JP2001515857A

JP2001515857A - 細胞活性を調節する方法

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Publication number: JP2001515857A
Application number: JP2000510431A
Authority: JP
Inventors: マシュー・バダス; ジェニファー・ギャンブル; プ・シア; フィリップ・バーター; ケリー−アン・ライ; ブライアン・ウォッテンバーグ; スチュアート・ピットソン
Original assignee: メドベット・サイエンス・プロプライエタリー・リミテッド
Priority date: 1997-09-08
Filing date: 1998-09-08
Publication date: 2001-09-25
Anticipated expiration: 2018-09-08
Also published as: CA2302838A1; WO1999012533A1; EP1011654A4; AUPO900297A0; AU757358B2; CA2302838C; EP1011654A1; AU8965898A; JP4570246B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、細胞活性を調節する方法およびそのために有用な薬剤に関する。具体的には、本発明は、内皮細胞活性およびさらに具体的には内皮細胞接着分子の発現を調節する方法に関する。最も具体的には、本発明は内皮細胞接着分子の発現を予防または減少して、冠状心疾患を処置する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 (技術分野) 本発明は、細胞活性を調節する方法およびそのために有用な薬剤に関する。具
体的には、本発明は、内皮細胞活性およびさらに具体的には内皮細胞接着分子の
発現を調節する方法に関する。最も具体的には、本発明は内皮細胞接着分子の発
現を予防または減少して、冠状心疾患を処置する方法を提供する。

【０００２】 (背景技術) 本明細書において引用する参考文献一覧を明細書の最後に記載する。本明細書
において引用するヌクレオチドおよびアミノ酸配列の配列番号(ＳＥＱＩＤＮＯ)を参考文献の直前に定義する。

【０００３】アテローム性冠状動脈心疾患は、欧米において主な死亡原因の一つである(世界保健統計年鑑(World Health Statistics Annual)）。アテローム形成の初期事
象は、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンなどの接着分子によっ
て内皮に単核細胞が接着することである。ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１およびＥ
−セレクチンはすべて、サイトカインに応じて迅速に合成される。ＶＣＡＭ−１
は、単核白血球が内皮に接着するのに主に関係する。ＶＣＡＭ−１は炎症性サイ
トカインＩＬ−１およびＴＮＦ−αによって迅速に誘発され、その誘発は４８−
７２時間維持される。ＩＣＡＭ−１は、多細胞型で発現され、活性化された内皮
への単核細胞およびリンパ球の接着に関係する。Ｅ−セレクチンは、内皮に沿っ
て動く軸流からサイトカインを捕捉するのに重要な内皮特異的接着分子である(A
bbassi et al., 1993)。

【０００４】初期アテローム性動脈硬化症病変の進行と成長アテローム性動脈硬化症プラー
クに対する接着分子の関与については、かなりの証拠がある(Van der Wal et al
., 1992)。変動的で低レベルのＥ−セレクチンおよびＶＣＡＭ−１が、プラーク
を覆う動脈内皮において検出された(Van der Wal et al., 1992; Wood et al.,
1993)。ＶＡＣＭ−１はまた、新血管形成の領域およびプラークの基部における炎症性湿潤において観察され、動脈内膜の新血管形成が進行した冠状動脈病変に
炎症性細胞を補充する重要な部位であることが示唆されている(O'Brien et al.,
1993)。ＩＣＡＭ−１は、アテローム性プラークを覆う内皮において発現するこ
とが示された(Johnson-Tidey et al., 1994)。

【０００５】接着分子の発現など細胞活性の上方制御を引き起こす情報伝達は明らかにされ
ていない。これら細胞の情報伝達メカニズムを解明することは、冠状動脈性心疾
患および炎症性症状など、該細胞活性が有害である症状への治療戦略の開発に必
要である。

【０００６】本発明に至る研究において、本発明者はスフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路
を同定した。その経路を通じて、接着分子発現などの細胞活性が達成される。こ
の経路の個々の構成成分の発現および活性を調節することにより、これらの細胞
活性が調節される。本発明者はまた、スフィンゴシンキナーゼ活性を発揮する薬
剤およびスフィンゴシンキナーゼ活性のアゴニストおよびアンタゴニストとして
機能し得る薬剤を検出するための迅速で高容量のアッセイを開発した。

【０００７】 (発明の要約) 下記の本明細書および請求の範囲を通して、文脈からして別の意味に取らざる
を得ない場合を除き、単語“含む（comprise）”および変体の“含む（comprise
s）”、“含んでいる”は、記述されたそのもの、その方法または両者の複合を含意するが、他のもの、方法または両者の複合を排除することを意味するわけで
はない。

【０００８】本発明の１つの態様は、哺乳動物における細胞活性を調節する方法に関し、該
方法は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分の活性を調節する
のに十分な時間および条件でもって、薬剤の有効量を該哺乳動物に投与すること
を含む。

【０００９】本発明の別の態様は、哺乳動物における接着分子発現を調節する方法に関し、
該方法は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分の活性を調節す
るのに十分な時間および条件でもって、薬剤の有効量を該哺乳動物に投与するこ
とを含む。

【００１０】本発明のさらに別の態様は哺乳動物における接着分子発現を調節する方法を提
供し、該方法は、スフィンゴシンキナーゼおよび/またはＳｐｈ−１−Ｐの１つまたは両方の活性を調節するのに十分な時間および条件でもって、薬剤の有効量
を該哺乳動物に投与することを含む。

【００１１】本発明のさらに別の態様は、哺乳動物における内皮細胞接着分子発現を調節す
る方法に関し、該方法は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分
の活性を調節するのに十分な時間および条件でもって、薬剤の有効量を該哺乳動
物に投与することを含む。

【００１２】本発明のさらに別の態様は、哺乳動物における内皮細胞接着分子発現を下方調
整する方法を提供し、該方法は、スフィンゴシンキナーゼおよび/またはＳｐｈ −１−Ｐの１つまたは両方の活性を調節するのに十分な時間および条件でもって
、薬剤の有効量を該哺乳動物に投与することを含む。

【００１３】本発明のさらに別の態様は哺乳動物における接着分子発現を調節する方法に関
し、該方法は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分またはその
機能的等価物の有効量を該哺乳動物に投与することを含む。

【００１４】本発明のさらに別の態様は炎症メカニズムを含む疾患状態を治療または予防す
る方法に関し、該方法は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分
の活性を調節するのに十分な時間および条件でもって、薬剤の有効量を該哺乳動
物に投与することを含む。情報伝達経路において該調節は接着分子発現をもたら
す。

【００１５】本発明のさらに別の態様は、冠状心疾患を示す哺乳動物を処置する方法を提供
し、該方法は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分を下方調整
するのに十分な時間と条件で薬剤の有効量を該哺乳動物に投与することを含む。
情報伝達経路において、該下方調整は内皮細胞接着分子発現の下方調整をもたら
す。

【００１６】本発明のさらに別の態様は、炎症メカニズムを含む疾患状態を治療または予防
する方法を提供し、該方法は、該哺乳動物にスフィンゴシンキナーゼ情報伝達経
路の１以上の成分またはその機能的等価物を投与することを含む。

【００１７】本発明のさらに別の態様は、哺乳動物のおける接着分子発現を調節する医薬の
製造において、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分の活性を調
節し得る薬剤を使用することに関する。

【００１８】本発明のさらに別の態様は、哺乳動物のおける接着分子発現を調節する医薬の
製造において、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分またはその
機能的等価物を使用することに関する。

【００１９】本発明のさらに別の態様は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の
成分の調節において用いる薬剤に関する。情報伝達経路では該成分が接着分子発
現を調節する。

【００２０】本発明のさらに別の態様は、哺乳動物における接着分子発現を調節するのに用
いるスフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分またその機能的等価物
に関する。

【００２１】本発明のさらに別の態様は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の
成分を調節し得る薬剤、および１以上の薬学的に許容される担体および／または
希釈剤を含む医薬組成物に関する。情報伝達経路では該調節が接着分子発現の調
節をもたらす。

【００２２】本発明のさらに別の態様は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の
成分またその機能的等価物、および１以上の薬学的に許容される担体および／ま
たは希釈剤を含む医薬組成物に関する。

【００２３】本発明の別の態様は、脂質に構造的または機能的に反応性の分析物を検出する
方法に関する。該方法は次のいずれかを、（ｉ）分析物が放射標識された該分析物；または（ii）該分析物とレポーター分子が放射標識されたレポーター分子、該分析物
は該レポーター分子と同時にまたは別個に該脂質と接触させられる；該脂質とシンチラントの存在下に、脂質放射標識複合体が該シンチラントを形成
し励起するのに十分な時間および条件で接触せしめ、該励起シンチラントを検出
する工程を含む。

【００２４】本発明の別の態様は、スフィンゴシンに構造的または機能的に反応性の分析物
を検出する方法に関する。該方法は次のいずれかを、（ｉ）分析物が放射標識された該分析物；または（ii）該分析物とレポーター分子が放射標識されたレポーター分子、該分析物
は該レポーター分子と同時にまたは別個に該脂質と接触させられる；該スフィンゴシンとシンチラントの存在下に、スフィンゴシン放射標識複合体が
該シンチラントを形成し励起するのに十分な時間および条件で接触せしめ、該励
起シンチラントを検出する工程を含む。

【００２５】本発明の別の態様は、スフィンゴシンキナーゼ活性を示す分析物検出する方法
に関する。該方法は、該分析物および³³Ｐ−ＡＴＰとスフィンゴシンとをシンチ
ラントの存在下に接触せしめる工程を含む。該分析物は該³³Ｐ−ＡＴＰと同時に
または別個に該スフィンゴシンに、³³Ｐスフィンゴシン複合体が該シンチラント
を形成し励起するのに十分な時間と条件で接触せしめ、該励起シンチラントを検
出する。

【００２６】（図面の簡単な説明）図１は、接着タンパク質ＶＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンの腫瘍壊死因子（
ＴＮＦ）調節誘導に対する高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の効果を示すグラフ
である。平均蛍光強度は、細胞表面の接着分子の発現強度を表わすフローサイト
メーター測定である。

【００２７】図２は、接着タンパク質発現に対するスフィンゴシンキナーゼ阻害剤の効果を
示すグラフである。細胞表面発現の強度は、ＴＮＦの１００Ｕにより起された平
均蛍光強度の％として測定された。図２Ａの黒印は、接着タンパク質に対する細
胞透過性セラミド（Ｃ２−セラミド）の作用を表わす。白印は１００Ｕ／ｍｌ
ＴＮＦの存在でのセラミドの作用を表わす。図２Ｂはスフィンゴシン−１−ホス
フェート（Ｓｐｈ−１−Ｐ）の作用を示す。図２Ｃは、ＴＮＦまたはＳｐｈ−１
−Ｐにより起された接着タンパク質発現（ＭＦＩ）に対するジメチルスフィンゴ
シン（ＤＭＳ）の効果を示す。図２Ｄは、Ｅ−セレクチンｍＲＮＡに対するこれ
らの薬剤の作用を示す。

【００２８】図３は、スフィンゴシン経路の主要成分に対するＨＵＶＥＣのＴＮＦ処理後の
時間的変化を示すグラフである。白丸は、図３Ａではスフィンゴシンの加水分解
を、図３Ｂではセラミドの生成を、図３Ｃではスフィンゴシンキナーゼ活性を、
図３Ｄではスフィンゴシン−１−ホスフェートの形成を表わし、すべて時間０か
らの％である。黒丸は、ＨＤＬでＨＵＶＥＣを前処置した作用を示す。

【００２９】図４は、ＥＲＫ（図４Ａ）およびＮＦ−κＢ（図４Ｂ）の生成に対するＳｐｈ
−１−Ｐ、ＴＮＦおよびＨＤＬの作用についての写真表示である。棒グラフは、
ＥＲＫ活性化に対する３つの独立の実験の要約である。（±ＳＥＭ）。＊はＴＮ
Ｆとの差異についてのｐ値を＜０．０１で、†は＜０．０５で、‡は無に対する
ｐ＜０．０１を表わす。図４Ｂの上部はＮＦ−κＢによるゲル遅速化を示す。図
４Ｂの下部は、ＮＦ−κＢのｐ５０およびｐ６５成分に特異的な抗体のスーパー
シフトを示し、ＴＮＦおよびＳｐｈ−１−Ｐにより促進されたＮＦ−κＢの類似
の組成を示す。

【００３０】図５は、ＨＤＬがＴＮＦ−α誘導の接着タンパク質発現を阻害するスフィンゴ
シンキナーゼ経路についての模式図である。

【００３１】図６は、スフィンゴシンキナーゼ活性の多ウェルアッセイについての模式図で
ある。アッセイの基本は、多ウェルプレートの壁に吸収により結合したスフィン
ゴシンのリン酸エステル化である。プレートでは壁がシンチラントで満たされて
いる（Flashplates, New England Nuclear）。γ−³³Ｐ標識ＡＴＰを酵素源の存
在でインキュベートする。活性酵素が存在すると³³Ｐはスフィンゴシンに移行す
る。ウェルを洗い、未結合³³Ｐを除去する。スフィンゴシンに結合した³³Ｐはシ
ンチラントを励起し、シンチレーション計数器で測定される信号が生じる。

【００３２】図７は、スフィンゴシンキナーゼ活性が多ウェルアッセイで測定したときに４
００分まで直線状であることを示すグラフである。５０μｌの内皮細胞抽出物（
実施例８に記載のようにつくり、スフィンゴシンキナーゼ活性を有する）および
５０μｌのＡＴＰ溶液（４００μＭＡＴＰ／２０μＣｉ／ｍｌ ³³Ｐ−ＡＴＰ
含有）を、リン脂質混合でコートしたフラッシュプレートと共に、スフィンゴシ
ンあり（黒四角）またはスフィンゴシンなし（白四角）で、インキュベートし、
そして洗滌前の表示時間で３７℃でインキュベートした。

【００３３】図８は、スフィンゴシンキナーゼ活性について各組織毎に示すグラフである。
５０μｌの抽出物からの高速“上澄”（白棒）および“ペレット”（黒棒）フラ
クションをスフィンゴシンキナーゼ活性についてアッセイした。

【００３４】（好ましい実施態様についての詳細な説明）本発明の１つの態様は、哺乳動物における細胞活性を調節する方法に関し、該
方法は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分の活性を調節する
のに十分な時間および条件でもって、薬剤の有効量を該哺乳動物に投与すること
を含む。

【００３５】用語“哺乳動物”は、ヒト、霊長類、家畜（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ
、ヤギ）、実験用動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット）、愛玩動
物（例えば、イヌ、ネコ）、捕獲野生動物（例えばカンガルー、シカ、キツネ）
であって、好ましくは、哺乳動物はヒトまたは実験用動物である。さらに好まし
くは、哺乳動物はヒトである。

【００３６】 “細胞活性を調節する”とは、細胞が行い得る活性の１以上を上方調整、下方
調整あるいは変化せしめることを意味する。活性には、限定でないが、１以上の
ケモカイン産生、サイトカイン産生、酸化窒素シンテアーゼ産生、接着分子発現
および他の炎症調節物の産生などがある。好ましくは、該細胞活性は接着分子発
現である。接着分子発現についての以下の言及は、他の細胞活性についての言及
を含むと読まれるべきである。

【００３７】本発明の１つの態様は、哺乳動物における接着分子発現を調節する方法に関し
、該方法は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分の活性を調節
するのに十分な時間および条件でもって、薬剤の有効量を該哺乳動物に投与する
ことを含む。

【００３８】用語“発現”とは、ポリペプチドの合成をもたらす核酸分子の転写および翻訳
を意味する。

【００３９】 “接着分子”とは、細胞の、他の細胞または細胞外マトリックスタンパク質な
どのタンパク質との結合を調節する分子を意味すると理解されるべきである。接
着分子の例には、限定ではないが、インテグリン、セレクチン（例えばＥ−セレ
クチン、Ｐ−セレクチン）、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバ
ー（例えばＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１）およびＣＤ４４がある。

【００４０】スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路成分の“活性”を調節するとは、該成分
が行い得る機能を調節することを意味する。該機能には、限定ではないが、ある
成分が行う役割また程度を増加または低下すること、またはある成分が行う機能
の性質を修飾することが含まれる。該“活性”の調節には、ある成分の濃度を増
加または低下することも含まれると理解されるべきである。該“活性”の調節は
下記によって達成される。（ｉ）基質（例えばスフィンゴシンまたはＡＴＰ）との競合によるスフィンゴ
シンキナーゼの触媒的活性の調節；（ii）アロステリック・メカニズムによるスフィンゴシンキナーゼの触媒活性
での干渉（基質結合部位以外の分子上の部位との結合）；（iii）次のことを変えるなどによる酵素活性化での干渉： −リン酸エステル化などの翻訳後共有結合修飾、脂質修飾 −タンパク質、脂質またはイオンなどの必要コアクチベーターとの非共有結
合 −酵素の細胞レベル下での局在。

【００４１】 “スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路”とは、スフィンゴシンキナーゼおよ
び／またはスフィンゴシン−１−ホスフェートの１つまたは両方を利用する情報
伝達経路を意味する。本発明を１つの理論または作用機序に限定するものではな
いが、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路は接着分子発現をもたらすカスケー
ドであると考えられ、次の形態をとり得る。（ｉ）Ｓ．Ｍａｓｅ活性を介してのスフィンゴミエリンからのセラミドの生成
、該セラミドはスフィンゴシンに変わる；（ii）スフィンゴシンキナーゼの促進によるスフィンゴシン−１−ホスフェー
ト（以下、“Ｓｐｈ−１−Ｐ”と表示する）生成：（iii）Ｓｐｈ−１−Ｐ生成の下流でのＭＥＫ／ＥＲＫの活性化および核転座、該下流での現象は接着分子発現に導く。

【００４２】用語“成分”は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路カスケードに関与する
、または関与し得るすべての分子を意味すると理解されるべきである。この分子
には、限定でないが、細胞タンパク質、代謝体（例えば、スフィンゴミエリン、
セラミッド、スフィンゴシン、Ｓｐｈ−１−Ｐ）、キナーゼ類（例えば、Ｓ．Ｍ
ａｓｅ、スフィンゴシンキナーゼ、タンパク質キナーゼＣおよびＥＲＫ）および
転写因子（例えば、ＮＦ−κＢ）がある。好ましくは、該成分はスフィンゴシン
キナーゼおよび／またはＳｐｈ−１−Ｐである。

【００４３】本発明の好ましい実施態様により、哺乳動物における接着分子発現を調節する
方法が提供される。該方法は、スフィンゴシンキナーゼおよび/またはＳｐｈ− １−Ｐの１つまたは両方の活性を調節するのに十分な時間および条件でもって、
薬剤の有効量を該哺乳動物に投与することを含む。

【００４４】多くの疾患状態での主要現象は、炎症に導く活性などの細胞活性の上方調整で
ある。例えば、サイトカイン、ケモカイン、ｅＮＯＳなどの炎症メディエーター
産生の上方調整であり、接着分子発現の上方調整である。該上方調整は多くの刺
激物により誘導され得る。刺激物には、例えば、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ）や
インターロイキン−１（ＩＬ−１）などの炎症サトイキン、エンドトキシン、酸
化または修飾脂質、放射または組織損傷が含まれる。好ましい態様において該細
胞活性は内皮細胞活性である。

【００４５】本発明の１つ態様は、哺乳動物における内皮細胞接着分子発現を調節する方法
に関し、該方法は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分の活性
を調節するのに十分な時間および条件でもって、薬剤の有効量を該哺乳動物に投
与することを含む。最も好ましい成分はスフィンゴシンキナーゼおよび／または
Ｓｐｈ−１−Ｐである。

【００４６】スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路に関与する成分の大部分がある種の細胞
活性に刺激性であるが、阻害性情報伝達成分も明らかである。例えば、Ｓｐｈ−
１−Ｐはスフィンゴシンからスフィンゴシンキナーゼによって生成される。内皮
細胞の刺激は、接着分子発現の上方調整に導く細胞性基質スフィンゴシンキナー
ゼ活性の迅速かつ一時的な増加をおこす。Ｓｐｈ−１−Ｐ産生はスフィンゴシン
キナーゼ活性に平行して誘導される。しかし、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達
経路の阻害性成分は接着分子発現の阻害をもたらす。スフィンゴシンキナーゼ情
報伝達経路の１以上の成分の活性に関する用語“調節”は、該活性の上方調整ま
たは下方調整あるいは変化を意味する。好ましい方法は、スフィンゴシンキナー
ゼ情報伝達経路活性の下方調整であって、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路
の１以上の刺激成分の活性を阻害または低下するか、または該経路の１以上の阻
害成分の活性を上方調整することにより行われる。しかし、接着分子発現を上方
調整する該成分の活性の調節は、ある種の状況において望ましい。最も好ましく
は、該刺激成分の生物活性が下方調整される。

【００４７】この最も好ましい実施態様により、哺乳動物における内皮細胞接着分子発現を
下方調整する方法が提供される。この方法は、スフィンゴシンキナーゼおよび／
またはＳｐｈ−１−Ｐの１つまたは両方の活性を下方調整するのに十分な時間ま
たは条件で、薬剤の有効量を該哺乳動物に投与することを含む。

【００４８】薬剤の哺乳動物への投与による該活性の調節は、いくつかの技法の１つによっ
て達成される。この技法には、限定ではないが、該哺乳動物にタンパク様または
非タンパク様分子を導入することが含まれる。この分子は、（ｉ）該成分の合成を調節する；（ii）該成分に対するアンタゴニストとして機能する；（iii）該成分に対するアゴニストとして機能する。

【００４９】該タンパク様分子は、融合タンパク質、または、例えば天然産物スクリーニン
グを含む天然、組み換えまたは合成源から誘導される。該非タンパク様分子は、
例えば天然産物スクリーニングなどの天然源からの誘導されるか、または化学的
に合成される。本発明は、該成分のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用
し得る該成分の化学類似体を含む。化学アゴニストは、該成分から必ずしも誘導
されることを要しないが、一定の立体配座の類似性を共有する。また、化学アゴ
ニストは特殊に設計されて該成分の特定の物理化学的性質に類似する。アンタゴ
ニストは、該成分を遮断しまたは阻害し得るか、または該成分の正常な機能の発
揮を防止し得るかする化学物である。アンタゴニストには、該成分またはその部
分に特異的なモノクロナール抗体および哺乳動物細胞中の遺伝子またはｍＲＮＡ
の転写または翻訳を防止するアンチセンス核酸が含まれる。

【００５０】本発明方法の例として高密度リポタンパク質（“ＨＳＬ”と表示する）の利用
がある。ＨＤＬでの内皮細胞の処置は、ＴＮＦの誘導スフィンゴシンキナーゼ活
性化の増幅および期間の両方を阻害する。ＨＤＬ処置は、スフィンゴシンキナー
ゼ活性の阻害により、Ｓｐｈ−１−Ｐ形成の増幅および期間を実質的に鈍化する
。Ｓｐｈ−１−Ｐ形成の阻害は、ＭＥＫ／ＥＲＫ活性化およびＮＦ−κＢ核転座
の鈍化を含む下流経路現象の鈍化をもたらして、接着タンパク質発現を低下する
。同様に、Ｎ、Ｎ−ジメチルスフィンゴシンは、ＴＮＦ−α誘導接着タンパク質
発現およびｍＲＮＡレベルを、スフィンゴシンキナーゼ活性の競合的阻害により
低下する。この点でのスフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の遮断は、細胞内Ｓ
ｐｈ−１−Ｐの下流形成を妨げて、接着タンパク質発現に導くＭＥＫ／ＥＲＫお
よびＮＦ−κＢのさらなる下流現象を防止する。

【００５１】この最も好ましい実施態様により、哺乳動物における内皮細胞接着分子発現を
下方調整する方法が提供される。この方法は、スフィンゴシンキナーゼの活性を
下方調整するのに十分な時間または条件で、ＨＤＬの有効量を該哺乳動物に投与
することを含む。

【００５２】 “有効量”とは、望む応答を少なくとも部分的にでも得るために、または接着
分子発現の開始を遅らすまたは進行を阻害する、または開始や進行を停止するた
めに必要な量を意味する。この量は、処置されるべき個体の健康および生理条件
、処置されるべき個体の系統学的グループ、医学状態の評価および他の関連因子
によって変わる。量は日常の試験を通して決定できる比較的広い範囲にあること
が期待される。

【００５３】細胞接着分子発現の調節は、１以上のスフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路成
分またはその機能的等価物を投与することにより達成される。

【００５４】この最も好ましい実施態様により、哺乳動物における内皮細胞接着分子発現を
下方調整する方法が提供される。この方法は、スフィンゴシンキナーゼおよび／
またはＳｐｈ−１−Ｐの１つまたは両方の活性を該哺乳動物に投与することを含
む。

【００５５】用語“機能的等価物”とは、限定ではないが、該成分の機能的活性を有する誘
導体を含む。

【００５６】誘導体は、天然、合成、融合タンパク質を含む組換え源からの、断片、部分、
部分体、化学的等価物、変異体、同族体、模倣体を含む。誘導体はアミノ酸の挿
入、欠失また置換から誘導され得る。アミノ酸挿入誘導は、アミノおよび／また
はカルボキシル末端融合、および単一または複数のアミノ酸の配列内挿入を含む
。挿入アミノ酸配列の異型は、１以上のアミノ酸残基がタンパク質内の前もって
決定した部位に導入されたものである。なお、ランダムな挿入も得た産物の適当
なスクリーニングでもって可能である。欠失異型は配列から１以上のアミノ酸を
除去することを特徴とする。置換的アミノ酸異型は、配列中の少なくとも１つの
残基が除去され、その位置に別の残基が挿入されたものである。アミノ酸配列へ
の追加は、他のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質との融合を含む。

【００５７】該成分の誘導体は、ペプチド、ポリペプチド、または他のタンパク様または非
タンパク様分子と融合した完全な成分の特定のエピトープまたは部位を有する断
片を含む。例えば、該成分またはその誘導体は、ある分子と融合して、その細胞
への挿入が容易になる。該成分の類似体には、限定でないが、側鎖の修飾、ペプ
チド、ポリペプチドまたはタンパク質合成時の非天然アミノ酸および／またはそ
の誘導体の合体、架橋剤の使用、タンパク様分子またはその類似体に対し配座拘
束を課す方法などがある。核酸配列の誘導体は、同様に単一または複数のヌクレ
オチド置換、欠失および／または付加から誘導される（他の核酸分子との融合を
含む）。本発明の核酸分子の誘導体には、オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマ
ー、アンチセンス分子および核酸分子の共抑制および融合に用いられる分子があ
る。

【００５８】本発明における側鎖修飾の例には、アミノ基の修飾がある。例えばアルデヒド
との反応に続くＮａＢＨ₄でに還元による還元的アルキル化；メチルアセチミデートによるアミジン化；酢酸無水物によるアシル化；シアネートによるアミノ基
のカルバモイル化；２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）に
よるアミノ基のトリニトロベンジル化；コハク酸無水物およびテトラヒドロフタ
ル酸無水物によるアミノ基のアシル化；およびピリドキサル−５−ホスフェート
によるリジンのピリドキシル化と続くＮａＢＨ₄での還元である。

【００５９】アルギニンのグアニジン基は、２，３−ブタネジオン、フェニルグリオキサル
およびグリオキサルなどの試薬での異項環縮合産物の形成によって修飾される。

【００６０】カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソウレア形成を介するカルボジイミド活性化
続く対応アミドなどへの誘導化によって修飾される。

【００６１】スルフィドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシ
メチル化、システイック酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物での混合ジスル
フィドの形成；マレイミド、マレイン酸無水物または他の置換マレイミドとの反
応；４−クロロマーキュリベンゾエート、４−クロロマーキュリフェニルスルホ
ン酸、フェニルマーキュリクロライド、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェ
ノールなどの水銀化合物を用いた水銀誘導体の形成；アルカリ性ｐＨでのシアネ
ートによるカルバモイル化などの方法によって修飾される。

【００６２】トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロモサクシンイミドによる酸化、また
は２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロマイドまたはスルフェニルハライド
によるインドール環のアルキル化で修飾される。他方、チロシン残基は、テトラ
ニトロメタンによるニトロ化で変えられて、３−ニトロチロシン誘導体を形成す
る。

【００６３】ヒスチジン残基のイミダゾール環は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化また
はジエチルピロカルボネートによるＮ−カルボエトキシル化で修飾される。

【００６４】タンパク質合成の間に組み込む非天然アミノ酸および誘導体の例には、制限す
るわけではないが、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキ
シ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノ
ルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−アミノー３−ヒド
ロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸
のＤ−異性体の使用が含まれる。考えられる非天然のアミノ酸のリストを表１に
示す。

【００６５】

【表１】表１

【００６６】

【表２】（表１の続き）

【００６７】

【表３】（表１の続き）

【００６８】

【表４】（表１の続き）

【００６９】

【表５】（表１の続き）

【００７０】

【表６】（表１の続き）

【００７１】

【表７】（表１の続き）

【００７２】

【表８】（表１の続き）

【００７３】

【表９】（表１の続き）

【００７４】架橋化剤が、例えば３Ｄ立体配座を安定化するのに用いられる。用いるホモ−
二官能性架橋化剤には、（ＣＨ₂）_nスペーサー基（ｎ＝１からｎ＝６）を有する
二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシサクシュイミド
エステル、およびＮ−ヒドロキシサクシニイミドなどのアミノ活性部分とマレイ
ミドまたはジチオ部分（ＳＨ）またはカルボジイミド（ＣＯＯＨ）などの他の特
異的活性部分を通常含有するヘテロ二官能性試薬などがある。さらに、ペプチド
の配座的拘束が、例えば、Ｃ_αおよびＮ_α−メチルアミノ酸の組みこみ、アミノ
酸のＣ_αとＣ_βの原子間への二重結合の導入、およびＮ末とＣ末との間、２つの
側鎖の間または側鎖とＮ末またＣ末との間にアミノ結合を形成するなどの共有結
合の導入によってなされる。

【００７５】本発明は、ヒト疾患状態に関して有用である。例えば、本発明が特に有用なの
は、限定ではないが、冠状心疾患などの炎症メカニズムを含む疾患状態の予防ま
たは治療としての使用である。

【００７６】本発明の他の態様は、哺乳動物における炎症メカニズムを含む疾患状態の治療
および予防の方法に関し、該方法は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１
以上の成分の活性を調節するのに十分な時間および条件でもって、薬剤の有効量
を該哺乳動物に投与することを含む。情報伝達経路において、該調節は接着分子
発現の調節をもたらす。

【００７７】該接着分子発現の好ましい調節は、内皮細胞接着分子発現の調節である。より
好ましくは、該成分がスフィンゴシンキナーゼおよび／またはＳｐｈ−１−Ｐで
ある。最も好ましくは、該成分は下方調整され、該下方調整が接着分子発現の下
方調整をもたらすことである。

【００７８】本発明の最も好ましい実施態様において、冠状心疾患を示す哺乳動物を処置す
る方法が提供される。該方法は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上
の成分の活性を下方調整するのに十分な時間と条件で、薬剤の有効量を該哺乳動
物に投与することを含む。情報伝達経路において、該下方調整は内皮細胞接着分
子発現の下方調整をもたらす。最も好ましくは、該成分がスフィンゴシンキナー
ゼおよび／またはＳｐｈ−１−Ｐである。

【００７９】本発明のさらに別の態様は、炎症メカニズムを含む疾患状態を治療または予防
する方法を提供し、該方法は、該哺乳動物にスフィンゴシンキナーゼ情報伝達経
路の１以上の成分またはその機能的等価物を投与することを含む。情報伝達経路
において、該調節は接着分子発現の調節をもたらす。

【００８０】薬剤または成分またはこれらの機能的等価物の投与は、医薬組成物の形態で、
通常の手段によってなされる。医薬組成物の薬剤または成分またはこれらの機能
的等価物は、特定の事例に依存した量で投与されたときに、治療的活性を発揮す
る。この量は、例えば、ヒトか動物か、および選択した薬剤によって変わる。広
い範囲の用量が適用できる。１人の患者で考えると、薬剤または成分またはこれ
らの機能的等価物の約０．１ｍｇから約１ｍｇが１日当り体重ｋｇにつき投与し
得る。用量は、最適の医学的応答を提供するように調整される。例えば、日、週
、月または適当な時間間隙で分割用量を投与することができ、また用量は状態の
必要性に応じて減少され得る。薬剤または成分またはこれらの機能的等価物は、
通常の方法で投与され得る。それには、経口、静注（水溶性の場合）、腹腔内、
筋肉内、皮下、皮内、坐剤、植込み（例えば、徐放分子を用いる）がある。薬剤
または成分またはこれらの機能的等価物の使用の具体例として、薬剤または成分
またはこれらの機能的等価物が薬学的に許容される非毒性塩の形態で投与され得
る。この塩には、酸付加塩または亜鉛や鉄など（本適用の目的のための塩として
考えられるもの）との金属複合体がある。このような塩付加塩の例としては、塩
酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、
安息香酸塩、酒石酸塩、マロン酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩などがある
。活性成分が錠剤の型で投与されるときは、錠剤は、トラガント、トウモロコシ
デンプンまたはゼラチンなどの結合剤；アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸
マグネシウムなどの滑沢剤を含む。

【００８１】本発明の好ましい実施態様において、方法に用いられる薬剤は、冠状内皮細胞
に特異的な抗体に連結しており、該薬剤をこれらの細胞に特異的に運送し得る。

【００８２】本発明のさらに別の態様は、哺乳動物のおける接着分子発現を調節する医薬の
製造において、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分の活性を調
節し得る薬剤を使用することに関する。

【００８３】該接着分子発現の好ましい調節は、内皮細胞接着分子発現の調節である。より
好ましくは、該成分がスフィンゴシンキナーゼおよび／またはＳｐｈ−１−Ｐで
ある。最も好ましくは、該成分は下方調整され、該下方調整が接着分子発現の下
方調整をもたらすことである。

【００８４】本発明の別の態様は、哺乳動物での接着分子発現を調節するための医薬の製造
においてスフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分またはその機能的
な等価物を使用することに関する。

【００８５】本発明のさらに別の態様は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の
成分の調節において用いる薬剤に関する。情報伝達経路では該成分が接着分子発
現を調節する。

【００８６】該接着分子発現の好ましい調節は、内皮細胞接着分子発現の調節である。より
好ましくは、該成分がスフィンゴシンキナーゼおよび／またはＳｐｈ−１−Ｐで
ある。最も好ましくは、該成分は下方調整され、該下方調整が接着分子発現の下
方調整をもたらすことである。

【００８７】本発明のさらに別の態様は、哺乳動物における接着分子発現を調節するのに用
いるスフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分またその機能的等価物
に関する。

【００８８】本発明のさらに別の態様は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の
成分を調節し得る薬剤、および１以上の薬学的に許容される担体および／または
希釈剤を含む医薬組成物に関する。情報伝達経路では該調節が接着分子発現の調
節をもたらす。

【００８９】本発明のさらに別の態様は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の
成分またその機能的等価物および１以上の薬学的に許容される担体および／また
は希釈剤を含む医薬組成物に関する。

【００９０】適切な薬学的形態には、注射液としての使用では無菌の水溶液(水溶性の場合)
または分散物および無菌の注射液または分散物の即席製造のための無菌粉末が含
まれ、クリームまたは局所適用では他の形態でもあり得る。これらの形態は、製
造および保管の条件下において安定であり、細菌および菌類などの微生物による
汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポ
リオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)、その適切な混合物および植物性油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分
散物の場合には必要な粒子サイズの維持、および表面活性剤の使用によって保持
され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パ
ラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによっ
てもたらされる。多くの場合、等張剤、例えば糖類または塩化ナトリウムを含む
のが好ましい。注射用組成物の長期間吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、
モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの組成物で使用することによ
りもたらされる。

【００９１】無菌注射液は、必要量の活性化合物を適切な溶媒に上記した他の種々の成分と
ともに加え、必要により濾過殺菌することにより製造される。一般的に、分散物
は種々の無菌活性成分を無菌媒体に加えることにより製造される。無菌媒体は、
塩基性の分散媒および上記の必要な他の成分を含む。無菌注射液の製造のための
無菌粉末の場合、好ましい製造方法は真空乾燥法および凍結乾燥法であり、この
方法により活性成分の粉末および所望の付加成分が、前に殺菌濾過したそれらの
溶液から得られる。

【００９２】活性成分は、適切に保護される場合、例えば非活性希釈剤または吸収可能な食
用担体と共に、または硬または軟カプセルに封入され、または錠剤に圧縮して、
または食材に直接加えられて、経口投与される。経口治療投与のために、活性化
合物は、賦形剤と共に、錠剤、舌下錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁
液、シロップ、ウエハースなどの形態で使用される。このような組成物および製
剤は、少なくとも１重量％の活性化合物を含有する。組成物および製剤の割合は
、もちろん、変動し得、重量単位の約５−約８０％の間にあるのが都合よい。こ
のような治療に有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な用量が得られるよう
な量である。本発明において好ましい組成物または製剤は、経口用量単位形態が
約０.１μgから２０００mgの活性化合物を含有するように製造される。

【００９３】錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなどは、以下に挙げるような構成成分を含有
し得る：ゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合
剤；ジカルシウムホスフェートなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイ
モデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤
；およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤が加えられ、ペ
パーミント、冬緑油またはサクランボ香料などの香味剤が加えられる。用量単位
形態がカプセルの場合、上記の型の物質に加えて液体担体を含有し得る。種々の
他の物質は、コーティングとして、またはそうでなければ用量単位の物理的形態
を変更するために存在する。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセルは、シェラッ
ク、糖または両方でコートされ得る。シロップまたはエリキシルは、活性化合物
、甘味剤としてスクロース、防腐剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベ
ン、サクランボまたはオレンジ風味などの着色剤および香料を含有し得る。もち
ろん、いかなる用量単位形態を製造するのに使用されるいかなる物質も、薬学的
に純粋であり、使用される量において実質的に非毒性である。さらに、活性化合
物は、徐放性製剤にし得る。

【００９４】医薬組成物はまた、標的細胞を形質移入し得るベクターなどの遺伝分子を含み
得る。ベクターはスフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の成分の発現を調節し得
る核酸分子を該標的細胞に運搬する。ベクターは、例えば、ウイルス性ベクター
であり得る。

【００９５】本発明方法で用いるのに適した薬剤の同定を容易にするために、本発明者は、
脂質に構造的または機能的に反応性の薬剤を選別するための、高速で簡易の高容
量アッセイを開発した。本発明方法で用いる薬剤を同定する意味において、この
アッセイは、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の成分に類似するか、または
スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の成分に対するアゴニストまたはアンタゴ
ニストとして作用する薬剤を簡易かつ迅速に同定する手段を提供する。

【００９６】本発明の別の態様は、脂質に構造的または機能的に反応性の分析物を検出する
方法を提供する。該方法は次のいずれかを、（ｉ）分析物が放射標識された該分析物；または（ii）該分析物とレポーター分子が放射標識されたレポーター分子、該分析物
とは該レポーター分子と同時にまたは別個に該脂質と接触させられる；該脂質とシンチラントの存在下に、脂質放射標識複合体が該シンチラントを形成
し励起するのに十分な時間および条件で接触せしめ、該励起シンチラントを検出
する工程を含む。

【００９７】好ましくは、該分子または分子およびレポーター分子が脂質および固体支持体
と結合したシンチラントに接触される。

【００９８】 “脂質”は、脂質成分を含むすべての分子を意味すると理解されるべきである
。好ましくは、該脂質は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の脂質成分であ
り、より好ましくはスフィンゴシンである。本発明のこの態様は本明細書中スフ
ィンゴシンで例示されるが、本発明の適用において限定を課すものと理解されて
はならない。

【００９９】本発明の別の態様は、スフィンゴシンに構造的または機能的に活性である分析
物を検出する方法に関する。該方法は次のいずれかを、（ｉ）分析物が放射標識された該分析物；または（ii）該分析物とレポーター分子が放射標識されたレポーター分子、該分析物
は該レポーター分子と同時にまたは別個に該脂質と接触させられる；該スフィンゴシンとシンチラントの存在下に、スフィンゴシン放射標識複合体が
該シンチラントを形成し励起するのに十分な時間および条件で接触せしめ、該励
起シンチラントを検出する工程を含む。

【０１００】好ましくは、該分析物または分析物およびレポーター分子がスフィンゴシンお
よびシンチラントに接触する。スフィンゴシンは、実施例９に記載の方法を用い
て、シンチラントがすでに結合した固体支持体に結合し得る。

【０１０１】脂質に“構造的”に反応性の分子とは、該脂質と結合、連結あるいは連絡する
分子を意味すると理解されるべきである。該連結などは、ペプチド結合、イオン
結合、水素結合または他の相互活性結合メカニズムの形成による。脂質に“機能
的”に反応性の分子とは、該脂質と相互作用したときに、機能的な過程を直接的
または間接的に生じせしめる分子であると理解されるべきである。機能的に反応
性の分析物は、該脂質に構造的に相互作用をすることもあり、しないこともある
。機能的に反応性の分析物の例としては、酵素（例えば、スフィンゴシンキナー
ゼ等価物）、脂質がその基質である酵素（例えば、スフィンゴシンキナーゼ）が
ある。この例において、スフィンゴシンキナーゼ活性を発揮する酵素は、ＡＴＰ
の存在において酵素がスフィンゴシンをリン酸エステル化するのに機能的に反応
性である。構造的または機能的な活性の発生は、本発明のこの態様方法で検出さ
れる。

【０１０２】構造的または機能的な反応性の検出は、脂質による放射標識複合体の形成に基
づく。シンチラントとの複合放射標識の近接性により、シンチラントが励起する
。

【０１０３】アッセイされる分析物は直接的に放射標識され得る。これが有用なのは、例え
ば、該分析物が該脂質と直接結合する場合である。あるいは、レポーター分子が
放射標識される。“レポーター分子”とは、分析物と脂質との間の反応性を検出
するすべての分子（分析物以外）を意味すると理解されるべきである。例えば、
レポーター分子は、望む分析物の表面に存在する１以上のエピトープを認識する
抗体であり得る。この検出方法は、“サンドウィッチアッセイ”と普通言われて
いる間接的な検出方法である。あるいは、レポーター分子は、検出を容易にする
のに加えて、分析物と脂質との間（例えば、レポーター分子は基質となり得る）
の反応性を容易にするのに要する分子であり得る。例示した方法において、レポ
ーター分子は³³Ｐ−ＡＴＰである。スフィンゴシンキナーゼ活性を示す分析物は
、³³Ｐ−ＡＴＰの存在下でスフィンゴシンをリン酸エステル化し、³³Ｐのスフィ
ンゴシンへの結合をもたらす。ホスフェートレポーター分子が存在しないと、分
析物は脂質をリン酸エステル化できない。さらに、分析物が検出を容易にするの
に十分に脂質と構造的に相互作用しないので、機能的反応性の検出方法は、放射
標識ホスフェートでの脂質のリン酸エステル化に基づく。

【０１０４】分析物が放射標識され、該分析物が脂質に結合している場合でも、分析物以外
の分子が反応混合物中に存在することが分析物の脂質との反応性を容易にするた
めに必要であり得ると理解されるべきである。

【０１０５】本発明での使用に適した固体支持体には、限定でないが、マイクロタイタープ
レート、９６ウェルプレート、カラムおよびマイクロビートがある。

【０１０６】好ましくは、本発明は、スフィンゴシンキナーゼ活性を示す分析物を検出する
方法を提供する。該方法は、該分析物および³³Ｐ−ＡＴＰをスフィンゴシンにシ
ンチラントの存在で接触せしめる工程を含み、該分析物の該スフィンゴシンとの
接触は、³³Ｐ−ＡＴＰと同時にまたは別個に行なわれ、³³Ｐスフィンゴシン複合
体が該シンチラントを形成し励起するのに十分な時間と条件でなされ、そして該
励起シンチラントが検出される。

【０１０７】好ましくは、該分析物および³³Ｐ−ＡＴＰは、固体支持体に結合したスフィン
ゴシンおよびシンチラントに接触させる。

【０１０８】励起シンチラントの検出は、限定ではないが、シンチレーション計数器を含む
適当な手段で行うことができる。

【０１０９】本発明のこの態様方法でアッセイされる分析物はいかなる適当な形態でもあり
得る。液体状態が特に有用であり、溶解質や均等質などの組織抽出物が有用であ
る。該分析物は、天然、組み換えまたは含成源から誘導されたタンパク様あるい
は非タンパク様の分子であり得る。

【０１１０】別の態様において、本発明は、脂質と構造的または機能的に反応する分析物の
アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する薬剤の検出にまで及ぶと理解さ
れるべきである。例えば、本発明は、スフィンゴシンキナーゼ活性のアゴニスト
またはアンタゴニストを検出するのに有用である。本発明のこの実施態様は、ス
フィンゴシンをスフィンゴシンキナーゼに、強度なアゴニストまたはアンタゴニ
ストの存在下に接触せしめることでなされる。スフィンゴシン放射標識複合体の
形成程度と、このものの添加を行わないコントロールアッセイとを比較するとア
ゴニストまたはアンタゴニスト活性が分かる。特に、コントロールに比してスフ
ィンゴシン³³Ｐ複合体の形成が増加していることは、アンタゴニスト活性の指標
である。本発明のこの態様は、下記した実施態様に限定されていると考えるべき
でない。むしろ、本発明のこの態様は、脂質に構造的または機能的に反応するす
べての分析物のアゴニストまたはアンタゴニストを検出するのに用いられる。

【０１１１】本発明方法において試験するのに適した薬剤に、限定ではないが、化学実験室
から単離された化合物または生物体の醗酵から生じた液がある。

【０１１２】上に詳記した好ましい実施態様において、本発明のこの態様方法での使用に適
したスフィンゴシンキナーゼ源は、限定でないが、（ｉ）哺乳動物組織から誘導
された部分的精製スフィンゴシンキナーゼ、（ii）酵素活性を示す哺乳動物組織
の粗製均質体、（iii）組み換え酵素、（iv）ＨＵＶＥＣ粗製溶解質を含む。

【０１１３】さらに本発明の特徴を下記実施例により詳細に記載する。しかし、この詳細な
説明は、本発明を例示する目的でのみ含まれていると理解されるべきである。上
記した本発明についての広い記述を制限するものと、いかなる程度にも理解され
てはならない。

【０１１４】実施例１ＨＤＬ単離ＨＤＬは、正常健康成人ドナーから、１.０７−１.２１ｇ／mlの密度範囲の連
続的超遠心により単離した。ＨＤＬの得られる調製物は二つの主要な集団を含ん
でいた：一つはストークス径１０.４５nmの粒子(ＨＤＬ₂)および一つは直径８. ６nmの粒子(ＨＤＬ₃)。ＨＤＬ₃の接着分子発現の阻害が、精製Ａｐｏ−Ａ−１お
よび卵ホスファチジルコリンまたはスフィンゴミエリンから精製した天然または
再構築ＨＤＬ粒子により誘導されるものより強いため、ＨＤＬ₃を本実験に使用した。実施例において、異なる対象の血漿におけるＨＤＬ₂とＨＤＬ₃の相対的比
率の変動を起こす作用の可能性を最小化するために、ヒトＨＤＬサブフラクショ
ン(ｄ＝１.１３〜１.２１ｇ／ml)を使用している。図１に示すように、ＨＤＬ₃ は、ヒト臍帯血管内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)によるＶＣＡＭ−１およびＥ−セレクチ
ンのＴＮＦα−誘導発現を、＞８０％まで阻害した。

【０１１５】実施例２スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路方法論ＨＵＶＥＣによるＴＮＦα誘導接着タンパク質発現におけるＨＤＬの作用ＨＵＶＥＣのコンフルエントな単層を、１mg／mlのａｐｏＡ−１濃度でヒト血
漿から１.１３〜１.２１ｇ／mlの密度のフラクションとして単離したＨＤＬ有り
または無しでプレインキュベートした。１６時間プレインキュベーション後に、
細胞をＴＮＦα(１００Ｕ／ml)で処理した。ＴＮＦαの４時間の処理に続き、Ｖ
ＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンの細胞表面発現をフローサイトメトリーを使用
して測定した。

【０１１６】セラミドおよびＳｐｈ−１−Ｐの接着タンパク質発現に対する作用ＨＵＶＥＣを、ＴＮＦα(１００Ｕ／ml)有りまたは無しのＣ₂−セラミドの増加濃度、またはＳｐｈ−１−Ｐの増加濃度で４時間処理した。ＶＣＡＭ−１また
はＥ−セレクチンの細胞表面発現をフローサイトメトリーによって測定した。Ｖ
ＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンの発現に対するスフィンゴシンキナーゼ阻害剤
(ＤＭＳ)の作用。細胞を媒体(Ｎｉｌ)、ＤＭＳ(５μＭ)、Ｓｐｈ−１−Ｐ(５μ Ｍ)、Ｃ₂−セラミド(１０μＭ)またはＴＮＦα(１００Ｕ／ml)で４時間処理し、
次いでＶＣＡＭ−１またはＥ−セレクチン発現を測定した。薬剤のＥ−セレクチ
ンｍＲＮＡレベルに対する作用およびＨＤＬとＤＭＳの作用の比較。４時間の示
した処理の後、Ｅ−セレクチンｍＲＮＡレベルをノーザンブロットアッセイによ
り測定した。(Ｄ)に示す結果は、３つの同様の実験の代表である。

【０１１７】ＴＮＦα誘導スフィンゴミエリン加水分解、セラミド産生、スフィンゴシンキナ
ーゼ活性化およびＳｐｈ−１−Ｐ生産へのＨＤＬの作用ＨＵＶＥＣを[³Ｈ]スフィンゴミエリンで標識し、ＴＮＦα処理の所望の時点で測定した。非標識細胞をＨＤＬおよび／またはＴＮＦαで示すように処理し、
細胞を融解してセラミドレベルおよびスフィンゴシンキナーゼ活性を各々測定し
た。細胞をＳｐｈ−１−Ｐのインビボでの生産の測定のために透過性にした。

【０１１８】ＥＲＫおよびＮＦ−κＢ活性化に対するＨＤＬおよびスフィンゴシンキナーゼ経
路の作用細胞を薬剤で３０分処理した後、ＥＲＫ活性を、基質としての塩基性タンパク
質(ＭＢＰ)と共に、ｐ４２／ｐ４４^MAPKに対する抗体での免疫沈降後にアッセイ
した(Berra et al., 1995; Li et al., 1996; Lee et al., 1997)。キナーゼ反応性産物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離した。ＥＲＫ活性を記
載する棒グラフは、ホスホロイメージャーで定量した。ＮＦ−κＢ結合活性は、
示したように処理３０分後の電気泳動移動性シフトにより測定した。特異的ＮＨ
−κＢ結合複合体は、抗−ｐ５０および抗−ｐ６５抗体とのスーパーシフトゲル
アッセイにより、および５０倍モル過剰の非標識ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチド
の添加による競合分析により同定した。

【０１１９】実施例３スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路接着タンパク質発現におけるスフィンゴ脂質代謝の役割を測定するために、細
胞透過性形のセラミド(Ｃ₂−セラミド)または内因性セラミドを産生するスフィンゴミエリナーゼ、またはＳｐｈ−１−Ｐを内皮細胞に添加した。Ｃ₂−セラミド(図２Ａ)またはスフィンゴミエリナーゼはＥ−セレクチンおよびＶＣＡＭ−１
の不十分な刺激剤であり、ＴＮＦ−αによる刺激の１０％より低いレベルに到達
した。対照的にＳｐｈ−１−ＰはＥ−セレクチンおよびＶＣＡＭ−１の強力で用
量依存的な誘導物質であり、１００Ｕ／ml ＴＮＦαとほぼ同等なレベルに５μ
Ｍで到達した(図２Ｂ)。Ｓｐｈ−１−Ｐの有効性は、更にそのＥ−セレクチン
ｍＲＮＡの誘導により示された(図２Ｄ)。Ｓｐｈ−１−Ｐの役割を試験するため
に、スフィンゴシンキナーゼの競合的阻害剤であるＮ,Ｎ−ジメチルスフィンゴシン(ＤＭＳ)で阻害した。ＤＭＳはＴＮＦ−α誘導接着タンパク質発現およびｍ
ＲＮＡレベルを５０から７０％の間まで減少させた(図２ＣおよびＤ)。これは、
スフィンゴースキナーゼ活性化がＴＮＦ−α作用の重要な事象であることを証明
する。コントロールとして、同じ濃度のＤＭＳが、ＴＮＦ−αまたはＰＭＡによ
り内皮細胞内で誘導されるスフィンゴシンキナーゼ活性およびＳｐｈ−１−Ｐ形
成を＞９０％まで阻害し、ＰＭＡはプロテインキナーゼＣ活性化を介してスフィ
ンゴシンキナーゼを活性化することが示されている(７)。ＴＮＦ−αでのこの作
用と対照的に、ＤＭＳはＳｐｈ−１−Ｐ誘導接着タンパク質発現を防止せず(図２Ｃ)、Ｓｐｈ−１−Ｐの生産におけるＤＭＳの特異的作用を示した。これらの結果は、ＴＮＦ−α誘導接着分子発現に関する新規情報伝達経路を示す。外来細
胞透過性セラミドは、ＴＮＦ−α誘導接着細胞タンパク質の強い阻害剤(＞６０％まで)であった(図２Ａ)。

【０１２０】実施例４スフィンゴシンキナーゼ情報伝達のＨＤＬ阻害図３Ａは、ＨＵＶＥＣのＴＮＦα刺激が、細胞性スフィンゴミエリン含量をコ
ントロールの４０％まで３０分以内に減少させ、２時間までに殆ど基底レベルま
で回復させることを示す。並行して、細胞性セラミドレベルは急速に増加し(約２倍)、ＴＮＦα処理後３０分でピークとなった(図３Ｂ)。内皮細胞のＨＤＬでの処理は強い作用を有した：ＴＮＦα後スフィンゴミエリンレベルの基準レベル
までの回復を送らせ、ＴＮＦα刺激後の増加したセラミドレベルを持続させた。

【０１２１】ＨＵＶＥＣのＴＮＦα刺激は、サイトゾルのスフィンゴシンキナーゼ活性の急
速で一過性の増加をもたらし、基底の最大約１６５±１３％(ｐ＜０.０１)に５分以内で到達した。ＨＤＬ前処理は、ＴＮＦα誘導スフィンゴシンキナーゼ活性
化の振幅および持続時間の両方を非常に阻害した(図３Ｃ)。Ｓｐｈ−１−Ｐの生
産は、スフィンゴシンキナーゼ活性と並行して誘導された。ＨＤＬ処理は、Ｓｐ
ｈ−１−Ｐ形成の振幅および持続時間を再び実質的に鈍らせた(図３Ｄ)。

【０１２２】実施例５ＥＲＫカスケードのＨＤＬ阻害図４Ａは、ＴＮＦαおよびＳｐｈ−１−Ｐの両方がＥＲＫ活性の刺激において
ほぼ等力であったが、一方Ｃ₂−セラミドは刺激しないことを示す。ＤＭＳでの処理は、ＴＮＦα活性化ＥＲＫを５０％(ｐ＜０.０２)まで阻害し、ＴＮＦα活性化ＥＲＫシグナルカスケードにおけるスフィンゴシンキナーゼの役割を示す。
ＨＵＶＥＣのＨＤＬとのプレインキュベーションは、またＴＮＦα刺激ＥＲＫ活
性化を減少させ、Ｓｐｈ−１−Ｐの細胞性レベルの減少への作用と一致する(図４Ａ、棒４)。

【０１２３】実施例６ＮＦ−κＢ活性化のＨＤＬ阻害ＮＦ−κＢ結合活性を測定するために、電気泳動移動性シフトアッセイを行っ
た。核抽出物を、３０分媒体または表示の薬剤で処理したＨＵＶＥＣから調製し
た。これらの実験でプローブとして使用した二本鎖オリゴヌクレオチドは、下線
を引いたＥ−セレクションプロモーターにおけるコンセンサスＮＫ−κＢ結合部
位を含む５'−ＧＧＡＴＧＣＣＡＴＴＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＣＴＧＧＡＴＧＴ−３'(配列番号１)を含んだ。コンセンサスＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドのゲル移動性シフトは、³²Ｐ標識ＮＦ−κＢプローブと４mgの核タンパク
質をインキュベートすることにより行った。ＮＦ−κＢ特異的複合体のＳｐｈ−
１−Ｐ誘導形成はＴＮＦαにより誘導されたものと類似であった。これらの特異
的ＤＮＡ−タンパク質複合体は、５０倍モル過剰の非標識Ｅ−セレクチンＮＦ−
κＢオリゴヌクレオチドの添加により完全に無くなった。ＮＦ−κＢ結合複合体
の特異性は、更にスーパーシフト分析により同定された。抗−ｐ５０および抗−
ｐ６５ポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, CAから購入)を放射標識
ＮＦ−κＢプローブの添加前に添加した。同じ表現型のゲル遅延が、Ｓｐｈ−１
−ＰおよびＴＮＦα−処理細胞の両方からの核抽出物と抗体とのプレインキュベ
ーション後のゲルシフトアッセイにおいて示された。電気泳動移動性シフトアッ
セイは、ＨＵＶＥＣのＳｐｈ−１−Ｐでの処理が有意な核ＮＦ−κＢ蓄積を誘導
することを示す(図４Ｂ)。Ｓｐｈ−１−Ｐ誘導ＮＦ−κＢ特異的タンパク質−Ｄ
ＮＡ複合体の組成は、ＴＮＦαにより誘導されたものと同一であり、ｐ５０／ｐ
６５ヘテロダイマーであると抗体スーパーシフトによりおよび競合分析により明
らかとなった(図４Ｂ、下部)。細胞のＨＤＬまたはＤＭＳとの処理は、ＮＦ−κ
ＢのＴＮＦα誘導活性化を４５−６０％まで阻害するが、Ｓｐｈ−１−Ｐにより
誘導されたものは阻害しなかった。

【０１２４】実施例７ＲＮＡ調製全ＲＮＡは、表示の薬剤で４時間処理したＨＵＶＥＣから調製した。全ＲＮＡ
の等量(１２μｇ)を１％ホルムアルデヒドゲルで電気泳動し、ナイロン膜に移し
た。ブロットをα³²Ｐ標識Ｅ−セレクションｃＤＮＡプローブとハイブリダイズ
した。Ｅ−セレクチンのｍＲＮＡレベルは、ホスホイメージャーにより定量し、
放射標識ＧＡＰＤＨプローブで標準化した。

【０１２５】実施例８スフィンゴミエリン測定スフィンゴミエリンを測定するために、ＨＵＶＥＣを[³Ｈ]セリン(５μＣｉ／
ml)で４８時間標識し、ＨＤＬ有りまたは無しで更に６時間プレインキュベートした。細胞を次いで３回洗浄し、更に２時間ＨＤＬ存在下または非存在下でイン
キュベートした。ＴＮＦαで示した時間処理した後、細胞性脂質を抽出し、薄層
クロマトグラフィー(ＴＬＣ)でクロロホルム：メタノール：酢酸：水(５０：３０：８：５、ｖ／ｖ)で分解した。スフィンゴミエリンスポットは螢光間接撮影法で可視化し、シンチレーション分光測定法で定量し、全細胞性脂質から回収さ
れた放射活性により標準化した。[³Ｈ]セリンの取りこみにおいて、ＨＤＬとおよびＨＤＬとプレインキュベートした細胞の間で有意な差はない。セラミドレベ
ルを測定するために、細胞性セラミドを抽出し、ジアシルグリセロールキナーゼ
反応により定量した(Kolesnick, 1991; Hannun & Bell, 1993)。スフィンゴシン
キナーゼ活性をインビトロで、少し変形させたが、先の記載のように測定した(M
attie et al., 1994; Ghosh et al., 1994; Choi et al., 1996)。１０ｍＭＭ
ｇＣｌ₂、２０％グリセロール、１ｍＭメカプトエタノール、１ｍＭＥＤＴＡ、２０μＭＺｎＣｌ₂、１ｍＭＮａ₃ＶＯ₄、１５ｍＭＮａＦ、１０μｇ／m
lロイペプチンおよびアプロチニン、１ｍＭＰＭＳＦおよび０.５ｍＭ４−デ
オキシピリドキシンを含む０.１ＭＨＥＰＥＳ緩衝液(ｐＨ７.２)中、２６１
／２Ｇシリンジを６回通すことにより細胞を融解させた。サイトソルフラクショ
ンを、１０５,０００×ｇで９０分遠心することにより調製した。スフィンゴシンキナーゼ活性は、上清を２０ｍＭスフィンゴシン−ＢＳＡ複合体および[γ³² Ｐ]ＡＴＰ(１ｍＭ、５μＣｉ／ml)と１５分、３７℃でインキュベートすることにより測定した。標識脂質を抽出し、Ｓｐｈ−１−Ｐスタンダードに従ってＴＬ
Ｃで分離した。Ｓｐｈ−１−Ｐに対応するスポットの放射活性を、ホスホイメー
ジャーシステムを使用して定量した。インビボのＳｐｈ−１−Ｐ形成の測定は、
先に記載のように行った(Olivier, 1996)。細胞を、１５分、３７℃で低張性緩衝液(２５ｍＭＨＥＰＥＳ、５ｍＭＭｇＣｌ₂、２０μＭＺｎＣｌ₂、２０ μＭＮａ₃ＶＯ₄、１０μg／mlロイペプチンおよびアプロチニン、１ｍＭＰＭＳＦおよび０.５ｍＭ４−デオキシピリドキシン、ｐＨ７.２)中、スフィンゴシン(１０μＭ)および[γ³²Ｐ]ＡＴＰ(１μＭ、１０μＣｉ／ml)で透過性とし
た。脂質を抽出し、ＴＬＣで分解し、[γ³²Ｐ]Ｓｐｈ−１−Ｐを上記のように定
量した。

【０１２６】実施例９スフィンゴシン−キナーゼ活性のマルチウェルアッセイフラッシュプレートを、メタノール中２００μlのホスファチジルコリン(１９
.５μg／ml)、ホスファチジルセリン(５.５μg／ml)およびスフィンゴシン(２５
μg／ml)の混合物を添加することにより脂質基質でコートし、３０℃でＮ₂下で３時間蒸発させた。スフィンゴシンキナーゼの源を、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐ
Ｈ７.２／２０％グリセロール／１０ｍＭＭｇＣｌ₂／１ｍＭＤＴＴ／２０μ
ＭＺｎＣｌ₂／１ｍＭＮａ₃ＶＯ₄／１５ｍＭＮａＦ／０.５ｍＭ４−デオ
キシピリドキシンを含む緩衝液中に、[³²Ｐ]−γ−ＡＴＯ(Bresatech, １μＣｉ
／ウェル／２００μＭ)と共に添加し、２時間まで３７℃でインキュベートする。次いで、プレートを４００μｌの５０ｍＭピロリン酸ナトリウムで４回洗浄し
、放射活性をシンチレーションカウンターで測定した(Top count, Packard)。

【０１２７】実施例１０スフィンゴシンキナーゼ活性の測量のための組織ホモジネートの調製組織を新たに殺した動物から回収し、すばやく液体窒素で凍結させ、２−５ｇ
の湿潤組織を、ポリトロン組織ホモジナイザーで、プロテアーゼ阻害剤カクテル
(Boehringer-Mannheim)を含む２容量の５０ｍＭトリスｐＨ７.４／２０％グ
リセロール／１ｍＭＤＴＴ／１ｍＭＥＤＴＡ中で均質化した。本材料を７５
００ｇで３０分の遠心に付し、大きな断片を除去した。得られた上清を更に高速
(１００,０００×ｇ、１時間)で遠心し、“上清”および“ペレット”フラクションを産生した。

【０１２８】実施例１１マルチウェルアッセイは時間および特異性に関して直線状である図７は、ヒト臍帯上皮細胞から作った細胞融解物のスフィンゴシンキナーゼ活
性に関するアッセイの結果を説明する。シグナルが約４００分の時間にわたり直
線状に増加することを見ることができる。このシグナルは、プレートをコートす
るのに使用した脂質混合物からのスフィンゴシンの除去が、得られるシグナルを
バックグラウンドレベルまで減少させるため、スフィンゴシンキナーゼに特異的
である。これは、脂質またはアッセイ混合物の他の成分ではなくスフィンゴシン
が、本アッセイ中でリン酸化されることを証明する。これは、本アッセイが、多
くの脂質およびプロテインキナーゼを含むと予測される粗融解物で行われていた
ことからして、注目すべきである。

【０１２９】実施例１２スフィンゴシンキナーゼのアゴニストおよびアンタゴニストの活性測定プレートを実施例９に記載のように調製した。スフィンゴシンキナーゼ(実施例９に記載のように、緩衝液中、³³Ｐ−ＡＴＰと共に調製した)をアンタゴニストまたはアゴニストの活性を試験する薬剤の存在下添加する。薬剤を、０−３時
間のインキュベーションの時間で直線状の反応を産生する酵素活性のレベルまで
添加する。プレートを、実施例９のように２時間、３７℃でインキュベートして
洗浄し、スフィンゴシンのリン酸化をシンチレーション計数により測定する。

【０１３０】試験薬剤の送達に使用したのと同じ媒体溶媒の等量を含むコントロールインキ
ュベーションと比較して、阻害(アンタゴニスト活性)は³³Ｐの取りこみの減少と
して、および刺激(アゴニスト活性)は³³Ｐの取りこみの増加として測定する。

【０１３１】当業者は、本明細書に記載の発明が、特記したもの以外にも変形および修飾が
可能であることを認めるであろう。本発明は、その精神および範囲内に含まれる
このような変形および修飾を含むことは理解されるべきである。本発明はまた明
細書中に個別にまたは集合的に言及したまたは示した全ての段階、性質、組成お
よび化合物、ならびに二つ以上の該段階または性質の全ての組合わせも含む。

【０１３２】参考文献 Abbassi O, Kishimoto T.K., McIntire I.V., Anderson D.C., Smith C.W., J.
Clin. Invest. 92:2719-2730(1993) Berra E. et al., EMBO J. 14:6157(1995) Choi O.H., Kim J.H., Kinet J.P., Nature 380:634(1996) Ghosh T.K., Bian J., Gill D.L., J. Biol. Chem. 269:22628(1994) Hannun Y.A., Bell R.M., Adv. Lipid Res. 25:27(1993) Johnson-Tidey R.R., McGregor J.L., Taylor P.R., Poston R.N., Am. J. Path
ol. 144:952-961(1994) Kolesnick R.N., Prog. Lipid Res. 30:1(1991) Lee F.S., Hagler J., Chen Z.J., Maniatis T., Cell 88:213(1997) Li Y.S. et al., Mol. Cell. Biol. 16:5947(1996) Mattie M., Brooker G., Spiegel S., J. Biol. Chem. 269:3181(1994) O'Brien K.D. et al., J. Clin. Invest. 92:945(1993) O'Brien K.D., Allen M.D., McDonald T.O., Chait A., Harlan J.M., Fishbein
D., McCarty J., Furgerson M., Hudkins K., Benjamin C.D., Lobb R., Alpers
C.R., J. Clin. Invest. 92:945-951(1993) Olivier C. et al., Nature 381:800(1996) Van der Wal A.C., Das P.K., Tigges A.J., Becker A.R., Am. J. Pathol. 141
:161-168(1992) Wood K.M., Cadogan M.D., Ranshaw A.I., Parums D.V., Histopathology 22:43
7-444(1993) World Health Organization. World Health Statistics Annual. Geneva, Switz
erland(1993)

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、接着タンパク質ＶＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンの腫
瘍壊死因子（ＴＮＦ）調節誘導に対する高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の効果
を示すグラフである。平均蛍光強度は、細胞表面の接着分子の発現強度を表わす
フローサイトメーター測定である。

【図２ＡおよびＢ】図２は、接着タンパク質発現に対するスフィンゴシン
キナーゼ阻害剤の効果を示すグラフである。図２Ａの黒印は、接着タンパク質に
対する細胞透過性セラミド（Ｃ２−セラミド）の作用を表わす。白印は１００Ｕ
／ｍｌＴＮＦの存在でのセラミドの作用を表わす。図２Ｂはスフィンゴシン−
１−ホスフェート（Ｓｐｈ−１−Ｐ）の作用を示す。

【図２ＣおよびＤ】図２は、接着タンパク質発現に対するスフィンゴシン
キナーゼ阻害剤の効果を示すグラフである。図２Ｃは、ＴＮＦまたはＳｐｈ−１
−Ｐにより起された接着タンパク質発現（ＭＦＩ）に対するジメチルスフィンゴ
シン（ＤＭＳ）の効果を示す。図２Ｄは、Ｅ−セレクチンｍＲＮＡに対するこれ
らの薬剤の作用を示す。

【図３ＡおよびＢ】図３は、スフィンゴシン経路の主要成分に対するＨＵＶＥ
ＣのＴＮＦ処理後の時間的変化を示すグラフである。白丸は、図３Ａではスフィ
ンゴシンの加水分解を、図３Ｂではセラミドの生成を表わし、すべて時間０から
の％である。黒丸は、ＨＤＬでＨＵＶＥＣを前処置した作用を示す。

【図３ＣおよびＤ】図３は、スフィンゴシン経路の主要成分に対するＨＵＶＥ
ＣのＴＮＦ処理後の時間的変化を示すグラフである。図３Ｃではスフィンゴシン
キナーゼ活性を、図３Ｄではスフィンゴシン−１−ホスフェートの形成を表わし
、すべて時間０からの％である。黒丸は、ＨＤＬでＨＵＶＥＣを前処置した作用
を示す。

【図４ＡおよびＢ】図４は、ＥＲＫ（図４Ａ）およびＮＦ−κＢ（図４Ｂ
）の生成に対するＳｐｈ−１−Ｐ、ＴＮＦおよびＨＤＬの作用についての写真表
示である。棒グラフは、ＥＲＫ活性化に対する３つの独立の実験の要約である。
（±ＳＥＭ）。＊はＴＮＦとの差異についてのｐ値を＜０．０１で、†は＜０．
０５で、‡は無に対するｐ＜０．０１を表わす。図４Ｂの上部はＮＦ−κＢによ
るゲル遅速化を示す。図４Ｂの下部は、ＮＦ−κＢのｐ５０およびｐ６５成分に
特異的な抗体のスーパーシフトを示し、ＴＮＦおよびＳｐｈ−１−Ｐにより促進
されたＮＦ−κＢの類似の組成を示す。

【図５】ＨＤＬがＴＮＦ−α誘導の接着タンパク質発現を阻害するスフィ
ンゴシンキナーゼ経路についての模式図である。

【図６】スフィンゴシンキナーゼ活性の多ウェルアッセイについての模式
図である。アッセイの基本は、多ウェルプレートの壁に吸収により結合したスフ
ィンゴシンのリン酸エステル化である。プレートでは壁がシンチラントで満たさ
れている（Flashplates, New England Nuclear）。γ−³³Ｐ標識ＡＴＰを酵素源
の存在でインキュベートする。活性酵素が存在すると³³Ｐはスフィンゴシンに移
行する。ウェルを洗い、未結合³³Ｐを除去する。スフィンゴシンに結合した³³Ｐ
はシンチラントを励起し、シンチレーション計数器で測定される信号が生じる。

【図７】図７は、スフィンゴシンキナーゼ活性が多ウェルアッセイで測定
したときに４００分まで直線状であることを示すグラフである。５０μｌの内皮
細胞抽出物（実施例８に記載のようにつくり、スフィンゴシンキナーゼ活性を有
する）および５０μｌのＡＴＰ溶液（４００μＭＡＴＰ／２０μＣｉ／ｍｌ
³³Ｐ−ＡＴＰ含有）を、リン脂質混合でコートしたフラッシュプレートと共に、
スフィンゴシンあり（黒四角）またはスフィンゴシンなし（白四角）で、インキ
ュベートし、そして洗滌前の表示時間で３７℃でインキュベートした。

【図８】図８は、スフィンゴシンキナーゼ活性について各組織毎に示すグ
ラフである。５０μｌの抽出物からの高速“上澄”（白棒）および“ペレット”
（黒棒）フラクションをスフィンゴシンキナーゼ活性についてアッセイした。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/45 Ａ６１Ｐ 29/00 51/00 Ａ６１Ｋ 37/22 Ａ６１Ｐ 9/10 37/52 29/00 49/02 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者プ・シアオーストラリア5067サウス・オーストラリア州ビューラー・パーク、ビューラー・ロード１／225番 (72)発明者フィリップ・バーターオーストラリア5065サウス・オーストラリア州トゥーラク・ガーデンズ、オーモンド・グローブ49番 (72)発明者ケリー−アン・ライオーストラリア5065サウス・オーストラリア州トゥーラク・ガーデンズ、オーモンド・グローブ49番 (72)発明者ブライアン・ウォッテンバーグオーストラリア5052サウス・オーストラリア州ベレアー、シーオーク・ロード137番 (72)発明者スチュアート・ピットソンオーストラリア5068サウス・オーストラリア州ケンジントン・パーク、デソーマレズ・ストリート４／19番Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA17 BA44 DC50 ZA401 ZA451 ZB111 ZB211 ZB221 ZC192 ZC202 4C085 HH03 KA29 KB07 KB60 KB82 LL07 4C086 AA01 AA02 DA42 MA01 MA04 ZA40 ZA45 ZB11 ZB21 ZB22 4C087 AA01 AA02 BB45 CA43 ZA40 ZA45 ZB11 ZB21 ZB22 4C206 AA01 AA02 FA03 MA01 MA04 ZA40 ZA45 ZB11 ZB21 ZB22

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】哺乳動物における細胞活性を調節する方法であって、該方法
は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分の活性を調節するのに
十分な時間および条件でもって、薬剤の有効量を該哺乳動物に投与することを含
む方法。
【請求項２】該成分がスフィンゴシンキナーゼである、請求項１の方法。
【請求項３】該成分がスフィンゴシン−１−ホスフェートである、請求項
１の方法。
【請求項４】該成分がスフィンゴシンキナーゼおよびスフィンゴシン−１
−ホスフェートである、請求項１の方法。
【請求項５】該細胞活性が接着分子発現である、請求項１−４の方法。
【請求項６】該接着分子発現が内皮分子発現である、請求項５の方法。
【請求項７】該調節が内皮分子発現の低下である、請求項６の方法。
【請求項８】該薬剤がＨＤＬである、請求項１−７の方法。
【請求項９】哺乳動物における細胞活性を調節する方法であって、該方法
は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分またはその機能的等価
物の有効量を該哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１０】該成分がスフィンゴシンキナーゼである、請求項９の方法
。
【請求項１１】該成分がスフィンゴシン−１−ホスフェートである、請求
項９の方法。
【請求項１２】該細胞活性が接着分子発現である、請求項９−１１の方法
。
【請求項１３】該接着分子発現が内皮細胞接着分子発現である、請求項１
２の方法。
【請求項１４】該調節が内皮分子発現の低下である、請求項１３の方法。
【請求項１５】炎症メカニズムを含む疾患状態を治療または予防する方法
であって、該方法は、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路（情報伝達経路にお
いて該調節は接着分子発現をもたらす）の１以上の成分の活性を調節するのに十
分な時間および条件でもって、薬剤の有効量を該哺乳動物に投与することを含む
方法。
【請求項１６】該疾患状態が冠状心疾患である、請求項１５の方法。
【請求項１７】該成分がスフィンゴシンキナーゼである、請求項１５また
は１６の方法。
【請求項１８】該成分がスフィンゴシン−１−ホスフェートである、請求
項１５または１６の方法。
【請求項１９】該成分がスフィンゴシンキナーゼおよびスフィンゴシン−
１−ホスフェートである、請求項１５または１６の方法。
【請求項２０】該接着分子発現が内皮分子発現である、請求項１５−１９
の方法。
【請求項２１】該調節が接着分子発現の低下である、請求項２０の方法。
【請求項２２】該薬剤がＨＤＬである、請求項１５−２１の方法。
【請求項２３】哺乳動物における炎症メカニズムを含む疾患状態を治療ま
たは予防する方法であって、該方法は、該哺乳動物にスフィンゴシンキナーゼ情
報伝達経路の１以上の成分またはその機能的等価物を投与することを含む方法。
【請求項２４】該疾患状態が冠状心疾患である、請求項２３の方法。
【請求項２５】該接着分子発現が内皮分子発現である、請求項２３または
２４の方法。
【請求項２６】該調節が接着分子発現の低下である、請求項２５の方法。
【請求項２７】哺乳動物における細胞活性を調節する医薬の製造での、ス
フィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分の活性を調節し得る薬剤の使
用。
【請求項２８】該細胞活性が接着分子発現である、請求項２７の使用。
【請求項２９】哺乳動物における細胞活性発現を調節する医薬の製造での
、スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分またはその機能的等価物
を使用。
【請求項３０】該細胞活性が接着分子発現である、請求項２９の使用。
【請求項３１】スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路（情報伝達経路では
該成分が接着分子発現を調節する）の１以上の成分の調節において用いる薬剤。
【請求項３２】該細胞活性が接着分子発現である、請求項３１の薬剤。
【請求項３３】細胞活性を調節するのに用いるスフィンゴシンキナーゼ情
報伝達経路の１以上の成分またその機能的等価物を含む組成物。
【請求項３４】該細胞活性が接着分子発現である、請求項３３の組成物。
【請求項３５】スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路（情報伝達経路では
接着分子発現の調節をもたらす）の１以上の成分を調節し得る薬剤、および１以
上の薬学的に許容される担体および／または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項３６】スフィンゴシンキナーゼ情報伝達経路の１以上の成分また
その機能的等価物、および１以上の薬学的に許容される担体および／または希釈
剤を含む医薬組成物。
【請求項３７】該細胞活性が接着分子発現である、請求項３４または３５
の医薬組成物。
【請求項３８】脂質に構造的または機能的に反応性の分析物を検出する方
法であって、該方法は次のいずれかを、（ｉ）分析物が放射標識された該分析物；または（ii）該分析物とレポーター分子が放射標識されたレポーター分子、該分析物
は該レポーター分子と同時にまたは別個に該脂質と接触させられる；該脂質とシンチラントの存在下に、脂質放射標識複合体が該シンチラントを形成
し励起するのに十分な時間および条件で接触せしめ、該励起シンチラントを検出
する工程を含む方法。
【請求項３９】該脂質および該シンチラントが固体支持体に結合している
、請求項３８の方法。
【請求項４０】該脂質がスフィンゴシンである、請求項３８または３９の
方法。
【請求項４１】スフィンゴシンキナーゼ活性を示す分析物を検出する方法
であって、該方法は、該分析物および³³Ｐ−ＡＴＰとスフィンゴシンとをシンチ
ラントの存在下に接触せしめる工程を含み、該分析物は該³³Ｐ−ＡＴＰと同時に
または別個に該スフィンゴシンに、³³Ｐスフィンゴシン複合体が該シンチラント
を形成し励起するのに十分な時間と条件で接触せしめ、該励起シンチラントを検
出する方法。
【請求項４２】該スフィンゴシンおよび該シンチラントが固体支持体に結
合している、請求項４１の方法。
【請求項４３】該哺乳動物がヒトである、請求項１−２６の方法。