JP5798345B2 - TAFIaタンパク質に対して阻害活性を有する化合物 - Google Patents
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<1> TAFIaタンパク質に対して阻害活性を有する化合物であって、下記一般式(1)で表わされる有機セレン化合物、該有機セレン化合物同士がジセレニド結合を介して結合している二量体、又はこれらの薬理学上許容される塩若しくは溶媒和物。
13C NMR(CDCl3) δ9.7,14.5,26.3,26.8,26.9,28.6(3carbons),30.1,33.0,40.7,41.7,46.5,60.8,79.3,156.2,174.9,202.6.
ESI−MS m/z(%):448(M+Na,20),447(M+Na,20),446(M+Na,100),445(M+Na,10),444(M+Na,50),443(M+Na,18),442(M+Na,18),424(25),423(20),422(75),421(13),420(38),419(10),418(8),392(8),391(6),390(40),389(3),388(6),387(6),386(6),326(13),325(9),324(63),323(5),322(31),321(11),320(11).
HRMS(ESI) calcd for C18H33NNaO5 80Se 446.14216, found 446.14188。
次に、前記式に示すスキームに記載の通り、調製例1で得られたセレノールエステル1を脱保護し、化合物Aを得た。すなわち、セレノールエステル1(25.9mg,0.061mmol)に濃塩酸(HCl、1mL)を加え、100℃で2時間撹拌した。次いで、反応液の溶媒を留去し、化合物A(16.5mg,98.3%)を得た。以下に得られた化合物A(化合物DD9)についての、1H NMR、ESI−MS、HRMSを示す。
ESI−MS m/z(%):481(M+H,25),480(M+H,8),479(M+H,35),478(22),477(M+H,100),476(M+H,22),475(M+H,92),474(M+H,35),473(M+H,55),472(M+H,15),471(M+H,22),470(M+H,12),469(M+H,3).
HRMS(ESI) calcd for C16H33N2O4 80Se2 477.07780, found 477.07708。
次に、前記式に示すスキームに記載の通り、調製例1で得られたセレノールエステル1を脱保護し、アミノ体Aを得た。すなわち、0℃に冷却したセレノールエステル1(19.2mg,0.045mmol)にdist H2O(50μL)とトリフルオロ酢酸(TFA、950μL)を加え、1時間撹拌した。次いで、反応液の溶媒を留去し、アミノ体A(19.9mg)を定量的に得た。以下に得られたアミノ体A(化合物DD10)についての、1H NMR、ESI−MS、HRMSを示す。
ESI−MS m/z(%):327(M+H,2),326(M+H,21),325(M+H, 17),324(M+H,100),323(M+H,8),322(M+H,53),321(M+H,19),320(M+H,19),280(3),379(2),278(17),277 1),276(8),275 (3),274(3),270(6),269(4),268(32),267(2),266(16),265(6),264(6),224(14),223(14),222(50),221(3),220(37),219(13),218(14),140(27).
HRMS (ESI) calcd for C13H26NO3 80Se 324.10779, found 324.10839。
13C NMR(CDCl3) δ9.7,25.9,26.7,26.8,28.6(3 cabons),30.0,32.8,40.6,41.7,46.3,79.4,156.3,179.6,202.6.
ESI−MS m/z(%):421(M+Na,1),420(M+Na,20),419(M+Na,18),418(M+Na,100),417(M+Na,9),416(M+Na,50),415(M+Na,18),414(M+Na,17),364(7),363(5),362(40),361(3),360(19),359(6),368(7),298(6),297(3),296(33),295(2),294(15),293(5),292(40),224(7),223(3),222(44),221(3),220(30),219(7),218(11),217(2),216(3).
HRMS(ESI) calcd for C16H29NNaO5 80Se 418.11086, found 418.11011。
13C NMR(CD3OD) δ9.8,26.6,27.1,27.6,28.3,33.4,40.6,42.2,47.4,178.2,203.7.
ESI−MS m/z(%):299(M+H,1),298(M+H,17),297(M+H,12),296(M+H,88),295(M+H,6),294(M+H,44),293(M+H,16),292(M+H,17),243(1),242(8),241(4),240(40),239(2),238(21),237(7),236(8),225(4),224(34),223(18),222(100),221(9),220(95),219(32),218(36),217(1),216(4).
HRMS(ESI) calcd for C11H22NO3 80Se 296.07649, found 296.07723。
13C NMR(CD3OD) δ26.8,27.2,28.3,28.4,33.4,36.7,40.6,47.4,48.0,127.1,129.45(2carbons),129.49(2carbons),142.5,178.1,202.8。
13C NMR(CD3OD) δ26.8,27.1,27.6,28.3,32.3,33.4,40.6,47.3,50.0,50.3,127.4,129.4(2carbons),129.5(2carbons),141.2,178.1,202.1。
13C NMR(CDCl3) δ9.7,14.4,26.0,28.6(3carbons),35.5,41.7,48.0,61.1,81.1,112.2,128.4,138.9,148.2,151.1,152.7,173.7,202.0.
ESI−MS m/z(%):448(M+H,8),447(M+H,22),446(M+H,23),445(M+H,100),444(M+H,13),443(M+H,53),442(M+H,20),441(M+H,19),392(3),391(15),390(13),389(73),388(7),387(35),386(15),385(15).
HRMS(ESI) calcd for C19H29N2O5 80Se1 445.12417, found 445.12508。
13C NMR(CD3OD) δ31.5 and 31.6(1:1,2carbons),34.5and34.6(1:1,2carbons),48.8and48.9(1:1,2carbons),114.9(2carbons),125.0(2carbons),135.1(2carbons),147.0(2carbons),154.7(2carbons),176.2(2carbons).
ESI−MSm/z(%):523(M+H,3),522(M+H,5),521(M+H,19),520(M+H,13),519(M+H,57),518(M+H,15),517(M+H,52),516(M+H,20),515(M+H,30),514(M+H,8),513(M+H,10),512(M+H,3),511(M+H,2),276(9),275(30),274(80),273(78),272(43),271(18),270(5),269(5),268(5),267(8),266(6),265(5),262(8),261(5),260(100),259(75),258(54),257(20),256(8),208(13),207(35),180(30),179(75).
HRMS(ESI) calcd for C18H23N4O4 80Se2 519.00497, found 519.00600。
13C NMR(CD3OD) δ9.7,14.5,26.1,34.7,42.2,48.2,62.1,114.8,124.8,135.3,147.0,154.9,175.6,203.1.
ESI−MS m/z(%):349(M+H,3),348(M+H,10),347(M+H,60),346(M+H,53),345(M+H,100),344(M+H,28),343(M+H,95),342(M+H,57),341(M+H,59),340(M+H,1),339(M+H,6).
HRMS(ESI) calcd for C14H21N2O3 80Se 345.07174, found 345.08189。
13C NMR(CDCl3) δ9.7,14.4,25.9,34.9,41.7,48.1,61.1,115.0,125.1,137.7,146.6,153.7,173.7,202.0.
ESI−MS m/z(%):383(M+H,5),382(M+H,6),381(M+H,45),380(M+H,18),379(M+H,100),378(M+H,13),377(M+H,50),376(M+H,15),375(M+H,17).
HRMS(ESI) calcd for C14H20 ClN2O3 80Se 379.03277, found 379.03314。
13C NMR(CD3OD) δ31.6,31.7(1:1,2carbons),34.37,34.41(1:1,2carbons),48.71,48.74(1:1,2carbons),119.8(2carbons),125.8(2carbons),134.6(2carbons),145.9(2carbons),152.0(2carbons),176.06,176.08(1:1,2carbons).
ESI−MSm/z(%):591(M+H,10),590(M+H,5),589(M+H,30),588(M+H,12),587(M+H,48),586(M+H,13),585(M+H,37),584(M+H,13),583(M+H,20),582(M+H,5),581(M+H,8),580(M+H,1),579(M+H,1).
HRMS(ESI) calcd for C18H20 Cl2N4O4 78Se80Se 583.91999, found 583.92394。
実施例1〜9にて得られた各化合物について、TAFIa阻害作用の測定を、Suzuki K.ら、J Pharmacol Exp Ther.、2004年、309巻、607〜615ページに記載の方法に準じて下記のように行った。
先ず、クエン酸採血したヒト血漿中に80mMの塩化バリウムを加え、4℃で30分間処理した。10000rpmで20分間遠心した上清を0.15M塩化ナトリウム含有20mM HEPES緩衝液(pH7.4)で透析した。さらに、35〜70%の硫安画分のタンパクをQ−セファロース、ヘパリン−セファロース、セファクリルS−300及びプラスミノーゲン−セファロースの各種カラムを用いたクロマトグラフィーにより精製した。
次に、得られたTAFI20μLにトロンボモジュリン液(トロンボモジュリン(ウサギ肺由来、American Diagnostia
inc社製、製品番号#237)を緩衝液A(0.1%ルブロール(Lubrol)、0.1%BSA、0.15M塩化ナトリウム含有50mMトリス−塩酸緩衝液
(pH7.4))に300ng/mLの濃度で溶解して得られた液)20μLを加え、25℃で3分間処理した後、トロンビン液(トロンビン(ヒト血漿由来、Sigma社製、
製品番号T8885)を緩衝液B(0.1% BSA、0.15M NaCl、10mM塩化カルシウム含有50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.4))に3u/mLの濃度で溶解した液)20μLを加え、更に25℃で20分間処理することにより、TAFIを活性化し、TAFIa溶液を得た。
次に、得られたTAFIa溶液25μLに、27μMジチオスレイトールを含む50mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.6)で段階希釈した各種阻害剤(実施例1〜9にて得られた各化合物を、これらの終濃度が1pM〜1mMとなるように10倍の希釈系列として調整した液)30μLを加えて良く混ぜ、25℃、10分間処理した。さらに、基質溶液(Hip−Arg(Sigma社製、H2508)を50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)に3.2mMの濃度になるように溶解した液)25μLを加えて良く混ぜ25℃、30分間反応させた。次いで、12.5%Tween含有0.2M PIPES緩衝液(pH7.5)を100μLを加え、反応を停止させた。そして、その5分後に発色液(1%塩化シアヌル含有2−メトキシエタノール)100μLを加えて室温にて15分間放置した後、405nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Bio Rad社製、Model3550)で測定した。これらの測定結果から、阻害率が50%となる濃度をIC50値として求めた。得られた結果を表1に示す。
実施例1〜9にて得られた各化合物について、CPB阻害作用の測定を下記のように行った。
ブタ膵臓由来カルボキシペプチダーゼB(CPB)(Worthington Biochemical Corporation社製)を50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.6)に32U/Lで溶解した液25μLに、27μMジチオスレイトールを含む50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.6)で段階希釈した各種阻害剤(実施例1〜9にて得られた各化合物を、これらの終濃度が1pM〜1mMとなるように10倍の希釈系列として調整した液)30μLを加えて良く混ぜ25℃、10分間処理した。さらに、基質溶液(Hip−Arg(Sigma社製、H2508)を50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)に3.2mMの濃度になるように溶解した液)25μLを加えて良く混ぜ、25℃、30分間反応させた。次に、12.5%Tween含有0.2M PIPES緩衝液(pH7.5)を100μLを加え、反応を停止させた。5分後に発色液(1%塩化シアヌル含有2−メトキシエタノール)100μlを加え、室温にて15分間放置した後、405nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Bio Rad社製、Model3550)で測定した。これらの測定結果から、阻害率が50%となる濃度をIC50値として求めた。得られた結果を表1に示す。
実施例1〜9にて得られた各化合物について、CPN阻害作用の測定を下記のように行った。
ヒト血漿由来カルボキシペプチダーゼN(CPN)(ELASTIN PRODUCTS COMPANY、INC社製)を50mMトリス−塩酸緩衝液
(pH7.6)に2μg/mlで溶解した液25μLに、27μMジチオスレイトールを含む50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.6)で段階希釈した各種阻害剤(実施例1〜9にて得られた各化合物を、これらの終濃度が1pM〜1mMとなるように10倍の希釈系列として調整した液)30μLを加えて良く混ぜ37℃、10分間処理した。さらに、基質溶液(Hip−Lys(Sigma社製、H6750)を50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)に10mMの濃度になるように溶解した液)25μLを加えて良く混ぜ、37℃、40分間反応させた。次に、12.5%Tween含有0.2M PIPES緩衝液(pH7.5)を100μLを加え、反応を停止する。5分後に発色液(1%塩化シアヌル含有2−メトキ
シエタノール)100μLを加え、室温にて15分間放置した後、405nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(BioRad社製、Model3550)で測定した。これらの測定結果から、阻害率が50%となる濃度をIC50値として求めた。得られた結果を表1に示す。
Claims (1)
- TAFIaタンパク質に対して阻害活性を有する化合物であって、下記一般式(1)で表わされる有機セレン化合物、該有機セレン化合物同士がジセレニド結合を介して結合している二量体、又はこれらの薬理学上許容される塩若しくは溶媒和物。
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