物、または化合物を同定する上記方法の各々のための
薬剤様化合物の開発のためのリード化合物であり得る。これらの方法は当業者に
十分公知なように医薬化合物または薬剤の開発におけるスクリーニングアッセイ
として有用であると考えられる。
【０１４８】 「薬剤様化合物」（drug-like-compound）とは当業者に十分公知であり、医療
用途に、例えば薬剤中の有効成分として好適とする特徴を有する化合物を意味す
るものとする。従って例えば薬剤様化合物は有機化学の技術、好ましくはないが
分子生物学または生化学の技術によって合成され得る分子であってよく、好まし
くは５０００ダルトンより小さい水溶性の小分子である。薬剤様化合物はさらに
特定のタンパク質と選択的に相互作用する特徴を示し、バイオアベラビリティー
があり、かつ／または標的細胞膜を透過するが、これらの特徴は不可欠ではない
と考えられる。
【０１４９】 「リード化合物」（lead compound）も同様に当業者に十分公知であり、それ
自体薬剤として用いるには適当でないが（例えばその意図される標的に弱い効果
しかなかったり、その作用が非選択性であったり、不安定であったり、溶解度が
不十分であったり、合成が困難であったり、あるいはバイオアベラビリティーが
不十分であったりするため）、より望ましい特徴を有する他の化合物の設計の起
点となり得る化合物を意味するものとする。
【０１５０】 高処理量操作が可能となるスクリーニングアッセイが特に好ましいと考えられ
る。その例としては細胞に基づくアッセイおよびタンパク質−タンパク質結合ア
ッセイが挙げられる。ＳＰＡに基づく系（シンチレーション近接アッセイ; Amer
sham International）を使用してもよい。例えばシンチラントと基質ポリペプチ
ド、例えばクロスチドまたはクロスチドのアミノ酸配列を含んでなるペプチドと
を含んでなるビーズを作製すればよい。これらのビーズを３２Ｐ−または３３Ｐ
−γ−標識ＡＴＰ、ＳＧＫ（上記で定義）を含んでなるサンプルと、また試験化
合物と混合すればよい。便宜にはこれは９６ウェル形式で行う。次ぎにこのプレ
ートを好適なシンチレーションカウンターを用い、３２Ｐまたは３３Ｐ ＳＰＡ
アッセイに関して公知のパラメーターを用いて計数する。シンチラントに近接し
て存在する３２Ｐまたは３３Ｐだけを、すなわちビーズと結合しているクロスチ
ドと結合しているものだけを検出する。例えば基質ポリペプチドが抗体または抗
体フラグメントを介してシンチラントビーズに固定化されているかかるアッセイ
の変法を使用してもよい。
【０１５１】 ポリペプチド／ポリペプチド相互作用を検出するその他の方法としてはイオン
スプレー質量分析／ＨＰＬＣ法を伴う限外濾過またはその他の物理的および分析
的方法が挙げられる。例えば当業者に十分公知の蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲ
ＥＴ）法を用いてもよく、ここでは２つの蛍光標識物質の結合が互いに近接して
いる場合に蛍光標識の相互作用を測定することで測定すればよい。
【０１５２】 本発明のさらなる態様は例えば本発明のスクリーニング法といった方法を実施
するのに有用な製品キットである。かかるキットはＳＧＫ（上記で定義）、ＰＤ
Ｋ１もしくはその機能的同等物またはＰＤＫ２活性を含む調製物もしくはその機
能的同等物および／またはＳＧＫの基質、例えばクロスチドまたはＧＳＫ３また
はＢＡＤを含んでなってよい。
【０１５３】 本発明にさらなる態様は本発明の方法によって同定可能なまたは同定される化
合物である。
【０１５４】 本発明の化合物はＰＫＢ、例えばＰＫＢαまたはＰＤＫ１の活性または活性化
を調整しないことが好ましい。従ってＰＫＢ、例えばＰＫＢαまたはＰＤＫ１の
活性または活性化に対する、本発明のスクリーニング法によって同定されるいず
れかの化合物の作用を評価することが望ましいと考えられる。ＰＫＢの活性また
は活性化に対するいずれかの化合物の作用を評価する方法は当業者に公知であり
、それは上記でＳＧＫについてＳＧＫと同様に定義されたように、ＳＧＫまたは
適当な変異体、断片、誘導体もしくは融合体、あるいは適当な変異体、断片もし
くは誘導体の融合物の置換を有するＳＧＫの活性または活性化に対する化合物の
作用を評価することについて本明細書で記載された方法と同様であり得る。
【０１５５】 本発明のさらなる態様はＳＫＧの基質を同定する方法であり、ここではＳＧＫ
の活性を調整する、例えば阻害するがＰＫＢ、例えばＰＫＢβの活性を調整しな
い、例えば阻害しない化合物が用いられる。例えば、この方法は細胞内代謝に対
する、ＳＧＫを阻害するがＰＤＫ１は阻害しない化合物の作用を評価する方法で
あってよい。従って例えば、実施例１で論じられるように、ＰＫＢαの活性化に
よって媒介されると考えられるシグナル伝達に対するかかる化合物の作用を評価
してもよい。かかる方法は全細胞で行っても、部分的または半精製細胞成分に対
して行ってもよいと考えられる。あるいは、ＰＫＢ、例えばＰＫＢαの活性を調
整する、例えば阻害するが、ＳＧＫの活性は調節しない、例えば阻害しない化合
物を上記と同様にしてＳＧＫの基質を同定する方法に用いてもよい。
【０１５６】 本発明のなおさらなる態様は医療に用いられる本発明の方法によって同定可能
なまたは同定される化合物である。
【０１５７】 本発明のさらなる態様はＳＧＫ、例えＳＧＫ１、ＳＧＫおよび／またはＳＧＫ
３に活性の調整を必要とする患者の治療用医薬の製造における、本発明の方法に
よって同定可能なまたは同定される化合物の使用である。
【０１５８】 好ましくは患者は哺乳類である。さらに好ましくは患者はヒトである。
【０１５９】 ＳＧＫの活性を低下し得る化合物は癌の治療に有用であり得る。ＰＫＢおよび
／またはＳＧＫは種々の経路で誘導されるアポトーシスから細胞を保護する生存
シグナルを与え得る（［８、１３］に概説）。従ってかかる化合物はアポトーシ
スを助けると考えられる。ＳＧＫの活性の低下はアポトーシスを促進し、従って
癌の治療に有用であり得る。アポトーシスを助ける条件は有益であり、それはま
た炎症の消散も含む。
【０１６０】 ＳＧＫ２の活性の調整を必要とする患者は肝臓、腎臓および／または脳を侵す
疾病または症状を有すると考えられる。
【０１６１】 ＳＧＫの活性を増強し得る化合物は糖尿病または肥満の治療に有用であり、ア
ポトーシスを阻害するのに有用であると考えられる。ＰＫＢおよび／またはＳＧ
Ｋの活性の増強は上記で論じられたように高レベルのレプチンをもたらし、これ
が体重低下をもたらすと考えられ、従ってかかる化合物は体重低下をもたらす可
能性がある。例えばかかる化合物は細胞アポトーシスを抑制し、細胞損傷過程中
または過程後の細胞の生存を助ける。かかる化合物はアポトーシスが関与する疾
病の治療に有用であると考えられる。かかる疾病の例としては、限定されるもの
ではないが物理的（熱によるものを含む）組織損傷または虚血性疾患、例えば卒
中および心筋梗塞、神経傷害および心筋梗塞が挙げられる。従ってＳＧＫの活性
の調整を必要とする患者とは、癌もしくは糖尿病患者、またはアポトーシスの阻
害を必要とする患者、例えば組織損傷もしくは卒中をはじめとする虚血性傷害患
者であり得る。
【０１６２】 このように本発明のさらなる態様は虚血性疾患患者を治療する方法を提供し、
その方法は本発明のスクリーニング法によって同定可能な化合物の有効量を患者
誘導体に投与することを含んでなる。
【０１６３】 なおさらなる発明は患者の虚血性疾患を治療する医薬の製造における本発明の
スクリーニング法によって同定可能な化合物の使用を提供する。
【０１６４】 従って本発明のさらなる態様は虚血性疾患患者を治療する方法を提供し、その
方法は本発明のスクリーニング法によって同定可能な化合物の有効量を患者に投
与することを含んでなる。
【０１６５】 患者がアポトーシスの誘導を必要とする患者、例えば癌患者であれば、医薬の
調製に用いられる本発明の化合物がＳＧＫの活性を低下し得ることが好ましい。
患者が糖尿病患者またはアポトーシスの阻害を必要とする患者、例えば虚血性疾
患患者であれば、医薬の調製に用いられる本発明の化合物がＳＧＫの活性を増強
し得るのが好ましい。
【０１６６】 本発明の化合物はＳＧＫ１、ＳＧＫ２および／またはＳＧＫ３の活性を種々の
程度で調整し得ると考えられる。特定の用途に関して上記の形態のＳＧＫに対し
て特定の活性プロフィールを有する化合物を選択することが望ましいと考えられ
る。ＳＧＫ２ ｍＲＮＡは肝臓、腎臓、膵臓および脳で最も高いレベルで存在す
るが、ＳＧＫ１およびＳＧＫ３をコードするｍＲＮＡは試験した総ての組成物で
同等である。従って虚血性肝疾患を治療する医薬の調製に用いるには、ＳＧＫ２
の活性を増強し得る化合物を選択することが重要である。
【０１６７】 本発明の上記化合物またはそれらの製剤は経口および非経口（例えば皮下また
は筋肉内）注射をはじめいずれの便宜な方法によって投与してもよい。この治療
薬は単一用量からなっても一定時間にわたる複用量からなってもよい。
【０１６８】 本発明の化合物は単独で投与することもできるが、１以上の許容される担体と
ともに医薬製剤として提供するのが好ましい。担体は本発明の化合物と適合し、
かつその受容者に悪影響を及ぼさないという点で「許容」されるものでなければ
ならない。典型的にはこれらの担体は無菌かつ発熱物質を含まない水または生理
食塩水である。
【０１６９】 従って本発明はまた、本発明のスクリーニング法によって同定可能な化合物と
医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。
【０１７０】
【実施例】実施例１： ホスファチジルイノシチド３−キナーゼを活性化するアゴニストによるＳＧＫの 活性化はＰＤＫ１およびＰＤＫ２によって媒介される 要約： ３−ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ−１および２（ＰＤＫ
１、ＰＤＫ２）によるタンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）のＰｔｄＩｎｓ（３，４
，５）Ｐ３依存性活性化はＰｔｄＩｎｓ３−キナーゼを活性化するシグナルの作
用の媒介において重要な現象である。血清および糖質コルチコイド誘導性タンパ
ク質キナーゼ（ＳＧＫ）はＰＫＢと最も類似しており（触媒ドメインにおいて５
４％の同一性）、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３結合性プレクストリン相同（
ＰＨ）ドメインを欠くものの、ＰＤＫ１によって（Ｔｈｒ３０８）およびＰＤＫ
２によって（Ｓｅｒ４７３））リン酸化されるＰＫＢ中の残基は保持している。
本明細書では、本発明者らはＰＫＢ同様ＳＧＫは、２９３細胞がインスリン様増
殖因子−１（ＩＧＦ−１）で刺激されるかまたは過酸化水素に曝されるとＰｔｄ
Ｉｎｓ３−キナーゼＰ３依存性経路を介して活性化されるということを示してい
る。この発見に一致して、ＰＤＫ１はin vitroで、Ｔｈｒ２５６、すなわちＰＫ
ＢのＴｈｒ３０８に相当する残基をリン酸化することによりＳＧＫを活性化する
が、活性化の速度はＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の影響を受けない。しかし
ながら、in vitroでのＳＧＫのＰＤＫ１誘導性活性化はＳｅｒ４２２（ＰＫＢの
Ｓｅｒ４７３に相当する残基）のＡｓｐへの変異によって大幅に増強される。こ
の発見に一致して、２９３細胞において発現されるＳＧＫ［Ｓｅｒ４２２Ａｓｐ
］は刺激を受けていない細胞においてでさえもリン酸化によって完全に活性化さ
れており、この活性化はＰｔｄＩｎｓ３−キナーゼの阻害剤の影響を受けない。
ＰＫＢとは対照的に、Ｓｅｒ４２２の変異体はそれ自身ではＳＧＫの活性化を全
く誘導せず、またＴｈｒ２５６のＡｓｐへの変異体も活性化を無効にする。本発
明者らの結果はＩＧＦ−１または過酸化水素によるＳＧＫの活性化がＳｅｒ４２
２をリン酸化するＰＤＫ２のＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３依存性活性化によ
って開始されるモデルと一致する。次いで、これにＰＤＫ１によって触媒される
Ｔｈｒ２５６でのＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３依存性活性化が続き、これが
ＳＧｋを活性化する。ＰＫＢ同様、ＳＧＫは好ましくはＡｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ
−Ｘａａ−Ｘａａ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）−モチーフ中に位置するセリンおよびト
レオニン残基をリン酸化し、またＳＧＫおよびＰＫＢはin vitroでグリコーゲン
シンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）を同様の速度で不活性化した。これらの発
見により構造的に活性なＰＫＢ変異体の過剰発現に基づいてＰＫＢに割り当てら
れるいくつかの生理学的役割はＳＧＫによって媒介され得るという可能性が高ま
る。
【０１７１】材料および方法 材料： ヒトＰＤＫ１は２９３細胞においてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現させ、グルタチオン−セファロースで
精製した［９］。Ｖ８プロテアーゼ（プロテアーゼＧｌｕ−Ｃ）および完全プロ
テアーゼ阻害剤反応混液はBoehringer Mannheimから購入した。ｃＡＭＰ依存性
タンパク質キナーゼ（ＰＫ１）の特異的タンパク質阻害剤の残基５〜２４および
総てのその他のペプチドはDepartment of MRC Protein Phosphorylation Unit,
University of DundeeでMr. F. B. Cauwellによって合成された。その他の材料
の供給源は［６］に示されている。
【０１７２】バッファー溶液： バッファーＡは５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．５、
１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＦ、５ｍＭのピロ
リン酸ナトリウム、０．２７Ｍのスクロース、０．１％（ｖ／ｖ）の２−メルカ
プトエタノールとした。溶解バッファーは１μＭの微小シスチン−ＬＲ、および
完全プロテアーゼ阻害剤反応混液（１錠／５０ｍｌ）を含有するバッファーＡと
した。バッファーＢは５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤ
ＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノールとした。
【０１７３】ＳＧＫを発現するプラスミドおよび位置指定突然変異誘発： 幼児脳ライブラリ
ー由来のヒトＳＧＫをコードする全長ｃＤＮＡはＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅコンソーシ
アム（クローンＩＤ４２６６９）から入手し、オリゴヌクレオチド５’−ＡＣＡ
ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＧＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＴＡ ＴＣＣ ＡＴＡ ＴＧＡ
ＴＧＴ ＴＣＣ ＡＧＡ ＴＴＡ ＴＧＣ ＴＡＣ ＧＧＴ ＧＡＡ ＡＡＣ
ＴＧＡ ＧＧＣ ＴＧＣ ＴＡＡ ＧＧＧ Ｃ−３’および５’−ＡＣＡ Ｃ
ＧＧ ＴＡＣ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＴＣ ＡＧＡ ＧＧＡ ＡＡＧ ＡＧＴ Ｃ
ＣＧ ＴＧＧ ＧＡＧ Ｇ−３’を用いてＰＣＲ増幅によって改変して５’末端
のＢａｍＨＩ部位（ｐＥＢＧ２ＴベクターのＧＳＴ配列を有するフレームにおい
て）および３’末端のＫｐｕＩ部位を導入した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよび
ＫｐｎＩで消化しｐＥＢＧ−２Ｔのクローニング部位に挿入した。Ｎ末端の６０
個の残基を欠くＳＧＫの末端切断型（ΔＮ−ＳＧＫ）はｃＤＮＡの５’のＢａｍ
Ｈｉ部位と開始コドンから１７５ｂｐに位置するＢｇｌII部位との間の断片を除
去し、次いでＫｌｅｎｏｗフラグメントでギャップを埋めた後に再連結すること
によって得た。ＳＧＫ遺伝子中の総ての点変異はＰＣＲを用いるin vitroでの突
然変異誘発によって導入した。
【０１７４】２９３細胞におけるＳＧＫの発現 細胞は改変リン酸カルシウムゲル法［６］を用いて１０μｇ（１０ｃｍシャー
レ）または３μｇ（６ｃｍシャーレ）のｐＥＢＧ−ＳＧＫ構築物でトランスフェ
クトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞から１６時間血清を取り
除き、次いで、１００ｎＭのウォルトマンニンを含むか含まないで１０分間イン
キュベートするか、またはその他の阻害剤を含むか含まないで１時間インキュベ
ートし、次いで５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１または２ｍＭの過酸化水素で刺激し
た。細胞は、ＰＫＢについて記載したように［６］、１ｍｌの氷冷溶解バッファ
ー中で溶解し、１３，０００ｇで５分間遠心分離し、グルタチオン−セファロー
スでＧＳＴ−ＳＧＫを精製した。グルタチオン−セファロース溶出液はアリコー
トで−８０℃で保存した。
【０１７５】ＳＧＫのリン酸化およびアッセイ： リン酸化は３０℃にて５０ｍＭのＴｒｉｓ
／ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）の２−メル
カプトエタノール、２．５μＭのＰＫＩ、１μＭの微小シスチン−ＬＲ、１０ｍ
Ｍの塩化マグネシウムおよび１００μＭのＡＴＰを含有する５０μｌのインキュ
ベーション中で実施した。ホスファチジルクロリン（１００μＭ）を含有する脂
質小胞が示されれば、ホスファチジルセリン（１００μＭ）およびＰｔｄＩｎｓ
（３，４，５）Ｐ３（１μＭ）も含まれていた。ＳＧＫ活性はＰＫＢに関して記
載されるように［６］、基質として３０μＭでペプチドＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ
（「クロスチド」）を用いて正確にアッセイした。１単位の活性（Ｕ）は１ｎモ
ルのクロスチドのリン酸化を１分で触媒する量とした。
【０１７６】ＰＤＫ１によってリン酸化されるＳＧＫ上の部位のマッピング： Ｓｅｒ４２２
がＡｓｐに変異されているＮ末端切断型ＳＧＫ（ＧＳＴ−ΔＮ−ＳＧＫ［Ｓ４２
２Ｄ］）（２６μｇ）をＰＰ２Ａ（３０ｍＵ／ｍｌ）（ここで、１単位の活性は
１ｎモルのホスホリラーゼａの脱リン酸化を１分で触媒する量である）とともに
３０℃で２０分間インキュベートした。ＰＰ２Ａを不活化するために微小シスチ
ン−ＬＲを１μＭまで添加した後、ＳＧＫをＧＳＴ−ＰＤＫ１（２μｇ）および
［γ３２Ｐ］ＡＴＰ（５，０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）とともに３０℃で３０分イ
ンキュベーションすることによってリン酸化した。反応は３０分後にＳＤＳおよ
び２−メルカプトエタノールをそれぞれ１％（ｗ／ｖ）および１％（ｖ／ｖ）の
最終濃度まで添加し、次いで、９５℃で５分間加熱することによって停止させた
。 次いで、サンプルを２％（ｖ／ｖ）の４−ビニルピリシンとともに３０℃で１時
間インキュベートしてシステイン残基をアルキル化し、１０％ＳＤＳ／ポリアク
リルアミドゲルで電気泳動に付し、３２Ｐ標識したＳＧＫをゲルから溶出させ、
トリクロロ酢酸を２０％（ｗ／ｖ）まで添加することによって沈殿させた。沈殿
したタンパク質は０．２ｍｌの水で６回洗浄し、０．３ｍｌの５０ｍＭのＮＨ４ ＨＣＯ３（ｐＨ７．８）に再懸濁し、結果で記載したようにＶ８プロテアーゼ（
１μｇ）で１８時間消化し、次いで、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラムでクロマトグラ
フィーに付した。ペプチド画分はマトリックスとして１０ｍｇ／ｍｌのα−シア
ノ桂皮酸を用いてＰｅｒｃｅｐｒｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Framingham,
MA）Ｅｌｉｔｅ ＳＴＲ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計でリニアおよびリフレ
クタ−モードで分析した。ホスホアミノ酸分析は［２６］に記載のように実施し
た。
【０１７７】結果 ２９３細胞におけるＳＧＫの発現 そのＮ末端に赤血球凝集素タグを有するＳＧＫを発現させる最初の試みは、発
現されたタンパク質が不溶性であったので不成功に終わった。従って、本実施例
で報告される研究は、２９３細胞において発現された場合に可溶性であるＧＳＴ
融合タンパク質を用いて実施した。２９３細胞では全長ＧＳＴ−ＳＧＫ（図２Ａ
、レーン２）はＧＳＴ−ＰＫＢα（図２Ａ、レーン３）よりもかなり低いレベル
で発現した。この低レベルの発現はＳＧＫのＮ末端の６０個の残基によると考え
られるが、これはそれらの除去により発現レベルが５０〜２５０倍が高まった（
図２Ｂ、レーン４および５）からである。通常、１０〜５０μｇの２０％の純粋
な全長ＳＧＫおよび０．５ｍｇの８０％の純粋なΔＮ−ＳＫＧ（６１−４３１）
が１０枚の直径１０ｃｍのシャーレの細胞から得られた。
【０１７８】in vitroでのＰＤＫ１による野生型ＳＧＫのリン酸化および活性化 ２９３細胞から精製したＧＳＴ−ＳＧＫの活性はタンパク質ホスファターゼ２
Ａ（ＰＰ２Ａ）（図３）、すなわちセリン／トレオニン特異的ホスファターゼと
ともにインキュベーションした後に７０％低下し、不活性化は微小シスチン、す
なわち特異的ＰＰ２Ａ阻害剤によって阻害された［２７］。従って、ＳＧＫの基
礎的な活性は１個以上のセリン／トレオニン残基でのそのリン酸化に起因する。
【０１７９】 ＧＳＴ−ＳＧＫはＰＤＫ１によってリン酸化され得（図４Ａ）、またリン酸化
は基礎的な活性において１０倍まで増加した（図４Ｂ）。ＧＳＴ−ＳＧＫをまず
ＰＰ２Ａでの処理によって不活性化し、次いでＰＤＫ１でリン酸化した場合にも
ほとんど同一レベルの活性を達成した（示されていないデータ）。しかしながら
、ＰＤＫ１はＧＳＴ−ＳＧＫをＰＫＢαよりもはるかにより遅くリン酸化し、達
成され得るリン酸化の最大化学量論は、ＰＫＢαの０．５モル／モルに比べ０．
０５モル／モルであった。さらに、ＰＫＢαの活性化とは異なり、ＳＧＫのリン
酸化（図４Ａ）および活性化（図４Ｂ）はホスファチジルセリンおよびホスファ
チジルコリンを含有する脂質小胞の存在（図４）または不在下（示されていない
データ）でＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の影響を受けなかった。
【０１８０】Ｓｅｒ４２２およびＴｈｒ２５６の変異のＳＧＫの活性に対する作用 ＰＫＢαはＴｈｒ３０８のＡｓｐへの変異またはＳｅｒ４７３のＡｓｐへの変
異によって部分的に活性化され（５倍）、両変異が組み合わされるとほとんど完
全に活性化され得る（２０倍）。従って。同等の変異のＳＧＫの活性に対する作
用を調べることは興味深いことであった。
【０１８１】 トランスフェクトした２９３細胞から精製したＧＳＴ−ＳＧＫ［Ｔ２５６Ｄ］
、ＧＳＴ−ＳＧＫ［Ｔ２５６Ｅ］またはＧＳＴ−ＳＧＫ［Ｔ２５６Ａ］は総て野
生型ＳＧＫよりもかなり活性が低く、これらの活性はＰＰ２Ａで処理した野生型
ＳＧＫと同様であった（図３）。対照的に、２９３細胞から精製したＧＳＴ−Ｓ
ＧＫ（Ｓ４２２Ｄ）は野生型酵素のものの１０倍を越える高い特異的活性を有し
ていた（図３）。しかしながら、ＧＳＴ−ＳＧＫ（Ｓ４２２Ｄ）の活性はそれ自
体はＳｅｒ４２２のＡｓｐへの変異に起因するものではなく、ＰＰ２Ａとのイン
キュベーションによってＧＳＴ−ＳＧＫ［Ｔ２５６Ｄ］またはＧＳＴ−ＳＧＫ［
Ｔ２５６Ａ］と同一レベルまで低下し得たのでリン酸化の増加に起因していた（
図２）。
【０１８２】 ２９３細胞から精製したＧＳＴ−ＳＧＫ［Ｓ４２２Ａ］も、ＧＳＴ−ＳＧＫ［
Ｔ２５６Ａ］またはＰＰ２Ａで処理した後の野生型酵素と同様、極めて低い活性
を有していた。
【０１８３】Ｓｅｒ４２２またはＴｈｒ２５６の変異のin vitroでのＰＤＫ１によるＳＧＫの リン酸化に対する作用 Ｓｅｒ４２２のＡｌａへの変異はＰＤＫ１によるＳＧＫのリン酸化度に影響を
及ぼさなかった（図５Ａ）が、活性化度は６０％低下した（図５Ｂ）。対照的に
、Ｔｈｒ２５６のＡｌａへの変異（またはＴｈｒ２５６とＳｅｒ４２２双方のＡ
ｌａへの変異）はリン酸化を８０〜９０％減少させ（図５Ａ）、ＰＤＫ１による
活性化を無効にした(図５Ｂ）。
【０１８４】 Ｓｅｒ４２２のＡｓｐへの変異はＰＤＫ１によるリン酸化の速度（図）５Ｃ）
および活性化の速度（図５Ｄ）を少なくとも６倍に刺激した。対照的に、ＧＳＴ
−ＳＧＫ［Ｔ２４５Ａ／Ｓ４２２Ｄ］二重変異はＰＤＫ１によって全く活性化さ
れず、かつ、ＰＤＫ１によるリン酸化は８０〜９０％減少した（示されていない
データ）。
【０１８５】 本発明者らはまた、ＡＴＰ結合部位においてＬｓｙ１２７をＡｌａに変異させ
て「キナーゼが働かない」タンパク質を作出した。この変異体は野生型ＳＧＫと
同様の速度で、かつ、同程度までリン酸化されたが、予想されたように、ＰＤＫ
１によって活性化され得なかった（図５Ｂ）。
【０１８６】in vitroでＰＤＫ１によってリン酸化されるＳＧＫ上の残基としてのＴｈｒ２５ ６の同定 前記の結果はＰＤＫ１によるＳＧＫの活性化はＴｈｒ２５６のリン酸化に起因
するようであるということを示唆した。このことがそうであるかどうかを調べる
ために、本発明者らはそのＮ末端で末端切断されたＳＧＫの形態（ＧＳｔ−ΔＮ
−ＳＧＫ［６１〜４３１］）を用い（これはこの変異体が野生型酵素よりもかな
り高レベルで発現されたからである）、かつ、Ｓｅｒ４２２もＡｓｐに変異させ
てＰＤＫ１によるリン酸化を促進した。ＧＳＴ−ＳＧＫ［Ｓ４２２Ｄ］（図３）
同様、２９３細胞から精製したＧＳＴ−ΔＮ−ＳＧＫ（６１〜４３１）［Ｓ４２
２Ｄ］は高い活性を有していたが、これはＰＰ２Ａでの処理で実質的に消失し得
た（示されていないデータ）。
【０１８７】 ＰＰ２Ａ処理したＧＳＴ−ΔＮ−ＳＧＫ［Ｓ４２２Ｄ］はＰＤＫ１によって０
．６モル／モルタンパク質の化学量論までリン酸化され、３２Ｐ標識した酵素を
Ｖ８プロテアーゼで消化し、Ｃ１８カラムでのクロマトフラフィーに付した。図
６Ａに示されるように、３２Ｐ放射能の主要なピークおよびいくつかの小ピーク
が認められた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計による主要なピークの分析によっ
てその分子量（１９２３．１５）は、１個のリン酸化された残基を含む、ＳＧＫ
の残基２４７〜２６２（ＮＥＥＨＮＳＴＴＳＴＦＣＧＴＰＥ）を含んでなるペプ
チドについて予想されたものと同一であると示された。Ｖ８プロテアーゼの特異
性から予想されたように、残基２４７はグルタミン酸の前に位置する。ホスホア
ミノ酸分析によりこのペプチドはホスホトレオニンのみ（図６Ａに挿入された）
を含んでいるということが示された。このリンペプチドを固相シークエンスに付
したところ、３２Ｐ放射能はエドマン分解の１０サイクル目の後に放出され、こ
れはＴｈｒ２５６に相当した（図６Ｂ）。これらの結果は、Ｓｅｒ２５６Ａｌａ
変異体を用いて得られたものとともに、ＳＧＫはＰＤＫ１によってＴｈｒ２５６
で、すなわちＰＫＢαのＴｈｒ３０８に相当する残基でリン酸化されるというこ
とを示す。
【０１８８】ＳＧＫの基質特異性： 本発明者らはＳＧＫとＰＫＢαの「クロスチド」に関連
する数種の合成ペプチドに対する基質特異性を比較した（表１）。ＰＫＢα同様
、ＳＧＫはリン酸化部位の５残基Ｎ末端のアルギニン残基を絶対的に必要とした
が、これは別の塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ）への変異でさえ活性をほとんど消失さ
せたからである。
【０１８９】 リン酸化部位の３残基Ｎ末端のＡｒｇの存在も重要であったが、ＰＫＢαにつ
いてほど非常に重要な意味を持つわけではなかった。ＰＫＢα同様、ＳＧＫはリ
ン酸化部位のＣ末端に少なくとも１個の残基を必要とし、ＰＫＢαについてほど
重要な意味を持つわけではないが、この位置には疎水性残基が非常に好ましい。
ＰＫＢαとＳＧＫとの間のもう１つの重要な相違は後者はリン酸化部位でのセリ
ンのトレオニンでの置換により寛容であるということであった。表１に示された
結果はＰＤＫ１によって活性化されたＧＳＴ−ΔＮ−ＳＧＫ［Ｓ４２２Ｄ］を用
いて実施したが、同様の結果が全長ＳＧＫを用いても得られた。
【０１９０】 グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ−３）はＰＫＢの生理学的基質であ
ると考えられるタンパク質である［２８］。ＰＫＢαおよびＳＧＫがクロスチド
に対する活性に関して一致する場合、両酵素はＧＳＫ３を同様の速度で不活化す
る（図７）。
【０１９１】細胞外シグナルによる２９３細胞におけるＳＧＫの活性化 ＰＫＢは２９３細胞においてインスリンまたはＩＧＦ−１などのＰｔｄＩｎｓ
３−キナーゼを活性化するアゴニストまたは特定の有害な刺激（熱ショック、酸
化ストレス）に応じて活性化される。ＰＫＢの活性化はＴｈｒ３０８およびＳｅ
ｒ４７３のリン酸化に起因するので、ＳＧＫにおいてこれらの残基およびその周
囲の配列は高度に保存されており（図１）、本発明者らはＳＧＫが２９３細胞に
おいてこれらおよび／またはその他のシグナルによって活性化され得るかどうか
調べた。
【０１９２】 ＧＳＴ−ＳＧＫを過剰発現する細胞はＩＧＦ−１または過酸化水素に曝される
ことで刺激され、２．５〜４倍の活性化を誘導した（図８Ａおよび８Ｂ）。活性
化は、細胞をまずＰｔｄＩｎｓ３−キナーゼ阻害剤であるウォルトマンニンとと
もにプレインキュベートした場合には強く抑制された（図８Ｂ）。対照的に、ｐ
７０Ｓ６キナーゼの活性化を阻害する免役抑制薬であるラパマイシンはＳＧＫの
活性化に対して全く影響を及ぼさなかった（示されていないデータ）。ＳＧＫ［
Ｔ２５６Ａ］はＩＧＦ−１または過酸化水素のいずれによっても活性化され得な
かった。
【０１９３】 ＩＧＦ−１および過酸化水素誘導性活性化は、基礎的な活性同様、刺激された
活性がＰＰ２Ａでの処理によって消失したので（図９）、リン酸化の増加によっ
て起こった。野生型ＳＧＫの代わりにＳＧＫ［Ｔ２５６Ａ］をトランスフェクト
した場合にも、これらの刺激による活性化以外は認められなかった（図８Ａ）。
ＩＧＦ−１または過酸化水素により誘導されたＧＳＴ−ＳＧＫの活性化は同様の
条件下でのＧＳＴ−ＰＫＢαの活性化よりもわずかに遅かった（図９）。
【０１９４】 ホルボールミリスチル酸アセテート（４００ｎｇ／ｍｌ、３０分）またはＥＧ
Ｆ（１００ｍｇ／ｍｌ、３０分）は、２９３細胞では古典的な分裂促進因子によ
り活性化されるタンパク質（ＭＡＰ）キナーゼカスケードの、ＩＧＦ−１よりも
かなり強力なアクチベーターであるが、これらはＳＧＫの活性化を全く誘導しな
かった（示されていないデータ）。
【０１９５】ＩＧＦ−１によるＳＧＫ変異体の活性化 ＧＳＴ−ＳＧＫ［Ｓ４２２Ｄ］の活性はＩＧＦ−１で刺激されていない２９３
細胞において高く（図３）、かつ、興味深いことに、ＩＧＦ−１によってさらに
は活性化され得なかった（図１０Ａ）。さらに、２９３細胞の１００ｎＭのウォ
ルトマンニンとのプレインキュベーション（３０分）はＳＧＫの高い基礎的な活
性に影響を及ぼさなかった（示されていないデータ）。対照的に、ＳＧＴ−ＳＧ
Ｋ［Ｓ４２２Ａ］は２９３細胞において極めて低い活性を有しており、これはＩ
ＧＦ−１によって増大しなかった（図１０Ａ）。
【０１９６】 ＧＳＴ−ΔＮ−ＳＧＫはＩＧＦ−１に応じて全長野生型ＳＧＫと同様に活性化
された（図１０Ｂおよび１０Ｃ）が、このことはＮ末端非触媒ドメインは２９３
細胞における活性化に必要でないということを示すものである。
【０１９７】考察 ＳＧＫが数種のアゴニストおよび病的条件に応じてそのレベルが１時間以内に
高まる最初期遺伝子の産物であるということは十分に確定されているが（導入を
参照）、ＳＧＫはまた可逆的リン酸化によって調節されるという可能性はこれま
でには調べられていない。本実施例では、本発明者らは２９３細胞において発現
されるＳＧＫの活性が、ＰｔｄＩｎｓ３−キナーゼを活性化するシグナルに応じ
て数分内に増加する（図８および９）そのリン酸化レベルによって決定されると
いうことを確定する（図３）。本発明者らはまたＳＧＫ上の重要なリン酸化部位
はＴｈｒ２５６およびＳｅｒ４２２、すなわちそれぞれＰＤＫ１およびＰＤＫ２
によって標的とされるＰＫＢα上のものに相当する残基であるという証拠を提供
した。
【０１９８】 ＳＧＫはin vitroでＰＤＫ１によってリン酸化され、かつ、活性化され（図４
）、主要なリン酸化部位はＴｈｒ２５６である（図６）。Ｔｈｒ２５６がＡｌａ
に変異された場合は活性化は無効にされ、リン酸化は大幅に減少する（図５）。
従って、ＳＧＫのＰＤＫ１誘導性活性化はＴｈｒ２５６のリン酸化によって媒介
されている。しかしながら、リン酸化の作用はＴｈｒ２５６を酸性残基に変異さ
せることによって模倣され得ず、かかる変異は実際には活性をＰＰ２Ａ処理した
野生型酵素のレベルにまで低下させた（図３）。このことはｐ７０Ｓ６キナーゼ
を用いて認められた観察結果と類似している［２８］が、Ｔｈｒ３０８のＡｓｐ
への変異が酵素の部分的な活性化を引き起こすＰＫＢα［６］とは対照的である
。Ｔｈｒ２５６がＡｌａに変異された場合にはＰＤＫ１によるＳＧＫのリン酸化
は全体的には無効にされないという発見（図４）はＰＤＫ１はin vitroでＧＳＴ
−ＳＧＫ［Ｔ２５６Ａ］上の別の部位をリン酸化し得るということを示唆するが
、活性化プロセスに関するこの部位の同一性およびその関連性（あるとすれば）
はいまだ評価されていない。ＰＫＢαのＴｈｒ３０８Ａｌａ変異体（野生型酵素
ではない）はin vitorでＰＤＫ１によってＴｈｒ３０４でリン酸化されるが活性
化は全く引き起こさない（示されていないデータ）。
【０１９９】 数系統の証拠からＳｅｒ４２２のリン酸化に関する１つの役割はＰＤＫ１によ
るＴｈｒ２５６でのリン酸化、ひいてはＳＧＫの活性化を促進することであると
いうことが示唆される。従って、ＧＳＴ−ＳＧＫはin vitroでＰＤＫ１によって
ＰＫＢαよりもはるかにより遅くリン酸化されるが、このリン酸化および活性化
はＳｅｒ４２２のＡｓｐへの変異によって大幅に増強される（図５）。Ｓｅｒ４
２２のＡｓｐへの変異はまた２９３細胞において発現されるＳＧＫの活性を大幅
に増大させるが（図３および９）、ＰＰ２Ａでの処理によって消失するので（図
３）またＴｈｒ２５６Ａｌａ／Ｓｅｒ４２２ＡｓｐおよびＴｈｒ２５６Ａｓｐ／
Ｓｅｒ４２１Ａｓｐの二重変異体は不活性であるので、このことはリン酸化（お
そらくはＴｈｒ２５６での）の増加に起因する。
【０２００】 Ｓｅｒ４２２Ａｓｐ変異体がこの残基でのリン酸化の作用を模倣し、またＧＳ
Ｔ融合タンパク質が野生型ＳＧＫと同様にふるまうと仮定すると、以下のＳＧＫ
の活性化モデルは本明細書で得られた結果と一致するであろう。（１）ＩＧＦ−
１または過酸化水素に応じて生じたＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３はＰＤＫ２
（または密接に関連する酵素）を活性化し、次いで、これがＳＧＫをＳｅｒ４２
２でリン酸化する。（２）Ｓｅｒ４２２のリン酸化はＰＤＫ１（または密接に関
連する酵素）によってＳＧＫがリン酸化され、かつ、活性化される速度を大幅に
上げる。このモデルは何故２９３細胞におけるＳＧＫのＩＧＦ−１誘導性または
過酸化水素誘導性活性化がウォルトマンニンによって抑制されるのか（図８Ｂ）
、何故in vitroでのＰＤＫ１によるＳＧＫの活性化がＰｔｄＩｎｓ（３，４，５
）Ｐ３に依存するのか（図４）、および何故ＧＳＴ−ＳＧＫ［Ｓ４２２Ｄ］の活
性がウォルトマンニンによって抑制されないのかを説明する。このモデルはｐ７
０Ｓ６キナーゼの活性化に関して提唱される機構［１５、１６］に類似している
が、確認するためには、ＰＤＫ２が実際にＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３依存
性であるかどうか調べ、ＰＤＫ１の存在および不在下でのＰＤＫ２のＳＧＫの活
性化に対する作用を調べる必要があろう。
【０２０１】 ＳＧＫの活性化機構はＰＫＢのものとはいくつかの点で異なっている。第１に
、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のＰＫＢのＰＨドメインへの結合は何らかの
活性化が起こり得る前に必須である［７］。第２に、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５
）Ｐ３のＰＫＢのＰＨドメインとの相互作用は原形質膜へのその補充を引き起こ
し、これが膜結合性ＰＤＫ１およびＰＤＫ２によるその活性化を容易にし得る。
第３に、ＰＤＫ１はin vitroでは脂質小胞におけるＰＫＢのＰｔｄＩｎｓ（３，
４，５）Ｐ３依存性活性化を大幅に促進し、従って、in vivoでの原形質膜での
ＰＫＢの活性化にも重要な意味を持ち得る。これらの相違により何故in vitroで
ＰＫＢの活性化がＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３が高まるまで本質的に起こら
ないのか、および２９３細胞においてＩＧＦ−１または過酸化水素によってＰＫ
Ｂがより多量により迅速に活性化されるのか（図９）を説明できる。しかしなが
ら、ＳＧＫの活性化同様、ＰＫＢの活性化もＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の
ＰＤＫ２との相互作用に依存し得る。
【０２０２】 ＰＫＢおよびｐ７０Ｓ６キナーゼ同様、ＳＧＫはペプチドをｎ−３およびｎ−
５位置にアルギニン残基およびｎ＋１に大きな疎水性残基を含む配列中（ここで
、ｎはリン酸化部位）に位置するセリンまたはトレオニン残基でリン酸化する。
ＳＧＫの生理学的基質はわかっていない。しかしながら、ＰＫＢ同様、ＳＧＫは
ＰｔｄＩｎｓ３−キナーゼ依存性経路によって活性化され、また（ｐ７０Ｓ６キ
ナーゼとは異なり）活性は免役抑制薬であるラパマイシンによって阻害されない
。さらに、標準的なペプチド基質であるクロスチドに対する活性が一致した場合
には、ＳＧＫおよびＰＫＢαはＧＳＫの不活化を同様の速度で触媒した（図７）
。ＧＳＫ３はＰＫＢの生理学的基質であると考えられているので［３０］、従っ
て、構造的に活性な変異体の過剰発現に基づいてＰＫＢに割り当てられたいくつ
かの生理学的役割（［２］に概説された）は実際にＳＧＫによって媒介され得る
可能性がある。ＰＫＢおよびＳＧＫはin vivoで同一のタンパク質キナーゼ（Ｐ
ＤＫ１およびＰＤＫ２）によって十分に活性化され得るので、それらの生理学的
役割をドミナントネガティブ変異体の使用によって区別することは不可能であろ
う。ＰＫＢを阻害するがＳＧＫを阻害しないおよびその逆の薬剤の開発またはマ
ウス「ノックアウト」の作製がこれらの問題に答えるために必要であろう。
【０２０３】表１：クロスチドに関連する合成ペプチドに対するＳＧＫおよびＰＫＢαの活性 の比較 この実験は２９３細胞から精製し、ＰＤＫ１によって活性化されたＧＳＴ−Δ
Ｎ−ＳＧＫおよびＧＳＴ−ＰＫＢαを用いて実施した。活性はペプチド１（クロ
スチド）と比較して示されている。各ペプチドの濃度は３０μＭとした。アミノ
酸置換に下線が引いてある。ＰＫＢによってリン酸化されるクロスチド中のセリ
ン残基はアスタリスクで印を付けた。
【０２０４】
【表１】
【０２０５】実施例２：代替のアッセイ シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）系（Amersham International）を用
いてクロスチドへの３２Ｐ放射能の組み込みを評価した。この系では、サンプル
（ＰＤＫ１によって活性化されたＧＳＴ−ΔＮ−ＳＧＫまたはＰＤＫ１によって
活性化されたＧＳＴ−ΔＮ−ＳＧＫ[Ｓｅｒ４２２Ａｓｐ]を含有する）、調べら
れる化合物および［γ−３２Ｐ］ＡＴＰまたは［γ−３３Ｐ］ＡＴＰをシンチラ
ントおよびクロスチドと結合する抗体を含んでなるビーズと混合する。便宜には
、これは９６ウェル形式で行う。次いで、プレートを３２Ｐまたは３３ＰＳＰＡ
アッセイの公知のパラメーターを用いて、好適なシンチレーションカウンターを
用いてカウントする。シンチラントに近接する３２Ｐまたは３３Ｐのみ、すなわ
ち、クロスチドと結合したもののみが、次いで抗体によって結合され、検出され
る。
【０２０６】実施例３：ＳＧＫ活性を調整する化合物のアッセイ アッセイは実施例１または実施例２に記載のようにクロスチドを用いて構成さ
れている。化合物をこのアッセイで試験し、ＳＧＫの阻害または活性化を引き起
こすものをさらなる研究のために選択する。化合物をＰＫＢに対する作用につい
てさらに調べ、ＰＫＢαによるクロスチドのリン酸化に影響を及ぼさないものを
選択する。
【０２０７】 調べる化合物は公知の特性、例えば、ＰＫＢαなどのその他のタンパク質キナ
ーゼを阻害する能力を基に選択された化合物であってよく、また種々のスクリー
ニング、例えば、「リード化合物作製」スクリーニングプログラムで調べるため
に集められた化合物のライブラリーの一部であってよい。化合物は天然のもので
あっても合成のものであってもよく、また当業者に公知の組合せ化学によって作
製されてもよい。
【０２０８】 選択された化合物は構造活性相関（ＳＡＲ）を開発することを目的とした、製
造または試験のためのさらなる化合物の設計に用いることができる。
【０２０９】実施例４：ＳＧＫと相互作用するポリペプチドのアッセイ 酵母二重ハイブリッドアッセイ系は転写の活性化が起こるのに十分に安定な方
法でＳＧＫと結合し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定する
よう構成されている。ポリヌクレオチドは（別個の実験で）ＳＧＫの発現を刺激
し得る刺激の前後の、発現されたＳＧＫを活性化し得る刺激の前後の、ＳＧＫを
発現し得る細胞からの、およびＳＧＫを発現しない細胞からのｍＲＮＡからコピ
ーされたｃＤＮＡである。これらの細胞種のみの集団に認められる相互作用は特
に注目される。
【０２１０】 ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは実施例１に記載のおよ
び当業者に十分に公知のサンガー法による挿入部分を配列決定によって決定し、
予想されるアミノ酸配列を得る。
【０２１１】参照文献
【化１２】
【０２１２】実施例５：血清および糖質コルチコイド誘導性タンパク質キナーゼの２種の新規 のイソ型の構造および調節の特性決定 略語：ＳＧＫ、血清および糖質コルチコイド調節性タンパク質キナーゼ；ＰＫ
Ｂ、タンパク質キナーゼＢ；ＰＤＫ１、３−ホスホイノシチド依存性タンパク質
キナーゼ１；タンパク質キナーゼＣ関連タンパク質キナーゼ２（ＰＲＫ２）、Ｐ
Ｉ、ホスファチジルイノシトール；ＩＧＦ１、インスリン様増殖因子−１；ＧＳ
Ｋ３、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３；ＧＳＴ、グルタチオンＳ−トラン
スフェラーゼ；ＰＭＡ、ホルボールミリスチル酸アセテート；ＰＰ２Ａ、タンパ
ク質ホスファターゼ２Ａ；ＰＣＲ、ポリメラーゼ鎖反応。
【０２１３】 本発明者らは実施例１および［１８］において、その後他の人物が［１９］、
ＰＫＢ同様、ＳＧＫも細胞がインスリン、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ１
）または血清で刺激されると、あるいは酸化ストレスに曝されるとリン酸化機構
を介して数分内に活性化されると示している。
【０２１４】 本明細書では、本発明者らは別個の遺伝子の産物であるＳＧＫ２およびＳＧＫ
３と呼ばれる２種の新規なＳＧＫのイソ型を同定しており、またそれらの組織分
布、血清および糖質コルチコイドによる誘導、リン酸化による活性化および基質
特異性をＳＧＫ（以後、ＳＧＫ１と呼ばれる）と比較している。それらはＳＧＫ
１と高度の配列類似性があるが、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３のレベルおよび活性を
調節する機構はＳＧＫ１とはいくつかの点でかなり異なっている。
【０２１５】 ＳＧＫ１同様、ＳＧＫ３をコードするｍＲＮＡは調べた総ての組織中で発現さ
れているが、ＳＧＫ２ｍＲＮＡは肝臓、腎臓および膵臓にかなりのレベルで、脳
に低レベルで存在するのみである。Ｈ４ＩＩＥ細胞におけるＳＧＫ２ｍＲＮＡお
よびＲａｔ２繊維芽細胞におけるＳＧＫ３ｍＲＮＡのレベルは血清またはデキサ
メタゾーンでの刺激によって上がらないが、他方、ＳＧＫ１ｍＲＮＡのレベルは
片方のまたは両アゴニストによって大幅に上がる。ＳＧＫ２およびＳＧＫ３はin
vitroでＳＧＫ１よりもより遅くではあるがＰＤＫ１によって活性化され、それ
らの活性化はそれぞれＴｈｒ１９３およびＴｈｒ２５３、すなわちＰＤＫ１によ
って標的とされるＰＫＢの「活性化ループ」中のＴｈｒに相当する残基のリン酸
化によって達成される。ＳＧＫ１同様、ＰＤＫ１により触媒されるＳＧＫ２およ
びＳＧＫ３のリン酸化および活性化は、ＰＫＢのＣ末端リン酸化部位に相当する
、Ｓｅｒ３５６およびＳｅｒ４１９をそれぞれＡｓｐに変異させることによって
大幅に増強される。ＳＧＫ１同様、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３は、細胞が過酸化水
素に曝されるとリン酸化機構を介して４倍活性化されるが、ＳＧＫ１とは対照的
に、活性化はＰＩ３−キナーゼの阻害剤によって部分的にしか抑制されない。Ｓ
ＧＫ２およびＳＧＫ３はＩＧＦ１によってＳＧＫ１よりも（５倍）より低い程度
に（２倍）活性化される。ＰＫＢおよびＳＧＫ１同様、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３
は好ましくはＡｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチー
フ中に位置するＳｅｒおよびＴｈｒ残基をリン酸化する。このことにより、構造
的に活性な変異体酵素を用いる過剰発現研究に基づいてＰＫＢに割り当てられた
いくつかの生理学的役割はＳＧＫのイソ型によって媒介され得るという可能性が
高まる。
【０２１６】材料および方法 材料： ヒトＰＤＫ１は２９３細胞中でグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（
ＧＳＴ）融合タンパク質として発現させ、グルタチオン−セファロースでのアフ
ィニティークロマトグラフィーによって精製した［５］。デキサメタゾーン、ウ
ォルトマンニンおよびＬＹ２９４００２はSigma(Poole, U.K.)から購入した。総
てのペプチドはGraham Blumberg(Department of Biochemistry, University of
Bristol, U.K.)によって合成された。ＳＧＫ１の発現プラスミドおよびＳＧＫ１
のＮ末端切断型であるΔＮ−ＳＧＫ１［６１〜４３１］は実施例１および［１８
］に記載されたｐＥＢＧ−ＳＧＫおよびｐＥＢＧ−ΔＮ−ＳＧＫ［６１〜４３１
］と同一であった。ｐＥＢＧ−２Ｔ−２ベクターはｐＥＢＧ−２ＴのＢａｍＨＩ
とＫｐｎＩ部位の間に５’ＧＡＴ ＣＴＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＴ ＡＡＣ
ＧＧＴ ＡＣ−３’および５’−ＣＧＴ ＴＡＧ ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＧＡ−３
’を挿入することによって作製した。これにより最初のｐＥＢＧ−２Ｔベクター
とは異なるリーディングフレームに位置する新規のＢａｍＨＩ部位を導入した。
【０２１７】バッファー溶液： バッファーＡは５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．５、
１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＦ、５ｍＭのピロ
リン酸ナトリウム、０．２７Ｍのスクロース、および０．１％（ｖ／ｖ）の２−
メルカプトエタノールを含んでなっていた。バッファーＢは５０ｍＭのＴｒｉｓ
／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプ
トエタノールを含んでなっていた。バッファーＣは５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ
ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのジ
チオスレイトールおよび１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含んでなっていた
。細胞溶解バッファーは１μＭの微小シスチン−ＬＲ、０．２ｍＭのフッ化フェ
ニルメチルスルホニルおよびプロテアーゼ阻害剤反応混液（１錠／５００ｍｌ）
を含有するバッファーＡとした。
【０２１８】ＳＧＫイソ型のクローニング： ヒトＳＧＫ２をコードする全長クローンは以下
のように得た。発現された配列タグ（ＥＳＴ）ＡＡ１３０８２８(ＩＭＡＧＥコ
ンソーシアム、St. Louis, MO, USA)の分析によりヒトＳＧＫ１と相同な新規の
キナーゼをコードしているということが示された。次いで、最初のＡＴＧの上流
に終結コドンがなかったので、ヒト腎臓ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄ
ｙ ｃＤＮＡ, Clontech, CA, USA）を鋳型として用いて５’−ＲＡＣＥを実施
した。ＳＧＫ２の５’−ＲＡＣＥに用いたプライマーは５’−ＧＣＴ ＣＴＧ
ＧＡＣ ＴＴＧ ＧＧＧ ＴＣＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＧＣ−３’、５’−ＧＴ
Ｔ ＧＡＴ ＧＴＴ ＣＣＣ ＡＴＴ ＧＧＣ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＧＧ−３’
および５’−ＧＣＴ ＧＧＧ ＣＡＴ ＴＴＧ ＧＧＴ ＴＧＧ ＣＴＧ ＡＡ
Ｇ ＧＣＣ−３’であった。３種の場合総てで２００〜２２０ｂｐの断片が得ら
れ、ＰＣＲ産物をｐＣＲ−２．１−ＴＯＰＯベクター（Introgen, USA）にクロ
ーニングした。分析した１０個のクローンのうちの８個のクローンが２００ｂｐ
の断片を保持しており、配列解析によりこれらはＥＳＴ ＡＡ１３０８２８の５
’部分に相当するということが示された。本発明者らはこのタンパク質キナーゼ
をＳＧＫ２αと呼んだ。２個のその他のクローンはより長い断片（５００および
６００ｂｐ）を含んでいた。配列解析によりこれらのクローンはＮ末端にさらな
る６０個のアミノ酸残基および異なる５’非コード領域を含むＳＧＫ２の別の型
に相当すると示された。この酵素はＳＧＫ２βと呼んだ。マウスクローン（受託
番号ＡＩ ３８６３６２）もヒトＳＧＫ２αの配列でＮＣＢＩ ＥＳＴデータベ
ースを検索することによって同定され、これはマウスＳＧＫ２αの全長タンパク
質をコードすると予測された。本発明者らはまた、クローンＡＡ７９０３７０（
これは最初の１２４０個のヌクレオチドをコードする）およびＡＡ１３８６６３
（ヌクレオチド１１４０から始まりポリＡ末端で終わる）を用いて全長ネズミｃ
ＤＮＡを構築した。
【０２１９】 ヒトＳＧＫ３をコードする全長クローンは以下のように得た。ＥＳＴ ＡＡ２
１９１６６（ＩＭＡＧＥコンソーシアム）の分析により、ＳＧＫ１およびＳＧＫ
２と相同な新規のタンパク質キナーゼの部分配列をコードするということが示さ
れた。このｃＤＮＡは中央部分にギャップを含んでいたので、鋳型としてヒト骨
格筋ライブラリーを用いてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲに用いたプライマーは
５’−ＡＡＣＡＴＣＣＧＴＴＴＴＴＧＧＴＴＧＧＡＴＴＧＣ−３’および５’−
ＧＧＧＴＡＧＡＴＧＴＴＡＧＴＧＴＡＡＡＣ−３’であった。このクローンは開
始ＡＴＧコドン含んでいなかったので、５’−ＲＡＣＥはヒト腎臓ｃＤＮＡを鋳
型として用いて実施した。５’−ＲＡＣＥに用いたプライマーは５’−ＡＴＡ
ＡＡＧ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＴＡ ＣＣＴ ＡＡＣ ＴＧＡ Ｇ−３’、５’−
ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＴＧ ＣＴＣ ＴＧＡ ＣＡＴ ＣＴＧ ＧＡＴ ＧＧ−３
’および５’−ＧＡＴ ＣＴＧ ＡＣＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＴＧ ＧＡＣ Ｔ
ＧＴ ＣＣ−３’であった。アガロースゲルで分析した場合にＰＣＲ産物の鮮明
なバンドを示したＳＧＫ２の５’ＲＡＣＥとは異なり、ＳＧＫ３のそれでは不鮮
明なものが生じた。従って、本発明者らはこれらの異種産物をｐＣＲ２．１−Ｔ
ＯＰＯベクター（Invitrogen, USA）に連結し、分析して２０個のクローンを得
た。配列分析により１２個のクローンが新規ＳＧＫ配列の見つかっていない部分
を含んでいることが示され、これを本発明者らはＳＧＫ３と呼んだ。
【０２２０】 ｐＥＢＧ−２Ｔ−２ベクターのＧＳＴ配列とインフレームの５’末端にＢａｍ
ＨＩ部位、および各オープンリーディングフレームの３’末端にＮｏｔＩ部位を
導入するために、ＰＣＲ増幅を以下のプライマー：ＳＧＫ２α：５’−ＧＧＡ
ＴＣＣ ＡＧＣ ＴＧＣ ＣＴＧ ＡＴＣ ＡＴＴ ＧＣＴ ＡＣ−３’および
５’−ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＴＡＧ ＣＡＡ ＴＣＣ ＡＡＧ ＡＴＧ Ｔ
ＣＡ ＴＣ−３’；ＳＧＫ２β：５’−ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＡＧ ＧＧＧ ＴＴ
Ｇ ＣＴＴ ＡＣＣ ＴＣＧ ＧＧ−３’および５’−ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ
ＴＡＧ ＣＡＡ ＴＣＣ ＡＡＧ ＡＴＧ ＴＣＡ ＴＣ−３’；全長ＳＧＫ
３：５’−ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＡＧ ＣＣＣ ＴＧＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＴＴＣ
ＣＴＧ ＣＣ−３’および５’−ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＣ ＡＡＡ
ＡＡＴ ＡＡＧ ＴＣＴ ＴＣ−３’；Ｎ末端の５２個の残基を欠いているＳＧ
Ｋ３（ΔＮ−ＳＧＫ３［５３〜４２９］）：５’− ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＧＧ
ＡＣＡ ＧＴＣ ＣＡＡ ＡＡＣ ＡＣＣ ＡＧ−３’および５’−ＧＣＧ Ｇ
ＣＣ ＧＣＴ ＣＡＣ ＡＡＡ ＡＡＴ ＡＡＧ ＴＣＴ ＴＣ−３’を用いて
実施した。ＰＣＲ産物はｐＣＲ−２．１−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）にク
ローニングし、配列決定した。各断片をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐ
ＥＢＧ−２Ｔ−２のクローニング部位に挿入した。ＳＧＫ２αのＳｅｒ３５６お
よびＳＧＫ３のＳｅｒ４１９はＰＣＲを用いるin vitro突然変異生成によってＡ
ｓｐに変異させた。
【０２２１】２９３細胞におけるＳＧＫイソ型の発現： 直径６ｃｍおよび１０ｃｍのシャー
レの細胞各々は改変リン酸カルシウム法［３］を用いてそれぞれ１０μまたは３
μｇのｐＥＢＧ−ＳＧＫ構築物でトランスフェクトした。トランスフェクション
の２４時間後に、細胞から１６時間血清を取り除き、次いで以下の方法の１つで
刺激した：５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１（１０分）、４００ｎｇ／ｍｌのホルボ
ールミリスチル酸アセテート（ＰＭＡ）（３０分）、１０％のウシ胎児血清（３
０分）、１μＭのデキサメタゾーン（６０分）、２ｍＭのＨ２Ｏ２（２５分）、
５μｇ／ｍｌのアニソマイシン（３０分）、０．４μＭのソルビトール（３０分
）、３０分の低浸透圧ストレス（水で４ｍｌに希釈した３ｍｌのＤＭＥＭ）およ
びＵＶ−Ｃ照射（２００Ｊ／ｍ２）。各処理の後に、細胞を溶解し、またＳＧＫ
イソ型の活性は、ＳＧＫ１に関してこれまでに記載したように［１８］、ＧＳＴ
融合タンパク質をグルタチオンセファロースでアフィニティー精製した後に測定
した。
【０２２２】in vitroでのＳＧＫイソ型の脱リン酸化、リン酸化およびアッセイ 各ＧＳＴ−ＳＧＫイソ型（０．４μｇ）を２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ
７．５、０．１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭのＥＧＴ
Ａおよび１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する１０μｌのインキュベー
ション中でタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ、３０ｍＵ／ｍｌ）ととも
に３０℃にて２０分間インキュベートした。微小シスチン−ＬＲを１μＭまで添
加してＰＰ２Ａを不活化した後、ＳＧＫ（０．４μｇ）を５０ｍＭのＴｒｉｓ／
ＨＣＬ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％（ｖ／ｖ）の２−メルカ
プトエタノール、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、バッファーＣに希釈したＧＳＴ−ＰＤ
Ｋ１（０．０３〜３００ｎｇ）および１００ｍＭの未標識ＡＴＰを含有する混合
物（２０μｌ）中で３０℃にて３０分間リン酸化した。ＳＧＫアッセイは３０μ
ｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１
％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、１００μＭ
の［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（５００ｃ．ｐ．ｍ／ｐｍｏｌ）、５０μＭのペプチド
基質クロスチド（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ）および４．２μＭのアデノシン３’
５’環状モノホスフェート依存性タンパク質キナーゼの特異的タンパク質阻害剤
の残基５〜２４を含有する混合物の添加によって開始した。３０℃にて１０分後
、アリコートをＰ８１ホスホセルロース紙にスポットし、直後に、７５ｍＭのリ
ン酸に浸漬することによって反応を終結させた。この紙を洗浄し、乾燥させて分
析した［３］。１単位（Ｕ）のＳＧＫは１ｎモルのクロスチドを１分でリン酸化
する量とした。
【０２２３】ＲＮＡの調製およびノーザンブロッティング： Ｒａｔ２繊維芽細胞またはＨ４
ＩＩＥ肝癌細胞（１０６細胞）を１０ｃｍシャーレにプレーティングし、１０％
のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ
）で２４時間インキュベートした。培地を血清を含まないＤＭＥＭに変更して細
胞をさらに２４時間インキュベートした。１０％のＦＥＢおよび１μＭのデキサ
メタゾーンで刺激した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（QIAGEN, West Susse
x, UK）を用いて細胞から総ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ（５μｇ）を０．６７Ｍ
のホルムアルデヒドの存在下で１．２％アガロースゲルで電気泳動し、Ｈｙｂｏ
ｎｄ−Ｎ＋（Amersham Pharmacia Biotech, UK）にトランスファーし、紫外線光
下（ＵＶ ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ, Stratagene, La Jolla, CA, USA）で架
橋させた。３２Ｐ標識したプローブはＳＧＫイソ型のオープンリーディングフレ
ームをマルチプライムＤＮＡ標識キット（Amersham Pharmacia Biotech）を用い
て［γ−３２Ｐ］ｄＡＴＰで標識することによって作製した。ハイブリダイゼー
ションはＲａｐｉｄ−ｈｙｂバッファー（Amersham Pharmacia Biotech）中で
６５℃にて２時間実施した。メンブレンは２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで室温に
て３０分間、次いで６５℃にて１５分間洗浄し、さらに０．２×ＳＳＣ／０．１
％ＳＤＳで６５℃にて１５分間洗浄して−７０℃にて３〜５日Ｘ線フィルム（Ｈ
ｙｐｅｒｆｉｌｍ, Amersham）に曝露した。
【０２２４】結果 新規のＳＧＫイソ型のクローニング： ＳＧＫは糖質コルチコイドおよび浸透圧
ストレス応答性遺伝子として最初に同定された（導入を参照）。新規のＳＧＫイ
ソ型を求めて、ＳＧＫの配列でＮＣＢＩデータベースを検索した。この調査によ
り、最初の遺伝子にかなりの類似性を示す２種のヒトＥＳＴが同定された。これ
らのＥＳＴの配列分析により、それらはＳＧＫ遺伝子ファミリーの２種の新規の
イソ型を表すと示され、それらを本発明者らはＳＧＫ２およびＳＧＫ３と名づけ
た。従って、最初のＳＧＫイソ型はＳＧＫ１と名づけた。
【０２２５】 これらのＥＳＴのうち全長クローンであるものはなかったので、５’ＲＡＣＥ
およびＰＣＲ反応を実施して配列の見つかっていない部分を得た（方法を参照）
。これによりＳＧＫ２の２種のスプライシング種を同定し、これらをＳＧＫ２α
およびＳＧＫ２βと名づけた（図１１）。ＳＧＫ２αは３６８個の残基からなり
、４１．１ｋＤａの予想分子量を有するタンパク質をコードしており、ＳＧＫ２
βは４２８個のアミノ酸からなり、４７．６ｋＤａの予想分子量を有するタンパ
ク質をコードしている。ネズミＳＧＫ２αをコードするＥＳＴも同定した（図１
３）。ヒトＳＧＫ２αとは異なり、ネズミｃＤＮＡは開始Ｍｅｔの直前にインフ
レームの終結コドンを含んでいる。このことは最も短いスプライシング種は実際
にはこの位置で開始しないということを確証する。
【０２２６】 ＳＧＫ３のヌクレオチド配列は２種のインフレームのＡＴＧコドンを含んでい
た（図１２）。第２のＡＴＧの周囲の配列は開始コドンを取り巻くことの多いコ
ンセンサスとより厳密に一致している。さらに、終結コドン（ＴＡＡ）が第１の
ＡＴＧのすぐ上流に存在している（図１２）。これらの理由のために、開始部位
は第２のＡＴＧであると考えられる。これは４３０個の残基からなる４９．０ｋ
Ｄａのタンパク質をコードするであろう。第１のＡＴＧが開始に用いられれば、
６２個のアミノ酸分長いポリペプチドが生じるであろう。
【０２２７】 ３種のＳＧＫイソ型のアミノ酸配列は触媒ドメインにおいてお互いに約８０％
同一であるが、他方、短いＣ末端非触媒ドメインはあまり類似していない（４４
〜６８％の同一性）。触媒ドメインの前に位置するＮ末端の８５残基はいっそう
類似していない。この領域には、ＳＧＫ１とＳＧＫ３との間で約２５％の同一性
しか認められず、またＳＧＫ２とその他のイソ型との間にはほとんど同一性がな
い（図１３）。
【０２２８】ＳＧＫイソ型ｍＲＮＡの組織分布： 他の人物によってこれまでに報告されたよ
うに［１３］、ＳＧＫ１ｍＲＮＡのレベルは調べた総ての組織で同様であり、主
要な２．６ｋｂの転写物および微量の７ｋｂの転写物を含んでいた。最高レベル
の両転写物は膵臓で認められた。ＳＧＫ３ｍＲＮＡのレベルも各組織において同
様であり、各場合において主要な５ｋｂの転写物を含んでいた。対照的に、ＳＧ
Ｋ２αおよびＳＧＫ２βを認識するプローブとハイブリダイズするｍＲＮＡはは
るかにより限定された組織分布を示し、２．１ｋｂおよび４．０ｋｂの転写物が
肝臓、腎臓、膵臓および脳に存在していた（図１４）。ＳＧＫ２β特異的プロー
ブもまた肝臓および腎臓において転写物を認識したが、そのレベルははるかに低
く、かつ、シグナルはいく分か拡散していた。
【０２２９】Ｒａｔ２繊維芽細胞およびＨ４ＩＩＥ肝癌細胞におけるＳＧＫイソ型ｍＲＮＡの レベルに対する血清およびデキサメタゾーンの作用： ＳＧＫ１は最初期遺伝子
であり、数種の細胞系統ではそのｍＲＮＡは血清および糖質コルチコイドでの刺
激の１時間以内に大幅に増加する［１１］。従って、本発明者らは３種のＳＧＫ
イソ型の総てをコードするｍＲＮＡに対するこれらの刺激の作用を調べた。Ｒａ
ｔ２繊維芽細胞では、ＳＧＫ１ｍＲＮＡは予想されたように２時間後には血清ま
たはデキサメタゾーンによって強力に誘導されたが、ＳＧＫ３ｍＲＮＡのレベル
はこれらのアゴニストの影響を受けなかった。ＳＧＫ２ｍＲＮＡはＲａｔ２繊維
芽細胞では発現しなかった（図１５Ａ）。ラットＨ４ＩＩＥ肝癌細胞では、血清
ではなくデキサメタゾーンがＳＧＫ１ｍＲＮＡの形成を誘導したが、ＳＧＫ２ｍ
ＲＮＡのレベルはいずれかのアゴニストの影響を受けなかった。ＳＧＫ３ｍＲＮ
ＡはＨ４ＩＩＥ細胞では発現しなかった（図１５Ｂ）。
【０２３０】２９３細胞におけるＳＧＫイソ型の発現： ３種のイソ型の総ては２９３細胞中
でＳＧＴ融合タンパク質として発現させた。ＧＳＴ−ＳＧＫ２α（７０ｋＤａ）
、ＧＳＴ−ＳＧＫ３（７５ｋＤａ）およびＧＳＴ−ΔＮ−ＳＧＫ３（７０ｋＤａ
）の大きさはそれらの予想分子量と一致していた（図１６）。しかしながら、ほ
とんど総てのＧＳＴ−ＳＧＫ２βはＧＳＴを含まないで（２５ｋＤａ）発現した
が、これはおそらく全長融合タンパク質のタンパク質分解のためであろう（図１
６、レーン３）。ＳＧＫ３のＮ末端領域の欠失によりその発現レベルが改良され
た（図１６、レーン５および６）が、ＳＧＫ１と同程度（図１６、レーン１およ
び２）ではなかった。典型的には、それぞれ４００μｇ、１００μｇおよび１５
０μｇの９０％の純粋なＧＳＴ−ΔＮ−ＳＧＫ［６１〜４３１］、８０％の純粋
なＧＳＴ−ＳＧＫ２αおよび９０％の純粋なＧＳＴ−ΔＮ−ＳＧＫ３［５３〜４
２９］が１０枚の直径１０ｃｍのシャーレの細胞から得られた。
【０２３１】ＰＤＫ１によるＳＧＫイソ型のリン酸化および活性化： ＰＫＢαの残基Ｔｈｒ
３０８およびＳｅｒ４７３［３］に相当する２つの重要なリン酸化部位がＳＧＫ
２（ＳＧＫ２α中のＴｈｒ１９３およびＳｅｒ３５６）およびＳＧＫ３（Ｔｈｒ
２５３およびＳｅｒ４１９）、ならびにＳＧＫ１（Ｔｈｒ２５６およびＳｅｒ４
２２）中に保存されている。本発明者ら（実施例１および［１８］）、その後他
の人物［１９］はＰＤＫ１はin vitroでＴｈｒ２５６をリン酸化することによっ
て野生型ＳＧＫ１を活性化すると示している（図１７Ａおよび１７Ｄも参照）。
野生型ＳＧＫ２αおよびＳＧＫ３はまたin vitroでＰＤＫ１によっても活性化さ
れるが、特にＳＧＫ２に関しては、活性化（図１７Ｂおよび１７Ｃ）およびリン
酸化（図１７Ｅおよび１７Ｆ）には高濃度のＰＤＫ１が必要であった。総てのＳ
ＧＫイソ型について１．５μｇ／ｍｌのＰＤＫ１との３０分間のインキュベーシ
ョン後に最大の活性化が認められた（図１７Ａ、１７Ｂおよび１７Ｃ）。この濃
度のＰＤＫ１で、リン酸化の化学量論はＳＧＫ１およびＳＧＫ３に関しては１ｍ
ｏｌ／ｍｏｌ近く、またＳＧＫ２に関しては０．２ｍｏｌ／ｍｏｌであった（示
されていないデータ）。ＰＤＫ１濃度が１０倍高い場合には、ＳＧＫ２およびＳ
ＧＫ３のリン酸化レベルはかなり上がったが、さらなる活性化はともなわなかっ
た（図１７Ｄ、１７Ｅおよび１７Ｆ）。このことはＰＤＫ１は、ＳＧＫ２および
ＳＧＫ３上の、活性に直接影響を及ぼさないその他の部位をリン酸化し得るとい
うことを示唆する。
【０２３２】 本発明者らはＳｅｒ４２２（ＰＤＫ２部位）がアスパラギン酸に変異されてい
るＳＧＫ１変異体は、２９３細胞において発現された後に野生型酵素のものより
も１０倍高い特異的な活性を有するということを証明した（実施例１および［１
８］）。この高い基礎的な活性はＴｈｒ２５６でのリン酸化の増加に起因し、Ｐ
Ｐ２Ａでの処理によって無効にされ得る（実施例１および［１８］）。本研究で
は、本発明者らはＰＰ２Ａ処理したＳＧＫ１［Ｓｅｒ４２２Ａｓｐ］はＰＰ２Ａ
処理した野生型ＳＧＫ１よりもかなり速い速度で再活性化され（図１７Ａ）、リ
ン酸化される（図１７Ｄ）ということを見出した。
【０２３３】 ＳＧＫ１のＳｅｒ４２２に相当するセリンがアスパラギン酸に変異されている
ＳＧＫ２およびＳＧＫ３の相当する変異体（ＳＧＫ２［Ｓｅｒ３５６Ａｓｐ］お
よびＳＧＫ３［Ｓｅｒ４１９Ａｓｐ］）も２９３細胞において発現された後に高
い活性を有していた（示されていないデータ）。ＰＰ２Ａでの処理後、ＳＧＫ２
αは不活性化され、ＳＧＫ１に関してと同様、ＳＧＫ２［Ｓｅｒ３５６Ａｓｐ］
はＰＤＫ１によって野生型ＳＧＫ２αよりもはるかにより効率的に活性化され（
図１７Ｂ）、リン酸化された（図１７Ｅ）。対照的に、ＳＧＫ３［Ｓｅｒ４１９
Ａｓｐ］はＰＰ２Ａによって不活性化されず、ＰＤＫ１およびＭｇＡＴＰとのイ
ンキュベーションによって活性がさらに増大することはなかった（図１７Ｃ）。
しかしながら、ＳＧＫ３［Ｓｅｒ４１９Ａｓｐ］はＰＤＫ１の不在下でさえ、Ｍ
ｇＡＴＰとのインキュベーション時にリン酸化型となったが（図１７Ｆ）、これ
はおそらくは自己リン酸化の結果としてであろう。免役ブロッティングによって
調製物中にＰＤＫ１が検出されなかったので、リン酸化は夾雑物として存在する
ＰＤＫ１によって触媒されるのではないと考えられた（示されていないデータ）
。
【０２３４】 ＳＧＫ２［Ｓｅｒ３５６Ａｓｐ］変異体および野生型ＳＧＫ３は１．５μｇ／
ｍｌのＰＤＫ１およびｍｏｌタンパク質当たりそれぞれ１．２および１．３ｍｏ
ｌのリン酸塩の組み込みをもたらすＭｇＡＴＰとともに３０℃にて３０分間イン
キュベートした。反応を終結させ、トリプシンで消化し、実施例１および［１８
］においてのようにリンペプチドをＣ１８カラムでクロマトグラフィーに付した
（図１８）。ＳＧＫ２由来の主要なホスホトレオニン含有ペプチドおよびＳＧＫ
３消化物（図１８Ａおよび１８Ｂ中のペプチドＰ２およびＰ５）をＮ−Ａｓｐプ
ロテイナーゼで半消化してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析および固相エドマン配列
決定［２０］に付してリン酸化部位を同定した。これらの実験によりＳＧＫ２由
来のリンペプチドはＴｈｒ１９３でリン酸化された残基１８９〜２０７に相当し
、他方、ＳＧＫ３リンペプチドはＴｈｒ２５３でリン酸化された残基２４９〜２
６７に相当するということが示された。これらの実験はＰＤＫ１は実際にＳＧＫ
２およびＳＧＫ３をＳＧＫ１のＴｈｒ２５６に相当する部位でリン酸化するとい
うことを確証するものである。
【０２３５】 ホスホセリン含有トリプシンペプチドＰ１、Ｐ３およびＰ４（図１８）もＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析およびエドマン配列決定によって分析した。これらの実
験により、ペプチドＰ１はＳｅｒ２７９でリン酸化された残基２７７〜２８７に
相当し、他方、ペプチドＰ３はＳｅｒ３３４でリン酸化された残基３３４〜３６
７を含んでなるということが示された。ペプチドＰ４は残基７３〜９９に相当し
、Ｓｅｒ７５またはＳｅｒ７７のいずれかでリン酸化されており、後者がリン酸
化の主要部位であった。これらの発見は考察でさらに考慮されている。
【０２３６】 ＰＤＫ１によるＳＧＫ２およびＳＧＫ３の活性化はホスファチジルセリンおよ
びホスファチジルコリンを含有する脂肪小胞の影響を受けず、また１０μＭのＰ
Ｉ３，４，５三リン酸をさらに含有することでわずかに阻害された（示されてい
ないデータ）。これらの結果はこれまでにＳＧＫ１に関して得られたものと同様
である。
【０２３７】ＳＧＫイソ型の基質特異性： 本発明者らはＳＧＫ１およびＰＫＢは一群の合成
ペプチドに対して同様の特異性を有し、好ましくはＡｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘ
ａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフ中に位置するセリンおよびトレオニン残
基をリン酸化するということを示している（実施例１および［１８］）。本実施
例では、ＳＧＫ２αおよびＳＧＫ３の特異性必要条件も同様であると認められた
（表２）が、ＳＧＫ３はｎ−３位置（ｎがリン酸化部位である場合の）でのアル
ギニンの代わりのリシンの存在をＳＧＫ１またはＳＧＫ２αよりもわずかにより
許容すると考えられた（表２）。
【０２３８】表２：クロスチドに関連する合成ペプチドに対するＳＧＫイソ型の活性の比較 この実験は２９３細胞から精製したＧＳＴ−ΔＮ−ＳＧＫ１［Ｓ４２２Ｄ］、
ＧＳＴ−ＳＧＫ２α［Ｓ３５６Ｄ］およびＧＳＴ−ΔＮ−ＳＧＫ３［Ｓ４１９Ｄ
］を用いて実施した。活性はペプチド１（クロスチド）と比較して示されている
。各ペプチドの濃度は３０μＭとした。ペプチド２へのアミノ酸置換に下線が引
かれている。示された結果は、各々±１０％まで一致する２回の実験の平均であ
る。
【０２３９】
【表２】
【０２４０】２９３細胞におけるＳＧＫイソ型の活性化： 各ＳＧＫイソ型を２９３細胞にお
いて発現させ、それらの種々の刺激によって敏感に活性化される能力を調べた。
これまでに報告されたように（実施例１および［１８、１９］）、ＩＧＦ１での
刺激はＳＧＫ１活性の４〜５倍の増大を誘導し（図１９）、これは１０分後に最
大に達した（示されていないデータ）。対照的に、ＳＧＫ２αおよびＳＧＫ３は
ＩＧＦ１によって２倍にしか活性化されなかった（図１９）。活性化は５分後に
最大となり、少なくとも２０分間持続した（示されていないデータ）。ＳＧＫ２
αおよびＳＧＫ３（５倍）の強力な活性化を生じるアゴニストはＳＧＫ１に関し
て認められたものと同様に過酸化水素であった（図１９）。血清も３種のイソ型
総ての弱いアクチベーターであった。しかしながら、ＳＧＫ１を強力に阻害する
浸透圧ショック（０．４Ｍのソルビトールでの処理）はＳＧＫ２αまたはＳＧＫ
３の活性に影響を及ぼさなかった（図１９）。
【０２４１】 過酸化水素によって誘導されたＳＧＫ２およびＳＧＫ３の活性化は、細胞を過
酸化水素での刺激に先立ってウォルトマンニンまたはＬＹ２９４００２（ＰＩ３
−キナーゼの２種の阻害剤）とともにプレインキュベートしても部分的にしか阻
害されなかった。対照的に、ＳＧＫ１の活性化は無効にされた（図２０）。
【０２４２】考察 本実施例では、本発明者らはＳＧＫ２およびＳＧＫ３と呼ばれるＳＧＫ１の２
種の新規なイソ型を同定しており、それらはその触媒ドメインにおいてＳＧＫ１
と８０％の同一性を共有している。しかしながら、この類似性にもかかわらず、
ＳＧＫ２およびＳＧＫ３はいくつかの点で互いにおよびＳＧＫ１とかなり異なっ
ている。第１に、ＳＧＫ１およびＳＧＫ３をコードするｍＲＮＡは広範に発現さ
れるが、ＳＧＫ２をコードするものはより限定された分布をしており、肝臓、腎
臓および膵臓で高く発現され、また脳で低レベルで発現されている（図４）。第
２に、ＳＧＫ２ｍＲＮＡおよびＳＧＫ３ｍＲＮＡは血清または糖質コルチコイド
での細胞刺激によって増加しない（図１５）が、他方、ＳＧＫ１ｍＲＮＡレベル
はこれらのアゴニストへの曝露の１時間以内に大幅に上がる（［１１］、図１５
）。
【０２４３】 ＳＧＫ２およびＳＧＫ３はＳＧＫ１よりも遅くではあるがin vitroでＰＤＫ１
によって活性化され（図１７）、かつ、活性化はキナーゼサブドメインVIIとVII
Iとの間の「活性化ループ」中の同一の残基（ＳＧＫ１中のＴｈｒ２５６、ＳＧ
Ｋ２中のＴｈｒ１９３、およびＳＧＫ３中のＴｈｒ２５３）のリン酸化によって
達成される。さらに、ＳＧＫ１（実施例１および［１８］）およびｐ７０Ｓ６キ
ナーゼ［９］同様、in vitroでのＳＧＫ２およびＳＧＫ３のＰＤＫ１によって触
媒されるリン酸化および活性化はＣ末端Ｓｅｒ（ＳＧＫ１中のＳｅｒ４２２、Ｓ
ＧＫ２中のＳｅｒ３５６およびＳＧＫ３中のＳｅｒ４１９）のＡｓｐへの変異に
よって大幅に増強されるが、このことはこの残基のリン酸化は活性化ループＴｈ
ｒのＰＤＫ１によって触媒されるリン酸化にとって必要条件であるということを
示唆する。これらの観察結果からＳＧＫイソ型をＣ末端Ｓｅｒでリン酸化するタ
ンパク質キナーゼの同定という問題が生じる。ＰＤＫ１はＰＲＫ２のＣ末端配列
に相当するペプチドと相互作用することによって、ＰＫＢをＳｅｒ４７３ならび
にＴｈｒ３０８でリン酸化する形態に変換される［６］。ＰＤＫ１が異なるタン
パク質と相互作用することによってＳＧＫイソ型を両部位でリン酸化する形態に
変換され得るのか、あるいはin vivoではこの残基が別個のタンパク質キナーゼ
によってリン酸化されるのかはまだ確認されていない。
【０２４４】 ＰＤＫ１によって１つの主要な部位（Ｔｈｒ２５６；実施例１および［１８］
）でリン酸化されるＳＧＫ１とは対照的に、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３はＰＤＫ１
およびＭｇＡＴＰとともにインキュベートすると２つのさらなるセリン残基でリ
ン酸化型となる（図１８）。ＳＧＫ２はＳｅｒ２７９およびＳｅｒ３３４、なら
びにＴｈｒ１９３でリン酸化される。Ｓｅｒ３３４の周囲の配列（Ｓｅｒ−Ｉｌ
ｅ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ）はＴ
ｈｒ１９３の周囲のもの（Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ））と類似しており（図１３）、このことはＳ
ｅｒ３３４がＰＤＫ１によってリン酸化されるということを示唆し、ＰＤＫ１の
生理学的基質はキナーゼではないタンパク質を包含し得るという可能性が高まる
。Ｓｅｒ３３４に相当するセリンはＳＧＫ１およびＳＧＫ３中に存在している（
図３）が、ＰＤＫ１によってかなりリン酸化されるわけではない［１８］（図１
８）。この理由は明らかではないが、この残基の付近に生じる特定のアミノ酸置
換に関連している可能性がある。
【０２４５】 興味深いことに、Ｓｅｒ２７９はＳＧＫおよびＰＫＢによるリン酸化のための
最適コンセンサス［１８、２２］に一致するＡｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−
Ｘａａ−Ｓｅｒ配列中に位置する（図１３）。このことはＳｅｒ２７９リン酸化
はＰＤＫ１によって活性化された後のＳＧＫ２自身によって触媒される自己リン
酸化現象であるようであるということを示唆する。この発見からもＳｅｒ２７９
はin vivoで別のＳＧＫイソ型またはＰＫＢなどの別のタンパク質キナーゼによ
ってリン酸化され得るという興味深い可能性が高まる。Ｓｅｒ２７９リン酸化が
細胞および組織において生じるのか、またそれがＳＧＫ２の特性を触媒的に変更
し調節するのかを調べることがかなり興味深いことであるのは明らかであろう。
Ｓｅｒ２７９はＳＧＫ１またはＳＧＫ３のいずれにも保存されていない（図１３
）。
【０２４６】 ＳＧＫ３もまた、ＰＤＫ１およびＭｇＡＴＰとともにインキュベーションした
際に２個のセリン（Ｓｅｒ７７およびＳｅｒ７９）でリン酸化型となったが、こ
れらもＳＧＫ１またはＳＧＫ２中には保存されていない（図１３）。これらの残
基はＳＧＫまたはＰＤＫ１のいずれかの最適コンセンサス配列中に位置しないが
、それらは２つの理由のためにおそらくはＳＧＫ３によって触媒される自己リン
酸化現象である。第１に、活性化されたＳＧＫ３はＰＤＫ１の不在下で自己リン
酸化する（図１７Ｆ）、第２に、これらのインキュベーション中のＳＧＫ３濃度
は最適ペプチド基質とともに用いるものと比較して極めて高い、第３に、塩基性
残基（Ｌｙｓ７４およびＨｉｓ７６）がＳｅｒ７７およびＳｅｒ７９の３残基Ｎ
末端に存在するが、これはＳＧＫによるリン酸化の必要条件の１つである。
【０２４７】 アゴニストに対するＳＧＫ２およびＳＧＫ３の応答もまたいくつかの点でＳＧ
Ｋ１と異なっている。例えば、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３はＩＧＦ１によってＳＧ
Ｋ１よりも低い程度に（同様に迅速にではあるが）活性化される（図１９）。過
酸化水素に応じた活性化は３種のイソ型総てに関して同様である（５倍）が、Ｐ
Ｉ−３キナーゼの阻害剤はＳＧＫ２およびＳＧＫ３の活性化を部分的にしか抑制
しないが、ＳＧＫ１の活性化は無効とされる（図２０）。さらに、ＳＧＫ２およ
びＳＧＫ３活性は浸透圧ストレスに対する曝露の影響を受けないが、ＳＧＫ１（
図１９）およびＰＫＢ［２３］活性は実質的に消失する。ＳＧＫ２およびＳＧＫ
３の細胞下局在化はＳＧＫ１のものに匹敵し得る。これらのイソ型はＳＧＫ１と
同様にして核または別の細胞小器官を異なるアゴニストに応じて輸送し得る［１
９］。ＳＧＫ２およびＳＧＫ３の内生レベルを検出するために十分に感受性のあ
るイソ型特異的抗体の開発はＳＧＫ２およびＳＧＫ３の細胞下位置を決定するの
に有用であり得る。
【０２４８】 構造的に活性な変異体の過剰発現によって得られた結果に基づいていくつかの
生理学的役割がＰＫＢに割り当てられている（［１、２］に概説されている）。
しかしながら、ＳＧＫイソ型はＰＫＢと同様の特異性を有しており（表２）、か
つ、in vivoで同一の刺激によって活性化される。さらに、ＳＧＫ１はＰＫＢのi
n vitroおよび同時トランスフェクション実験（実施例１および［１８］）でグ
リコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）を不活性化する能力を模倣し得る
。従って、ＰＫＢによって果たされると考えられているいくつかの生理学的役割
はＳＧＫイソ型によって媒介されることが可能である。逆に、アフリカツメガエ
ル卵母細胞におけるＳＧＫ１との同時発現によって生じた上皮ナトリウムチャン
ネルの活性化［１６］は別のＳＧＫイソ型によってまたはＰＫＢによって実際に
媒介され得る。
【０２４９】実施例５の参照文献
【化１３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＰＫＢ、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、およびＰＫＣζにおける活性化リン酸化部位周
辺のアミノ酸配列ならびに対応するＳＧＫの領域とのそれらの類似点。それらを
太字で表し、ＰＫＢおよびｐ７０Ｓ６キナーゼにおけるリン酸化残基に下線を付
けている。リン酸化部位は各酵素の１６０〜１６５残基で識別される。
【図２】 ２９３細胞におけるＳＧＫおよびＰＫＢ融合タンパク質の発現および精製。２
９３細胞において発現されたＧＳＴ融合タンパク質を細胞溶解タンパク質２００
μｇからグルタチオンセファロースで精製し、５〜２０％（パネルＡ）または１
０％（パネルＢ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に付し、クマシ
ーブルーで染色した。細胞を次の構築物：レーン１、ＧＳＴを発現するｐＥＢＧ
２Ｔ；レーン２および４、全長ＳＧＫを発現するｐＥＢＧ−ＳＧＫ；レーン３、
全長ＰＫＢαを発現するｐＥＢＧ−ＰＫＢα；レーン５、Ｎ末端切断型ＳＧＫを
発現するｐＥＢＧ−ΔＮ−ＳＧＫ（６１−４３１）でトランスフェクトした。ま
たマーカータンパク質（レーンＭ）およびそれらの分子量も示す。
【図３】 非刺激２９３細胞から精製したＧＳＴ−ＳＧＫ融合タンパク質の活性。指示し
た野生型ＳＧＫおよび変異体を２９３細胞において発現させ、グルタチオンセフ
ァロースで精製した。各融合タンパク質（１μｇ）を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣ
ｌ ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエ
タノール５０μｌ中のタンパク質ホスファターゼ２Ａ（３０ｍＵ／ｍｌ）を加え
て３０℃で２０分間インキュベートした。（＋）を示した場合、ＰＰ２Ａを加え
る前にミクロシスチン−ＬＲ（１μＭ）を加えた。別のインキュベーション（−
）では、ホスファターゼによる処理後にミクロシスチン−ＬＲだけを加えた。次
いで基質として「クロスチド」を用い、ＳＧＫ活性を測定した。
【図４】 in vitroにおけるＰＤＫ１によるＳＧＫのリン酸化および活性化。（Ａ）方法
で記載したように、ＧＳＴ−ＰＤＫ１（０．１μｇ）および［γ−３２Ｐ］ＡＴ
Ｐ（５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を用いてＧＳＴ−ＳＧＫ（０．３μｇ）をリン酸
化した。（＋）を示した場合、ホスファチジルセリン（１００μＭ）およびホス
ファチジルコリン（１００μＭ）（ＰＳ／ＰＣ）を含有する脂質小胞中の１μＭ
ＰｔｄＩｎｓ［３，４，５］Ｐ３も加えた。ＳＤＳを２％まで加えて反応を停
止させ、９５℃で５分間加熱した後にサンプルを１０％ＳＤＳ／ポリアクリルア
ミドゲルでの電気泳動に付し、クマシーブルーで染色し、次いでオートラジオグ
ラフを撮影した。分子量マーカーの位置も示した。（Ｂ）［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ
の代わりに非標識ＡＴＰを用いたことを除いて、（Ａ）と同様である。３０℃で
１０分間インキュベートした後、基質として「クロスチド」を用い、１０μｌア
リコートをＳＧＫ活性についてアッセイした。結果は異なる３回の試験の±ＳＤ
で示されている。
【図５】 in vitroにおけるＰＤＫ１によるＳＧＫのリン酸化への突然変異の影響。（Ａ
）図３の説明で記載したように、野生型（ＷＴ）ＧＳＴ融合タンパク質または変
異体ＧＳＫ（０．３μｇ）をＰＰ２Ａを加えてインキュベートし、ＰＰ２Ａを不
活性化するミクロシスチン−ＬＲ（１μＭ）を加えた後、ＳＧＫタンパク質をＰ
ＤＫ１（０．１μｇ）を加え（＋）および加えず（−）、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ
（５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を加えてインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付
し、クマシーブルーで染色し、次いでオートラジオグラフを撮影した。Ｌｙｓ１
２７Ａｌａ突然変異により触媒的に不活性な変異体が生じる。（Ｂ）［γ−３２ Ｐ］ＡＴＰ（５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）の代わりに非標識ＡＴＰを用いたことを
除いて、（Ａ）と同様である。３０℃で１０分間インキュベートした後、基質と
して「クロスチド」を用い、１０μｌアリコートをＳＧＫ活性についてアッセイ
した。結果は異なる３回の試験の±ＳＤで示されている。（Ｃ）（Ａ）の場合の
ように野生型ＳＧＫのＧＳＴ融合タンパク質またはＳ４２２Ｄ変異体（１μｇ）
をＰＰ２Ａを加えてインキュベートし、ＰＤＫ１（０．２μｇ）および［γ−３ ２ Ｐ］ＡＴＰによりリン酸化し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてオートラジオ
グラフィーに付した。（Ｄ）［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの代わりに非標識ＡＴＰを用
いたことを除いて、（Ｃ）と同様である。３０℃で１０分間インキュベートした
後、アリコートの反応物をＳＧＫ活性についてアッセイした。結果は異なる３回
の試験の±ＳＤで示されている。
【図６】 ＳＧＫにおけるＰＤＫ１リン酸化部位のマッピング。（Ａ）方法で記載したよ
うに、ＧＳＴ−ΔＮ−ＳＧＫ［Ｓ４２２Ｄ］（２６μｇ）をＰＤＫ１によりリン
酸化し、Ｖ８プロテアーゼで消化した。消化物を０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）中で平衡状態にしたＶｙｄａｃ Ｃ１８カラムに加えた。カラ
ムを０．１％ＴＦＡ中の直線勾配のアセトニトリルにより流量０．８ｍｌ／分で
展開し、０．４ｍｌの画分を回収した。３２Ｐ−放射能を実線で、アセトニトリ
ル勾配を対角線で示す。挿入図は主要な３２Ｐ標識ペプチドのホスホアミノ酸解
析を示している。（Ｂ）パネルＡの１アリコートの主要なリンペプチドをApplie
d Biosystems 470A シーケンサー［２９］における固相配列決定により解析し、
エドマン分解の各サイクル後に放出される３２Ｐ−放射能を測定した。
【図７】 ＳＧＫおよびＰＫＢαはＧＳＫ３を同程度に不活性化する。ウサギ骨格筋から
精製したＧＳＫ３（５０ｍＵ）をペプチドの代わりにしたことを除いて、ペプチ
ドリン酸化に関して記載したようにインキュベーションを行った。ＧＳＫ３活性
の単位を［３０］に記載する。ＭｇＡＴＰ単独（△）およびＳＧＫ（○）または
ＰＫＢα（●）のいずれかを加えてインキュベーションした後の種々の時点にア
リコートを取り、［３０］の場合のようにＧＳＫ３活性についてアッセイした。
【図８】 ２９３細胞におけるＳＧＫの活性化。 （Ａ）細胞を野生型ＧＳＴ−ＳＧＫ（ＳＧＫ−ＷＴ）またはＧＳＴ−ＳＧＫ［Ｔ
２５６Ａ］を発現するＤＮＡ構築物で一時的にトランスフェクトし、次いで５０
ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−１により１０分間または２ｍＭ過酸化水素にとり２５分間
刺激し、続いて氷冷溶解バッファー中に溶解した。グルタチオンセファロース５
μｌを細胞溶解タンパク質５０ｍｇに加え、４０℃で３０分間のエンド・オーバ
ー・エンド・ローテーション(end over end rotation)の後、懸濁液を１３，０
００×ｇで１分間遠心分離した。上清を廃棄し、ビーズを０．５Ｍ ＮａＣｌを
含むバッファーＡ １ｍｌで４回、次いでバッファーＢで３回洗浄した。６０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１２ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１２％（ｖ
／ｖ）２−メルカプトエタノール、３．０μＭ ＰＫＩ、１．２μＭミクロシス
チン−ＬＲ、１２ｍＭ塩化マグネシウムおよび３６μＭ「クロスチド」の４０４
ｌをビーズに加えた。氷上に１０分間置いた後、ビーズに１ｍＭ［γ−３２Ｐ］
ＡＴＰ（５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）５μｌを加えてＳＧＫ活性について３０℃で
アッセイした。ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いてクマシーブル
ーでの染色（データは示さず）によりわかるように、２９３細胞における野生型
および変異体ＳＧＫの発現は類似していた。結果は異なる３回の試験の±Ｓ．Ｄ
．で示されている。（Ｂ）ＩＧＦ−１または過酸化水素により刺激する前に細胞
を１００ｎＭウォルトマンニンで１０分間前処理したことを除いて、（Ａ）の場
合のように野生型ＧＳＴ−ＳＧＫ（ＳＧＫ−ＷＴ）について試験を行った。
【図９】 ２９３細胞におけるＳＧＫの活性化の時間経過。２９３細胞をｐＥＢＧ−ＳＧ
Ｋ（○）またはｐＥＢＧ−ＰＫＢα（●）で一時的にトランスフェクトし、次い
で５０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−１（Ａ）または２ｍＭ過酸化水素で（Ｂ）により刺
激した。示された時間に細胞を溶解し、ＧＳＴ−ＳＧＫまたはＧＳＴ−ＰＫＢα
を図８の場合のようにグルタチオンセファロースで精製してアッセイした。△は
図３の説明で記載したように、ＰＰ２Ａ（３０ｍＵ／ｍｌ）を加えてインキュベ
ーションした後のＧＳＴ−ＳＧＫ活性を示す。結果は１回の試験の＋Ｓ．Ｄ．で
示されている。この試験では各時点に異なる３枚のディッシュの細胞を用いた。
同様の結果が別の独立した試験でも得られた。
【図１０】 ２９３細胞におけるＳＧＫの活性化へのＳｅｒ４２２における突然変異の影響
。２９３細胞をｐＥＢＧ−ＳＧＫ、ｐＥＢＧ−ＳＧＫ［Ｓ４２２Ａ］またはｐＥ
ＢＧ−ＳＧＫ［Ｓ４２２Ｄ］で一時的にトランスフェクトし、次いで５０ｎｇ／
ｍｌ ＩＧＦ−１を加え（＋）または加えず（−）に１０分間刺激した。細胞を
溶解し、ＧＳＴ−ＳＧＫを図８の場合のようにグルタチオンセファロースで精製
してアッセイした。細胞溶解タンパク質５０μｇを野生型ＳＧＫおよびＳＧＫ［
Ｓ４２２Ａ］のアッセイに、および２５μｇをＳＧＫ［Ｓ４２２Ｄ］のアッセイ
に用いた。ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いてクマシーブルーで
の染色（データは示さず）によりわかるように、各タンパク質は同程度の量発現
された。（Ｂ、Ｃ）２９３細胞を指示したｐＥＢＧ−ＳＧＫ（Ｂ）またはｐＥＢ
Ｇ−ΔＮ−ＳＧＫ（Ｃ）で一時的にトランスフェクトし、５０ｎｇ／ｍｌ ＩＧ
Ｆ−１を加えて１０分間刺激したことを除いて、（Ａ）と同様である。細胞溶解
タンパク質５０μｇを野生型ＳＧＫのアッセイに、および１０μｇをＮ末端切断
型酵素のアッセイに用いた。
【図１１】 ヒトおよびマウスＳＧＫ２のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列。Ａ、ＳＧ
Ｋ２α。キナーゼ触媒ドメインに対応する残基３３〜３２９。終結コドンに▲の
印をつけている。Ｂ、ＳＧＫ２β；ＳＧＫ２αとは異なるＳＧＫ２βの５’領域
。ＳＧＫ２αの配列を開始する開始メチオニンにアスタリスク（＊）の印をつけ
ている。この残基の後のＳＧＫ２αおよびＳＧＫ２βの配列は同一である。
【図１２】 ヒトおよびＳＧＫ３のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列。Ａ、ＳＧＫ２α
。キナーゼ触媒ドメインに対応する残基９３〜３８９。終結コドンに▲の印をつ
けている。＊＊＊で５’ＡＴＧコドンのだいたいの位置を示し、直前にある終結
コドンに下線を付けている。
【図１３】 ＳＧＫイソ型のアミノ酸配列アラインメント。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム
(Thompson, J. D., Higgins, D. G. and Gibson T. J. (1994) Nuc. Acids Res.
22, 4673-4680)を用いてヒト（ｈ）ＳＧＫ１、ｈＳＧＫ２、ネズミ（ｍ）ＳＧ
Ｋ２およびｈＳＧＫ３のアラインメントを行った。それらに黒で影を付け、ＳＧ
Ｋ２αおよびＳＧＫ２βの開始コドンを矢で示す。２つの重要なリン酸化に＊で
印をつけている。
【図１４】 種々のヒト組織におけるＳＧＫ１、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３をコードするｍＲ
ＮＡの発現。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ２μｇを含むノーザンブロットを３２Ｐ標識Ｓ
ＧＫ１、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３ｃＤＮＡプローブでハイブリダイズした。次い
でメンブランを３〜５日間Ｘ線フィルムに露光した。ＳＧＫ２のプローブはＳＧ
Ｋ２αおよびＳＧＫ２βと共通のものである。特異なＳＧＫ２βに関して得られ
た結果を別のパネルに示す。キロベース（ｋｂ）の規定サイズをもつ標準ＲＮＡ
マーカーの位置に印をつけている。
【図１５】 種々のアゴニストによるＳＧＫイソ型をコードするｍＲＮＡの導入。（Ａ）血
清の機能を２４時間失わせたラット２繊維芽細胞を１０％胎児ウシ血清（血清）
または１μＭデクサメタゾン（Ｄｅｘ）を加えてまたはさらなる添加剤を加えず
に（対照）２時間インキュベートした。各ディッシュの細胞（５μｇ）から抽出
される全ＲＮＡを電気泳動に付し、ノーザンブロッティングによるＳＧＫイソ型
転写物について解析した。サンプルの添加が等量であること証明するために、メ
ンブランを３２Ｐ標識グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
（ＧＡＰＤＨ）ＤＮＡで再びプロービングした（パネル下）。標準ＲＮＡマーカ
ー１８Ｓおよび２８ＳリボゾームＲＮＡの位置を示す。Ｈ４ＩＩＥ肝癌細胞を用
いる、Ａと同様の試験。
【図１６】 ２９３細胞におけるＧＳＴ融合タンパク質としてのＳＧＫイソ型の発現。ＧＳ
Ｔ融合タンパク質を２９３細胞において発現させ、細胞溶解タンパク質２００μ
ｇからグルタチオンセファロースにおけるクロマトグラフィーにより精製した。
１５ｍＭグルタチオンで溶出したタンパク質を１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミ
ドゲルでの電気泳動に付し、クマシーブルーで染色した。細胞を次の構築物：レ
ーン１、全長ＳＧＫ１を発現するｐＥＢＧ−ＳＧＫ１；レーン２、Ｎ末端切断型
ＳＧＫ１を発現するｐＥＢＧ−ΔＮ−ＳＧＫ１；全長ＳＧＫ２βを発現するｐＥ
ＢＧ−ＳＧＫ２β；レーン４、全長ＳＧＫ２αを発現するｐＥＢＧ−ＳＧＫ２α
；レーン５、全長ＳＧＫ３を発現するｐＥＢＧ−ＳＧＫ３；レーン６、Ｎ末端切
断型ＳＧＫ３を発現するｐＥＢＧ−ΔＮ−ＳＧＫ３；レーン７、ＧＳＴを発現す
るｐＥＢＧ−２Ｔでトランスフェクトした。またマーカータンパク質（レーンＭ
）およびそれらの分子量も示す。
【図１７】 ＰＤＫ１による野生型および変異体ＳＧＫイソ型のリン酸化および活性化。Ａ
、ＢおよびＣ；材料および方法で記載したように、精製したＧＳＴ融合タンパク
質（０．４μｇ）をＰＰ２Ａを加えてインキュベートし、次いでミクロシスチン
−ＬＲ（１μＭ）を加えてＰＰ２Ａを不活性化した。次いで指示した量の精製Ｇ
ＳＴ−ＰＤＫ１を用いてＳＧＫイソ型（２０μｇ／ｍｌ）をリン酸化した。３０
℃で３０分後、基質として「クロスチド」を用い、ＳＧＫ活性を測定した。結果
は３回の試験の±ＳＤで示されている。●は野生型ＳＧＫについての結果および
○はそのＰＫＢのＳｅｒ４７３と等しい残基がＡｓｐに変化した変異体ＳＧＫに
ついての結果を示す。Ｄ、ＥおよびＦ；非標識ＡＴＰの代わりに１００μＭ［γ
−３２Ｐ］ＡＴＰ（５００ｃ．ｐ．ｍ．／ｐｍｏｌ）を用いたことを除いて、Ａ
、ＢおよびＣと同様である。ＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールをそれぞれ
最終濃度１％（ｗ／ｖ）および１％（ｖ／ｖ）まで加えて反応を停止させ、９５
℃で５分間の加熱、１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動および
オートラジオグラフィーを続けた。パネル上は野生型（ｗｔ）ＳＧＫイソ型につ
いての結果およびパネル下は変異体ＳＧＫついての結果を示す。ゲルにおける各
ＳＧＫイソ型およびＰＤＫ１の位置に印をつけている。
【図１８】 ＰＤＫ１によるリン酸化後のＳＧＫ２αおよびＳＧＫ３からのトリプシンリン
ペプチドの分離。ＧＳＴ−ＳＧＫ２α（パネル上）またはＧＳＴ−ＳＧＫ３（パ
ネル下）をＰＰ２Ａによる処理で不活性化し、ＰＤＫ１（１．５μｇ／ｍｌ）お
よびＭｇ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（５０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）によりリン酸化し
、ＳＤＳにおいて変性し、４−ビニルピリシンによりアルキル化し、図１７の説
明で記載したように、ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。ＳＧ
Ｋ２αおよびＳＧＫ３に相当するバンドを削り取り、ゲルから溶出し、トリクロ
ロ酢酸で沈殿させて、従前に記載したようにトリプシンで消化した(Cuenda et a
l (1996) EMBO J 15, 4156-4164)。消化物を０．１％トリフルオロ酢酸中で平衡
状態にしたＶｙｄａｃ Ｃ１８カラムに加え、３２Ｐ−ペプチド（Ｐ）を０．１
％トリフルオロ酢酸中の直線アセトニトリル勾配を用い、流量０．８ｍｌ／分で
分離した。０．４ｍｌの画分を回収し、３２Ｐ−放射能（実線）について分析し
た。アセトニトリル勾配を破線の対角線で示す。
【図１９】 ２９３細胞におけるＳＧＫイソ型の活性化。 細胞を（Ａ）ＧＳＴ−ＳＧＫ１、（Ｂ）ＧＳＴ−ＳＧＫ２αおよび（Ｃ）ＧＳＴ
−ＳＧＫ３を発現するＤＮＡ構築物で一時的にトランスフェクトした。トランス
フェクション２４時間後、細胞を血清の機能を１６時間失わせ、次いで５０ｎｇ
／ｍｌ ＩＧＦ−１（１０分）、４００ｎｇ／ｍｌホルボールミリステートアセ
テート（ＰＭＡ）（３０分）、１０％血清（３０分）、１μＭデクサメタゾン（
Ｄｅｘ、６０分）、２ｍＭ Ｈ２Ｏ２（２５分）、５μｇ／ｍｌアニソマイシン
（ＡＮ、３０分）、０．４Ｍソルビトール（３０分）、低張ストレス（ＤＭＥＭ
３ｍｌに加える水１ｍｌ、３０分）、ＵＶ照射（２００Ｊ／ｍ２への照射後３０
分）に曝すまたは未処理状態（対照）とした。各処理後に細胞を氷冷溶解バッフ
ァー中に溶解し、細胞溶解タンパク質１００μｇのＳＧＫ活性を測定した。ＳＤ
Ｓ／ＰＡＧＥ、続いてクマシーブルーでの染色（結果は示さず）によりわかるよ
うに、それぞれのトランスフェクションにおいて各イソ型の発現は類似していた
。結果は異なる３回の試験の±Ｓ．Ｄ．で示されている。
【図２０】 ２９３細胞における過酸化水素によるＳＧＫイソ型の活性化へのＰＩ３−キナ
ーゼ阻害剤の影響。細胞を（Ａ）ＧＳＴ−ＳＧＫ１、（Ｂ）ＧＳＴ−ＳＧＫ２α
および（Ｃ）ＧＳＴ−ＳＧＫ３を発現するＤＮＡ構築物で一時的にトランスフェ
クトした。トランスフェクション２４時間後、細胞を血清の機能を１６時間失わ
せた。次いでトランスフェクト細胞を１００ｎＭウォルトマンニンで１０分間ま
たは１００μＭ ＬＹ２９４００２で１時間前処理し、次いで２ｍＭ Ｈ２Ｏ２ により２５分間刺激した。結果は異なる３回の試験の±Ｓ．Ｄ．で示されている
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 19/00 ４Ｂ０６５ Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８４ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 ４Ｈ０４５ 1/19 1/21 1/21 9/12 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9/12 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/48 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 マリア、ディーク イギリス国ダンディー、フォース、プレイ ス、18 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB24 BB46 BB50 CB01 DA13 DA36 FB01 FB02 FB08 4B024 AA01 AA11 BA10 CA04 CA07 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 GA11 HA01 HA11 4B050 CC03 CC04 CC05 DD07 HH01 KK18 LL01 LL03 4B063 QQ27 QQ95 QR07 QR48 QR57 QS24 QX07 4B064 AG01 CA01 CA19 CC24 DA01 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 BA01 CA29 CA44 4C084 AA17 ZA542 ZB262 ZC202 ZC352 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA89 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (44)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 血清および糖質コルチコイド誘導性タンパク質キナーゼ（ＳＧＫ）をリン酸化
    し、ＳＧＫを活性化する方法。
  2. 【請求項２】 ＳＧＫを脱リン酸化する、リン酸化されたＳＧＫの活性を低下させる方法。
  3. 【請求項３】 ＳＧＫを、ＰＤＫ１またはその変異体、断片、融合体もしくは誘導体、または
    前記の変異体、断片もしくは誘導体の融合物によってリン酸化する、請求項１に
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 ＳＧＫを、ＰＰ１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ａまたはそれらの変異体、断片、融合体
    もしくは誘導体、または前記の変異体、断片もしくは誘導体の融合物によって脱
    リン酸化する、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 ＳＧＫを不活性化および／または脱リン酸化する方法における、ＰＰ１、ＰＰ
    ２Ｃ、ＰＰ２Ａまたはそれらの変異体、断片、融合体もしくは誘導体、または前
    記の変異体、断片、もしくは誘導体の融合物の使用。
  6. 【請求項６】 ＳＧＫを活性化および／またはリン酸化する方法における、ＰＤＫ１またはそ
    の変異体、断片、融合体もしくは誘導体、または前記の変異体、断片もしくは誘
    導体の融合物の使用。
  7. 【請求項７】 ＳＧＫを全長ヒトＳＧＫ１のＴｈｒ２５６に相当する残基においてリン酸化す
    る、ＳＧＫを活性化する方法。
  8. 【請求項８】 ＳＧＫを全長ヒトＳＧＫ１のＳｅｒ４２２に相当する残基においてリン酸化す
    る、ＳＧＫを活性化する方法。
  9. 【請求項９】 ＳＧＫを全長ヒトＳＧＫ１のＴｈｒ２５６に相当する残基においてさらにリン
    酸化する、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ＳＧＫを、ＰＤＫ２活性を含む調製物によって活性化および／またはリン酸化
    される、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ヒトＳＧＫまたはその変異体、断片もしくは誘導体を含んでなる、融合ポリペ
    プチド。
  12. 【請求項１２】 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含んでなる、請求項１１に記載の融
    合ポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 ヒト全長ＳＧＫ１のＮ末端の約２０個、３０個、４０個、５０個もしくは６０
    個のアミノ酸に相当する残基が存在しない、ヒトＳＧＫまたはその変異体もしく
    は誘導体の断片を含んでなる、請求項１１または１２に記載の融合ポリペプチド
    。
  14. 【請求項１４】 全長ヒトＳＧＫ１のセリン４２２に相当する残基が置換されており、かつ／ま
    たは全長ヒトＳＧＫ１のトレオニン２５６に相当する残基が置換されており、か
    つ／または全長ヒトＳＧＫ１のリシン１２７に相当する残基が置換されている、
    ヒトＳＧＫまたはその断片、変異体、誘導体もしくは融合体のアミノ酸配列を含
    んでなるポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 全長ヒトＳＧＫ１のセリン４２２に相当する残基がアスパラギン酸、グルタミ
    ン酸、アラニンまたはその他のリン酸化できない残基で置換されており、かつ／
    または全長ヒトＳＧＫ１のトレオニン２５６に相当する残基がアラニンまたはそ
    の他のリン酸化できない残基で置換されており、かつ／または全長ヒトＳＧＫ１
    のリシン１２７に相当する残基がアラニン残基で置換されている、請求項１４に
    記載のポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 全長ヒトＳＧＫ１のセリン４２２に相当する残基がアスパラギン酸残基で置換
    されており、かつ、全長ヒトＳＧＫ１のトレオニン２５６およびリシン１２７に
    相当する残基がそれぞれトレオニンおよびリシンのままである、請求項１５に記
    載のポリペプチド。
  17. 【請求項１７】 全長ヒトＳＧＫ１のＮ末端の２０個、３０個、４０個、５０個または６０個の
    アミノ酸に相当する残基が存在しない、請求項１６に記載のポリペプチド。
  18. 【請求項１８】 請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌ
    クレオチド。
  19. 【請求項１９】 請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現させるのに好適
    な、組換えポリヌクレオチド。
  20. 【請求項２０】 請求項１８または１９に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、宿主細胞。
  21. 【請求項２１】 請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを作製する方法であっ
    て、 組換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードする複製可能なベクター
    を含んでなる宿主細胞を培養し、宿主細胞からポリペプチドを単離することを含
    んでなる、方法。
  22. 【請求項２２】 ポリペプチドが活性化および／またはリン酸化されるように宿主細胞を処理す
    ることをさらに含んでなる、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 宿主細胞をＩＧＦ−１および／または過酸化水素に曝することによって処理す
    る、請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法によって得られる、ポリペプチ
    ド。
  25. 【請求項２５】 活性化されたＳＧＫが用いられる、ＳＧＫの活性を調整する化合物を同定する
    方法。
  26. 【請求項２６】 ＳＧＫの活性を調整する化合物を同定する方法であって、 化合物をＳＧＫと接触させ、ＳＧＫの活性が化合物の不在下でのＳＧＫの活性
    と比較して変化するかどうかを調べることを含んでなり、ＳＧＫの活性が、好適
    なリン酸供与体であるコンセンサス配列（Ａｒｇ／Ｌｙｓ；好ましくはＡｒｇ）
    −Ｘ−（Ｘ／Ａｒｇ）−Ｘ−Ｘ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）−Ｚ）（ここで、Ｘはいず
    れかのアミノ酸を示し、Ｘ／Ａｒｇはいずれかのアミノ酸を示し（好ましくはア
    ルギニン）、かつ、Ｚはアミノ酸残基が好ましくは疎水性残基であることを示す
    ）に相当するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの存在下でＳＧＫによるリ
    ン酸化を測定することによって測定される、方法。
  27. 【請求項２７】 ＳＧＫまたは活性化されたＳＧＫが、全長ヒトＳＧＫ１のセリン４２２に相当
    する残基がアスパラギン酸残基で置換され、かつ、全長ヒトＳＧＫ１のトレオニ
    ン２５６およびリシン１２７に相当する残基がそれぞれトレオニンおよびリシン
    のままであるＳＧＫである、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 ＳＧＫがリン酸化によって活性化されるＳＧＫである、請求項２５〜２７のい
    ずれか一項に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 ＳＧＫの活性が化合物の存在下で低下する、請求項２４〜２８のいずれか一項
    に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 ＳＧＫの活性が化合物の存在下で増大する、請求項２５または２６に記載の方
    法。
  31. 【請求項３１】 ＢＡＤもしくはＧＳＫ３のようなＳＧＫの生理学的基質に結合し、かつ、ＳＧ
    Ｋによるその活性化および／またはリン酸化を増強するかまたは阻害するかのい
    ずれかである化合物を同定する方法であって、 化合物が基質のＳＧＫとの相互作用を増強するかまたは阻害するかを調べる、
    あるいは化合物がＳＧＫによる基質のリン酸化および／または活性化を実質的に
    阻害するかどうかを調べることを含んでなる、方法。
  32. 【請求項３２】 ＰＤＫ１のようなポリペプチド、またはＰＤＫ２活性を有するポリペプチドと
    相互作用することによりＳＧＫの活性化を調整する化合物を同定する方法であっ
    て、 化合物が（ａ）ＳＧＫと（ｂ）ＰＤＫ１などの相互作用するポリペプチド、ま
    たはＰＤＫ１の機能的同等物またはＰＤＫ２活性を含む調製物との間の相互作用
    を増強するかまたは阻害するかを調べる、あるいは化合物がＰＤＫ１などの相互
    作用するポリペプチド、またはＰＤＫ２活性を含む調製物またはその機能的同等
    物によりＳＧＫの活性化を調整するかどうかを調べることを含んでなる、方法。
  33. 【請求項３３】 活性化されたＳＧＫと相互作用するポリペプチドを同定する方法であって、 （１）（ａ）ＳＧＫと（ｂ）活性化されたＳＧＫと相互作用するポリペプチド
    を含み得る組成物を接触させ、 （２）ＳＧＫおよびポリペプチドを含む複合体の存在を検出し、 （３）所望により、タンパク質キナーゼと結合したいずれものポリペプチドを
    同定する ことを含んでなる、方法。
  34. 【請求項３４】 請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の方法を実施するのに有用な、製品キ
    ット。
  35. 【請求項３５】 ＳＧＫ、ＰＤＫ１もしくはその機能的同等物、ＰＤＫ２活性を含む調製物もし
    くはその機能的同等物および／またはＳＧＫの基質、例えば、クロスチドもしく
    はＢＡＤもしくはＧＳＫ３を含んでなる、請求項３４に記載の製品キット。
  36. 【請求項３６】 ＳＧＫの基質を同定する方法における、ＳＧＫを阻害するがＰＫＢを阻害しな
    い化合物の使用。
  37. 【請求項３７】 請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の方法によって同定可能なまたは同定
    される化合物。
  38. 【請求項３８】 医薬に用いる、請求項３７に記載の化合物。
  39. 【請求項３９】 ＳＧＫの活性の調整を必要とする患者の治療のための医薬の製造における、請
    求項３７に記載の化合物の使用。
  40. 【請求項４０】 有効量の請求項３７に記載の化合物を患者に投与する、ＳＧＫの活性の調整を
    必要とする患者の治療方法。
  41. 【請求項４１】 薬剤様化合物または薬剤様化合物の開発のためのリード化合物のスクリーニン
    グアッセイにおける活性化されたＳＧＫの使用。
  42. 【請求項４２】 患者が癌を患っている、請求項３９に記載の使用、または請求項４０に記載の
    方法。
  43. 【請求項４３】 患者が糖尿病または虚血性疾患を患っている、請求項３９に記載の使用、また
    は請求項４０に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 ＳＧＫがＳＧＫ１、ＳＧＫ２α、ＳＧＫ２βまたはＳＧＫ３である、請求項１
    〜１７、２５〜３３、３５、３９〜４３のいずれか一項に記載の方法、使用、融
    合ポリペプチド、ポリペプリドまたは製品キット。
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