JP2004018524A - 動脈硬化症を処置するための方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】内皮細胞のアポトーシスを促進する動脈硬化症を直接的または間接的に妨げるための、方法ならびに物質または物質群を提供すること。
【解決手段】動脈硬化症を予防するためまたは動脈硬化症リスクを減少させるための組成物。ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する物質を同定するための方法。ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害することによって内皮細胞におけるアポトーシスプロセスに影響を及ぼし得る物質を同定するための方法。内皮細胞におけるアポトーシスを阻害するための物質。ＰＰ２ＣのｍＲＮＡと複合体形成することを特徴とする生体分子。動脈硬化症を処置するための治療剤を生成するための方法。その発現産物がＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡと複合体形成する生体分子であることを特徴とする、細胞において発現可能な核酸構築物。動脈硬化症および／または動脈硬化症に関連する疾患を処置するための組成物。
【選択図】 なし
【解決手段】動脈硬化症を予防するためまたは動脈硬化症リスクを減少させるための組成物。ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する物質を同定するための方法。ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害することによって内皮細胞におけるアポトーシスプロセスに影響を及ぼし得る物質を同定するための方法。内皮細胞におけるアポトーシスを阻害するための物質。ＰＰ２ＣのｍＲＮＡと複合体形成することを特徴とする生体分子。動脈硬化症を処置するための治療剤を生成するための方法。その発現産物がＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡと複合体形成する生体分子であることを特徴とする、細胞において発現可能な核酸構築物。動脈硬化症および／または動脈硬化症に関連する疾患を処置するための組成物。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動脈硬化症を処置するための方法に関する。本発明は、ドイツ国特許出願１０２ ２６ ４２０．１の優先権を主張し、これは、開示目的のために参照される。
【０００２】
【従来の技術】
心筋梗塞、発作および塞栓症のような心臓血管疾患は、とりわけ、先進国における最も一般的な死因である。これらの疾患は、しばしば、動脈硬化症によって引き起こされる。動脈硬化症は、中血管壁に対する変化と合わせた、内側の血管壁に対する複合した変化（これらとしては、脂肪、複合糖質、血液成分ならびに繊維性組織およびカルシウムの局所的蓄積が挙げられる）に起因する、形態学的徴候として理解されている。これらの因子は、動脈壁中の隆起した硬化性の領域を導く。
【０００３】
動脈硬化性損傷（病変）の発生は、特に、３つのプロセス、すなわち、内側の血管壁中のマクロファージ、Ｔ−リンパ球および平滑筋細胞の移動、増殖および蓄積、平滑筋細胞を横切る細胞外マトリクスの産生、ならびにマクロファージ、筋細胞および細胞外マトリクスにおける脂質の蓄積、を含む（Ｒｏｓｓ，Ｒ．（１９９３）．Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｃｌｅｒｏｓｉｓ：ａ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ｔｈｅ １９９０ｓ．Ｎａｔｕｒｅ １９９３ Ａｐｒｉｌ ２９；３６２（６４２３）８０１−８０９（非特許文献１））。
【０００４】
動脈硬化性の病変の発生は、内皮組織の損傷または機能不全によって惹起される。これは、特に、血栓嚢腫の接着および凝集を生じ、そしてこれに起因して、例えば、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）のような、増殖因子の分泌を生じる。これに続いて、内膜平滑筋細胞の増殖が生じ、そして最後に、新しい内側の血管壁（新内膜）の発生によって、血管壁の肥厚を生じる。さらに、内皮細胞病変は、接着分子の発現の増加に加えて、血管壁の透過性の増加を引き起こし、これが、マクロファージおよび白血球の浸潤、そして結果的に、その後の炎症反応を導く。
【０００５】
喫煙、高血圧および糖尿病に加えて、血中脂質のレベルの増加（特に、２００ｍｇ／日を超える血中コレステロールレベルの増加）は、動脈硬化症の発生の重要な危険因子を代表する。血中脂質は、中性脂肪（トリグリセリド）、リン脂質、コレステロール、コレステロールエステルおよび遊離脂肪酸から構成される。血中では、これらは、遊離形態で存在せず、いわゆる、リポタンパク質と呼ばれるように、すなわち、キャリアタンパク質に結合されている。これらのキャリアタンパク質は、超遠心分離または電気泳動におけるそれらの特性に従って、いくつかの型、すなわち、カイロミクロン、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中比重リポタンパク質、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）および高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）に細区分され；これらは、アポリポタンパク質として要約される。ＬＤＬの本質的な成分は、コレステロールである。
【０００６】
ＬＤＬは、末梢の細胞にコレステロールを輸送するので、高ＬＤＬ濃度は、血管壁でのコレステロール沈着の増加を導く。それによって、これらは、動脈硬化症の発生を促進する。対照的に、ＨＤＬレベルの上昇は、保護機能を示す。
【０００７】
ＬＤＬの顕著な動脈硬化性効果はまた、周辺組織から放出される反応性酸素種または酵素によって引き起こされ、これらは、ｏｘＬＤＬへＬＤＬを酸化し得る。浸潤性マクロファージは、それらのスカベンジャーレセプターによってｏｘＬＤＬを取り込み得、そして細胞内脂質蓄積の結果として、いわゆる、泡沫細胞となり、これは、炎症誘発性、血栓誘発性およびアテローム発生性の物質を分泌し、そしてサイトカインを放出し、その後、血管平滑筋細胞の増殖が生じる（ｄｅＷｉｎｔｅｒ Ｍ．Ｐ．ら、Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌａｓｓ Ａ：Ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２０００ Ｆｅｂ；２０（２）：２９０−２９７（非特許文献２））。
【０００８】
ＬＤＬ沈着の元の小さい領域は、進行的に蓄積して、プラークを形成する。さらなるカルシウム沈着によって、プラークが形成され得、これが、血管を大きく収縮させる。プラークの破裂の結果として、血栓が生じ得、これが、塞栓症を導き、そして結果として、周辺組織における虚血、そしておそらく、虚血性発作を導く。
【０００９】
血中脂肪レベルの増加は、動脈硬化症の主要な危険因子と考えられているので、処置および予防のための公知の治療概念は、増加された血漿脂質レベルの減少に基づき、それによって、特に、ＬＤＬおよびその前駆体であるＶＬＤＬの減少に焦点を当てられている。この目的を達成するために、フィブラート（ｆｉｂｒａｔｏ）誘導体またはニコチン酸誘導体を使用することが公知であり、これらは、潜在的アテローム発生性のＶＬＤＬの合成の減少および分解の増加によって、血漿トリグリセリドおよび血漿コレステロールの濃度を減少する。イオン交換樹脂もまた使用され、潜在的アテローム発生性のＬＤＬの濃度を減少し得る。
【００１０】
動脈硬化症の処置のための別の治療アプローチは、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ（コレステロール生合成の重要な酵素を構成する）のインヒビターによって、および肝臓ＬＤＬレセプターの過剰発現を刺激することによって、ＬＤＬ濃度を減少することを試みる。これらのＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼインヒビター（「スタチン」とも称される）は、潜在的アテローム発生性のＬＤＬ−コレステロールの６０％までの減少を達成し得る。
【００１１】
さらに、アポトーシスプロセスが、動脈硬化症の発生に関与することが公知である。アポトーシス（プログラムされた細胞死）は、ストレス因子または毒性物質に対する反応としての、または意図的な細胞自殺反応の結果としての、細胞の排除である。アポトーシスは、特徴的なＤＮＡフラグメント化、核膜の破壊、クロマチン凝集、核の縮小および膜の不安定化（ｂｌａｂｂｉｎｇ）を導く、シグナル伝達経路の標的化された活性化によって達成される（Ｋｅｒｒ Ｊ．Ｆ．ら（１９７２）．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ａ ｂａｓｉｃ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ｗｉｔｈ ｗｉｄｅ−ｒａｎｇｉｎｇ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ２６，１９７２ Ａｕｇ；２６（４）：２３９−２５７（非特許文献３）；Ｓｅａｒｌｅ Ｊ．ら（１９８２）Ｎｅｃｒｏｓｉｓ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｗｉｔｈｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．Ｐａｔｈｏｌ Ａｎｎｕ １７，２２９−２５９（非特許文献４））。食作用による死細胞の排除は、隣接する細胞によって行われる。
【００１２】
いくつかのシグナル伝達経路が、アポトーシスの誘導について記載されている。哺乳動物において、アポトーシスは、カスパーゼ、Ａｐａｆ１（アポトーシスプロテアーゼ活性化因子）およびＢｃｌ２ファミリーによって主に調節される（Ａｄａｍｓ ＪＭら（１９９８）．Ｔｈｅ Ｂｃｌ−２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ：ａｒｂｉｔｅｒｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８ Ａｕｇ．２８；２８１（５３８１）：１３２２−１３２６（非特許文献５）；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（１９９８）．Ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９８ Ａｕｇ．２８；２８１（５３８１）：１３０５−１３０８（非特許文献６）を参照のこと）。
【００１３】
ヒトアテレクトミーに対するいくつかの研究は、動脈硬化症性プラークにおけるアポトーシスを検出する（Ｈａｎら（１９９５）．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎ ｒａｔ ｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｅｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９５ Ａｕｇ．；１４７（２），２６７−２７７（非特許文献７）；Ｈｅｇｙｉ，Ｌ．ら（１９９６）．Ｆｏａｍ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐｉｄｃｏｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ １９９６ Ｄｅｃ；１８０（４），４２３−４２９（非特許文献８））。従って、アポトーシスプロセスは、マクロファージおよび平滑筋細胞において明らかにされている。さらに、プラークの破裂後、アポトーシスは、主に、繊維性のキャップにおいて、破裂位置において、脂質封入体の付近において、および壊死性中心の周辺において生じることが公知である（Ｃｒｉｓｂｙら（１９９７）．Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｂｏｔｈ ｏｎｃｏｓｉｓ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９７ Ａｐｒ．；１３０（１−２），１７−２７（非特許文献９））。
【００１４】
多くの糸口は、動脈硬化誘発性因子（ｏｘＬＤＬ、アンギオテンシンＩＩまたは反応性酸素のような）がまた、インビトロで、内皮細胞においてアポトーシスを誘導するので、アポトーシスによる内皮破壊が、動脈硬化症の発生における初期事象を構成することを示す（Ｄｉｍｍｌｅｒら（１９９７）．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．８１，９７０−９７６（非特許文献１０）；Ｄｉｍｍｌｅｒら（１９９７）．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｖｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＩＣＥ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ＣＰＰ３２−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５，６０１−６０８（非特許文献１１）；Ｈｅｒｍａｎｎら（１９９７）．Ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｈ２Ｏ２ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｏｘ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １９９７ Ｄｅｃ．；１７（１２）３５８８−３５９２（非特許文献１２））。内皮のアポトーシスは、内皮層の完全性を破壊し、そしてそれによって、プラークの発生を導く炎症誘発性反応に寄与する。従って、内皮細胞におけるアポトーシスは、プラーク侵食および血小板凝集のプロセスに必須である。
【００１５】
さらに、アポトーシスのシグナル伝達における重要な生理学的メディエータとしてのＮＯの役割が、議論されている。先の研究は、ＮＯが、異なる細胞型においてアポトーシスを誘導し得ることを示した。対照的に、より最近の研究は、ＮＯによる抗アポトーシス効果および内皮細胞の保護を指摘する（Ｄｉｍｍｌｅｒら（１９９７）．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．８１，９７０−９７６（非特許文献１３）；Ｄｉｍｍｌｅｒら（１９９７）．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｖｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＩＣＥ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ＣＰＰ３２−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５，６０１−６０８（非特許文献１４）；Ｈｅｒｍａｎｎら（１９９７）．Ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｈ２Ｏ２ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｏｘｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １９９７ Ｄｅｃ．；１７（１２）３５８８−３５９２（非特許文献１５））。これに従って、内皮細胞は、プログラムされた細胞死を触媒する酵素を阻害する一酸化窒素を放出することによって、それら自身をアポトーシスに対して保護する。しかし、酸素ラジカルは、一酸化窒素を不活性化し、それによって、アポトーシスを誘導する能力を維持させる。従って、内皮細胞は、ＮＯの存在下でさえも死ぬ。死細胞が、新しい細胞によって置換されるが、後者は、低下したＮＯを放出する能力を示す。並行した一酸化窒素の産生の減少は、動脈硬化症の進行を支持する。さらに、一酸化窒素の産生の減少は、血管平滑筋細胞の増殖を支持し、従って、血管をさらに収縮し、そして酸素枯渇という公知の結果を導く。また、この機構は、動脈硬化症の発生に関する、内皮細胞の基本的関連性を指摘する。
【００１６】
従って、内皮細胞におけるアポトーシスの阻害が、動脈硬化症のための効果的な予防および治療についての研究の焦点にある。従って、長年、治療物質の開発のために、内皮細胞のアポトーシスと動脈硬化症との間の関連性に対する洞察（特に、動脈硬化誘導因子についての知見）を使用することが試みられている。にもかかわらず、ＢＡＤ（細胞死を引き起こす、Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ＸＬ−アンタゴニスト）の寄与に関する事実が利用可能であるとしても、これらの試みは、現在まで、依然として不成功である。
【００１７】
ＢＡＤは、Ｂｃｌ−２ファミリーと称される、動脈硬化調節タンパク質のグループに属し、これらには、Ｂａｘのようなアポトーシス誘発（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質ならびにＢｃｌ−２およびＢｃｌ−Ｘのような抗アポトーシスタンパク質が含まれる。ＢＡＤは、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−Ｘと選択的にダイマーを形成し（Ｙａｎｇ Ｅ．ら、（１９９５）ＢＡＤ，ａ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ｐａｒｔｎｅｒ ｆｏｒ Ｂｃｌ−ＸＬ ａｎｄ Ｂｃｌ−２ ｄｉｓｐｌａｃｅｓ Ｂａｘ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｃｅｌｌ １９９５ Ｊａｎ．２７；Ｖｏｌ．８０（２）２８５−２９１（非特許文献１６））、そして結果として、Ｂｃｌ−ＸＬの結合パートナーとしてＢａｘを置換する。従って、Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ＸＬの抗アポトーシス効果は、ブロックされる。これに加えて、放出されたＢａｘは、アポトーシス反応を誘導する（Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ ＳＪ．（１９９９）．ＢＣＬ−２ ｇｅｎｅｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９ Ａｐｒ．１；１：５９（７ 補遺）１６９３−１７００（非特許文献１７））。おそらく、この反応は、アポトーシスが促進される本質的機構と考えられるべきである。
【００１８】
ＢＡＤは、いくつかの別個のリン酸化形態で存在し得る。セリン１１２およびセリン１３６が、リン酸化され得ることが、長年公知であり、これは、インビボにて証明されている。リン酸基の除去が、ＰＰ１（プロテインホスファターゼ１）およびＰＰ２Ｂ（プロテインホスファターゼ２Ｂ型）によって触媒されることもまた公知である（Ａｙｌｌｏｎ Ｖ．ら（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ １ α ｉｓ ａ ｒａｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＢＡＤ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＥＭＢＯ Ｊ．２０００ Ｍａｙ １５；Ｖｏｌ．１９（１０）２２３７−２２４６（非特許文献１８）；Ｗａｎｇ ＨＧら、（１９９９）Ｃａ２＋ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＡＤ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９ Ａｐｒ．９；Ｖｏｌ．２８４（５４１２）３３９−３４３（非特許文献１９））。さらに、ＢＡＤが、セリン１５５でもまたリン酸化され得ることが、近年見出されている。インビトロでのこのセリンのリン酸化は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）によって達成される。この酵素は、ｃＡＭＰによって活性化される。
【００１９】
ＢＡＤが、リン酸化された状態（以後、「ホスホ−ＢＡＤ」と称する）で存在する場合、Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−Ｘへの結合は不可能となり、そしてホスホ−ＢＡＤは解離する。対照的に、ホスホ−ＢＡＤは、いわゆる、１４−３−３タンパク質に結合する。遊離Ｂｃｌ−ＸＬは、その抗アポトーシス効果を示し得、そしてＢａｘと相互作用する（Ｚｈａ Ｊ．ら、（１９９６）Ｓｅｒｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅａｔｈ ａｇｏｎｉｓｔ ＢＡＤ ｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｓｕｌｔｓｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ １４−３−３ ｎｏｔ Ｂｃｌ−ＸＬ，Ｃｅｌｌ １９９６ Ｎｏｖ．１５；Ｖｏｌ．８７（４）６１９−６２８（非特許文献２０））。結果として、ＢＡＤのリン酸化は、抗アポトーシスプロセスを支持する（Ｌｉｚｃａｎｏ Ｊ．Ｍ．、Ｍｏｒｉｃｅ Ｎ．およびＣｏｈｅｎ Ｐ．（２０００）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＡＤ ｂｙ ｃＡＭＰ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｖｉａ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｄｅ，Ｓｅｒ１５５，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２０００ Ｊｕｌ．１５；Ｖｏｌ．；３４９（Ｐｔ２）；５４７−５５７（非特許文献２１）；Ｔａｎ Ｙら（２０００）ＢＡＤ Ｓｅｒ１５５ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＢＡＤ／ＢｃｌＸＬ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００ Ａｕｇ．１８；２７５（３３）：２５８６５−２５８６９（非特許文献２２））。
【００２０】
この機構は、おそらく、ＨＤＬが、プロテインキナーゼＡｋｔを誘導することによってアポトーシスに対して内皮細胞を保護し得ることが示されたように、抗アテローム発生特性を示すＨＤＬの周知の現象に基づく。このプロテインキナーゼはまた、ＨＤＬ粒子から単離されるリゾホスホリピドによって誘導され得る（Ｎｏｆｅｒら（２００１）Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｎ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＨＤＬ） ａｎｄ ＨＤＬ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｓｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２００１ Ｓｅｐ．１４：２７６（３７）：３４４８０−５（非特許文献２３））。
【００２１】
動脈硬化症のための確立された治療は、通常、特に、血中脂質濃度を減少する物質によって、血漿脂質レベルを妨げる。これはまた、内皮細胞におけるアポトーシスの後退（例えば、ＨＤＬを増加することによる）を含むアプローチについて有効である。これらはまた、血中脂質レベルの調節に主に焦点を当てている。
【００２２】
【非特許文献１】
Ｒｏｓｓ，Ｒ．、”Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｃｌｅｒｏｓｉｓ：ａ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ｔｈｅ １９９０ｓ．”Ｎａｔｕｒｅ １９９３ Ａｐｒｉｌ ２９；３６２（６４２３）８０１−８０９
【非特許文献２】
ｄｅ Ｗｉｎｔｅｒ Ｍ．Ｐ．ら、”Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌａｓｓ Ａ：Ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．”Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２０００ Ｆｅｂ；２０（２）：２９０−２９７
【非特許文献３】
Ｋｅｒｒ Ｊ．Ｆ．ら、”Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ａ ｂａｓｉｃ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ｗｉｔｈ ｗｉｄｅ−ｒａｎｇｉｎｇ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ．”Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２６，１９７２ Ａｕｇ；２６（４）：２３９−２５７
【非特許文献４】
Ｓｅａｒｌｅ Ｊ．ら、”Ｎｅｃｒｏｓｉｓ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｗｉｔｈ ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．”Ｐａｔｈｏｌ Ａｎｎｕ １９８２、１７，２２９−２５９
【非特許文献５】
Ａｄａｍｓ ＪＭら、”Ｔｈｅ Ｂｃｌ−２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ：ａｒｂｉｔｅｒｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８ Ａｕｇ．２８；２８１（５３８１）：１３２２−１３２６
【非特許文献６】
Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、”Ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８ Ａｕｇ．２８；２８１（５３８１）：１３０５−１３０８
【非特許文献７】
Ｈａｎら、”Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎ ｒａｔ ｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｅｌ．”Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９５ Ａｕｇ．；１４７（２），２６７−２７７
【非特許文献８】
Ｈｅｇｙｉ，Ｌ．ら、”Ｆｏａｍ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐｉｄ ｃｏｒｅｏｆ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．”Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ １９９６ Ｄｅｃ；１８０（４），４２３−４２９
【非特許文献９】
Ｃｒｉｓｂｙら、”Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｂｏｔｈ ｏｎｃｏｓｉｓ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．”Ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９７ Ａｐｒ．；１３０（１−２），１７−２７
【非特許文献１０】
Ｄｉｍｍｌｅｒら、”Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ ｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ．”Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．１９９７ ８１，９７０−９７６
【非特許文献１１】
Ｄｉｍｍｌｅｒら、”Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｖｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆＩＣＥ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ＣＰＰ３２−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．”Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７ １８５，６０１−６０８
【非特許文献１２】
Ｈｅｒｍａｎｎら、”Ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｈ２Ｏ２ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｏｘ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ．”Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １９９７ Ｄｅｃ．；１７（１２）３５８８−３５９２
【非特許文献１３】
Ｄｉｍｍｌｅｒら、”Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ ｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ．”Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．１９９７ ８１，９７０−９７６
【非特許文献１４】
Ｄｉｍｍｌｅｒら、”Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｖｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆＩＣＥ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ＣＰＰ３２−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．”Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７ １８５，６０１−６０８
【非特許文献１５】
Ｈｅｒｍａｎｎら、”Ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｈ２Ｏ２ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｏｘ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ．”Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １９９７ Ｄｅｃ．；１７（１２）３５８８−３５９２
【非特許文献１６】
Ｙａｎｇ Ｅ．ら、”ＢＡＤ，ａ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ｐａｒｔｎｅｒ ｆｏｒ Ｂｃｌ−ＸＬ ａｎｄ Ｂｃｌ−２ ｄｉｓｐｌａｃｅｓＢａｘ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．”Ｃｅｌｌ １９９５ Ｊａｎ．２７；Ｖｏｌ．８０（２）２８５−２９１
【非特許文献１７】
Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ ＳＪ．、”ＢＣＬ−２ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９ Ａｐｒ．１；１：５９（７ 補遺）１６９３−１７００
【非特許文献１８】
Ａｙｌｌｏｎ Ｖ．ら、”Ｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ １α ｉｓ ａ ｒａｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＢＡＤ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．”ＥＭＢＯ Ｊ．２０００ Ｍａｙ １５；Ｖｏｌ．１９（１０）２２３７−２２４６
【非特許文献１９】
Ｗａｎｇ ＨＧら、”Ｃａ２＋ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＡＤ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９ Ａｐｒ．９；Ｖｏｌ．２８４（５４１２）３３９−３４３
【非特許文献２０】
Ｚｈａ Ｊ．ら、”Ｓｅｒｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅａｔｈ ａｇｏｎｉｓｔ ＢＡＤ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ １４−３−３ ｎｏｔ Ｂｃｌ−ＸＬ，”Ｃｅｌｌ １９９６ Ｎｏｖ．１５；Ｖｏｌ．８７（４）６１９−６２８
【非特許文献２１】
Ｌｉｚｃａｎｏ Ｊ．Ｍ．、”Ｍｏｒｉｃｅ Ｎ．およびＣｏｈｅｎ Ｐ．（２０００）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＡＤ ｂｙ ｃＡＭＰ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｖｉａ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｄｅ，”Ｓｅｒ１５５，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２０００ Ｊｕｌ．１５；Ｖｏｌ．；３４９（Ｐｔ２）；５４７−５５７
【非特許文献２２】
Ｔａｎ Ｙら、”ＢＡＤ Ｓｅｒ１５５ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＢＡＤ／ＢｃｌＸＬ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００ Ａｕｇ．１８；２７５（３３）：２５８６５−２５８６９
【非特許文献２３】
Ｎｏｆｅｒら、”Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｎ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＨＤＬ） ａｎｄ ＨＤＬ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｓｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２００１ Ｓｅｐ．１４：２７６（３７）：３４４８０−５
【００２３】
【発明が解決しようとする課題】
これに基づいて、本発明の目的は、内皮細胞のアポトーシスを促進する動脈硬化症を直接的または間接的に妨げるための、方法ならびに物質または物質群を提供することである。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
１つの局面において、本発明は、動脈硬化症を予防するためまたは動脈硬化症リスクを減少させるための組成物を提供し、この予防または減少は、内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を予防するかまたは減少させることを特徴とする。
【００２５】
１つの局面において、本発明は、動脈硬化症を予防するためまたは動脈硬化症リスクを減少させるための組成物を提供し、この予防または減少は、内皮細胞におけるＢＡＤのリン酸化を増加させることを特徴とする。
【００２６】
１つの実施形態において、上記の組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００２７】
別の実施形態において、上記の組成物は、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００２８】
別の実施形態において、上記の組成物は、上記予防または減少が、ＢＡＤのｓｅｒ１１２、ｓｅｒ１３６および／またはｓｅｒ１５５のリン酸化／脱リン酸化に影響を及ぼすことを特徴とする。
【００２９】
別の実施形態において、上記の組成物は、セリン−スレオニン−ホスファターゼインヒビターを含む。好ましい実施形態において、上記の組成物は、ＰＰ２Ｃインヒビターを含む。
【００３０】
別の実施形態において、上記の組成物は、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターを含む。好ましい実施形態において、上記の組成物は、ＰＰ２Ｃが、ＰＰ２Ｃα、ＰＰ２Ｃβ、ＰＰ２Ｃγ、ＰＰ２Ｃδおよびそれらのサブタイプを含む群より選択される。
【００３１】
別の局面において、本発明は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する物質を同定するための方法を提供し、この方法は、以下：
ａ．ＰＰ２Ｃと、ホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログと、少なくとも１つの試験物質とを共に、インビトロでインキュベートする工程、および
ｂ．ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化について、この試験物質の有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする。
【００３２】
１つの実施形態において、上記の方法は、工程ａ）において、ＰＰ２Ｃを活性化する少なくとも１つの脂肪酸を添加することを特徴とする。
【００３３】
別の局面において、本発明は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害することによって内皮細胞におけるアポトーシスプロセスに影響を及ぼし得る物質を同定するための方法を提供し、この方法は、以下：
ａ．内皮細胞においてアポトーシスを誘導する工程、
ｂ．１種または数種の試験物質を接触させ、この試験物質と共にインキュベートする工程、および
ｃ．ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログの脱リン酸化について、この試験物質の有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする。
【００３４】
１つの実施形態において、上記の方法は、工程ａ）の後に、酵素的に活性な細胞抽出物を、上記誘導された内皮細胞から得ることを特徴とする。好ましい実施形態において、上記の方法は、工程ａ）における誘導のために、少なくとも１つのＰＰ２Ｃ活性化脂肪酸を使用し、この脂肪酸は、好ましくは、少なくとも１５炭素原子長を有し、少なくとも１つの位置で不飽和であり、そして少なくとも１つの遊離カルボキシル基を有し、そして好ましくは、オレイン酸、アラキドン酸および／またはギンコール酸であることを特徴とする。
【００３５】
別の局面において、本発明は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する物質を同定するための方法を提供し、この方法は、以下：
ａ．結合パートナーを同定するための標的としてＰＰ２ＣまたはＰＰ２Ｃフラグメントを用いて、物質のライブラリーをスクリーニングする工程、
ｂ．工程ａ）において単離された物質を、ＰＰ２Ｃと、ホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログと共に、インキュベートする工程、ならびに
ｃ．このホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログの脱リン酸化について、工程ａ）において単離されたこの物質の有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする。
【００３６】
１つの実施形態において、この方法は、上記物質のライブラリーが、化学物質ライブラリー、天然物質ライブラリー、生物学的物質ライブラリーおよびペプチドライブラリーからなる群より選択されることを特徴とする。
【００３７】
別の局面において、本発明は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する物質を同定するための方法を提供し、この方法は、以下：
ａ．ホスホ−ＢＡＤと相互作用する結合パートナーを同定するための標的としてホスホ−ＢＡＤまたはリン酸化されたＢＡＤペプチドフラグメントを用いて、物質のライブラリーをスクリーニングする工程、
ｂ．工程ａ）において単離された物質と、ＰＰ２Ｃと、ホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログとを共に、インキュベートする工程、ならびに
ｃ．ＰＰ２Ｃによるこのホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログの脱リン酸化について、有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする。
【００３８】
別の局面において、本発明は、動脈硬化症を処置するための治療剤を生成するための方法を提供し、この方法は、以下：
ａ．請求項９、１１、１４および１６のうちの少なくとも１項に記載の方法によって、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害することによって内皮細胞におけるアポトーシスプロセスを調節する物質を同定する工程、ならびに
ｂ．この物質を少なくとも１つの生理学的に受容可能なキャリア物質と混合して、治療剤を形成する工程、
を包含することを特徴とする。
【００３９】
１つの実施形態において、上記のいずれかの方法は、ＰＰ２Ｃが、ＰＰ２Ｃα、ＰＰ２Ｃβ、ＰＰ２Ｃγ、ＰＰ２Ｃδおよびそれらのサブタイプを含む群より選択されることを特徴とする。好ましい実施形態において、上記のいずれかの方法は、ホスホ−ＢＡＤの代謝回転を検出するために、ホスホ−ＢＡＤに対する抗体および／またはＢＡＤに対する抗体を使用することを特徴とする。より好ましい実施形態において、上記のいずれかの方法は、ｓｅｒ１５５、ｓｅｒ１１２および／またはｓｅｒ１３６の位置でリン酸化されている、ホスホ−ＢＡＤまたはホスホ−ＢＡＤペプチドフラグメントを使用することを特徴とする。さらにより好ましい実施形態において、上記の方法は、ＢＡＤのｓｅｒ１１２、ｓｅｒ１３６および／またはｓｅｒ１５５を取り囲むアミノ酸領域に由来するペプチドフラグメントを使用することを特徴とする。なおさらにより好ましい実施形態において、上記の方法は、上記ペプチドフラグメントが、少なくとも８アミノ酸長を有することを特徴とする。
【００４０】
別の局面において、本発明は、上記のいずれかの方法によって生成される物質を含む、動脈硬化症を処置するための治療組成物を提供し、この物質は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を妨げる。
【００４１】
別の局面において、本発明は、ＰＰ２Ｃのインヒビターであることを特徴とする、内皮細胞においてアポトーシスを阻害するための物質を提供する。
【００４２】
１つの実施形態において、上記の物質は、脂肪酸によって活性化可能であるＰＰ２Ｃのインヒビターであることを特徴とする。好ましい実施形態において、上記の物質は、ＰＰ２Ｃの脂肪酸活性化の選択的インヒビターであることを特徴とする。より好ましい実施形態において、上記のいずれかの物質は、ＰＰ２Ｃへの脂肪酸の結合を競合的に阻害することを特徴とする。さらに好ましい実施形態において、上記のいずれかの物質は、脂肪酸、改変された脂肪酸、脂肪酸誘導体、ジホスホネート脂肪酸誘導体または脂肪酸アナログであることを特徴とする。なおさらに好ましい実施形態において、上記の物質は、以下の一般式
【００４３】
【化２】
のジホスホン酸またはその誘導体であることを特徴とし、
ここで、
Ｒ１は、１〜１２個の炭素原子を有する直鎖アルキル残基または分枝鎖アルキル残基であり、このアルキル残基は、アミノ基、Ｎ−モノアルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基および／またはＳＨ基のような置換基で置換され得、このアルキル残基は、１〜１２個のＣ原子を含み得るか、あるいは
Ｒ１は、置換または非置換の炭素環式アリール残基または複素環式アリール残基であり、このアリール残基は、１または数個のヘテロ原子を有し得、かつ置換基として、１〜１２個のＣ原子を有する分枝鎖アルキル残基または１〜１２個のＣ原子を有する直鎖アルキル残基、遊離アミノ基、モノアルキルアミノ基、もしくはジアルキルアミノ基、またはハロゲン原子を含み得、このアルキルアミノ基のアルキルは、それぞれ、１〜６個のＣ原子を有し、そして
Ｒ２は、ＯＨ、ハロゲン原子（好ましくは、Ｃｌ）、ＨまたはＮＨ２である、物質。なおよりさらに好ましい実施形態において、上記の物質は、イバンドロン酸、エチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、チルドロン酸、ゾレドロン酸、シマドロン酸、ネリドロン酸、オルパドロン酸、３−ピロール−１−ヒドロキシプロパン−１−１−ジホスホン酸および／またはミノドロン酸、ジホスホネート−１，１−ジカルボン酸（ＤＰＤ）および／または１−メチル−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸（ＭＤＰ）を含む群より選択されることを特徴とする。なおよりさらに好ましい実施形態において、上記のいずれかの物質は、脂肪酸によって活性化可能であるＰＰ２Ｃの、ネガティブレギュレーターであることを特徴とする。なおよりさらに好ましい実施形態において、上記のいずれかの物質は、ＰＰ２Ｃの活性中心に結合し、そして／または、ＰＰ２Ｃへのホスホ−ＢＡＤの結合を競合的に妨げることを特徴とする。なおよりさらに好ましい実施形態において、上記の物質は、ホスホ−ＢＡＤの三次元構造に本質的に対応する三次元構造を有すること、および転換可能でないかまたはゆっくりでしか転換可能ではない基質アナログであることを特徴とする。
【００４４】
別の局面において、本発明は、内皮細胞におけるアポトーシスを阻害するための物質を提供し、この物質は、ホスホ−ＢＡＤに結合し、そしてホスフェート残基（特に、Ｐ−Ｓｅｒ１５５）をＰＰ２Ｃに接近不可能にすることを特徴とする。
【００４５】
１つの実施形態において、上記の物質は、ポリペプチドであることを特徴とする。好ましい実施形態において、上記の物質は、相互作用領域（好ましくは、結合ポケット）によってホスホ−ＢＡＤに結合することを特徴とする。より好ましい実施形態において、上記の物質は、上記結合ポケットの三次元構造が、ホスホ−ＢＡＤに対する抗体の抗原結合部位に本質的に対応することを特徴とする。なおより好ましい実施形態において、上記の物質は、抗ホスホ−ＢＡＤ抗体の改変された抗原結合部位に対応する結合ポケットを含むことを特徴とする。なおよりさらに好ましい実施形態において、上記のいずれかの物質は、上記結合ポケットの三次元構造が、ホスホ−ＢＡＤ Ｓｅｒ１１２、ホスホ−ＢＡＤ Ｓｅｒ１３６および／またはホスホ−ＢＡＤ Ｓｅｒ１１５に対する抗体の抗原結合部位に本質的に対応することを特徴とする。
【００４６】
別の局面において、本発明は、内皮細胞におけるアポトーシスを阻害するための物質であって、ＰＰ２Ｃに結合するポリペプチドであることを特徴とする、物質を提供する。
【００４７】
１つの実施形態において、上記の物質は、抗体または抗体フラグメントであることを特徴とする。
【００４８】
別の局面において、本発明は、ＰＰ２ＣのｍＲＮＡと複合体形成することを特徴とする、生体分子を提供する。
【００４９】
１つの実施形態において、上記の生体分子は、少なくとも部分的に一本鎖であるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。好ましい実施形態において、上記のオリゴヌクレオチドは、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡの反対の鎖に完全にかまたは部分的に対応する核酸配列であることを特徴とし、その結果、この分子が、このＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによって、二本鎖領域を有する少なくとも部分を形成する。
【００５０】
別の局面において、本発明は、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡと複合体形成させるためのアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての、上記のオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【００５１】
別の局面において、本発明は、内皮細胞においてアポトーシスを予防するための組成物を提供し、この組成物は、上記のいずれかの物質または生体分子（特に、上記の少なくとも部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチド）を含む。
【００５２】
別の局面において、本発明は、細胞において発現可能な核酸構築物を提供し、この核酸構築物は、その発現産物が、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡと複合体形成する生体分子であることを特徴とする。
【００５３】
１つの実施形態において、上記の核酸構築物は、上記発現産物が、一本鎖オリゴヌクレオチドであることを特徴とする。好ましい実施形態において、上記の核酸構築物は、上記発現産物が、図１に示される配列のうちの１つの核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。より好ましい実施形態において、上記のいずれかの核酸構築物は、真核生物において発現可能な発現ベクターであることを特徴とする。なおより好ましい実施形態において、上記のいずれかの核酸構築物は、ＰＰ２Ｃのコード配列が、真核生物で発現可能な発現ベクターのプロモーターの後ろに、逆方向に少なくとも部分的にクローニングされていることを特徴とする。
【００５４】
別の局面において、本発明は、動脈硬化症を処置するために内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための組成物を提供し、この組成物は、上記のいずれかの核酸構築物を含む。
【００５５】
別の局面において、本発明は、動脈硬化症および／または動脈硬化症に関連する疾患を処置するための組成物を提供し、この組成物は、上記の少なくとも１つの物質、生体分子または核酸構築物を含む。
【００５６】
別の局面において、本発明は、動脈硬化症を処置するための薬理学的に活性な組成物を提供し、この組成物は、上記のいずれかの少なくとも１つの物質、生体分子または核酸構築物を含む。
【００５７】
１つの実施形態において、上記の組成物は、少なくとも１つの脂質減少剤および／またはＨＤＬ濃度を増加する薬剤を含むことを特徴とする。
【００５８】
別の局面において、本発明は、アポトーシスの予防のために内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの量を増加するための組成物を提供し、この組成物は、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターを含む。
【００５９】
別の局面において、本発明は、動脈硬化症の予防または動脈硬化症リスクの減少のための医薬の製造のための、内皮細胞においてホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化の予防または減少を生じる物質の使用を提供する。
【００６０】
別の局面において、本発明は、動脈硬化症の予防または動脈硬化症リスクの減少のための医薬の製造のための、内皮細胞においてＢＡＤのリン酸化の増加を生じる物質の使用を提供する。好ましい実施形態において、上記の使用は、上記物質が、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターである。別の好ましい実施形態において、上記のいずれかの使用は、上記物質が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の好ましい実施形態において、上記のいずれかの使用は、上記物質が、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の好ましい実施形態において、上記のいずれかの使用は、上記予防または減少が、ＢＡＤのｓｅｒ１１２、ｓｅｒ１３６および／またはｓｅｒ１５５のリン酸化／脱リン酸化に影響を及ぼすことを特徴とする。別の好ましい実施形態において、上記のいずれかの使用は、上記物質が、セリン−スレオニン−ホスファターゼインヒビターである。より好ましい実施形態において、上記の使用は、上記インヒビターが、ＰＰ２Ｃインヒビターである。なおより好ましい実施形態において、上記の使用は、ＰＰ２Ｃが、ＰＰ２Ｃα、ＰＰ２Ｃβ、ＰＰ２Ｃγ、ＰＰ２Ｃδおよびそれらのサブタイプを含む群より選択される。
【００６１】
別の局面において、本発明は、動脈硬化症の処置のための治療剤を製造するための、上記の１以上の方法によって生成される物質の使用を提供し、この物質は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を妨げる。
【００６２】
別の局面において、本発明は、内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための医薬の製造のための、上記のいずれかの物質または生体分子（特に、上記の少なくとも部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチド）の使用を提供する。
【００６３】
別の局面において、本発明は、内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための医薬の製造のための、上記の核酸構築物の使用を提供する。
【００６４】
別の局面において、本発明は、動脈硬化症および／または動脈硬化症に関連する疾患の処置のための医薬の製造のための、上記の少なくとも１つの物質、生体分子または核酸構築物の使用を提供する。
【００６５】
別の局面において、本発明は、内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの量を増加することによってアポトーシスを予防するための医薬の製造のための、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターの使用を提供する。
【００６６】
項１ 動脈硬化症を予防するためまたは動脈硬化症リスクを減少させるための組成物であって、この予防または減少は、内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を予防するかまたは減少させることを特徴とする、組成物。
【００６７】
項２ 動脈硬化症を予防するためまたは動脈硬化症リスクを減少させるための組成物であって、この予防または減少は、内皮細胞におけるＢＡＤのリン酸化を増加させることを特徴とする、組成物。
【００６８】
項３ アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、項１〜２のいずれか１項に記載の組成物。
【００６９】
項４ ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【００７０】
項５ 項１〜２のいずれか１項に記載の組成物であって、上記予防または減少が、ＢＡＤのｓｅｒ１１２、ｓｅｒ１３６および／またはｓｅｒ１５５のリン酸化／脱リン酸化に影響を及ぼすことを特徴とする、組成物。
【００７１】
項６ セリン−スレオニン−ホスファターゼインヒビターを含む、項１、２または５のいずれか１項に記載の組成物。
【００７２】
項７ ＰＰ２Ｃインヒビターを含む、項６に記載の組成物。
【００７３】
項８ β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターを含む、項２に記載の組成物。
【００７４】
項９ ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する物質を同定するための方法であって、以下：
ａ．ＰＰ２Ｃと、ホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログと、少なくとも１つの試験物質とを共に、インビトロでインキュベートする工程、および
ｂ．ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化について、この試験物質の有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする、方法。
【００７５】
項１０ 工程ａ）において、ＰＰ２Ｃを活性化する少なくとも１つの脂肪酸を添加することを特徴とする、項９に記載の方法。
【００７６】
項１１ ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害することによって内皮細胞におけるアポトーシスプロセスに影響を及ぼし得る物質を同定するための方法であって、以下：
ａ．内皮細胞においてアポトーシスを誘導する工程、
ｂ．１種または数種の試験物質を接触させ、この試験物質と共にインキュベートする工程、および
ｃ．ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログの脱リン酸化について、この試験物質の有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする、方法。
【００７７】
項１２ 工程ａ）の後に、酵素的に活性な細胞抽出物を、上記誘導された内皮細胞から得ることを特徴とする、項１１に記載の方法。
【００７８】
項１３ 項１１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、工程ａ）における誘導のために、少なくとも１つのＰＰ２Ｃ活性化脂肪酸を使用し、この脂肪酸は、好ましくは、少なくとも１５炭素原子長を有し、少なくとも１つの位置で不飽和であり、そして少なくとも１つの遊離カルボキシル基を有し、そして好ましくは、オレイン酸、アラキドン酸および／またはギンコール酸であることを特徴とする、方法。
【００７９】
項１４ ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する物質を同定するための方法であって、以下：
ａ．結合パートナーを同定するための標的としてＰＰ２ＣまたはＰＰ２Ｃフラグメントを用いて、物質のライブラリーをスクリーニングする工程、
ｂ．工程ａ）において単離された物質を、ＰＰ２Ｃと、ホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログと共に、インキュベートする工程、ならびに
ｃ．このホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログの脱リン酸化について、工程ａ）において単離されたこの物質の有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする、方法。
【００８０】
項１５ 項１４に記載の方法であって、上記物質のライブラリーが、化学物質ライブラリー、天然物質ライブラリー、生物学的物質ライブラリーおよびペプチドライブラリーからなる群より選択されることを特徴とする、方法。
【００８１】
項１６ ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する物質を同定するための方法であって、以下：
ａ．ホスホ−ＢＡＤと相互作用する結合パートナーを同定するための標的としてホスホ−ＢＡＤまたはリン酸化されたＢＡＤペプチドフラグメントを用いて、物質のライブラリーをスクリーニングする工程、
ｂ．工程ａ）において単離された物質と、ＰＰ２Ｃと、ホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログとを共に、インキュベートする工程、ならびに
ｃ．ＰＰ２Ｃによるこのホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログの脱リン酸化について、有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする、方法。
【００８２】
項１７ 動脈硬化症を処置するための治療剤を生成するための方法であって、以下：
ａ．項９、１１、１４および１６のうちの少なくとも１項に記載の方法によって、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害することによって内皮細胞におけるアポトーシスプロセスを調節する物質を同定する工程、ならびに
ｂ．この物質を少なくとも１つの生理学的に受容可能なキャリア物質と混合して、治療剤を形成する工程、
を包含することを特徴とする、方法。
【００８３】
項１８ 項９〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、ＰＰ２Ｃが、ＰＰ２Ｃα、ＰＰ２Ｃβ、ＰＰ２Ｃγ、ＰＰ２Ｃδおよびそれらのサブタイプを含む群より選択されることを特徴とする、方法。
【００８４】
項１９ 項９〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、ホスホ−ＢＡＤの代謝回転を検出するために、ホスホ−ＢＡＤに対する抗体および／またはＢＡＤに対する抗体を使用することを特徴とする、方法。
【００８５】
項２０ 項９〜１９のいずれか１項に記載の方法であって、ｓｅｒ１５５、ｓｅｒ１１２および／またはｓｅｒ１３６の位置でリン酸化されている、ホスホ−ＢＡＤまたはホスホ−ＢＡＤペプチドフラグメントを使用することを特徴とする、方法。
【００８６】
項２１ 項２０に記載の方法であって、ＢＡＤのｓｅｒ１１２、ｓｅｒ１３６および／またはｓｅｒ１５５を取り囲むアミノ酸領域に由来するペプチドフラグメントを使用することを特徴とする、方法。
【００８７】
項２２ 項２１に記載の方法であって、上記ペプチドフラグメントが、少なくとも８アミノ酸長を有することを特徴とする、方法。
【００８８】
項２３ 項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法によって生成される物質を含む、動脈硬化症を処置するための治療組成物であって、この物質は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を妨げる、治療組成物。
【００８９】
項２４ ＰＰ２Ｃのインヒビターであることを特徴とする、内皮細胞においてアポトーシスを阻害するための物質。
【００９０】
項２５ 項２４に記載の物質であって、脂肪酸によって活性化可能であるＰＰ２Ｃのインヒビターであることを特徴とする、物質。
【００９１】
項２６ 項２４または２５に記載の物質であって、ＰＰ２Ｃの脂肪酸活性化の選択的インヒビターであることを特徴とする、物質。
【００９２】
項２７ 項２４〜２６のいずれか１項に記載の物質であって、ＰＰ２Ｃへの脂肪酸の結合を競合的に阻害することを特徴とする、物質。
【００９３】
項２８ 項２４〜２７のいずれか１項に記載の物質であって、脂肪酸、改変された脂肪酸、脂肪酸誘導体、ジホスホネート脂肪酸誘導体または脂肪酸アナログであることを特徴とする、物質。
【００９４】
項２９ 項２８に記載の物質であって、以下の一般式
【００９５】
【化３】
のジホスホン酸またはその誘導体であることを特徴とし、
ここで、
Ｒ１は、１〜１２個の炭素原子を有する直鎖アルキル残基または分枝鎖アルキル残基であり、このアルキル残基は、アミノ基、Ｎ−モノアルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基および／またはＳＨ基のような置換基で置換され得、このアルキル残基は、１〜１２個のＣ原子を含み得るか、あるいは
Ｒ１は、置換または非置換の炭素環式アリール残基または複素環式アリール残基であり、このアリール残基は、１または数個のヘテロ原子を有し得、かつ置換基として、１〜１２個のＣ原子を有する分枝鎖アルキル残基または１〜１２個のＣ原子を有する直鎖アルキル残基、遊離アミノ基、モノアルキルアミノ基、もしくはジアルキルアミノ基、またはハロゲン原子を含み得、このアルキルアミノ基のアルキルは、それぞれ、１〜６個のＣ原子を有し、そして
Ｒ２は、ＯＨ、ハロゲン原子（好ましくは、Ｃｌ）、ＨまたはＮＨ２である、物質。
【００９６】
項３０ 項２９に記載の物質であって、イバンドロン酸、エチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、チルドロン酸、ゾレドロン酸、シマドロン酸、ネリドロン酸、オルパドロン酸、３−ピロール−１−ヒドロキシプロパン−１−１−ジホスホン酸および／またはミノドロン酸、ジホスホネート−１，１−ジカルボン酸（ＤＰＤ）および／または１−メチル−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸（ＭＤＰ）を含む群より選択されることを特徴とする、物質。
【００９７】
項３１ 項２４〜３０のいずれか１項に記載の物質であって、脂肪酸によって活性化可能であるＰＰ２Ｃの、ネガティブレギュレーターであることを特徴とする、物質。
【００９８】
項３２ 項２４〜３１のいずれか１項に記載の物質であって、ＰＰ２Ｃの活性中心に結合し、そして／または、ＰＰ２Ｃへのホスホ−ＢＡＤの結合を競合的に妨げることを特徴とする、物質。
【００９９】
項３３ 項３２に記載の物質であって、ホスホ−ＢＡＤの三次元構造に本質的に対応する三次元構造を有すること、および転換可能でないかまたはゆっくりでしか転換可能ではない基質アナログであることを特徴とする、物質。
【０１００】
項３４ 内皮細胞におけるアポトーシスを阻害するための物質であって、ホスホ−ＢＡＤに結合し、そしてホスフェート残基（特に、Ｐ−Ｓｅｒ１５５）をＰＰ２Ｃに接近不可能にすることを特徴とする、物質。
【０１０１】
項３５ ポリペプチドであることを特徴とする、項３４に記載の物質。
【０１０２】
項３６ 相互作用領域（好ましくは、結合ポケット）によってホスホ−ＢＡＤに結合することを特徴とする、項３４または３５に記載の物質。
【０１０３】
項３７ 上記結合ポケットの三次元構造が、ホスホ−ＢＡＤに対する抗体の抗原結合部位に本質的に対応することを特徴とする、項３６に記載の物質。
【０１０４】
項３８ 抗ホスホ−ＢＡＤ抗体の改変された抗原結合部位に対応する結合ポケットを含むことを特徴とする、項３６または３７に記載の物質。
【０１０５】
項３９ 項３６〜３８のいずれか１項に記載の物質であって、上記結合ポケットの三次元構造が、ホスホ−ＢＡＤ Ｓｅｒ１１２、ホスホ−ＢＡＤ Ｓｅｒ１３６および／またはホスホ−ＢＡＤ Ｓｅｒ１１５に対する抗体の抗原結合部位に本質的に対応することを特徴とする、物質。
【０１０６】
項４０ 内皮細胞におけるアポトーシスを阻害するための物質であって、ＰＰ２Ｃに結合するポリペプチドであることを特徴とする、物質。
【０１０７】
項４１ 抗体または抗体フラグメントであることを特徴とする、項４０に記載の物質。
【０１０８】
項４２ ＰＰ２ＣのｍＲＮＡと複合体形成することを特徴とする、生体分子。
【０１０９】
項４３ 少なくとも部分的に一本鎖であるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、項４２に記載の生体分子。
【０１１０】
項４４ 項４３に記載のオリゴヌクレオチドであって、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡの反対の鎖に完全にかまたは部分的に対応する核酸配列であることを特徴とし、その結果、この分子が、このＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによって、二本鎖領域を有する少なくとも部分を形成する、オリゴヌクレオチド。
【０１１１】
項４５ ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡと複合体形成させるためのアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての、項４３または４４に記載のオリゴヌクレオチドの使用
項４６ 内皮細胞においてアポトーシスを予防するための組成物であって、項２４〜４４のいずれか１項に記載の物質または生体分子（特に、項４４に記載の少なくとも部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチド）を含む、組成物。
【０１１２】
項４７ 細胞において発現可能な核酸構築物であって、その発現産物は、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡと複合体形成する生体分子であることを特徴とする、核酸構築物。
【０１１３】
項４８ 上記発現産物が、一本鎖オリゴヌクレオチドであることを特徴とする、項４７に記載の核酸構築物。
【０１１４】
項４９ 上記発現産物が、図１に示される配列のうちの１つの核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、項４７または４８に記載の核酸構築物。
【０１１５】
項５０ 項４７〜４９のいずれか１項に記載の核酸構築物であって、真核生物において発現可能な発現ベクターであることを特徴とする、核酸構築物。
【０１１６】
項５１ ＰＰ２Ｃのコード配列が、真核生物で発現可能な発現ベクターのプロモーターの後ろに、逆方向に少なくとも部分的にクローニングされていることを特徴とする、項４７〜５０のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【０１１７】
項５２ 動脈硬化症を処置するために内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための組成物であって、項４７〜５１のいずれか１項に記載の核酸構築物を含む、組成物。
【０１１８】
項５３ 動脈硬化症および／または動脈硬化症に関連する疾患を処置するための組成物であって、項２４〜４４および４７〜５１の少なくとも１項に記載の、少なくとも１つの物質、生体分子または核酸構築物を含む、組成物。
【０１１９】
項５４ 動脈硬化症を処置するための薬理学的に活性な組成物であって、項２４〜４４および４７〜５１の少なくとも１項に記載の、少なくとも１つの物質、生体分子または核酸構築物を含む、組成物。
【０１２０】
項５５ 少なくとも１つの脂質減少剤および／またはＨＤＬ濃度を増加する薬剤を含むことを特徴とする、項５４に記載の組成物。
【０１２１】
項５６ アポトーシスの予防のために内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの量を増加するための組成物であって、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターを含む、組成物。
【０１２２】
項５７ ＰＰ２Ｃが、ＰＰ２Ｃα、ＰＰ２Ｃβ、ＰＰ２Ｃγ、ＰＰ２Ｃδおよびそれらのサブタイプを含む群より選択される、項７に記載の組成物。
【０１２３】
項５８ 動脈硬化症の予防または動脈硬化症リスクの減少のための医薬の製造のための、内皮細胞においてホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化の予防または減少を生じる物質の使用。
【０１２４】
項５９ 動脈硬化症の予防または動脈硬化症リスクの減少のための医薬の製造のための、内皮細胞においてＢＡＤのリン酸化の増加を生じる物質の使用。
【０１２５】
項６０ 上記物質が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、項５８〜５９のいずれか１項に記載の使用。
【０１２６】
項６１ 上記物質が、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項５８〜６０のいずれか１項に記載の使用。
【０１２７】
項６２ 上記予防または減少が、ＢＡＤのｓｅｒ１１２、ｓｅｒ１３６および／またはｓｅｒ１５５のリン酸化／脱リン酸化に影響を及ぼすことを特徴とする、項５８〜５９のいずれか１項に記載の使用。
【０１２８】
項６３ 上記物質が、セリン−スレオニン−ホスファターゼインヒビターである、項５８、５９または６２のいずれか１項に記載の使用。
【０１２９】
項６４ 上記インヒビターが、ＰＰ２Ｃインヒビターである、項６３に記載の使用。
【０１３０】
項６５ 上記物質が、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターである、項５９に記載の使用。
【０１３１】
項６６ ＰＰ２Ｃが、ＰＰ２Ｃα、ＰＰ２Ｃβ、ＰＰ２Ｃγ、ＰＰ２Ｃδおよびそれらのサブタイプを含む群より選択される、項６４に記載の使用。
【０１３２】
項６７ 動脈硬化症の処置のための治療剤を製造するための、項１７〜２２の１以上の方法によって生成される物質の使用であって、この物質は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を妨げる、使用。
【０１３３】
項６８ 内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための医薬の製造のための、項２４〜４４のいずれか１項に記載の物質または生体分子（特に、項４４に記載の少なくとも部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチド）の使用。
【０１３４】
項６９ 内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための医薬の製造のための、項４７〜５１に記載の核酸構築物の使用。
【０１３５】
項７０ 動脈硬化症および／または動脈硬化症に関連する疾患の処置のための医薬の製造のための、項２４〜４４および４７〜５１の少なくとも１項に記載の、少なくとも１つの物質、生体分子または核酸構築物の使用。
【０１３６】
項７１ 内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの量を増加することによってアポトーシスを予防するための医薬の製造のための、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターの使用。
【０１３７】
１つの局面において、項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法によって生成される物質の、動脈硬化症を処置するための治療剤としての使用が提供され、この物質は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を妨げる。
【０１３８】
１つの局面において、内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための方法が提供され、この方法は、項２４〜４４のいずれか１項に記載の物質または生体物質、特に、項４４に記載の少なくとも部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチドが、内皮細胞中に導入されることを特徴とする。
【０１３９】
１つの局面において、動脈硬化症を処置するために内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための方法が提供され、この方法は、項４７〜５１のいずれか１項に記載の核酸構築物で内皮細胞をトランスフェクトすることを特徴とする。
【０１４０】
１つの局面において、動脈硬化症および／または動脈硬化症に関連する疾患の処置のために、項２４〜４４および４７〜５１のうちの少なくとも１つに記載の少なくとも１つの物質、生体分子、または核酸構築物の使用が、提供される。
【０１４１】
１つの局面において、アポトーシスの予防のために内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの量を増加するための、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターの使用が、提供される。
【０１４２】
１つの局面において、動脈硬化症を予防するためまたは動脈硬化症リスクを減少させるための方法が提供され、この方法は、内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を予防するかまたは減少させることを特徴とする。
【０１４３】
１つの局面において、動脈硬化症を予防するためまたは動脈硬化症リスクを減少させるための方法が提供され、この方法は、内皮細胞におけるＢＡＤのリン酸化を増加させることを特徴とする。
【０１４４】
１つの実施形態において、上記の方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を特徴とする。
【０１４５】
好ましい実施形態において、上記の方法は、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を特徴とする。
【０１４６】
別の実施形態において、上記の方法は、ＢＡＤのｓｅｒ１１２、ｓｅｒ１３６および／またはｓｅｒ１５５のリン酸化／脱リン酸化に影響を及ぼすことを特徴とする。
【０１４７】
別の実施形態において、上記の方法は、セリン−スレオニン−ホスファターゼインヒビターの使用を特徴とする。
【０１４８】
好ましい実施形態において、上記の方法は、ＰＰ２Ｃインヒビターの使用を特徴とする。
【０１４９】
別の実施形態において、上記の方法は、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターの使用を特徴とする。
【０１５０】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＢＡＤのリン酸化状態を意図的にもたらすことによる、動脈硬化症の予防または動脈硬化症リスクの減少のための方法に関する。
【０１５１】
本発明は、主にその抗アポトーシス性のホスホ形態においてＢＡＤを安定化させることによってか、またはＢＡＤをその形態に変換することによる、標的化された意図的な様式での動脈硬化促進アポトーシスの調節のために、これらの抗アポトーシス効果を利用および支持する概念に基づく。これは、基本的には、ホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を直接的または間接的にブロックすることによって、そしてリン酸化を直接的または間接的に刺激および誘導することによって、達成され得る。
【０１５２】
本発明の第１の実施形態に従って、脱リン酸化の後退または減少は、好ましくは、セリン−スレオニン−ホスファターゼ（特に、２Ｃ型プロテインホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ））を阻害する治療物質を投与することによって、達成される。
【０１５３】
先に記載の特徴に従う治療物質とは、これらのプロテアーゼの発現またはそれらの生物学的活性の低下または減少を直接的または間接的に導き得る、全ての生物学的または薬学的に活性な物質をいう。従って、この定義はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチド治療剤を包含する。
【０１５４】
２Ｃ型プロテインホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）は、Ｍｎ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンに依存する脱リン酸化活性を有する、真核生物セリン−スレオニン−ホスファターゼ（ＰＰ１、ＰＰ２Ａ、ＰＰ２Ｂ、ＰＰ２Ｃ）に属する（ＭｃＧｏｗａｎ，ＣＨ．およびＣｏｈｅｎ Ｐ．（１９８８）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−２Ｃ ｆｒｏｍ ｒａｂｂｉｔ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ：ａｎ Ｍｇ２＋ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８８；Ｖｏｌ．１５９，４１６−４２６）。ＰＰ２Ｃは、アポトーシスの調節に関与する。この酵素の過剰発現は、致死的である（Ｗｅｎｋ Ｊ．およびＭｉｅｓｋｅｓ Ｇ．（１９９５）Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２Ｃ ｂｅｔａ １ ｉｎ ＣＯＳ ａｎｄＢＨＫ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９５ Ｄｅｃ；６８（４），３７７−３８６；Ｃｈｅｎｇ Ａら（１９９９）Ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅｓ ｂｙ ｔｙｐｅ ２Ｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９９９ Ｎｏｖ．１５；１３（２２），２９４６−２９５７）。ＰＰ２Ｃがアポトーシス調節を妨害する正確な機構について確認された情報は、依然存在しない。
【０１５５】
ＰＰ２Ｃは、現在までにいくつかの組織（例えば、神経組織）中で検出されている。対照的に、ＰＰ２Ｃは、現在までに内皮細胞中で検出されていない。結論として、これらの細胞におけるホスホ−ＢＡＤおよびＰＰ２Ｃによって制御されるアポトーシスの調節は、未知であった。この理由のために、ＢＡＤまたはホスホ−ＢＡＤの濃度調節から始まる動脈硬化症を処置または予防するための治療手段は、現在まで存在していなかった。
【０１５６】
ここでは、内皮細胞中でＢＡＤに加えてＰＰ２Ｃを検出すること、およびホスホ−ＢＡＤがＰＰ２Ｃの基質であることを示すことにも成功した。従って、特にＰＰ２Ｃ（セリン−スレオニン−ホスファターゼとしての）を阻害する治療剤を投与すること、そしてそれによってホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を意図的に抑制することが、望ましい。これによって、動脈硬化症の処置および予防のための有効な治療手段が提供される。
【０１５７】
不飽和脂肪酸によって刺激されるというＰＰ２Ｃの性質が知られている（Ｋｌｕｍｐｐ，Ｓ．，Ｓｅｌｋｅ，Ｄ．，Ｈｅｒｍｅｓ Ｍａｙｅｒ Ｊ．（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２Ｃ ａｃｔｉｖｅ ａｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｇ２＋：ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ．ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ １９９８ Ｏｃｔ．２３；４３７（３）２２９−２３２）。このことは、脂肪酸が内皮細胞中に高濃度で存在し、それによりＰＰ２Ｃを刺激することによって内皮細胞中でアポトーシスを誘導し得、その結果、動脈硬化症の危険性を増大させるという理由に関連する。脂肪酸は、ＰＰ２Ｃ活性を刺激することによって内皮細胞のアポトーシスを誘導し得るので、動脈硬化症の治療および予防をまた、脂肪酸により活性化される内皮ホスファターゼＰＰ２Ｃによってホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害することに基づかせることが、本発明の特に有益な点である。このことは、本発明に従って、脂肪酸活性化の標的化された抑制によって達成され得る。
【０１５８】
本発明のさらなる実施形態に従って、ホスホ−ＢＡＤ比の増大はまた、ＢＡＤリン酸化タンパク質キナーゼの発現増大、誘導、活性化、または刺激を引き起こす物質によって達成され得る。好ましいこの種のキナーゼは、例えば、タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢまたはＡｋｔ）、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ活性化タンパク質キナーゼ−１（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１またはＲＳＫ）およびタンパク質キナーゼＡである。これらのキナーゼは、ＢＡＤのＳｅｒ−１１２、Ｓｅｒ−１３６、またはＳｅｒ−１５５をリン酸化する。本発明に従うＢＡＤリン酸化の刺激は、例えば、調節的な様式にてシグナル伝達プロセスまたは発現プロセスを妨害し、それによってキナーゼ活性の増大を引き起こす物質によってか、またはＢＡＤリン酸化キナーゼの直接的なアクチベーターによって、達成され得る。
【０１５９】
従って、本発明は、動脈硬化症の治療処置および予防のための有効な手段を提供する。なぜなら、リン酸化状態に影響を与えることによる本発明に従って、活性なプロアポトーシスＢＡＤの存在量を制御することは、特に、動脈硬化症発生の最初の事象（すなわち、内皮細胞のアポトーシス）を中和するからである。
【０１６０】
本発明の好ましい実施形態において、高レベルのホスホ−ＢＡＤおよびその結果としての低レベルのＢＡＤは、ホスファターゼ（特にＰＰ２Ｃ）による脱リン酸化を妨害または少なくとも低減することによって維持される。これは、いくつかの方法、例えば、以下：
ａ）ホスファターゼインヒビター
ｂ）ホスホ−ＢＡＤに結合し、ホスホ−ＢＡＤを安定化し、そして／または必要である場合、ホスホ−ＢＡＤをホスファターゼに接近不可能にする、物質
ｃ）内皮細胞において選択されたホスファターゼ（特に、ＰＰ２Ｃ）の発現を抑制するアンチセンス−オリゴヌクレオチド
の適用によって、達成され得る。
【０１６１】
アンチセンス−オリゴヌクレオチドによって、そして特にそのアンチセンス−オリゴヌクレオチドを使用してＰＰ２ＣのｍＲＮＡと複合体化させることによって、本発明に従うホスホ−ＢＡＤ脱リン酸化の阻害を達成することは、特に有益であることが示された。このオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドヌおよび天然起源のオリゴヌクレオチドであり得る。これらは、例えば、酵母から単離され得る。
【０１６２】
本発明は、脱リン酸化を阻害するために使用され得る、本発明に従う、適切なホスファターゼのインヒビターまたはホスホ−ＢＡＤの結合パートナーを同定し得る方法を提供する。
【０１６３】
１つの実施形態に従って、ＰＰ２Ｃを阻害し、結果としてホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する活性な物質が、同定され得、そして提供され得る。この方法は、試験化合物の存在下でのＰＰ２Ｃとホスホ−ＢＡＤとのインビトロインキュベーション、続いて、低減または阻害されたホスホ−ＢＡＤ脱リン酸化のその後の試験に基づく。
【０１６４】
この型の同定系を使用して、本発明に従って動脈硬化症を処置または予防するために使用され得る物質が、見出され得る。特別な利点は、アポトーシスに対するホスホ−ＢＡＤの間接的な調節効果がまた、ＰＰ２Ｃ活性に依存するという事実に基づく。
【０１６５】
本発明に従う方法の別の好ましい局面に従って、ＰＰ２Ｃを活性化する性質を有する少なくとも１つの脂肪酸が、インキュベーション工程の間に添加される。この実験的な手段によって、特に、脂肪酸によるＰＰ２Ｃの活性化を選択的に阻害する物質が同定され得る。従って、アテローム発生の脂肪酸濃度にて特に内皮アポトーシスを阻害する活性な物質を同定する好ましい方法が、提供される（すなわち、この同定された物質は、この増大した脂肪酸レベルの効果を選択的に中和する）。この高い選択性は、特に有利である。なぜなら、この高い選択性でなければ、ＰＰ２Ｃ効果を含むさらなる調節プロセスの妨害によって引き起こされる所望されない副作用が生じ得るからである。アポトーシスの予定外の阻害は、例えば、癌の発生の増大した危険性を導き得る。なぜなら、プログラムされた細胞死は、細胞増殖を調節する主要な機構であるからである。ＰＰ２Ｃの脂肪酸活性化を選択的に阻害することは、治療物質の予想された副作用を好都合に低減する。なぜなら、アテローム発生因子によって誘導または刺激されるアポトーシスのみが、低減または予防されるからである。
【０１６６】
さらなる実施形態に従って、記載されたアポトーシスプロセスを調節するための物質を同定するための方法を提案し、この方法において、内皮細胞中でアポトーシスを誘導した後、酵素学的に活性な細胞抽出物が調製され、これは引続き、ホスホ−ＢＡＤおよび１または数個の試験物質と共にインキュベートされる。その後、試験物質によるホスホ−ＢＡＤ脱リン酸化の可能性のある阻害が、評価される。
【０１６７】
この方法は特に有利である。なぜなら、この方法は、内皮細胞の生理学的特徴を考慮し、結果として、本発明に従う治療手段に特に適切な試験物質の同定を可能にするからである。この方法は、代替的に、細胞抽出物の代わりに、内皮細胞培養物中で直接試験される物質を用いて実施され得る。内皮細胞におけるアポトーシス誘導の評価は、実施例２に記載される方法に従って実行され得る。
【０１６８】
アポトーシスは、好ましくは少なくとも１つのＰＰ２Ｃ活性化脂肪酸によって誘導され得る。上に記載されるこの方法は、選択的に活性化する物質を提供するという利点を有する。
【０１６９】
さらなる実施形態は、物質を同定する方法を提供し、この方法は、標的としてＰＰ２Ｃを用いて物質のライブラリーをスクリーニングし、結合パートナーを同定する工程を包含する。次いで、この同定された物質は、ＰＰ２Ｃおよびホスホ−ＢＡＤと共にインキュベートされ、そしてホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化に対するそれらの物質の効果が分析される。これは、最初に無細胞系で実行され、その後続いて、内皮細胞に対して候補物を試験することによって実行され得る。
【０１７０】
このことは、以前のスクリーニングにおいてＰＰ２Ｃに結合することが既に示された物質のみをＰＰ２Ｃ調節活性について試験するという利点をともにする。これは、有利なことに、可能性のある試験物質の数を低減し、それによって本方法の効率を強く増大する。物質のライブラリーとして、化学物質ライブラリー、天然物質ライブラリー、生物学的物質ライブラリーまたはペプチドライブラリーが、本発明に従って選択され得る。多数のこのようなライブラリーが、技術標準として公知であり、そして本発明に従って使用され得る。潜在的に活性なペプチドの同定について、ファージライブラリーおよびファージミドライブラリーが特に適切である。
【０１７１】
さらに、標的としてホスホ−ＢＡＤを用いて物質ライブラリーをスクリーニングして、結合パートナーを同定する方法が提供される。ホスホ−ＢＡＤの代わりに、セリン１１２、セリン１３６およびセリン１５５のそれぞれのリン酸化領域に対応するリン酸化ペプチドもまた、標的として使用され得る。これは、関連するリン酸化ＢＡＤ部位に結合し、かつホスホ−ＢＡＤの他の構造には結合しない結合パートナーが選択的に単離される点で、利点を有する。潜在的に活性な物質を同定するための可能性のあるペプチド標的は、以下：
１１２部位：Ｒ（１０７）ＳＲＭＳＳ（１１２）ＹＰＤＲＧ（１１７） （配列番号１）
１３６部位Ｒ（１３２）ＧＳＲＳ（１３６）ＡＰＰＮＮ（１４１） （配列番号２）
１５５部位Ｒ（１４９）ＥＬＲＲＭＳ（１５５）ＤＥＦＥＧＳ（１６１） （配列番号３）
である。
【０１７２】
これらの配列は、マウス由来の抗原配列である。代わりに、各ヒトＢＡＤペプチド配列が、代替的に使用され得る。明らかに、選択されたペプチド配列はまた、Ｎ末端方向またはＣ末端方向に拡大されてもシフトされてもよい。
【０１７３】
本発明においてまた、この同定されたリガンドは、引続いてＰＰ２Ｃおよびホスホ−ＢＡＤと共にインキュベートされ得、続いて、ホスホ−ＢＡＤ脱リン酸化に対するそれらの効果が評価される。
【０１７４】
この実施形態は、このアッセイが、リン酸化ＢＡＤに結合し、それによってそのリン酸化部位をＰＰ２Ｃに対して接近不可能にする物質の検出を選択的に可能にするという点で、利点を有する。この方法において、ＰＰ２Ｃに直接作用しない脱リン酸化工程の適切なインヒビターが同定され得る。好ましくは、ＰＰ２Ｃの活性、そして結果としての他の代謝経路の調節（ここで、ＰＰ２Ｃは、調節因子として関与する）は、影響を受けない。これに関して、ペプチドライブラリー（またはファージミドライブラリー）をスクリーニングすることが有利である。なぜなら、ペプチド候補物は、タンパク質およびペプチドに典型的な相互作用を提示し、ゆえに、特異的な結合を提示する可能性を有するからである。さらに、このペプチド候補物のホスホ−ＢＡＤに対する結合特異性は、いくつかのスクリーニング工程および適切な候補物の組換えによって意図的に増大され得る。
【０１７５】
さらに、動脈硬化症の処置のための治療剤を生成する方法が提供される。この方法において、内皮細胞における各アポトーシスプロセスに対する阻害効果を有する物質が、好ましくは本発明に従う方法によって、第１工程にて同定される。さらなる工程において、これらの物質は、十分量で生成され、そして生理学的に受容可能なキャリア物質と混合される。動脈硬化症の処置に利用され得る治療的に活性な物質または薬理学的に活性な物質が提供される。
【０１７６】
上記に言及した方法のさらなる有利な局面に従って、ＰＰ２Ｃは、ＰＰ２Ｃα、ＰＰ２Ｃβ、ＰＰ２Ｃγ、ＰＰ２Ｃδおよびこれらのサブタイプからなる群より選択される。これらのサブタイプは、以下の刊行物（これらは、完全に本明細書によって参考として援用される）に記載される：Ｔｅｒａｓａｖａら（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｓｏｔｙｐ ｏｆ Ｍｇ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ β ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｉｎ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｈｅａｒｔ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０７，３４２−３４９；Ｈｏｕら（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃＤＮＡｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｏ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２Ｃβ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｔｅｓｔｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３２，７７３−７８０；Ｋａｔｏら（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆｍｏｕｓｅ Ｍｇ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐ ２Ｃβ−４．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１８，３８７−３９３。好ましくは、ＰＰ２Ｃαおよび／またはＰＰ２Ｃβ、特に、ＰＰ２αが、ＰＰ２Ｃとして使用される。
【０１７７】
本発明に従って、セリン１５５位、セリン１１２位、および／またはセリン１３６位でリン酸化されるホスホ−ＢＡＤが使用され得る。これらのリン酸化部位の全てに関して、これらがＢｃｌ−２とＢｃｌ−ＸＬとのＢＡＤの相互作用を妨害することが知られている。一方、セリン１３６のリン酸化は、ＢＡＤの１４−３−３タンパク質への結合を促進する。特に有利な改変体として、セリン１５５がリン酸化されたＢＡＤが使用される。セリン１５５におけるリン酸化は、ＢＡＤがＢｃｌ−ＸＬに結合することを妨害し、ゆえに、調節効果の原因となる。本明細書中において、ＰＰ２Ｃが、好ましくは、Ｐ−ｓｅｒ１１２およびＰ−ｓｅｒ１３６と比較して、Ｐ−ｓｅｒ１５５を脱リン酸化することが、示され得る。この選択性は、アポトーシス調節におけるＰＰ２Ｃの重要な役割を際立たせる。この選択性を理由として、主にアポトーシスを妨害する際のセリン１５５の中枢的な役割を理由として、セリン１５５における脱リン酸化を選択的に抑制するインヒビターを同定することが、特に有利である。さらなる改変体として、セリン１７０においてリン酸化されたＢＡＤが使用され得る。
【０１７８】
上に記載された方法の望ましいさらなる局面に従って、ホスホ−ＢＡＤは、検出を容易にするために放射性標識される。このためには、（［３２Ｐ］）ＢＡＤが使用され得る。さらなる検出方法として、ホスホ−ＢＡＤおよび／またはＢＡＤに対する抗体もまた、（リン酸化状態に影響を与えることなく）使用され得る。Ｐ−ｓｅｒ１１２、Ｐ−ｓｅｒ１３６、またはＰ−ｓｅｒ１５５に対して選択的な抗体を使用することがさらに有利である。このような抗体は、試験物質が上記の位置のうちの１つにおける脱リン酸化を選択的に妨害する場合の分析を可能にする。
【０１７９】
ＰＰ２Ｃを活性化するために、好ましくは少なくとも１５炭素原子長を有する脂肪酸であって、１つの位置において少なくとも不飽和化され、そして少なくとも１つの遊離カルボキシル基を保有する脂肪酸が選択される。選択的にＰＰ２Ｃを活性化するこの種の脂肪酸の例は、オレイン酸、アラキドン酸、およびジンコール酸（ｇｉｎｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）である。これらがＰＰ２Ｃを１０〜１５倍活性化することが実証されている。
【０１８０】
さらに、Ｍｎ２＋およびＭｇ２＋がこの試験混合物に添加され、好ましくは、０．５〜１．５ｍＭの濃度のＭｇ２＋が添加される。さらに、この混合物は、さらなる添加物（例えば、緩衝液など）、さらなる補因子、および／または類似の物質を含む。
【０１８１】
この記載した方法は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を妨害し、ゆえに動脈硬化症を処置するための治療剤として使用され得る物質を検出するような望ましい様式で使用され得る。
【０１８２】
この方法は、本発明に従って使用される物質が、ＰＰ２Ｃの脂肪酸活性化をブロックすることによって内皮アポトーシスを妨害する場合、特に有利である。
【０１８３】
この方法は、これらの物質がＰＰ２Ｃへの活性化脂肪酸の結合を競合的に阻害する場合、さらに特に好ましい。これらの物質は、活性化脂肪酸に対するＰＰ２Ｃの結合部位をブロックするが、それ自体のＰＰ２Ｃ活性化特性を保持しない、脂肪酸であっても改変脂肪酸であっても脂肪酸アナログであってもよい。
【０１８４】
ＰＰ２Ｃ活性化脂肪酸の阻害誘導体はさらにジホスホネート（ｂｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）脂肪酸および／またはそれらの誘導体間で見出され得る。これらの物質はさらに、それらのジホスホネート残基を介して血管中のカルシウム沈着物に結合し、それゆえに所望の位置にてより正確に作用し得るという有利な特性を有する。これらは、カルボン酸基のホスホン化によって各脂肪酸から合成され得る。例は、ジホスホン酸（ｂｉｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）およびそれらの塩、好ましくは以下の一般式に従うものである。
【０１８５】
【化４】
ここで、Ｒ１は、１〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のアルキル残基、あるいは置換または非置換の炭素環式アリール残基または複素環式アリール残基であり、ここで、このアルキル残基は、アミノ基、Ｎ−モノアルキルアミノ基、Ｎ−ジアルキルアミノ基、および／もしくはＳＨ−基で置換され得、このアルキル基は、１〜１２個の炭素原子を有し得、そしてこのアリール残基は、１もしくは数個のヘテロ原子を有し得、そして置換基として、１〜１２個のＣ原子を有する分枝鎖および／もしくは直鎖のアルキル残基、遊離アミノ基、１〜６個のＣ原子を有するモノアルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基、あるいはハロゲン原子を有し得、ここで、Ｒ２は、ＯＨ、ハロゲン原子（好ましくはＣｌ）、ＨまたはＮＨ２である。これらの物質の例は、イバンドロン酸（ｉｂａｎｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、エチドロン酸、クロドロン酸（ｃｌｏｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、パミドロン酸（ｐａｍｉｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アレンドロン酸（ａｌｅｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、リセドロン酸（ｒｉｓｅｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、チルドロン酸（ｔｉｌｕｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ゾレドロン酸（ｚｏｌｅｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、シマドロン酸（ｃｉｍａｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ネリドロン酸（ｎｅｒｉｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、オルパドロン酸（ｏｌｐａｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、３−ピロール−１−ヒドロキシプロパン−１，１−ジホスホン酸および／またはミノドロン酸（ｍｉｎｏｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ジホスホネート−１，１−ジカルボン酸（ＤＰＤ）および／または１−メチル−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸（ＭＤＰ）である。
【０１８６】
本発明に従う活性な物質は、さらに、診断目的のため（例えば、プラークの位置を確認するため）、または造影剤として使用され得る。ジホスホネート脂肪酸誘導体のそれぞれの使用が特に有利である。なぜなら、これら（上記のもの）は、それらのジホスホネート残基を介してカルシウム沈着物に結合し、それによって動脈硬化症のホットスポット（プラーク）を検出するからである。従って、これらは、例えば、シンチグラム造影法に利用され得る。このことを目的として、好ましくはＤＰＤおよびＭＤＰが使用される。さらに、ジホスホネート基は、テクネチウム−９９−メタによって放射性標識され得る。次いで、レセプター結合する場合の脂肪酸残基は、プラークから構成される結合部位に放射性シグナルを伝達し、それによって診断を可能にし得る。さらに、いわゆる常磁性鉄ナノ粒子と組み合わされたジホスホネート脂肪酸誘導体が、磁気共鳴断層撮影（ＭＲＴ）における造影剤として使用され得る。これによって、圧倒的な衛生上の傷害が生じる前の初期段階に、発生中の動脈硬化症または既に存在する動脈硬化症の診断を可能にする好ましい様式で、プラークが検出され得る。
【０１８７】
同様に、本発明に従って適用可能な物質は、脂肪酸による活性化を示すＰＰ２Ｃに対する、ネガティブレギュレーターであり得る。このような物質は、例えば、ＰＰ２Ｃのそれぞれの調節中心に結合し得、これによって、活性化を妨げ得る。
【０１８８】
さらなる実施形態によれば、その阻害性物質は、ＰＰ２Ｃの活性中心に結合し得、これによって、ホスホ−ＢＡＤに対するＰＰ２Ｃの結合を競合的に阻害し得る。これに関して、この物質は、その三次元構造がホスホ−ＢＡＤの三次元構造に本質的に対応し、転換しないかまたはゆっくりとしか転換しないアナログを構成する場合に、有利である。それにもかかわらず、異なる構造を有する競合的インヒビターもまた、本発明に従って使用され得る。さらなる実施形態によれば、ＰＰ２Ｃに対する抗体または抗体フラグメントが、本発明に従って使用され得る。ＰＰ２Ｃの調節部位を特異的に標的とする抗体または抗体フラグメントは、ＰＰ２Ｃの結合部位を有利にブロックし得、これによって、ＰＰ２Ｃの活性化を妨げ得る。
【０１８９】
さらに、ホスホ−ＢＡＤに結合し、これによって、ＰＰ２Ｃのリン酸残基を接近不可能にする物質が、本発明に従って使用され得る。このような物質は、例えば、ペプチドまたはポリペプチドであり得る。ポリペプチドの使用は、このポリペプチドが、確立されたスクリーニング手順によってペプチドライブラリーから単離され得、そしてまた、高い特異性の方向で、最適化または改変され得るという、利点を与える。このようなポリペプチドは、好ましくは、例えば結合ポケットのような相互作用部位を有するべきであり、これによって、このポリペプチドは、ホスホ−ＢＡＤに結合して、そのリン酸化部位を、ＰＰ２Ｃに対して接近不可能にし得る。この部位が結合ポケットを構成する場合、この部位は、例えば、その三次元構造に関して、抗ホスホ−ＢＡＤ抗体の抗原結合部位にほぼ対応し得る。この種の抗体は、既に公知であるので、このような物質は、この抗原結合部位の既知のアミノ酸配列から容易に作製され得る。この結合ポケットはまた、そのそれぞれのリン酸化部位において、ホスホ−ＢＡＤに対する特に高い特異性を達成するため、そして必要であれば、他の細胞成分との副作用を低下させるために、改変され得る。
【０１９０】
本発明による別の好ましい実施形態において、この物質の結合ポケットは、その三次元構造において、ホスホ−ＢＡＤセリン１１２、ホスホ−ＢＡＤセリン１３６およびホスホ−ＢＡＤセリン１５５に対する抗体の抗原結合部位にほぼ対応する。この文脈において、ホスホ−ＢＡＤセリン１５５に対応する結合ポケットを形成することが、特に有利である。なぜなら、ＰＰ２Ｃは、好ましくは、ＢＡＤの調節機構に対する特別の関連を有するこの部位を脱リン酸化することが示されたからである。
【０１９１】
ホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化はまた、細胞内でのＰＰ２Ｃの合成を抑制することによって、防止され得る。この目的のために、ＰＰ２ＣのｍＲＮＡと複合体形成し、それによってその翻訳をブロックする分子が使用され得る。この分子は、ＰＰ２ＣのｍＲＮＡにハイブリダイズする、少なくとも部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチド（いわゆるアンチセンスオリゴヌクレオチド）であり得る。いくつかのＰＰ２ＣサブタイプのｍＲＮＡ核酸配列は、標準的なインターネットデータベース（例えば、ＮＣＢＩによって提供されるもの）においてアクセス可能である。確立された方法により、これらの配列から出発して、関連するｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス分子の設計が可能である。代表的な例を、図１に列挙する。
【０１９２】
好ましくは、ＰＰ２ＣのｍＲＮＡと複合体形成する生体分子は、アポトーシスを予防するために、内皮細胞に導入される。有利には、この生体分子は、上述の実施形態に従うオリゴヌクレオチドである。
【０１９３】
本発明は、ＰＰ２ＣのｍＲＮＡと複合体形成し得る発現産物をコードする、細胞において発現可能な核酸構築物をさらに提供する。この発現産物は、好ましくは、一本鎖オリゴヌクレオチドである。この産物は、例えば、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡの反対の鎖（相補鎖）の配列を（完全にかまたは部分的に）提示し、その結果、この産物は、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡにハイブリダイズして、二重ヘリックスを形成する。代表的なオリゴヌクレオチドの例を、図１に示す。
【０１９４】
好ましい発展に従えば、本発明に従う核酸構築物は、真核生物において発現可能な発現ベクターである。ＰＰ２Ｃのコード配列が、真核生物において発現可能な発現ベクタープロモーターの下流で逆方向に（少なくとも部分的に）クローニングされる場合が、特に好ましい。この様式で、この配列が読まれる場合に転写産物が同時に生成し、この転写産物は、アンチセンス分子として作用し、ＰＰ２ＣのｍＲＮＡと複合体形成し、これによって、ＰＰ２Ｃの翻訳を妨げる。
【０１９５】
この核酸構築物は、内皮細胞においてアポトーシスを予防する方法において使用され得、ここで、内皮細胞は、それぞれの核酸構築物でトランスフェクトされる。
【０１９６】
本発明のさらなる実施形態において、ＢＡＤからホスホ−ＢＡＤへのリン酸化が、アポトーシス誘発性（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）ＢＡＤレベルを、好ましくは低レベルに維持することの結果として、支持され得る。この目的のために、ＢＡＤのリン酸化に関連するプロテインキナーゼ（上記を参照のこと）の活性または発現に、直接的にかまたは間接的に影響を与えることが提唱される。このことは、例えば、酵素発現の誘導もしくは強化によって、またはこれらの酵素の活性を、例えばリガンドによって増加させることによって、達成され得る。
【０１９７】
１つの関連する実施形態において、β−２−交感神経作用剤（ｓｙｍｐａｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃ）であるクレンブテロールが、動脈硬化症の治療のために投与される。内皮細胞は、β１−レセプターおよびβ２−レセプターを保有し、その結果、クレンブテロールは、これらの細胞において、ＴＧＦ−β１の合成を誘導し得る。増殖因子がＢＡＤのリン酸化を導くことが公知であるので、クレンブテロールは、高いＢＡＤレベルによるアポトーシス誘発（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）効果を低下させるために、使用され得る。
【０１９８】
さらに、β−交感神経作用剤としてのクレンブテロールは、アドレナリンまたはノルアドレナリンと同様に、細胞ｃＡＭＰレベルの増加を開始させ、このことは、プロテインキナーゼＡを刺激するアクチベータとして作用する。従って、クレンブテロールはまた、この機構によって、ＢＡＤレベルの低下をもたらし、同時に平行して、ホスホ−ＢＡＤ値を増加させる。
【０１９９】
この好ましい適用は、原理的にはまた、細胞ｃＡＭＰレベルの上昇をもたらす他の活性物質に対して有効である。この群の物質は、例えば、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）のインヒビターおよびさらなるβ−交感神経作用剤を包含し、これらは、本発明に従って、リン酸化ＢＡＤの量を、好ましい様式で上昇させるために使用され得る。ＰＥＤインヒビターの例は、カフェイン（ｃｏｆｆｅｉｎｅ）、テオフィリン（ｔｈｅｏｐｙｌｌｉｎｅ）およびシルデニフィル（ｓｉｌｄｅｎｉｆｉｌ）である。この群のさらなるメンバーは、文献から公知である。
【０２００】
本発明に従ってホスホ−ＢＡＤ値の上昇をもたらし得るさらなる物質は、血液ＨＤＬ濃度を上昇させる物質、ならびに生物活性スフィンゴリピド（例えば、シロホスホリルコリン（ｓｙｌｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎ）およびリソスルファチド（ｌｙｓｏｓｕｌｆａｔｉｄ）のような）である。増加したＨＤＬ濃度および生物活性スフィンゴリピドは、キナーゼ活性を刺激することによって、ホスホ−ＢＡＤ値の上昇を生じる。
【０２０１】
記載した物質、分子および核酸構築物の全ては、好ましくは、動脈硬化症を処置するために使用され得る。本発明によれば、さらに、治療物質または薬理学的に活性な物質が提供され、これらの物質は、動脈硬化症の処置のために先に記載された物質の少なくとも１つを含むか、またはこの少なくとも１つによって構成される。
【０２０２】
それぞれの治療剤の調製のために、活性物質は、医療調製物のために通常使用されるキャリアとさらに組み合わせられ得る。従って、この物質は、以下のような適用形態（例えば、皮膚上（ｅｐｉｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、頬、舌、舌下、経口、直腸、肺、結膜、吸入による、心臓下、動脈内、静脈内、腰内（ｉｎｔｒａｌｕｍｂａｌｌｙ）、ヘクト内（ｉｎｔｒａｈｅｃｔａｌｌｙ）、皮内、皮下、粘膜内、または腹腔内）の１つのために調製され得る。
【０２０３】
この目的のために、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、フォーム、軟膏、ペースト、錠剤、丸剤、糖剤、坐剤、直腸カプセル、ゼリー、スプレー、エアロゾル、吸入剤、ドロップ、注射用溶液、注入用溶液、移植物またはリポソーム系が、調製され得る。本発明に従うオリゴヌクレオチド治療剤のために、核酸が細胞に移入される生薬形態が必要である。このことは、例えば、リポソームによって、またはウイルスビヒクルもしくは非ウイルスビヒクルによって、実施され得る。
【０２０４】
このような治療剤の調製のために、活性物質は、治療的に活性なさらなる物質とさらに組み合わせられ得る。複合調製物において、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を妨げる物質が、本発明に従うＢＡＤリン酸化を刺激する物質と組み合わせられ得る。これらの物質を、単独でか、または脂質の減少のための公知の物質もしくはＨＤＬ濃度を増加させる物質と組み合わせて組み合わせることが、さらに可能である。このような複合調製物によって、動脈硬化症の本質的な要因（上昇した脂質レベル）および高い脂質レベルの結果（内皮細胞のアポトーシス）が、同時に阻止され得る。
【０２０５】
本発明によれば、インビトロの方法は特に、細胞、細胞培養物、器官または器官の一部、器官系およびヒト身体由来の部分もしくは動物身体由来の部分の使用を包含する技術であると理解される。用語「インビトロ」は、特に、細胞、細胞抽出物、精製された成分、ホモジネートなどを使用する、人工系を包含する。
【０２０６】
本発明による方法と結び付けて使用される、用語「ホスホ−ＢＡＤ」はまた、ＰＰ２Ｃによって脱リン酸化される、可能なホスホ−ＢＡＤアナログおよび代替の物質（例えば、カゼイン）の使用を包含する。
【０２０７】
本発明によって適用可能な物質は、キラル物質の場合、ラセミ体および／または異性体として使用され得る。
【０２０８】
本発明を、以下の実施例によって、さらに説明する。
【０２０９】
【実施例】
（実施例１）
本発明による試験方法の１つの実施形態において、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化は、組換えＢＡＤを使用してインビトロで達成される（Ｌｉｚｃａｎｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｏｒｒｉｃｅ，Ｎ．およびＣｏｈｅｎ，Ｐ．（２０００）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＡＤ ｂｙ ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｖｉａ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｔｅ，ｓｅｒ１５５．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３４９巻、５４７−５５７）。ホスホ−ＢＡＤを、１２μｇ ＢＡＤ（ＧＳＴ融合タンパク質として；Ｌｉｚｃａｎｏら、２０００）、０．５５μｇ ＰＫＡ（Ｓｉｇｍａ）、１μｌ ＡＴＰ、１５μＣｉ ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む反応混合物（１２μｌ）によって得た。この反応混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０２１０】
ホスホ−ＢＡＤのための代替の調製方法において、８ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）中の３．４μｇ ＧＳＴ−ＢＡＤ；１０ｍＭ β−グリセロホスフェート、２ｍＭ ＥＤＴＡ；０．４ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム；１５ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．０４％ ２−メルカプトエタノール；１μＭ ＡＴＰおよび１５μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（放射能検出のため）を、それぞれのキナーゼ（１００ｎｇ ＰＫＡ、１００ｎｇ ＰＫＢまたは５ｍＵ ＲＳＫ）と共に、総容量１０μｌで、３０℃で３０分間インキュベートした。
【０２１１】
リン酸化反応を、５μｌ Ｌａｅｍｍｌｉプローブ緩衝剤の添加によって停止させた。インキュベーションの後に、放射能標識ＡＴＰおよび非標識ＡＴＰを、Ｃｅｎｔｒｉ−ＳＥＰ遠心分離カラム（ｅｍｐ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｒｌｉｎ）中での遠心分離（７５０×ｇｍａｘで２分間）によって除去し、（ＰＰ２Ｃとの）２回目のインキュベーション工程における新たなリン酸化を防止した。プローブを、時間的に遅れることなく、さらなる工程において処理するべきである。
【０２１２】
ＰＰ２Ｃ酵素を得るために、ｃＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、その後、Ｎｉ−ＮＴＡセファロースで精製した。この場合には、ウシの脳由来のＰＰ２ＣβをコードするｃＤＮＡを使用した（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５１，３２８−３３８（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ ２−Ｃ ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｒｅｔｉｎａｅ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）。
【０２１３】
ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化は、時間と濃度との両方に依存する。試験混合物は、Ｍｇ２＋イオンまたはＭｎ２＋イオンを含まなければならない。なぜなら、ＰＰ２Ｃは、これらのイオンの存在に依存するからである。好ましくは、試験混合物は、０．５〜１．５ｍＭ／ｌのＭｇ２＋を含む。インキュベーション期間は、少なくとも１０分間であり得るが、好ましくは、３０分間である。ＰＰ２Ｃを、少なくとも３０ｎｇの濃度、好ましくは３００ｎｇを超える濃度で、添加した。
【０２１４】
遠心分離によって精製した、放射能標識［３２Ｐ］ＢＡＤを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１０倍に希釈した。１５μｌのインキュベーション混合物を、３７℃（または３０℃）で３０分間インキュベートした。この試験混合物は、以下を含んだ：９μｌ ［３２Ｐ］ＢＡＤ（０．２μｇ）；１．５μｌ １０倍反応緩衝剤（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、１％ ２−メルカプトエタノール）；３００ｎｇ ＰＰ２Ｃ。
【０２１５】
この反応を、５μｌの変性緩衝剤の添加によって停止させ、そしてタンパク質が１２．５％ ＳＤＳ ＰＡＧＥミニゼリー上で分離されるまで、氷上に維持した。脱リン酸化またはリン酸化の程度を、オートラジオグラフィーによって分析した。
【０２１６】
さらなる可能なインビトロ試験混合物によれば、ＰＰ２Ｃの活性は、以下を含有する３０μｌの混合物を、３０℃で１０分間インキュベートすることによって、分析される：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；０．０１％ ２−メルカプトエタノール；１．３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび１μＭ［３２Ｐ］カゼイン（５×１０４ｃｐｍ）（ＭｃＧｏｗａｎおよびＣｏｈｅｎ，１９８８；Ｃｏｈｅｎ １９９１）。脂肪酸の存在下でのＰＰ２Ｃ活性を決定するために、０．７μＭの酢酸マグネシウムを添加した。この反応を、２００μｌの２０％トリクロロ酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ）の添加によって、停止させた。１００００ｇでの遠心分離（５分間）の後、２００μｌの上清を、その［３２Ｐ］リン酸塩の濃度について分析した。
【０２１７】
それぞれの結果により、試験系が機能的であるか否かを試験することが可能である。脱リン酸化を阻害する能力について試験される物質を、それぞれの試験混合物に添加し、そして上記のようにインキュベートする。オートラジオグラフィーによって、コントロール（試験物質なし）と比較してどの程度の阻害が起こったかを、以下の様式で試験する。好ましくは、潜在的な活性物質を、異なる濃度で試験して、間違った濃度では効果を示さない有望な候補を失わないようにする。候補（特に、有望な候補）はまた、１つの共通の混合物内で、それらの相乗効果について試験され得る。
【０２１８】
脂肪酸により活性化されたＰＰ２Ｃを標的とする阻害がどの程度可能であるかを試験するために、ＰＰ２Ｃ活性化脂肪酸もまた、この混合物に添加した。例として、好ましくは１０μＭと５００μＭとの間の濃度の、オレイン酸を使用した。それぞれのコントロールによって、どの程度まで、試験物質が、ＰＰ２Ｃの「通常の」（刺激されていない）活性を並行して阻害することなく、脂肪酸によるＰＰ２Ｃの活性化のみを停止させるかが決定され得る。このような実験アプローチによって、通常の調節プロセスを妨害することなく、脂肪酸により誘導されるアポトーシスを正確にかつ単独で阻害する物質が、選択的に決定され得る。
【０２１９】
このように同定した試験物質を、以下の様式で、内皮細胞において試験し得る（実施例２を参照のこと）。
【０２２０】
（実施例２）
内皮細胞培養物を懸濁させ、そして試験細胞培養物を、４×１０４細胞／ｃｍ２の初期細胞密度で、ポリ−Ｌ−リジンコーティングした球またはポリ−Ｌ−リジンコーティングしたスライドガラス上に接種し、ＴＵＮＥＬアッセイのためにペトリ皿に入れた。これらの培養物を、ＤＭＥＭ中の加湿雰囲気下で温度３７℃および５％ＣＯ２に維持し、これに、２０％のウシ胎仔血清および抗生物質を添加した。培地を、２日おきに交換した。
【０２２１】
接種の４日後、培養物を無血清培地に２４時間曝露した。これに続いて、これらの細胞を、試験物質および／またはＰＰ２Ｃ活性化脂肪酸、脂肪酸誘導体もしくは結合剤で処理した。脂肪酸および／またはそれらの誘導体を、純粋なＤＭＳＯに最初に溶解し、次いで、培養培地で希釈して、全ての実験において、０．０１６％ＤＭＳＯの最終濃度にした。
【０２２２】
アポトーシスを誘導するために、好ましくはＰＰ２Ｃ活性化脂肪酸（例えば、オレイン酸またはギンコール酸（ｇｉｎｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ））を添加したが、他の公知のアポトーシス誘発物質もまた使用され得る。内皮細胞培養物においてＰＰ２Ｃを検出するために、２０ｍＭのＭｇ２＋イオンを使用した。インキュベーションに続いて、どの程度まで試験物質がアポトーシスを阻害し得るかを分析した。
【０２２３】
アポトーシスの検出のために、核の形態および染色体の構造を、核ＤＮＡについて染料としてＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８を適用して、可視化し得る。これらの培養物を、メタノール中１０μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８と共に１０分間インキュベートし、続いてメタノールおよびＰＢＳで洗浄する。引き続いて、核の形態を、蛍光顕微鏡で分析した。収縮した核および濃縮されたクロマチンを有する内皮細胞の数を、４つの異なる培養球ごとに３つの領域で計数した。これらの結果を、細胞全体における、濃縮されたクロマチンおよび収縮した核を有する内皮細胞の百分率として、表現および分析した。
【０２２４】
ＤＮＡの断片化の検出のために、市販のキットを製造業者の指示に従って使用して、ＴＵＮＥＬアッセイを実施した。細胞単層を、−２０℃で２０分間、メタノール中に手短に固定し、次いで３７℃で１時間、ジゴキシゲニン標識ｄｄＵＴＰと共に、ターミナルトランスフェラーゼの存在下でインキュベートした。この反応を停止させ、そしてフルオレセインイソチオシアネートと結合した抗ジゴキシゲニン抗体を添加し、そしてこの混合物をさらに３０分間インキュベートした。引き続いて、適切な顕微鏡（ＬＳＭ ５１０、Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、蛍光を分析した。
【０２２５】
カスパーゼ−３の活性を、蛍光定量キットで決定した。このアッセイは、カスパーゼ−３による、ペプチド基質アセチル−ａｓｐ−ｇｌｕ−ｖａｌ−ａｓｐ−７−アミノ−４−メチルクマリン（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ）の加水分解（蛍光ＡＭＣ成分の放出をもたらす）に基づく。細胞を採取し、そして４℃にて６００×ｇで５分間の遠心分離によって、ペレット化した。上清を除き、そしてペレットをＰＢＳで洗浄した。続いて、ペレットを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）；５ｍＭ ３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニウム１−プロパンスルホネートおよび５ｍＭ ジチオスレイトールを含む、溶解緩衝液に溶解し、そして氷上で２０分間インキュベートした。引き続いて、細胞を、４℃にて１４０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を、反応緩衝剤（１０ｍＭ Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ；２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）；２ｍＭ ＥＤＴＡ；０．１％ ３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネートおよび５ｍＭ ジチオスレイトール）と混合した。ＡＭＣの蛍光を、３６０ｎｍの活性化波長および４６０ｎｍの発光波長で測定した。この結果を、ＡＭＣ標準曲線に関して計算し、そして好ましくは、ｎｍｏｌ ＡＭＣ／ｍｇタンパク質／分として決定した。タンパク質の量を、標準物としてウシ血清アルブミンを用いる「ビシンコリン酸（ｂｉｃｉｎｃｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）タンパク質アッセイ」キットを使用することによって、測定した。
【０２２６】
記載された方法によって、処置される細胞がアポトーシスプロセスを示すか否かを決定し得る。これによって、内皮細胞においてアポトーシスを減少させるかまたは防止する試験物質が決定され得る。この様式で、動脈硬化症に対する価値ある潜在的な治療剤が、同定され得る。
【０２２７】
【表１】
【０２２８】
【発明の効果】
本発明により、内皮細胞のアポトーシスを促進する動脈硬化症を直接的または間接的に妨げるための、方法ならびに物質または物質群が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡにハイブリダイズして二重ヘリックスを形成する、代表的なオリゴヌクレオチドの例を示す。いくつかのＰＰ２ＣサブタイプのｍＲＮＡ核酸配列は、標準的なインターネットデータベース（例えば、ＮＣＢＩによって提供されるもの）においてアクセス可能である。確立された方法により、これらの配列から出発して、関連するｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス分子の設計が可能である。代表的な例を、図１に列挙する。
【発明の属する技術分野】
本発明は、動脈硬化症を処置するための方法に関する。本発明は、ドイツ国特許出願１０２ ２６ ４２０．１の優先権を主張し、これは、開示目的のために参照される。
【０００２】
【従来の技術】
心筋梗塞、発作および塞栓症のような心臓血管疾患は、とりわけ、先進国における最も一般的な死因である。これらの疾患は、しばしば、動脈硬化症によって引き起こされる。動脈硬化症は、中血管壁に対する変化と合わせた、内側の血管壁に対する複合した変化（これらとしては、脂肪、複合糖質、血液成分ならびに繊維性組織およびカルシウムの局所的蓄積が挙げられる）に起因する、形態学的徴候として理解されている。これらの因子は、動脈壁中の隆起した硬化性の領域を導く。
【０００３】
動脈硬化性損傷（病変）の発生は、特に、３つのプロセス、すなわち、内側の血管壁中のマクロファージ、Ｔ−リンパ球および平滑筋細胞の移動、増殖および蓄積、平滑筋細胞を横切る細胞外マトリクスの産生、ならびにマクロファージ、筋細胞および細胞外マトリクスにおける脂質の蓄積、を含む（Ｒｏｓｓ，Ｒ．（１９９３）．Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｃｌｅｒｏｓｉｓ：ａ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ｔｈｅ １９９０ｓ．Ｎａｔｕｒｅ １９９３ Ａｐｒｉｌ ２９；３６２（６４２３）８０１−８０９（非特許文献１））。
【０００４】
動脈硬化性の病変の発生は、内皮組織の損傷または機能不全によって惹起される。これは、特に、血栓嚢腫の接着および凝集を生じ、そしてこれに起因して、例えば、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）のような、増殖因子の分泌を生じる。これに続いて、内膜平滑筋細胞の増殖が生じ、そして最後に、新しい内側の血管壁（新内膜）の発生によって、血管壁の肥厚を生じる。さらに、内皮細胞病変は、接着分子の発現の増加に加えて、血管壁の透過性の増加を引き起こし、これが、マクロファージおよび白血球の浸潤、そして結果的に、その後の炎症反応を導く。
【０００５】
喫煙、高血圧および糖尿病に加えて、血中脂質のレベルの増加（特に、２００ｍｇ／日を超える血中コレステロールレベルの増加）は、動脈硬化症の発生の重要な危険因子を代表する。血中脂質は、中性脂肪（トリグリセリド）、リン脂質、コレステロール、コレステロールエステルおよび遊離脂肪酸から構成される。血中では、これらは、遊離形態で存在せず、いわゆる、リポタンパク質と呼ばれるように、すなわち、キャリアタンパク質に結合されている。これらのキャリアタンパク質は、超遠心分離または電気泳動におけるそれらの特性に従って、いくつかの型、すなわち、カイロミクロン、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中比重リポタンパク質、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）および高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）に細区分され；これらは、アポリポタンパク質として要約される。ＬＤＬの本質的な成分は、コレステロールである。
【０００６】
ＬＤＬは、末梢の細胞にコレステロールを輸送するので、高ＬＤＬ濃度は、血管壁でのコレステロール沈着の増加を導く。それによって、これらは、動脈硬化症の発生を促進する。対照的に、ＨＤＬレベルの上昇は、保護機能を示す。
【０００７】
ＬＤＬの顕著な動脈硬化性効果はまた、周辺組織から放出される反応性酸素種または酵素によって引き起こされ、これらは、ｏｘＬＤＬへＬＤＬを酸化し得る。浸潤性マクロファージは、それらのスカベンジャーレセプターによってｏｘＬＤＬを取り込み得、そして細胞内脂質蓄積の結果として、いわゆる、泡沫細胞となり、これは、炎症誘発性、血栓誘発性およびアテローム発生性の物質を分泌し、そしてサイトカインを放出し、その後、血管平滑筋細胞の増殖が生じる（ｄｅＷｉｎｔｅｒ Ｍ．Ｐ．ら、Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌａｓｓ Ａ：Ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２０００ Ｆｅｂ；２０（２）：２９０−２９７（非特許文献２））。
【０００８】
ＬＤＬ沈着の元の小さい領域は、進行的に蓄積して、プラークを形成する。さらなるカルシウム沈着によって、プラークが形成され得、これが、血管を大きく収縮させる。プラークの破裂の結果として、血栓が生じ得、これが、塞栓症を導き、そして結果として、周辺組織における虚血、そしておそらく、虚血性発作を導く。
【０００９】
血中脂肪レベルの増加は、動脈硬化症の主要な危険因子と考えられているので、処置および予防のための公知の治療概念は、増加された血漿脂質レベルの減少に基づき、それによって、特に、ＬＤＬおよびその前駆体であるＶＬＤＬの減少に焦点を当てられている。この目的を達成するために、フィブラート（ｆｉｂｒａｔｏ）誘導体またはニコチン酸誘導体を使用することが公知であり、これらは、潜在的アテローム発生性のＶＬＤＬの合成の減少および分解の増加によって、血漿トリグリセリドおよび血漿コレステロールの濃度を減少する。イオン交換樹脂もまた使用され、潜在的アテローム発生性のＬＤＬの濃度を減少し得る。
【００１０】
動脈硬化症の処置のための別の治療アプローチは、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ（コレステロール生合成の重要な酵素を構成する）のインヒビターによって、および肝臓ＬＤＬレセプターの過剰発現を刺激することによって、ＬＤＬ濃度を減少することを試みる。これらのＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼインヒビター（「スタチン」とも称される）は、潜在的アテローム発生性のＬＤＬ−コレステロールの６０％までの減少を達成し得る。
【００１１】
さらに、アポトーシスプロセスが、動脈硬化症の発生に関与することが公知である。アポトーシス（プログラムされた細胞死）は、ストレス因子または毒性物質に対する反応としての、または意図的な細胞自殺反応の結果としての、細胞の排除である。アポトーシスは、特徴的なＤＮＡフラグメント化、核膜の破壊、クロマチン凝集、核の縮小および膜の不安定化（ｂｌａｂｂｉｎｇ）を導く、シグナル伝達経路の標的化された活性化によって達成される（Ｋｅｒｒ Ｊ．Ｆ．ら（１９７２）．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ａ ｂａｓｉｃ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ｗｉｔｈ ｗｉｄｅ−ｒａｎｇｉｎｇ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ２６，１９７２ Ａｕｇ；２６（４）：２３９−２５７（非特許文献３）；Ｓｅａｒｌｅ Ｊ．ら（１９８２）Ｎｅｃｒｏｓｉｓ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｗｉｔｈｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．Ｐａｔｈｏｌ Ａｎｎｕ １７，２２９−２５９（非特許文献４））。食作用による死細胞の排除は、隣接する細胞によって行われる。
【００１２】
いくつかのシグナル伝達経路が、アポトーシスの誘導について記載されている。哺乳動物において、アポトーシスは、カスパーゼ、Ａｐａｆ１（アポトーシスプロテアーゼ活性化因子）およびＢｃｌ２ファミリーによって主に調節される（Ａｄａｍｓ ＪＭら（１９９８）．Ｔｈｅ Ｂｃｌ−２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ：ａｒｂｉｔｅｒｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８ Ａｕｇ．２８；２８１（５３８１）：１３２２−１３２６（非特許文献５）；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（１９９８）．Ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９８ Ａｕｇ．２８；２８１（５３８１）：１３０５−１３０８（非特許文献６）を参照のこと）。
【００１３】
ヒトアテレクトミーに対するいくつかの研究は、動脈硬化症性プラークにおけるアポトーシスを検出する（Ｈａｎら（１９９５）．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎ ｒａｔ ｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｅｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９５ Ａｕｇ．；１４７（２），２６７−２７７（非特許文献７）；Ｈｅｇｙｉ，Ｌ．ら（１９９６）．Ｆｏａｍ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐｉｄｃｏｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ １９９６ Ｄｅｃ；１８０（４），４２３−４２９（非特許文献８））。従って、アポトーシスプロセスは、マクロファージおよび平滑筋細胞において明らかにされている。さらに、プラークの破裂後、アポトーシスは、主に、繊維性のキャップにおいて、破裂位置において、脂質封入体の付近において、および壊死性中心の周辺において生じることが公知である（Ｃｒｉｓｂｙら（１９９７）．Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｂｏｔｈ ｏｎｃｏｓｉｓ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９７ Ａｐｒ．；１３０（１−２），１７−２７（非特許文献９））。
【００１４】
多くの糸口は、動脈硬化誘発性因子（ｏｘＬＤＬ、アンギオテンシンＩＩまたは反応性酸素のような）がまた、インビトロで、内皮細胞においてアポトーシスを誘導するので、アポトーシスによる内皮破壊が、動脈硬化症の発生における初期事象を構成することを示す（Ｄｉｍｍｌｅｒら（１９９７）．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．８１，９７０−９７６（非特許文献１０）；Ｄｉｍｍｌｅｒら（１９９７）．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｖｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＩＣＥ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ＣＰＰ３２−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５，６０１−６０８（非特許文献１１）；Ｈｅｒｍａｎｎら（１９９７）．Ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｈ２Ｏ２ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｏｘ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １９９７ Ｄｅｃ．；１７（１２）３５８８−３５９２（非特許文献１２））。内皮のアポトーシスは、内皮層の完全性を破壊し、そしてそれによって、プラークの発生を導く炎症誘発性反応に寄与する。従って、内皮細胞におけるアポトーシスは、プラーク侵食および血小板凝集のプロセスに必須である。
【００１５】
さらに、アポトーシスのシグナル伝達における重要な生理学的メディエータとしてのＮＯの役割が、議論されている。先の研究は、ＮＯが、異なる細胞型においてアポトーシスを誘導し得ることを示した。対照的に、より最近の研究は、ＮＯによる抗アポトーシス効果および内皮細胞の保護を指摘する（Ｄｉｍｍｌｅｒら（１９９７）．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．８１，９７０−９７６（非特許文献１３）；Ｄｉｍｍｌｅｒら（１９９７）．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｖｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＩＣＥ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ＣＰＰ３２−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５，６０１−６０８（非特許文献１４）；Ｈｅｒｍａｎｎら（１９９７）．Ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｈ２Ｏ２ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｏｘｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １９９７ Ｄｅｃ．；１７（１２）３５８８−３５９２（非特許文献１５））。これに従って、内皮細胞は、プログラムされた細胞死を触媒する酵素を阻害する一酸化窒素を放出することによって、それら自身をアポトーシスに対して保護する。しかし、酸素ラジカルは、一酸化窒素を不活性化し、それによって、アポトーシスを誘導する能力を維持させる。従って、内皮細胞は、ＮＯの存在下でさえも死ぬ。死細胞が、新しい細胞によって置換されるが、後者は、低下したＮＯを放出する能力を示す。並行した一酸化窒素の産生の減少は、動脈硬化症の進行を支持する。さらに、一酸化窒素の産生の減少は、血管平滑筋細胞の増殖を支持し、従って、血管をさらに収縮し、そして酸素枯渇という公知の結果を導く。また、この機構は、動脈硬化症の発生に関する、内皮細胞の基本的関連性を指摘する。
【００１６】
従って、内皮細胞におけるアポトーシスの阻害が、動脈硬化症のための効果的な予防および治療についての研究の焦点にある。従って、長年、治療物質の開発のために、内皮細胞のアポトーシスと動脈硬化症との間の関連性に対する洞察（特に、動脈硬化誘導因子についての知見）を使用することが試みられている。にもかかわらず、ＢＡＤ（細胞死を引き起こす、Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ＸＬ−アンタゴニスト）の寄与に関する事実が利用可能であるとしても、これらの試みは、現在まで、依然として不成功である。
【００１７】
ＢＡＤは、Ｂｃｌ−２ファミリーと称される、動脈硬化調節タンパク質のグループに属し、これらには、Ｂａｘのようなアポトーシス誘発（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質ならびにＢｃｌ−２およびＢｃｌ−Ｘのような抗アポトーシスタンパク質が含まれる。ＢＡＤは、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−Ｘと選択的にダイマーを形成し（Ｙａｎｇ Ｅ．ら、（１９９５）ＢＡＤ，ａ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ｐａｒｔｎｅｒ ｆｏｒ Ｂｃｌ−ＸＬ ａｎｄ Ｂｃｌ−２ ｄｉｓｐｌａｃｅｓ Ｂａｘ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｃｅｌｌ １９９５ Ｊａｎ．２７；Ｖｏｌ．８０（２）２８５−２９１（非特許文献１６））、そして結果として、Ｂｃｌ−ＸＬの結合パートナーとしてＢａｘを置換する。従って、Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ＸＬの抗アポトーシス効果は、ブロックされる。これに加えて、放出されたＢａｘは、アポトーシス反応を誘導する（Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ ＳＪ．（１９９９）．ＢＣＬ−２ ｇｅｎｅｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９ Ａｐｒ．１；１：５９（７ 補遺）１６９３−１７００（非特許文献１７））。おそらく、この反応は、アポトーシスが促進される本質的機構と考えられるべきである。
【００１８】
ＢＡＤは、いくつかの別個のリン酸化形態で存在し得る。セリン１１２およびセリン１３６が、リン酸化され得ることが、長年公知であり、これは、インビボにて証明されている。リン酸基の除去が、ＰＰ１（プロテインホスファターゼ１）およびＰＰ２Ｂ（プロテインホスファターゼ２Ｂ型）によって触媒されることもまた公知である（Ａｙｌｌｏｎ Ｖ．ら（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ １ α ｉｓ ａ ｒａｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＢＡＤ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＥＭＢＯ Ｊ．２０００ Ｍａｙ １５；Ｖｏｌ．１９（１０）２２３７−２２４６（非特許文献１８）；Ｗａｎｇ ＨＧら、（１９９９）Ｃａ２＋ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＡＤ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９ Ａｐｒ．９；Ｖｏｌ．２８４（５４１２）３３９−３４３（非特許文献１９））。さらに、ＢＡＤが、セリン１５５でもまたリン酸化され得ることが、近年見出されている。インビトロでのこのセリンのリン酸化は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）によって達成される。この酵素は、ｃＡＭＰによって活性化される。
【００１９】
ＢＡＤが、リン酸化された状態（以後、「ホスホ−ＢＡＤ」と称する）で存在する場合、Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−Ｘへの結合は不可能となり、そしてホスホ−ＢＡＤは解離する。対照的に、ホスホ−ＢＡＤは、いわゆる、１４−３−３タンパク質に結合する。遊離Ｂｃｌ−ＸＬは、その抗アポトーシス効果を示し得、そしてＢａｘと相互作用する（Ｚｈａ Ｊ．ら、（１９９６）Ｓｅｒｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅａｔｈ ａｇｏｎｉｓｔ ＢＡＤ ｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｓｕｌｔｓｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ １４−３−３ ｎｏｔ Ｂｃｌ−ＸＬ，Ｃｅｌｌ １９９６ Ｎｏｖ．１５；Ｖｏｌ．８７（４）６１９−６２８（非特許文献２０））。結果として、ＢＡＤのリン酸化は、抗アポトーシスプロセスを支持する（Ｌｉｚｃａｎｏ Ｊ．Ｍ．、Ｍｏｒｉｃｅ Ｎ．およびＣｏｈｅｎ Ｐ．（２０００）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＡＤ ｂｙ ｃＡＭＰ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｖｉａ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｄｅ，Ｓｅｒ１５５，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２０００ Ｊｕｌ．１５；Ｖｏｌ．；３４９（Ｐｔ２）；５４７−５５７（非特許文献２１）；Ｔａｎ Ｙら（２０００）ＢＡＤ Ｓｅｒ１５５ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＢＡＤ／ＢｃｌＸＬ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００ Ａｕｇ．１８；２７５（３３）：２５８６５−２５８６９（非特許文献２２））。
【００２０】
この機構は、おそらく、ＨＤＬが、プロテインキナーゼＡｋｔを誘導することによってアポトーシスに対して内皮細胞を保護し得ることが示されたように、抗アテローム発生特性を示すＨＤＬの周知の現象に基づく。このプロテインキナーゼはまた、ＨＤＬ粒子から単離されるリゾホスホリピドによって誘導され得る（Ｎｏｆｅｒら（２００１）Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｎ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＨＤＬ） ａｎｄ ＨＤＬ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｓｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２００１ Ｓｅｐ．１４：２７６（３７）：３４４８０−５（非特許文献２３））。
【００２１】
動脈硬化症のための確立された治療は、通常、特に、血中脂質濃度を減少する物質によって、血漿脂質レベルを妨げる。これはまた、内皮細胞におけるアポトーシスの後退（例えば、ＨＤＬを増加することによる）を含むアプローチについて有効である。これらはまた、血中脂質レベルの調節に主に焦点を当てている。
【００２２】
【非特許文献１】
Ｒｏｓｓ，Ｒ．、”Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｃｌｅｒｏｓｉｓ：ａ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ｔｈｅ １９９０ｓ．”Ｎａｔｕｒｅ １９９３ Ａｐｒｉｌ ２９；３６２（６４２３）８０１−８０９
【非特許文献２】
ｄｅ Ｗｉｎｔｅｒ Ｍ．Ｐ．ら、”Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌａｓｓ Ａ：Ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．”Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２０００ Ｆｅｂ；２０（２）：２９０−２９７
【非特許文献３】
Ｋｅｒｒ Ｊ．Ｆ．ら、”Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ａ ｂａｓｉｃ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ｗｉｔｈ ｗｉｄｅ−ｒａｎｇｉｎｇ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ．”Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２６，１９７２ Ａｕｇ；２６（４）：２３９−２５７
【非特許文献４】
Ｓｅａｒｌｅ Ｊ．ら、”Ｎｅｃｒｏｓｉｓ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｗｉｔｈ ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．”Ｐａｔｈｏｌ Ａｎｎｕ １９８２、１７，２２９−２５９
【非特許文献５】
Ａｄａｍｓ ＪＭら、”Ｔｈｅ Ｂｃｌ−２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ：ａｒｂｉｔｅｒｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８ Ａｕｇ．２８；２８１（５３８１）：１３２２−１３２６
【非特許文献６】
Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、”Ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８ Ａｕｇ．２８；２８１（５３８１）：１３０５−１３０８
【非特許文献７】
Ｈａｎら、”Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎ ｒａｔ ｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｅｌ．”Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９５ Ａｕｇ．；１４７（２），２６７−２７７
【非特許文献８】
Ｈｅｇｙｉ，Ｌ．ら、”Ｆｏａｍ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐｉｄ ｃｏｒｅｏｆ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．”Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ １９９６ Ｄｅｃ；１８０（４），４２３−４２９
【非特許文献９】
Ｃｒｉｓｂｙら、”Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｂｏｔｈ ｏｎｃｏｓｉｓ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．”Ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９７ Ａｐｒ．；１３０（１−２），１７−２７
【非特許文献１０】
Ｄｉｍｍｌｅｒら、”Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ ｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ．”Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．１９９７ ８１，９７０−９７６
【非特許文献１１】
Ｄｉｍｍｌｅｒら、”Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｖｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆＩＣＥ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ＣＰＰ３２−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．”Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７ １８５，６０１−６０８
【非特許文献１２】
Ｈｅｒｍａｎｎら、”Ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｈ２Ｏ２ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｏｘ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ．”Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １９９７ Ｄｅｃ．；１７（１２）３５８８−３５９２
【非特許文献１３】
Ｄｉｍｍｌｅｒら、”Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ ｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ．”Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．１９９７ ８１，９７０−９７６
【非特許文献１４】
Ｄｉｍｍｌｅｒら、”Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｖｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆＩＣＥ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ＣＰＰ３２−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．”Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７ １８５，６０１−６０８
【非特許文献１５】
Ｈｅｒｍａｎｎら、”Ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｈ２Ｏ２ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｏｘ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ．”Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １９９７ Ｄｅｃ．；１７（１２）３５８８−３５９２
【非特許文献１６】
Ｙａｎｇ Ｅ．ら、”ＢＡＤ，ａ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ｐａｒｔｎｅｒ ｆｏｒ Ｂｃｌ−ＸＬ ａｎｄ Ｂｃｌ−２ ｄｉｓｐｌａｃｅｓＢａｘ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．”Ｃｅｌｌ １９９５ Ｊａｎ．２７；Ｖｏｌ．８０（２）２８５−２９１
【非特許文献１７】
Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ ＳＪ．、”ＢＣＬ−２ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９ Ａｐｒ．１；１：５９（７ 補遺）１６９３−１７００
【非特許文献１８】
Ａｙｌｌｏｎ Ｖ．ら、”Ｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ １α ｉｓ ａ ｒａｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＢＡＤ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．”ＥＭＢＯ Ｊ．２０００ Ｍａｙ １５；Ｖｏｌ．１９（１０）２２３７−２２４６
【非特許文献１９】
Ｗａｎｇ ＨＧら、”Ｃａ２＋ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＡＤ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９ Ａｐｒ．９；Ｖｏｌ．２８４（５４１２）３３９−３４３
【非特許文献２０】
Ｚｈａ Ｊ．ら、”Ｓｅｒｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅａｔｈ ａｇｏｎｉｓｔ ＢＡＤ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ １４−３−３ ｎｏｔ Ｂｃｌ−ＸＬ，”Ｃｅｌｌ １９９６ Ｎｏｖ．１５；Ｖｏｌ．８７（４）６１９−６２８
【非特許文献２１】
Ｌｉｚｃａｎｏ Ｊ．Ｍ．、”Ｍｏｒｉｃｅ Ｎ．およびＣｏｈｅｎ Ｐ．（２０００）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＡＤ ｂｙ ｃＡＭＰ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｖｉａ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｄｅ，”Ｓｅｒ１５５，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２０００ Ｊｕｌ．１５；Ｖｏｌ．；３４９（Ｐｔ２）；５４７−５５７
【非特許文献２２】
Ｔａｎ Ｙら、”ＢＡＤ Ｓｅｒ１５５ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＢＡＤ／ＢｃｌＸＬ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００ Ａｕｇ．１８；２７５（３３）：２５８６５−２５８６９
【非特許文献２３】
Ｎｏｆｅｒら、”Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｎ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＨＤＬ） ａｎｄ ＨＤＬ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｓｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２００１ Ｓｅｐ．１４：２７６（３７）：３４４８０−５
【００２３】
【発明が解決しようとする課題】
これに基づいて、本発明の目的は、内皮細胞のアポトーシスを促進する動脈硬化症を直接的または間接的に妨げるための、方法ならびに物質または物質群を提供することである。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
１つの局面において、本発明は、動脈硬化症を予防するためまたは動脈硬化症リスクを減少させるための組成物を提供し、この予防または減少は、内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を予防するかまたは減少させることを特徴とする。
【００２５】
１つの局面において、本発明は、動脈硬化症を予防するためまたは動脈硬化症リスクを減少させるための組成物を提供し、この予防または減少は、内皮細胞におけるＢＡＤのリン酸化を増加させることを特徴とする。
【００２６】
１つの実施形態において、上記の組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００２７】
別の実施形態において、上記の組成物は、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００２８】
別の実施形態において、上記の組成物は、上記予防または減少が、ＢＡＤのｓｅｒ１１２、ｓｅｒ１３６および／またはｓｅｒ１５５のリン酸化／脱リン酸化に影響を及ぼすことを特徴とする。
【００２９】
別の実施形態において、上記の組成物は、セリン−スレオニン−ホスファターゼインヒビターを含む。好ましい実施形態において、上記の組成物は、ＰＰ２Ｃインヒビターを含む。
【００３０】
別の実施形態において、上記の組成物は、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターを含む。好ましい実施形態において、上記の組成物は、ＰＰ２Ｃが、ＰＰ２Ｃα、ＰＰ２Ｃβ、ＰＰ２Ｃγ、ＰＰ２Ｃδおよびそれらのサブタイプを含む群より選択される。
【００３１】
別の局面において、本発明は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する物質を同定するための方法を提供し、この方法は、以下：
ａ．ＰＰ２Ｃと、ホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログと、少なくとも１つの試験物質とを共に、インビトロでインキュベートする工程、および
ｂ．ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化について、この試験物質の有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする。
【００３２】
１つの実施形態において、上記の方法は、工程ａ）において、ＰＰ２Ｃを活性化する少なくとも１つの脂肪酸を添加することを特徴とする。
【００３３】
別の局面において、本発明は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害することによって内皮細胞におけるアポトーシスプロセスに影響を及ぼし得る物質を同定するための方法を提供し、この方法は、以下：
ａ．内皮細胞においてアポトーシスを誘導する工程、
ｂ．１種または数種の試験物質を接触させ、この試験物質と共にインキュベートする工程、および
ｃ．ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログの脱リン酸化について、この試験物質の有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする。
【００３４】
１つの実施形態において、上記の方法は、工程ａ）の後に、酵素的に活性な細胞抽出物を、上記誘導された内皮細胞から得ることを特徴とする。好ましい実施形態において、上記の方法は、工程ａ）における誘導のために、少なくとも１つのＰＰ２Ｃ活性化脂肪酸を使用し、この脂肪酸は、好ましくは、少なくとも１５炭素原子長を有し、少なくとも１つの位置で不飽和であり、そして少なくとも１つの遊離カルボキシル基を有し、そして好ましくは、オレイン酸、アラキドン酸および／またはギンコール酸であることを特徴とする。
【００３５】
別の局面において、本発明は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する物質を同定するための方法を提供し、この方法は、以下：
ａ．結合パートナーを同定するための標的としてＰＰ２ＣまたはＰＰ２Ｃフラグメントを用いて、物質のライブラリーをスクリーニングする工程、
ｂ．工程ａ）において単離された物質を、ＰＰ２Ｃと、ホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログと共に、インキュベートする工程、ならびに
ｃ．このホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログの脱リン酸化について、工程ａ）において単離されたこの物質の有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする。
【００３６】
１つの実施形態において、この方法は、上記物質のライブラリーが、化学物質ライブラリー、天然物質ライブラリー、生物学的物質ライブラリーおよびペプチドライブラリーからなる群より選択されることを特徴とする。
【００３７】
別の局面において、本発明は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する物質を同定するための方法を提供し、この方法は、以下：
ａ．ホスホ−ＢＡＤと相互作用する結合パートナーを同定するための標的としてホスホ−ＢＡＤまたはリン酸化されたＢＡＤペプチドフラグメントを用いて、物質のライブラリーをスクリーニングする工程、
ｂ．工程ａ）において単離された物質と、ＰＰ２Ｃと、ホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログとを共に、インキュベートする工程、ならびに
ｃ．ＰＰ２Ｃによるこのホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログの脱リン酸化について、有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする。
【００３８】
別の局面において、本発明は、動脈硬化症を処置するための治療剤を生成するための方法を提供し、この方法は、以下：
ａ．請求項９、１１、１４および１６のうちの少なくとも１項に記載の方法によって、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害することによって内皮細胞におけるアポトーシスプロセスを調節する物質を同定する工程、ならびに
ｂ．この物質を少なくとも１つの生理学的に受容可能なキャリア物質と混合して、治療剤を形成する工程、
を包含することを特徴とする。
【００３９】
１つの実施形態において、上記のいずれかの方法は、ＰＰ２Ｃが、ＰＰ２Ｃα、ＰＰ２Ｃβ、ＰＰ２Ｃγ、ＰＰ２Ｃδおよびそれらのサブタイプを含む群より選択されることを特徴とする。好ましい実施形態において、上記のいずれかの方法は、ホスホ−ＢＡＤの代謝回転を検出するために、ホスホ−ＢＡＤに対する抗体および／またはＢＡＤに対する抗体を使用することを特徴とする。より好ましい実施形態において、上記のいずれかの方法は、ｓｅｒ１５５、ｓｅｒ１１２および／またはｓｅｒ１３６の位置でリン酸化されている、ホスホ−ＢＡＤまたはホスホ−ＢＡＤペプチドフラグメントを使用することを特徴とする。さらにより好ましい実施形態において、上記の方法は、ＢＡＤのｓｅｒ１１２、ｓｅｒ１３６および／またはｓｅｒ１５５を取り囲むアミノ酸領域に由来するペプチドフラグメントを使用することを特徴とする。なおさらにより好ましい実施形態において、上記の方法は、上記ペプチドフラグメントが、少なくとも８アミノ酸長を有することを特徴とする。
【００４０】
別の局面において、本発明は、上記のいずれかの方法によって生成される物質を含む、動脈硬化症を処置するための治療組成物を提供し、この物質は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を妨げる。
【００４１】
別の局面において、本発明は、ＰＰ２Ｃのインヒビターであることを特徴とする、内皮細胞においてアポトーシスを阻害するための物質を提供する。
【００４２】
１つの実施形態において、上記の物質は、脂肪酸によって活性化可能であるＰＰ２Ｃのインヒビターであることを特徴とする。好ましい実施形態において、上記の物質は、ＰＰ２Ｃの脂肪酸活性化の選択的インヒビターであることを特徴とする。より好ましい実施形態において、上記のいずれかの物質は、ＰＰ２Ｃへの脂肪酸の結合を競合的に阻害することを特徴とする。さらに好ましい実施形態において、上記のいずれかの物質は、脂肪酸、改変された脂肪酸、脂肪酸誘導体、ジホスホネート脂肪酸誘導体または脂肪酸アナログであることを特徴とする。なおさらに好ましい実施形態において、上記の物質は、以下の一般式
【００４３】
【化２】
ここで、
Ｒ１は、１〜１２個の炭素原子を有する直鎖アルキル残基または分枝鎖アルキル残基であり、このアルキル残基は、アミノ基、Ｎ−モノアルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基および／またはＳＨ基のような置換基で置換され得、このアルキル残基は、１〜１２個のＣ原子を含み得るか、あるいは
Ｒ１は、置換または非置換の炭素環式アリール残基または複素環式アリール残基であり、このアリール残基は、１または数個のヘテロ原子を有し得、かつ置換基として、１〜１２個のＣ原子を有する分枝鎖アルキル残基または１〜１２個のＣ原子を有する直鎖アルキル残基、遊離アミノ基、モノアルキルアミノ基、もしくはジアルキルアミノ基、またはハロゲン原子を含み得、このアルキルアミノ基のアルキルは、それぞれ、１〜６個のＣ原子を有し、そして
Ｒ２は、ＯＨ、ハロゲン原子（好ましくは、Ｃｌ）、ＨまたはＮＨ２である、物質。なおよりさらに好ましい実施形態において、上記の物質は、イバンドロン酸、エチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、チルドロン酸、ゾレドロン酸、シマドロン酸、ネリドロン酸、オルパドロン酸、３−ピロール−１−ヒドロキシプロパン−１−１−ジホスホン酸および／またはミノドロン酸、ジホスホネート−１，１−ジカルボン酸（ＤＰＤ）および／または１−メチル−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸（ＭＤＰ）を含む群より選択されることを特徴とする。なおよりさらに好ましい実施形態において、上記のいずれかの物質は、脂肪酸によって活性化可能であるＰＰ２Ｃの、ネガティブレギュレーターであることを特徴とする。なおよりさらに好ましい実施形態において、上記のいずれかの物質は、ＰＰ２Ｃの活性中心に結合し、そして／または、ＰＰ２Ｃへのホスホ−ＢＡＤの結合を競合的に妨げることを特徴とする。なおよりさらに好ましい実施形態において、上記の物質は、ホスホ−ＢＡＤの三次元構造に本質的に対応する三次元構造を有すること、および転換可能でないかまたはゆっくりでしか転換可能ではない基質アナログであることを特徴とする。
【００４４】
別の局面において、本発明は、内皮細胞におけるアポトーシスを阻害するための物質を提供し、この物質は、ホスホ−ＢＡＤに結合し、そしてホスフェート残基（特に、Ｐ−Ｓｅｒ１５５）をＰＰ２Ｃに接近不可能にすることを特徴とする。
【００４５】
１つの実施形態において、上記の物質は、ポリペプチドであることを特徴とする。好ましい実施形態において、上記の物質は、相互作用領域（好ましくは、結合ポケット）によってホスホ−ＢＡＤに結合することを特徴とする。より好ましい実施形態において、上記の物質は、上記結合ポケットの三次元構造が、ホスホ−ＢＡＤに対する抗体の抗原結合部位に本質的に対応することを特徴とする。なおより好ましい実施形態において、上記の物質は、抗ホスホ−ＢＡＤ抗体の改変された抗原結合部位に対応する結合ポケットを含むことを特徴とする。なおよりさらに好ましい実施形態において、上記のいずれかの物質は、上記結合ポケットの三次元構造が、ホスホ−ＢＡＤ Ｓｅｒ１１２、ホスホ−ＢＡＤ Ｓｅｒ１３６および／またはホスホ−ＢＡＤ Ｓｅｒ１１５に対する抗体の抗原結合部位に本質的に対応することを特徴とする。
【００４６】
別の局面において、本発明は、内皮細胞におけるアポトーシスを阻害するための物質であって、ＰＰ２Ｃに結合するポリペプチドであることを特徴とする、物質を提供する。
【００４７】
１つの実施形態において、上記の物質は、抗体または抗体フラグメントであることを特徴とする。
【００４８】
別の局面において、本発明は、ＰＰ２ＣのｍＲＮＡと複合体形成することを特徴とする、生体分子を提供する。
【００４９】
１つの実施形態において、上記の生体分子は、少なくとも部分的に一本鎖であるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。好ましい実施形態において、上記のオリゴヌクレオチドは、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡの反対の鎖に完全にかまたは部分的に対応する核酸配列であることを特徴とし、その結果、この分子が、このＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによって、二本鎖領域を有する少なくとも部分を形成する。
【００５０】
別の局面において、本発明は、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡと複合体形成させるためのアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての、上記のオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【００５１】
別の局面において、本発明は、内皮細胞においてアポトーシスを予防するための組成物を提供し、この組成物は、上記のいずれかの物質または生体分子（特に、上記の少なくとも部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチド）を含む。
【００５２】
別の局面において、本発明は、細胞において発現可能な核酸構築物を提供し、この核酸構築物は、その発現産物が、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡと複合体形成する生体分子であることを特徴とする。
【００５３】
１つの実施形態において、上記の核酸構築物は、上記発現産物が、一本鎖オリゴヌクレオチドであることを特徴とする。好ましい実施形態において、上記の核酸構築物は、上記発現産物が、図１に示される配列のうちの１つの核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。より好ましい実施形態において、上記のいずれかの核酸構築物は、真核生物において発現可能な発現ベクターであることを特徴とする。なおより好ましい実施形態において、上記のいずれかの核酸構築物は、ＰＰ２Ｃのコード配列が、真核生物で発現可能な発現ベクターのプロモーターの後ろに、逆方向に少なくとも部分的にクローニングされていることを特徴とする。
【００５４】
別の局面において、本発明は、動脈硬化症を処置するために内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための組成物を提供し、この組成物は、上記のいずれかの核酸構築物を含む。
【００５５】
別の局面において、本発明は、動脈硬化症および／または動脈硬化症に関連する疾患を処置するための組成物を提供し、この組成物は、上記の少なくとも１つの物質、生体分子または核酸構築物を含む。
【００５６】
別の局面において、本発明は、動脈硬化症を処置するための薬理学的に活性な組成物を提供し、この組成物は、上記のいずれかの少なくとも１つの物質、生体分子または核酸構築物を含む。
【００５７】
１つの実施形態において、上記の組成物は、少なくとも１つの脂質減少剤および／またはＨＤＬ濃度を増加する薬剤を含むことを特徴とする。
【００５８】
別の局面において、本発明は、アポトーシスの予防のために内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの量を増加するための組成物を提供し、この組成物は、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターを含む。
【００５９】
別の局面において、本発明は、動脈硬化症の予防または動脈硬化症リスクの減少のための医薬の製造のための、内皮細胞においてホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化の予防または減少を生じる物質の使用を提供する。
【００６０】
別の局面において、本発明は、動脈硬化症の予防または動脈硬化症リスクの減少のための医薬の製造のための、内皮細胞においてＢＡＤのリン酸化の増加を生じる物質の使用を提供する。好ましい実施形態において、上記の使用は、上記物質が、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターである。別の好ましい実施形態において、上記のいずれかの使用は、上記物質が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の好ましい実施形態において、上記のいずれかの使用は、上記物質が、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の好ましい実施形態において、上記のいずれかの使用は、上記予防または減少が、ＢＡＤのｓｅｒ１１２、ｓｅｒ１３６および／またはｓｅｒ１５５のリン酸化／脱リン酸化に影響を及ぼすことを特徴とする。別の好ましい実施形態において、上記のいずれかの使用は、上記物質が、セリン−スレオニン−ホスファターゼインヒビターである。より好ましい実施形態において、上記の使用は、上記インヒビターが、ＰＰ２Ｃインヒビターである。なおより好ましい実施形態において、上記の使用は、ＰＰ２Ｃが、ＰＰ２Ｃα、ＰＰ２Ｃβ、ＰＰ２Ｃγ、ＰＰ２Ｃδおよびそれらのサブタイプを含む群より選択される。
【００６１】
別の局面において、本発明は、動脈硬化症の処置のための治療剤を製造するための、上記の１以上の方法によって生成される物質の使用を提供し、この物質は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を妨げる。
【００６２】
別の局面において、本発明は、内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための医薬の製造のための、上記のいずれかの物質または生体分子（特に、上記の少なくとも部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチド）の使用を提供する。
【００６３】
別の局面において、本発明は、内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための医薬の製造のための、上記の核酸構築物の使用を提供する。
【００６４】
別の局面において、本発明は、動脈硬化症および／または動脈硬化症に関連する疾患の処置のための医薬の製造のための、上記の少なくとも１つの物質、生体分子または核酸構築物の使用を提供する。
【００６５】
別の局面において、本発明は、内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの量を増加することによってアポトーシスを予防するための医薬の製造のための、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターの使用を提供する。
【００６６】
項１ 動脈硬化症を予防するためまたは動脈硬化症リスクを減少させるための組成物であって、この予防または減少は、内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を予防するかまたは減少させることを特徴とする、組成物。
【００６７】
項２ 動脈硬化症を予防するためまたは動脈硬化症リスクを減少させるための組成物であって、この予防または減少は、内皮細胞におけるＢＡＤのリン酸化を増加させることを特徴とする、組成物。
【００６８】
項３ アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、項１〜２のいずれか１項に記載の組成物。
【００６９】
項４ ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【００７０】
項５ 項１〜２のいずれか１項に記載の組成物であって、上記予防または減少が、ＢＡＤのｓｅｒ１１２、ｓｅｒ１３６および／またはｓｅｒ１５５のリン酸化／脱リン酸化に影響を及ぼすことを特徴とする、組成物。
【００７１】
項６ セリン−スレオニン−ホスファターゼインヒビターを含む、項１、２または５のいずれか１項に記載の組成物。
【００７２】
項７ ＰＰ２Ｃインヒビターを含む、項６に記載の組成物。
【００７３】
項８ β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターを含む、項２に記載の組成物。
【００７４】
項９ ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する物質を同定するための方法であって、以下：
ａ．ＰＰ２Ｃと、ホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログと、少なくとも１つの試験物質とを共に、インビトロでインキュベートする工程、および
ｂ．ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化について、この試験物質の有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする、方法。
【００７５】
項１０ 工程ａ）において、ＰＰ２Ｃを活性化する少なくとも１つの脂肪酸を添加することを特徴とする、項９に記載の方法。
【００７６】
項１１ ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害することによって内皮細胞におけるアポトーシスプロセスに影響を及ぼし得る物質を同定するための方法であって、以下：
ａ．内皮細胞においてアポトーシスを誘導する工程、
ｂ．１種または数種の試験物質を接触させ、この試験物質と共にインキュベートする工程、および
ｃ．ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログの脱リン酸化について、この試験物質の有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする、方法。
【００７７】
項１２ 工程ａ）の後に、酵素的に活性な細胞抽出物を、上記誘導された内皮細胞から得ることを特徴とする、項１１に記載の方法。
【００７８】
項１３ 項１１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、工程ａ）における誘導のために、少なくとも１つのＰＰ２Ｃ活性化脂肪酸を使用し、この脂肪酸は、好ましくは、少なくとも１５炭素原子長を有し、少なくとも１つの位置で不飽和であり、そして少なくとも１つの遊離カルボキシル基を有し、そして好ましくは、オレイン酸、アラキドン酸および／またはギンコール酸であることを特徴とする、方法。
【００７９】
項１４ ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する物質を同定するための方法であって、以下：
ａ．結合パートナーを同定するための標的としてＰＰ２ＣまたはＰＰ２Ｃフラグメントを用いて、物質のライブラリーをスクリーニングする工程、
ｂ．工程ａ）において単離された物質を、ＰＰ２Ｃと、ホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログと共に、インキュベートする工程、ならびに
ｃ．このホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログの脱リン酸化について、工程ａ）において単離されたこの物質の有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする、方法。
【００８０】
項１５ 項１４に記載の方法であって、上記物質のライブラリーが、化学物質ライブラリー、天然物質ライブラリー、生物学的物質ライブラリーおよびペプチドライブラリーからなる群より選択されることを特徴とする、方法。
【００８１】
項１６ ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する物質を同定するための方法であって、以下：
ａ．ホスホ−ＢＡＤと相互作用する結合パートナーを同定するための標的としてホスホ−ＢＡＤまたはリン酸化されたＢＡＤペプチドフラグメントを用いて、物質のライブラリーをスクリーニングする工程、
ｂ．工程ａ）において単離された物質と、ＰＰ２Ｃと、ホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログとを共に、インキュベートする工程、ならびに
ｃ．ＰＰ２Ｃによるこのホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログの脱リン酸化について、有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする、方法。
【００８２】
項１７ 動脈硬化症を処置するための治療剤を生成するための方法であって、以下：
ａ．項９、１１、１４および１６のうちの少なくとも１項に記載の方法によって、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害することによって内皮細胞におけるアポトーシスプロセスを調節する物質を同定する工程、ならびに
ｂ．この物質を少なくとも１つの生理学的に受容可能なキャリア物質と混合して、治療剤を形成する工程、
を包含することを特徴とする、方法。
【００８３】
項１８ 項９〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、ＰＰ２Ｃが、ＰＰ２Ｃα、ＰＰ２Ｃβ、ＰＰ２Ｃγ、ＰＰ２Ｃδおよびそれらのサブタイプを含む群より選択されることを特徴とする、方法。
【００８４】
項１９ 項９〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、ホスホ−ＢＡＤの代謝回転を検出するために、ホスホ−ＢＡＤに対する抗体および／またはＢＡＤに対する抗体を使用することを特徴とする、方法。
【００８５】
項２０ 項９〜１９のいずれか１項に記載の方法であって、ｓｅｒ１５５、ｓｅｒ１１２および／またはｓｅｒ１３６の位置でリン酸化されている、ホスホ−ＢＡＤまたはホスホ−ＢＡＤペプチドフラグメントを使用することを特徴とする、方法。
【００８６】
項２１ 項２０に記載の方法であって、ＢＡＤのｓｅｒ１１２、ｓｅｒ１３６および／またはｓｅｒ１５５を取り囲むアミノ酸領域に由来するペプチドフラグメントを使用することを特徴とする、方法。
【００８７】
項２２ 項２１に記載の方法であって、上記ペプチドフラグメントが、少なくとも８アミノ酸長を有することを特徴とする、方法。
【００８８】
項２３ 項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法によって生成される物質を含む、動脈硬化症を処置するための治療組成物であって、この物質は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を妨げる、治療組成物。
【００８９】
項２４ ＰＰ２Ｃのインヒビターであることを特徴とする、内皮細胞においてアポトーシスを阻害するための物質。
【００９０】
項２５ 項２４に記載の物質であって、脂肪酸によって活性化可能であるＰＰ２Ｃのインヒビターであることを特徴とする、物質。
【００９１】
項２６ 項２４または２５に記載の物質であって、ＰＰ２Ｃの脂肪酸活性化の選択的インヒビターであることを特徴とする、物質。
【００９２】
項２７ 項２４〜２６のいずれか１項に記載の物質であって、ＰＰ２Ｃへの脂肪酸の結合を競合的に阻害することを特徴とする、物質。
【００９３】
項２８ 項２４〜２７のいずれか１項に記載の物質であって、脂肪酸、改変された脂肪酸、脂肪酸誘導体、ジホスホネート脂肪酸誘導体または脂肪酸アナログであることを特徴とする、物質。
【００９４】
項２９ 項２８に記載の物質であって、以下の一般式
【００９５】
【化３】
ここで、
Ｒ１は、１〜１２個の炭素原子を有する直鎖アルキル残基または分枝鎖アルキル残基であり、このアルキル残基は、アミノ基、Ｎ−モノアルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基および／またはＳＨ基のような置換基で置換され得、このアルキル残基は、１〜１２個のＣ原子を含み得るか、あるいは
Ｒ１は、置換または非置換の炭素環式アリール残基または複素環式アリール残基であり、このアリール残基は、１または数個のヘテロ原子を有し得、かつ置換基として、１〜１２個のＣ原子を有する分枝鎖アルキル残基または１〜１２個のＣ原子を有する直鎖アルキル残基、遊離アミノ基、モノアルキルアミノ基、もしくはジアルキルアミノ基、またはハロゲン原子を含み得、このアルキルアミノ基のアルキルは、それぞれ、１〜６個のＣ原子を有し、そして
Ｒ２は、ＯＨ、ハロゲン原子（好ましくは、Ｃｌ）、ＨまたはＮＨ２である、物質。
【００９６】
項３０ 項２９に記載の物質であって、イバンドロン酸、エチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、チルドロン酸、ゾレドロン酸、シマドロン酸、ネリドロン酸、オルパドロン酸、３−ピロール−１−ヒドロキシプロパン−１−１−ジホスホン酸および／またはミノドロン酸、ジホスホネート−１，１−ジカルボン酸（ＤＰＤ）および／または１−メチル−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸（ＭＤＰ）を含む群より選択されることを特徴とする、物質。
【００９７】
項３１ 項２４〜３０のいずれか１項に記載の物質であって、脂肪酸によって活性化可能であるＰＰ２Ｃの、ネガティブレギュレーターであることを特徴とする、物質。
【００９８】
項３２ 項２４〜３１のいずれか１項に記載の物質であって、ＰＰ２Ｃの活性中心に結合し、そして／または、ＰＰ２Ｃへのホスホ−ＢＡＤの結合を競合的に妨げることを特徴とする、物質。
【００９９】
項３３ 項３２に記載の物質であって、ホスホ−ＢＡＤの三次元構造に本質的に対応する三次元構造を有すること、および転換可能でないかまたはゆっくりでしか転換可能ではない基質アナログであることを特徴とする、物質。
【０１００】
項３４ 内皮細胞におけるアポトーシスを阻害するための物質であって、ホスホ−ＢＡＤに結合し、そしてホスフェート残基（特に、Ｐ−Ｓｅｒ１５５）をＰＰ２Ｃに接近不可能にすることを特徴とする、物質。
【０１０１】
項３５ ポリペプチドであることを特徴とする、項３４に記載の物質。
【０１０２】
項３６ 相互作用領域（好ましくは、結合ポケット）によってホスホ−ＢＡＤに結合することを特徴とする、項３４または３５に記載の物質。
【０１０３】
項３７ 上記結合ポケットの三次元構造が、ホスホ−ＢＡＤに対する抗体の抗原結合部位に本質的に対応することを特徴とする、項３６に記載の物質。
【０１０４】
項３８ 抗ホスホ−ＢＡＤ抗体の改変された抗原結合部位に対応する結合ポケットを含むことを特徴とする、項３６または３７に記載の物質。
【０１０５】
項３９ 項３６〜３８のいずれか１項に記載の物質であって、上記結合ポケットの三次元構造が、ホスホ−ＢＡＤ Ｓｅｒ１１２、ホスホ−ＢＡＤ Ｓｅｒ１３６および／またはホスホ−ＢＡＤ Ｓｅｒ１１５に対する抗体の抗原結合部位に本質的に対応することを特徴とする、物質。
【０１０６】
項４０ 内皮細胞におけるアポトーシスを阻害するための物質であって、ＰＰ２Ｃに結合するポリペプチドであることを特徴とする、物質。
【０１０７】
項４１ 抗体または抗体フラグメントであることを特徴とする、項４０に記載の物質。
【０１０８】
項４２ ＰＰ２ＣのｍＲＮＡと複合体形成することを特徴とする、生体分子。
【０１０９】
項４３ 少なくとも部分的に一本鎖であるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、項４２に記載の生体分子。
【０１１０】
項４４ 項４３に記載のオリゴヌクレオチドであって、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡの反対の鎖に完全にかまたは部分的に対応する核酸配列であることを特徴とし、その結果、この分子が、このＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによって、二本鎖領域を有する少なくとも部分を形成する、オリゴヌクレオチド。
【０１１１】
項４５ ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡと複合体形成させるためのアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての、項４３または４４に記載のオリゴヌクレオチドの使用
項４６ 内皮細胞においてアポトーシスを予防するための組成物であって、項２４〜４４のいずれか１項に記載の物質または生体分子（特に、項４４に記載の少なくとも部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチド）を含む、組成物。
【０１１２】
項４７ 細胞において発現可能な核酸構築物であって、その発現産物は、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡと複合体形成する生体分子であることを特徴とする、核酸構築物。
【０１１３】
項４８ 上記発現産物が、一本鎖オリゴヌクレオチドであることを特徴とする、項４７に記載の核酸構築物。
【０１１４】
項４９ 上記発現産物が、図１に示される配列のうちの１つの核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、項４７または４８に記載の核酸構築物。
【０１１５】
項５０ 項４７〜４９のいずれか１項に記載の核酸構築物であって、真核生物において発現可能な発現ベクターであることを特徴とする、核酸構築物。
【０１１６】
項５１ ＰＰ２Ｃのコード配列が、真核生物で発現可能な発現ベクターのプロモーターの後ろに、逆方向に少なくとも部分的にクローニングされていることを特徴とする、項４７〜５０のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【０１１７】
項５２ 動脈硬化症を処置するために内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための組成物であって、項４７〜５１のいずれか１項に記載の核酸構築物を含む、組成物。
【０１１８】
項５３ 動脈硬化症および／または動脈硬化症に関連する疾患を処置するための組成物であって、項２４〜４４および４７〜５１の少なくとも１項に記載の、少なくとも１つの物質、生体分子または核酸構築物を含む、組成物。
【０１１９】
項５４ 動脈硬化症を処置するための薬理学的に活性な組成物であって、項２４〜４４および４７〜５１の少なくとも１項に記載の、少なくとも１つの物質、生体分子または核酸構築物を含む、組成物。
【０１２０】
項５５ 少なくとも１つの脂質減少剤および／またはＨＤＬ濃度を増加する薬剤を含むことを特徴とする、項５４に記載の組成物。
【０１２１】
項５６ アポトーシスの予防のために内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの量を増加するための組成物であって、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターを含む、組成物。
【０１２２】
項５７ ＰＰ２Ｃが、ＰＰ２Ｃα、ＰＰ２Ｃβ、ＰＰ２Ｃγ、ＰＰ２Ｃδおよびそれらのサブタイプを含む群より選択される、項７に記載の組成物。
【０１２３】
項５８ 動脈硬化症の予防または動脈硬化症リスクの減少のための医薬の製造のための、内皮細胞においてホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化の予防または減少を生じる物質の使用。
【０１２４】
項５９ 動脈硬化症の予防または動脈硬化症リスクの減少のための医薬の製造のための、内皮細胞においてＢＡＤのリン酸化の増加を生じる物質の使用。
【０１２５】
項６０ 上記物質が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、項５８〜５９のいずれか１項に記載の使用。
【０１２６】
項６１ 上記物質が、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項５８〜６０のいずれか１項に記載の使用。
【０１２７】
項６２ 上記予防または減少が、ＢＡＤのｓｅｒ１１２、ｓｅｒ１３６および／またはｓｅｒ１５５のリン酸化／脱リン酸化に影響を及ぼすことを特徴とする、項５８〜５９のいずれか１項に記載の使用。
【０１２８】
項６３ 上記物質が、セリン−スレオニン−ホスファターゼインヒビターである、項５８、５９または６２のいずれか１項に記載の使用。
【０１２９】
項６４ 上記インヒビターが、ＰＰ２Ｃインヒビターである、項６３に記載の使用。
【０１３０】
項６５ 上記物質が、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターである、項５９に記載の使用。
【０１３１】
項６６ ＰＰ２Ｃが、ＰＰ２Ｃα、ＰＰ２Ｃβ、ＰＰ２Ｃγ、ＰＰ２Ｃδおよびそれらのサブタイプを含む群より選択される、項６４に記載の使用。
【０１３２】
項６７ 動脈硬化症の処置のための治療剤を製造するための、項１７〜２２の１以上の方法によって生成される物質の使用であって、この物質は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を妨げる、使用。
【０１３３】
項６８ 内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための医薬の製造のための、項２４〜４４のいずれか１項に記載の物質または生体分子（特に、項４４に記載の少なくとも部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチド）の使用。
【０１３４】
項６９ 内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための医薬の製造のための、項４７〜５１に記載の核酸構築物の使用。
【０１３５】
項７０ 動脈硬化症および／または動脈硬化症に関連する疾患の処置のための医薬の製造のための、項２４〜４４および４７〜５１の少なくとも１項に記載の、少なくとも１つの物質、生体分子または核酸構築物の使用。
【０１３６】
項７１ 内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの量を増加することによってアポトーシスを予防するための医薬の製造のための、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターの使用。
【０１３７】
１つの局面において、項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法によって生成される物質の、動脈硬化症を処置するための治療剤としての使用が提供され、この物質は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を妨げる。
【０１３８】
１つの局面において、内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための方法が提供され、この方法は、項２４〜４４のいずれか１項に記載の物質または生体物質、特に、項４４に記載の少なくとも部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチドが、内皮細胞中に導入されることを特徴とする。
【０１３９】
１つの局面において、動脈硬化症を処置するために内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための方法が提供され、この方法は、項４７〜５１のいずれか１項に記載の核酸構築物で内皮細胞をトランスフェクトすることを特徴とする。
【０１４０】
１つの局面において、動脈硬化症および／または動脈硬化症に関連する疾患の処置のために、項２４〜４４および４７〜５１のうちの少なくとも１つに記載の少なくとも１つの物質、生体分子、または核酸構築物の使用が、提供される。
【０１４１】
１つの局面において、アポトーシスの予防のために内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの量を増加するための、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターの使用が、提供される。
【０１４２】
１つの局面において、動脈硬化症を予防するためまたは動脈硬化症リスクを減少させるための方法が提供され、この方法は、内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を予防するかまたは減少させることを特徴とする。
【０１４３】
１つの局面において、動脈硬化症を予防するためまたは動脈硬化症リスクを減少させるための方法が提供され、この方法は、内皮細胞におけるＢＡＤのリン酸化を増加させることを特徴とする。
【０１４４】
１つの実施形態において、上記の方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を特徴とする。
【０１４５】
好ましい実施形態において、上記の方法は、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を特徴とする。
【０１４６】
別の実施形態において、上記の方法は、ＢＡＤのｓｅｒ１１２、ｓｅｒ１３６および／またはｓｅｒ１５５のリン酸化／脱リン酸化に影響を及ぼすことを特徴とする。
【０１４７】
別の実施形態において、上記の方法は、セリン−スレオニン−ホスファターゼインヒビターの使用を特徴とする。
【０１４８】
好ましい実施形態において、上記の方法は、ＰＰ２Ｃインヒビターの使用を特徴とする。
【０１４９】
別の実施形態において、上記の方法は、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターの使用を特徴とする。
【０１５０】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＢＡＤのリン酸化状態を意図的にもたらすことによる、動脈硬化症の予防または動脈硬化症リスクの減少のための方法に関する。
【０１５１】
本発明は、主にその抗アポトーシス性のホスホ形態においてＢＡＤを安定化させることによってか、またはＢＡＤをその形態に変換することによる、標的化された意図的な様式での動脈硬化促進アポトーシスの調節のために、これらの抗アポトーシス効果を利用および支持する概念に基づく。これは、基本的には、ホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を直接的または間接的にブロックすることによって、そしてリン酸化を直接的または間接的に刺激および誘導することによって、達成され得る。
【０１５２】
本発明の第１の実施形態に従って、脱リン酸化の後退または減少は、好ましくは、セリン−スレオニン−ホスファターゼ（特に、２Ｃ型プロテインホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ））を阻害する治療物質を投与することによって、達成される。
【０１５３】
先に記載の特徴に従う治療物質とは、これらのプロテアーゼの発現またはそれらの生物学的活性の低下または減少を直接的または間接的に導き得る、全ての生物学的または薬学的に活性な物質をいう。従って、この定義はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチド治療剤を包含する。
【０１５４】
２Ｃ型プロテインホスファターゼ（ＰＰ２Ｃ）は、Ｍｎ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンに依存する脱リン酸化活性を有する、真核生物セリン−スレオニン−ホスファターゼ（ＰＰ１、ＰＰ２Ａ、ＰＰ２Ｂ、ＰＰ２Ｃ）に属する（ＭｃＧｏｗａｎ，ＣＨ．およびＣｏｈｅｎ Ｐ．（１９８８）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−２Ｃ ｆｒｏｍ ｒａｂｂｉｔ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ：ａｎ Ｍｇ２＋ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８８；Ｖｏｌ．１５９，４１６−４２６）。ＰＰ２Ｃは、アポトーシスの調節に関与する。この酵素の過剰発現は、致死的である（Ｗｅｎｋ Ｊ．およびＭｉｅｓｋｅｓ Ｇ．（１９９５）Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２Ｃ ｂｅｔａ １ ｉｎ ＣＯＳ ａｎｄＢＨＫ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９５ Ｄｅｃ；６８（４），３７７−３８６；Ｃｈｅｎｇ Ａら（１９９９）Ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅｓ ｂｙ ｔｙｐｅ ２Ｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９９９ Ｎｏｖ．１５；１３（２２），２９４６−２９５７）。ＰＰ２Ｃがアポトーシス調節を妨害する正確な機構について確認された情報は、依然存在しない。
【０１５５】
ＰＰ２Ｃは、現在までにいくつかの組織（例えば、神経組織）中で検出されている。対照的に、ＰＰ２Ｃは、現在までに内皮細胞中で検出されていない。結論として、これらの細胞におけるホスホ−ＢＡＤおよびＰＰ２Ｃによって制御されるアポトーシスの調節は、未知であった。この理由のために、ＢＡＤまたはホスホ−ＢＡＤの濃度調節から始まる動脈硬化症を処置または予防するための治療手段は、現在まで存在していなかった。
【０１５６】
ここでは、内皮細胞中でＢＡＤに加えてＰＰ２Ｃを検出すること、およびホスホ−ＢＡＤがＰＰ２Ｃの基質であることを示すことにも成功した。従って、特にＰＰ２Ｃ（セリン−スレオニン−ホスファターゼとしての）を阻害する治療剤を投与すること、そしてそれによってホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を意図的に抑制することが、望ましい。これによって、動脈硬化症の処置および予防のための有効な治療手段が提供される。
【０１５７】
不飽和脂肪酸によって刺激されるというＰＰ２Ｃの性質が知られている（Ｋｌｕｍｐｐ，Ｓ．，Ｓｅｌｋｅ，Ｄ．，Ｈｅｒｍｅｓ Ｍａｙｅｒ Ｊ．（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２Ｃ ａｃｔｉｖｅ ａｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｇ２＋：ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ．ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ １９９８ Ｏｃｔ．２３；４３７（３）２２９−２３２）。このことは、脂肪酸が内皮細胞中に高濃度で存在し、それによりＰＰ２Ｃを刺激することによって内皮細胞中でアポトーシスを誘導し得、その結果、動脈硬化症の危険性を増大させるという理由に関連する。脂肪酸は、ＰＰ２Ｃ活性を刺激することによって内皮細胞のアポトーシスを誘導し得るので、動脈硬化症の治療および予防をまた、脂肪酸により活性化される内皮ホスファターゼＰＰ２Ｃによってホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害することに基づかせることが、本発明の特に有益な点である。このことは、本発明に従って、脂肪酸活性化の標的化された抑制によって達成され得る。
【０１５８】
本発明のさらなる実施形態に従って、ホスホ−ＢＡＤ比の増大はまた、ＢＡＤリン酸化タンパク質キナーゼの発現増大、誘導、活性化、または刺激を引き起こす物質によって達成され得る。好ましいこの種のキナーゼは、例えば、タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢまたはＡｋｔ）、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ活性化タンパク質キナーゼ−１（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１またはＲＳＫ）およびタンパク質キナーゼＡである。これらのキナーゼは、ＢＡＤのＳｅｒ−１１２、Ｓｅｒ−１３６、またはＳｅｒ−１５５をリン酸化する。本発明に従うＢＡＤリン酸化の刺激は、例えば、調節的な様式にてシグナル伝達プロセスまたは発現プロセスを妨害し、それによってキナーゼ活性の増大を引き起こす物質によってか、またはＢＡＤリン酸化キナーゼの直接的なアクチベーターによって、達成され得る。
【０１５９】
従って、本発明は、動脈硬化症の治療処置および予防のための有効な手段を提供する。なぜなら、リン酸化状態に影響を与えることによる本発明に従って、活性なプロアポトーシスＢＡＤの存在量を制御することは、特に、動脈硬化症発生の最初の事象（すなわち、内皮細胞のアポトーシス）を中和するからである。
【０１６０】
本発明の好ましい実施形態において、高レベルのホスホ−ＢＡＤおよびその結果としての低レベルのＢＡＤは、ホスファターゼ（特にＰＰ２Ｃ）による脱リン酸化を妨害または少なくとも低減することによって維持される。これは、いくつかの方法、例えば、以下：
ａ）ホスファターゼインヒビター
ｂ）ホスホ−ＢＡＤに結合し、ホスホ−ＢＡＤを安定化し、そして／または必要である場合、ホスホ−ＢＡＤをホスファターゼに接近不可能にする、物質
ｃ）内皮細胞において選択されたホスファターゼ（特に、ＰＰ２Ｃ）の発現を抑制するアンチセンス−オリゴヌクレオチド
の適用によって、達成され得る。
【０１６１】
アンチセンス−オリゴヌクレオチドによって、そして特にそのアンチセンス−オリゴヌクレオチドを使用してＰＰ２ＣのｍＲＮＡと複合体化させることによって、本発明に従うホスホ−ＢＡＤ脱リン酸化の阻害を達成することは、特に有益であることが示された。このオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドヌおよび天然起源のオリゴヌクレオチドであり得る。これらは、例えば、酵母から単離され得る。
【０１６２】
本発明は、脱リン酸化を阻害するために使用され得る、本発明に従う、適切なホスファターゼのインヒビターまたはホスホ−ＢＡＤの結合パートナーを同定し得る方法を提供する。
【０１６３】
１つの実施形態に従って、ＰＰ２Ｃを阻害し、結果としてホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する活性な物質が、同定され得、そして提供され得る。この方法は、試験化合物の存在下でのＰＰ２Ｃとホスホ−ＢＡＤとのインビトロインキュベーション、続いて、低減または阻害されたホスホ−ＢＡＤ脱リン酸化のその後の試験に基づく。
【０１６４】
この型の同定系を使用して、本発明に従って動脈硬化症を処置または予防するために使用され得る物質が、見出され得る。特別な利点は、アポトーシスに対するホスホ−ＢＡＤの間接的な調節効果がまた、ＰＰ２Ｃ活性に依存するという事実に基づく。
【０１６５】
本発明に従う方法の別の好ましい局面に従って、ＰＰ２Ｃを活性化する性質を有する少なくとも１つの脂肪酸が、インキュベーション工程の間に添加される。この実験的な手段によって、特に、脂肪酸によるＰＰ２Ｃの活性化を選択的に阻害する物質が同定され得る。従って、アテローム発生の脂肪酸濃度にて特に内皮アポトーシスを阻害する活性な物質を同定する好ましい方法が、提供される（すなわち、この同定された物質は、この増大した脂肪酸レベルの効果を選択的に中和する）。この高い選択性は、特に有利である。なぜなら、この高い選択性でなければ、ＰＰ２Ｃ効果を含むさらなる調節プロセスの妨害によって引き起こされる所望されない副作用が生じ得るからである。アポトーシスの予定外の阻害は、例えば、癌の発生の増大した危険性を導き得る。なぜなら、プログラムされた細胞死は、細胞増殖を調節する主要な機構であるからである。ＰＰ２Ｃの脂肪酸活性化を選択的に阻害することは、治療物質の予想された副作用を好都合に低減する。なぜなら、アテローム発生因子によって誘導または刺激されるアポトーシスのみが、低減または予防されるからである。
【０１６６】
さらなる実施形態に従って、記載されたアポトーシスプロセスを調節するための物質を同定するための方法を提案し、この方法において、内皮細胞中でアポトーシスを誘導した後、酵素学的に活性な細胞抽出物が調製され、これは引続き、ホスホ−ＢＡＤおよび１または数個の試験物質と共にインキュベートされる。その後、試験物質によるホスホ−ＢＡＤ脱リン酸化の可能性のある阻害が、評価される。
【０１６７】
この方法は特に有利である。なぜなら、この方法は、内皮細胞の生理学的特徴を考慮し、結果として、本発明に従う治療手段に特に適切な試験物質の同定を可能にするからである。この方法は、代替的に、細胞抽出物の代わりに、内皮細胞培養物中で直接試験される物質を用いて実施され得る。内皮細胞におけるアポトーシス誘導の評価は、実施例２に記載される方法に従って実行され得る。
【０１６８】
アポトーシスは、好ましくは少なくとも１つのＰＰ２Ｃ活性化脂肪酸によって誘導され得る。上に記載されるこの方法は、選択的に活性化する物質を提供するという利点を有する。
【０１６９】
さらなる実施形態は、物質を同定する方法を提供し、この方法は、標的としてＰＰ２Ｃを用いて物質のライブラリーをスクリーニングし、結合パートナーを同定する工程を包含する。次いで、この同定された物質は、ＰＰ２Ｃおよびホスホ−ＢＡＤと共にインキュベートされ、そしてホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化に対するそれらの物質の効果が分析される。これは、最初に無細胞系で実行され、その後続いて、内皮細胞に対して候補物を試験することによって実行され得る。
【０１７０】
このことは、以前のスクリーニングにおいてＰＰ２Ｃに結合することが既に示された物質のみをＰＰ２Ｃ調節活性について試験するという利点をともにする。これは、有利なことに、可能性のある試験物質の数を低減し、それによって本方法の効率を強く増大する。物質のライブラリーとして、化学物質ライブラリー、天然物質ライブラリー、生物学的物質ライブラリーまたはペプチドライブラリーが、本発明に従って選択され得る。多数のこのようなライブラリーが、技術標準として公知であり、そして本発明に従って使用され得る。潜在的に活性なペプチドの同定について、ファージライブラリーおよびファージミドライブラリーが特に適切である。
【０１７１】
さらに、標的としてホスホ−ＢＡＤを用いて物質ライブラリーをスクリーニングして、結合パートナーを同定する方法が提供される。ホスホ−ＢＡＤの代わりに、セリン１１２、セリン１３６およびセリン１５５のそれぞれのリン酸化領域に対応するリン酸化ペプチドもまた、標的として使用され得る。これは、関連するリン酸化ＢＡＤ部位に結合し、かつホスホ−ＢＡＤの他の構造には結合しない結合パートナーが選択的に単離される点で、利点を有する。潜在的に活性な物質を同定するための可能性のあるペプチド標的は、以下：
１１２部位：Ｒ（１０７）ＳＲＭＳＳ（１１２）ＹＰＤＲＧ（１１７） （配列番号１）
１３６部位Ｒ（１３２）ＧＳＲＳ（１３６）ＡＰＰＮＮ（１４１） （配列番号２）
１５５部位Ｒ（１４９）ＥＬＲＲＭＳ（１５５）ＤＥＦＥＧＳ（１６１） （配列番号３）
である。
【０１７２】
これらの配列は、マウス由来の抗原配列である。代わりに、各ヒトＢＡＤペプチド配列が、代替的に使用され得る。明らかに、選択されたペプチド配列はまた、Ｎ末端方向またはＣ末端方向に拡大されてもシフトされてもよい。
【０１７３】
本発明においてまた、この同定されたリガンドは、引続いてＰＰ２Ｃおよびホスホ−ＢＡＤと共にインキュベートされ得、続いて、ホスホ−ＢＡＤ脱リン酸化に対するそれらの効果が評価される。
【０１７４】
この実施形態は、このアッセイが、リン酸化ＢＡＤに結合し、それによってそのリン酸化部位をＰＰ２Ｃに対して接近不可能にする物質の検出を選択的に可能にするという点で、利点を有する。この方法において、ＰＰ２Ｃに直接作用しない脱リン酸化工程の適切なインヒビターが同定され得る。好ましくは、ＰＰ２Ｃの活性、そして結果としての他の代謝経路の調節（ここで、ＰＰ２Ｃは、調節因子として関与する）は、影響を受けない。これに関して、ペプチドライブラリー（またはファージミドライブラリー）をスクリーニングすることが有利である。なぜなら、ペプチド候補物は、タンパク質およびペプチドに典型的な相互作用を提示し、ゆえに、特異的な結合を提示する可能性を有するからである。さらに、このペプチド候補物のホスホ−ＢＡＤに対する結合特異性は、いくつかのスクリーニング工程および適切な候補物の組換えによって意図的に増大され得る。
【０１７５】
さらに、動脈硬化症の処置のための治療剤を生成する方法が提供される。この方法において、内皮細胞における各アポトーシスプロセスに対する阻害効果を有する物質が、好ましくは本発明に従う方法によって、第１工程にて同定される。さらなる工程において、これらの物質は、十分量で生成され、そして生理学的に受容可能なキャリア物質と混合される。動脈硬化症の処置に利用され得る治療的に活性な物質または薬理学的に活性な物質が提供される。
【０１７６】
上記に言及した方法のさらなる有利な局面に従って、ＰＰ２Ｃは、ＰＰ２Ｃα、ＰＰ２Ｃβ、ＰＰ２Ｃγ、ＰＰ２Ｃδおよびこれらのサブタイプからなる群より選択される。これらのサブタイプは、以下の刊行物（これらは、完全に本明細書によって参考として援用される）に記載される：Ｔｅｒａｓａｖａら（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｓｏｔｙｐ ｏｆ Ｍｇ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ β ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｉｎ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｈｅａｒｔ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０７，３４２−３４９；Ｈｏｕら（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃＤＮＡｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｏ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２Ｃβ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｔｅｓｔｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３２，７７３−７８０；Ｋａｔｏら（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆｍｏｕｓｅ Ｍｇ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐ ２Ｃβ−４．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１８，３８７−３９３。好ましくは、ＰＰ２Ｃαおよび／またはＰＰ２Ｃβ、特に、ＰＰ２αが、ＰＰ２Ｃとして使用される。
【０１７７】
本発明に従って、セリン１５５位、セリン１１２位、および／またはセリン１３６位でリン酸化されるホスホ−ＢＡＤが使用され得る。これらのリン酸化部位の全てに関して、これらがＢｃｌ−２とＢｃｌ−ＸＬとのＢＡＤの相互作用を妨害することが知られている。一方、セリン１３６のリン酸化は、ＢＡＤの１４−３−３タンパク質への結合を促進する。特に有利な改変体として、セリン１５５がリン酸化されたＢＡＤが使用される。セリン１５５におけるリン酸化は、ＢＡＤがＢｃｌ−ＸＬに結合することを妨害し、ゆえに、調節効果の原因となる。本明細書中において、ＰＰ２Ｃが、好ましくは、Ｐ−ｓｅｒ１１２およびＰ−ｓｅｒ１３６と比較して、Ｐ−ｓｅｒ１５５を脱リン酸化することが、示され得る。この選択性は、アポトーシス調節におけるＰＰ２Ｃの重要な役割を際立たせる。この選択性を理由として、主にアポトーシスを妨害する際のセリン１５５の中枢的な役割を理由として、セリン１５５における脱リン酸化を選択的に抑制するインヒビターを同定することが、特に有利である。さらなる改変体として、セリン１７０においてリン酸化されたＢＡＤが使用され得る。
【０１７８】
上に記載された方法の望ましいさらなる局面に従って、ホスホ−ＢＡＤは、検出を容易にするために放射性標識される。このためには、（［３２Ｐ］）ＢＡＤが使用され得る。さらなる検出方法として、ホスホ−ＢＡＤおよび／またはＢＡＤに対する抗体もまた、（リン酸化状態に影響を与えることなく）使用され得る。Ｐ−ｓｅｒ１１２、Ｐ−ｓｅｒ１３６、またはＰ−ｓｅｒ１５５に対して選択的な抗体を使用することがさらに有利である。このような抗体は、試験物質が上記の位置のうちの１つにおける脱リン酸化を選択的に妨害する場合の分析を可能にする。
【０１７９】
ＰＰ２Ｃを活性化するために、好ましくは少なくとも１５炭素原子長を有する脂肪酸であって、１つの位置において少なくとも不飽和化され、そして少なくとも１つの遊離カルボキシル基を保有する脂肪酸が選択される。選択的にＰＰ２Ｃを活性化するこの種の脂肪酸の例は、オレイン酸、アラキドン酸、およびジンコール酸（ｇｉｎｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）である。これらがＰＰ２Ｃを１０〜１５倍活性化することが実証されている。
【０１８０】
さらに、Ｍｎ２＋およびＭｇ２＋がこの試験混合物に添加され、好ましくは、０．５〜１．５ｍＭの濃度のＭｇ２＋が添加される。さらに、この混合物は、さらなる添加物（例えば、緩衝液など）、さらなる補因子、および／または類似の物質を含む。
【０１８１】
この記載した方法は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を妨害し、ゆえに動脈硬化症を処置するための治療剤として使用され得る物質を検出するような望ましい様式で使用され得る。
【０１８２】
この方法は、本発明に従って使用される物質が、ＰＰ２Ｃの脂肪酸活性化をブロックすることによって内皮アポトーシスを妨害する場合、特に有利である。
【０１８３】
この方法は、これらの物質がＰＰ２Ｃへの活性化脂肪酸の結合を競合的に阻害する場合、さらに特に好ましい。これらの物質は、活性化脂肪酸に対するＰＰ２Ｃの結合部位をブロックするが、それ自体のＰＰ２Ｃ活性化特性を保持しない、脂肪酸であっても改変脂肪酸であっても脂肪酸アナログであってもよい。
【０１８４】
ＰＰ２Ｃ活性化脂肪酸の阻害誘導体はさらにジホスホネート（ｂｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）脂肪酸および／またはそれらの誘導体間で見出され得る。これらの物質はさらに、それらのジホスホネート残基を介して血管中のカルシウム沈着物に結合し、それゆえに所望の位置にてより正確に作用し得るという有利な特性を有する。これらは、カルボン酸基のホスホン化によって各脂肪酸から合成され得る。例は、ジホスホン酸（ｂｉｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）およびそれらの塩、好ましくは以下の一般式に従うものである。
【０１８５】
【化４】
【０１８６】
本発明に従う活性な物質は、さらに、診断目的のため（例えば、プラークの位置を確認するため）、または造影剤として使用され得る。ジホスホネート脂肪酸誘導体のそれぞれの使用が特に有利である。なぜなら、これら（上記のもの）は、それらのジホスホネート残基を介してカルシウム沈着物に結合し、それによって動脈硬化症のホットスポット（プラーク）を検出するからである。従って、これらは、例えば、シンチグラム造影法に利用され得る。このことを目的として、好ましくはＤＰＤおよびＭＤＰが使用される。さらに、ジホスホネート基は、テクネチウム−９９−メタによって放射性標識され得る。次いで、レセプター結合する場合の脂肪酸残基は、プラークから構成される結合部位に放射性シグナルを伝達し、それによって診断を可能にし得る。さらに、いわゆる常磁性鉄ナノ粒子と組み合わされたジホスホネート脂肪酸誘導体が、磁気共鳴断層撮影（ＭＲＴ）における造影剤として使用され得る。これによって、圧倒的な衛生上の傷害が生じる前の初期段階に、発生中の動脈硬化症または既に存在する動脈硬化症の診断を可能にする好ましい様式で、プラークが検出され得る。
【０１８７】
同様に、本発明に従って適用可能な物質は、脂肪酸による活性化を示すＰＰ２Ｃに対する、ネガティブレギュレーターであり得る。このような物質は、例えば、ＰＰ２Ｃのそれぞれの調節中心に結合し得、これによって、活性化を妨げ得る。
【０１８８】
さらなる実施形態によれば、その阻害性物質は、ＰＰ２Ｃの活性中心に結合し得、これによって、ホスホ−ＢＡＤに対するＰＰ２Ｃの結合を競合的に阻害し得る。これに関して、この物質は、その三次元構造がホスホ−ＢＡＤの三次元構造に本質的に対応し、転換しないかまたはゆっくりとしか転換しないアナログを構成する場合に、有利である。それにもかかわらず、異なる構造を有する競合的インヒビターもまた、本発明に従って使用され得る。さらなる実施形態によれば、ＰＰ２Ｃに対する抗体または抗体フラグメントが、本発明に従って使用され得る。ＰＰ２Ｃの調節部位を特異的に標的とする抗体または抗体フラグメントは、ＰＰ２Ｃの結合部位を有利にブロックし得、これによって、ＰＰ２Ｃの活性化を妨げ得る。
【０１８９】
さらに、ホスホ−ＢＡＤに結合し、これによって、ＰＰ２Ｃのリン酸残基を接近不可能にする物質が、本発明に従って使用され得る。このような物質は、例えば、ペプチドまたはポリペプチドであり得る。ポリペプチドの使用は、このポリペプチドが、確立されたスクリーニング手順によってペプチドライブラリーから単離され得、そしてまた、高い特異性の方向で、最適化または改変され得るという、利点を与える。このようなポリペプチドは、好ましくは、例えば結合ポケットのような相互作用部位を有するべきであり、これによって、このポリペプチドは、ホスホ−ＢＡＤに結合して、そのリン酸化部位を、ＰＰ２Ｃに対して接近不可能にし得る。この部位が結合ポケットを構成する場合、この部位は、例えば、その三次元構造に関して、抗ホスホ−ＢＡＤ抗体の抗原結合部位にほぼ対応し得る。この種の抗体は、既に公知であるので、このような物質は、この抗原結合部位の既知のアミノ酸配列から容易に作製され得る。この結合ポケットはまた、そのそれぞれのリン酸化部位において、ホスホ−ＢＡＤに対する特に高い特異性を達成するため、そして必要であれば、他の細胞成分との副作用を低下させるために、改変され得る。
【０１９０】
本発明による別の好ましい実施形態において、この物質の結合ポケットは、その三次元構造において、ホスホ−ＢＡＤセリン１１２、ホスホ−ＢＡＤセリン１３６およびホスホ−ＢＡＤセリン１５５に対する抗体の抗原結合部位にほぼ対応する。この文脈において、ホスホ−ＢＡＤセリン１５５に対応する結合ポケットを形成することが、特に有利である。なぜなら、ＰＰ２Ｃは、好ましくは、ＢＡＤの調節機構に対する特別の関連を有するこの部位を脱リン酸化することが示されたからである。
【０１９１】
ホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化はまた、細胞内でのＰＰ２Ｃの合成を抑制することによって、防止され得る。この目的のために、ＰＰ２ＣのｍＲＮＡと複合体形成し、それによってその翻訳をブロックする分子が使用され得る。この分子は、ＰＰ２ＣのｍＲＮＡにハイブリダイズする、少なくとも部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチド（いわゆるアンチセンスオリゴヌクレオチド）であり得る。いくつかのＰＰ２ＣサブタイプのｍＲＮＡ核酸配列は、標準的なインターネットデータベース（例えば、ＮＣＢＩによって提供されるもの）においてアクセス可能である。確立された方法により、これらの配列から出発して、関連するｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス分子の設計が可能である。代表的な例を、図１に列挙する。
【０１９２】
好ましくは、ＰＰ２ＣのｍＲＮＡと複合体形成する生体分子は、アポトーシスを予防するために、内皮細胞に導入される。有利には、この生体分子は、上述の実施形態に従うオリゴヌクレオチドである。
【０１９３】
本発明は、ＰＰ２ＣのｍＲＮＡと複合体形成し得る発現産物をコードする、細胞において発現可能な核酸構築物をさらに提供する。この発現産物は、好ましくは、一本鎖オリゴヌクレオチドである。この産物は、例えば、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡの反対の鎖（相補鎖）の配列を（完全にかまたは部分的に）提示し、その結果、この産物は、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡにハイブリダイズして、二重ヘリックスを形成する。代表的なオリゴヌクレオチドの例を、図１に示す。
【０１９４】
好ましい発展に従えば、本発明に従う核酸構築物は、真核生物において発現可能な発現ベクターである。ＰＰ２Ｃのコード配列が、真核生物において発現可能な発現ベクタープロモーターの下流で逆方向に（少なくとも部分的に）クローニングされる場合が、特に好ましい。この様式で、この配列が読まれる場合に転写産物が同時に生成し、この転写産物は、アンチセンス分子として作用し、ＰＰ２ＣのｍＲＮＡと複合体形成し、これによって、ＰＰ２Ｃの翻訳を妨げる。
【０１９５】
この核酸構築物は、内皮細胞においてアポトーシスを予防する方法において使用され得、ここで、内皮細胞は、それぞれの核酸構築物でトランスフェクトされる。
【０１９６】
本発明のさらなる実施形態において、ＢＡＤからホスホ−ＢＡＤへのリン酸化が、アポトーシス誘発性（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）ＢＡＤレベルを、好ましくは低レベルに維持することの結果として、支持され得る。この目的のために、ＢＡＤのリン酸化に関連するプロテインキナーゼ（上記を参照のこと）の活性または発現に、直接的にかまたは間接的に影響を与えることが提唱される。このことは、例えば、酵素発現の誘導もしくは強化によって、またはこれらの酵素の活性を、例えばリガンドによって増加させることによって、達成され得る。
【０１９７】
１つの関連する実施形態において、β−２−交感神経作用剤（ｓｙｍｐａｔｈｏｍｉｍｅｔｉｃ）であるクレンブテロールが、動脈硬化症の治療のために投与される。内皮細胞は、β１−レセプターおよびβ２−レセプターを保有し、その結果、クレンブテロールは、これらの細胞において、ＴＧＦ−β１の合成を誘導し得る。増殖因子がＢＡＤのリン酸化を導くことが公知であるので、クレンブテロールは、高いＢＡＤレベルによるアポトーシス誘発（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）効果を低下させるために、使用され得る。
【０１９８】
さらに、β−交感神経作用剤としてのクレンブテロールは、アドレナリンまたはノルアドレナリンと同様に、細胞ｃＡＭＰレベルの増加を開始させ、このことは、プロテインキナーゼＡを刺激するアクチベータとして作用する。従って、クレンブテロールはまた、この機構によって、ＢＡＤレベルの低下をもたらし、同時に平行して、ホスホ−ＢＡＤ値を増加させる。
【０１９９】
この好ましい適用は、原理的にはまた、細胞ｃＡＭＰレベルの上昇をもたらす他の活性物質に対して有効である。この群の物質は、例えば、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）のインヒビターおよびさらなるβ−交感神経作用剤を包含し、これらは、本発明に従って、リン酸化ＢＡＤの量を、好ましい様式で上昇させるために使用され得る。ＰＥＤインヒビターの例は、カフェイン（ｃｏｆｆｅｉｎｅ）、テオフィリン（ｔｈｅｏｐｙｌｌｉｎｅ）およびシルデニフィル（ｓｉｌｄｅｎｉｆｉｌ）である。この群のさらなるメンバーは、文献から公知である。
【０２００】
本発明に従ってホスホ−ＢＡＤ値の上昇をもたらし得るさらなる物質は、血液ＨＤＬ濃度を上昇させる物質、ならびに生物活性スフィンゴリピド（例えば、シロホスホリルコリン（ｓｙｌｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎ）およびリソスルファチド（ｌｙｓｏｓｕｌｆａｔｉｄ）のような）である。増加したＨＤＬ濃度および生物活性スフィンゴリピドは、キナーゼ活性を刺激することによって、ホスホ−ＢＡＤ値の上昇を生じる。
【０２０１】
記載した物質、分子および核酸構築物の全ては、好ましくは、動脈硬化症を処置するために使用され得る。本発明によれば、さらに、治療物質または薬理学的に活性な物質が提供され、これらの物質は、動脈硬化症の処置のために先に記載された物質の少なくとも１つを含むか、またはこの少なくとも１つによって構成される。
【０２０２】
それぞれの治療剤の調製のために、活性物質は、医療調製物のために通常使用されるキャリアとさらに組み合わせられ得る。従って、この物質は、以下のような適用形態（例えば、皮膚上（ｅｐｉｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、頬、舌、舌下、経口、直腸、肺、結膜、吸入による、心臓下、動脈内、静脈内、腰内（ｉｎｔｒａｌｕｍｂａｌｌｙ）、ヘクト内（ｉｎｔｒａｈｅｃｔａｌｌｙ）、皮内、皮下、粘膜内、または腹腔内）の１つのために調製され得る。
【０２０３】
この目的のために、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、フォーム、軟膏、ペースト、錠剤、丸剤、糖剤、坐剤、直腸カプセル、ゼリー、スプレー、エアロゾル、吸入剤、ドロップ、注射用溶液、注入用溶液、移植物またはリポソーム系が、調製され得る。本発明に従うオリゴヌクレオチド治療剤のために、核酸が細胞に移入される生薬形態が必要である。このことは、例えば、リポソームによって、またはウイルスビヒクルもしくは非ウイルスビヒクルによって、実施され得る。
【０２０４】
このような治療剤の調製のために、活性物質は、治療的に活性なさらなる物質とさらに組み合わせられ得る。複合調製物において、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を妨げる物質が、本発明に従うＢＡＤリン酸化を刺激する物質と組み合わせられ得る。これらの物質を、単独でか、または脂質の減少のための公知の物質もしくはＨＤＬ濃度を増加させる物質と組み合わせて組み合わせることが、さらに可能である。このような複合調製物によって、動脈硬化症の本質的な要因（上昇した脂質レベル）および高い脂質レベルの結果（内皮細胞のアポトーシス）が、同時に阻止され得る。
【０２０５】
本発明によれば、インビトロの方法は特に、細胞、細胞培養物、器官または器官の一部、器官系およびヒト身体由来の部分もしくは動物身体由来の部分の使用を包含する技術であると理解される。用語「インビトロ」は、特に、細胞、細胞抽出物、精製された成分、ホモジネートなどを使用する、人工系を包含する。
【０２０６】
本発明による方法と結び付けて使用される、用語「ホスホ−ＢＡＤ」はまた、ＰＰ２Ｃによって脱リン酸化される、可能なホスホ−ＢＡＤアナログおよび代替の物質（例えば、カゼイン）の使用を包含する。
【０２０７】
本発明によって適用可能な物質は、キラル物質の場合、ラセミ体および／または異性体として使用され得る。
【０２０８】
本発明を、以下の実施例によって、さらに説明する。
【０２０９】
【実施例】
（実施例１）
本発明による試験方法の１つの実施形態において、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化は、組換えＢＡＤを使用してインビトロで達成される（Ｌｉｚｃａｎｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｏｒｒｉｃｅ，Ｎ．およびＣｏｈｅｎ，Ｐ．（２０００）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＡＤ ｂｙ ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｖｉａ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｔｅ，ｓｅｒ１５５．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３４９巻、５４７−５５７）。ホスホ−ＢＡＤを、１２μｇ ＢＡＤ（ＧＳＴ融合タンパク質として；Ｌｉｚｃａｎｏら、２０００）、０．５５μｇ ＰＫＡ（Ｓｉｇｍａ）、１μｌ ＡＴＰ、１５μＣｉ ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む反応混合物（１２μｌ）によって得た。この反応混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０２１０】
ホスホ−ＢＡＤのための代替の調製方法において、８ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）中の３．４μｇ ＧＳＴ−ＢＡＤ；１０ｍＭ β−グリセロホスフェート、２ｍＭ ＥＤＴＡ；０．４ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム；１５ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．０４％ ２−メルカプトエタノール；１μＭ ＡＴＰおよび１５μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（放射能検出のため）を、それぞれのキナーゼ（１００ｎｇ ＰＫＡ、１００ｎｇ ＰＫＢまたは５ｍＵ ＲＳＫ）と共に、総容量１０μｌで、３０℃で３０分間インキュベートした。
【０２１１】
リン酸化反応を、５μｌ Ｌａｅｍｍｌｉプローブ緩衝剤の添加によって停止させた。インキュベーションの後に、放射能標識ＡＴＰおよび非標識ＡＴＰを、Ｃｅｎｔｒｉ−ＳＥＰ遠心分離カラム（ｅｍｐ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｒｌｉｎ）中での遠心分離（７５０×ｇｍａｘで２分間）によって除去し、（ＰＰ２Ｃとの）２回目のインキュベーション工程における新たなリン酸化を防止した。プローブを、時間的に遅れることなく、さらなる工程において処理するべきである。
【０２１２】
ＰＰ２Ｃ酵素を得るために、ｃＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、その後、Ｎｉ−ＮＴＡセファロースで精製した。この場合には、ウシの脳由来のＰＰ２ＣβをコードするｃＤＮＡを使用した（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５１，３２８−３３８（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ ２−Ｃ ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｒｅｔｉｎａｅ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）。
【０２１３】
ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化は、時間と濃度との両方に依存する。試験混合物は、Ｍｇ２＋イオンまたはＭｎ２＋イオンを含まなければならない。なぜなら、ＰＰ２Ｃは、これらのイオンの存在に依存するからである。好ましくは、試験混合物は、０．５〜１．５ｍＭ／ｌのＭｇ２＋を含む。インキュベーション期間は、少なくとも１０分間であり得るが、好ましくは、３０分間である。ＰＰ２Ｃを、少なくとも３０ｎｇの濃度、好ましくは３００ｎｇを超える濃度で、添加した。
【０２１４】
遠心分離によって精製した、放射能標識［３２Ｐ］ＢＡＤを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１０倍に希釈した。１５μｌのインキュベーション混合物を、３７℃（または３０℃）で３０分間インキュベートした。この試験混合物は、以下を含んだ：９μｌ ［３２Ｐ］ＢＡＤ（０．２μｇ）；１．５μｌ １０倍反応緩衝剤（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、１％ ２−メルカプトエタノール）；３００ｎｇ ＰＰ２Ｃ。
【０２１５】
この反応を、５μｌの変性緩衝剤の添加によって停止させ、そしてタンパク質が１２．５％ ＳＤＳ ＰＡＧＥミニゼリー上で分離されるまで、氷上に維持した。脱リン酸化またはリン酸化の程度を、オートラジオグラフィーによって分析した。
【０２１６】
さらなる可能なインビトロ試験混合物によれば、ＰＰ２Ｃの活性は、以下を含有する３０μｌの混合物を、３０℃で１０分間インキュベートすることによって、分析される：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；０．０１％ ２−メルカプトエタノール；１．３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび１μＭ［３２Ｐ］カゼイン（５×１０４ｃｐｍ）（ＭｃＧｏｗａｎおよびＣｏｈｅｎ，１９８８；Ｃｏｈｅｎ １９９１）。脂肪酸の存在下でのＰＰ２Ｃ活性を決定するために、０．７μＭの酢酸マグネシウムを添加した。この反応を、２００μｌの２０％トリクロロ酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ）の添加によって、停止させた。１００００ｇでの遠心分離（５分間）の後、２００μｌの上清を、その［３２Ｐ］リン酸塩の濃度について分析した。
【０２１７】
それぞれの結果により、試験系が機能的であるか否かを試験することが可能である。脱リン酸化を阻害する能力について試験される物質を、それぞれの試験混合物に添加し、そして上記のようにインキュベートする。オートラジオグラフィーによって、コントロール（試験物質なし）と比較してどの程度の阻害が起こったかを、以下の様式で試験する。好ましくは、潜在的な活性物質を、異なる濃度で試験して、間違った濃度では効果を示さない有望な候補を失わないようにする。候補（特に、有望な候補）はまた、１つの共通の混合物内で、それらの相乗効果について試験され得る。
【０２１８】
脂肪酸により活性化されたＰＰ２Ｃを標的とする阻害がどの程度可能であるかを試験するために、ＰＰ２Ｃ活性化脂肪酸もまた、この混合物に添加した。例として、好ましくは１０μＭと５００μＭとの間の濃度の、オレイン酸を使用した。それぞれのコントロールによって、どの程度まで、試験物質が、ＰＰ２Ｃの「通常の」（刺激されていない）活性を並行して阻害することなく、脂肪酸によるＰＰ２Ｃの活性化のみを停止させるかが決定され得る。このような実験アプローチによって、通常の調節プロセスを妨害することなく、脂肪酸により誘導されるアポトーシスを正確にかつ単独で阻害する物質が、選択的に決定され得る。
【０２１９】
このように同定した試験物質を、以下の様式で、内皮細胞において試験し得る（実施例２を参照のこと）。
【０２２０】
（実施例２）
内皮細胞培養物を懸濁させ、そして試験細胞培養物を、４×１０４細胞／ｃｍ２の初期細胞密度で、ポリ−Ｌ−リジンコーティングした球またはポリ−Ｌ−リジンコーティングしたスライドガラス上に接種し、ＴＵＮＥＬアッセイのためにペトリ皿に入れた。これらの培養物を、ＤＭＥＭ中の加湿雰囲気下で温度３７℃および５％ＣＯ２に維持し、これに、２０％のウシ胎仔血清および抗生物質を添加した。培地を、２日おきに交換した。
【０２２１】
接種の４日後、培養物を無血清培地に２４時間曝露した。これに続いて、これらの細胞を、試験物質および／またはＰＰ２Ｃ活性化脂肪酸、脂肪酸誘導体もしくは結合剤で処理した。脂肪酸および／またはそれらの誘導体を、純粋なＤＭＳＯに最初に溶解し、次いで、培養培地で希釈して、全ての実験において、０．０１６％ＤＭＳＯの最終濃度にした。
【０２２２】
アポトーシスを誘導するために、好ましくはＰＰ２Ｃ活性化脂肪酸（例えば、オレイン酸またはギンコール酸（ｇｉｎｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ））を添加したが、他の公知のアポトーシス誘発物質もまた使用され得る。内皮細胞培養物においてＰＰ２Ｃを検出するために、２０ｍＭのＭｇ２＋イオンを使用した。インキュベーションに続いて、どの程度まで試験物質がアポトーシスを阻害し得るかを分析した。
【０２２３】
アポトーシスの検出のために、核の形態および染色体の構造を、核ＤＮＡについて染料としてＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８を適用して、可視化し得る。これらの培養物を、メタノール中１０μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８と共に１０分間インキュベートし、続いてメタノールおよびＰＢＳで洗浄する。引き続いて、核の形態を、蛍光顕微鏡で分析した。収縮した核および濃縮されたクロマチンを有する内皮細胞の数を、４つの異なる培養球ごとに３つの領域で計数した。これらの結果を、細胞全体における、濃縮されたクロマチンおよび収縮した核を有する内皮細胞の百分率として、表現および分析した。
【０２２４】
ＤＮＡの断片化の検出のために、市販のキットを製造業者の指示に従って使用して、ＴＵＮＥＬアッセイを実施した。細胞単層を、−２０℃で２０分間、メタノール中に手短に固定し、次いで３７℃で１時間、ジゴキシゲニン標識ｄｄＵＴＰと共に、ターミナルトランスフェラーゼの存在下でインキュベートした。この反応を停止させ、そしてフルオレセインイソチオシアネートと結合した抗ジゴキシゲニン抗体を添加し、そしてこの混合物をさらに３０分間インキュベートした。引き続いて、適切な顕微鏡（ＬＳＭ ５１０、Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、蛍光を分析した。
【０２２５】
カスパーゼ−３の活性を、蛍光定量キットで決定した。このアッセイは、カスパーゼ−３による、ペプチド基質アセチル−ａｓｐ−ｇｌｕ−ｖａｌ−ａｓｐ−７−アミノ−４−メチルクマリン（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ）の加水分解（蛍光ＡＭＣ成分の放出をもたらす）に基づく。細胞を採取し、そして４℃にて６００×ｇで５分間の遠心分離によって、ペレット化した。上清を除き、そしてペレットをＰＢＳで洗浄した。続いて、ペレットを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）；５ｍＭ ３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニウム１−プロパンスルホネートおよび５ｍＭ ジチオスレイトールを含む、溶解緩衝液に溶解し、そして氷上で２０分間インキュベートした。引き続いて、細胞を、４℃にて１４０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を、反応緩衝剤（１０ｍＭ Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ；２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）；２ｍＭ ＥＤＴＡ；０．１％ ３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネートおよび５ｍＭ ジチオスレイトール）と混合した。ＡＭＣの蛍光を、３６０ｎｍの活性化波長および４６０ｎｍの発光波長で測定した。この結果を、ＡＭＣ標準曲線に関して計算し、そして好ましくは、ｎｍｏｌ ＡＭＣ／ｍｇタンパク質／分として決定した。タンパク質の量を、標準物としてウシ血清アルブミンを用いる「ビシンコリン酸（ｂｉｃｉｎｃｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）タンパク質アッセイ」キットを使用することによって、測定した。
【０２２６】
記載された方法によって、処置される細胞がアポトーシスプロセスを示すか否かを決定し得る。これによって、内皮細胞においてアポトーシスを減少させるかまたは防止する試験物質が決定され得る。この様式で、動脈硬化症に対する価値ある潜在的な治療剤が、同定され得る。
【０２２７】
【表１】
【発明の効果】
本発明により、内皮細胞のアポトーシスを促進する動脈硬化症を直接的または間接的に妨げるための、方法ならびに物質または物質群が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡにハイブリダイズして二重ヘリックスを形成する、代表的なオリゴヌクレオチドの例を示す。いくつかのＰＰ２ＣサブタイプのｍＲＮＡ核酸配列は、標準的なインターネットデータベース（例えば、ＮＣＢＩによって提供されるもの）においてアクセス可能である。確立された方法により、これらの配列から出発して、関連するｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス分子の設計が可能である。代表的な例を、図１に列挙する。
Claims (71)
- 動脈硬化症を予防するためまたは動脈硬化症リスクを減少させるための組成物であって、該予防または減少は、内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を予防するかまたは減少させることを特徴とする、組成物。
- 動脈硬化症を予防するためまたは動脈硬化症リスクを減少させるための組成物であって、該予防または減少は、内皮細胞におけるＢＡＤのリン酸化を増加させることを特徴とする、組成物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の組成物。
- ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
- 請求項１〜２のいずれか１項に記載の組成物であって、前記予防または減少が、ＢＡＤのｓｅｒ１１２、ｓｅｒ１３６および／またはｓｅｒ１５５のリン酸化／脱リン酸化に影響を及ぼすことを特徴とする、組成物。
- セリン−スレオニン−ホスファターゼインヒビターを含む、請求項１、２または５のいずれか１項に記載の組成物。
- ＰＰ２Ｃインヒビターを含む、請求項６に記載の組成物。
- β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターを含む、請求項２に記載の組成物。
- ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する物質を同定するための方法であって、以下：
ａ．ＰＰ２Ｃと、ホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログと、少なくとも１つの試験物質とを共に、インビトロでインキュベートする工程、および
ｂ．ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化について、該試験物質の有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする、方法。 - 工程ａ）において、ＰＰ２Ｃを活性化する少なくとも１つの脂肪酸を添加することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
- ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害することによって内皮細胞におけるアポトーシスプロセスに影響を及ぼし得る物質を同定するための方法であって、以下：
ａ．内皮細胞においてアポトーシスを誘導する工程、
ｂ．１種または数種の試験物質を接触させ、該試験物質と共にインキュベートする工程、および
ｃ．ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログの脱リン酸化について、該試験物質の有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする、方法。 - 工程ａ）の後に、酵素的に活性な細胞抽出物を、前記誘導された内皮細胞から得ることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
- 請求項１１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、工程ａ）における誘導のために、少なくとも１つのＰＰ２Ｃ活性化脂肪酸を使用し、該脂肪酸は、好ましくは、少なくとも１５炭素原子長を有し、少なくとも１つの位置で不飽和であり、そして少なくとも１つの遊離カルボキシル基を有し、そして好ましくは、オレイン酸、アラキドン酸および／またはギンコール酸であることを特徴とする、方法。
- ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する物質を同定するための方法であって、以下：
ａ．結合パートナーを同定するための標的としてＰＰ２ＣまたはＰＰ２Ｃフラグメントを用いて、物質のライブラリーをスクリーニングする工程、
ｂ．工程ａ）において単離された物質を、ＰＰ２Ｃと、ホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログと共に、インキュベートする工程、ならびに
ｃ．該ホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログの脱リン酸化について、工程ａ）において単離された該物質の有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする、方法。 - 請求項１４に記載の方法であって、前記物質のライブラリーが、化学物質ライブラリー、天然物質ライブラリー、生物学的物質ライブラリーおよびペプチドライブラリーからなる群より選択されることを特徴とする、方法。
- ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害する物質を同定するための方法であって、以下：
ａ．ホスホ−ＢＡＤと相互作用する結合パートナーを同定するための標的としてホスホ−ＢＡＤまたはリン酸化されたＢＡＤペプチドフラグメントを用いて、物質のライブラリーをスクリーニングする工程、
ｂ．工程ａ）において単離された物質と、ＰＰ２Ｃと、ホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログとを共に、インキュベートする工程、ならびに
ｃ．ＰＰ２Ｃによる該ホスホ−ＢＡＤまたは転換可能なアナログの脱リン酸化について、有効性を検出する工程、
を包含することを特徴とする、方法。 - 動脈硬化症を処置するための治療剤を生成するための方法であって、以下：
ａ．請求項９、１１、１４および１６のうちの少なくとも１項に記載の方法によって、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を阻害することによって内皮細胞におけるアポトーシスプロセスを調節する物質を同定する工程、ならびに
ｂ．該物質を少なくとも１つの生理学的に受容可能なキャリア物質と混合して、治療剤を形成する工程、
を包含することを特徴とする、方法。 - 請求項９〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、ＰＰ２Ｃが、ＰＰ２Ｃα、ＰＰ２Ｃβ、ＰＰ２Ｃγ、ＰＰ２Ｃδおよびそれらのサブタイプを含む群より選択されることを特徴とする、方法。
- 請求項９〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、ホスホ−ＢＡＤの代謝回転を検出するために、ホスホ−ＢＡＤに対する抗体および／またはＢＡＤに対する抗体を使用することを特徴とする、方法。
- 請求項９〜１９のいずれか１項に記載の方法であって、ｓｅｒ１５５、ｓｅｒ１１２および／またはｓｅｒ１３６の位置でリン酸化されている、ホスホ−ＢＡＤまたはホスホ−ＢＡＤペプチドフラグメントを使用することを特徴とする、方法。
- 請求項２０に記載の方法であって、ＢＡＤのｓｅｒ１１２、ｓｅｒ１３６および／またはｓｅｒ１５５を取り囲むアミノ酸領域に由来するペプチドフラグメントを使用することを特徴とする、方法。
- 請求項２１に記載の方法であって、前記ペプチドフラグメントが、少なくとも８アミノ酸長を有することを特徴とする、方法。
- 請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法によって生成される物質を含む、動脈硬化症を処置するための治療組成物であって、該物質は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を妨げる、治療組成物。
- ＰＰ２Ｃのインヒビターであることを特徴とする、内皮細胞においてアポトーシスを阻害するための物質。
- 請求項２４に記載の物質であって、脂肪酸によって活性化可能であるＰＰ２Ｃのインヒビターであることを特徴とする、物質。
- 請求項２４または２５に記載の物質であって、ＰＰ２Ｃの脂肪酸活性化の選択的インヒビターであることを特徴とする、物質。
- 請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の物質であって、ＰＰ２Ｃへの脂肪酸の結合を競合的に阻害することを特徴とする、物質。
- 請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の物質であって、脂肪酸、改変された脂肪酸、脂肪酸誘導体、ジホスホネート脂肪酸誘導体または脂肪酸アナログであることを特徴とする、物質。
- 請求項２８に記載の物質であって、以下の一般式
ここで、
Ｒ１は、１〜１２個の炭素原子を有する直鎖アルキル残基または分枝鎖アルキル残基であり、該アルキル残基は、アミノ基、Ｎ−モノアルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基および／またはＳＨ基のような置換基で置換され得、該アルキル残基は、１〜１２個のＣ原子を含み得るか、あるいは
Ｒ１は、置換または非置換の炭素環式アリール残基または複素環式アリール残基であり、該アリール残基は、１または数個のヘテロ原子を有し得、かつ置換基として、１〜１２個のＣ原子を有する分枝鎖アルキル残基または１〜１２個のＣ原子を有する直鎖アルキル残基、遊離アミノ基、モノアルキルアミノ基、もしくはジアルキルアミノ基、またはハロゲン原子を含み得、該アルキルアミノ基のアルキルは、それぞれ、１〜６個のＣ原子を有し、そして
Ｒ２は、ＯＨ、ハロゲン原子（好ましくは、Ｃｌ）、ＨまたはＮＨ２である、物質。 - 請求項２９に記載の物質であって、イバンドロン酸、エチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、チルドロン酸、ゾレドロン酸、シマドロン酸、ネリドロン酸、オルパドロン酸、３−ピロール−１−ヒドロキシプロパン−１−１−ジホスホン酸および／またはミノドロン酸、ジホスホネート−１，１−ジカルボン酸（ＤＰＤ）および／または１−メチル−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸（ＭＤＰ）を含む群より選択されることを特徴とする、物質。
- 請求項２４〜３０のいずれか１項に記載の物質であって、脂肪酸によって活性化可能であるＰＰ２Ｃの、ネガティブレギュレーターであることを特徴とする、物質。
- 請求項２４〜３１のいずれか１項に記載の物質であって、ＰＰ２Ｃの活性中心に結合し、そして／または、ＰＰ２Ｃへのホスホ−ＢＡＤの結合を競合的に妨げることを特徴とする、物質。
- 請求項３２に記載の物質であって、ホスホ−ＢＡＤの三次元構造に本質的に対応する三次元構造を有すること、および転換可能でないかまたはゆっくりでしか転換可能ではない基質アナログであることを特徴とする、物質。
- 内皮細胞におけるアポトーシスを阻害するための物質であって、ホスホ−ＢＡＤに結合し、そしてホスフェート残基（特に、Ｐ−Ｓｅｒ１５５）をＰＰ２Ｃに接近不可能にすることを特徴とする、物質。
- ポリペプチドであることを特徴とする、請求項３４に記載の物質。
- 相互作用領域（好ましくは、結合ポケット）によってホスホ−ＢＡＤに結合することを特徴とする、請求項３４または３５に記載の物質。
- 前記結合ポケットの三次元構造が、ホスホ−ＢＡＤに対する抗体の抗原結合部位に本質的に対応することを特徴とする、請求項３６に記載の物質。
- 抗ホスホ−ＢＡＤ抗体の改変された抗原結合部位に対応する結合ポケットを含むことを特徴とする、請求項３６または３７に記載の物質。
- 請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の物質であって、前記結合ポケットの三次元構造が、ホスホ−ＢＡＤ Ｓｅｒ１１２、ホスホ−ＢＡＤ Ｓｅｒ１３６および／またはホスホ−ＢＡＤ Ｓｅｒ１１５に対する抗体の抗原結合部位に本質的に対応することを特徴とする、物質。
- 内皮細胞におけるアポトーシスを阻害するための物質であって、ＰＰ２Ｃに結合するポリペプチドであることを特徴とする、物質。
- 抗体または抗体フラグメントであることを特徴とする、請求項４０に記載の物質。
- ＰＰ２ＣのｍＲＮＡと複合体形成することを特徴とする、生体分子。
- 少なくとも部分的に一本鎖であるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項４２に記載の生体分子。
- 請求項４３に記載のオリゴヌクレオチドであって、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡの反対の鎖に完全にかまたは部分的に対応する核酸配列であることを特徴とし、その結果、該分子が、該ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによって、二本鎖領域を有する少なくとも部分を形成する、オリゴヌクレオチド。
- ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡと複合体形成させるためのアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての、請求項４３または４４に記載のオリゴヌクレオチドの使用
- 内皮細胞においてアポトーシスを予防するための組成物であって、請求項２４〜４４のいずれか１項に記載の物質または生体分子（特に、請求項４４に記載の少なくとも部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチド）を含む、組成物。
- 細胞において発現可能な核酸構築物であって、その発現産物は、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡと複合体形成する生体分子であることを特徴とする、核酸構築物。
- 前記発現産物が、一本鎖オリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項４７に記載の核酸構築物。
- 前記発現産物が、図１に示される配列のうちの１つの核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項４７または４８に記載の核酸構築物。
- 請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の核酸構築物であって、真核生物において発現可能な発現ベクターであることを特徴とする、核酸構築物。
- ＰＰ２Ｃのコード配列が、真核生物で発現可能な発現ベクターのプロモーターの後ろに、逆方向に少なくとも部分的にクローニングされていることを特徴とする、請求項４７〜５０のいずれか１項に記載の核酸構築物。
- 動脈硬化症を処置するために内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための組成物であって、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載の核酸構築物を含む、組成物。
- 動脈硬化症および／または動脈硬化症に関連する疾患を処置するための組成物であって、請求項２４〜４４および４７〜５１の少なくとも１項に記載の、少なくとも１つの物質、生体分子または核酸構築物を含む、組成物。
- 動脈硬化症を処置するための薬理学的に活性な組成物であって、請求項２４〜４４および４７〜５１の少なくとも１項に記載の、少なくとも１つの物質、生体分子または核酸構築物を含む、組成物。
- 少なくとも１つの脂質減少剤および／またはＨＤＬ濃度を増加する薬剤を含むことを特徴とする、請求項５４に記載の組成物。
- アポトーシスの予防のために内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの量を増加するための組成物であって、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターを含む、組成物。
- ＰＰ２Ｃが、ＰＰ２Ｃα、ＰＰ２Ｃβ、ＰＰ２Ｃγ、ＰＰ２Ｃδおよびそれらのサブタイプを含む群より選択される、請求項７に記載の組成物。
- 動脈硬化症の予防または動脈硬化症リスクの減少のための医薬の製造のための、内皮細胞においてホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化の予防または減少を生じる物質の使用。
- 動脈硬化症の予防または動脈硬化症リスクの減少のための医薬の製造のための、内皮細胞においてＢＡＤのリン酸化の増加を生じる物質の使用。
- 前記物質が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５８〜５９のいずれか１項に記載の使用。
- 前記物質が、ＰＰ２Ｃ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の使用。
- 前記予防または減少が、ＢＡＤのｓｅｒ１１２、ｓｅｒ１３６および／またはｓｅｒ１５５のリン酸化／脱リン酸化に影響を及ぼすことを特徴とする、請求項５８〜５９のいずれか１項に記載の使用。
- 前記物質が、セリン−スレオニン−ホスファターゼインヒビターである、請求項５８、５９または６２のいずれか１項に記載の使用。
- 前記インヒビターが、ＰＰ２Ｃインヒビターである、請求項６３に記載の使用。
- 前記物質が、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターである、請求項５９に記載の使用。
- ＰＰ２Ｃが、ＰＰ２Ｃα、ＰＰ２Ｃβ、ＰＰ２Ｃγ、ＰＰ２Ｃδおよびそれらのサブタイプを含む群より選択される、請求項６４に記載の使用。
- 動脈硬化症の処置のための治療剤を製造するための、請求項１７〜２２の１以上の方法によって生成される物質の使用であって、該物質は、ＰＰ２Ｃによるホスホ−ＢＡＤの脱リン酸化を妨げる、使用。
- 内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための医薬の製造のための、請求項２４〜４４のいずれか１項に記載の物質または生体分子（特に、請求項４４に記載の少なくとも部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチド）の使用。
- 内皮細胞におけるアポトーシスを予防するための医薬の製造のための、請求項４７〜５１に記載の核酸構築物の使用。
- 動脈硬化症および／または動脈硬化症に関連する疾患の処置のための医薬の製造のための、請求項２４〜４４および４７〜５１の少なくとも１項に記載の、少なくとも１つの物質、生体分子または核酸構築物の使用。
- 内皮細胞におけるホスホ−ＢＡＤの量を増加することによってアポトーシスを予防するための医薬の製造のための、β−交感神経作用剤、β−２−交感神経作用剤（特に、クレンブテロール）および／またはホスホジエステラーゼインヒビターの使用。
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