JP2004501670A - Grf2結合タンパク質およびその用途 - Google Patents
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Abstract
GRF2相互作用タンパク質(GRF2−IP)のタンパク質および複合体、並びにGRF2−IPと相互作用するタンパク質、同様にこれらタンパク質をコードするポリヌクレオチド関する試薬およびその使用方法である。
Description
【0001】
【関連出願の引用】
本願は、2000年6月30日付で出願された仮出願60/215,504、および、2001年1月24日付で出願された仮出願60/263690に対する優先権を主張し、当該明細書は、参照によって本明細書に含まれる。
【0002】
【発明の背景】
Rasは、いわゆる「低分子量の」Gタンパク質のラージファミリーに関するプロトタイプである(1、2で述べられている)。Rasは、質量約21kDaのGTPアーゼである。Rasは、2種の異なるコンフォメーションで存在し、1つはGDPに結合したコンフォメーションであり、他方はGTPに結合したコンフォメーションである。Rasは、これら2種の異なる形態で細胞のタンパク質の異なるセットに物理的に結合することができる。それによりRasは、分子スイッチとして機能し得る。ヒトのガンにおいて、RasのGTP結合状態を促進する変異が頻繁に起こる。3種のヒトRas遺伝子(H、KおよびN)と、数ダースのRas関連低分子量Gタンパク質とがあり、これらはサブファミリーに細分化される(例えば、Ras、Rho、Rab、RanおよびArfサブファミリー)。Rasは進化の際に高度に保存されてきた。Saccharomyces cerevisiaeおよびSchizosaccharomyces pombeのような単細胞酵母ですらRas遺伝子を有し、ヒトRasは、効果的に酵母のRas遺伝子と置換することができる。しかしながら、Ras遺伝子がヒトの酵母で機能する際の経路は無関係であることが証明されている。出芽酵母においては、Rasは細胞外グルコースへの応答でアデニリルシクラーゼを活性化するように機能し、分裂酵母においては、Rasは交配に関与する。
【0003】
ヒト、試験された他の哺乳動物種、および、C. elegansやD. melanogasterのような真核生物モデルにおいて、Rasは、細胞に影響を与える様々な細胞外シグナル下流の分子スイッチとして機能する。ヒトおよびマウス細胞でRasを活性化するシグナルとしては、様々なホルモン、成長因子、分化因子およびサイトカイン因子、細胞−細胞外基質の相互作用、および、カルシウム流入がある。これらシグナルに対する受容体としてはチロシンキナーゼがあり、そのいくつかは、成長因子受容体、インテグリン、およびGタンパク質共役セルペンチン受容体(GPCR)である。
【0004】
Rasは、細胞外シグナルの直接的なターゲットではない。Rasの不活性型と活性型との間の自発的な変換はごくわずかであり、なぜなら、RasはGDPとGTPとの両方に高い親和性で結合し(Kdは約10−11M)、その内因性のGTPアーゼ活性は弱いためである。別々のタンパク質が直接Rasと相互作用し、ヌクレオチド交換を触媒し、そのGTPアーゼ活性を刺激する。RasのGTP結合状態へ活性化は、一般的にグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)と呼ばれるタンパク質が仲介する。GEFの刺激によって、Rasから結合したGDPが放出され、続いて、自発的にGTP分子で置換されるが、このような置換は細胞内のGDPより頻繁におこる。Rasの不活性化、すなわちGDP結合型へ再変換は、結合したGTPのγリン酸を加水分解することによって起こり、その際の反応は、GTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)による一時的なRas−GTPの結合を必要とする。Ras−GEFおよびGAPは、マルチドメインタンパク質であって、これはシグナルで活性化された受容体にそれらをカップリングするためのモジュールを含む(3、4)。受容体活性化への応答におけるGEFおよびGAPの活性化のメカニズムにおいては、サイトゾルから細胞質膜の内部表面へGEFおよびGAPを再局在化させ、そこにRasを閉じ込めると考えられる。GEFおよびGAPが共に活性化されることによって、一時的に起こる低分子量Gタンパク質活性化を確実にする。
【0005】
哺乳動物細胞において、Ras・GTPは、Raf1タンパク質キナーゼ、ホスファチジルイノシトール−3−OHキナーゼ(PI3K)、Ral−GDS、および他の既知の候補エフェクタータンパク質と相互作用可能である。細胞質膜でのRas−GTPとの相互作用により何とかしてRafを活性化し、一連の下流タンパク質キナーゼを順に活性化するが、このようなキナーゼとしては、ERKキナーゼ(またはMEKとして知られる)、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)(またはERK(細胞外シグナル調節キナーゼ)として知られる)、およびリボゾームタンパク質S6キナーゼ(RSK)がある(3で述べられる)。このような活性化タンパク質キナーゼのターゲットのなかで、様々な転写因子および他のシグナル伝達タンパク質は、Ras活性化を起こす細胞外シグナルへの細胞性応答を仲介する(5)。Ras−GTPとこれら異なるエフェクタータンパク質との相互作用を制御するメカニズムはわかっていない。
【0006】
細胞分裂周期の刺激、および悪性の細胞形質転換の維持は、十分に確立されたRaf−MEK−ERKキナーゼカスケード(Rasで活性化された)、および、GTPアーゼのRhoファミリー(Rhoそのもの、RacおよびCdc42を含む)の両方が必要である。Rho、RacおよびCdc42の活性化GTP結合型は、分裂を促進し(6)、細胞質膜に局所的に接着する複合体と、特定のアクチン構造との形成を促進するが、これは血清飢餓マウスSwiss3T3細胞で実証されており、ストレスファイバー(Rho・GTP)、ラッフル(ruffles)/膜状突起(lamellipodia)(Rac・GTP);および糸状突起(filopodia)/微小突起(microspike)(Cdc42・GTP)が形成される。その結果、GTPアーゼのRhoファミリーは、細胞内のアクチン構造の調節において主要な役割を有し、それゆえに、細胞の極性、形状、付着および運動性を制御する。このような細胞行動のパラメーターは、正常な細胞成長、分裂および分化と密接に関連しており、これら細胞の特徴の調節ミスは腫瘍細胞の増殖と転移に関連している。Rasのように、Rhoファミリータンパク質は特定のGEFおよびGAPによって調節される(7、8で述べられる)。
【0007】
RasおよびRhoファミリーGTPアーゼによるシグナル伝達は、そのGEFおよびGAPのレベルに調節されるが、ここで当該GEFおよびGAPは、ある場合において、同じタンパク質または直接相互作用するタンパク質に存在する。例えば、様々なシグナルは、p120Ras−GAPと、p190Rho−GAPとの物理的な結合を刺激する(9、10)。タンパク質GRF2は、別々のRasおよびRacGEFドメインおよび活性を有するが(11〜13)、それに対してCNrasGEFは、cAMP結合に対する応答においてRasを活性化し、cAMPが活性化されていなければRap1を活性化する(14、15)。それゆえに、GEFおよびGAPを含むタンパク質複合体を介してシグナル伝達経路間の混線が起こる可能性がある。
【0008】
これまで、哺乳動物/ヒト細胞において、RasGEFの4種のクラスが同定されており、そのクラスとは、SOS(Sos1およびSos2)(16)、GRF(Ras−GRF1およびRas−GRF2)(17〜19)、Ras− GRP(Ras−GRP1およびRas−GRP2)(20)およびCNrasGEF(21)である。様々なRas特異的GEFは、マルチドメインタンパク質である。それらは類似のRas結合ドメイン(Cdc25ドメイン)を共有しているが、それらの異なる細胞シグナルを認識する能力によって区別される。SOSタンパク質は、タンパク質GRB2(成長因子受容体結合タンパク質−2)を複合化し、GRB2のSH2ドメインを利用して、多くの成長因子およびサイトカイン因子の活性化ターゲットにおけるタンパク質−ホスホチロシン(pTyr)と結合する(22、23)。Ras−GRF1およびRas−GRF2はカルモジュリンと結合し、カルシウムシグナルに対する応答においてRasを活性化させる(12、24)。Ras−GRPはジアシルグリセロール(DAG)と結合し(20)、それに対してCNrasGEFはcAMPに結合し(21)、その結果、これらの相互作用によりインビボでRasの活性化が起こる。このような「第2メッセンジャー」(pTyr、Ca、DAG、cAMP)との直接的または間接的な相互作用の結果として、RasGEFは細胞質膜へ移動し、機能的に活性化する。それによりGEFとRasとの相互作用が可能になり、脂質によってそれらが共有結合で改変され、その結果、細胞質膜の内部表面と密接に結合する。
【0009】
このようなGEF機能の上流の観点(すなわち、Rasのシグナル誘導による活性化、GEF仲介による活性化)はかなり理解されているにも関わらず、結果生じる細胞応答を制御する下流での現象におけるGEFの役割は、酵母からヒトに至るまで殆どわかっていない。
【0010】
図1に示すように、GRF2および関連タンパク質GRF1は、類似した認識可能なドメインおよび配列モチーフの集合体を含む。GRF1は脳で最も多く発現され、また膵臓特異的なアイソフォームも存在する(25)。またマウスGRF2も脳で多く発現されるが、他の多くの組織にも存在する(19)。マウスGRF2の遺伝子は第13染色体(13C3−D1)にマッピングされ、一方、ヒト遺伝子(RASGRF2)では第5染色体の同遺伝子型領域(5q13)に存在する(26)。GRF1は別の遺伝子産物であり、その遺伝子は、マウスでは第9染色体(27)、ヒトでは第15染色体に存在する(28)。
【0011】
RasおよびRasGEFに関与する細胞経路は、酵母およびヒト細胞において異なることが述べられている(1で述べられる)。出芽酵母においては、CDC25遺伝子でコードされるGEFは、細胞外グルコース濃度への応答においてRasを活性化し、それによりアデニリルシクラーゼが活性化される。分裂酵母においては、RasGEFはste6遺伝子でコードされ、これは交配に必須である。酵母GEFとは異なり、ヒト(およびげっ歯類)GRFタンパク質は2つのPHドメインとDHドメインとを含み、これはGRF2の場合、低分子量GTPアーゼRacと結合し活性化することがわかっている(13)。すなわちGRF2は二官能価のGEFである。2つのMAPKシグナル伝達経路、すなわちERKおよびSAPK(ストレス活性化タンパク質キナーゼ)が、GRF2により活性化されることがわかっている。GRF2によるSAPK経路の活性化は、GRF2のDHドメインを必要とする。このドメインはRacと相互作用するため、活性化RacはGRF2をSAPK経路にカップリングする可能性がある。従って、GRF2によるSAPKの活性化は間接的であり、このシグナル伝達の連結を仲介する同一なタンパク質は、Rac以外に同定されていない。GRF2と直接相互作用することがわかっているタンパク質としては、カルモジュリン、RasおよびRacがあり(13、19)、ならびに、GRF1およびGRF2が互いに相互作用することが示唆されている(29)。
【0012】
分裂酵母においては、RasおよびRac関連タンパク質Cdc42を含む経路がある(30)(図1参照)。この経路は、タンパク質キナーゼOrb6を含み、細胞周期と調和して働く細胞極性の維持や細胞の形態形成に必要とされる。Orb6キナーゼは有糸分裂の阻害剤である(30)。Orb6のヒト相同体としては、Ndrが知られている。Ndrは、カルシウムシグナル(GRF2のような)により活性化されリン酸化されるが、その機能は未知である(31)。タンパク質キナーゼShk1(またはPakとして知られる)は、分裂酵母におけるOrb6の上流の活性化剤である。Shk1は、哺乳動物p21(odc42/Rac)活性化タンパク質キナーゼ(PAK)の相同体である。分裂酵母のSkb1遺伝子産物(また出芽酵母においてはHSL7として知られる)は、Shk1に結合する高度に保存されたタンパク質であり、Orb6/Ndrと同様に、有糸分裂の負の調節因子である(32)。Skb1欠損酵母変異体で発現される場合、酵母タンパク質をヒトSkb1タンパク質で置換することができ、タンパク質−メチルトランスフェラーゼ触媒活性を有することが報告されている(33)。
【0013】
酵母タンパク質Orb6/NdrおよびSkb1に対するヒトまたは哺乳動物の対応物が知られているが、酵母相同体により制御される経路と類似した経路において機能することは示されておらず、RasまたはGRF2と相互作用することも知られていない。GRF2は、有糸分裂の調節に関与しない。
【0014】
【発明の要約】
本発明は、Rasシグナル経路の成分を含むタンパク質複合体の発見に関し、より特定には、GRF2仲介シグナル伝達に関与するタンパク質に関する。これらのタンパク質の様々な相互作用により、細胞の恒常性という特定の観点において、生化学的な性質に関する新しい情報と、細胞内のシグナル伝達経路の細胞性かつ生理学的な結果とが解明された。
【0015】
本発明の1つの観点は、哺乳動物のGRF2タンパク質またはGRF2を含むタンパク質複合体と相互作用する能力を有するタンパク質の同定に基づく。我々は、GRF2を「ベイト(bait)」タンパク質として利用することによって生理的条件下でGRF2と複合体を形成する様々な異なるタンパク質を同定し、本明細書ではこのようなタンパク質を総合して「GRF2相互作用タンパク質」または「GRF2−IP」と称する。特定のGRF2−IPを表1に列挙する。
【0016】
我々は、特定のGRF2−IPをベイトタンパク質として利用することによって、これらタンパク質とさらなるタンパク質複合体との関係に及んで解釈した。特に、本発明の他の観点は、セリン/スレオニンキナーゼNdrと相互作用するタンパク質、または、セリン/スレオニンキナーゼNdrを含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「Ndr相互作用タンパク質」または「Ndr−IP」と称する。代表的なNdr−IPを表3A〜Bに示す。同様に、本発明のさらに他の観点は、メチルトランスフェラーゼSkb1(またはGRF2−IP)を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「Skb1相互作用タンパク質」または「Skb1−IP」と称する。代表的なSkb1−IPを表4A〜Bに示す。本発明のさらに他の観点は、GRF2−IPホスファターゼPP2Cを含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「PP2C相互作用タンパク質」または「PP2C−IP」と称する。代表的なPP2C−IPを表5に示す。
【0017】
我々は、GRF2複合体への関連をよりいっそう拡張して、ベイトタンパク質としてSkb1相互作用タンパク質、pIClnを選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、pIClnを含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「pICln相互作用タンパク質」または「pICln−IP」と称する。代表的なpICln−IPを表2に示す。
【0018】
また我々は、GRF2複合体への関連をよりいっそう拡張して、ベイトタンパク質として、pICln相互作用タンパク質、タンパク質4.1SVWL2(タンパク質4.1の多くのアイソフォームのうちの新規の型の一つ)を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、4.1SVWL2を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「4.1SVWL2相互作用タンパク質」または「4.1SVWL2−IP」と称する。代表的な4.1SVWL2−IPを表6に示す。
【0019】
また我々は、GRF2複合体への関連をよりいっそう拡張して、ベイトタンパク質として、さらに他のpICln相互作用タンパク質、smD1を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、smD1を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「smD1相互作用タンパク質」または「smD1−IP」と称する。代表的なsmD1−IPを表7に示す。
【0020】
また我々は、GRF2複合体への関連をよりいっそう拡張して、ベイトタンパク質として、さらに他のpICln相互作用タンパク質、タンパク質smD3を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、smD3を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「smD3相互作用タンパク質」または「smD3」と称する。代表的なsmD3−IPを表8に示す。
【0021】
これら様々なGRF2/GRF2−IP複合体、Ndr/Ndr−IP複合体、Skb1/Skb1−IP複合体、PP2C/PP2C−IP複合体、pICln/pICln−IP複合体、4.1SVWL2/4.1SVWL2−IP複合体、smD1/smD1−IP複合体、およびsmD3/smD3−IP複合体の順列(permutation)は、これらが相互作用することにより、GRF2の様々な機能活性の調節に関与し、さらに、Ras依存性シグナル伝達および細胞成長の調節に関連する。これらの機能活性としては、これらに限定されないが、(i)生理学的なプロセス(例えば、細胞周期の制御、有糸分裂の調節、RNA代謝、細胞骨格構造の調節、細胞分化およびアポトーシス)、(ii)ウイルス感染への応答、(iii)細胞内シグナル伝達、(iv)転写調節、および(v)病態生理学的なプロセス(例えば、腫瘍形成や腫瘍の広がりなどの過増殖性疾患(hyperproliferative disorder)、神経変性疾患などの変性疾患、ウイルス感染)がある。
【0022】
本発明の他の観点は、上述したタンパク質の完全長または部分的なコーディング配列のいずれかを含む単離された核酸配列を提供する。
【0023】
本発明はさらに、その他の観点において、本発明のGRF2/GRF2−IP複合体、Ndr/Ndr−IP複合体、Skb1/Skb1−IP複合体、PP2C/PP2C−IP複合体、pICln/pICln−IP複合体、4.1SVWL2/4.1SVWL2−IP複合体、smD1/smD1−IP複合体、およびsmD3/smD3−IP複合体、同様に、それらの個々の要素を利用する様々な方法を提供する。
【0024】
好ましい実施形態において、タンパク質複合体の調節因子を同定する方法を提供し、当該方法は、(i)GRF2、GRF2相互作用タンパク質、Ndr相互作用タンパク質、Skb1相互作用タンパク質、PP2C相互作用タンパク質、pICln相互作用タンパク質、4.1SVWL2相互作用タンパク質、smD1相互作用タンパク質、およびsmD3相互作用タンパク質からなる群より選択された少なくとも2種のタンパク質のタンパク質複合体を含む反応混合物を作製すること、(ii)前記反応混合物と試験薬剤とを接触させること、および(iii)1以上の活性に関する試験薬剤の効果を測定すること、を含み、ここで当該効果は、以下の(a)〜(h)からなる群より選択される:(a)上記タンパク質複合体の存在度の変化、(b)上記複合体の活性の変化、(c)上記複合体の少なくとも1種の活性の変化 、(d)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体またはその成分の細胞内局在の変化、(e)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子の転写量の変化、(f)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の存在度の変化、(g)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の活性の変化、および(h)上記反応混合物が細胞全体の場合、細胞中の第2メッセンジャー量の変化。最も好ましい実施形態において、分析で同定された薬剤の1以上が、製薬上許容できる賦形剤と共に配合できる。
【0025】
好ましい実施形態において、GRF2依存性の成長を調節できる薬剤を同定する方法を提供し、当該方法は、(i)GRF2相互作用タンパク質、Ndr相互作用タンパク質、Skb1相互作用タンパク質、PP2C相互作用タンパク質、pICln相互作用タンパク質、4.1SVWL2相互作用タンパク質、smD1相互作用タンパク質、およびsmD3相互作用タンパク質からなる群より選択されたタンパク質を含む反応混合物を作製すること、(ii)前記反応混合物と試験薬剤とを接触させること、および(iii)試験薬剤の効果を1以上の活性に関して検出すること、を含み、ここで当該活性は、以下の(a)〜(h)からなる群より選択される:(a)上記タンパク質複合体の存在度の変化、(b)上記複合体の活性の変化、(c)上記複合体の少なくとも1種の活性の変化、(d)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体またはその成分の細胞内局在の変化、(e)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子の転写量の変化、(f)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の存在度の変化、(g)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の活性の変化、および(h)上記反応混合物が細胞全体の場合、細胞中の第2メッセンジャー量の変化。最も好ましい実施形態において、分析で同定された薬剤の1以上が、製薬上許容できる賦形剤と共に配合できる。
【0026】
本発明の他の観点は、細胞の成長状態を改変する方法を提供し、当該方法は、細胞と、上述した分析により同定された本発明のタンパク質複合体を調節する薬剤、または、GRF2依存性成長経路を調節する薬剤のいずれかとを接触させることを含む。
【0027】
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、上述した分析により同定された本発明のタンパク質複合体を調節する薬剤、または、GRF2依存性成長経路を調節する薬剤のいずれかとを接触させることを含む。
【0028】
本発明の他の観点は、細胞の分化を誘導する方法を提供し、当該方法は、細胞と、上述した分析により同定された本発明のタンパク質複合体を調節する薬剤、または、GRF2依存性成長経路を調節する薬剤のいずれかとを接触させることを含む。
【0029】
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖に関する症状の厳しさを軽減する方法を提供し、当該方法は、上述した分析により同定された本発明のタンパク質複合体を調節する薬剤、または、GRF2依存性成長経路を調節する薬剤のいずれかの治療上有効な量を、前記症状を有する動物に投与することを含む。
【0030】
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Rasシグナル伝達経路に含まれる活性の一部を抑制することができる薬剤とを接触させることを含む。
【0031】
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Skb1のメチルトランスフェラーゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む。
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Skb1のキナーゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む。
【0032】
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Skb1の正常な細胞内局在の阻害剤とを接触させることを含む。
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Ndrのキナーゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む。
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Ndrの正常な細胞内局在の阻害剤とを接触させることを含む。
【0033】
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、PP2Cのホスファターゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む。
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、pIClnの活性の阻害剤とを接触させることを含む。
本発明の他の観点は、表1〜9に列挙されたタンパク質およびその相同体を生産するように遺伝子操作された宿主細胞を提供する。
【0034】
本発明の他の観点は、細胞中の異常なGRF2依存性シグナル伝達を検出する方法を提供し、当該方法は、以下の(i)〜(iii)の1以上に関して細胞をスクリーニングする工程を含む:(i)GRF2相互作用タンパク質、Ndr相互作用タンパク質、Skb1相互作用タンパク質、PP2C相互作用タンパク質、pICln相互作用タンパク質、4.1SVWL2相互作用タンパク質、smD1相互作用タンパク質、またはsmD3相互作用タンパク質をコードした遺伝子の改変された発現量、(ii)GRF2相互作用タンパク質、Ndr相互作用タンパク質、Skb1相互作用タンパク質、PP2C相互作用タンパク質、pICln相互作用タンパク質、4.1SVWL2相互作用タンパク質、smD1相互作用タンパク質、またはsmD3相互作用タンパク質の、安定性、翻訳後修飾、細胞内局在および/または酵素活性の、改変されたレベル、および(iii)GRF2相互作用タンパク質、Ndr相互作用タンパク質、Skb1相互作用タンパク質、PP2C相互作用タンパク質、pICln相互作用タンパク質、4.1SVWL2相互作用タンパク質、smD1相互作用タンパク質、またはsmD3相互作用タンパク質を含む複合体の活性の改変されたレベル、である。
以下に、本発明の上記および他の観点を、添付の図面を参照しながら説明する。
【0035】
【発明の詳述】
1.大要
本発明はRasシグナル経路の成分を含むタンパク質複合体の発見に関し、より特定には、GRF2仲介シグナル伝達に関与するタンパク質に関する。これらタンパク質の様々な相互作用は、細胞の恒常性という特定の観点において、生化学的な性質新しい情報と、細胞内のシグナル伝達経路の細胞性かつ生理学的な結果とが解明された。
【0036】
本発明の一つの観点は、哺乳動物のGRF2タンパク質またはGRF2を含むタンパク質複合体と相互作用する能力を有するタンパク質を同定することに基づく。「ベイト(bait)」タンパク質としてGRF2を利用することによって、我々は、生理的な条件下でGRF2と複合体を形成する様々な異なるタンパク質を同定し、このようなタンパク質を、本明細書では集合的に「GRF2相互作用タンパク質」または「GRF2−IP」と称する。特定のGRT2−IPを表1に列挙する。
【0037】
特定のGRF2−IPをベイトタンパク質として利用することによって、このようなタンパク質と、さらなるタンパク質複合体との関係を拡張した。特に、本発明の他の観点は、セリン/スレオニンキナーゼNdrと相互作用するタンパク質、または、セリン/スレオニンキナーゼNdrを含む複合体を形成するタンパク質を同定することに関し、このようなタンパク質を本明細書では「Ndr相互作用タンパク質」または「Ndr−IP」と称する。代表的なNdr−IPを表3A〜Bに示す。同様に、本発明のさらに他の観点は、メチルトランスフェラーゼSkb1(またはGRF2−IP)を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「Skb1相互作用タンパク質」または「Skb1−IP」と称する。代表的なSkb1−IPを表4A〜Bに示す。本発明のさらに他の観点は、GRF2−IPホスファターゼPP2Cを含む複合体を形成するタンパク質を同定することに関し、このようなタンパク質を本明細書では「PP2C相互作用タンパク質」または「PP2C−IP」と称する。代表的なPP2C−IPを表5に示す。
【0038】
GRF2複合体への関連をよりいっそう拡張して、我々は、ベイトタンパク質として、Skb1相互作用タンパク質、pIClnを選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、pIClnを含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「pICln相互作用タンパク質」または「PICln−IP」と称する。代表的なpICln−IPを表2に示す。
【0039】
GRF2複合体への関連をよりいっそう拡張して、我々はまた、ベイトタンパク質として、pICln相互作用タンパク質、タンパク質4.1SVWL2(タンパク質4.1の多くのアイソフォームのうちの新規の型の一つ)を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、4.1SVWL2を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「4.1SVWL2相互作用タンパク質」または「4.1SVWL2−IP」と称する。代表的な4.1SVWL2−IPを表6に示す。
【0040】
GRF2複合体への関連をよりいっそう拡張して、我々はまた、ベイトタンパク質として、さらに他のpICln相互作用タンパク質、smD1を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、smD1を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「smD1相互作用タンパク質」または「smD1−IP」と称する。代表的なsmD1−IPを表7に示す。
【0041】
GRF2複合体への関連をよりいっそう拡張して、我々はまた、ベイトタンパク質として、さらに他のpICln相互作用タンパク質、タンパク質smD3を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、smD3を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「smD3相互作用タンパク質」または「smD3」と称する。代表的なsmD3−IPを表8に示す。
【0042】
これら様々なGRF2/GRF2−IP複合体、Ndr/Ndr−IP複合体、Skb1/Skb1−IP複合体、PP2C/PP2C−IP複合体、pICln/pICln−IP、4.1SVWL2/4.1SVWL2−IP複合体、smD1/smD1)−IP複合体、およびsmD3/smD3−IP複合体の順列は、これらが相互作用することにより、GRF2の様々な機能活性の調節に関与し、さらに、Ras依存性シグナル伝達および細胞成長の調節に関連する。これらの機能活性としては、これらに限定されないが、(i)生理学的なプロセス(例えば、細胞周期の制御、有糸分裂の調節、RNA代謝、細胞骨格構造の調節、細胞分化およびアポトーシス)、(ii)ウイルス感染への応答、(iii)細胞内シグナル伝達、(iv)転写調節、および(v)病態生理学的なプロセス(例えば、腫瘍形成や腫瘍の広がりなどの過増殖性疾患、神経変性疾患などの変性疾患、ウイルス感染)がある。
【0043】
従って、本発明において、治療および診断における使用のための利用可能な新規の分析および試薬が作製される。その上、以上の本発明の複合体の形成、または、1以上の本発明のタンパク質(GRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、PP2C−IP、pICln−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IP)の内因性の活性に影響を与え得る薬剤を同定するために、、薬剤を発見する分析が提供される。このような薬剤は、治療上、細胞成長および/または分化を改変するのに有用である。
【0044】
本発明はまた、1以上の本発明に係るGRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、PP2C−IP、pICln−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質、または、このようなタンパク質を含む複合体の生産および/または単離に関する方法論、およびその方法論から得られた調製物に関する。特に、本発明に係るタンパク質、および、その配列にハイブリダイズする核酸プローブのコーディング配列を含む組換え発現系が考慮されている。
【0045】
また本発明においては、本発明に係るGRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質に特異的な抗体、同様に、このようなタンパク質を含む複合体に特異的な抗体も考慮される。本発明の複合体に特異的な抗体は、組織中で上記複合体を検出すること、および、それらの組織における分布を決定すること、に用いることができる。
【0046】
2.定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で用いられる特定の用語を、以下にまとめる。
本明細書で用いられる「活性」という用語は、その最も広い概念における分子の機能を意味する。当該用語は、通常、これらに限定されないが、分子の生物学的、生化学的、物理学的または化学的な機能を含む。例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力や、他の分子の機能を促進する、活性化する、安定化する、阻害する、抑制する、または不安定化する能力や、他の分子を改変する能力や、他の分子によって改変される能力や、安定性や、細胞の内部または外部の特定の細胞内局在に位置させる能力が全て、本明細書で用いられる用語の定義に含まれるように考慮される。
【0047】
本明細書で用いられる「アゴニスト」という用語は、タンパク質複合体の形成を増大させる分子を意味するか、または、本発明の複合体または当該複合体中の分子に結合する場合、上記複合体の活性量を増加させる、もしくは、上記複合体の活性の持続時間を延長させる分子を意味する。アゴニストとしては、タンパク質、核酸、炭化水素、または他のいかなる分子が含まれ、例えば、複合体または当該複合体の分子に結合できる化学物質類、金属類、有機金属化合物剤などが挙げられる。またアゴニストとして、本発明の複合体のタンパク質要素から誘導された機能性ペプチドまたはペプチド断片も含まれ、または、タンパク質要素それ自身も含み得る。特定のペプチドの構造的特徴を模擬して設計された物理構造を有するペプチドミメティック、合成分子をアゴニストとして提供することもできる。その刺激は、直接的もしくは間接的でもよく、または、競合的もしくは非競合的メカニズムによるものでもよい。
【0048】
本明細書で用いられる「動物」という用語は、哺乳動物を意味し、好ましくは ヒトのような哺乳動物である。
【0049】
本明細書で用いられる「アンタゴニスト」という用語は、本発明の複合体または当該複合体中のタンパク質に結合する場合、上記複合体の活性またはそのタンパク質要素の量または持続期間を減少させる分子、または、形成された複合体の量を減少させる分子を意味する。アンタゴニストとしては、タンパク質(複合体の要素の結合領域で競合的に結合する抗体を含む)、核酸(遺伝子レベルで複合体の要素の発現を阻止するアンチセンス分子を含む)、炭化水素、または他のいかなる分子(例えば、化学物質類、金属類、有機金属化合物剤など)があり、これらは、複合体形成または活性を妨げるのに有効な程度で、哺乳動物型、好ましくはヒト型のGRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、または4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質に結合する。またアンタゴニストとしては、GRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質から誘導されたペプチドまたはペプチド断片、同様に、優性阻害性の点変異体がある。特定のペプチドの構造的特徴を模擬して設計された物理構造を有するペプチドミメティック、合成分子をアンタゴニストとして提供することもできる。その阻害は、直接的もしくは間接的でもよく、または、競合的もしくは非競合的メカニズムによるものでもよい。
【0050】
「ベイト」または「ベイトタンパク質」という用語は、それと結合し得る他のタンパク質を見出すためのターゲットとして用いられるポリペプチドを意味する。一般的に、ベイトタンパク質は、ベイトタンパク質を含む複合体の単離を容易にするために、タグを付されるか、または、固定化される。
【0051】
「結合」という用語は、2つの分子間の安定な結合を意味し、すなわち本発明においては、例えば、生理的条件下での静電性、疎水性、イオン性および/または水素結合による相互作用による、GRF2およびGRF2−IP、NdrおよびNdr−IP、SkbおよびSkb1−IP、pIClnおよびpICln−IP、PP2CおよびPP2C−IPタンパク質、4.1SVWL2および4.1SVWL2−IP、smD1およびsmD1−IP、smD3およびsmD3−IP間での安定な結合を意味する。
【0052】
本明細書において、「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」という用語は交換可能に用いられる。このような用語は、特定の被験細胞だけでなく、このような細胞の後代または可能性のある後代も意味すると解釈する。変異または環境的な影響のいずれかにより継代においてある種の改変が生じる可能性があるため、実際にはこのような後代は必ずしも親細胞と同一とはいえないが、本明細書で用いられる用語の範囲に含まれる。
【0053】
「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」とは、第一のアミノ酸配列(ポリペプチドをコードする)と、第二のアミノ酸配列(上記タンパク質のいずれのドメインとも無関係で実質的に非相同なドメインを定義した)との融合物である。キメラタンパク質は、上記第一のタンパク質も発現する生物中で(異なるタンパク質にもかかわらず)見出される外来ドメインを提示し、またキメラタンパク質は、異なる生物種で発現されるタンパク質構造の、「種間」、「遺伝子間」等での融合物であり得る。
【0054】
「GRF2シグナル伝達経路の成分」または「GRF2経路成分」という用語は、GRF2シグナル伝達現象の仲介に関与するポリペプチドを意味する。GRF2シグナル伝達経路の成分は、例えば、GRF2に直接結合するタンパク質、GRF2−IPには結合するがGRF2それ自身には直接結合することのできないタンパク質等を含むものとする。このような成分は、シグナル伝達経路においてGRF2の上流または下流に位置し、GRF2仲介シグナル伝達を作動または拮抗することができる。
【0055】
「化合物」、「試験化合物」および「分子」という用語は、本明細書において交換可能に用いられ、例えば、これらに限定されないが、ペプチド、核酸、炭化水素、低分子の有機分子、天然産物の抽出物のライブラリー、および他のいかなる分子(これらに限定されないが、化学物質類、金属類および有機金属化合物を含む)を意味する。
【0056】
「GRF2仲介シグナル伝達に影響を及ぼす(または調節する)ことができる化合物」という成句は、GRF2経路を介してシグナル伝達を阻害または強化する化合物を意味する。
【0057】
「保存された残基」または「保存的なアミノ酸置換」という成句は、特定の共通の特性に基づいたアミノ酸の分類を意味する。個々のアミノ酸間の共通の特性を定義する機能的な方法は、同種生物の対応するタンパク質間におけるアミノ酸変化の正規化した頻度を分析することである(Schulz, G. E. and R. H. Schirmer., Principles of Protein Structure, Springer−Verlag)。グループ間のアミノ酸が互いに優先的に交換する場合、従って、タンパク質構造全体に対する影響が互いに最も類似している場合、このような分析によってアミノ酸のグループを定義することができる(Schulz, G. E. and R. H. Schirmer., Principles of Protein Structure, Springer−Verlag)。この方法によって定義されたアミノ酸グループの例を以下に示す。
【0058】
(i)GluおよびAsp、Lys、ArgおよびHisからなる帯電したグループ、
(ii)Lys、ArgおよびHisからなる正に帯電したグループ、
(iii)GluおよびAspからなる負に帯電したグループ、
(iv)Phe、TyrおよびTipからなる芳香族グループ、
(v)HisおよびTrpからなる窒素環グループ、
(vi)Val、LeuおよびIleからなる大きい脂肪族の非極性グループ、
(vii)MetおよびCysからなるわずかに極性のグループ、
(viii)Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、GlnおよびProからなる小さい残基のグループ、
(ix)Val、Leu、Ile、MetおよびCysからなる脂肪族グループ、および
(x)SerおよびThrからなる小さいヒドロキシルグループ。
【0059】
上述したグループに加えて、各アミノ酸残基はそれ自身のグループを形成することができ、その個々のアミノ酸で形成されたグループは、当業界で一般的に用いられるアミノ酸の1文字表記および/または3文字表記で簡単に示される。
【0060】
「DEADボックス型」、「DEADボックス型ドメイン」または「DEADボックス型モチーフ」という用語は、アミノ酸モチーフ:Asp−Glu−Ala−Asp(1文字コードではDEAD)を意味する。DEADボックス型タンパク質とは、少なくとも1つのDEADボックス型モチーフを含むタンパク質であり、遺伝子発現の転写後調節に関与するものと考えられている。DEADボックス型ドメインは多くの推定のRNAヘリカーゼで見出されており、タンパク質と特定のRNAまたはRNAファミリーとの特異的な相互作用に寄与するものと考えられている(Lost et al. (1994) Nature 372:93−196;and Pause et al. (1993) Current Opinion in Structural Biology 3:953−959)。
【0061】
「破壊(destruction)ボックス型配列」または「破壊ボックス型モチーフ」という用語は、いくつかの細胞周期関連タンパク質のユビキチンが仲介する分解に必須なアミノ酸コンセンサス配列:RxxLxxxxNを意味する(Glotzer et al. (1991) Nature 349:132−138)。破壊 ボックス型配列は、タンパク質とその特異的なユビキチン化機構との間の要素を認識するように作用すると考えられている。
【0062】
「ポリペプチドをコードするDNA配列」という用語は、特定の個体中の1以上の遺伝子を意味し得る。当業界周知のように、特定のポリペプチドに関する遺伝子は、個体のゲノム中にシングルコピーまたは複数のコピーとして存在し得る。このような複製遺伝子は同一であるか、または、特定の改変(ヌクレオチド置換、付加または欠失がある)を含み、それでもなお、これらは全て実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードする。その上、ヌクレオチド配列中の特定の差異が個々の生物間で存在し、これは対立遺伝子(対立遺伝子)と呼ばれる。このような対立遺伝子の差異(allelic differences)により、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列において差異を生じることもあれば生じないこともあり、それでもなお同じ生物活性を有するタンパク質をコードする。
【0063】
本明細書で用いられる「ドメイン」という用語は、その分子の他の部分とは異なる特定の構造や機能を含む、タンパク質中の領域を意味する。
【0064】
本明細書で用いられる「遺伝子」または「組換え遺伝子」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を意味し、エキソンおよび(場合によっては)イントロン配列の両方を含む。「組換え遺伝子」は、ポリペプチドをコードする核酸、および、エキソンコーディング配列を含む核酸を意味するが、場合により染色体遺伝子由来のイントロン配列を含んでもよい。「イントロン」という用語は、タンパク質に翻訳されない所定の遺伝子に存在するDNA配列を意味し、通常、エキソンの間に見出される。
【0065】
「GI」または「GI番号」または「GI No.」という用語は、遺伝子および/またはタンパク質に関するデータベース照会番号(遺伝子バンクなど)を意味し、配列や他の関連情報を検索するのに有用である。
【0066】
「GRF2シグナル伝達経路」または「GRF2仲介シグナル」という用語は、GRF2またはGRF2と相互作用できるタンパク質を含むシグナル伝達現象を意味するものとする。
【0067】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、2つのペプチド間、または、2つの核酸分子間での配列類似性を意味する。相同性および同一性はいずれも、比較用に並べられた各配列の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列中の対応する位置が同じ塩基またはアミノ酸で占有されていれば、その分子はその位置において同一であり、対応する部位が同じまたは類似のアミノ酸残基(例えば、立体構造的および/または電子的な性質において類似するもの)で占有されていれば、その分子はその位置において相同(類似)とされる。相同性/類似性または同一性の割合の表現は、比較配列と共有の位置の同一または類似のアミノ酸の数を意味する。「関連していない」または「非相同の」配列とは、本発明に係る配列と、40%未満の同一性、好ましくは25%未満の同一性しかもたない配列である。同様に、「相同」または「相同の」配列とは、互いに少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、さらに95%〜99%の同一性を有する配列を意味する。
【0068】
「相同性」という用語は、類似の機能またはモチーフを有する遺伝子またはタンパク質を同定するのに用いられる数理学に基づく配列類似性の比較を意味する。本発明の核酸およびタンパク質配列は、公共データベースを用いて検索するための「問い合わせ配列」として用いることができ、例えば、他のファミリーメンバー、関連配列または相同体を同定することができる。このような検索は、NBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)(Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403−10)を用いて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラム(スコア=100、語長(wordlength)=12)を用いて行い、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラム(スコア=50、語長=3)を用いて行い、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較用のギャップ有り(gapped)アライメントを得るために、ギャップ有りBLASTを利用することができ、これはAltschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389−3402で説明される。BLASTおよびギャップ有りBLASTプログラムを利用する際、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびBLAST)のデフォルトパラメーターを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照。
【0069】
本明細書で用いられる「同一性」とは、配列の適合が最大になるように(すなわちギャップや挿入を考慮して)配列を並べた場合の、2以上の配列における対応する位置で同一なヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合を意味する。同一性は、既知の方法で容易に計算でき、この既知の方法としては、これらに限定されないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects、Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993;Computer Analysis of Sequence Data, Part I、Griffin、A. M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994;Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987;and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991;and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073(1988)で説明される方法がある。同一性を決定する方法は、試験された配列間で最大の適合が得られるように設計される。その上、同一性を決定する方法は、公共の利用可能なコンピュータープログラムでコード化されている。2つの配列間の同一性を決定するコンピュータープログラム方法としては、これらに限定されないが、GCGプログラムパッケージ(Devereux、J., et al., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984))、BLASTP、BLASTN、およびFASTA(Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215:403 −410 (1990) and Altschul et al. Nuc. Acids Res. 25:3389−3402 (1997))がある。BLASTXプログラムは、NCBIおよび他の源により公に利用可能である(BLAST Manual、Altschul、S.、et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894;Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403−410 (1990)。また、周知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性を決定するのに用いることができる。
【0070】
「相互作用タンパク質」という用語は、他のタンパク質と直接または間接的のいずれかで相互作用するポリペプチドを含むものとする。直接的な相互作用とは、タンパク質が、互いに結合する能力によって(例えば、共免疫沈降または他の手段によって)単離されることを意味する。間接的な相互作用とは、互いに結合するために他の分子を必要とするタンパク質を意味する。あるいは、間接的な相互作用とは、互いが直接結合することは決してないが、仲介物を介して相互作用するタンパク質を意味する。例えば、Rasは、GRF2と直接相互作用し、タンパク質4.1は、pIClnと直接相互作用する(タンパク質4.1はpIClnベイトと共免疫沈降する)。しかしながら、タンパク質4.1は、pICln仲介物によりGRF2と間接的に相互作用する(タンパク質4.1は、GRF2ベイトと共免疫沈降しないことがわかった)。
【0071】
本明細書で用いられる「単離された」という用語は、本発明に係るタンパク質およびタンパク質複合体に関しては、例えば、当該タンパク質または複合体が内在的に見出される細胞環境において、当該タンパク質または複合体と結合して通常存在しうるタンパク質の混入が本質的にないタンパク質またはタンパク質複合体の調製物を意味する。従って、単離されたタンパク質複合体は、例えばそれらの調節因子をスクリーニングする際のような単離中に通常「混入する」または上記複合体の研究を妨害する細胞成分から単離される。しかしながら、このような「単離された」複合体は他のタンパク質を組み込んでいてもよく、当該他のタンパク質は、調査される本発明に係るタンパク質またはタンパク質複合体によって調節される、ということが理解される。この場合において、このような追加のタンパク質としては、例えば、Ras、GEF、および、GRF2複合体で仲介されるシグナル伝達カスケードに関与する他のタンパク質がある。
【0072】
本明細書で用いられる「単離された」という用語は、DNAまたはRNAなどの核酸に関して、他のDNA、またはRNA(それぞれ高分子化合物(macromolecule)の天然資源に存在する)から分離された分子を意味する。好ましくは、例えば、単離されたポリペプチドをコードする核酸は、ゲノムDNAの特定の遺伝子の天然で直接隣接する核酸配列の10キロ塩基(kb)以下を含み、より好ましくはこのような天然に存在する隣接配列の5kb以下を含み、および最も好ましくはこのような天然に存在する隣接配列の1.5kb未満を含む。また、本明細書で用いられる「単離された」という用語は、細胞成分、ウイルス成分、または培地(組換えDNA技術で生産された場合)、または化学的な前駆物質もしくは他の化学物質(化学的に合成された場合)を実質的に含まない核酸またはペプチドを意味する。さらに、「単離された核酸」は、断片として天然に存在せず、自然状態で見出されない核酸断片を含むものとする。
【0073】
「哺乳動物GRF2」とは、Rasの活性化に関与するGタンパク質交換因子と相互作用する哺乳動物タンパク質、および、ヒトGRF2の配列またはそれと実質的に同一な配列を有する配列のいずれかの配列を有する哺乳動物タンパク質のファミリーを意味し、例えば、GRF2の非微生物性、望ましくは哺乳動物(例えば、マウス)の相同体がある。ヒトGRF2の配列(配列番号1)を以下に示す。
【0074】
【化1】
【0075】
「哺乳動物Ndr」とは、以下に示す配列(配列番号3)を有するヒトNdrを含む哺乳動物タンパク質、および、実質的にそれと同一な配列を有するタンパク質(その哺乳動物相同体を含む)のファミリーを意味する。
【0076】
【化2】
【0077】
「哺乳動物Skb1」とは、以下に示す配列(配列番号2)を有するヒトSkb1を含む哺乳動物タンパク質、および、実質的にそれと同一な配列を有するタンパク質(その哺乳動物相同体を含む)のファミリーを意味する。
【0078】
【化3】
【0079】
「哺乳動物4.1SVWL2」とは、以下に示す配列(配列番号4)を有するヒト4.1SVWL2を含む哺乳動物タンパク質ファミリー、および、実質的にそれと同一な配列を有する哺乳動物タンパク質(その哺乳動物相同体を含む)のファミリーを意味する。また、上記4.1ファミリータンパク質の他の新規のメンバーの一つである4.1SVWL1を、以下に示す(配列番号5)。
【0080】
【化4】
【0081】
ホモサピエンスの赤血球膜タンパク質4.1svwl1(配列番号5)のmRNAの10個のコンティグの翻訳および組み合わせは、cdsを用いて完成させた。
【0082】
【化5】
【0083】
本明細書でタンパク質の「哺乳動物相同体」と称されるポリペプチドは、他の哺乳動物のパラログまたは他の哺乳動物のオーソログを意味する。
【0084】
本明細書で用いられる「モチーフ」という用語は、特定の構造または機能を有するタンパク質で共通して見出されるアミノ酸配列を意味する。一般的に、コンセンサス配列は、特定のモチーフを表すために定義される。当該コンセンサス配列は、厳密に定義される必要はなく、位置の変異、退縮、長さの変異を含んでよい。当該コンセンサス配列をデータベース検索に用いて、アミノ酸配列中のモチーフの存在によって類似の構造または機能を有する他のタンパク質を同定することができる。特定のモチーフを有する他のタンパク質を同定するために、例えばGenBankまたはSwissProtのようなオンラインデータベースを、コンセンサス配列を用いて検索することができる。様々な検索アルゴリズムおよび/またはプログラムを用いることができ、例えばFASTA、BLASTまたはENTREZがある。FASTAおよびBLASTは、GCG配列分析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部として利用可能である。ENTREZは、National Center for Biotechniques Information, National Library of Medicine, National Institute of Health, Bethesda, Mdを介して利用可能である。
【0085】
本発明の「非ヒト動物」としては、例えばげっ歯類、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、雌牛、ニワトリ、両生類、爬虫類などのような脊椎動物がある。好ましい非ヒト動物は、げっ歯類ファミリーから選択され、例えばラットおよびマウスであり、最も好ましくはマウスであるが、トランスジェニック両生類、例えばアフリカツメガエル属のメンバーや、トランスジェニックニワトリも、例えば、胚形成および組織のパターニングを理解するための重要なツールを提供することができる。本明細書において「キメラ動物」という用語は、組換え遺伝子が見出される動物、または、動物細胞のいくつか(しかし全てではない)で組換え体が発現される動物を意味するように用いられる。「組織特異的キメラ動物」という用語は、組換え遺伝子が、いくつかの組織で存在する、および/または発現される(ただし他の組織では存在する、および/または発現されない)ことを示す。
【0086】
本明細書で用いられる「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、および、場合によってはリボ核酸(RNA)のようなポリヌクレオチドを意味する。また、この用語は、ヌクレオチド類似体から生産されたRNAまたはDNAいずれかの等価物、類似体として、および、説明される実施形態に適用可能なものとして、一本鎖ポリヌクレオチド(センスまたはアンチセンスなど)および二本鎖ポリヌクレオチドを含むものと理解されるべきである。
【0087】
本明細書では、「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は交換可能に用いられる。
【0088】
「PEST配列」または「PESTモチーフ」という用語は、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンおよびスレオニン残基が豊富なタンパク質の領域を意味する。PEST配列は、ユビキチン経路を介した様々なタンパク質の分解シグナルとして作用するようである。PEST領域は、タンパク質およびその特異的ユビキチン化機構の間の認識要素として作用すると考えられている。
【0089】
「PH」とは、プレクストリンホモロジーを意味する。
「PHドメイン」または「PHモチーフ」という用語は、プレックストリンの約100個のアミノ酸領域と相同性を有するポリペプチドを意味する。構造的な研究が示すところによれば、PHドメインは、2つの逆平行β−シートおよび長いC末端αヘリックスを含む類似のコンフォメーションに折りたたまれる(Gibson et al., 1994, Trends Biochem. Sci. 19:349−353)。PHドメインを有することがわかったタンパク質のなかでも、シグナル伝達または細胞骨格の構築において重要な役割を有するタンパク質のメンバーは、例えば、スペクトリン、ダイナミン、ホスホリパーゼC−γ、Btk、RasGAP、mSOS−1、Rac、Aktである。様々なPHドメインの例は、Musacchio, A., et al., TIBS, 18:343−348, 1993およびGibson, T. J., et al., TIBS, 19:349−353, 1994に示される。他のPHドメインは、これらの出版物で説明されている配列アライメント技術および3次構造比較を用いて同定することができる。
【0090】
本明細書で用いられる「表現型」とは、例えば、いずれか一つの特性を有する細胞の、または特性のいずれかのグループを有する細胞の、全体の物理学的、生化学的、および生理学的な性質を意味する。
【0091】
「精製タンパク質」という用語は、タンパク質の調製物を意味し、好ましくは、単離形態のタンパク質、またあるいは、細胞または細胞溶解産物中で通常タンパク質と結合する他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質を意味する。「他の細胞のタンパク質を実質的に含まない」(または本明細書では「他の混入タンパク質を実質的に含まない」ともいう)という用語は、20%未満(乾燥重量で)の混入タンパク質、および好ましくは5%未満の混入タンパク質しか含まない各構成タンパク質の個々の調製物と定義される。各構成タンパク質の機能的形態は、以下の実施例で説明されるような、クローン化遺伝子を用いて調製される精製調製物であり得る。再構成タンパク質混合物を生成するのに用いられる構成タンパク質を調製することに言及する場合、「精製された」とは、指定の分子が他の生体高分子の非存在下で存在することを意味し、ここで他の生体高分子とは、例えば他のタンパク質(特に、精製調製物として、または、本発明に係る再構成混合物中のその機能において、構成タンパク質の特徴を実質的にマスクする、減少させる、混同させる、または改変するような他のタンパク質)である。本明細書で用いられる「精製された」という用語は、好ましくは少なくとも80%(乾燥重量で)、より好ましくは95〜99重量%の範囲、および最も好ましくは少なくとも99.8重量%の同じ型の生体高分子が存在することを意味する(しかしながら、水、緩衝液、および他の低分子、特に5000未満の分子量を有する分子は存在してよい)。本明細書で用いられる「純粋な」という用語は、好ましくは、直前で述べた「精製された」と同じ数的限定を有する。「単離された」および「精製された」とは、天然状態(例えば、細胞の一部として)のタンパク質、または、細胞溶解産物の一部としてのタンパク質のいずれも含まれず、または、成分に分離されているが(例えば、アクリルアミドゲルで)純粋な(例えば、混入タンパク質を含まない)物質または溶液のいずれの状態でもないタンパク質も含まれない。また、本明細書で用いられる「単離された」という用語は、組換えDNA技術で生産された場合は細胞成分または培地、または、化学合成された場合は化学的な前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない構成タンパク質を意味する。
【0092】
「組換えタンパク質」という用語は、組換えDNA技術により生産される本発明のタンパク質を意味し、この際、通常、発現タンパク質をコードするDNAは適切な発現ベクターに挿入され、次にそれを用いて宿主細胞に形質転換し、異種タンパク質を生産する。その上、組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子に関して「から誘導された」という成句は、「組換えタンパク質」の意味の範囲内で、野生型タンパク質のアミノ酸配列、または、それに類似したアミノ酸配列(天然に存在するタンパク質を置換および欠失などで変異させることにより生成した)を有するタンパク質を含むものとする。
【0093】
本明細書で用いられる「レポーター遺伝子構造」とは、転写調節配列に実施可能に連結した「レポーター遺伝子」を含む核酸である。レポーター遺伝子の転写は、これらの配列によって制御される。少なくとも1以上のこれら制御配列の活性は、GRF2またはGRF2相互作用タンパク質を含むシグナル伝達経路によって直接的または間接的的に調節される。転写調節配列は、プロモーターおよび他の調節領域を含み、例えば、基質タンパク質のレベルへの応答してレポーター遺伝子の発現レベルを調節するエンハンサー配列などがある。
【0094】
「半精製された(semi−purified)」とは、タンパク質調製に関して、他の細胞性タンパク質またはウイルスタンパク質から予め分離されたタンパク質を意味する。例えば、全部の細胞溶解物に比べて、基質タンパク質を共に含む再構成された複合系のタンパク質は、混合物中の全ての他のタンパク質に対して少なくとも50%の純度で混合物中に存在し、より好ましくは少なくとも75%の純度、さらにより好ましくは90〜95%の純度で存在する。
【0095】
本明細書で用いられる「半精製された細胞抽出物」という用語、あるいは、「分画された溶解物」という用語は、全部の細胞溶解物の少なくとも1つの成分を実質的に分離するように処理された細胞溶解物、または、全部の細胞溶解物の少なくとも1つの成分を実質的に高濃度にするように処理された細胞溶解物を意味する。本明細書で用いられる「実質的に分離する」とは、全部の細胞溶解物の成分の、少なくとも10%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも80%を分離することを意味する。本明細書で用いられる「実質的に高濃度にする」とは、全細胞溶解物の少なくとも1つの成分を、全細胞溶解物の他の成分と比較して、少なくとも10%、より好ましくは少なくとも30%、さらにより好ましくは少なくとも約50%まで高濃度にすることを意味する。分離または高濃度にされた成分は、GRF2シグナル伝達経路の成分、例えば、GRF2、GRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質等であり得る。また、「半精製された細胞抽出物」という用語は、所定の成分がコントロールされた細胞より実質的に多くなる、または実質的に少なくなるように細胞を処理した場合、細胞からの溶解物も含むものとする。例えば、GRF2シグナル伝達経路の成分を全く(または非常に少量しか)生産しないように改変された細胞(例えば、組換えDNA技術により)は、細胞溶解により、半精製された細胞抽出物を生産する。
【0096】
本明細書において「シグナル伝達」、「シグナル伝達」、「シグナル伝達経路」、「シグナル伝達経路」などの用語は交換可能に用いられ、細胞環境からの物理学的または化学的シグナルの細胞膜を介したプロセシングを意味し、これは、数種のメカニズムの1以上を介して生じ、当該メカニズムとしては、例えば、酵素(プロテアーゼ、または、リン酸化パターンまたは他の翻訳後修飾を改変し得る他の酵素)の活性化/不活性化、イオンチャンネルまたは細胞内のイオン貯蔵の活性化、グアニンヌクレオチド結合タンパク質中間体を介したエフェクター酵素の活性化、イノシトールリン酸の形成、アデニリルシクラーゼの活性化または不活性化、転写因子および/または活性化の直接的な活性化(または阻害)などがある。
【0097】
本明細書で用いられる「低分子」とは、約5kD未満、最も好ましくは約2.5kD未満の分子量を有する組成物を意味するものとする。低分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティック、炭化水素、脂質または他の有機分子(炭素含有)または無機分子であり得る。多くの製薬会社は、化学的および/または生物学的な混合物の広範なライブラリーを所持しており、当該ライブラリーは一連の低分子、しばしば真菌、細菌、または藻類抽出物を含み、本発明のいずれかの分析でスクリーニング可能である。
【0098】
本明細書で用いられる「特異的にハイブリダイズする」という用語は、ターゲット遺伝子配列、または、それらに相補的な配列、またはそれらの天然に存在する変異体の少なくとも15、25、50または100個の連続したヌクレオチドにハイブリダイズし、ターゲット遺伝子に比べて細胞性の核酸(例えば、mRNAまたはゲノムDNA)に対するバックグラウンドハイブリダイゼーションが、15%未満、好ましくは10%未満、およびより好ましくは5%未満であるような、本発明の核酸プローブ/プライマーの能力を意味する。
【0099】
ポリペプチドに対して用いられる場合の「実質的な配列同一性」とは、2種の哺乳動物ペプチド配列が、デフォルトGAPを用いるGAPまたはBESTFITプログラムによって並べられた場合、少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは少なくとも99%の配列同一性またはそれ以上の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的なアミノ酸置換と区別される。例えば、電荷または極性などの化学的特性が類似するアミノ酸の置換によって、タンパク質の特性が影響を受けることはあまりない。例えば、アスパラギンに対してグルタミン、または、アスパラギン酸に対してグルタミン酸が挙げられる。
【0100】
本明細書で用いられる「組織特異的プロモーター」という用語は、プロモーターとして作用するDNA配列、すなわち、プロモーターに操作可能に連結した選択DNA配列の発現を調節するDNA配列を意味し、これらは、組織の特定の細胞、例えば泌尿器系由来の細胞(例えば、腎臓細胞)、または神経系由来の細胞(例えば、ニューロン性細胞)において、選択DNA配列の発現に作用する。またこの用語は、最初はある組織での選択DNAの発現を調節するが、他の組織での発現を起こすような、いわゆる「leaky」プロモーターも同様に含む。
【0101】
本明細書で用いられる「トランスフェクション」という用語は、核酸が仲介する遺伝子の移動によって、核酸、例えば発現ベクターを、レシピエント細胞に導入することを意味する。本明細書で用いられる「形質転換」とは、細胞が外来性のDNAまたはRNAを取り込んだ結果として細胞が変化し、例えば、形質転換した細胞が本発明のポリペプチドの組換え型を発現するようなプロセス、または、形質転換された遺伝子からアンチセンス発現が起こり、その結果天然に存在する型の遺伝子の発現が行われなくなるようなプロセス、を意味する。
【0102】
本明細書で用いられる「形質転換遺伝子」という用語は、それが導入されるトランスジェニック動物または細胞にとって部分的または完全に異種な、すなわち外来の核酸配列、または、それが導入されるトランスジェニック動物または細胞の内在性遺伝子と相同な核酸配列を意味するが、これらは、それが挿入される細胞のゲノムを変化させるような方法で(例えば、天然の遺伝子の位置とは異なる位置に挿入されるか、または、それが挿入されることによりノックアウトが起こる)、動物のゲノムに挿入できるように設計されるか、または、動物のゲノムに挿入される。形質転換遺伝子は、選択核酸の最適な発現に必要な1以上の転写調節配列やその他いかなる核酸(例えばイントロンなど)を含んでもよい。
【0103】
本明細書で用いられる「トランスジェニック動物」とは、いかなる動物、好ましくはヒト以外の哺乳動物、鳥類または両生類であり、この場合、当業界周知のトランスジェニック技術のような人間が介入する方法で導入された異種核酸を上記動物の1以上の細胞に含む。マイクロインジェクションや組換えウイルスでの感染などの方法によって計画的に遺伝子操作して、核酸を細胞の前駆体に導入することによって、直接または間接的に核酸を細胞に導入する。遺伝子操作という用語は、典型的な異種交配、またはインビトロの受精というよりむしろ、組換えDNA分子の導入を指す。このような分子は、染色体に統合されてもよいし、または、染色体外で複製されるDNAであってもよい。本発明で望ましい一般的なトランスジェニック動物において、形質転換遺伝子は、例えば、アゴニスト型またはアンタゴニスト型のいずれかの形態で、細胞にタンパク質の組換え型を発現させる。しかしながら、例えば、以下で説明するFLPまたはCREリコンビナーゼ依存性の構造として、組換え遺伝子がサイレントであるトランスジェニック動物も含まれる。
【0104】
「転写調節配列」とは、本明細書で用いられる総称的な用語であり、それと操作可能に連結されるタンパク質のコーディング配列の転写を誘導または制御するDNA配列(例えば開始シグナル、エンハンサー、およびプロモーターなど)を意味する。好ましい実施形態において、組換えタンパク質遺伝子の転写は、発現が意図された細胞型における組換え遺伝子発現を制御するプロモーター配列(または他の転写調節配列)の制御下で行われる。また、組換え遺伝子も、タンパク質の天然に存在する形態の転写を制御する配列と同じかまたは異なる転写調節配列の制御下にあり得ることも理解されよう。
【0105】
本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、それに連結した他の核酸を移送することができる核酸分子を意味する。好ましいベクターの一つの型としてエピゾームがあり、すなわちエピゾームとは、染色体外での複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、それに連結した核酸の自律的な複製/発現が可能なベクターである。操作可能に連結した遺伝子の発現の指示が可能なベクターとは、本明細書では「発現ベクター」と称する。一般的に、組換えDNA技術で有用な発現ベクターは、多くの場合「プラスミド」の形態であり、プラスミドとは、環状の二本鎖DNAのループであり、それがベクター形態の場合には染色体に結合しない。プラスミドは最も広く用いられる形態のベクターであるため、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられる。しかしながら、本発明では、同等の機能を有し、今後当業界で知られるようになる他の形態の発現ベクターも含むものとする。
【0106】
また「WD−40モチーフ」は、当業界では「β−トランスデューシンリピート」または「WD−40リピート」と呼ばれ、これは、配列の2つの末端(アミノ末端およびカルボキシル末端)において比較的よく保存された一連のアミノ酸を有する約25〜50個の連続したアミノ酸配列と概略的に定義できる(Simon et al., Science 252:802−808 (1991) and Neer et al., Nature 371:297 (1994)で述べられる)。WD−40リピート含有タンパク質の少なくとも1つのWD−40リピートの保存されたセットは、一般的に、特定の位置に保存されたアミノ酸を含む。アミノ末端のセットは、2個の連続したアミノ酸から構成され、多くの場合、Gly、その後にHisを含む。カルボキシル末端のセットは、6〜8個の連続したアミノ酸から構成され、一般的に、その第一の位置にAsp、およびTrp、続いてその最後の2つの位置にAspを含む。WD40リピートを特徴付ける一般式は、{X6〜94−[GH−X23〜41−WD]}Nであり、式中、X6〜94は、6〜94個の連続したアミノ酸残基を示し、X23〜41は、23〜41個の連続したアミノ酸残基を示し、およびNは、4〜8の整数を示す(Neer et al., Nature 371:297 (1994))。しかしながら、他のWD40リピートも当業者により認識できる。特定のタンパク質中のWD−40リピートの数は、2から8以上の範囲であり得る。
【0107】
「全部の溶解物」という用語は、単に細胞を溶解させて溶解物状にする工程の後に、例えば、分画したり、除去したり、付け加えたりする操作を行っていない細胞溶解物を意味する。
【0108】
「亜鉛(zinc)フィンガードメイン」および「亜鉛フィンガーモチーフ」という用語は、以下の一般式で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを単離したペプチド、またはその部分的なペプチドを意味する:一般式C−X2,4−C−X3−[LIVMFYWC]−X8−H−X3,5−H、および/または、一般式C−X2,4−C−X3−F−X5−L−X2−H−X3,4−Hであり、式中、Xは任意のアミノ酸を示す(Prosite PDOC00028)。亜鉛フィンガーのフォールディングは、保存されたシステイン(C)およびヒスチジン(H)残基が結合して四面体状に配置された亜鉛イオンの周りで組織化される(Miller et al. (1985) EMBO J. 4:1609, ’Klug and Rhodes (1987) Trends Biochem. Sci. 12:464)。タンパク質は、その配列中に、ドメインの不完全または減縮されたコピーを含む亜鉛フィンガーモチーフを1つまたは複数含んでもよい。多数の亜鉛フィンガータンパク質が、亜鉛フィンガーを介してDNAと相互作用するDNA結合タンパク質であることがわかっている。
【0109】
3.代表的な核酸および発現ベクター
以下に説明するように、本発明の一つの観点は、GRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、またはsmD3−IPタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸に関し、ここで上記タンパク質としては、例えば、表1〜9に示されたタンパク質、および/またはこのような核酸の等価物である。本明細書で用いられる「核酸」という用語は、断片および等価物を含むように意図される。等価物という用語は、GRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、またはsmD3−IPタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、例えば、他のタンパク質(GRF2シグナル伝達経路の他の成分など)と結合する能力を保持するもの、または、タンパク質が内因性の酵素活性を有する場合は基質に作用するもの、と理解される。同等のヌクレオチド配列とは、1以上のヌクレオチド置換、付加または欠失により異なる配列(例えば対立遺伝子変異体)を含み、従って、例えば遺伝子コードの減縮により、表1〜9で示されたコーディング配列のヌクレオチド配列とは異なるコーディング配列を含む。また等価物は、ストリンジェントな条件下(すなわち、約1Mの塩濃度で形成された二本鎖DNA分子の融解温度(Tm)より約20〜27℃低い条件に等しい)で、表1〜9で示されたコーディング配列のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。DNAハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェント条件としては、例えば、約45℃での6.0×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)、続いて50℃での2.0×SSCによる洗浄が、当業者周知であるか、または、Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1−6.3.6)に記載されている。例えば、洗浄工程における塩濃度は、低いストリンジェンシー(50℃で約2.0×SSC)から、高いストリンジェンシー(50℃で約0.2×SSC)までの範囲から選択できる。加えて、洗浄工程における温度は、低いストリンジェント条件(室温、すなわち約22℃)から、高いストリンジェント条件(約65℃)にかけて増加しうる。一つの実施形態において、等価物は、表1〜9で示されるコーディング配列のヌクレオチド配列から誘導された核酸配列、および、進化的に関連する核酸配列をさらに含む。
【0110】
その上、通常認識されるように、特定の環境下では、本発明に係るGRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質の相同体を提供することが有利な場合があり、当該相同体は、天然に存在する型のタンパク質の生物活性の部分集合だけを促進または阻害するために、アゴニスト(ミメティック)またはアンタゴニストのいずれか一方として限定された能力で機能する。従って、全ての特定のタンパク質の生物活性に向けられたアゴニストまたはアンタゴニストを用いた治療に比べて、限定された機能を有し、より少ない副作用の相同体を用いた治療によって、特定の生物学的な効果を引き出すことができる。例えば、アンタゴニスト型の相同体を生産することができ、当該相同体は、GRF2シグナル伝達経路において他のタンパク質と結合する野生型(「元の(authentic)」)タンパク質の能力を妨害するが、内因性の酵素活性またはその他の複合体を形成する能力(例えば、細胞の他の調節メカニズムに関与し得るような)を実質的に妨害しない。
【0111】
本明細書ではGRF2経路成分ポリペプチドと称されるポリペプチド、例えば、GRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質は、好ましくは、表1〜9に記載のGenBank寄託物で示されるアミノ酸配列の全部または部分に相当するアミノ酸配列を有するか、または、これらタンパク質の一つと相同であり、例えば他のヒトパラログ、または哺乳動物オーソログなどがある。
【0112】
一般的に、GRF2経路成分ポリペプチドの生物活性は、以下に示す1以上の性質によって特徴付けられる:真核細胞、特に哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)の細胞周期を調節する能力;真核細胞の増殖/細胞成長を調節する能力;または、細胞/組織の分化を調節する能力、である。また、本発明に係るポリペプチドは、他の細胞のタンパク質の動作に影響を与えることによって、細胞成長または増殖を調節することができる。GRF2経路成分ポリペプチドは、タンパク質の野生型の機能の特異的なアゴニストでもよく、または、触媒的に不活性な変異体のような特異的なアンタゴニストでもよい。本発明に係るGRF2経路成分の他の生物活性とは、本明細書で説明されるほか、本発明の開示の観点において当業者に十分明白であるものも含まれる。
【0113】
一つの実施形態において、本発明の核酸は、天然に存在する脊椎動物のGRF2経路成分の遺伝子産物のアゴニストまたはアンタゴニストであるポリペプチド(例えば、表1〜9で示されたタンパク質)をコードする。好ましいGRF2経路成分は、表1〜9で示されたアミノ酸配列と同一または相同の成分である。好ましい核酸は、表1〜9で示されたアミノ酸配列と、少なくとも60%相同、より好ましくは70%相同、最も好ましくは80%相同のポリペプチドをコードする。また、GRF2経路成分の活性を有するポリペプチドをコードし、表1〜9で示された配列と少なくとも約90%、より好ましくは少なくとも約95%、および最も好ましくは少なくとも約98〜99%相同な核酸も、本発明の範囲内に含まれる。好ましくは、当該核酸は、表1〜9で示されたヒトGRF2シグナル伝達経路の成分をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むcDNA分子である。
【0114】
また、遺伝子コードが減縮したことによって表1〜9で示されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と異なる単離された核酸も、本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸の数は、1以上のトリプレットで設計される。同じアミノ酸を明示するコドンまたは同義コドン(例えば、CAUおよびCACはヒスチジンの同義コドンである)により、アミノ酸配列またはタンパク質に影響を与えない「サイレント」変異が生じる。しかしながら、本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列に変化を与えないDNA配列多型が、哺乳動物細胞中に存在することが予測される。特定のタンパク質をコードする核酸の1以上のヌクレオチド(ヌクレオチドの約35%まで)のこのような変異が、自然の対立遺伝子変異により、所定の種の個体間で存在することが、当業者には明白である。このようなヌクレオチド変異のいずれかまたは全部、およびその結果生じるアミノ酸多型は、本発明の範囲内である。
【0115】
本発明は、真核細胞から誘導されたGRF2経路成分をコードする核酸に関し、当該核酸は、表1〜9に記載の配列で示されるGRF2経路成分と進化的に関連したアミノ酸配列を有し、ここで「進化的に関連した」とは、自然に生じる(例えば、対立遺伝子変異またはディファレンシャルスプライシングによって)アミノ酸配列を有するGRF2経路成分を意味し、同様に、例えば、コンビナトリアル変異誘発により生じるGRF2経路成分の突然変異体を意味する。
【0116】
また、本発明に係るタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする核酸の断片も本発明の範囲内である。本明細書で用いられる、GRF2経路成分の活性な部分をコードする核酸の断片とは、例えば、表1〜9で示されたタンパク質の完全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より少ないヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、および、完全長タンパク質の生物活性の少なくとも一部を保持するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またあるいは、完全長タンパク質の生物活性のアンタゴニストとして機能的なヌクレオチド配列、を意味する。このような断片は、例えば、当該断片が誘導される完全長タンパク質に適切なものとして、GRF2経路成分と他のタンパク質との相互作用を仲介するドメインを含むポリペプチドを含む。
【0117】
また、本発明の範囲内の核酸は、リンカー配列、改変された制限エンドヌクレアーゼ部位、および、このような組換えポリペプチドの分子クローニング、発現または精製に有用な他の配列を含んでもよい。
【0118】
以下に示される実施例で指示したとおり、GRF2経路成分ポリペプチドをコードする核酸は、本明細書で説明されるプロトコール、同様に一般的に当業者既知のプロトコールに従って、いずれの脊椎生物からのmRNAまたはゲノムDNAから得ることができる。GRF2経路成分ポリペプチドをコードするcDNAは、例えば、細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞からのトータルmRNAを単離することによって得ることができる。続いて、多数の既知の技術のいずれかを用いて、二本鎖cDNAsを上記トータルmRNAから調製し、その後、適切なプラスミドまたはバクテリオファージベクターに挿入することができる。また、GRF2経路成分をコードする遺伝子を、確立されたポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて、本発明で提供されるヌクレオチド配列情報に従いクローニングすることができる。
【0119】
本発明の他の観点は、「アンチセンス」療法における単離された核酸の使用に関する。本明細書で用いられるアンチセンス療法とは、本発明に係るGRF2経路成分の一つをコードする細胞性のmRNAおよび/またはゲノムDNAを含む細胞環境下で特異的にハイブリダイズする(例えば、結合する)オリゴヌクレオチドプローブまたはそれらの誘導体を投与し、または、インサイチュで生成することによって、そのタンパク質の発現を阻害すること(例えば、転写および/または翻訳を阻害することによって)を意味する。結合は、決まった塩基対の相補性によってなされ、または、例えば二本鎖DNAに結合する場合は、ダブルヘリックスの主溝における特異的な相互作用を介して結合が起こる。一般的に、アンチセンス療法とは、当業界で通常用いられる技術範囲を意味し、オリゴヌクレオチド配列への特異的な結合によるいかなる治療も含まれる。
【0120】
本発明のアンチセンス構造(構造)は、例えば、細胞中で転写される場合、GRF2経路成分をコードする細胞のmRNAの少なくとも特有な部分に相補的なRNAを生産する発現プラスミドとして提供される。あるいは、アンチセンス構造は、エクスビボで生成するオリゴヌクレオチドプローブであり、これは、細胞に導入された場合、GRF2経路成分をコードするmRNAおよび/またはゲノム配列とハイブリダイズすることによって発現を阻害する。このようなオリゴヌクレオチドプローブとして好ましくは、内在性ヌクレアーゼ(例えば、エキソヌクレアーゼおよび/またはエンドヌクレアーゼ)に耐性であり、従ってインビボで安定な、改変オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いられる代表的な核酸分子は、DNAのホスホラミデート、ホスホチオエートおよびメチルホスホネート類似体である(米国特許第5,176,996号;第5,264,564号;および第5,256,775号も参照)。加えて、アンチセンス療法に有用なオリゴマーを構築する一般的な方法は、例えば、van der Krol et al., (1988) Biotechniques 6:958−976;およびStein et al., (1988) Cancer Res 48:2659−2668に記載される。
【0121】
従って、本発明の改変オリゴマーは、治療、診断、および研究の環境において有用である。治療用途において、当該オリゴマーは、一般的にアンチセンス療法に適切な方法で利用できる。このような療法のために、全身および局所的または部分的な投与を含む様々な投与様式にあわせて本発明のオリゴマーを配合することができる。通常、技術や配合については、Remmington’s Pharmaceutical Sciences(Meade Publishing Co., Easton、PA)で見出すことができる。全身投与に関しては、注射が好ましく、例えば筋肉注射、静脈注射、腹膜内注射、結節内(intranodal)注射、および皮下注射があり、本発明のオリゴマーは、液体、好ましくは生理学的に適合可能な緩衝液(例えばハンクス液またはリンガー液)に配合することができる。加えて、当該オリゴマーは、固形状で配合され、使用直前に再溶解または懸濁することができる。また、凍結乾燥形態も含まれる。
【0122】
また、経粘膜または経皮の方法で全身投与することができ、また上記化合物を経口的に投与することもできる。経粘膜または経皮投与に関して、関門(barrier)を透過させるのに適した浸透剤が製剤に用いられる。このような浸透剤としては、一般的に当業界で知られており、例えば、経粘膜投与のための胆汁酸塩やフシジン酸誘導体がある。加えて、透過を促進するのに界面活性剤を用いることができる。経粘膜投与は、鼻内噴霧を介して、または、坐剤を用いてなされ得る。経口投与に関して、上記オリゴマーは、従来の経口投与形態、例えばカプセル、錠剤、およびトニックに配合される。局所投与に関して、本発明のオリゴマーは、一般的に当業界で既知の軟膏、軟膏剤(salve)、ゲル、またはクリーム剤に配合される。
【0123】
治療での使用に加えて、本発明のオリゴマーは、診断試薬として用いることができ、当該診断試薬は、上記オリゴマーが特異的に結合するターゲットDNAまたはRNA配列の存在または非存在を検出し、例えば、本発明の遺伝子の発現レベルを決定したり、本発明の遺伝子が遺伝学的な異常を含むかどうかを決定したりできる。
【0124】
本発明の他の観点において、本発明に係る核酸は発現ベクター中に供給され、当該発現ベクターは、目的のGRF2経路成分ポリペプチドをコードし、少なくとも1つの調節配列が操作可能に連結したヌクレオチド配列を含む。「操作可能に連結された」とは、ヌクレオチド配列を発現させるような方法でヌクレオチド配列が調節配列に連結されていることを意味するものとする。調節配列は、技術的に認識されており、GRF2経路成分の活性を有するポリペプチドが発現するように選択される。従って、「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御因子を含む。代表的な調節配列は、Goeddel;Gene Expression Technology:Methods in Enzymology(Academic Press, San Diego, CA (1990))に記載される。例えば、DNA配列が発現制御配列に操作可能に連結された場合、DNA配列の発現を制御するような多様な発現制御配列のいずれもこれらベクター中で用いることができ、それによって本発明のGRF2経路成分をコードするDNA配列を発現する。このような有用な発現制御配列としては、例えば、SV40の初期および後期プロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス前初期プロモーター、lac系、trp系、TACまたはTRC系、T7プロモーター(その発現はT7RNAポリメラーゼにより指示される)、λファージの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質に関する制御領域、3−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素に関するプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター(例えば、Pho5)、酵母のα−交配因子プロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、および、原核細胞もしくは真核細胞またはそのウイルスの遺伝子発現を制御することが知られている他の配列、およびそれらの様々な組み合わせ、が挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞および/または発現が望まれるタンパク質のタイプなどの要素に依存すると理解されるべきである。その上、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、ベクターによりコードされた他のタンパク質(例えば抗生物質マーカー)のいずれかの発現も考慮されるべきである。
【0125】
本発明に係る遺伝子構造を用いて、本発明に係るGRF2経路成分ポリペプチドを培地で増殖させた細胞中で発現させ、例えば、タンパク質またはポリペプチド(精製のための融合タンパク質またはポリペプチドを含む)を生産することができることは、明白である。
【0126】
また、本発明は、1以上の本発明に係るGRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質のコーディング配列を含む組換え遺伝子でトランスフェクトした宿主細胞に関する。当該宿主細胞は、どのような原核または真核細胞でもよい。例えば、本発明のポリペプチドは、微生物細胞(例えばE. coli)、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス発現系を利用)、酵母、または哺乳動物細胞で発現させることができる。他の適切な宿主細胞が当業者既知である。
【0127】
従って、本発明はさらに、本発明に係るGRF2経路成分ポリペプチドを生産する方法に関する。例えば、GRF2経路成分ポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞を、上記ポリペプチド発現を起こすのに適した条件下で培養することができる。上記ポリペプチドは、細胞の混合物やポリペプチドを含む培地から分離・単離することができる。あるいは、上記ポリペプチドが細胞質中に保持される場合、その細胞を回収し、溶解し、そのタンパク質を単離する。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養物に適切な培地は、当業界周知である。上記ポリペプチドは、当業界で知られたタンパク質精製の技術を用いて、細胞培地、宿主細胞、またはその両方から単離することができ、上記精製技術としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動、および、GRF2経路成分の特定のエピトープに特異的な抗体を用いたイムノアフィニティー精製がある。好ましい実施形態において、GRF2経路成分は、その精製を促進するドメインを含む融合タンパク質であり、例えばGRF2経路成分−GST融合タンパク質である。
【0128】
従って、本発明に記載のGRF2経路成分のクローニングで得られたヌクレオチド配列は、上記タンパク質の全部または選択された部分をコードしており、これらは、微生物細胞または真核細胞のプロセスにより上記タンパク質の組換え形態を生産するのに用いることができる。標準的な方法として、ポリヌクレオチド配列を遺伝子構造(例えば発現ベクター)にライゲーションし、および、真核細胞(酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物の細胞)または原核細胞(細菌細胞)のいずれかの宿主へ形質転換またはトランスフェクションする。本発明に従って、類似の方法またはその改変方法を用いて、微生物による方法または組織培養技術で組換えGRF2経路成分、またはその部分を調製することができる。
【0129】
クローニングされた遺伝子またはその部分を、原核細胞、真核細胞のいずれか、またはその両方で発現させるのに適切なベクターにライゲーションすることによって、組換えGRF2経路成分を生産することができる。組換えGRF2経路成分を生産するための発現媒体としては、プラスミドおよび他のベクターがある。例えば、GRF2経路成分の発現に適切なベクターとしては、原核細胞(例えばE. coli)での発現用として、以下の型のプラスミド:pBR322由来プラスミド、pEMBL由来プラスミド、pEX由来プラスミド、pBTac由来プラスミドおよびpUC由来プラスミドがある。
【0130】
酵母中で組換えタンパク質を発現させるための多数のベクターがある。例えば、YEP24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2、およびYRP17は、遺伝子構造をS. cerevisiaeに導入するのに有用なクローニングおよび発現媒体である(例えば、Broach et al., (1983) in Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye Academic Press, p. 83を参照;参照によって本明細書に含まれる)。これらのベクターは、pBR322のoriの存在によりE. coli中で複製でき、および、酵母2μプラスミドの複製の決定基(決定基)によりS. cerevisiae中で複製できる。加えて、薬剤耐性マーカー(例えばアンピシリン)も用いることができる。
【0131】
好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌でベクターの増殖を促進するような原核性の配列と、真核細胞で発現される1以上の真核性の転写単位とを両方含む。真核細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例としては、pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2−dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko−neoおよびpHyg由来のベクターがある。これらのベクターのいくつかを、細菌性のプラスミド(例えばpBR322)からの配列を用いて改変することによって、原核および真核細胞の両方で複製および薬剤耐性セレクションを容易にすることができる。あるいは、ウイルス誘導体、例えば、ウシ乳頭腫ウイルス(BPV−1)、またはエプスタイン−バーウイルス(pHEBo、pREP由来およびp205)も、真核細胞でのタンパク質の一過性発現に用いることができる。他のウイルス性発現系(レトロウイルス性を含む)の例は、以下の遺伝子治療運搬システムの説明で示される。プラスミドの調製や宿主生物の形質転換に用いられる様々な方法は、当業界周知である。原核および真核細胞の両方のための他の適切な発現系、同様に、一般的な組換え方法に関しては、Molecular Cloning A Laboratory Manual(2nd Ed, ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989))の第16章および第17章を参照すること。いくつかの例においては、バキュロウイルス発現系を用いることによって組換えGRF2経路成分を発現させることが説明される。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、pVL由来ベクター(例えば、pVL1392、pVL1393およびpVL941)、pAcUW由来ベクター(例えばpAcUW1)、およびpBlueBac由来ベクター(例えば、β−gal含有pBlueBacIII)がある。
【0132】
完全長GRF2経路成分のカルボキシル末端断片、すなわち短縮された変異体(truncation mutant)の発現が所望の場合、所望の配列を含むオリゴヌクレオチド断片に開始コドン(ATG)を付加し、発現させることが必要である。メチオニンアミノペプチダーゼ(MAP)酵素を用いてN末端のメチオニンの位置を酵素的に開裂することができることは当業界周知である。MAPは、E. coli(Ben−Bassat et al., (1987) J. Bacteriol. 169:751−757)およびSalmonella typhimuriumからクローニングされており、これらは組換えタンパク質でインビトロ活性を有する(Miller et al., (1987) PNAS USA 84:2718−1722)。従って、必要であれば、インビボで、すなわちこのような組換えポリペプチドをMAPを生産する宿主(例えば、E. coliまたはCM89またはS. cerevisiae)中で発現させることによって、または、インビトロで、すなわち精製MAPを用いて(例えば、Miller等の方法で)、のいずれにおいても、N末端メチオニンの除去は達成できる。
【0133】
あるいは、異なるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む融合遺伝子の一部として、上記ポリペプチドに関するコーディング配列を含ませることができる。このタイプの発現系は、例えば、GRF2経路成分の免疫原性の断片を生産したい場合の条件下で有用である。例えば、ロタウイルスのVP6キャプシドタンパク質は、単量体形態またはウイルス粒子形態のいずれかで、ポリペプチドの部分に対する免疫学的な担体タンパク質として用いることができる。GRF2経路成分の部分(それに対する抗体が生産される予定の)に対応する核酸配列は、後期のワクシニアウイルス構造タンパク質に関するコーディング配列を含む融合遺伝子構造に組み入れられ、ビリオン部分としてのタンパク質部分を含む融合タンパク質を発現する組換えウイルスのセットが生産される。また、B型肝炎表面抗原もその役割において同様に用いることができる。同様に、免疫原性を強化するために、GRF2経路成分の部分およびポリオウイルスキャプシドタンパク質を含む融合タンパク質をコードするキメラ構造を製造することができる(例えば、欧州特許公報第0259149号;and Evans et al.,(1989) Nature 339:385;Huang et al., (1988) J. Virol. 62:3855;and Schlienger et al., (1992) J. Virol. 66:2を参照)。
【0134】
ペプチドに基づく免疫化のための複数の抗原ペプチド系が利用でき、この際、所望のGRF2経路成分の部分は、有機化学によりオリゴマー状に分岐したリシンコア上に直接合成されたペプチドから得ることができる(例えば、Posnett et al., (1988) JBC 263:1719 and Nardelli et al., (1992) J. Immunol. 148:914を参照)。また、GRT2経路成分の抗原決定基も、細菌性の細胞により発現および提示され得る。
【0135】
免疫原性を強化するために融合タンパク質を利用することに加えて、融合タンパク質もタンパク質発現を促進するすることが広く認識されている。例えば、本発明のGRF2経路成分を、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質として生成することができる。このようなGST融合タンパク質を用いてGRF2経路成分の精製を簡単にすることができ、例えば、グルタチオンで誘導されたマトリックスの使用を介してなされる(例えば、Current Protocoles in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., (N.Y.:John Wiley & Sons, 1991)を参照)。
【0136】
他の実施形態において、精製リーダー配列(例えば、組換えタンパク質の所望の部分のN末端におけるポリ(His)/エンテロキナーゼ開裂部位配列)をコードする融合遺伝子により、発現された融合タンパク質をNi2+金属樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。その後、エンテロキナーゼで処理して精製リーダー配列を除去し、精製GRF2経路成分を得る(例えば、Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177;and Janknecht et al., PNAS USA 88:8972を参照)。
【0137】
さらに他の実施形態において、相互作用する2種のタンパク質を含むように本発明に係る融合タンパク質を生成することができ、それにより、例えば、タンパク質複合体の共有結合型の変異体(covalent version)が形成される。例えば、本明細書においては、GRF2およびGRF2−IP、NdrおよびNdr−IP、Skb1およびSkb1−IP、pIClnおよびpICln−IP、PP2CおよびPP2C−IP、4.1SVWL2および4.1SVWL2−IP、smD1およびsmD1−IP、またはsmD3およびsmD3−IPポリペプチド部分を含む融合タンパク質が考慮される。特定の例においては、2種の異なるタンパク質間で相互作用が可能なフレキシブルなポリペプチドリンカー配列を含むことが望ましい。
【0138】
融合遺伝子を製造する技術が周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする様々なDNA断片の連結は、従来技術に従ってなされ、すなわち、ライゲーションのために平滑末端とずれた末端(stagger−ended)とを用い、制限酵素消化して適切な末端にし、適切な相補末端で充填し、アルカリホスファターゼ処理して望ましくない連結を防ぎ、および酵素的にライゲーションすることによってなされる。他の実施形態において、融合遺伝子は、DNA自動合成装置などの従来技術によって合成できる。あるいは、遺伝子断片のPCR増幅は、2つの連続した遺伝子断片間の相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いてなされ、その後、アニールすることによってキメラ遺伝子配列が得られる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons:1992を参照)。
【0139】
4.代表的なポリペプチド
また本発明は、単離および/または精製された形態の本発明に係るGRF2経路成分を利用可能にし、当該成分は単離形態であるか、またあるいは、通常タンパク質と結合し得る他の細胞内のタンパク質または当該タンパク質を含む特定の複合体を実質的に含まない。「他の細胞のタンパク質を実質的に含まない」(また「他の細胞のタンパク質」とは、本明細書では「混入タンパク質」ともいう)という用語は、例えば、GRF2経路成分の調製物が、20%未満(乾燥重量で)の混入タンパク質、好ましくは5%未満の混入タンパク質しか含まないことと定義される。本明細書で説明されるクローン化遺伝子を用いて精製された調整物のような、GRF2経路成分ポリペプチドの機能的な形態が初めて調製される。「精製された」とは、ポリペプチドに言及される場合、指定の分子が実質的に他の生体高分子、例えば他のタンパク質(混入タンパク質)の非存在下で存在することを意味する。本明細書で用いられる「精製された」という用語は、好ましくは少なくとも80%(乾燥重量で)、より好ましくは95〜99重量%の範囲、最も好ましくは少なくとも99.8重量%の同じ型の生体高分子が存在することを意味する(しかしながら、水、緩衝液、および他の低分子、特に5000未満の分子量を有する分子は存在してよい)。本明細書で用いられる「純粋な」という用語は、好ましくは、直前で述べた「精製された」と同じ数的限定を有する。「単離された」および「精製された」とは、天然状態の天然物質、または、成分に分離されているが(例えば、アクリルアミドゲルで)純粋な(例えば、混入タンパク質、または、変性剤などのクロマトグラフィー試薬、および、例えば、アクリルアミドまたはアガロースなどのポリマーを含まない)物質または溶液のいずれの状態でもない天然物質はいずれも含まれない。
【0140】
本発明の他の観点は、完全長GRF2経路成分から誘導されたポリペプチドに関する。本発明に係るタンパク質の単離されたペプチジル部分は、このようなポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換えにより製造されたポリペプチドをスクリーニングすることによって得られる。加えて、断片は、従来のMerrifieldの固相によるf−Mocまたはt−Boc化学のような当業界で知られた技術を用いて化学的に合成できる。例えば、本発明に係るタンパク質のいずれか一つは、所望の長さの断片(断片のオーバーラップを含まない)に任意に分割でき、また好ましくは、所望の長さのオーバーラップする断片に分割してもよい。上記断片を製造し(組換えまたは化学合成により)、試験することによって、特異的タンパク質複合体形成の、またはより一般的にはGRF2シグナル伝達経路のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして機能する上記ペプチジル断片を、例えばマイクロインジェクション分析によって同定することができる。
【0141】
治療または予防の有効性、または安定性(例えば、エクスビボでの貯蔵寿命や、インビボでのタンパク分解に対する耐性)を強化する等の目的で、本発明に係るGRF2経路成分の構造を改変することも可能である。このような改変ポリペプチドは、そのタンパク質の天然に存在する形態の少なくとも1つの活性を保持するように設計された場合、本明細書においてより詳細に説明されるGRF2経路成分と同等の機能を有するものと解釈される。このような改変ポリペプチドは、例えば、アミノ酸置換、欠失、または付加によって生産できる。
【0142】
例えば、イソロイシンまたはバリンでのロイシンの単独置換、グルタミン酸でのアスパラギン酸の単独置換、セリンでのスレオニンの単独置換、または、構造的に関連するアミノ酸での同類アミノ酸置換(すなわち、保存的な変異)は、結果生じる分子の生物活性に目立った影響を与えないことが合理的に予想できる。保存的な置換は、側鎖が関連したアミノ酸ファミリー間で起こる。遺伝的にコードされたアミノ酸は、以下の4つのファミリーに分けることができる:(1)酸性=アスパラギン酸、グルタミン酸;(2)塩基性=リシン、アルギニン、ヒスチジン;(3)非極性=アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;および(4)非電荷、極性 =グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンであり、場合によって、これらはまとめて芳香族アミノ酸と分類される。同様の方法で、アミノ酸群を以下のように分類できる:(1)酸性=アスパラギン酸、グルタミン酸;(2)塩基性=リシン、アルギニン、ヒスチジン、(3)脂肪族=グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニンであり、ここでセリンおよびスレオニンは、場合により、脂肪族−ヒドロキシルとして別に分類される;(4)芳香族=フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン;(5)アミド=アスパラギン、グルタミン;および(6)硫黄含有=システインおよびメチオニンである(例えば、Biochemistry, 2nd Ed, ed. by L. Stryer, W.H. Freeman and Co., 1981を参照)。ポリペプチドのアミノ酸配列における変化により機能的な相同体が生じたかどうかは、変異ポリペプチドが野生型タンパク質と同じように細胞中で応答を発生させる能力を評価することによって、容易に調べられる。例えば、このようなGRF2経路成分の変異型を、他のポリペプチド、例えば他のGRF2経路成分と結合する能力に関して評価できる。2以上置換されたポリペプチドは、同じ方法で簡単に試験することができる。
【0143】
さらに本発明は、本発明に係るGRF2経路成分のコンビナトリアル変異体のセット、同様に、短縮された(truncation)変異体を生産する方法を考慮しており、当該方法は特に、GRF2経路成分への結合において機能する可能性のある変異配列(例えば、相同体)を同定するのに有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用し得るGRF2経路成分の相同体、またあるいは、新規の活性を全て共に有するGRF2経路成分の相同体を生産することである。コンビナトリアルで誘導された相同体として、天然に存在するGRF2経路成分に関連する選択的な効力を有する相同体が生産できる。このようなタンパク質を、組換えDNA構造で発現させることによって、遺伝子治療プロトコールに用いることができる。
【0144】
同様に、変異誘発により、対応する野生型タンパク質とは劇的に異なる細胞内の半減期を有する相同体を得ることができる。例えば、変化したタンパク質において、タンパク分解または他の細胞性プロセスに対する安定性を高くさせるか、または、低くさせることが可能であり、それによりGRF2経路成分の破壊あるいは不活性化をもたらす。このような相同体、およびそれらをコードする遺伝子は、そのタンパク質の半減期を調節することによって、GRF2経路成分の発現を変えるのに利用できる。例えば、短い半減期により、より多くの一時的な生物学的効果を生じさせることができ、さらに、誘導性の発現系の場合には、組換えGRF2経路成分の細胞内レベルをより強く制御することができる。上述したように、このようなタンパク質、および、特にその組換え核酸構造は、遺伝子治療プロトコールに用いることができる。
【0145】
同様の方法において、GRF2経路成分相同体は、現在のコンビナトリアル方法により、アンタゴニストとして作用するように生産でき、この場合、上記相同体は、対応する野生型タンパク質がGRF2仲介シグナル伝達を調節する能力を妨害することができる。
【0146】
本発明の方法の代表的な実施形態において、GRF2経路成分相同体の集団に関するアミノ酸配列は並べられ、それにより、好ましくは、可能な最も高い相同性を得ることができる。このような変異体の集団は、例えば、1以上の種から得られた相同体、または、同じ種だが変異のために異なる相同体を含む。並べられた配列の各位置にみられるアミノ酸は、コンビナトリアル配列のディジェネレートセットが得られるように選択される。好ましい実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、それぞれ可能性のあるGRF2経路成分配列の部分を少なくとも含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子のディジェネレートライブラリーを用いて生産される。例えば、可能性のあるGRF2経路成分のヌクレオチド配列のディジェネレートセットが個々のポリペプチドとして、またあるいは、より大きい融合タンパク質のセットとして(例えば、ファージディスプレイのために)発現可能な遺伝子配列に、合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的にライゲーションできる。
【0147】
多くの方法によって、可能性のある相同体のライブラリーが、ディジェネレートオリゴヌクレオチド配列から生産できる。ディジェネレート遺伝子配列の化学合成は、DNA自動合成装置を用いて行うことができ、次に、その合成遺伝子は、発現用の適切な遺伝子にライゲーションできる。遺伝子のディジェネレートセットの目的は、1つの混合物に、可能性のあるGRF2経路成分配列の所望のセットをコードする配列全てを含ませることである。ディジェネレートオリゴヌクレオチドの合成は当業界周知である(例えば、Narang, SA(1983) Tetrahedron 39:3;Itakura et al.,(1981) Recombinant DNA, Proc, 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam:Elsevier pp273−289;Itakura et al.,(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323;Itakura et al.,(1984) Science 198:1056;Ike et al.,(1983) Nucleic Acid Res. 11:477を参照)。このような技術は、他のタンパク質の方向付けられた進化に用いられている(例えば、Scott et al.,(1990) Science 249:386−390;Roberts et al.,(1992) PNAS USA 89:2429−2433;Devlin et al.,(1990) Science 249:404−406;Cwirla et al.,(1990) PNAS USA 87:6378−6382;同様に、米国特許第5,223,409号、第5,198,346号、および第5,096,815号を参照)。
【0148】
あるいは、変異誘発の他の形態をコンビナトリアルライブラリーを生産するのに利用することができる。例えば、GRF2経路成分相同体(アゴニストおよびアンタゴニスト形態の両方)を生産し、スクリーニングによってライブラリーから単離され、ここで当該スクリーニングとしては、例えば、アラニンスキャニングによる変異誘発等を用いたスクリーニング(Ruf et al.,(1994) Biochemistry 33:1565−1572;Wang et al.,(1994) J. Biol. Chem. 269:3095−3099;Balint et al.,(1993) Gene 137:109−118;Grodberg et al.,(1993) Eur. J. Biochem. 218:597−601;Nagashima et al.,(1993) J. Biol. Chem. 268:2888−2892;Lowman et al.,(1991) Biochemistry 30:10832−10838;and Cunningham et al.,(1989) Science 244:1081−1085)、リンカースキャニング変異誘発によるスクリーニング(Gustin et al.,(1993) Virology 193:653 −660;Brown et al.,(1992) Mol. Cell Biol. 12:2644−2652;McKnight et al.,(1982) Science 232:316)、飽和変異誘発によるスクリーニング(Meyers et al.,(1986) Science 232:613)、PCR変異誘発によるスクリーニング(Leung et al.,(1989) Method Cell Mol Biol 1:11−19)、または、化学的な変異誘発などを含むランダム変異誘発によるスクリーニングがある。(Miller et al.,(1992) A Short Course in Bacterial Genetics、CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY;and Greener et al.,(1994) Strategies in Mol Biol 7:32−34)。リンカースキャニング変異誘発は、特にコンビナトリアルのセッティングにおいて、GRF2経路成分の短縮された(truncated)(生物活性)形態を同定するのに魅力的な方法である。
【0149】
点変異および短縮(truncation)により製造されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための方法、その方法に関して、特定の特性を有する遺伝子産物に関してcDNAライブラリーをスクリーニングする方法について、広範な技術が当業界で知られている。このような技術は、通常、GRF2経路成分相同体のコンビナトリアル変異誘発によって生成した遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用できる。大規模な遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く用いられる技術は、一般的に、複製可能な発現ベクターに遺伝子ライブラリーをクローニングし、適切な細胞に形質転換することによりベクターのライブラリーを得て、所望の活性の検出により、生産物がすでに検出されている遺伝子をコードするベクターを比較的簡単に単離させるような条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。以下に説明される各分析例は、コンビナトリアル変異誘発技術により製造された大量のディジェネレート配列をスクリーニングするのに必要なハイスループット分析で処理することができる。
【0150】
スクリーニング分析の実施形態の例を説明すると、本発明に係るタンパク質のいずれか一つの候補のコンビナトリアル遺伝子産物が細胞またはウイルスの表面に表示され、特定の細胞またはウイルス粒子の、他のGRF2経路成分(例えばGRF2または表1〜9で示されたタンパク質)を結合させる能力が「パニング分析(panning assay)」で検出される。例えば、GRF2−IP 変異体のライブラリーを、細菌性の細胞表面膜タンパク質に関する遺伝子にクローニングすることができ(Ladner et al., WO88/06630;Fuchs et al.,(1991) Bio/Technology 9:1370−1371;and Goward et al.,(1992) TIBS 18:136−140)、結果生じた融合タンパク質を、例えばGRF2−IPに結合する蛍光標識された分子(例えばFITCで標識されたGRF2)を用いたパニングによって検出し、可能性のある機能的な相同体に関するスコアを取る。蛍光顕微鏡により細胞を視覚的に観察、分離することができ、また、細胞の形態学が可能であれば、蛍光活性化セルソーターで細胞を分離することができる。前述の説明は、GRF2−IPとGRF2とが関与する相互作用を利用する実施形態に対して向けられているが、例えば、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2、smD1、およびsmD3タンパク質およびその同種の結合パートナーを用いても同様の実施形態が可能であることが理解できる。
【0151】
同様の方法において、上記遺伝子ライブラリーは、ウイルス粒子の表面で融合タンパク質として発現させることができる。例えば、糸状ファージ系において、外来ペプチド配列を感染性のファージの表面上で発現させることができ、それにより2つの顕著な利点が得られる。第一に、これらのファージは非常に高濃度でアフィニティーマトリックスに適用できるため、多数のファージを同時にスクリーニングすることができる。第二に、各感染性ファージがその表面にコンビナトリアル遺伝子産物を表示するため、特定のファージが低い収率でしかアフィニティーマトリックスから回収されなかったとしても、そのファージを感染をさらに行うことによって増幅することができる。殆ど同一のE. coli糸状ファージM13、fd、およびf1のグループがファージディスプレイライブラリーに最も頻繁に用いられるが、これは、ファージgIIIまたはgVIIIコートタンパク質のいずれかも、ウイルス粒子の根本的なパッケージングを破壊することなく融合タンパク質を生成するのに用いることができるためである(Ladner等のPCT出願WO90/02909;Garrard等のPCT出願WO92/09690;Marks et al.,(1992) J. Biol. Chem. 267:16007−16010;Griffiths et al.,(1993) EMBO J 12:725−734;Clackson et al.,(1991) Nature 352:624−628;and Barbas et al.,(1992) PNAS USA 89:4457−4461)。
【0152】
また本発明は、本発明に係るGRF2経路成分の減少を提供することによって、ミメティック、例えば、ペプチドまたは非ペプチド薬剤を生産することができ、当該ミメティックは、元のタンパク質が他の細胞内のパートナーに結合することを模擬できる。また、このような上述の変異誘発技術は、チオレドキシン系も同様に、特に、例えば、本発明に係るタンパク質の相互の結合を含むタンパク質−タンパク質相互作用に関与するGRF2経路成分の決定基のマッピングに有用である。説明すると、基質タンパク質の分子認識に関与するGRF2経路成分に決定的な残基を決定し、それを用いることによって、GRF2経路成分から誘導されたペプチドミメティックを生産することができ、ここで上記ペプチドミメティックは、基質タンパク質に結合し、さらに、GRF2経路成分の結合を抑制することによって、その生物活性を抑制するように作用する。他のポリペプチドとの結合に関与するGRF2経路成分のアミノ酸残基をマッピングするために、例えば、スキャニング変異誘発を用いることによって、ペプチドミメティック化合物を、結合に関与するそれら残基を模擬するように生産できる。例えば、このような残基の非加水分解性のペプチド類似体は、ベンゾジアゼピン(例えば、Freidinger et al., in Peptides:Chemistry and Biology, G.R. Marshall Ed, ESCOM Publisher:Leiden, Netherlands, 1988を参照)、アゼピン(例えば、Huffman et al., in Peptides:Chemistry and Biology, G. R. Marshall Ed, ESCOM Publisher:Leiden, Netherlands, 1988を参照)、置換されたγラクタム環(Garvey et al., in Peptides:Chemistry and Biology, G.R. Marshall Ed, ESCOM Publisher:Leiden, Netherlands, 1988)、ケト−メチレンプソイドペプチド(Ewenson et al.,(1986) J. Med. Chem. 29:295;and Ewenson et al., in Peptides:Structure and Function (9th American Peptides Symposiumの議事録) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985)、β−ターンジペプチドコア(Nagai et al., (1985) Tetrahedron Lett 26:647;and Sato et al.,(1986) J. Chem Soc Perkin Trans 1:1231)、およびβ−アミノアルコール(Gordon et al.,(1985) Biochem Biophys Res Commun 126:419;and Dann et al.,(1986) Biochem Biophys Res Commun 134:71)を用いて生産可能である。
【0153】
5.ヌクレオチドおよびポリペプチド配列の相同性検索
本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、データベース(GenBank、SwissProt、BLOCKS、およびPimaIIなど)に対する問い合わせ配列として用いることができる。これらのデータベースは、すでに同定された注釈付きの配列を含み、BLAST(Basic Local Aligninent Search Toolを表す)を用いて相同性(類似性)領域に関して検索可能である(Altschul S F (1993) J. Mol Evol 36:290−300;Altschul、S F et al (1990) J. Mol Biol 215:403−10)。
【0154】
BLASTにより、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の両方のアライメントを得て、配列類似性を決定することができる。アライメントの位置的な性質により、BLASTは、正確な適合を決定すること、または、原核性(細菌の)または真核性(動物、真菌または植物)の起源由来であり得る相同体を同定することにおいて特に有用である。一次配列パターンおよび二次構造のギャップペナルティーを処理する場合、他のアルゴリズム(例えばSmith、R. F. and T. F. Smith(1992;Protein Engineering 5:35−51)で説明されたアルゴリズム;参照により本明細書に含める)を用いてもよい。本出願で開示したように、配列は、少なくとも49ヌクレオチドの長さであり、不必要な塩基は12%以下である(ここで、A、C、G、またはTではなくNを記録する)。
【0155】
BLAST法は、KarlinおよびAltschulに記載されるように(1993;Proc Nat Acad Sci 90:5873−7;参考により本明細書に含める)、問い合わせ配列とデータベース配列との間の適合を検索することにより、見出された全ての適合の統計学的な有意差を評価し、使用者が選択した有意な閾値を満たすような適合のみが報告される。好ましくは、この閾値は、ヌクレオチドに対しては10〜25、ペプチドに対しては3〜15に設定される。
【0156】
6.代表的な抗体
本発明の他の観点は、GRF2経路成分(例えば表1〜9に列挙されたもの)と特異的に反応する抗体に関する。例えば、本発明に係るタンパク質の配列に基づいたペプチドを用いて、特異的な抗血清またはモノクローナル抗体を標準的な方法により製造できる。哺乳動物(例えばマウス、ハムスターまたはウサギ)を、ペプチド(例えば、抗体応答を惹起できる抗原性断片)の免疫原性形態により免疫化することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を与える技術は、担体への結合、または、当業界周知の他の技術を含む。例えば、本発明に係るタンパク質のいずれか一つのペプチジル部分は、アジュバントの存在下で投与できる。免疫化の進行は、血漿または血清中の抗体のタイターを検出することによってモニターできる。抗原として免疫原を用いて標準的なELISAまたは他のイムノアッセイを行うことによって、抗体レベルを評価することができる。
【0157】
免疫化した後、抗血清を得て、所望であれば、ターゲットタンパク質に対するポリクローナル抗体をさらに血清から単離してもよい。モノクローナル抗体を生産するために、抗体生産細胞(リンパ球)を免疫化動物から回収し、不死化細胞(例えば、ハイブリドーマ細胞を得るためのミエローマ細胞)を用いた標準的な体細胞融合法によって融合させることができる。このような技術は当業界周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術(もとはといえばKohler およびMilsteinにより開発された;(1975) Nature、256:495−497)、同様に、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4:72)、および、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのEBV−ハイブリドーマ技術(Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77−96)がある。ハイブリドーマ細胞は、GRF2経路成分および単離されたモノクローナル抗体と特異的に反応する抗体の生産に関して、免疫化学的にスクリーニングすることができる。
【0158】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、その断片を含むものとし、当該断片はまた、本発明に係るタンパク質または当該タンパク質を含む複合体のいずれか一つと特異的に反応する。抗体は従来技術で断片化でき、さらに、抗体全体について上述したのと同じ方法を利用してスクリーニングできる。例えば、抗体をペプシン処理することによりF(ab’)2断片を得ることができる。得られたF(ab’)2断片を処理して、ジスルフィド架橋を還元し、Fab’断片を得ることができる。本発明の抗体はさらに、二重特異性分子およびキメラ分子、同様に一本鎖(scFv)抗体を含むものとする。
【0159】
本発明に係る抗体は、三量体の抗体およびヒト化抗体を含み、これらは例えば米国特許第5,585,089号で説明されたように調製することができる。また一本鎖抗体も本発明の範囲内である。これら抗体および抗体断片の改変形態の全てを「抗体」という用語に含むものとし、より広い用語「GRF2経路成分結合タンパク質」に含まれる。
【0160】
本発明に係るGRF2経路成分に対して向けられたモノクローナルおよびポリクローナル抗体(Ab)の両方、および抗体断片(例えばFab’およびF(ab’)2)は、個々のGRF2経路成分を選択的にブロックし、それにより細胞周期、細胞増殖、分化および/または生存を調節するのに用いることができる。
【0161】
一つの実施形態において、本発明に係る抗体は、発現ベクター(例えばλgt11、λgtl8〜23、λZAP、およびλORF8)に構築されたcDNAライブラリーを免疫学的にスクリーニングすることに用いることができる。このタイプのメッセンジャーライブラリーは、正しいリーディングフレームと方向で挿入されたコーディング配列を含み、融合タンパク質を生産することができる。例えば、λgt11は、アミノ末端がβ−ガラクトシダーゼアミノ酸配列からなり、そのカルボキシル末端が外来ポリペプチドからなる融合タンパク質を生産する。次に、GRF2経路成分の抗原性エピトープ、例えば表1〜9に列挙されたGRF2経路成分に抗原として関連するタンパク質を、抗体で検出することができ、例えば、感染プレートから持ち上げたニトロセルロースフィルターと、抗GRF2経路成分抗体とを反応させることによって検出される。次に、この分析でスコアを付けたファージを感染プレートから単離できる。このようにして、GRF2経路成分相同体を検出し、他の源からクローニングできる。
【0162】
7.トランスジェニック動物
本発明のさらに他の観点は、GRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質に関する異種遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト動物、または、動物の組織または細胞型の少なくとも一つで、GRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質をコードする1以上のゲノム遺伝子を破壊したトランスジェニック非ヒト動物を提供する。例えば、1以上の遺伝子座で破壊を受けたトランスジェニックマウスを、例えば相同組換えにより製造することができる。
【0163】
他の観点において、本発明は、誤って発現したGRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2、smD1、およびsmD3タンパク質に関する遺伝子の対立遺伝子を有する発育異常の動物モデルを提供する。例えば、特定の対立遺伝子が欠失したマウス、または、1以上の遺伝子のエキソンの全部または一部が欠失したマウスを飼育できる。このような対立遺伝子変異体がGRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2、smD1、およびsmD3遺伝子に対して生産される場合、このようなマウスモデルは、GRF2経路の異常調節により発症する病気の研究に用いることができる。
【0164】
従って、本発明は、本発明の形質転換遺伝子を含む細胞(その動物)からなるトランスジェニック動物に関し、好ましくは(ただし場合により)、動物の1以上の細胞で外来性のGRF2経路成分を発現するトランスジェニック動物に関する。GRF2経路成分の形質転換遺伝子は、タンパク質の野生型をコードしてもよいし、または、その相同体(アゴニストおよびアンタゴニストの両方、同様にアンチセンス構造を含む)をコードしてもよい。好ましい実施形態において、形質転換遺伝子の発現は、例えば、所望のパターンに発現を制御するシス作用性配列 を利用して、細胞、組織または発生段階の特定の部分集合に制限される。本発明において、このような本発明に係るタンパク質のモザイク発現は、多くの形態の系列分析に必須であり、加えて、例えば、細胞周期の進行の効果(それにより、異なる正常な胚の組織の小さいパッチにおける発生を大きく改変し得る)を評価する手段を提供する。その結果に対して、組織特異的な調節配列および条件的な調節配列を用いて、特定の空間的なパターンで形質転換遺伝子の発現を制御することができる。その上、例えば、条件的な組換え系または原核性の転写調節配列によって、一時的な発現パターンを提供できる。
【0165】
形質転換遺伝子を発現させるための遺伝子技術は、インビボで部位特異的な遺伝子操作により調節でき、当業者既知である。例えば、遺伝学的システムを、リコンビナーゼ発現(ターゲット配列の遺伝子組換えを触媒する)を調節するのに利用できる。本明細書で用いられる「ターゲット配列」という成句は、リコンビナーゼにより遺伝子組換えされたヌクレオチド配列を意味する。ターゲット配列は、リコンビナーゼ認識配列を端に有しており、通常、リコンビナーゼ活性を発現する細胞中で切除または逆転される。リコンビナーゼで触媒された組換え現象は、ターゲット配列の組換えにより本発明に係るGRF2経路成分ポリペプチドの発現が活性化または抑制されるように設計することができる。例えば、組換えGRF2経路成分の遺伝子の発現を妨害するターゲット配列の切除を設計して、その遺伝子発現を活性化させることができる。このタンパク質発現の妨害は、様々なメカニズムによって生じ、例えば、GRF2経路成分遺伝子をプロモーター要素または内部の停止コドンから空間的に分離することによって生じる。さらに、形質転換遺伝子が形成され、その際、遺伝子のコーディング配列の端にリコンビナーゼ認識配列が置かれ、はじめにプロモーター要素に関して3’から5’への方向で細胞にトランスフェクトされる。このような場合において、ターゲット配列の逆位により、プロモーター要素(転写の活性化を起こすプロモーターを含む)に関する方向にコーディング配列の5’末端を配置させて、本発明に係る遺伝子を再び方向付ける。
【0166】
例示された実施形態において、バクテリオファージP1のCre/loxPリコンビナーゼ系(Lakso et al.,(1992) PNAS USA 89:6232−6236;Orban et al.,(1992) PNAS USA 89:6861−6865)またはSaccharomyces cerevisiae のFLPリコンビナーゼ系(O’Gorman et al.,(1991) Science 251:1351−1355;PCT公告WO92/15694)のいずれを用いても、インビボの部位特異的遺伝子組換え系を製造することができる。Creリコンビナーゼは、loxP配列の間に位置する介在ターゲット配列の部位特異的組換えを触媒する。loxP配列は、Creリコンビナーゼが結合する34塩基対のヌクレオチド反復配列であり、Creリコンビナーゼが仲介する遺伝子組換えに必要である。loxP配列の方向により、Creリコンビナーゼが存在する場合に介在ターゲット配列が切除されるか逆転されるかが決定され(Abremski et al.,(1984) J. Biol. Chem. 259:1509−1514)、すなわち、loxP配列が直接リピートの向きである場合はターゲット配列の切除を触媒し、loxP配列が逆転したリピートの向きである場合はターゲット配列の逆転が触媒される。
【0167】
従って、ターゲット配列の遺伝子組換えはCreリコンビナーゼの発現に依存する。リコンビナーゼの発現を、調節的な制御(例えば、組織特異的、発生段階特異的、外部から添加された薬剤での誘導または抑制)を受けやすいプロモーター要素で調節することができる。このような調節された制御により、リコンビナーゼ発現がプロモーター要素で仲介される細胞においてのみターゲット配列の遺伝子組換えが起こり得る。従って、GRF2経路成分遺伝子の発現の活性化は、リコンビナーゼ発現の調節を介して調節できる。
【0168】
Cre/loxPリコンビナーゼ系を用いて組換えGRF2経路構成タンパク質の発現を調節するために、Creリコンビナーゼと本発明に係るタンパク質との両方をコードする形質転換遺伝子を含むトランスジェニック動物の構築が必要である。Creリコンビナーゼと組換えGRF2経路成分遺伝子の両方を含む動物は、「ダブル」トランスジェニック動物の構築により得られる。このような動物を得る便利な方法は、2種のトランスジェニック動物(それぞれ形質転換遺伝子、例えば、GRF2経路成分遺伝子とリコンビナーゼ遺伝子とを含む)を交配することである。
【0169】
リコンビナーゼの仲介で発現可能な形式でGRF2経路成分の形質転換遺伝子を含むトランスジェニック動物を最初に構築することから得られる利点は、本発明に係るタンパク質がトランスジェニック動物における発現に有害である可能性に由来する。このような場合において、初代集団(全ての組織において本発明に係る形質転換遺伝子がサイレントである)を繁殖させ、維持する。この初代集団の個体は、例えば1以上の組織でリコンビナーゼを発現する動物と交配させることができる。このようにして、初代集団(例えば、アンタゴニスト型のGRF2経路成分の形質転換遺伝子がサイレントである)を形成し、その初代の後代(特定の組織において、または、発生段階で細胞周期調節が破壊されることにより、例えば致死表現型になる)を研究に用いることができる。
【0170】
同様の条件的な形質転換遺伝子を、原核性のプロモーター配列を用いて得ることができ、この際、当該プロモーター配列は、形質転換遺伝子の発現を促進するために、原核性のタンパク質を同時に発現させる必要がある。代表的なプロモーターおよび対応するトランス活性化された原核性のタンパク質は、米国特許第4,833,080号に記載される。その上、条件的な形質転換遺伝子の発現は、遺伝子治療的な方法で誘導され、この場合、トランス活性化タンパク質、例えばリコンビナーゼまたは原核性のタンパク質をコードする遺伝子は組織に運搬され、細胞型に特異的な方法で発現が起こる。この方法により、GRF2経路成分の形質転換遺伝子は、トランス活性化因子の導入によって「開始」されるまで、成人期にサイレントのままでいることができる。
【0171】
代表的な実施形態において、本発明の「トランスジェニック非ヒト動物」は、形質転換遺伝子を非ヒト動物の生殖細胞系に導入することによって製造される。様々な発生段階における胎児性のターゲット細胞を用いて、形質転換遺伝子を導入することができる。胎児性ターゲット細胞の発生段階に応じて、異なる方法を用いる。受精体はマイクロインジェクションのための最良のターゲットである。マウスにおいて、雌性前核は直径約20マイクロメーターの大きさに達するので、1〜2plのDNA溶液を再現性よくインジェクションすることができる。遺伝子トランスファーのターゲットとして受精体を用いることは、殆どの場合インジェクションされたDNAは初めの分割の前に宿主遺伝子に組み込まれるという大きい利点がある(Brinster et al.,(1985) PNAS USA 82:4438−4442)。結果として、トランスジェニック非ヒト動物の全ての細胞が組み込まれた形質転換遺伝子を含むようになる。またこれは、一般的に、生殖細胞の50%が形質転換遺伝子に隣接しているため、形質転換遺伝子の初代の子孫への効率的な伝達に反映される。本発明の実施において、受精体のマイクロインジェクションは、形質転換遺伝子の取り込みのために好ましい方法である。
【0172】
また、レトロウイルスの感染を用いて、形質転換遺伝子を非ヒト動物に導入することができる。発生中の非ヒト胚を、胚盤胞期までインビトロで培養することができる。この期間中、その分割球はレトロウイルスの感染に対するターゲットとなり得る(Jaenich, R. (1976) PNAS USA 73:1260−1264)。効率的な分割球の感染は、酵素処理により透明帯を取り除くことによってなされる(Manipulating the Mouse Enibryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986))。形質転換遺伝子を導入するのに用いられたウイルスベクター系は、一般的に、形質転換遺伝子を有する複製欠損レトロウイルスである(Jahner et al.,(1985) PNAS USA 82:6927−6931;Van der Putten et al.,(1985) PNAS USA 82:6148−6152)。トランスフェクションは、ウイルス生産細胞の単分子層上で分割球を培養することによって容易かつ効率的に達成できる(上記のVan der Putten;Stewart et al.,(1987) EMBO J 6:383 −388)。あるいは、感染は、後期で行ってもよい。ウイルスまたはウイルス生産細胞を胞胚腔に注入してもよい(Jahner et al.,(1982) Nature 298:623−628)。トランスジェニック非ヒト動物を形成する細胞の部分集合においてのみ取り込みが起こるため、初代の殆どは形質転換遺伝子に関してモザイクである。さらに、初代において、形質転換遺伝子の様々なレトロウイルスの挿入は、ゲノム(通常、子孫で分離する)中の異なる位置でなされる。加えて、懐胎中期の胚の子宮内のレトロウイルス感染により、形質転換遺伝子を生殖細胞系に導入することができる(上記のJahner et al.,(1982))。
【0173】
形質転換遺伝子の導入のためのターゲット細胞の第三の型は、胎性幹細胞(ES)である。インビトロで培養された移植前の胚からES細胞を得て、胚と融合させる(Evans et al.,(1981) Nature 292:154−156;Bradley et al.,(1984) Nature 309:255−258;Gossler et al.,(1986) PNAS USA 83:9065−9069;and Robertson et al.,(1986) Nature 322:445−448)。DNAトランスフェクションまたはレトロウイルスが仲介する導入により、形質転換遺伝子を効率的にES 細胞に導入できる。その後、このような形質転換されたES細胞と、非ヒト動物の胚盤胞とを合わせることができる。その後、ES細胞は胚に定着し、生じるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する。参考文献として、Jaenisch, R. (1988) Science 240:1468−1474を参照すること。
【0174】
ノックアウトまたは破壊トランスジェニック動物の作製方法もまた一般的に知られている。例えば、Manipulating the Mouse Embryoを参照すること(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)。また、リコンビナーゼ依存性ノックアウトも製造可能であり、例えば、GRF2経路成分遺伝子の不活性化の組織特異的および/または一時的な制御が上述したように行われるように、相同組換えによりターゲット配列を挿入して製造される。
【0175】
8.GRF2経路成分遺伝子および遺伝子産物の検出
また、本発明のGRF2経路成分で特異的に免疫活性な抗体は、タンパク質発現の存在度およびパターンを評価するために、組織サンプルの免疫組織化学的な染色に用いることができる。体液から単離された組織または細胞における1以上のGRF2経路成分のレベルを検出および評価するために、臨床的な試験方法の一部として、抗GRF2経路成分の抗体を免疫沈降および免疫ブロッティングにおいて診断的に用いることができる。抗GRF2経路成分抗体を用いる診断用分析において、例えば、新生物または過形成性の疾患の初期診断で補助となるように設計されたイムノアッセイ、例えば、サンプル中のガン細胞の存在、例えば、GRF2経路成分遺伝子の発現レベルが改変された細胞を、正常な細胞に対して検出すること、が含まれる。
【0176】
加えて、ヌクレオチドプローブは本発明に係るGRF2経路成分のクローン化配列から製造することができ、それにより、インタクト組織および組織サンプルを、GRF2経路成分をコードした核酸の存在に関して組織学的にスクリーニングすることができる。抗GRF2経路成分の抗体の診断における使用と同様に、GRF2経路成分をコードしたmRNAまたはゲノムGRF2経路成分の遺伝子配列に向けられたプローブの使用は、例えば、新生物または過形成性の疾患(例えば、不要な細胞成長)または不要な分化現象で明白な対立遺伝子変異の予測および治療的な評価のいずれにも用いることができる。
【0177】
抗GRF2経路成分の抗体のイムノアッセイと、ヌクレオチドプローブとを併せて用いることによって、発育障害(GRF2経路成分の発現(またはその欠失)に関連した数々の異常を含む)に対する分子機構の決定を促進することができる。例えば、GRF2経路成分合成における変化と、コーディング配列の変異とを区別できる。
【0178】
一つの実施形態において、本発明の方法は、タンパク質分解、異常細胞増殖および/または分化を特徴とする障害に対するリスクを検体が有するかどうかを決定する方法を提供する。好ましい実施形態において、当該方法は、通常、脊椎動物の検体(好ましくはヒトまたは他の哺乳動物の検体)からの細胞サンプルにおいて、遺伝的な異常の存在または非存在を検出することを含むことを特徴とし、ここで当該遺伝的な異常は、少なくとも以下の(i)または(ii)のいずれか一つを特徴とする:(i)GRF2経路成分の遺伝子の完全性(integrity)に影響を及ぼす変性;または(ii)GRF2経路成分の遺伝子の誤った発現。例証として、このような遺伝的な異常は、少なくとも以下の(i)〜(ix)のいずれか一つの存在を確認することによって検出することができる:(i)GRF2経路成分の遺伝子からの1以上のヌクレオチドの欠失、(ii)1以上のヌクレオチドのGRF2経路成分の遺伝子への付加、(iii)GRF2経路成分の遺伝子の1以上のヌクレオチドの置換、(iv)GRF2経路成分の遺伝子の著しい染色体の配列換え、(v)GRF2経路成分の遺伝子のメッセンジャーRNA転写レベルの著しい変化、(vi)ゲノムDNAのメチル化パターン等におけるGRF2経路成分の遺伝子の異常な修飾、(vii)GRF2経路成分の遺伝子のメッセンジャーRNA転写の非野生型スプライシングパターンの存在、(viii)非野生型のGRF2経路構成タンパク質のレベル、および(ix)GRF2経路構成タンパク質の不適切な翻訳後修飾。以下に示すように、本発明は、GRF2経路成分の遺伝子における異常を検出するための多数の分析技術を提供し、さらに重要なことには、GRF2仲介シグナル伝達依存性の異常な細胞成長、増殖および/または分化の基礎となる様々な分子レベルの原因を識別する能力を提供する。
【0179】
代表的な実施形態において、(精製)オリゴヌクレオチドプローブを含む核酸組成物が提供され、ここで当該オリゴヌクレオチドプローブは、GRF2経路成分の遺伝子(例えば、表1〜9に列挙されたタンパク質をコードする遺伝子)または天然に存在するそれらの変異体、または5’または3’隣接配列、または、本発明に係るGRF2経路成分の遺伝子と自然に結合するイントロン部の配列、または、天然に存在するそれらの変異体など)のセンスまたはアンチセンス配列にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列の領域を含む。細胞の核酸をハイブリダイゼーションに利用しやすいようにし、プローブをサンプルの核酸に晒し、プローブとサンプル核酸とのハイブリダイゼーションを検出する。このような技術を用いて、ゲノムレベルまたはmRNAレベルいずれかにおける異常(欠失、置換等を含む)を検出することができ、同様に、mRNA転写レベルを測定することができる。
【0180】
特定の実施形態において、異常の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(例えば、米国特許第4,683,195号および第4,683,202号を参照)(例えばアンカーPCRまたはRACE PCR)で、またあるいは、ライゲーション連鎖反応(ligation chain reaction)(LCR)(例えば、Landegran et al., (1988) Science 241:1077−1080;and Nakazawa et al.,(1994) PNAS USA 91:360−1364を参照)でプローブ/プライマーを利用することを含み、その後者は、GRF2経路成分の遺伝子における点変異を検出するのに特に有用である。
【0181】
単なる例証的な実施形態において、上記方法は、以下の(i)〜(iv)の工程を含む:(i)患者から細胞サンプルを回収すること、(ii)核酸(例えば、ゲノム、mRNAまたは両方)を前記サンプルの細胞から単離すること、(iii)前記核酸サンプルと1以上のプライマーとを接触させること、ここで当該プライマーは、GRF2経路成分の遺伝子(存在する場合)のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下で、特異的にGRF2経路成分の遺伝子にハイブリダイズする、および(iv)増幅産物の存在または非存在を検出すること、または、増幅産物のサイズを検出し、コントロールサンプルの長さと比較すること。
【0182】
さらに他の代表的な実施形態において、患者のサンプルからのゲノムDNAを、1以上の制限エンドヌクレアーゼ(メチル化に感受性を有し、その認識部位がGRF2経路成分の遺伝子(隣接配列およびイントロン部の配列に含まれる)に存在する)で消化することによって、GRF2経路成分の遺伝子の異常なメチル化パターンを検出することができる。例えば、Buiting et al.,(1994) Human Mol Genet 3:893−895を参照すること。消化されたDNAをゲル電気泳動で分離し、例えば、ゲノムまたはcDNA配列から誘導されたプローブを用いてハイブリダイズする。GRF2経路成分の遺伝子のメチル化状態は、サンプルDNAから得られた制限パターンと、既知のメチル化標準の制限パターンとを比較することによって測定できる。
【0183】
さらに他の実施形態において、診断用分析が提供され、当該分析において、GRF2経路成分の遺伝子産物(例えば生検細胞から単離された)の、他の細胞のタンパク質と結合する能力が検出される。例えば、他のGRF2経路成分または基質タンパク質より高いまたは低い結合親和性で結合するGRF2経路成分の変異体を検出することが望ましい。このような変異体は、例えば、微細な変異、例えば、診断用のDNA配列解析技術や上述したイムノアッセイでは検出不可能な点変異体から生じる。従って、本発明はさらに、診断用のスクリーニング分析を考慮しており、当該スクリーニング分析は、一般的に、1以上のGRF2経路成分の遺伝子をサンプル細胞からクローニングすること、および、組換え遺伝子産物と基質タンパク質、例えば、他のGRF2経路成分との相互作用を検出できるような条件下で、そのクローン化遺伝子を発現すること、を含む。以下に示す様々な薬剤スクリーニング分析の説明から明らかなように、広範な技術を用いて、GRF2経路構成タンパク質が他の細胞成分と結合する能力を決定することができる。
【0184】
また、本発明に係る方法を用いて、充実性腫瘍の検出および/または予後を強化することができ、当該充実性腫瘍としては、例えば組織(これらに限定されないが、卵巣、肺、腸、膵臓、前立腺、精巣、肝臓、皮膚、胃、腎臓、頚部、結腸直腸、ならびに、頭部および首)の癌腫(特に上皮由来の癌腫);黒色腫;および肉腫、例えば、カポジ肉腫および横紋筋肉腫がある。好ましい実施形態において、本発明に係る方法を用いて、悪性または前ガンの上皮ガンを評価できる。
【0185】
また、本発明の診断方法を治療の経過観察として用いることもでき、例えば、GRF2経路成分またはその活性のレベルを定量することにより、現在行われている、または以前に行われたガン治療の有効性、同様に、患者の予後におけるこれらの治療効果を示すことができる。
【0186】
従って、本発明は、血管増殖性の障害の診断および表現形解析を補助するために、細胞のGRF2経路成分のアップレギュレーションを検出するのに利用可能な診断用分析および試薬を作製し、ここで上記血管増殖性の障害は、例えば、細胞の腫瘍化、または他の過形成性または腫瘍性転化プロセス、同様に細胞分化性の疾患、例えば、組織変性(例えば、神経変性)から生じる。
【0187】
9.遺伝子治療
本発明はGRF2仲介シグナル伝達を調節する方法を提供する。従って、本発明は、細胞増殖、分化および/または生存を調節する方法を提供し、当該方法を用いて、例えば、異常な細胞増殖、分化および/または生存に関する病気または状態を治療することができる。本発明の方法によって、GRF2経路成分の治療剤は、異常な細胞増殖、分化および/または細胞の生存に関する病気に罹った被験者に投与される。
【0188】
様々な異常な細胞の血管増殖性の状態に対して、本発明のGRF2経路成分の遺伝子構造、ミメティックおよびアンタゴニストは、異常な細胞増殖を調節する一般的な方法を用いて、治療上の利益を提供することができる。例えば、本発明の遺伝子構造を遺伝子治療プロトコールの一部として用いることによって、例えば、タンパク質が誤って発現している細胞、または、GRF2経路成分上流のシグナル伝達経路が機能障害を起こしている細胞において、GRF2経路成分の機能を再生したり、または、例えば、優性阻害変異体を運搬することによって、野生型タンパク質の機能を阻害したりすることができる。
【0189】
説明すると、おそらくGRF2経路構成タンパク質の機能(または機能障害)に少なくとも部分的に依存する病的または異常な成長を示す細胞型としては、様々なガンや白血病、乾癬、骨疾患、線維増殖性疾患(例えば、結合組織、アテローム性動脈硬化症、および、他の平滑筋の血管増殖性の疾患を含む)、同様に、慢性炎症がある。血管増殖性の疾患に加えて、有糸分裂への異常な再開始による組織の脱分化、または調節タンパク質の障害による不要な分化のいずれかによって生じる細胞分化性の疾患の治療も含む。
【0190】
また、本発明に係るGRF2経路成分(例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト型)またはアンチセンス核酸の遺伝子治療用の構造を一時使用することによって、インビボでの組織の再形成を、例えば、臓器の発生および維持について達成することができることも明白である。本発明に係る遺伝子構造を用いて、異なる細胞に対して血管増殖および細胞分化の可能性を制御することによって、損傷した組織を再形成したり、または、移植および移植組織の形態を改良したりできる。例えば、GRF2シグナル伝達経路のアゴニストおよびアンタゴニストを用いて、物理学的、化学的または病的な傷害を受けた後の臓器を治療的に調節することができる。例えば、遺伝子治療を用いて、部分的な肝切除の後の肝臓を再生したり、または、肺気腫の治療における肺組織の再生を促進したりできる。
【0191】
本発明の1つの観点において、本発明に係るGRF2経路成分の発現構造、または、アンチセンス分子を生産するための発現構造を、生物学的に有効ないずれの担体、例えば、インビボで組換えGRF2経路成分の遺伝子を効果的に細胞にトランスフェクトできるいずれの製剤または組成物として投与することができる。方法は、ウイルスベクター中に本発明に係る遺伝子を挿入することを含み、当該ベクターとしては、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純疱疹ウイルス−1、または、組換え細菌性もしくは真核性プラスミドがある。ウイルスベクターを用いる場合、細胞を直接トランスフェクトすることができ、その一方で、プラスミドDNAを用いる場合、例えば、カチオン性リポソーム(リポフェクチン)、または、誘導された(例えば、抗体が結合した)、ポリリシン包接体、グラマシジンS、人工ウイルスエンベロープまたは他の細胞内の担体など、同様に、遺伝子構造の直接注入、または、インビボで行われたCaPO4沈殿の補助によって運搬することもできる。適切なターゲット細胞の導入は遺伝子治療において重要な第一工程であるため、特定の遺伝子運搬システムの選択は、目的のターゲットの表現型や投与経路(例えば、局所的または全身的)などの要素に依存することが認識できる。
【0192】
インビボで本発明に係るタンパク質のいずれか一つをコードした核酸を細胞に導入する好ましい方法は、核酸(例えば、遺伝子産物をコードしたcDNA)を含むウイルスベクターの使用による方法である。細胞のウイルスベクターの感染は、ターゲット化細胞の大規模な集団が上記核酸を受け取ることができるという利点がある。加えて、ウイルスベクター中にコードされた分子は、例えばウイルスベクターに含まれたcDNAによって、ウイルスベクター核酸を摂取した細胞中で効率的に発現させることができる。
【0193】
一般的に、レトロウイルスベクター およびアデノ随伴ウイルスベクターは、インビボで外来性の遺伝子を特にヒトへ導入するために選択される組換え遺伝子運搬システムであると理解される。これらのベクターにより、遺伝子は細胞へ効率的に運搬され、導入された核酸は宿主の染色体DNAに安定して統合される。レトロウイルスを使用する際の主な必要条件は、特に、細胞集団における野生型ウイルスの拡散の可能性に関して、それらの使用の安全性を確認することである。複製能が欠損したレトロウイルスのみを生産する特殊化した細胞系(「パッケージング細胞」とよばれる)の開発により、遺伝子治療のためのレトロウイルスの有用性が高められ、および、欠損レトロウイルスは、遺伝子治療本発明に係る遺伝子導入のための使用においてよく特徴付けられる(文献として、Miller, A.D.(1990) Blood 76:271を参照)。従って、組換えレトロウイルスを構築して、レトロウイルスのコーディング配列(gag、pol、env)の一部をGRF2経路成分ポリペプチドをコードした核酸で置換し、レトロウイルスの複製を不完全にすることができる。次に、その複製欠損レトロウイルスをビリオンにパッケージングして、標準的な技術によってヘルパーウイルスを用いることによりターゲット細胞を感染させることができる。組換えレトロウイルスを生産するプロトコール、および、インビトロまたはインビボでこのようなウイルスを細胞に感染させるプロトコールは、Current Protocoles in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al., (eds.), John Wiley & Sons, Inc., Greene Publishing Associates, (2001), Sections 9.9−9.14 および他の標準的な実験マニュアルで見出すことができる。適切なレトロウイルスの例としては、pLJ、pZIP、pWEおよびpEMがあり、これらはいずれも当業者周知である。環境栄養性および両栄養性レトロウイルス系の両方を調製するための適切なパッケージングウイルス系の例としては、ΨCrip、ΨCre、Ψ2およびΨAMがある。レトロウイルスは、インビトロおよび/またはインビボで、様々な遺伝子を多くの異なる細胞型に導入するために用いられており、当該細胞型としては、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋原細胞、肝細胞、骨髄 細胞がある(例えば、Eglitis et al.,(1985) Science 230:1395−1398;Danos and Mulligan,(1988) PNAS USA 85:6460−6464;Wilson et al.,(1988) PNAS USA 85:3014−3018;Armentano et al.,(1990) PNAS USA 87:6141−6145;Huber et al.,(1991) PNAS USA 88:8039−8043;Ferry et al.,(1991) PNAS USA 88:8377−8381;Chowdhury et al.,(1991) Science 254:1802−1805;van Beusechem et al.,(1992) PNAS USA 89:7640−7644;Kay et al.,(1992) Human Gene Therapy 3:641−647;Dai et al.,(1992) PNAS USA 89:10892−10895;Hwu et al.,(1993) J Immunol. 150:4104−4115;米国特許第4,868,116号;米国特許第4,980,286号;PCT出願WO89/07136;PCT出願WO89/02468;PCT出願WO89/05345;およびPCR出願WO92/07573を参照)。
【0194】
その上、ウイルス粒子表面上でウイルスパッケージングタンパク質を改変することによって、レトロウイルスの感染範囲、および、レトロウイルスに基づくベクターの結果を制限することができることがわかっている(例えばPCT出願WO93/25234、WO94/06920、およびWO94/11524を参照)。例えば、レトロウイルスベクターの感染範囲を改変する方法としては:細胞の表面抗原に特異的な抗体と、ウイルスenvタンパク質とをカップリングする方法(Roux et al.,(1989) PNAS USA 86:9079−9083;Julan et al.,(1992) J. Gen Virol 73:3251−3255;and Goud et al.,(1983) Virology 163:251−254);または、細胞表面リガンドと、ウイルスenvタンパク質とをカップリングする方法がある(Neda et al.,(1991) J. Biol. Chem. 266:14143−14146)。カップリングとしては、タンパク質または他の変種(variety)で化学的に架橋した形態があり(例えば、ラクトースを用いて、envタンパク質をシアロ糖タンパク質に変換する)、同様に、融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体/env融合タンパク質)を生産することによる方法がある。この技術は、感染を特定の組織型に限定したり、または、方向付けるのに有用であるが、その一方で、環境栄養性ベクターを両栄養性ベクターに変換するのにも用いられる。
【0195】
本発明で有用な他のウイルス遺伝子運搬システムは、アデノウイルス誘導ベクターを利用する。興味のある遺伝子産物をコードするが、その正常な溶菌性ウイルスの生活環において複製する能力を不活化するように、アデノウイルスのゲノムを操作することができる(例えば、Berkner et al., (1988) Bio techniques 6:616;Rosenfeld et al.,(1991) Science 252:431−434;and Rosenfeld et al.,(1992) Cell 68:143−155を参照)。アデノウイルス系のAd5型dl324または他のアデノウイルス系(例えば、Ad2、Ad3、Ad7等)から誘導された適切なアデノウイルスベクターは当業者周知である。組換えアデノウイルスは、特定の環境、すなわち、非分裂細胞には感染しないが、広範な細胞型に感染するのに用いることができる環境において有利であり、ここで当該細胞型としては、気道の上皮細胞(上記のRosenfeld et al.,(1992))、内皮細胞 (Lemarchand et al.,(1992) PNAS USA 89:6482−6486)、肝細胞(Herz and Gerard,(1993) PNAS USA 90:2812−2816)および筋細胞(Quantin et al.,(1992) PNAS USA 89:2581−2584)がある。その上、ウイルス粒子は比較的安定で、精製および濃縮可能であり、さらに、上述したように、感染力の範囲に影響を与えるように改変することができる。加えて、導入されたアデノウイルスDNA(およびそれらに含まれる外来DNA)は、宿主細胞のゲノムに統合されず、エピゾーム状態を維持し、それによって、導入されたDNAが宿主ゲノム(例えば、レトロウイルスのDNA)に統合され得るような状況での挿入突然変異誘発の結果として生じる潜在的な問題を防ぐことができる。その上、アデノウイルスゲノムの外来DNAに対する環境収容力は、他の遺伝子運搬ベクターに比べて大きい(8キロベースまで)(上記のBerkner et al.;Haj−Ahmand and Graham(1986) J. Virol. 57:267)。現在使用されており、従って本発明でも好ましい殆どの複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスのElおよびE3遺伝子の全部または一部を欠損しているが、アデノウイルス遺伝物質の80%を保持する(例えば、上記のJones et al.,(1979) Cell 16:683;Berkner et al.;and Graham et al., in Methods in Molecular Biology, E.J. Murray, Ed.(Humana, Clifton, NJ, 1991) vol. 7. pp. 109−127を参照)。挿入されたGRF2経路成分の遺伝子は、例えば、E1Aプロモーター、主要後期プロモーター(MLP)および関連リーダー配列、ウイルスE3プロモーター、または外部から付加されたプロモーター配列の制御下で発現させることができる。
【0196】
本発明に係るGRF2経路成分の遺伝子の運搬に有用なさらに他のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス(AAV)。アデノ随伴ウイルスは、天然に存在する欠損ウイルスであって、当該ウイルスは、効率的な複製および増殖性の生活環のために、ヘルパーウイルスとして他のウイルス(例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス)を必要とする(文献として、Muzyczka et al., Curr. Topics in Micro. and Immunol.(1992) 158:97−129を参照)。また、アデノ随伴ウイルスは、そのDNAを非分裂細胞に統合させ、高頻度の安定な統合を示すことのできるわずかなウイルス種のひとつである(例えば、Flotte et al.,(1992) AM. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349−356;Samulski et al.,(1989) J. Virol. 63:3822−3828;and McLaughlin et al.,(1989) J. Virol. 62:1963−1973を参照)。AAVの300塩基対しか含まないベクターをパッケージングして、統合させることができる。外来性のDNAのためのスペースは、約4.5kbに制限される。AAVベクター(例えばTratschin et al.,(1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251−3260で説明される)を用いて、DNAを細胞に導入することができる。AAVベクターを用いて、様々な核酸を異なる細胞型に導入することができる(例えば、Hermonat et al.,(1984) PNAS USA 81:6466−6470;Tratschin et al.,(1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072−2081;Wondisford et al.,(1988) Mol. Endocrinol. 2:32−39;Tratschin et al.,(1984) J. Virol. 51:611−619;and Flotte et al.,(1993) J. Biol. Chem. 268:3781−3790を参照)。
【0197】
遺伝子治療で適用されてきた他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、および数種のRNAウイルスから誘導されたものであった。特に、ヘルペスウイルスベクターにより、中枢神経系の細胞および眼の組織で組換えGRF2経路成分の遺伝子を残存させるための特殊な方法を提供できる(Pepose et al.,(1994) Invest Ophthalmol Vis Sci 35:2662−2666)。
【0198】
上述したウイルス導入方法に加えて、非ウイルス的な方法を用いて、動物の組織中でGRF2経路成分を発現させることもできる。遺伝子導入のための非ウイルス的な方法の殆どは、生体高分子の取り込みおよび細胞内の輸送に関する哺乳動物細胞で用いられる正常なメカニズムに頼っている。好ましい実施形態において、本発明の非ウイルス性の遺伝子運搬システムは、ターゲット化細胞による本発明に係るGRF2経路成分の遺伝子の取り込みのための細胞内経路に頼っている。この種の代表的な遺伝子運搬システムとしては、リポゾーム由来のシステム(liposomal derived systems)、ポリリシン包接体、および人工ウイルスエンベロープがある。
【0199】
代表的な実施形態において、GRF2経路成分ポリペプチドをコードする遺伝子は、表面に正電荷を有するリポゾーム(例えば、リポフェクチン)、および(場合によって)ターゲット組織の細胞の表面抗原に対する抗体でタグを付されたリポゾーム(Mizuno et al.,(1992) No Shinkei Geka 20:547 551;PCT出願WO91/06309;日本国特許出願第1047381号;および欧州特許公報EP−A−43075)に捕獲され得る。例えば、神経膠腫細胞のリポフェクションは、神経膠腫関連抗原に対するモノクローナル抗体でタグを付されたリポゾームを用いて行うことができる(Mizuno et al.,(1992) Neurol. Med Chir. 32:873−876)。
【0200】
さらに他の例証的な実施形態において、遺伝子運搬システムは、遺伝子の結合剤(例えばポリリシン)で架橋された抗体または細胞表面リガンドを含む(例えば、PCT出願WO93/04701、WO92/22635、WO92/20316、WO92/19749、およびWO92/06180を参照)。例えば、本発明に係るGRF2経路成分の遺伝子構造を用いて、ポリカチオン(例えば、ポリリシン)に包接された抗体を含む可溶性ポリヌクレオチド担体によりインビボで特定の細胞にトランスフェクトさせることができる(米国特許第5,166,320号を参照)。また、エンドサイトーシスが仲介する本発明に係る核酸構造の有効な運搬を、エンドソーム構造からの遺伝子の逸脱を高める薬剤を用いて促進することができる、ということは明白である。例えば、アデノウイルス全体またはインフルエンザHA遺伝子産物の融合ペプチドを運搬システムの一部として用いて、DNA含有エンドソームの効率的な破壊を誘導することができる(Mulligan et al.,(1993) Science 260−926;Wagner et al.,(1992) PNAS USA 89:7934;and Christiano et al.,(1993) PNAS USA 90:2122)。
【0201】
臨床的な環境において、遺伝子運搬システムを、数多くの方法のいずれか(いずれも当業界でよく知られている)により患者に導入することができる。例えば、遺伝子運搬システムの医薬製剤を、例えば、静脈注射により全身に導入することができ、その構造のターゲット細胞における特異的が導入されるが、このような導入は、主に、遺伝子運搬媒体によって生じるトランスフェクションの特異性、遺伝子発現を制御する転写調節配列による細胞または組織での発現、またはその組み合わせによってなされる。他の実施形態において、組換え遺伝子の最初の運搬は、動物への導入が完全に局在化されるように限定される。例えば、遺伝子運搬媒体をカテーテルによって(米国特許第号5,328,470号を参照)、または、定位注入(stereotactic injection)によって(例えば、Chen et al.,(1994) PNAS USA 91:3054−3057を参照)導入することができる。
【0202】
10.薬物スクリーニング分析
また本発明は、薬物を同定する分析方法を提供し、当該薬物は、正常または異常細胞の増殖および/または分化またはそれに関する疾患の病因論の観点において、本発明に係るGRF2経路成分または当該タンパク質の役割の正常な細胞における機能に対するアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかである。一つの実施形態において、当該分析は、本発明に係るGRF2経路成分のいずれか一つと他のGRF2経路成分との相互作用を阻害する薬剤を検出する。他の実施形態において、当該分析は、GRF2経路成分またはGRF2経路成分複合体の内因性の生物活性、例えば、酵素活性、他の細胞成分への結合、細胞の区画化等を調節する薬剤を検出する。このような調節因子を、例えば、血管増殖性疾患および/または細胞分化性の疾患の治療に用いることができ、さらに、アポトーシスを調節することができる。
【0203】
様々な分析様式を用いられるが、本発明の開示の観点において、本明細書で明確に説明されていない分析様式も当業者によって理解される。タンパク質複合体、酵素活性、さらにGRF2仲介シグナル伝達経路が形成されるような状態に近い分析様式は、無細胞系(例えば、精製タンパク質または細胞溶解産物)に基づく分析、同様に、インタクト細胞を利用した細胞に基づく分析などの多くの異なる形態において可能である。また、簡単な結合分析を用いて、GRF2経路成分の結合、またはGRF2経路成分または複合体の基質への結合を破壊することによって、GRF2仲介シグナル伝達を阻害する薬剤を検出できる。GRF2シグナル伝達阻害剤として作用する能力を試験される薬剤は、例えば、細菌、酵母または他の生物によって製造され(例えば、天然産物)、化学的に製造され(例えば、ペプチドミメティックを含む低分子)、または組換えによって製造される。好ましい実施形態において、試験薬剤としては、約2,000ダルトン未満の分子量を有するペプチドまたはオリゴヌクレオチドのほかには、例えば、低分子の有機分子がある。
【0204】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所定の時間で調査される化合物数を最大化するために、ハイスループット分析が望ましい。本発明の、無細胞系でなされる分析(例えば精製または半精製タンパク質または溶解産物を用いて行われるような分析)は、しばしば「一次」スクリーニングとして行うことができ、この場合、当該スクリーニングにより、試験化合物で仲介される分子ターゲットの変化を迅速に展開し、比較的簡単に検出することができる。その上、一般的に、試験化合物の細胞毒性の効果および/または生物学的利用能は、インビトロ系では無視され、その代わりに、当該分析は、他のタンパク質との結合親和性の変化、または、分子ターゲットの酵素特性の変化に関して明白であるため、主として分子ターゲットにおける薬物の効果に焦点が当てられる。従って、可能性のある調節剤、例えば、GRF2仲介シグナル伝達の活性化剤または阻害剤は、細胞溶解産物中で機能的なGRF2シグナル伝達経路を構成することによって得られる無細胞分析において検出することができる。その代わりの様式において、以下で説明されるように、溶解産物に基づく分析に対して多くの利益を提供する再構成タンパク質混合物として、当該分析を行うことができる。
【0205】
一つの観点において、本発明は、GRF2仲介シグナル伝達を調節する薬物をスクリーニングするのに用いることができる分析を提供する。例えば、本発明の薬物スクリーニング分析は、GRF2シグナル伝達経路の成分の結合を破壊する薬剤を検出できるように設計することができる。他の実施形態において、本発明に係る分析は、GRF2シグナル伝達経路の成分の酵素活性の阻害剤を同定する。好ましい実施形態において、上記化合物は、メカニズムに基づく阻害剤であって、当該阻害剤は、GRF2シグナル伝達経路の成分を化学的に改変し、さらに、上記成分の特異的な阻害剤であり、例えば、阻害定数が相同タンパク質に比べて10倍、100倍、またより好ましくは1000倍異なる阻害剤である。
【0206】
本発明の分析の好ましいインビトロ実施形態において、GRF2シグナル伝達経路は、少なくとも半精製タンパク質の再構成タンパク質混合物を含む。半精製された、とは、他の細胞タンパク質またはウイルスタンパク質から予め分離された再構成混合物において利用されるタンパク質を意味する。例えば、細胞溶解産物と比較して、GRF2仲介シグナル伝達に関与するタンパク質は、混合物中の全ての他のタンパク質に対して少なくとも50%の純度で、より好ましくは90〜95%の純度で混合物中に存在する。本発明に係る方法の特定の実施形態において、再構成タンパク質混合物は、高度に精製されたタンパク質を混合することによって得られ、この場合、再構成混合物が、GRF2仲介シグナル伝達を測定する能力を妨害したり改変したりする可能性のある他のタンパク質(例えば細胞のタンパク質またはウイルス由来のタンパク質)を実質的に含まないようにする。
【0207】
一つの実施形態において、再構成タンパク質混合物の使用により、GRF2シグナル伝達状態をより慎重に制御することができる。その上、GRF2シグナル伝達経路の特定の段階の阻害剤を見出すのに好都合なシステムを引き出すことができる。例えば、再構成タンパク質の分析は、候補薬剤の存在または非存在下の両方で行い、それによってGRF2仲介シグナル伝達の阻害剤を検出することができる。
【0208】
候補の阻害剤の存在および非存在下でのGRF2仲介シグナル伝達の分析は、反応物を入れるのに適切ないかなる容器を用いて行うことができる。例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管がある。
【0209】
本発明の一つの実施形態において、GRF2シグナル伝達経路の成分の結合を妨害する能力に基づいて阻害剤を検出する薬物スクリーニング分析が提供される。代表的な結合分析において、興味のある化合物と、GRF2経路成分ポリペプチドから得られた混合物とを接触させる。例えば、当該混合物は、GRF2と表1で示されるポリペプチドの1以上、pIClnおよび表2で示されるポリペプチドの1以上、Ndrおよび表3A〜Bで示されるポリペプチドの1以上、Skb1および表4A〜Bで示されるポリペプチドの1以上、または、PP2Cおよび表5で示されるポリペプチドの1以上の混合物である。GRF2 シグナル伝達複合体の検出および定量は、上記2種のポリペプチド間での複合体形成を阻害する(または強化する)ことに関する化合物の有効性 を決定するための手段を提供する。上記化合物の有効性は、試験化合物の様々な濃度を用いて得られたデータによる用量反応曲線を作製することによって評価できる。その上、コントロール分析を行い、比較用の基準線を得ることができる。コントロール分析において、複合体の形成は試験化合物の非存在下で定量される。
【0210】
GRF2経路成分ポリペプチドの間またはGRF2経路成分と基質ポリペプチドとの間の複合体形成は、様々な技術によって検出することができ、その技術の多くは事実上上述されている。例えば、複合体形成における調節は、例えば、検出可能な標識タンパク質(例えば、放射標識した、蛍光標識、または酵素的に標識された)を用いて、イムノアッセイ、またはクロマトグラフィーによる検出によって定量することができる。
【0211】
一般的に、ポリペプチドのいずれか一つを固定することが望ましく、それにより、タンパク質のいずれか一つの複合化していない形態から複合体を分離することを容易にし、同様に、分析の自動化に便宜をはかることができる。例証的な実施形態において、タンパク質を不溶性マトリックスに結合させるようなドメインを付加された融合タンパク質が提供される。例えば、GST−GRF2経路成分の融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオン誘導マイクロタイタープレートに吸着させ、次に、可能性のある相互作用タンパク質(例えば、35Sで標識したポリペプチド)および試験化合物を加え、複合体形成を助ける状態のもとでインキュベートすることができる。インキュベーション後、そのビーズを洗浄して、未結合の相互作用タンパク質の全てを除去し、マトリックスビーズに結合した放射標識を直接測定する(例えば、シンチラントに位置するビーズ)、または、例えばマイクロタイタープレートを用いた場合、複合体を解離させた後、上清を測定する。あるいは、未結合のタンパク質を洗浄で除いた後、複合体をマトリックスから解離し、SDS−PAGEゲルで分離し、およびマトリックス結合分画で見出された相互作用するポリペプチドのレベルを標準的な電気泳動技術を用いてゲルにより定量することができる。
【0212】
さらに他の実施形態において、GRF2経路成分および可能性のある相互作用ポリペプチドを用いて、相互作用トラップ分析を行い(または米国特許第5,283,317号;Zervos et al.(1993) Cell 72:223−232;Madura et al.(1993) J Biol Chem 268:12046−12054;Bartel et al.(1993) Bio techniques 14:920−924;and Iwabuchi et al.(1993) Oncogene 8:1693−1696を参照)、その後、互いのタンパク質の結合を破壊する薬剤を検出することができる。
【0213】
特に、当該方法は、ハイブリッドタンパク質を発現するキメラ遺伝子を利用することができる。説明すると、第一のハイブリッド遺伝子は、転写活性因子のDNA結合ドメインのコーディング配列を含み、「ベイト」タンパク質(例えば、可能性のある相互作用タンパク質に結合するのに十分な長さのGRF2経路成分ポリペプチド)のコーディング配列のフレーム中に融合させることができる。第二のハイブリッドタンパク質は、転写活性化ドメインをコードしており、当該転写活性化ドメインは、「魚(fish)」タンパク質(例えば、ベイト融合タンパク質のGRF2経路成分ポリペプチド部分と相互作用するのに十分な長さを有する、可能性のある相互作用タンパク質)をコードする遺伝子のフレームに融合されている。上記ベイトおよび魚タンパク質が相互作用できる場合、例えば、GRF2経路成分複合体を形成する場合、それらは近接した2つの転写活性因子ドメインを生じる。この近接により、転写活性因子に関与する転写調節部位に実施可能に連結したレポーター遺伝子の転写が起こり、レポーター遺伝子の発現を検出し、ベイトおよび魚タンパク質の相互作用を評価するのに用いることができる。
【0214】
本発明に従って、当該方法は、「ベイト」融合タンパク質を宿主細胞に提供することを含み、当該宿主細胞としては、好ましくは酵母細胞、例えば、Kluyverei lactis、Schizosaccharomyces pombe、Ustilago maydis、Saccharomyces cerevisiae、Neurospora crassa、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans、Pichia pastoris、Candida tropicalis、およびHansenula polymorphaがあり、最も好ましくはS cerevisiaeまたはS. pombeである。当該宿主細胞はレポーター遺伝子を含み、当該レポーター遺伝子は、ベイトタンパク質で用いられた転写活性因子のDNA結合ドメインのための結合部位を有し、遺伝子の転写が活性化された場合、レポーター遺伝子は検出可能な遺伝子産物を発現させることができる。第一のキメラ遺伝子は、宿主細胞の染色体に存在してもよいし、発現ベクターの一部として存在してもよい。
【0215】
また、宿主細胞は、宿主細胞で発現させることができる第一のキメラ遺伝子を含む。当該遺伝子は、キメラタンパク質をコードしており、(i)レポーター遺伝子に応答する要素を宿主細胞中で認識するDNA結合ドメイン、および(ii)ベイトタンパク質(例えばGRF2経路成分ポリペプチド配列)を含む。
【0216】
また、第二のキメラ遺伝子が提供され、これは、宿主細胞中で発現させることができ、「魚」融合タンパク質をコードする。一つの実施形態において、魚および第二のキメラ遺伝子の両方を、プラスミドの形態で宿主細胞に導入することができる。しかしながら、好ましくは、第一のキメラ遺伝子は宿主細胞の染色体中に存在し、第二のキメラ遺伝子はプラスミドの一部として宿主細胞に導入される。
【0217】
好ましくは、第一のハイブリッドタンパク質のDNA結合ドメインと、第二のハイブリッドタンパク質の転写活性化ドメインとは、分離可能なDNA結合および転写活性化ドメインを有する転写活性因子から誘導される。例えば、これらの独立したDNA結合および転写活性化ドメインは、酵母GAL4タンパク質で見出されることがわかっており、さらに、酵母GCN4およびADR1タンパク質で見出されることがわかっている。また、転写に関与する他のタンパク質の多くは分離可能な結合および転写活性化ドメインを有し、これらは本発明において有用であり、例えば、LexAおよびVP16タンパク質がある。他の(実質的に)転写不活性なDNA結合ドメインを本発明に係る構造に用いることができ、例えばACE1、λcI、lacリプレッサー、junまたはfosのドメインがあることが理解できる。他の実施形態において、DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインは、異なるタンパク質からでもよい。LexAのDNA結合ドメインを使用することによって、特定の利点が得られる。例えば、酵母において、LexA部分は、活性化機能を含まず、酵母遺伝子の転写になんの既知の影響ももたない。加えて、LexAの使用により、相互作用レベルの分析の感度を制御することができる(例えば、Brent等のPCT出願WO94/10300を参照)。
【0218】
好ましい実施形態において、ベイトまたは魚タンパク質に関するいかなる酵素活性(例えば、優性阻害)が不活性化されており、または、GRF2経路成分他の変異体を用いてもよい。
【0219】
例証的な実施例の続きとして、宿主細胞中で、ベイトおよび魚の融合タンパク質間で、GRF2経路成分が仲介する相互作用が生じ、それによりドメインが活性化され、レポーター遺伝子の転写を活性化することができる。当該方法は、第一のキメラ遺伝子および第二のキメラ遺伝子を宿主細胞に導入し、ベイトおよび魚の融合タンパク質が、レポーター遺伝子が活性化されるのに十分な量で発現される状態のもとに当該細胞をさらすことによって行われる。GRF2経路成分/相互作用タンパク質複合体の形成により、レポーター遺伝子の発現により生産された検出可能なシグナルが生じる。従って、試験化合物の存在下および試験化合物の非存在下の複合体の形成のレベルを、いずれの場合のレポーター遺伝子の発現レベルを検出することによって評価できる。様々なレポーター構造が本発明の方法に従って用いることができ、例えば、検出可能なシグナルを生産するレポーター遺伝子があり、当該検出可能なシグナルは、酵素シグナル、蛍光シグナル、リン光性シグナルおよび薬剤耐性からなる群より選択することができる。
【0220】
本発明の一つの観点は、再構成タンパク質の調製物、例えば、精製タンパク質の組み合わせを提供し、当該組み合わせとしては、GRF2および表1に記載のポリペプチドの1以上、pIClnおよび表2に記載のポリペプチドの1以上、Ndrおよび表3A〜Bに記載のポリペプチドの1以上、Skb1および表4A〜Bに記載のポリペプチドの1以上、または、PP2Cおよび表5に記載のポリペプチドの1以上がある。
【0221】
本発明の分析のさらなる実施形態において、本発明に係る分析をサポートする細胞培養技術の利点を利用して、GRF2シグナル伝達経路を細胞全体で発生させることができる。例えば、以下で説明されるように、GRF2シグナル伝達経路を、真核細胞培養系(哺乳動物や酵母細胞を含む)で構築することができる。インタクト細胞中で本発明に係る分析を行う利点は、阻害剤の治療的使用が必要となり得る環境によりいっそう近い環境で機能的な阻害剤を検出する能力を含み、例えば、薬剤の細胞への侵入を強化する能力がある。その上、例えば以下に示す実施例のような、インビボでの当該分析の実施形態のいくつかは、候補薬剤のハイスループット分析で処理することができる。
【0222】
GRF2シグナル伝達経路の成分は、上記分析をサポートするように選択された細胞に内在するものでもよい。あるいは、当該成分のいくつかまたは全部が外来性の源より誘導されてもよい。例えば、融合タンパク質は、組換え技術(例えば発現ベクターの使用によって)によって細胞に導入してもよいし、同様に、融合タンパク質自身または当該融合タンパク質をコードしたmRNAをマイクロインジェクションすることによって細胞に導入してもよい。
【0223】
いずれの場合においても、GRF2仲介シグナル伝達現象(例えば、GRF2経路成分基質の翻訳後修飾(例えばリン酸化)の調節、GRF2シグナル伝達への応答における遺伝子の転写の調節など)の検出を促進するために、細胞を候補の阻害剤でインキュベートした後に最終的に処理する。再構成タンパク質混合物または溶解産物で行われた分析に関して上述したように、候補の阻害剤の有効性は、GRF2経路成分ポリペプチドの直接的な特徴を測定することによって評価でき、当該測定としては、電気泳動法による分子量の移動、または、結合分析における検出がある。これらの実施形態に関して、一般的に、候補の薬剤でのインキュベーションの終わりに細胞を溶解させ、その溶解産物を、再構成タンパク質混合物または溶解産物(例えば上述した方法)で用いられたのと大体同じ方法で検出工程において操作することができる。
【0224】
また、GRF2シグナル伝達経路の間接的な測定は、GRF2仲介シグナル伝達現象によって調節されたGRF2経路成分に関する生物活性を検出することによって達成することができる。上述したように、GRF2経路成分ポリペプチドを含む融合タンパク質および酵素活性の使用は、本発明に係る分析の代表的な実施形態であり、当該方法において、検出手段は、関連する酵素活性を定量することによってGRF2経路成分ポリペプチドを間接的に測定することによる。
【0225】
プロテインキナーゼ活性の阻害剤の同定
タンパク質キナーゼは、アデノシン三リン酸(ATP)またはグアノシン三リン酸(GTP)からのリンのターゲット化タンパク質への移動を触媒して、リン酸化タンパク質およびアデノシン二リン酸(ADP)またはグアノシン二リン酸(GDP)とをそれぞれ生産する酵素である。ATPまたはGTPは、まず加水分解されて、ADPまたはGDP、および無機リン酸を形成する。次に、無機リン酸はターゲット化タンパク質に付着する。キナーゼによりターゲット化されたタンパク質基質は、構造タンパク質であり、膜成分(例えば細胞壁、または、機能的タンパク質である他の酵素)で見出される。
【0226】
タンパク質キナーゼは、しばしば、それらがリン酸化するアミノ酸残基に基づいて2つのグループに分割される。第一のグループは、いわゆるセリン/スレオニンキナーゼであり、例えば、サイクリックAMPおよびサイクリックGMP依存性タンパク質キナーゼ、カルシウムおよびリン脂質依存性タンパク質キナーゼ、カルシウムおよびカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ、カゼインキナーゼ、細胞分裂周期タンパク質キナーゼ等がある。通常、これらのキナーゼは、細胞質性か、または、できればタンパク質を固定することにより細胞の粒子分画に結合している。
【0227】
第二のキナーゼのグループは、いわゆるチロシンキナーゼであり、チロシン残基をリン酸化する。これらは、かなり少量でしか存在しないが、細胞調節において均一な重要な役割を果たす。これらのキナーゼは数種の受容体を含み、当該受容体は、成長因子やホルモンのような分子に対するものであり、例えば、上皮成長因子受容体、インスリン受容体、血小板由来成長因子受容体等のような分子に対する数種の受容体である。研究が示すところによれば、多くのチロシンキナーゼは、膜貫通型タンパク質であり、その受容体ドメイン(細胞の外側に位置する)およびそのキナーゼドメイン(内側に位置する)を共に有する。
【0228】
本明細書で用いられる「キナーゼ」とは、ATPまたはGTPから基質ポリペプチドへリン酸基を移動させることができる酵素的に活性なポリペプチドを意味する。キナーゼは、単独の未改変ポリペプチドで活性であるか、または、付加的な活性のための因子を必要とすることもあり、当該因子としては、例えば、他のポリペプチド(例えば、サイクリン依存性タンパク質キナーゼに対するサイクリンサブユニットのような結合パートナー)、コファクター(例えば、マグネシウム、マンガン、カルシウムなど)および/または翻訳後修飾(例えば、リン酸化、糖付加など)がある。
【0229】
試験分子がキナーゼ活性を阻害する有効性を評価するためのインビトロ分析は、精製キナーゼポリペプチドまたはポリペプチド複合体を用いて行うことができる。精製キナーゼは、完全長分子の組換え産物、または生物学的に活性なそれらの変異体または誘導体によって得ることができる。組換えポリペプチドを生産する方法は上述したとおりである。キナーゼポリペプチドの組換え産物のための宿主細胞としては、これらに限定されないが、細菌(例えばE. coli)、酵母、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス系を用いた)、哺乳動物細胞、または他の真核細胞がある。複数のサブユニットのキナーゼ複合体のポリペプチド構成要素を、同じ宿主細胞で共に生産することができ、この場合、その宿主細胞は、各ポリペプチドをコードするDNAで共にトランスフェクトされる。キナーゼポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、宿主細胞(または、それらが分泌される場合は、培地)から精製することができ、一般的に、この方法は、各ポリペプチドを、「タグ」配列(例えばヘマグルチニン(「HA」)、His(ヘキサヒスチジンのようなポリヒスチジン)、mycまたはFLAG)と共に発現させ、タグを付されたポリペプチドをアフィニティークロマトグラフィーによって精製することによってなされ、当該アフィニティークロマトグラフィーにおいては、例えば、ポリヒスチジンに対してはニッケルカラムを用い、またはmycまたはFLAGに対してはモノまたはポリクローナル抗体を用いることができる。キナーゼ活性に必要な翻訳後修飾は、生産中に宿主細胞で自然に起こり得るが、精製成分を用いてなされてもよい。例えば、バキュロウイルス発現系を用いた昆虫細胞でのCdk2/サイクリンA共発現により、細胞から活性キナーゼ複合体(すなわち、活性化したスレオニンリン酸化を含む)を単離することができる。あるいは、別々に発現されたCdk2およびサイクリンAポリペプチドを混合して、ATPの存在下でCdk活性化キナーゼまたは「Cak」とインキュベートし、活性化Cdk2/サイクリンAペアを生産することができる。
【0230】
本発明の分析において有用なキナーゼ基質としては、タンパク質、タンパク質断片またはペプチド(Kemp, Design and Use of Peptides Substrates for Protein Kinase. Methods in Enzymology. 200:121−134,(1991))がある。多くのタンパク質キナーゼの基質は、市販されており、例えばヒストンH1は、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼの一般的に用いられる基質であり、および多くの腫瘍遺伝子がチロシン残基でリン酸化されることがわかっている。あるいは、キナーゼ分析で用いることができる基質ポリペプチドを同定するために、各ペプチドが少なくとも1種のセリン、スレオニンおよび/またはチロシン残基を含むペプチドライブラリーを特異性が未知のタンパク質キナーゼの基質として用いることができる(Songyang, Z. et al., Curr. Biol. 4:973−982(1994) and Songyang & Cantley, Methods Mol. Biol. 87:87−98(1998))。簡単に言えば、ペプチドの混合ライブラリーを、ATPの存在下で、タンパク質キナーゼによるリン酸化で処理することができる。次に、リン酸化ペプチドを残りのライブラリーから分離し、配列分析で処理することができる。個々のリン酸化ペプチドは、その後のキナーゼ分析の基質として用いることができ、また、そのキナーゼに対するコンセンサス基質配列を、上記キナーゼの基質として作用し得るライブラリーからの全てのペプチドの分析に基づいて決定することができる。
【0231】
一般的に、タンパク質キナーゼ活性を測定する方法は、放射性の検出方法に基づく。このような方法において、興味のあるキナーゼを含むサンプルを、γ−32P−ATPまたはγ−32P−GTPの存在下で、活性化剤および基質とインキュベートする。しばしば、一般的で廉価な基質(例えばヒストンまたはカゼイン)が用いられる。適切なインキュベーション期間の後、反応物を保存し、ゲル電気泳動によって、または、フィルターに基質を結合させることによってリン酸化基質と遊離のリン酸とを分離し、洗浄して過剰な放射活性標識された遊離のATPを除去する。基質に取り込まれた放射標識されたリン酸の量は、シンチレーション計数またはリン光イメージ分析によって測定できる。あるいは、基質のリン酸化は、ホスホセリン、ホスホスレオニンまたはホスホチロシン残基に特異的な抗体(例えば、抗ホスホセリン、Sigma#P3430;抗ホスホスレオニン、Sigma#P3555;および抗ホスホチロシン、Sigma#P3300)を用いた免疫蛍光法によって検出できる。
【0232】
代表的な実施形態において、キナーゼ活性の阻害剤である薬剤を同定するための分析は、溶液中で行われる。活性キナーゼは、ガンマ標識されたATP(例えば32P−ATP)と、基質(例えばヒストンH1、カゼインなど)と、および試験分子と混合され、これらは、同時または連続的に溶液に加えられる。インキュベーション期間の後、基質を単離し、基質が含む標識の量を分析する。
【0233】
一つの好ましい分析は、「シンチレーション近接アッセイ」または「SPA」(Cook, Drug Discovery Today, 1:287−294(1996))とよばれ、当該分析において、ビオチン化基質(例えばヒストンH1または網膜芽腫ペプチド)をストレプトアビジンでコーティングされた非多孔質性ビーズに付着させ、シンチレーション液で充填される。マイクロタイタープレート(例えば96ウェルプレートまたは384ウェルプレート)を用いて、上記ビーズを、活性キナーゼ、ガンマ標識されたATPおよび試験分子とインキュベートすることができる。放射標識したリン酸基が活性キナーゼの活性を介して基質へ移動したら、放射性のリン酸基により放出されたフォトンをシンチレーションカウンターを用いて記録する。キナーゼ活性を阻害するのに有効な試験分子を含むウェルにおいて検出される放射性の計測数は、コントロールウェルに比べて少ない。
【0234】
また、他のインビトロ分析で処理して、試験分子を評価することができる。このような分析の一つにおいて、基質をマイクロタイタープレートのウェルに付着させ、続いて、活性ホロ酵素複合体、ガンマ標識されたATP(または他の適切な検出因子)および試験分子を連続的または同時に加えることができる。短時間のインキュベーション(秒〜分単位)の後、その溶液を各ウェルから除去してプレートを洗浄し、次に、キナーゼ活性により基質に付加された標識されたγリン酸の量を測定することができる。
【0235】
これらの分析の他のバリエーションは、当業者に明白である。例えば、基質は、ビーズ、あるいはその代わりに各ウェルの底部にに付着させることができる;次に、当該ビーズを、試験分子、標識されたATP、および活性ホロ酵素複合体と共にインキュベーションした後、溶液から除去し、次に、基質に取り込まれた標識の量を測定することができる。
【0236】
一般的に、各タイプの分析において、試験分子は濃度の範囲にわたり評価され、および、一連の適切なコントロールは結果を評価する上での正確さを求めるために用いられる。いくつかの場合において、「相乗」効果の可能性を分析するために、2以上の試験分子を一緒に評価することが有用である。
【0237】
他の実施形態において、キナーゼが基質をリン酸化する能力を阻害する試験薬剤の能力は、基質分子の活性を測定することによって達成できる。例えば、基質分子がキナーゼによってリン酸化に関して活性化される場合、基質分子の活性は、キナーゼの活性を測定するための手段として分析される。キナーゼと試験分子とをインキュベートした際に、基質の活性化のレベルが減少すれば、キナーゼ阻害剤である可能性を示す。例えば、分析は、以下に示すような分析によって行うことができ、すなわち、基質による細胞性の第2メッセンジャー(例えば、細胞内のCa2+、ジアシルグリセロール、IP3など)の誘導を検出することによって、基質の触媒性/酵素活性を検出することによって、レポーター遺伝子(検出可能なマーカー(例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)をコードする核酸に操作可能に連結された基質応答性の調節要素を含む)の誘導を検出することによって、または、ターゲットが調節する細胞応答を検出することによって、分析を行うことができる。
【0238】
ホスファターゼ活性の阻害剤の同定
タンパク質ホスファターゼ活性の決定は、リン酸化された基質から遊離した32Pを定量することによって決定することができる(例えば、Honkanen et al., J. Biol. Chem. 265:19401−04(1990);Honkanen et al., Mol. Pharmacol. 40:577−83(1991);and Critz and Honkanen, NeuroProtocoles 6:78−83(1995)を参照)。一般的に、ホスファターゼ分析は、ホスファターゼと32Pで放射標識した基質とを混合することによって行うことができる。次に、遊離した32Pを残存した放射標識した基質から分離し、上清中の放射活性レベルをシンチレーション計測によって測定する。例えば、GSTが融合した放射標識した基質を、ホスファターゼとインキュベートすることができる(Tonks et al., J. Biol. Chem. 263:6731−6737(1988))。次に、その基質をグルタチオンアガロースビーズを用いて反応物から分離する。次に、上清中に残存した放射活性の量を用いて、ホスファターゼ活性レベルを定量することができる。あるいは、放射標識した基質とホスファターゼとをインキュベートした後、その反応物をSDSゲルを用いて分離し、遊離した32Pを残存した放射標識した基質から分離することができる。未処理の基質と比較した基質における放射活性の減少は、ホスファターゼ活性レベルの決定に用いることができる。放射標識した基質の定量は、ゲル上のバンドを切り出し、シンチレーション計測するか、または、リン光イメージ分析によって測定することができる。
【0239】
本発明の分析において有用なホスファターゼ基質としては、リン酸化タンパク質、タンパク質断片、ペプチドまたは人工基質がある。ホスファターゼ分析のための代表的な基質としては、これらに限定されないが、p−ニトロフェニルホスフェート、リン酸化リゾチーム(例えば、ホスホチロシン還元カルボキシアミドメチル化およびマレイル化リゾチーム(RCML)およびホスホセリン(RCML))、リン酸化ミエリン塩基性タンパク質、チロシンリン酸化EGFRペプチド(DADEpYLIPQQG)、チロシンリン酸化v−ablペプチド(EDNDYINASL)、リン酸化p42mapkなどがある(Tonks, NK et al., J. Biol. Chem. 263:6731−6737(1988);Zhang, Z−Y et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4446−4450(1993);Charles, CH et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5292−5296(1993);Hannon, GJ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1731−1735(1994);およびZhang, Z Y, J. Biol. Chem. 270:16052−16055(1995))。
【0240】
ホスファターゼ阻害剤を決定するために、リン酸化基質の付加の後、または、それと同時に、試験分子をホスファターゼ分析に加えることができる。ホスファターゼ活性レベルを測定し、試験分子非存在下での活性のレベルと比較する。遊離した32Pの量が減少していれば、または、基質における放射活性が減少していれば、試験分子がホスファターゼ阻害活性を有することが示される。既知のホスファターゼ阻害剤(例えばオカダ酸)の付加は陽性コントロールとして用いることができる。
【0241】
メチルトランスフェラーゼ活性の阻害剤の同定
メチルトランスフェラーゼ活性は、ドナー基質とアクセプター基質との間での放射標識したメチル基の移動を測定することによって決定できる。例えば、[3H]AdoMet(NEN catalog No. Net115)を、アクセプター基質およびメチルトランスフェラーゼと共に、ドナー基質と混合することによって分析することができる。インキュベーション後、ドナー基質をろ過することによって、または、SDSゲルで分離することによって反応物から分離する。次に、取り込まれた[3H]メチルの量を、シンチレーション計数によって、または、リン光イメージ分析によって測定する。検出された放射活性の量は、メチルトランスフェラーゼ活性に比例する。本発明の分析において有用なメチルトランスフェラーゼのアクセプター基質としては、核酸、例えば、RNAまたはDNAのオリゴヌクレオチド、特に少なくとも1つのシトシン(C)ヌクレオチドを含む上記オリゴヌクレオチドがある(Smith, SS, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4744−4748(1992))。
【0242】
メチルトランスフェラーゼ阻害剤を決定するために、アクセプター基質の添加の前に、またはと同時に、試験分子をメチルトランスフェラーゼ分析に加えることができる。メチルトランスフェラーゼ活性のレベルを測定し、試験分子非存在下での活性のレベルと比較する。アクセプター基質に取り込まれた[3H]メチルの量が減少していれば、試験分子はメチルトランスフェラーゼ阻害活性を有することが示される。
【0243】
他の実施形態において、GRF2経路成分ポリペプチドの生物活性は、ターゲット化細胞の表現型の変化をモニターすることによって評価できる。例えば、検出手段は、転写調節要素を含むレポーター遺伝子構造であってもよく、ここで当該転写調節要素は、いくつかの形態で、GRF2経路成分またはGRF2経路成分の基質タンパク質のレベルに依存する。GRF2経路成分は、レポーター遺伝子構造のDNA要素に結合するドメインを有する融合タンパク質として提供され得る。付加された融合タンパク質のドメインは、そのDNA結合能力によって、レポーター遺伝子の転写を増加または減少させるドメインであり得る。いずれの場合においても、融合タンパク質中に上記ドメインが存在することによって、レポーター遺伝子をGRF2仲介シグナル伝達経路に応答させることができる。従って、レポーター遺伝子の発現レベルは、GRF2経路成分の発現レベルに応じて変化する。
【0244】
レポーター遺伝子産物は、検出可能な標識であって、例えばルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼであり、これらは無傷の細胞中で生産される。その後の細胞の溶解物において、標識を測定することができる。しかしながら、溶解工程を省略することが好ましく、一般的に、標識を測定するために細胞溶解工程を用いることは、標識の検出が細胞全体中で達成できない場合においてのみ用いられることが好ましい。
【0245】
その上、本発明に係る分析の細胞全体の実施形態において、レポーター遺伝子構造は、発現の際に選択可能なマーカーを提供することができる。レポーター遺伝子は、検出可能な遺伝子産物(RNAまたはタンパク質であり得る)を発現するいずれの遺伝子を含む。好ましいレポーター遺伝子は、容易に検出可能なものである。また、レポーター遺伝子は、融合遺伝子の形態で構造に含ませることができ、ここで当該融合遺伝子は、所望の転写調節配列を含むか、または、他の望ましい特性を示す遺伝子を有する。例えば、レポーター遺伝子の生産物は、抗生物質または他の薬物に対する耐性を付与する酵素、または、宿主細胞における欠陥を補足する酵素(すなわち、チミジンキナーゼまたはジヒドロ葉酸レダクターゼ)であり得る。説明すれば、細菌性のトランスポゾン遺伝子Tn5 neoでコードされたアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼを、細胞中に存在するGRF2経路成分ポリペプチドのレベルに応答するプロモーター要素の転写調節下に置いてもよい。このような本発明に係る分析の実施形態は、特にハイスループット分析で処理することができ、この場合、GRF2仲介シグナル伝達経路の阻害として細胞増殖を簡単に測定できる。
【0246】
レポーター遺伝子の他の例としては、これらに限定されないが、CAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)(Alton and Vapnek(1979), Nature 282:864−869)ルシフェラーゼ、および他の酵素検出系、例えばβ−ガラクトシダーゼ;ホタルのルシフェラーゼ(deWet et al.(1987), Mol. Cell. Biol. 7:725−737);細菌性のルシフェラーゼ(Engebrecht and Silverman(1984), PNAS 1:4154−4158;Baldwin et al.(1984)、Biochernistry 23:3663−3667);アルカリホスファターゼ(Toh et al.(1989) Eur. J. Biochem. 182:231−23 8, Hall et al.(1983) J. Mol. Appl. Gen. 2:101)、ヒト胎盤で分泌されるアルカリホスファターゼ(Cullen and Malim(1992) Methods in Enzymol. 216:362−368)がある。
【0247】
レポーター遺伝子からの転写量は、当業者既知の適切な方法のいずれかを用いて測定することができる。例えば、特異的なmRNA発現は、ノーザンブロットを用いて検出することができ、または、特異的なタンパク質産物は、特徴的な染色、ウェスタンブロットまたは内因性の活性により同定することができる。
【0248】
好ましい実施形態において、レポーター遺伝子産物は、その産物と結合する内因性の活性によって検出される。例えば、レポーター遺伝子は、酵素活性によって色、蛍光、または発光に基づく検出シグナルを生じる遺伝子産物をコードし得る。
【0249】
次に、レポーター遺伝子の発現量と、試験化合物非存在下の同じ細胞の発現量とを比較するか、または、レポーター遺伝子の発現量と、GRF2仲介シグナル伝達経路成分を含まない実質的に同一な細胞における転写量とを比較することができる。
【0250】
11.実施例
以上、本発明を一般的に説明したが、以下の実施例を参照することによって本発明をより容易に理解することができ、当該実施例は、本発明の特定の観点および実施形態を単に説明する目的のためであって、本発明を限定する意図はない。
【0251】
実施例1:GRF2相互作用タンパク質の同定
細胞性プロセスにおけるGRF2シグナル伝達経路およびその役割をよりよく理解するために、共免疫沈降反応実験を反復して行い、GRY2シグナル伝達に関与するタンパク質−タンパク質相互作用を綿密にまとめた。以下で説明される実験において、エピトープタグを付したマウスGRF2の誘導体(Flag−GRF2)を用いて、ヒト胚の腎臓上皮細胞(HEK293)からGRF2関連タンパク質を単離した。Flag−GRF2関連タンパク質を、SDS−PAGEで分離したトリプシン消化タンパク質をマススペクトロメトリー分析することによって同定した。この方法によって、ヒトタンパク質pICln、Ndr、Skb1およびPP2Cを含むこれらヒト細胞から回収されたGRF2と結合する様々なタンパク質が見出された。次に、同様の実験でこれらタンパク質をベイトとして用いて、これらGRF2相互作用タンパク質と結合するタンパク質を単離した。
【0252】
免疫沈降反応
Flag−エピトープタグを付したマウスRas−GRF2発現ベクターおよびヒト293細胞由来の細胞系クローン13(またはcl.13)およびクローン21(またはcl.21)(これらはマウスFlag−Ras−GRF2(GRF2)を安定して発現する)は、Fam等(12)で説明される。Flag−Ras−GRF2タンパク質(GRF2)を一時的に発現させるため、ヒト胚腎臓細胞系293を、リポフェクトアミンプラス(Gibco−BRL)を用いてトランスフェクトした。48時間(hまたはhr)後、トランスフェクトされた細胞(約1×108細胞)をトリス−塩類液(25mMのトリス−HCl(pH7.5)、140mMのNaCl、8mMのKCl、700μMのNa2HP04、5.5mMのグルコース)で洗浄し、リシスバッファー(KLB、20mMのトリス−HCl(pH7.5)、150mMのNaCl、1%のNP40、0.5%のデオキシコール酸ナトリウム、および0.2mMのAEBSF(4−(2−アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオライド))で溶解させた。続いて、遠心分離して不溶性物質を除去し、澄んだ溶解産物を、セファロース−4B(溶解産物1mlにつき10μlの充填セファロース)で、穏やかに混合しながら(転倒させることにより)40℃で20分間インキュベートした。次に、その上清を、固定化抗Flagモノクローナル抗体(M2−アガロース、Sigma−Aldrich;溶解産物1mlにつき1μlの充填M2−アガロース)を用いて、穏やかに混合しながら4℃で60分間インキュベートした。上記M2−アガロースを1mlのKLBを含まないAEBSFで2回洗浄し、1mlの50mMの重炭酸アンモニウムで1回洗浄した。M2−アガロースからのFlag−Ras−GRF2および関連タンパク質を特異的に溶出するために(競合させることにより)、M2−アガロースビーズを、50mMの重炭酸アンモニウム(400μg/mlのFlagペプチド(Sigma−Aldrich)を含む)で再懸濁した。4℃で30分経過した後、M2−アガロースビーズを遠心分離によって除去し、溶出したタンパク質を真空遠心分離により凍結乾燥させ、SDS−PAGEサンプル緩衝液に再懸濁した。
【0253】
FLAG−pICln、FLAG−Ndr、FLAG−Skb1およびFLAG−PP2C融合タンパク質を用いた共免疫沈澱反応実験を、GFR−2タンパク質に対して上述したように行った。FLAG−Ndrの免疫沈降は、オカダ酸(ホスファターゼ阻害剤)で処理した細胞を用いて、または、FLAG−Ndr(K118A)変異融合タンパク質(Ndrのキナーゼ不活性型)を用いて、行った。FLAG−Skb1の免疫沈降は、共発現GRF2または非共発現GRF2のいずれかの細胞で行われた。
【0254】
サンプル調製およびSDS−PAGE分析
再懸濁されたサンプルを最終濃度1×SDSのサンプル緩衝液(pH8.8に調節)中で沸騰させた。次に、このサンプルを1%アクリルアミド(Fisher)を含むように調整し、23℃で1時間インキュベートした。4〜15%のアクリルアミド−トリス−HClグラージェントゲルを用いたSDS−PAGE(BioRad)でサンプルを分離した。そのゲルをまず製造者説明書に従ってGELCODEブルー染色試薬(Pierce)で染色した。クローン13で誘導された細胞溶解物からのM2免疫沈降物に特有な染色されたタンパク質バンドを単離し、マススペクトロメトリーによる分析のために調製した(次の章を参照)。次に、そのゲルをShevchenko 96で説明された方法(ただし以下の点で異なる:50%エタノール、10%酢酸で固定し、50%エタノールですすぎ、0.0004%チオ硫酸ナトリウムを現像溶液に加え、および反応を1%酢酸中で止めた)に従って銀染色した。クローン13で誘導された細胞溶解物からのM2免疫沈降物に特有な銀染色されたバンドを単離し、マススペクトロメトリーによる分析のために調製した。
【0255】
マススペクトロメーター分析のためのサンプル調製
ゲル内消化およびペプチド抽出を、Shevchenko 96に従って行った(ただし以下の点で異なる:システインをアクリルアミドで改変し(上述したとおり)、そのため、DTT還元およびヨードアセトアミド工程を省略した)。簡単に言えば、そのゲルスライスを重炭酸アンモニウムで洗浄し、次に、100%アセトニトリルで脱水した。そのゲルスライスを氷上で消化用緩衝液(50mMの重炭酸アンモニウム、5mMのCaCl2、および12.5ng/μlのトリプシンを含む)(Boehringer MannheimまたはPromega)を用いて元に戻し、トリプシンを含まない消化用緩衝液で37℃で一晩インキュベートした。20mMの重炭酸アンモニウムを1回交換して、さらに、50%アセトニトリル中の5%ギ酸を2回交換して、ペプチドを抽出した。サンプルを真空遠心分離で量が10μlになるまで濃縮した。
【0256】
結果
GRF2経路成分相互作用タンパク質
FLAG−GRF2免疫沈降実験で得られたタンパク質の、代表的なクーマシーブルーおよび銀で染色されたゲルを図2に示す。これらタンパク質を上記ゲルから単離し、上述したマススペクトロメトリー分析により同定した。
図3Aおよび3Bに、FLAG−Ndr(オカダ酸存在下で)免疫沈降実験から単離されたポリペプチドの代表的なスペクトルを示す。BLAST分析を用いて、これらのポリペプチドをスピンドリンタンパク質の断片と同定した。
図4Aおよび4Bに、FLAG−Ndr(オカダ酸存在下で)免疫沈降実験から単離されたポリペプチドの代表的なスペクトルを示す。BLAST分析を用いて、これらのポリペプチドがEST705582のコーディング配列を含むことを同定した。この新規のタンパク質は、MOB様タンパク質に対する相同性を有する。
【0257】
図5に、EST6593318およびEST5339315のコーディング配列を含むタンパク質の完全長タンパク質配列を示す。当該タンパク質を同定するのに用いられたペプチドを一重下線で、または隣接ペプチドを二重下線で示す。完全長cDNAを、EST6593318の5’末端に特異的なプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いたPCR増幅でクローニングした。予想タンパク質は、分子中央に6個のWD40リピートと、特有なNおよびC末端配列とを含む。
【0258】
図6に、MOB関連タンパク質(EST705582またはEST8922671のコーディング配列を含む)およびスピンドリンのタンパク質配列を示す。タンパク質同定に用いられた5種のペプチドを下線で示した。
図7に、本発明で同定されたMOB関連タンパク質(図中、上部の7配列)と、S. cerevisiaeおよびS. pombeのMOB1タンパク質とを比較したアライメントを示す。
図8は、図7のMOB関連タンパク質の関係を示す系統樹である。
【0259】
GRF2と相互作用することが同定されたタンパク質の概要を表1に示す。GRF2は、様々なタンパク質と相互作用し、例えば、シグナル伝達経路および細胞周期調節(Skb1、NdrおよびPP2C、機能が未知のタンパク質(EST6593318のコーディング配列を有する)、構造タンパク質(ABP−280およびスペクトリン)、RNA結合(hnRNPHおよびKIAA0122)、延長因子(EF1a)、および、アダプタータンパク質と考えられるpIClnに関与するタンパク質が含まれる。
【0260】
pIClnと相互作用することが同定されたタンパク質の概要を表2に示す。PIClnは、様々なタンパク質と相互作用し、例えば、メチルトランスフェラーゼ(Skb1)、タンパク質キナーゼ(Ndr)、機能が未知のタンパク質(EST6593318のコーディング配列を含む)、および、RNA代謝に関与する様々なタンパク質(hnRNPK(ROK)、snRNPタンパク質、タンパク質4.1、KIAA0987、Gar1、gemin4およびSMN)が含まれる。
【0261】
Ndrタンパク質キナーゼと相互作用することが同定されたタンパク質の概要を表3A〜Bに示す。オカダ酸(ホスファターゼ阻害剤)の存在下で、Ndr相互作用タンパク質は、機能が未知のタンパク質(EST6593318のコーディング配列を含む)、数種のMOB関連タンパク質(EST705582のタンパク質のコーディング配列、および、機能未知のタンパク質8922671を含む)、細胞分裂に関与するタンパク質(スピンドリン)、および、シグナル伝達で誘導されたタンパク質(プロラクチン誘導タンパク質またはPIP)を含む(表3A)。不活性Ndrキナーゼを用いた(KI18A Ndrは結合するが、ATPを加水分解できない)を用いた共免疫沈降実験により、Ndrが、数種のシャペロンタンパク質(CDC37、Hsp70、Hsp71およびHsp7c)を含む様々なタンパク質と相互作用することがわかった(表3B)。
【0262】
Skb1メチルトランスフェラーゼと相互作用することが同定されたタンパク質の概要を表4A〜Bに示す。Skb1は、GRF2を共発現する細胞から共免疫沈降される場合、GRF2およびpIClnを含む様々なタンパク質と相互作用し(表4A)、一方でGRF2が共発現されない場合、RACK1および機能が未知のタンパク質(EST6593318のコーディング配列を含む)と相互作用することが示された(表4B)。
PP2Cと相互作用することが同定されたタンパク質の概要を表5に示す。
【0263】
GRF2、pICln、Skb1、NdrおよびPP2C相互作用タンパク質のいくつかの簡単な説明を以下に記す。各相互作用タンパク質を共免疫沈降させることができるベイトタンパク質が記載される。いくつかの場合において、同じ相互作用タンパク質が、複数のベイト(すなわち、2以上のGRF2、pICln、Skb1、NdrおよびPP2C)で共免疫沈降された。同様に、上記ベイトタンパク質は、場合によって、相互作用タンパク質として、他のベイトと共免疫沈降されるようである(すなわち、Skb1は、相互作用タンパク質としてGRF2ベイトと共免疫沈降された)。
【0264】
ABP−280(または、フィラミン1もしくは非筋肉性のフィラミンともいう)は、周辺の細胞質に局在する280kDaのアクチン結合タンパク質である。ABP−280は、そのC末端を介してホモ二量体化され、そのN末端を介してアクチンと結合する。ABP−280はGRF2と共免疫沈降することが示された。
【0265】
α−チューブリンは主要な微小管成分の一つであり、β−チューブリンとの二量体として機能する。α/β−チューブリン二量体は、2モルのGTPと結合するこの二量体は2分子のGTPと結合するが、その一はα−チューブリンの結合部位とは交換不可能である。α−チューブリンは、PP2Cと共免疫沈降することがわかった。
【0266】
CDC37は、約50kDaのタンパク質であり、不安定な腫瘍キナーゼをターゲットとし、それらを分子シャペロンHsp90に向ける。この相互作用は、シグナル伝達経路の確立に重要であると考えられる。CDC37のターゲットとしては、Cdk4、Raflおよびv−srcがある。またCDC37は、細胞の形質転換においてc−mycおよびサイクリンDに協力するようである(Stepanova et al., Mol. Cell Biol. 29:4462−4473(2000))。
【0267】
CDC37は、安定化に関与し、それによりNdrキナーゼの活性を高める可能性がある。CDC37は、キナーゼ不活性KI18A Ndr変異体と結合することがわかった。
EG5は、Skb1−IPとして単離される。これは、二極性の紡錐体形成に必須なキネシン関連モーターである。
EG5に関して、p34cdc2によるリン酸化は、ヒトEg5の紡錐体結合を調節する。
【0268】
延長因子1α(EF−1a)は、タンパク質合成中のアミノアシル−tRNAと80sリボゾームとのGTP依存性結合に関与する。これは、細胞質に局在するセリン/スレオニンリンタンパク質である。EF−1aがPP2Cに結合することがわかった。
【0269】
EST6028549は、機能未知のタンパク質に対応する配列を有するポリペプチドをコードし、ベイトとしてGRF2と共免疫沈降することがわかった。
【0270】
EST6593318は、約42kDaの機能が未知のタンパク質(「タンパク質EST6593318」)に対応する配列を有するポリペプチドをコードする。当該タンパク質は、6個のWD40リピートと、特有のNおよびC末端を含む。WD40リピートは、多様な機能(シグナル伝達とF−ボックス型タンパク質とに関与する機能を含む)を有するタンパク質中で見出された。タンパク質EST6593318は、Skb1と強く相互作用するようであり、これは、Skb1とGRF2との両方でも共免疫沈澱するという事実に基づく。多数の他のタンパク質(例えば、RNA代謝に関与するタンパク質)がpIClnのみと共免疫沈澱し、Skb1およびGRF2反応ではみられなかった。これは、EST6593318でコードされるタンパク質がSkb1のコレギュレーターまたはコファクターである可能性を示す。EST6593318でコードされたタンパク質は、GRF2、pICln、NdrおよびSkb1と共免疫沈澱することがわかった。
【0271】
EST705582は、同定されていないタンパク質に対応する配列を有するポリペプチドをコードし、当該ポリペプチドは、〜30kDaのタンパク質としてSDSゲル上を移動し、3つの異なるバンドとして観察され、これはすなわち翻訳後修飾されたことを示す(「タンパク質EST705582」)。BLAST検索の結果により、このタンパク質と、S. pombeおよびS. cerevisiaeからのMOBタンパク質(細胞周期調節、隔壁形成および細胞質分裂に関与すると考えられる)とは顕著な相同性を有することが示された。酵母において、Ndr関連キナーゼDBF2は、後期有糸分裂中、適切に進行するのに必要であり、MOB1タンパク質に結合し、MOB1タンパク質を介して作用する。MOB1はリンタンパク質であり、その活性は、細胞周期を制御することが示された。タンパク質EST705582は、オカダ酸の存在下で、Ndrタンパク質キナーゼで共免疫沈澱された。ある最近の結果によれば、MOBはNdrキナーゼの基質であることが初めて示された。図19に示すように、GST融合タンパク質として発現された組換えMOBは、活性Ndrにより特異的にリン酸化される。
【0272】
Gar1は、プレrRNAスプライシングに必要な、プレrRNAのシュードウリジル化に関与する核小体のタンパク質である(Bousquet−Antonelli et al., EMBO J. 16:4770−4776 (1997))。Gar1は、RNA結合において補助的な役割を有する2つのグリシン/アルギニン豊富なドメインを含む(Bagni et al., J.Biol.Chem. 273:10868−73 (1998))。これらのドメインは、hnRNPで見出されたのと類似したRGGリピートを有する。また、C末端の先端は配列FRGRGHを含み、当該配列は、メチルトランスフェラーゼによるメチル化の基質(例えばSkb1)となり得る。実際には、RNアーゼ処理酵母抽出物からのGar1は、酵母タンパク質RMT1による非対称なアルギニンジメチル化のインビトロ基質であることがわかっている。Gar1は、Cbf5pタンパク質(シュードウリジンシンターゼタンパク質)と結合することがわかっている。シュードウリジンシンターゼ相同体ジスケリン(dyskerin)の変異により、先天性角化異常症(Heiss et al., Nat. Genet.19:32−38(1998))、骨髄障害に関連する病気および他の疾患を発症することがわかっている。またGar1は、RNAドメインと結合するリボ核タンパク質であるヒトテロメラーゼと結合し、インビボでの染色体安定性および機能に必須であることがわかっている(Dragon et al., Mol. Cell. Biol. 20:3037−3048(2000))。Gar1免疫沈降は、pICln反応においてのみ起こった。
【0273】
Gemin4は、SMN(survival of motor neurons)タンパク質と免疫沈降するタンパク質と同定された。SMNは、snRNPの細胞質の構築およびプレmRNAスプライシングに関与する大型のタンパク質複合体の一部である。Gemin4は、smB、smD1〜3およびsmEと直接相互作用し、細胞質中のUsnRNAと結合する。またGemin4は、gemsおよび核小体に局在し(スプライシング因子と共に)、プレrRNAプロセシングに関与する(Charroux et al., J. Cell Biol. 148:1177−1186 (2000))。Gemin4は、DEADボックス型タンパク質gemin3、推定のATPアーゼ/ヘリカーゼタンパク質と直接相互作用することによって、SMN複合体と結合し、これは、gemin4がgemin3のコファクターである可能性を示す。Gemin4は、既知のタンパク質モチーフ/ドメインを含まないが、グリシン残基の近くの位置に多くのアルギニン残基を含んでおり、これは、メチルトランスフェラーゼに対する可能性のある基質(例えばSkb1)であることを示す。Gemin4は、pIClnと結合するが、GRF2、Ndr、Skb1またはPP2Cとは結合しないことだけがわかった。
【0274】
GRF2は、RasやRacとは異なるドメインおよび活性を有する二官能価のグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)である。GRF2は、2つのプレックトリン相同(PH)ドメインと、DHドメインとを含む。GRF2は、ベイトとしてSkb1と免疫沈降するすることがわかった。
【0275】
hnRNP H1(異種核のリボ核タンパク質H1またはROH1)は、核タンパク質であり、プレmRNAと結合するhnRNP複合体の成分である。hnRNP H1は、ポリRG(Arg/Gly)配列に結合し、3つのRNP/RRM RNA結合モチーフを含むことがわかっている。hnRNP H1は、GRF2およびSkb1と結合することがわかっている。
【0276】
異種核のリボ核タンパク質複合体K(hnRNPKまたはROK)は、〜66kDaのタンパク質であり、シチジン豊富なプレmRNAsに結合し、その成熟mRNAへのプロセシングを促進する。また、hnRNPKは、転写にも関与する可能性がある(Michelotti, et al., Mol. Cell. Biol. 16:2350−2360 (1996))。hnRNPK(および他のhnRNP)は、RNA結合に関与する可能性のあるRGGボックス型モチーフ(アミノ酸Arg−Gly−Glyのリピートで構成される)を含む。hnRNPKは、インビボでメチル化可能であり、また、インビトロでは非対称なアルギニンメチルトランスフェラーゼによりおそらくRGGボックス上でメチル化可能である(Liu, et al., Mol. Cell. Biol. 15:2800−2808(1995))。hnRNPのアルギニンのメチル化は、その核の搬出を促進する可能性がある(遺伝子 & Dev. 12:679−691)。hnRNPKはpIClnとだけ結合した。
【0277】
Hsp90、Hsp71およびHsp7cは全て、熱ショックタンパク質である。Hsp90は、CDC37により方向付けられるように、不安定な腫瘍キナーゼと特異的に結合することが知られている。これらタンパク質は、安定化に関与し、それによりNdrキナーゼの活性を高める可能性がある。Hsp90、Hsp71およびHsp7cは全て、キナーゼ不活性K118A Ndrタンパク質と免疫沈降することがわかった。
【0278】
機能未知のタンパク質8922671は、約30kDaとしてSDSゲル上を泳動し、MOBファミリーのタンパク質と顕著な相同性を有することがわかった。このタンパク質は、オカダ酸の存在下で、Ndrと結合することがわかった。ある最近の研究結果によれば、MOBがNdrキナーゼの基質であることが初めて示された。図19で示すように、GST融合タンパク質として発現した組換えMOBは、活性Ndrにより特異的にリン酸化される。
【0279】
KIAA0122は、機能が未知の亜鉛フィンガータンパク質である。その配列は、ヒトKG−1細胞系からのcDNAクローンから推測された。そのN末端およびC末端の半分はそれぞれRNA結合ドメインを含む(RRM/RNPタイプ)。KIAA0122は、GRF2と結合することがわかった。
【0280】
KIAA0987タンパク質は、ヒト脳cDNAライブラリーからの同定されていない遺伝子のコーディング配列から推測された(Nagase et al., DNA Res. 6:63 70 (1999)。KIAA0987タンパク質は、タンパク質4.1と関連し、それにより類似の機能を有するようである。KIAA0987の免疫沈降は、ベイトタンパク質としてpIClnを用いた場合にのみ達成された。
【0281】
Ndrは、Ser281およびThr444において、カルシウム調節に関する活性と、リン酸化を増加させる活性とを有するセリン/スレオニンキナーゼである。Ndrは、Dbf2(Saccharomyces cerevisiae)、Orb6(Schizosaccharomyces pombe)、Warts/Lats(ショウジョウバエ属)およびCOT−1(アカパンカビ属)キナーゼと相同である。Orb6は、p34(cdc2)有糸分裂のキナーゼを作用させることによって、分裂間期に細胞極性を維持し、有糸分裂を遅らせるのに必要である。Ndrは、HanksおよびQuinnによって定義された12個のタンパク質キナーゼのサブドメイン全て(Hanks and Quinn, Methods Enzymol. 200:38−62 (1991))、核局在シグナル(NLS)として機能し得る塩基性アミノ酸の数種の保存されたクラスター(Millward et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:5022−5026 (1995))を含む。我々の実験により、Ndrは、GRF2、pIClnおよびSkb1と結合することが見出され、Skb1との複合体において機能する可能性が示された。加えて、Ndrがオカダ酸により活性化された場合、Ndrは、MOB様タンパク質と結合することがわかった(表3A)。MOBは活性Ndrキナーゼの基質であることが初めて示された(図19)。予備的な結果によれば、GRF2の存在により、オカダ酸および/またはイオノマイシンで処理された細胞中でNDRキナーゼ活性を高めることができるということがさらに示される(図19)。これは、NdrがGFR2相互作用タンパク質であるという発見と一致する。
【0282】
pIClnはもともと、アフリカツメガエルの卵母細胞において、塩素の導入で誘導される膨潤に関連する塩素チャンネルであると考えられている。ヒトpIClnのアミノ酸配列は、ラット腎臓およびイヌ腎臓上皮の細胞系MDCKから単離された相同体と、それぞれ90.2%および92.7%の同一性を有する。哺乳動物のあいだでpIClnは保存されているが、これまで出芽酵母S. cerevisiaeでは相同体は同定されていない。しかしながら、少なくとも1種のS. pombe相同体(GI:3183396)がPSI BLASTを用いて同定可能である。我々が発見したところによれば、pIClnは、基質に特異的な部分集合を有するSkb1メチルトランスフェラーゼを共に運搬するアダプタータンパク質として作用する可能性がある。RNA代謝に関与するタンパク質は、Skb1によるメチル化に関する可能性のある基質である。pIClnは、GRF2と共発現される場合、GRF2およびSkb1と結合することがわかった。
【0283】
プロラクチン誘導タンパク質(PIP)の発現は、プロラクチンまたはアンドロゲンで誘導され、乳ガンのマーカーとして用いられる(Clark et al., Br. J. Cancer 81:1002−1008(1999))。PIPは、プロラクチンおよび受容体チロシンキナーゼとの間での混線に関与することが示唆されているシグナルペプチド配列をそのN末端に有する。これに一致して、プロラクチンは、いくつかの受容体チロシンキナーゼからのRasシグナル伝達を阻害することが示されている(D’Angelo et al., Mo. Endrocrinol. 13:692−704(1999) and Johnson et al., J. Biol. Chem. 271:21574−21578(1996))。PIPは、オカダ酸の存在下で、Ndrと共免疫沈降することが示された。
【0284】
タンパク質4.1は、少なくとも2種のアイソフォームを有し(アイソフォームAは〜130kDa、および、アイソフォームBは〜84kDa)、これらはいずれもpIClnで免疫沈降する。2種の新規の形態、4.1SVWL1および4.1SVWL2が近年クローニングされた。タンパク質4.1は、最初は、赤血球(核を有さない)における細胞骨格のタンパク質であることが示され、骨格ネットワークを安定化する役割を有すると考えられている。pIClnは、タンパク質4.1のアイソフォームBのC末端と相互作用することが以前に示されている。この相互作用は、塩素チャンネルとしてのpIClnの機能に関与すると考えられている(Tang et al., Blood 92:1442−1447(1998))。しかしながら、近年の研究によれば、タンパク質4.1は、核にも存在し、スプライシングプロセスに関与するタンパク質を強化するスペックルドメインに局在することが示されている(Lallena et al., J. Cell Sci. 111:1963−1971(1998))。タンパク質4.1は、多くのArg残基を含み、そのうちのいくつかは、メチルトランスフェラーゼによるメチル化に関する可能性のある部位(例えばSkb1)であるRGまたはGRの形態である。タンパク質4.1のアイソフォームAおよびBは、いずれもpIClnのみと結合することがわかった。4.1SVWL2を「ベイト」として用いて、4.1SVWL2と相互作用する多くのタンパク質を同定した。それらを「4.1SVWL2−IP」の「4.1SVWL2相互作用タンパク質」と指定し、表6に列挙する。
【0285】
我々は、14−3−3タンパク質の全てのファミリーがタンパク質4.1ベイト4.1SVWL2と相互作用することを初めて示す。タンパク質4.1種は、細胞周期の際に細胞中で空間的に再編成されることがわかっていることから、この研究結果により、4.1SVWL2は、細胞の何らかのシグナル伝達/細胞周期の機能に関与する可能性を示す。タンパク質4.1種は、分裂間期には核質および細胞膜に局在し、有糸分裂時には有糸分裂の紡錐体の形態、細胞質分裂時には中間体の形態である。従って、14−3−3タンパク質は、それらのタンパク質4.1種との結合を介してこれらのプロセスに関与する可能性がある。
【0286】
タンパク質ホスファターゼ2C(PP2C)は、Mn2+またはMg2+依存性のSer/Thrタンパク質ホスファターゼである(Das et al., EMBO J. 15:6798−6809 (1996))。PP2Cは、真核生物における細胞性ストレス応答を調節するのに必須であることがわかっている。またPP2Cは、cdkを脱リン酸化することによって細胞周期調節において機能する可能性がある(Cheng et al., J. Biol. Chem. 275:34744−9)。PP2Cは、GRF2と共免疫沈降することがわかった。
【0287】
RanBP8(GI:5454000)は、Skb1と免疫沈降し、RanGTPアーゼと相互作用することが知られている(Gorlich et al., J. Cell Biol. 138:65−80, 1997)。しかしながら、その機能は未知である。RanGTPアーゼは、有糸分裂の開始の調節、および、有糸分裂の紡錐体形成の誘導に関与する。他のRan結合タンパク質はRanのGTPアーゼ活性を調節するため、RanBP8は類似の機能を有する可能性が考えられる。従って、RanBP8は、有糸分裂の調節にも関与する可能性がある。これはまた、Skb1も、終期の際の有糸分裂のスピンドルポールボディ(SPB)に局在するという我々の予備的な結果と一致し(図17)、Skb1/RanBP8/Ran経路が存在し、RanBP8が有糸分裂の調節におけるSkb1に対する重要なターゲットである可能性を示す。
【0288】
活性化タンパク質キナーゼC1の受容体(RACK1)。活性化の際に、PKCは、可溶性フラクションから細胞粒子画分に転座する。アイソザイム特異的RACKは、活性化の際に、異なるPKCアイソザイムを別の細胞内部位に転座させることに関与することが示唆されている。RACK1は、WD40リピートを含み、β−アドレナリン受容体キナーゼの膜への固定化に関与するGタンパク質のβサブユニットの相同体である。RACK1は、GRF2と結合することがわかった。
【0289】
Skb1は、ミエリン塩基性タンパク質およびヒストンをメチル化するアルギニンメチルトランスフェラーゼである(J. Biol. Chem. 274:31531−31542 (1999))。Skb1は、pIClnアミノ酸配列のC末端の最後の29個のアミノ酸を介してpIClnと相互作用することがわかっている(J. Biol. Chem. 273:10811−10814 (1998);Biochim Biophys Acta 1404(3):321−8 (1998))。Skb1は、GRF2およびpIClnの両方と免疫沈降した。我々の近年の研究結果によれば、S1cb1は、終期の際に細胞の分裂溝に局在することが示される(図17)。Skb1の分裂溝への局在は、有糸分裂の際のそのS. pombe相同体の局在と一致する(Bao et al., J. Biol. Chem.、2001 manuscript C100096200)。
【0290】
またSkb1は、スピンドルポールボディにも局在する可能性がある(図17)。近年の発見の観点によれば、Skb1は、RanBP8(GI:5454000)、機能が未知のRanGTPアーゼ結合タンパク質と共免疫沈澱することが説明されている。上述したように、RanGTPアーゼは、有糸分裂の開始の調節と、有糸分裂の紡錐体形成の誘導とに関与する。他のRan結合タンパク質はRanのGTPアーゼ活性を調節することから、RanBP8が類似の機能を有する可能性が考えられる。従って、RanBP8は、有糸分裂の調節において、Skb1/RanBP8/Ran経路で機能する可能性がある。
【0291】
内在性Skb1は、核スペックルに似た構造で見出された(図18)。Skb1の核局在はpICln、Skb1相互作用タンパク質がsnRNPと免疫沈降するという発見と一致しており、スペックル様の核構造で保存される。またこれはは、pIClnが、Skb1およびその基質のいくつか(例えば、smD1およびsmD3)を共に運搬するアダプタータンパク質として作用するというモデルと一致する。
【0292】
SMN(生存運動ニューロン)タンパク質は細胞質に局在し、そこでコアのsmタンパク質と結合して、snRNP構築に関与する。核において、SMNはスプライシングが必要であり、コイルドボディに結合するgemsに存在する。またSNWは、gemin2、3および4との複合体中に存在し(しかしながら、gemin4およびSMNは直接相互作用しない)、それにより、snRNPの再生またはリサイクルに関与する可能性がある(Charroux et al., J. Cell Biol. 148:1177−1186(2000))。SMNは、棘筋の萎縮を患う患者において頻繁に欠失しているか、または変異している(Lefebvre et al., Cell 80:155−165(1995))。SMNタンパク質は、pIClnのみと結合することがわかった。
【0293】
smタンパク質(核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチド)であるsmD1〜3、smB/B’、smG、smEおよびsmFは、コアsnRNP(核内低分子リボ核タンパク質粒子)のタンパク質成分である。これらは、細胞質中で、UsnRNAと共にsnRNPに組み立てられ、その複合体は、核に戻され、そこでプレmRNAスプライシングが起こる。smタンパク質であるsmD1、smD2、smD3、smB/B’、smEおよびsmGは、pIClnと共免疫沈降することがわかった。smD3、smD1およびsmB/B’は、pIClnと相互作用することがアフィニティークロマトグラフィーを用いて以前に示されている(Mol. Cell. Biol. 19:4113−4120(1999))。smEがpIClnと免疫沈降することはこれまでに示されておらず、標識されたsmD2およびsmEを用いた実験によれば、バックグラウンドに対して弱い結合しか示されていない(Mol. Cell. Biol. 19:4113−4120(1999))。数種のsmタンパク質のC末端は、RGリピートを含む。smD1およびsmD3の上記リピート中のArg残基が、インビボで対称的にジメチル化されることが近年証明された(Brahms, et al., J. Biol. Chem. 275:17122−17129 (2000))。全身性エリテマトーデスの患者は、インビボで、対称的にジメチル化されたsmタンパク質に対する自己抗体を生産する(Brahms, et al., J. Biol. Chem. 275:17122−17129 (2000))。smタンパク質は、pIClnの存在下でのみ免疫沈降することがわかった。smタンパク質を含む複合体をさらに特徴付けるために、smD1およびsmD3を「ベイト」として用いて、「smD1−IP」および「smD3−IP」を同定した。これら2種のスクリーニングで同定されたタンパク質を表7および8にそれぞれ列挙した。
【0294】
スピンドリン(またはSpin)は、約30kDaのタンパク質であり、マウス卵母細胞において、分裂中期と終期との間における紡錐体ミメティックとの結合を増加させることがわかっている(Oh et al., Development 124:493−503 (1997))。スピンドリンは、マウスにおいて、最初の有糸分裂の細胞周期の、減数分裂周期の際と、分裂中期の際とにリン酸化される。リン酸化はSer/Thr残基上で起こり、Mos MAPキナーゼによって少なくとも部分的に調節される。スピンドリンと分裂中期Iの紡錐体との結合が減少し、これはMos−null変異体でみられることから、スピンドリンが紡錐体と結合するのにリン酸化が必要である可能性を示す(Oh et al., Mol. Reprod. Dev. 50:240−249(1998))。スピンドリンは、オカダ酸の存在下で、Ndrと共免疫沈降することがわかった。
【0295】
GI13543922は、新規のsudD様ヒトタンパク質であり、Skb1およびpIClnの両方と結合する(と共免疫沈降する)ことが可能であると同定された。アスペルギルス属のsudDはもともと、bimD6変異体の遺伝子外サプレッサーとして同定された(Anaya et al., Gene 211:323−329, 1998)。BimD6変異は有糸分裂の異常を引き起こし、それにより染色体は紡錘微細管に適切に付着できなくなり、染色体消失の増加を引き起こす。bimD6変異はsudAにより抑制することができるため、BIMDが染色体凝縮に関与する可能性が示唆されており、BIMDはSMCタンパク質をコードし、クロマチン濃縮および分離に関与する。sudAの発現中は、sudDの低温感受性変異が抑制される。またsudDは、染色体凝縮および分離に関与する可能性がある。
【0296】
sudDの相同体は、多くの種(古細菌、酵母(Rio1タンパク質)およびホモサピエンスを含む)に存在するようである。ヒトsudD相同体が以前に同定されているが、これはSkb1およびpIClnとの複合体に関して示したタンパク質とは異なる。sudD様タンパク質のヒト相同体がさらに2種存在し(AF258661およびFLJ11159)、それらと他のsudDファミリータンパク質とのアライメントを図20に示す。
【0297】
これらタンパク質は全て、RIOドメインと称する保存されたドメインを含む。このドメインの機能は報告されていない。しかしながら、psi BLAST検索により、sudDとタンパク質キナーゼとがいくらか相同性を有することが明らかになり、この相同領域は、RIOドメインとオーバーラップする。このようなsudD様タンパク質は、Skb1による有糸分裂の調節に関する重要なターゲットとなり得る。
【0298】
Mob様タンパク質FLJ10788をベイトとして用いた場合、LATS1が相互作用タンパク質として回収された(表9)。LATS1はキナーゼのNdrファミリーの他のメンバーであるため、および、LATS1は腫瘍抑制因子であるため、Mobタンパク質もLATS1および2の基質であるかどうかを観察することは興味深い。有糸分裂/細胞質分裂の際に、LATSおよびNdrがこれらタンパク質をわずかに異なる位置でターゲットとすることが可能である。
【0299】
最終的に、予備的なウェスタンブロットにより、Skb1は哺乳動物PAK種と相互作用することが示されたが、用いられた抗体は哺乳動物PAKアイソフォーム3種全てと交叉反応することが知られているため、PAKの正確な不明確である。Skb1−PAK相互作用は酵母における発見と一致する。我々の知る限りでは、哺乳動物におけるこのような相互作用はこれまでに報告されていない。
【0300】
タンパク質相互作用研究からの結論
アクチン依存性の細胞極性、および、分裂間期の際の細胞分裂に関して調節された制限(constraint)の両方を維持して、細胞分裂周期の有糸分裂期における細胞分裂の開始を導く経路において、哺乳動物NdrおよびSkb1タンパク質に対する分裂酵母の対応物は、RasおよびRac関連タンパク質Cdc42の下流で機能する。
【0301】
従って、ヒト細胞における細胞分裂のレギュレーターとして機能し得るGRF2 を含むタンパク質複合体が同定された。この複合体の破壊または機能的な不活性化は、細胞分裂周期の際の異なる正常な制限に影響を及ぼし、細胞中のアクチン構造の正常な調節を破壊し得る。正常な細胞周期の進行、または、RasまたはRacのGTP結合型を促進する腫瘍化変異の結果として、この複合体の構築、維持、および活性は、RasまたはRacの活性化により影響を受けることがある。一つの可能性として、RasのGTP結合型を促進する腫瘍性変異は、GRF2複合体を破壊し、それによって細胞分裂の際の制限を除去することができる。
【0302】
GRF2は、タンパク質キナーゼNdrおよび候補のメチルトランスフェラーゼSkb1を含むタンパク質複合体に関係する。従って、GRG2複合体は、細胞の形と細胞周期のG2/M移行とを調節する分裂酵母タンパク質と類似したタンパク質を含む(34)。GRF2のように、Ndrはカルシウムイオノフォアによりインビボで活性化され、カルシウム結合タンパク質のカルモジュリン/S100ファミリーのタンパク質と結合する。
【0303】
GRF2およびNdrを含むタンパク質複合体は、細胞周期の際の不適切な細胞分裂および複合体の破壊(正常には細胞分裂に必要な現象として起こるが、不適切な細胞分裂や増殖の原因となる)を防ぐように機能し得ることが考えられる。Rasの腫瘍性の変異により細胞の形質転換および腫瘍形成が促進されるが、これは、正常には細胞分裂を制限し、細胞の形を制御するように機能するタンパク質複合体が破壊されることによる。
【0304】
このタンパク質複合体に影響を及ぼす薬剤が、細胞分裂に影響を及ぼすことがある。例えば、GRF2および関連タンパク質GRF1(またはRas−GRFとして知られる)は、非分裂性の、脳で最終分化した神経細胞で大量に発現される。本明細書で説明されたGRF2複合体は、GRF2発現細胞の増殖を防ぐように機能し得る。従って、この複合体を阻害することによって、脳および他の神経組織における神経成長および組織再生を促進することができる。GRF2(ならびに、NdrおよびSkb1)は多くの他の細胞組織で発現されるため、GRF2複合体をターゲットとする薬剤はこれら組織の増殖を刺激することができる。GRF2複合体成分の活性化は有糸分裂を阻害するか、または、細胞の形を変え、それによって細胞増殖を制限または阻害する。
【0305】
有糸分裂の阻害剤として、および、細胞の形のレギュレーターとしてのGRF2複合体の活性は、ヒトの発ガン現象で必要な工程がこの複合体の不活性化であるという示唆と類似している。ヒトRas遺伝子のいわゆる活性化変異により、Rasタンパク質をGTPに結合させ、GRF2複合体の構築、維持および/または機能を減じ、それによって腫瘍形成を促進させる。
【0306】
ミエリン塩基性タンパク質(MBP)は、アルギニン残基で対称的にジメチル化されていることがわかっている。ほとんどの同定されたメチルトランスフェラーゼは、アルギニンに対する非対称的なジメチル化活性を有する。Skb1は、基質としてミエリン塩基性タンパク質を用いることのできる唯一のクローン化アルギニンメチルトランスフェラーゼである。Skb1の触媒ドメインは、最低限、クローン化アルギニンメチルトランスフェラーゼでよく保存されている(J. Biol. Chem. 274:31531−31542(1999))。従って、Skb1は、対称的なジメチルアルギニンを形成することができるII型のアルギニンメチルトランスフェラーゼである可能性がある。
【0307】
pIClnは、その基質の特異的な部分集合を有するSkb1メチルトランスフェラーゼを共に運搬するアダプタータンパク質としての役割を有する可能性がある。上記で列挙したRNA代謝タンパク質、または、それに強く結合するタンパク質は、Skb1によるメチル化の基質である可能性がある。smタンパク質D1およびD3はSkb1の基質であることが予測され、なぜなら、それらはインビボでそのC末端で見出されたRGリピート上で対称的にジメチル化されることがわかっているためである(J. Biol. Chem. 275:17122−17129(2000))。これらタンパク質のメチル化は、それらとsnRNPの他の成分との相互作用、または、それらと核輸送担体との相互作用に影響を及ぼす可能性がある。RNA代謝に関与する多くのタンパク質がpIClnと免疫沈降するという発見により、Skb1が、RNA代謝の調節(例えば、mRNAスプライシング、プレrRNA代謝、場合によってテロメラーゼ機能を含む)に関する全体的な経路に関与する可能性が示される。
【0308】
また、hnRNPKおよびGar1も、それらとpIClnとの結合、および、そのアミノ酸配列中にRGが豊富なドメインが存在することに基づいて、Skb1の基質であることが予測される。また、タンパク質4.1、KIAA0987、gemin4およびSMNも、それらが大規模なRGリピートを含まないにも関わらず、Skb1の基質である可能性がある。この予測の裏付けとして、ミエリン塩基性タンパク質が、これは1つのアルギニン残基しか含まないが、メチルトランスフェラーゼの基質である、ということが近年示された(Int. J. Biochem. Cell Biol. 29:743−51(1997))。
【0309】
Skb1の酵母相同体(S. cerevisiaeについてはMcMillan et al., Moll. Cell. Biol. 19:6929−6939 (1999);S. PombeについてはGilbreth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14781−14786(1998))が、細胞周期調節に関与することが示された。S. cerevisiaeは、pICln相同体を有さず、また、そのsmタンパク質のC末端にRGリピートが存在しないようである。しかしながら、pIClnは、アフリカツメガエルからヒトにかけて保存されている。これに関する一つの考えられる理由としては、S. cerevisiae において、RNAスプライシングの複雑さが他の真核生物に比べて低減されることがある。S. pombeではスプライシングはより複雑であるため、S. pombeはpICln相同体を有するはずと予測され得る。PSI BLASTプログラムを用いて、我々は、S. pombeからpIClnに相同性を有する機能未知のタンパク質を見出した。加えて、S. pombeからのsmD1は、そのC末端に多数のRGリピートを有し、一方で、smD3は、2つの可能性のあるアルギニンメチル化部位を有する。これらの観察結果により、pICln相同体は、S. pombeにおいて、ヒトの場合と類似の機能を提供し得ることが示される。
【0310】
実施例2:マススペクトロメトリー分析によるpICln相互作用タンパク質の同定
タンパク質相互作用の研究により、ヒトの生物学に対して広い洞察が提供されてきた。タンパク質−タンパク質(およびタンパク質−低分子)相互作用は、細胞の成長および発生、構造、操作、複製、および選択的除去を制御する代謝およびシグナル伝達経路を構築するため、それらは重要である。タンパク質の役割は、それと他のタンパク質との相互作用に反映される(35)。従って、複数のタンパク質の複合体の同定および逆重畳積分は、タンパク質機能および細胞調節をよりよく理解するための方法である。タンパク質−タンパク質相互作用におけるエラーによりヒトの病気を示すことができるため(例えば、(36)参照)、タンパク質−タンパク質相互作用の系統的な定義は、治療介入のための新規のターゲットを同定するための多大な発展性を秘めている。
【0311】
タンパク質複合体を捕獲するためにタンパク質−タンパク質相互作用の高親和性特徴を開発する方法と、超高感度のタンパク質同定技術の適用とを組み合わせることによって、タンパク質の機能を測定することができる。数年に渡り、マススペクトロメトリー(MS)に基づく様々な技術が、タンパク質分析分野で優位を占めていた。その理由の一つとして、マススペクトロメトリーは、タンパク質の明瞭な同定、および、ペプチドおよびタンパク質の質量の正確な測定に関して、他の技術を超える莫大な利益を提供することが挙げられる。
【0312】
我々は、親和性に基づくタンパク質複合体精製方法を示し、低いフェムトモル量のタンパク質の同定に適用できるようなマススペクトロメトリーの原理を再検討する。特に、我々は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質を同定するために、MS、DNAおよびタンパク質データベースを利用する。
【0313】
タンパク質複合体のワンステップバッチによる吸着
免疫沈降によるタンパク質単離技術、およびそのタンパク質複合体回収の利点は、よく確立されている(37)。この方法は、ワンステップバッチによる吸着である。この方法による相互作用タンパク質の回収率は、その結合定数(より特定には、結合と解離との割合)および存在度(すなわち、細胞あたりのコピー数);細胞抽出物中の溶解性および濃度;および、安定性の関数であり、ここで上記安定性とは、実験条件下での相互作用タンパク質の内因性の安定性、および、抽出物中での酵素による攻撃(それらを破壊するかまたはそれらの相互作用を破壊する)に対するそれらの耐性の両方を意味する。
【0314】
免疫複合体からの結合タンパク質の溶出は、遊離ペプチドを用いてベイトタンパク質およびベイト関連タンパク質を置換することによってなされ、ただし、抗体または固定マトリックスに非特異的に吸着したタンパク質、またあるいは、不溶性形態で回収されたタンパク質は溶出させないことにより、この方法に高度の特異性をもたらす。捕獲されたタンパク質複合体を特異的に溶出させるための代替法は、部位特異的プロテアーゼを用いて、エピトープタグに近接するように操作された部位を切断することである。この特異的な溶出工程においては、様々なタンパク質相互作用に寛容であるように設定された細胞抽出物調製条件、および、免疫沈降が補足される。この方法は、前から存在する比較的強く相互作用する(すなわち、サブマイクロモルのKd)タンパク質複合体を回収するのに好都合である。この方法は、分析の際に顕著な「ノイズ」を与えてしまう大量の非特異的相互作用タンパク質の回収には不適切である点において有利であるが、少量で存在する(すなわち、細胞あたり数千コピー未満)および/またはマイクロモル〜ミリモル範囲の結合定数を有する相互作用タンパク質を回収するその能力を明らかに制限する。
【0315】
この免疫親和性法の適用は、クロマトグラフィー工程に組み入れることができ、その際、細胞抽出物は固定化抗体充填カラムを通過する。この方法により、少量しか存在しない抗原(例えば、エピトープでタグを付した「ベイト」タンパク質)および関連タンパク質の回収を高めることができる。
【0316】
エピトープでタグを付したタンパク質複合体:FLAG−PICLnおよび関連タンパク質の細胞トランスフェクションおよび免疫沈降
この実験において、タンパク質配列DYKDDDDKを有するFLAGエピトープ(Sigma)を「ベイト」タンパク質pICLnのアミノ末端に導入した。pICLnは、広範に発現される26kDaであり、ホモサピエンスからアフリカツメガエルに至る種で保存されている。pICLnの正確な機能はまだ研究中であるが、初めは塩素チャンネルとして機能することが推測され、より最近にはスプライセオソームの調節に関与することがわかっている(38、39)。
【0317】
ヒト胎児の腎臓細胞(HEK293T)を本質的に上述したような方法を用いて細胞をトランスフェクションした2日後、その溶解物から免疫沈降によりタグを付されたpICLnを回収した(12)。HEK293細胞は効率的にトランスフェクトされる(40)。293T変異株は、SV40ウイルスのラージT抗原を発現し、トランスフェクトされたプラスミドを増幅してプラスミドがコードするcDNAの生産をさらに高めることができる。リン酸カルシウム/DNA沈殿物の形態で10μgのプラスミドDNA(pCDNA3−Flag−pICLn)を加えることによって、約2×107個の細胞がトランスフェクトされた(41)。脂質が仲介するDNAトランスフェクション法を用いても同等の結果が得られた(41)。トランスフェクトされた細胞を、溶解バッファー(1ml)[20mMのトリス−HCl(pH7.5)、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1%NP−40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、10μg/mlのアプロチニン、0.2mMのAEBSF(CalBiochem)]を加えることにより溶解し、20,000×gで30分間遠心分離することによって透明にした。細胞溶解物およびタンパク質を0〜4℃の間の温度に維持した。架橋アガロースビーズ(M2、Sigma)に共有結合した抗FLAGモノクローナル抗体(5μg)を加えることにより、その澄んだ溶解物を免疫沈降させた。その混合物を穏やかに倒置することにより60分間攪拌した。不溶性分画と結合した免疫複合体を遠心分離によって(1000×g、2分間)回収し、溶解バッファーへの再懸濁を3サイクル行うことによって洗浄し、続いて、上述したように遠心分離した。免疫複合体を、250μlの50mM重炭酸アンモニウム(使用直前に調製された)(400μMのFLAGペプチドを含む)に再懸濁することによって、ビーズから溶出した。30分間インキュベートした後、ビーズを遠心分離によって取り除き、FLAGペプチドと溶出したタンパク質とを含む上清を凍結乾燥した。
【0318】
タンパク質を標準的な一次元SDS−PAGE法により解析し、製造者の推奨法に従ってコロイド状のクーマシーブルー染色液(GelCode Blue, Pierce)で染色した。SDS−PAGEのためのサンプル調製中に、混入タンパク質(例えばヒト皮膚から誘導されたケラチン)が入らないように注意した。染色ゲルによれば、ベイトタンパク質pICLnに加えて数種のタンパク質が見出された(図9)。これらタンパク質のいくつかは他の方法ですでに同定されているが、同定されていないものもあった。例えば、タンパク質4.1、Skb1、IBP42、smB/B′、およびsmD3は、アフィニティークロマトグラフィーにより、または、酵母2ハイブリッド系により、相互作用することが示された(39、42、43)。それに比べ、smEおよびsmGについては、pIClnとの複合体に関してこれまで示されていなかった。
これらタンパク質を同定するのに用いられた解析方法、および代替法を以下に説明する。
【0319】
マススペクトロメトリー用のサンプル調製
回収された免疫沈降タンパク質のMSによる同定を促進するために、1以上のタンパク質種を含む染色バンドをポリアクリルアミドゲルから切り出し、インサイチュでのトリプシン処理によりポリペプチドに分解し、およびMS分析に適した溶液に移し、MS分析に適するように濃縮した(図10で説明される)。タンパク質をゲル内で処理する技術は、標準化したプロトコールに改良されている。いわゆる「ゲル内消化」法は、ゲル片に含まれたタンパク質を酵素的に断片化し、生じたペプチドを抽出することに関して開発されている(44)。配列解析グレードに改変されたトリプシンは、タンパク質のハイスループット同定に選択された酵素である。一般的なゲル内消化プロトコールの概要を図11に示す。この方法において、興味のあるバンドをゲルから切り出し、還元およびアルキル化してシステイン架橋を壊し、システイン架橋が再形成されるのを防いだ。対応する緩衝液で平衡化した後、そのゲル片をトリプシン溶液で膨潤させ、酵素をゲル中に入り込ませた。一般的に一晩、37℃で消化を行った。生じたペプチドを抽出物し、MS分析用に調製した。
【0320】
タンパク質同定のためのマススペクトロメーター
一般的に、マススペクトロメーターは、少なくとも3つの部品、すなわちイオン化装置、質量分離装置、および検出器で構成される。マススペクトロメトリーは非常に強力な分離技術であるが、気相で帯電する分子を分離することしかできないことを理解することが重要である。その上、マススペクトロメーターは、1度に正または負に帯電した分析物のどちらかしか分離できない。本来、ほとんどのマススペクトロメーターは分子のイオン化を行わないため、イオン化という用語は紛らわしい。それよりも、イオン化という用語は、分析物を気相へ移動させ、同時に、その電荷を維持し、および/または、サンプルの環境からの電荷を一般的にプロトンの形態で捉えることに関する。ペプチドおよびタンパク質の研究において、主として、2つのサンプルイオン化技術、すなわちマトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)(45〜47)およびエレクトロスプレーイオン化(ESI)(48)が優位を占めている。
【0321】
MALDIマススペクトロメーター、ペプチドおよびタンパク質分析
MALDIイオン化は、興味のあるサンプル、この場合ペプチドおよびタンパク質を酸性化マトリックスを用いて共結晶化する技術である(49)。上記マトリックスは低分子であり、特定の波長、一般的には紫外線(UV)の範囲で吸収し、吸収エネルギーを熱として放散する。エネルギーをマトリックスに迅速に(数nsで)運ぶために、一般的にパルスレーザー光線が用いられる。このような迅速なエネルギー運搬により、マトリックスは迅速にその表面から分離し、気相中にマトリックスのプリューム(plume)と、再結晶化された分析物とが生成する。脱離プロセス中、または、マトリックス分子と相互作用することにより分子のガスプリュームを導入した後に、分析物が変化を受けているかどうかははっきりしない。しかしながら、最終結果として、気相に存在する帯電した分析物の小さい空洞が得られる。これまで、MALDIは、主に、飛行時間型(TOF)マススペクトロメーターと並列して連結されている。飛行時間型マススペクトロメーターの機能は、分析物が固定された経路の長さ(TOFチューブまたはチャンバー)を通過して飛行するのにかかる時間を測定することである。従って、プリューム中に存在する帯電した分析物は、適切なタイムディレイ後にTOFチューブに移送される。分析物をTOFチューブに動かすために、MALDIプレートに高圧が適用して、プレートとTOFチャンバーの入り口との間に強い電場を発生させる。より小さい分析物は、チャンバー入り口により大きい分析物より迅速に到達する(すなわち、一定の運動エネルギーを適用して、分析物の異なる速度が得られる)。飛行すると、検出器に向かって移動する間に、分析物は無電界領域に存在し、チューブに沿って分離する。再び、少ない質量の分析物はチューブに沿ってより速く移動し、より大きい質量の分析物より前に検出器に到達する。検出器は、レーザーショットとタイムディレイとを順に有し、ペプチドおよびタンパク質イオンが時間中に到達する度に、それらを測定する。既知の質量および電荷を有する標準物質を用いて質量範囲を測定することによって、所定のイオンの飛行時間を質量に変換することができる。最終結果として、イオン(タンパク質またはポリペプチド)質量に対して観察された強度を比較したスペクトルが得られる。
【0322】
MALDI−TOF MSは、最新のマススペクトロメーターを用いて簡単に実行できる。一般的に、興味のあるサンプル(この場合ペプチドまたはタンパク質)とマトリックス混合物とを混合し(図12参照)、続いて、研磨されたステンレス鋼プレート(MALDIプレート)上にスポットする。市販のMALDIプレートは、1プレートあたり96サンプルを置くことができる。次に、MALDIプレートをMALDIマススペクトロメーターの減圧室に挿入する。次に、パルスレーザーを活性化し、上述したように飛行時間の獲得を始める。次に、質量を含むMSスペクトルを集め、ペプチド/タンパク質の電荷比を得る。MALDIによりイオン化された分子の電荷は、通常1である。
【0323】
近年、MALDIイオンソース技術も、ハイブリッド直交型マススペクトロメーターと連結される。この設計において、MALDIイオン化法は、本質的には上述したとおりである(ただしわずかな変更を含む)。しかしながら、TOF検出器は直交型マススペクトロメーター(例えば、PE−Sciex社製のQ−Star)で置き換えられ、直交型マススペクトロメーターは、四重極、それに続く衝突セル、およびパルス垂直型TOF MSから構成される。ハイブリッド機器(MALDI−Q−Star)は、ペプチド混合物に含まれるペプチドの質量を高解像度でマッピングでき、および、衝突誘導解離による選択されたペプチドの効率的な断片化を選択できるという利点を有する。これらの断片化パターンは、ペプチドのアミノ酸配列に関する情報を含む。
【0324】
ESIマススペクトロメーター、ペプチドおよびタンパク質分析
また、タンパク質およびペプチド混合物をマススペクトロメーターに導入するために、エレクトロスプレーイオン化も広く利用されている。エレクトロスプレーイオン化(ESI)(48)は、大気圧で分析物を液相から気相へ移すことができる。イオン化プロセスは、小さいチューブのチップとマススペクトロメーターの入り口との間に電場を印加することによって達成される。その電場によりチップの先端に帯電液が誘導され、電荷/表面の比を最小化するテイラーコーンと呼ばれるコーンが形成される。コーン先端から液滴を遊離させ、マススペクトロメーターの入り口に送る。遊離した液滴から溶媒を蒸発させ、液滴をより小さい液滴にフラグメンテーションするプロセスを繰り返し行う。このプロセスにより、多数の液滴は消失するサイズになり、溶媒がなくなって帯電した分析物が気相に存在するようになる。さらに、液滴が収縮すると同時に、pHが減少し、分析物のプロトン化が起こる。従って、トリプシン処理タンパク質を扱う場合、ESIにより多価の分析物が共通して得られる。
【0325】
一般的に、エレクトロスプレーイオン化は、酸連四重極、イオントラップ、またはハイブリッド四重極−時間飛行型マススペクトロメーター((50)で述べられる)と連結させて用いられる。エレクトロスプレーイオン化は、分離技術(例えばHPLC、LCおよびCE)との組み合わせが容易である点で、MALDIに対して相当な利点がある。またESIは、サンプルの連続注入に用いることができる。さらに、トリプシン消化物から多価ペプチドが得られる傾向により、衝突誘導解離と関連して、従来のMALDI−TOFまたはハイブリッドMALDI−Q−Star装置のいずれかで達成されたスペクトルより増強されたMS/MSスペクトルを発生させることができる。
【0326】
エレクトロスプレーイオン化およびMALDI−Q−Star装置はいずれも、衝突誘起解離によって、選択されたペプチドのアミノ酸配列に関するフラグメンテーションパターン(MS/MSスペクトル)を発生させる(図10)。一般的に、MS/MSスペクトルの発生は、2つの独立した実験を必要とする。第一の通過において、ペプチド混合物(トリプシン消化物)は、マススペクトロメーターによる質量−電荷(m/z)比にしたがって分離され、最も強いペプチドのピークのリストが立証される。第二の通過において(図13に示す)、特定のm/z種(第一の通過分析で同定された)、おそらくは特有のペプチドイオンのみをマススペクトロメーターに入らせるように、装置を調節する。これらのイオンは衝突セルに向けられ、その運動エネルギーが増加する。衝突セル中で、そのイオンと十分な運動エネルギーを有する不活性ガス分子とが衝突して、ペプチド結合が破壊される。このプロセスは衝突誘起解離、CIDと呼ばれ、同じ「親」イオンから誘導された帯電した断片および中性の断片の両方が生じる。最終的に、新しく生じた帯電した断片は、そのm/zに従ってマススペクトロメーターで分離され、MS/MSスペクトルを得る。適切な衝突エネルギーを印加することによって、主としてペプチド結合で断片化が起こり、断片のラダーが得られる。特定のピーク間の質量の差が1つのアミノ酸の損失に相当する。次に、連続する質量間での質量差を特定のイオンタイプ(すなわち、yまたはb系のイオン;図13を参照)に関して測定してラダー状に並べることによって、ペプチド配列を再構成することができる。
【0327】
一般的に、ペプチド質量はMALDI−TOFまたはMALDI−Q−Starマススペクトロメーターを用いれば低いppm(百万分率)まで正確に測定される。トリプシン消化で観察されたペプチド質量の集合は、ペプチド質量フィンガープリンテイングとよく称呼される方法でタンパク質/DNAデータベースの検索に用いられ得る(51−53)(図14)。この方法において、データベースにエントリーされたタンパク質は、それらの予測されたトリプシン消化パターンに適合するペプチド質量数に従って階級付けされることができる。市販のソフトウェアは、データベースのサイズ、ペプチドに適合する番号、および異なるペプチドに基づいたスコア付けの方法を提供するものである。観察されたペプチド数、測定の正確さ、特定の種のゲノムの大きさに従って、明瞭に同定することができる。
【0328】
MS/MSスペクトルは、タンパク質同定に用いることができる情報の第二のセットである。MS/MSスペクトルは、特定のペプチドのアミノ酸配列に関する断片化パターンを含む。一般的に、MS/MSスペクトル分析はかなり集約的である。これらのスペクトルの解釈に用いられる方法は、必要な使用者の介入のレベルに従って3つのサブグループに分類することができる。
【0329】
第一のサブグループにおいては、スペクトルの解釈は必要ではない。スペクトルに含まれる情報は、データベースに含まれるタンパク質/DNA配列情報と直接関係づけられる。この特定の作業のために、様々なアルゴリズムが開発されている。これらのアルゴリズムにより、タンパク質およびDNAデータベースに対して自動的に未解釈のMS/MSスペクトルを検索し、そのいくつかは無料で利用でき(非営利団体のもの)、ウェブ上でアクセス可能である。Matrix SciencesのMascot(www.matrixscience.com)、およびUCSFのProteinProspector(http://prospector.ucsf.edu)が最も一般的に用いられるウェブベースのMS/MS検索エンジンである。タンパク質同定は、一般的に、同じタンパク質に適合するペプチドの数により明確である。普及している他のアルゴリズムとしては、「Sequest」がある(54〜56)。提示されたいずれのMS/MSスペクトルに関して、このアルゴリズムは、上位500個の等重のペプチドをタンパク質/DNAデータベースから検索し、対応する予想スペクトルが得られる(図15)。高速フーリエ変換を用いて頻度ドメインで多重化させることによって、予想スペクトルを迅速に測定スペクトルに適合させる。次に、相関パラメーター(予測スペクトルと測定スペクトルとの間の適合のクオリティーを示す)を推測する。高い相互相関は、測定スペクトルとの高い適合を示す。このアルゴリズムを用いてわずか1種のペプチドをタンパク質同定したとしても、多くのペプチドがデータベース中で同じ登録物にマッチするため、タンパク質の由来の明瞭な同定をよく達成することができる。Sequestアルゴリズムは、集中的に計算するので、ハイスループットに対してデマンドがデュアルCPUサーバーをすぐに麻痺させることがある。本質的にSequestが遅いのは、それが最高にマッチする500個の等重のペプチドを見出そうとするためである。このリストをコンパイルするために繰り返しスキャンされるデータベースが大規模であればあるほど、この機能にかかる時間は長くなる。ソフトウェアの改良バージョン(Turbo−Sequestという)は、データベースを前処理して整えるため、検索時間が大幅に改良される。
【0330】
第二のサブグループにおける方法は全て、MS/MSスペクトルの部分的な解釈を行うため、人間の介入が必要である。有力な方法は、しばしば「配列タグ」と呼ばれるが(57〜59)(図16)、MS/MSスペクトルにおける数個の特定の断片間の質量間隔を読み取り、ペプチド配列の短い区間(タグ)を得ることからなる。このタグと残基の質量情報とを用いて、等重のペプチドに関してタンパク質データベースから得られた配列と、計算質量とを比較し、ペプチドの由来を確認することができる。それぞれのMS/MSスペクトルは、タグの作製、それに続くデータベース検索が必要である。多くのペプチドが同じタンパク質にマッチすることによって、タンパク質の明瞭な同定が確立される。数年に渡り、配列タグを用いてデータベース検索するために、このテーマに関する様々なバリエーションが開発されてきた。大規模プロテオミクスに関する努力における「配列タグ」法の主な制約は、MS/MSスペクトルの必要な部分解釈を手作業で行うために必要とされる労力と専門知識である。この問題を解決するために、配列タグを自動的に作製する試みが行われている。
【0331】
最後のサブグループは、タンパク質のデノボ配列解析(60、61)と呼ばれ、これはしばしば適合情報がデータベースで得られない場合の最後の方策として用いられ、MS/MSスペクトルのクオリティーは良好である。ペプチドのMS/MSスペクトルはラダー型の情報を含み、これは、原理的にはそのアミノ酸配列を示す。経験豊富なマススペクトロメトリー技師は、抽出物CIDスペクトルからペプチド配列を手作業で抽出することができる(デノボ配列解析)。
【0332】
研究中のデータのクオリティーおよび種の複雑さによって、ペプチドMS/MSスペクトルとタンパク質配列登録物との間で一つの確信的な適合があれば、タンパク質またはタンパク質ファミリーを同定するのに十分である。低い適合度および/または部分的な適用範囲のデータベースを扱う場合、および、SNPデータベースにアクセスするためには、同定されたペプチドがタンパク質に対して特有でない場合、明瞭な同定に必要な配列の適用範囲は、相同タンパク質に対して増加する。同じタンパク質に対するマッチする続いて得られるペプチドMS/MSはいずれも、さらに同定の信頼度を増すことは明らかである。
【0333】
これらMSに基づく方法それぞれの最終結果により、分析用に提示されたタンパク質または新規のタンパク質の部分アミノ酸配列の同一性がもたらされる。
【0334】
結果
ペプチド混合物のMS分析により、ペプチドの質量(MSスキャン)、それらのアミノ酸配列(MS/MSスキャン)、および、場合によって翻訳後修飾(例えばリン酸基)の存在に関する情報を提供することができる。
【0335】
本明細書で説明した分析方法は、タンパク質混合物に寛容であり、電気泳動におけるタンパク質の共移動はMS分析により独立して同定される。本研究で説明された実施例において、タンパク質smGは、smEに関し、smEを含む同じゲル断片で同定された(MSおよびMS/MSデータは示さず)。本明細書で報告した特定の発見は、タンパク質pIClnがスプライセオソーム機構と直接相互作用することによってRNAプロセシングの調節に関与するという示唆と一致する。興味深いことに、データによればpICLn様々なタンパク質−タンパク質相互作用に関与することが示されているが、簡単に認識できるタンパク質−タンパク質相互作用ドメインは全く含んでいない。我々は、pICLnは新規のタンパク質相互作用ドメインおよび/または結合部位を含む可能性がある、と結論付ける。
【0336】
この情報で概説されたワンステップの親和性による精製法の魅力的な活性の特徴は、細胞中に存在するタンパク質複合体を捕獲するように設計されていることである。可能性のある制限は、異常発現のレベルが「正常な」レベルを超過する、および、293細胞の細胞環境がベイトタンパク質に対する生理学的な結合パートナーを供与しない、ということである。タグの位置がタンパク質機能を妨害する可能性がある。これは、2以上の親和性タグを用いて、それを興味のあるタンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端両方に適用することによって、部分的に処理される。この方法のバリエーションとして、生理学的なレベルのベイトタンパク質を発現する安定な細胞系をつくること、または、野生型タンパク質に対して向けられた抗体を用いて内在性ベイトおよびベイト関連タンパク質を捕獲することがある。様々な関連する細胞型および細胞状態から内在性タンパク質複合体を捕獲する能力は、プロテオミクスにおける挑戦であり続ける。
【0337】
タンパク質−タンパク質相互作用を測定するための酵母2−ハイブリッド法は広範囲の二元的なタンパク質親和性に適しているが、その一方で、誤った陽性結果、すなわち、相互作用するタンパク質ペアを同定するが、必ずしもインビボで結合するとは限らない結果が発生しやすい。ワンステップの親和性による捕獲方法は、いくつもの弱い相互作用の付加的な効果により安定化された複数のタンパク質複合体を精製する可能性がある。この方法の考えられる制限は、初期データがタンパク質複合体における接点の個々のポイントを示していないことである。これは、相互作用を検証する必要性を強調する。タンパク質相互作用を検証する一つのメカニズムは、疑わしい複合体の各メンバー上にエピトープタグを順に置くことによって、複合体を通して「検証する」ことである。これは、相互作用を検証することに役立ち、数種のタンパク質で構成される複合体の二元的な相互作用を逆重畳積分するための情報を提供する。
【0338】
【表1】
【0339】
【表2】
【0340】
【表3】
【0341】
【表4】
【0342】
【表5】
【0343】
【表6】
【0344】
【表7】
【0345】
【表8】
【0346】
【表9】
【0347】
【表10】
【0348】
【表11】
【0349】
【表12】
【0350】
【表13】
【0351】
【表14】
【0352】
【表15】
【0353】
【表16】
【0354】
【表17】
【0355】
【表18】
【0356】
【表19】
【0357】
【表20】
【0358】
対等物
詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、これらは単に解説のためだけに提供されることを理解すべきであり、なぜなら、本明細書の詳細な説明から、本発明の本質および範囲内での様々な変化および改変が当業者には明白であるためである。
上述で補足説明された参考文献の全文を以下に報告するが、これらは参照することにより本明細書に含める。
【0359】
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【図面の簡単な説明】
【図1A】
Ras−GRF2の機能ドメインを示す。
【図1B】
分裂酵母において既知のGRF2経路を示す。
【図1C】
NdrおよびSkb1の結合を示すと仮定されたGRF2複合体を示す。
【図2】
ヒト細胞から単離されたGRF2結合パートナーのゲル分離であり、GRF2結合パートナーのゲル上の位置を示す。
【図3A】
FLAG−Ndr(オカダ酸存在下で)免疫沈降実験から単離されるポリペプチドの代表的なスペクトルである。BLAST分析を用いて、これらのポリペプチドをスピンドリンタンパク質の断片と同定した。
【図3B】
FLAG−Ndr(オカダ酸存在下で)免疫沈降実験から単離されるポリペプチドの代表的なスペクトルである。BLAST分析を用いて、これらのポリペプチドをスピンドリンタンパク質の断片と同定した。
【図4A】
FLAG−Ndr(オカダ酸存在下で)免疫沈降実験から単離されるポリペプチドの代表的なスペクトルである。BLAST分析を用いて、これらのポリペプチドがEST705582のコーディング配列を含むことを同定した。この新規のタンパク質は、MOB様タンパク質に対する相同性を有する。
【図4B】
FLAG−Ndr(オカダ酸存在下で)免疫沈降実験から単離されるポリペプチドの代表的なスペクトルである。BLAST分析を用いて、これらのポリペプチドがEST705582のコーディング配列を含むことを同定した。この新規のタンパク質は、MOB様タンパク質に対する相同性を有する。
【図5】
EST6593318およびEST5339315のコーディング配列を含むタンパク質の完全長タンパク質配列である。当該タンパク質を同定するのに用いられたペプチドを一重下線、または隣接ペプチドを二重下線で示す。その完全長cDNAを、EST6593318の5’末端とオリゴdTプライマーとの特異的プライマーを用いたPCR増幅によりクローニングした。予想タンパク質は、分子中央に6個のWD40リピートと、特有のNおよびC末端配列とを含む。
【図6】
MOB関連タンパク質(EST705582またはEST8922671のコーディング配列を含む)およびスピンドリンのタンパク質配列である。タンパク質同定に用いられたペプチドを下線で示す。
【図7A】
本発明で同定されたMOB関連タンパク質(図中、上の7配列)と、S. cerevisiaeおよびS. pombeからのMOB1タンパク質とを比較したアライメントである。
【図7B】
図7Aのアライメントの続きである。
【図7C】
図7Aのアライメントの続きである。
【図8】
図7のMOB関連タンパク質の関係を示す系統樹である。
【図9】
Flag−pIClnおよび関連タンパク質の免疫沈降である。細胞溶解物を抗FLAGアガロースで免疫沈降させ、結合タンパク質をFLAGペプチドで溶出させた。溶出したタンパク質を4〜15%グラージェントSDSゲルで分離し、クーマシーブルーで染色した。レーン1は、HEK293T細胞溶解物である。レーン2は、FLAG−pIClnを発現するHEK293T細胞の溶解物である。タンパク質分子量マーカーの分子量を示す(M.W.)。マススペクトロメトリーで同定されたタンパク質の部分集合を標識する。本明細書で説明されたMSおよびMS/MS分析の結果として、smEおよびsmGを含むことがわかった染色されたタンパク質のバンドを矢印で示す。
【図10】
タンパク質消化物のMALDI−TOF分析の概略図である。上述したように、興味のある切り出しバンドを消化し、生成したペプチドを抽出する。そのペプチド混合物を、マトリックス溶液(本明細書中で説明された)と共にMALDIプレート上に置く。液体を乾燥させた後、そのプレートをMALDI−TOF装置の減圧室に置く。そのサンプルを気相に迅速に移送し、スポット上にレーザー光線を当てることによってTOF装置で分析する。消化物に含まれていたペプチドの質量電荷比(m/z)を示すMSスペクトルが得られる。
【図11】
タンパク質のゲル消化、および、マススペクトロメトリー分析のペプチド回収のプロトコールである。
【図12】
マススペクトロメトリーサンプルの調製プロトコールである。ZipTipを用いて脱塩し、サンプルをMALDIプレートに載せ、MALDI−TOF MS分析する。
【図13A】
タンパク質消化物のMS/MS分析の概略図である。上述したように、興味のある切り出しバンドを消化し、生成したペプチドを抽出する。ペプチド混合物を、エレクトロスプレーイオン化によりMSに注入する。MSスペクトルを得た後、所定のm/zを有するペプチドをスペクトルから抽出し、断片化用に選択する。選択されたペプチドをガス分子を用いた衝突誘起解離(CID)により断片化する。
【図13B】
タンパク質消化物のMS/MS分析の概略図である。ペプチド結合で断片化が起こり、優先的にb型またはy型のプロトン化した断片が生じ、それにより断片は電荷を維持する(図示したとおり)。次に生成した断片をそのm/z比に従って分離する。選択されたペプチドのアミノ酸配列に関する情報を含むMS/MSスペクトルが得られる。
【図13C】
タンパク質消化物のMS/MS分析の概略図である。ペプチド結合で断片化が起こり、優先的にb型またはy型のプロトン化した断片が生じ、それにより断片は電荷を維持する(図示したとおり)。次に生成した断片をそのm/z比に従って分離する。選択されたペプチドのアミノ酸配列に関する情報を含むMS/MSスペクトルが得られる。
【図14】
MALDI−TOFで得られた質量測定結果に基づくタンパク質同定のプロセス、すなわちペプチドマスフィンガープリンティングである。図1において矢印で示されたsmEバンドの分析である。測定質量は、MALDI−TOFで得られたMSスペクトルから抽出される。次にその質量を、タンパク質データベースのコンピュータ内での解析から得られた計算質量と合わせる。最大数適合したデータベース登録を、可能性のある同定として一般的に印をつける。この場合、問題のバンドは、ヒトの核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチドEと同定された。
【図15】
未解釈のMS/MSスペクトル、すなわちSequestを用いたデータベース検索に基づくタンパク質同定の例である。このソフトウェアは、質量情報を用いて、データベースから500個の関連ペプチドを同定する。次に予想スペクトルをその500個のスペクトルから得て、実測スペクトルと相関させ、相関信頼値を得る。次に、最もよく適合したペプチドを可能性のある同定として選択する。たった一つのペプチドを用いて同定を行ったとしても、同じタンパク質中の異なるペプチドに適合するMSスペクトルの冗長性(redundancy)により、明瞭なタンパク質同定を達成することができる。Sequest分析は、図1において矢印で示したバンドを処理することによってなされた。そのMS/MSスペクトルは、酸化されたメチオニン(Mox)を有するペプチドVMoxVQPINLIFRとして同定され、このバンド中のタンパク質を、核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチドEと同定した。また、他のペプチドから得られたMS/MSスペクトルもこのタンパク質と適合しており、同定が確認された。追加のペプチドは、共に移動した別のタンパク質、すなわち核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチドG(smG;データは示さず)を含むバンドを示した。
【図16】
データベース検索とMS/MSスペクトルの部分的な解釈、すなわち配列tagに基づいたタンパク質(smE)同定の例である。配列tag方法を用いて、図1において矢印で示されたバンドのトリプシン消化物から単離されたペプチドから得られたMS/MSスペクトルを分析した。そのMS/MSスペクトルを部分的に解釈すると、アミノ酸配列の小さいストレッチが得られる。次に、ペプチドの質量、その配列tag成分、およびtag前後での差し引きの質量を用いて、データベースを検索する。ペプチドが適合した場合、リストは通常スコアリングスキームを示さないで得られる。そのMS/MSスペクトルは、酸化されたメチオニン(Mox)を有するペプチドVMoxVQPINLIFRとして同定し、これは核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチドEとして同定された。また、他のペプチドから得られたMS/MSスペクトルもこのタンパク質に適合し、同定が確認された。
【図17A】
FLAG−Skb1の終期における局在である。分裂溝における局在は、有糸分裂中のS. pombe でみられる局在と一致する。
【図17B】
FLAG−Skb1の終期における局在である。分裂溝における局在は、有糸分裂中のS. pombe でみられる局在と一致する。
【図18A】
核スペックルに似た構造における内在性Skb1の局在である。Skb1の核局在は、pICln、Skb1相互作用タンパク質はsnRNPsで共に免疫沈降し、またスペックル様の核構造中に保存される、という発見と一致する。またこれは、pIClnが、Skb1とその基質のいくつか(例えば、smD1やsmD3)を共に運搬するアダプタータンパク質として機能するというモデルと一致する。
【図18B】
核スペックルに似た構造における内在性Skb1の局在である。Skb1の核局在は、pICln、Skb1相互作用タンパク質はsnRNPsで共に免疫沈降し、またスペックル様の核構造中に保存される、という発見と一致する。またこれは、pIClnが、Skb1とその基質のいくつか(例えば、smD1やsmD3)を共に運搬するアダプタータンパク質として機能するというモデルと一致する。
【図19A】
GRF2の存在により、オカダ酸および/またはイオノマイシンで標的化された細胞中のNdrキナーゼ活性が高められる可能性があることを示す。これは、GRF2がオカダ酸の存在によりNdrと共に免疫沈降するという発見と一致する。オカダ酸とイオノマイシンとを用いた二重の処理により、オカダ酸のみでの処理と比べてNdr活性がわずかに減少した。これは、イオノマイシン処理において、担体としてDMSOが存在することによる可能性がある。
【図19B】
GRF2の存在により、オカダ酸および/またはイオノマイシンで標的化された細胞中のNdrキナーゼ活性が高められる可能性があることを示す。これは、GRF2がオカダ酸の存在によりNdrと共に免疫沈降するという発見と一致する。オカダ酸とイオノマイシンとを用いた二重の処理により、オカダ酸のみでの処理と比べてNdr活性がわずかに減少した。これは、イオノマイシン処理において、担体としてDMSOが存在することによる可能性がある。
【図20A】
sudD関連タンパク質のアライメントである。Aspergillus nidulans(sudD)およびSaccharomyces cerevisiae(RIO1)からのsudDタンパク質と、すでに同定されたヒトsudDタンパク質(HssudD)と、他のヒトsudD関連タンパク質(GI13543922;AF258661;FLJ11159)とを、共に並べた。影をつけた領域は保存領域を示し、最も暗い領域は、最も高度に保存された領域を示す。
【図20B】
図20Aのアライメントの続きである。
【図20C】
図20Aのアライメントの続きである。
【図20D】
図20Aのアライメントの続きである。
【関連出願の引用】
本願は、2000年6月30日付で出願された仮出願60/215,504、および、2001年1月24日付で出願された仮出願60/263690に対する優先権を主張し、当該明細書は、参照によって本明細書に含まれる。
【0002】
【発明の背景】
Rasは、いわゆる「低分子量の」Gタンパク質のラージファミリーに関するプロトタイプである(1、2で述べられている)。Rasは、質量約21kDaのGTPアーゼである。Rasは、2種の異なるコンフォメーションで存在し、1つはGDPに結合したコンフォメーションであり、他方はGTPに結合したコンフォメーションである。Rasは、これら2種の異なる形態で細胞のタンパク質の異なるセットに物理的に結合することができる。それによりRasは、分子スイッチとして機能し得る。ヒトのガンにおいて、RasのGTP結合状態を促進する変異が頻繁に起こる。3種のヒトRas遺伝子(H、KおよびN)と、数ダースのRas関連低分子量Gタンパク質とがあり、これらはサブファミリーに細分化される(例えば、Ras、Rho、Rab、RanおよびArfサブファミリー)。Rasは進化の際に高度に保存されてきた。Saccharomyces cerevisiaeおよびSchizosaccharomyces pombeのような単細胞酵母ですらRas遺伝子を有し、ヒトRasは、効果的に酵母のRas遺伝子と置換することができる。しかしながら、Ras遺伝子がヒトの酵母で機能する際の経路は無関係であることが証明されている。出芽酵母においては、Rasは細胞外グルコースへの応答でアデニリルシクラーゼを活性化するように機能し、分裂酵母においては、Rasは交配に関与する。
【0003】
ヒト、試験された他の哺乳動物種、および、C. elegansやD. melanogasterのような真核生物モデルにおいて、Rasは、細胞に影響を与える様々な細胞外シグナル下流の分子スイッチとして機能する。ヒトおよびマウス細胞でRasを活性化するシグナルとしては、様々なホルモン、成長因子、分化因子およびサイトカイン因子、細胞−細胞外基質の相互作用、および、カルシウム流入がある。これらシグナルに対する受容体としてはチロシンキナーゼがあり、そのいくつかは、成長因子受容体、インテグリン、およびGタンパク質共役セルペンチン受容体(GPCR)である。
【0004】
Rasは、細胞外シグナルの直接的なターゲットではない。Rasの不活性型と活性型との間の自発的な変換はごくわずかであり、なぜなら、RasはGDPとGTPとの両方に高い親和性で結合し(Kdは約10−11M)、その内因性のGTPアーゼ活性は弱いためである。別々のタンパク質が直接Rasと相互作用し、ヌクレオチド交換を触媒し、そのGTPアーゼ活性を刺激する。RasのGTP結合状態へ活性化は、一般的にグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)と呼ばれるタンパク質が仲介する。GEFの刺激によって、Rasから結合したGDPが放出され、続いて、自発的にGTP分子で置換されるが、このような置換は細胞内のGDPより頻繁におこる。Rasの不活性化、すなわちGDP結合型へ再変換は、結合したGTPのγリン酸を加水分解することによって起こり、その際の反応は、GTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)による一時的なRas−GTPの結合を必要とする。Ras−GEFおよびGAPは、マルチドメインタンパク質であって、これはシグナルで活性化された受容体にそれらをカップリングするためのモジュールを含む(3、4)。受容体活性化への応答におけるGEFおよびGAPの活性化のメカニズムにおいては、サイトゾルから細胞質膜の内部表面へGEFおよびGAPを再局在化させ、そこにRasを閉じ込めると考えられる。GEFおよびGAPが共に活性化されることによって、一時的に起こる低分子量Gタンパク質活性化を確実にする。
【0005】
哺乳動物細胞において、Ras・GTPは、Raf1タンパク質キナーゼ、ホスファチジルイノシトール−3−OHキナーゼ(PI3K)、Ral−GDS、および他の既知の候補エフェクタータンパク質と相互作用可能である。細胞質膜でのRas−GTPとの相互作用により何とかしてRafを活性化し、一連の下流タンパク質キナーゼを順に活性化するが、このようなキナーゼとしては、ERKキナーゼ(またはMEKとして知られる)、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)(またはERK(細胞外シグナル調節キナーゼ)として知られる)、およびリボゾームタンパク質S6キナーゼ(RSK)がある(3で述べられる)。このような活性化タンパク質キナーゼのターゲットのなかで、様々な転写因子および他のシグナル伝達タンパク質は、Ras活性化を起こす細胞外シグナルへの細胞性応答を仲介する(5)。Ras−GTPとこれら異なるエフェクタータンパク質との相互作用を制御するメカニズムはわかっていない。
【0006】
細胞分裂周期の刺激、および悪性の細胞形質転換の維持は、十分に確立されたRaf−MEK−ERKキナーゼカスケード(Rasで活性化された)、および、GTPアーゼのRhoファミリー(Rhoそのもの、RacおよびCdc42を含む)の両方が必要である。Rho、RacおよびCdc42の活性化GTP結合型は、分裂を促進し(6)、細胞質膜に局所的に接着する複合体と、特定のアクチン構造との形成を促進するが、これは血清飢餓マウスSwiss3T3細胞で実証されており、ストレスファイバー(Rho・GTP)、ラッフル(ruffles)/膜状突起(lamellipodia)(Rac・GTP);および糸状突起(filopodia)/微小突起(microspike)(Cdc42・GTP)が形成される。その結果、GTPアーゼのRhoファミリーは、細胞内のアクチン構造の調節において主要な役割を有し、それゆえに、細胞の極性、形状、付着および運動性を制御する。このような細胞行動のパラメーターは、正常な細胞成長、分裂および分化と密接に関連しており、これら細胞の特徴の調節ミスは腫瘍細胞の増殖と転移に関連している。Rasのように、Rhoファミリータンパク質は特定のGEFおよびGAPによって調節される(7、8で述べられる)。
【0007】
RasおよびRhoファミリーGTPアーゼによるシグナル伝達は、そのGEFおよびGAPのレベルに調節されるが、ここで当該GEFおよびGAPは、ある場合において、同じタンパク質または直接相互作用するタンパク質に存在する。例えば、様々なシグナルは、p120Ras−GAPと、p190Rho−GAPとの物理的な結合を刺激する(9、10)。タンパク質GRF2は、別々のRasおよびRacGEFドメインおよび活性を有するが(11〜13)、それに対してCNrasGEFは、cAMP結合に対する応答においてRasを活性化し、cAMPが活性化されていなければRap1を活性化する(14、15)。それゆえに、GEFおよびGAPを含むタンパク質複合体を介してシグナル伝達経路間の混線が起こる可能性がある。
【0008】
これまで、哺乳動物/ヒト細胞において、RasGEFの4種のクラスが同定されており、そのクラスとは、SOS(Sos1およびSos2)(16)、GRF(Ras−GRF1およびRas−GRF2)(17〜19)、Ras− GRP(Ras−GRP1およびRas−GRP2)(20)およびCNrasGEF(21)である。様々なRas特異的GEFは、マルチドメインタンパク質である。それらは類似のRas結合ドメイン(Cdc25ドメイン)を共有しているが、それらの異なる細胞シグナルを認識する能力によって区別される。SOSタンパク質は、タンパク質GRB2(成長因子受容体結合タンパク質−2)を複合化し、GRB2のSH2ドメインを利用して、多くの成長因子およびサイトカイン因子の活性化ターゲットにおけるタンパク質−ホスホチロシン(pTyr)と結合する(22、23)。Ras−GRF1およびRas−GRF2はカルモジュリンと結合し、カルシウムシグナルに対する応答においてRasを活性化させる(12、24)。Ras−GRPはジアシルグリセロール(DAG)と結合し(20)、それに対してCNrasGEFはcAMPに結合し(21)、その結果、これらの相互作用によりインビボでRasの活性化が起こる。このような「第2メッセンジャー」(pTyr、Ca、DAG、cAMP)との直接的または間接的な相互作用の結果として、RasGEFは細胞質膜へ移動し、機能的に活性化する。それによりGEFとRasとの相互作用が可能になり、脂質によってそれらが共有結合で改変され、その結果、細胞質膜の内部表面と密接に結合する。
【0009】
このようなGEF機能の上流の観点(すなわち、Rasのシグナル誘導による活性化、GEF仲介による活性化)はかなり理解されているにも関わらず、結果生じる細胞応答を制御する下流での現象におけるGEFの役割は、酵母からヒトに至るまで殆どわかっていない。
【0010】
図1に示すように、GRF2および関連タンパク質GRF1は、類似した認識可能なドメインおよび配列モチーフの集合体を含む。GRF1は脳で最も多く発現され、また膵臓特異的なアイソフォームも存在する(25)。またマウスGRF2も脳で多く発現されるが、他の多くの組織にも存在する(19)。マウスGRF2の遺伝子は第13染色体(13C3−D1)にマッピングされ、一方、ヒト遺伝子(RASGRF2)では第5染色体の同遺伝子型領域(5q13)に存在する(26)。GRF1は別の遺伝子産物であり、その遺伝子は、マウスでは第9染色体(27)、ヒトでは第15染色体に存在する(28)。
【0011】
RasおよびRasGEFに関与する細胞経路は、酵母およびヒト細胞において異なることが述べられている(1で述べられる)。出芽酵母においては、CDC25遺伝子でコードされるGEFは、細胞外グルコース濃度への応答においてRasを活性化し、それによりアデニリルシクラーゼが活性化される。分裂酵母においては、RasGEFはste6遺伝子でコードされ、これは交配に必須である。酵母GEFとは異なり、ヒト(およびげっ歯類)GRFタンパク質は2つのPHドメインとDHドメインとを含み、これはGRF2の場合、低分子量GTPアーゼRacと結合し活性化することがわかっている(13)。すなわちGRF2は二官能価のGEFである。2つのMAPKシグナル伝達経路、すなわちERKおよびSAPK(ストレス活性化タンパク質キナーゼ)が、GRF2により活性化されることがわかっている。GRF2によるSAPK経路の活性化は、GRF2のDHドメインを必要とする。このドメインはRacと相互作用するため、活性化RacはGRF2をSAPK経路にカップリングする可能性がある。従って、GRF2によるSAPKの活性化は間接的であり、このシグナル伝達の連結を仲介する同一なタンパク質は、Rac以外に同定されていない。GRF2と直接相互作用することがわかっているタンパク質としては、カルモジュリン、RasおよびRacがあり(13、19)、ならびに、GRF1およびGRF2が互いに相互作用することが示唆されている(29)。
【0012】
分裂酵母においては、RasおよびRac関連タンパク質Cdc42を含む経路がある(30)(図1参照)。この経路は、タンパク質キナーゼOrb6を含み、細胞周期と調和して働く細胞極性の維持や細胞の形態形成に必要とされる。Orb6キナーゼは有糸分裂の阻害剤である(30)。Orb6のヒト相同体としては、Ndrが知られている。Ndrは、カルシウムシグナル(GRF2のような)により活性化されリン酸化されるが、その機能は未知である(31)。タンパク質キナーゼShk1(またはPakとして知られる)は、分裂酵母におけるOrb6の上流の活性化剤である。Shk1は、哺乳動物p21(odc42/Rac)活性化タンパク質キナーゼ(PAK)の相同体である。分裂酵母のSkb1遺伝子産物(また出芽酵母においてはHSL7として知られる)は、Shk1に結合する高度に保存されたタンパク質であり、Orb6/Ndrと同様に、有糸分裂の負の調節因子である(32)。Skb1欠損酵母変異体で発現される場合、酵母タンパク質をヒトSkb1タンパク質で置換することができ、タンパク質−メチルトランスフェラーゼ触媒活性を有することが報告されている(33)。
【0013】
酵母タンパク質Orb6/NdrおよびSkb1に対するヒトまたは哺乳動物の対応物が知られているが、酵母相同体により制御される経路と類似した経路において機能することは示されておらず、RasまたはGRF2と相互作用することも知られていない。GRF2は、有糸分裂の調節に関与しない。
【0014】
【発明の要約】
本発明は、Rasシグナル経路の成分を含むタンパク質複合体の発見に関し、より特定には、GRF2仲介シグナル伝達に関与するタンパク質に関する。これらのタンパク質の様々な相互作用により、細胞の恒常性という特定の観点において、生化学的な性質に関する新しい情報と、細胞内のシグナル伝達経路の細胞性かつ生理学的な結果とが解明された。
【0015】
本発明の1つの観点は、哺乳動物のGRF2タンパク質またはGRF2を含むタンパク質複合体と相互作用する能力を有するタンパク質の同定に基づく。我々は、GRF2を「ベイト(bait)」タンパク質として利用することによって生理的条件下でGRF2と複合体を形成する様々な異なるタンパク質を同定し、本明細書ではこのようなタンパク質を総合して「GRF2相互作用タンパク質」または「GRF2−IP」と称する。特定のGRF2−IPを表1に列挙する。
【0016】
我々は、特定のGRF2−IPをベイトタンパク質として利用することによって、これらタンパク質とさらなるタンパク質複合体との関係に及んで解釈した。特に、本発明の他の観点は、セリン/スレオニンキナーゼNdrと相互作用するタンパク質、または、セリン/スレオニンキナーゼNdrを含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「Ndr相互作用タンパク質」または「Ndr−IP」と称する。代表的なNdr−IPを表3A〜Bに示す。同様に、本発明のさらに他の観点は、メチルトランスフェラーゼSkb1(またはGRF2−IP)を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「Skb1相互作用タンパク質」または「Skb1−IP」と称する。代表的なSkb1−IPを表4A〜Bに示す。本発明のさらに他の観点は、GRF2−IPホスファターゼPP2Cを含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「PP2C相互作用タンパク質」または「PP2C−IP」と称する。代表的なPP2C−IPを表5に示す。
【0017】
我々は、GRF2複合体への関連をよりいっそう拡張して、ベイトタンパク質としてSkb1相互作用タンパク質、pIClnを選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、pIClnを含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「pICln相互作用タンパク質」または「pICln−IP」と称する。代表的なpICln−IPを表2に示す。
【0018】
また我々は、GRF2複合体への関連をよりいっそう拡張して、ベイトタンパク質として、pICln相互作用タンパク質、タンパク質4.1SVWL2(タンパク質4.1の多くのアイソフォームのうちの新規の型の一つ)を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、4.1SVWL2を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「4.1SVWL2相互作用タンパク質」または「4.1SVWL2−IP」と称する。代表的な4.1SVWL2−IPを表6に示す。
【0019】
また我々は、GRF2複合体への関連をよりいっそう拡張して、ベイトタンパク質として、さらに他のpICln相互作用タンパク質、smD1を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、smD1を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「smD1相互作用タンパク質」または「smD1−IP」と称する。代表的なsmD1−IPを表7に示す。
【0020】
また我々は、GRF2複合体への関連をよりいっそう拡張して、ベイトタンパク質として、さらに他のpICln相互作用タンパク質、タンパク質smD3を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、smD3を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「smD3相互作用タンパク質」または「smD3」と称する。代表的なsmD3−IPを表8に示す。
【0021】
これら様々なGRF2/GRF2−IP複合体、Ndr/Ndr−IP複合体、Skb1/Skb1−IP複合体、PP2C/PP2C−IP複合体、pICln/pICln−IP複合体、4.1SVWL2/4.1SVWL2−IP複合体、smD1/smD1−IP複合体、およびsmD3/smD3−IP複合体の順列(permutation)は、これらが相互作用することにより、GRF2の様々な機能活性の調節に関与し、さらに、Ras依存性シグナル伝達および細胞成長の調節に関連する。これらの機能活性としては、これらに限定されないが、(i)生理学的なプロセス(例えば、細胞周期の制御、有糸分裂の調節、RNA代謝、細胞骨格構造の調節、細胞分化およびアポトーシス)、(ii)ウイルス感染への応答、(iii)細胞内シグナル伝達、(iv)転写調節、および(v)病態生理学的なプロセス(例えば、腫瘍形成や腫瘍の広がりなどの過増殖性疾患(hyperproliferative disorder)、神経変性疾患などの変性疾患、ウイルス感染)がある。
【0022】
本発明の他の観点は、上述したタンパク質の完全長または部分的なコーディング配列のいずれかを含む単離された核酸配列を提供する。
【0023】
本発明はさらに、その他の観点において、本発明のGRF2/GRF2−IP複合体、Ndr/Ndr−IP複合体、Skb1/Skb1−IP複合体、PP2C/PP2C−IP複合体、pICln/pICln−IP複合体、4.1SVWL2/4.1SVWL2−IP複合体、smD1/smD1−IP複合体、およびsmD3/smD3−IP複合体、同様に、それらの個々の要素を利用する様々な方法を提供する。
【0024】
好ましい実施形態において、タンパク質複合体の調節因子を同定する方法を提供し、当該方法は、(i)GRF2、GRF2相互作用タンパク質、Ndr相互作用タンパク質、Skb1相互作用タンパク質、PP2C相互作用タンパク質、pICln相互作用タンパク質、4.1SVWL2相互作用タンパク質、smD1相互作用タンパク質、およびsmD3相互作用タンパク質からなる群より選択された少なくとも2種のタンパク質のタンパク質複合体を含む反応混合物を作製すること、(ii)前記反応混合物と試験薬剤とを接触させること、および(iii)1以上の活性に関する試験薬剤の効果を測定すること、を含み、ここで当該効果は、以下の(a)〜(h)からなる群より選択される:(a)上記タンパク質複合体の存在度の変化、(b)上記複合体の活性の変化、(c)上記複合体の少なくとも1種の活性の変化 、(d)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体またはその成分の細胞内局在の変化、(e)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子の転写量の変化、(f)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の存在度の変化、(g)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の活性の変化、および(h)上記反応混合物が細胞全体の場合、細胞中の第2メッセンジャー量の変化。最も好ましい実施形態において、分析で同定された薬剤の1以上が、製薬上許容できる賦形剤と共に配合できる。
【0025】
好ましい実施形態において、GRF2依存性の成長を調節できる薬剤を同定する方法を提供し、当該方法は、(i)GRF2相互作用タンパク質、Ndr相互作用タンパク質、Skb1相互作用タンパク質、PP2C相互作用タンパク質、pICln相互作用タンパク質、4.1SVWL2相互作用タンパク質、smD1相互作用タンパク質、およびsmD3相互作用タンパク質からなる群より選択されたタンパク質を含む反応混合物を作製すること、(ii)前記反応混合物と試験薬剤とを接触させること、および(iii)試験薬剤の効果を1以上の活性に関して検出すること、を含み、ここで当該活性は、以下の(a)〜(h)からなる群より選択される:(a)上記タンパク質複合体の存在度の変化、(b)上記複合体の活性の変化、(c)上記複合体の少なくとも1種の活性の変化、(d)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体またはその成分の細胞内局在の変化、(e)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子の転写量の変化、(f)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の存在度の変化、(g)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の活性の変化、および(h)上記反応混合物が細胞全体の場合、細胞中の第2メッセンジャー量の変化。最も好ましい実施形態において、分析で同定された薬剤の1以上が、製薬上許容できる賦形剤と共に配合できる。
【0026】
本発明の他の観点は、細胞の成長状態を改変する方法を提供し、当該方法は、細胞と、上述した分析により同定された本発明のタンパク質複合体を調節する薬剤、または、GRF2依存性成長経路を調節する薬剤のいずれかとを接触させることを含む。
【0027】
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、上述した分析により同定された本発明のタンパク質複合体を調節する薬剤、または、GRF2依存性成長経路を調節する薬剤のいずれかとを接触させることを含む。
【0028】
本発明の他の観点は、細胞の分化を誘導する方法を提供し、当該方法は、細胞と、上述した分析により同定された本発明のタンパク質複合体を調節する薬剤、または、GRF2依存性成長経路を調節する薬剤のいずれかとを接触させることを含む。
【0029】
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖に関する症状の厳しさを軽減する方法を提供し、当該方法は、上述した分析により同定された本発明のタンパク質複合体を調節する薬剤、または、GRF2依存性成長経路を調節する薬剤のいずれかの治療上有効な量を、前記症状を有する動物に投与することを含む。
【0030】
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Rasシグナル伝達経路に含まれる活性の一部を抑制することができる薬剤とを接触させることを含む。
【0031】
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Skb1のメチルトランスフェラーゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む。
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Skb1のキナーゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む。
【0032】
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Skb1の正常な細胞内局在の阻害剤とを接触させることを含む。
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Ndrのキナーゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む。
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Ndrの正常な細胞内局在の阻害剤とを接触させることを含む。
【0033】
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、PP2Cのホスファターゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む。
本発明の他の観点は、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、pIClnの活性の阻害剤とを接触させることを含む。
本発明の他の観点は、表1〜9に列挙されたタンパク質およびその相同体を生産するように遺伝子操作された宿主細胞を提供する。
【0034】
本発明の他の観点は、細胞中の異常なGRF2依存性シグナル伝達を検出する方法を提供し、当該方法は、以下の(i)〜(iii)の1以上に関して細胞をスクリーニングする工程を含む:(i)GRF2相互作用タンパク質、Ndr相互作用タンパク質、Skb1相互作用タンパク質、PP2C相互作用タンパク質、pICln相互作用タンパク質、4.1SVWL2相互作用タンパク質、smD1相互作用タンパク質、またはsmD3相互作用タンパク質をコードした遺伝子の改変された発現量、(ii)GRF2相互作用タンパク質、Ndr相互作用タンパク質、Skb1相互作用タンパク質、PP2C相互作用タンパク質、pICln相互作用タンパク質、4.1SVWL2相互作用タンパク質、smD1相互作用タンパク質、またはsmD3相互作用タンパク質の、安定性、翻訳後修飾、細胞内局在および/または酵素活性の、改変されたレベル、および(iii)GRF2相互作用タンパク質、Ndr相互作用タンパク質、Skb1相互作用タンパク質、PP2C相互作用タンパク質、pICln相互作用タンパク質、4.1SVWL2相互作用タンパク質、smD1相互作用タンパク質、またはsmD3相互作用タンパク質を含む複合体の活性の改変されたレベル、である。
以下に、本発明の上記および他の観点を、添付の図面を参照しながら説明する。
【0035】
【発明の詳述】
1.大要
本発明はRasシグナル経路の成分を含むタンパク質複合体の発見に関し、より特定には、GRF2仲介シグナル伝達に関与するタンパク質に関する。これらタンパク質の様々な相互作用は、細胞の恒常性という特定の観点において、生化学的な性質新しい情報と、細胞内のシグナル伝達経路の細胞性かつ生理学的な結果とが解明された。
【0036】
本発明の一つの観点は、哺乳動物のGRF2タンパク質またはGRF2を含むタンパク質複合体と相互作用する能力を有するタンパク質を同定することに基づく。「ベイト(bait)」タンパク質としてGRF2を利用することによって、我々は、生理的な条件下でGRF2と複合体を形成する様々な異なるタンパク質を同定し、このようなタンパク質を、本明細書では集合的に「GRF2相互作用タンパク質」または「GRF2−IP」と称する。特定のGRT2−IPを表1に列挙する。
【0037】
特定のGRF2−IPをベイトタンパク質として利用することによって、このようなタンパク質と、さらなるタンパク質複合体との関係を拡張した。特に、本発明の他の観点は、セリン/スレオニンキナーゼNdrと相互作用するタンパク質、または、セリン/スレオニンキナーゼNdrを含む複合体を形成するタンパク質を同定することに関し、このようなタンパク質を本明細書では「Ndr相互作用タンパク質」または「Ndr−IP」と称する。代表的なNdr−IPを表3A〜Bに示す。同様に、本発明のさらに他の観点は、メチルトランスフェラーゼSkb1(またはGRF2−IP)を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「Skb1相互作用タンパク質」または「Skb1−IP」と称する。代表的なSkb1−IPを表4A〜Bに示す。本発明のさらに他の観点は、GRF2−IPホスファターゼPP2Cを含む複合体を形成するタンパク質を同定することに関し、このようなタンパク質を本明細書では「PP2C相互作用タンパク質」または「PP2C−IP」と称する。代表的なPP2C−IPを表5に示す。
【0038】
GRF2複合体への関連をよりいっそう拡張して、我々は、ベイトタンパク質として、Skb1相互作用タンパク質、pIClnを選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、pIClnを含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「pICln相互作用タンパク質」または「PICln−IP」と称する。代表的なpICln−IPを表2に示す。
【0039】
GRF2複合体への関連をよりいっそう拡張して、我々はまた、ベイトタンパク質として、pICln相互作用タンパク質、タンパク質4.1SVWL2(タンパク質4.1の多くのアイソフォームのうちの新規の型の一つ)を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、4.1SVWL2を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「4.1SVWL2相互作用タンパク質」または「4.1SVWL2−IP」と称する。代表的な4.1SVWL2−IPを表6に示す。
【0040】
GRF2複合体への関連をよりいっそう拡張して、我々はまた、ベイトタンパク質として、さらに他のpICln相互作用タンパク質、smD1を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、smD1を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「smD1相互作用タンパク質」または「smD1−IP」と称する。代表的なsmD1−IPを表7に示す。
【0041】
GRF2複合体への関連をよりいっそう拡張して、我々はまた、ベイトタンパク質として、さらに他のpICln相互作用タンパク質、タンパク質smD3を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、smD3を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「smD3相互作用タンパク質」または「smD3」と称する。代表的なsmD3−IPを表8に示す。
【0042】
これら様々なGRF2/GRF2−IP複合体、Ndr/Ndr−IP複合体、Skb1/Skb1−IP複合体、PP2C/PP2C−IP複合体、pICln/pICln−IP、4.1SVWL2/4.1SVWL2−IP複合体、smD1/smD1)−IP複合体、およびsmD3/smD3−IP複合体の順列は、これらが相互作用することにより、GRF2の様々な機能活性の調節に関与し、さらに、Ras依存性シグナル伝達および細胞成長の調節に関連する。これらの機能活性としては、これらに限定されないが、(i)生理学的なプロセス(例えば、細胞周期の制御、有糸分裂の調節、RNA代謝、細胞骨格構造の調節、細胞分化およびアポトーシス)、(ii)ウイルス感染への応答、(iii)細胞内シグナル伝達、(iv)転写調節、および(v)病態生理学的なプロセス(例えば、腫瘍形成や腫瘍の広がりなどの過増殖性疾患、神経変性疾患などの変性疾患、ウイルス感染)がある。
【0043】
従って、本発明において、治療および診断における使用のための利用可能な新規の分析および試薬が作製される。その上、以上の本発明の複合体の形成、または、1以上の本発明のタンパク質(GRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、PP2C−IP、pICln−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IP)の内因性の活性に影響を与え得る薬剤を同定するために、、薬剤を発見する分析が提供される。このような薬剤は、治療上、細胞成長および/または分化を改変するのに有用である。
【0044】
本発明はまた、1以上の本発明に係るGRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、PP2C−IP、pICln−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質、または、このようなタンパク質を含む複合体の生産および/または単離に関する方法論、およびその方法論から得られた調製物に関する。特に、本発明に係るタンパク質、および、その配列にハイブリダイズする核酸プローブのコーディング配列を含む組換え発現系が考慮されている。
【0045】
また本発明においては、本発明に係るGRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質に特異的な抗体、同様に、このようなタンパク質を含む複合体に特異的な抗体も考慮される。本発明の複合体に特異的な抗体は、組織中で上記複合体を検出すること、および、それらの組織における分布を決定すること、に用いることができる。
【0046】
2.定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で用いられる特定の用語を、以下にまとめる。
本明細書で用いられる「活性」という用語は、その最も広い概念における分子の機能を意味する。当該用語は、通常、これらに限定されないが、分子の生物学的、生化学的、物理学的または化学的な機能を含む。例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力や、他の分子の機能を促進する、活性化する、安定化する、阻害する、抑制する、または不安定化する能力や、他の分子を改変する能力や、他の分子によって改変される能力や、安定性や、細胞の内部または外部の特定の細胞内局在に位置させる能力が全て、本明細書で用いられる用語の定義に含まれるように考慮される。
【0047】
本明細書で用いられる「アゴニスト」という用語は、タンパク質複合体の形成を増大させる分子を意味するか、または、本発明の複合体または当該複合体中の分子に結合する場合、上記複合体の活性量を増加させる、もしくは、上記複合体の活性の持続時間を延長させる分子を意味する。アゴニストとしては、タンパク質、核酸、炭化水素、または他のいかなる分子が含まれ、例えば、複合体または当該複合体の分子に結合できる化学物質類、金属類、有機金属化合物剤などが挙げられる。またアゴニストとして、本発明の複合体のタンパク質要素から誘導された機能性ペプチドまたはペプチド断片も含まれ、または、タンパク質要素それ自身も含み得る。特定のペプチドの構造的特徴を模擬して設計された物理構造を有するペプチドミメティック、合成分子をアゴニストとして提供することもできる。その刺激は、直接的もしくは間接的でもよく、または、競合的もしくは非競合的メカニズムによるものでもよい。
【0048】
本明細書で用いられる「動物」という用語は、哺乳動物を意味し、好ましくは ヒトのような哺乳動物である。
【0049】
本明細書で用いられる「アンタゴニスト」という用語は、本発明の複合体または当該複合体中のタンパク質に結合する場合、上記複合体の活性またはそのタンパク質要素の量または持続期間を減少させる分子、または、形成された複合体の量を減少させる分子を意味する。アンタゴニストとしては、タンパク質(複合体の要素の結合領域で競合的に結合する抗体を含む)、核酸(遺伝子レベルで複合体の要素の発現を阻止するアンチセンス分子を含む)、炭化水素、または他のいかなる分子(例えば、化学物質類、金属類、有機金属化合物剤など)があり、これらは、複合体形成または活性を妨げるのに有効な程度で、哺乳動物型、好ましくはヒト型のGRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、または4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質に結合する。またアンタゴニストとしては、GRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質から誘導されたペプチドまたはペプチド断片、同様に、優性阻害性の点変異体がある。特定のペプチドの構造的特徴を模擬して設計された物理構造を有するペプチドミメティック、合成分子をアンタゴニストとして提供することもできる。その阻害は、直接的もしくは間接的でもよく、または、競合的もしくは非競合的メカニズムによるものでもよい。
【0050】
「ベイト」または「ベイトタンパク質」という用語は、それと結合し得る他のタンパク質を見出すためのターゲットとして用いられるポリペプチドを意味する。一般的に、ベイトタンパク質は、ベイトタンパク質を含む複合体の単離を容易にするために、タグを付されるか、または、固定化される。
【0051】
「結合」という用語は、2つの分子間の安定な結合を意味し、すなわち本発明においては、例えば、生理的条件下での静電性、疎水性、イオン性および/または水素結合による相互作用による、GRF2およびGRF2−IP、NdrおよびNdr−IP、SkbおよびSkb1−IP、pIClnおよびpICln−IP、PP2CおよびPP2C−IPタンパク質、4.1SVWL2および4.1SVWL2−IP、smD1およびsmD1−IP、smD3およびsmD3−IP間での安定な結合を意味する。
【0052】
本明細書において、「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」という用語は交換可能に用いられる。このような用語は、特定の被験細胞だけでなく、このような細胞の後代または可能性のある後代も意味すると解釈する。変異または環境的な影響のいずれかにより継代においてある種の改変が生じる可能性があるため、実際にはこのような後代は必ずしも親細胞と同一とはいえないが、本明細書で用いられる用語の範囲に含まれる。
【0053】
「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」とは、第一のアミノ酸配列(ポリペプチドをコードする)と、第二のアミノ酸配列(上記タンパク質のいずれのドメインとも無関係で実質的に非相同なドメインを定義した)との融合物である。キメラタンパク質は、上記第一のタンパク質も発現する生物中で(異なるタンパク質にもかかわらず)見出される外来ドメインを提示し、またキメラタンパク質は、異なる生物種で発現されるタンパク質構造の、「種間」、「遺伝子間」等での融合物であり得る。
【0054】
「GRF2シグナル伝達経路の成分」または「GRF2経路成分」という用語は、GRF2シグナル伝達現象の仲介に関与するポリペプチドを意味する。GRF2シグナル伝達経路の成分は、例えば、GRF2に直接結合するタンパク質、GRF2−IPには結合するがGRF2それ自身には直接結合することのできないタンパク質等を含むものとする。このような成分は、シグナル伝達経路においてGRF2の上流または下流に位置し、GRF2仲介シグナル伝達を作動または拮抗することができる。
【0055】
「化合物」、「試験化合物」および「分子」という用語は、本明細書において交換可能に用いられ、例えば、これらに限定されないが、ペプチド、核酸、炭化水素、低分子の有機分子、天然産物の抽出物のライブラリー、および他のいかなる分子(これらに限定されないが、化学物質類、金属類および有機金属化合物を含む)を意味する。
【0056】
「GRF2仲介シグナル伝達に影響を及ぼす(または調節する)ことができる化合物」という成句は、GRF2経路を介してシグナル伝達を阻害または強化する化合物を意味する。
【0057】
「保存された残基」または「保存的なアミノ酸置換」という成句は、特定の共通の特性に基づいたアミノ酸の分類を意味する。個々のアミノ酸間の共通の特性を定義する機能的な方法は、同種生物の対応するタンパク質間におけるアミノ酸変化の正規化した頻度を分析することである(Schulz, G. E. and R. H. Schirmer., Principles of Protein Structure, Springer−Verlag)。グループ間のアミノ酸が互いに優先的に交換する場合、従って、タンパク質構造全体に対する影響が互いに最も類似している場合、このような分析によってアミノ酸のグループを定義することができる(Schulz, G. E. and R. H. Schirmer., Principles of Protein Structure, Springer−Verlag)。この方法によって定義されたアミノ酸グループの例を以下に示す。
【0058】
(i)GluおよびAsp、Lys、ArgおよびHisからなる帯電したグループ、
(ii)Lys、ArgおよびHisからなる正に帯電したグループ、
(iii)GluおよびAspからなる負に帯電したグループ、
(iv)Phe、TyrおよびTipからなる芳香族グループ、
(v)HisおよびTrpからなる窒素環グループ、
(vi)Val、LeuおよびIleからなる大きい脂肪族の非極性グループ、
(vii)MetおよびCysからなるわずかに極性のグループ、
(viii)Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、GlnおよびProからなる小さい残基のグループ、
(ix)Val、Leu、Ile、MetおよびCysからなる脂肪族グループ、および
(x)SerおよびThrからなる小さいヒドロキシルグループ。
【0059】
上述したグループに加えて、各アミノ酸残基はそれ自身のグループを形成することができ、その個々のアミノ酸で形成されたグループは、当業界で一般的に用いられるアミノ酸の1文字表記および/または3文字表記で簡単に示される。
【0060】
「DEADボックス型」、「DEADボックス型ドメイン」または「DEADボックス型モチーフ」という用語は、アミノ酸モチーフ:Asp−Glu−Ala−Asp(1文字コードではDEAD)を意味する。DEADボックス型タンパク質とは、少なくとも1つのDEADボックス型モチーフを含むタンパク質であり、遺伝子発現の転写後調節に関与するものと考えられている。DEADボックス型ドメインは多くの推定のRNAヘリカーゼで見出されており、タンパク質と特定のRNAまたはRNAファミリーとの特異的な相互作用に寄与するものと考えられている(Lost et al. (1994) Nature 372:93−196;and Pause et al. (1993) Current Opinion in Structural Biology 3:953−959)。
【0061】
「破壊(destruction)ボックス型配列」または「破壊ボックス型モチーフ」という用語は、いくつかの細胞周期関連タンパク質のユビキチンが仲介する分解に必須なアミノ酸コンセンサス配列:RxxLxxxxNを意味する(Glotzer et al. (1991) Nature 349:132−138)。破壊 ボックス型配列は、タンパク質とその特異的なユビキチン化機構との間の要素を認識するように作用すると考えられている。
【0062】
「ポリペプチドをコードするDNA配列」という用語は、特定の個体中の1以上の遺伝子を意味し得る。当業界周知のように、特定のポリペプチドに関する遺伝子は、個体のゲノム中にシングルコピーまたは複数のコピーとして存在し得る。このような複製遺伝子は同一であるか、または、特定の改変(ヌクレオチド置換、付加または欠失がある)を含み、それでもなお、これらは全て実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードする。その上、ヌクレオチド配列中の特定の差異が個々の生物間で存在し、これは対立遺伝子(対立遺伝子)と呼ばれる。このような対立遺伝子の差異(allelic differences)により、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列において差異を生じることもあれば生じないこともあり、それでもなお同じ生物活性を有するタンパク質をコードする。
【0063】
本明細書で用いられる「ドメイン」という用語は、その分子の他の部分とは異なる特定の構造や機能を含む、タンパク質中の領域を意味する。
【0064】
本明細書で用いられる「遺伝子」または「組換え遺伝子」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を意味し、エキソンおよび(場合によっては)イントロン配列の両方を含む。「組換え遺伝子」は、ポリペプチドをコードする核酸、および、エキソンコーディング配列を含む核酸を意味するが、場合により染色体遺伝子由来のイントロン配列を含んでもよい。「イントロン」という用語は、タンパク質に翻訳されない所定の遺伝子に存在するDNA配列を意味し、通常、エキソンの間に見出される。
【0065】
「GI」または「GI番号」または「GI No.」という用語は、遺伝子および/またはタンパク質に関するデータベース照会番号(遺伝子バンクなど)を意味し、配列や他の関連情報を検索するのに有用である。
【0066】
「GRF2シグナル伝達経路」または「GRF2仲介シグナル」という用語は、GRF2またはGRF2と相互作用できるタンパク質を含むシグナル伝達現象を意味するものとする。
【0067】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、2つのペプチド間、または、2つの核酸分子間での配列類似性を意味する。相同性および同一性はいずれも、比較用に並べられた各配列の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列中の対応する位置が同じ塩基またはアミノ酸で占有されていれば、その分子はその位置において同一であり、対応する部位が同じまたは類似のアミノ酸残基(例えば、立体構造的および/または電子的な性質において類似するもの)で占有されていれば、その分子はその位置において相同(類似)とされる。相同性/類似性または同一性の割合の表現は、比較配列と共有の位置の同一または類似のアミノ酸の数を意味する。「関連していない」または「非相同の」配列とは、本発明に係る配列と、40%未満の同一性、好ましくは25%未満の同一性しかもたない配列である。同様に、「相同」または「相同の」配列とは、互いに少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、さらに95%〜99%の同一性を有する配列を意味する。
【0068】
「相同性」という用語は、類似の機能またはモチーフを有する遺伝子またはタンパク質を同定するのに用いられる数理学に基づく配列類似性の比較を意味する。本発明の核酸およびタンパク質配列は、公共データベースを用いて検索するための「問い合わせ配列」として用いることができ、例えば、他のファミリーメンバー、関連配列または相同体を同定することができる。このような検索は、NBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)(Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403−10)を用いて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラム(スコア=100、語長(wordlength)=12)を用いて行い、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラム(スコア=50、語長=3)を用いて行い、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較用のギャップ有り(gapped)アライメントを得るために、ギャップ有りBLASTを利用することができ、これはAltschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389−3402で説明される。BLASTおよびギャップ有りBLASTプログラムを利用する際、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびBLAST)のデフォルトパラメーターを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照。
【0069】
本明細書で用いられる「同一性」とは、配列の適合が最大になるように(すなわちギャップや挿入を考慮して)配列を並べた場合の、2以上の配列における対応する位置で同一なヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合を意味する。同一性は、既知の方法で容易に計算でき、この既知の方法としては、これらに限定されないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects、Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993;Computer Analysis of Sequence Data, Part I、Griffin、A. M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994;Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987;and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991;and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073(1988)で説明される方法がある。同一性を決定する方法は、試験された配列間で最大の適合が得られるように設計される。その上、同一性を決定する方法は、公共の利用可能なコンピュータープログラムでコード化されている。2つの配列間の同一性を決定するコンピュータープログラム方法としては、これらに限定されないが、GCGプログラムパッケージ(Devereux、J., et al., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984))、BLASTP、BLASTN、およびFASTA(Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215:403 −410 (1990) and Altschul et al. Nuc. Acids Res. 25:3389−3402 (1997))がある。BLASTXプログラムは、NCBIおよび他の源により公に利用可能である(BLAST Manual、Altschul、S.、et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894;Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403−410 (1990)。また、周知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性を決定するのに用いることができる。
【0070】
「相互作用タンパク質」という用語は、他のタンパク質と直接または間接的のいずれかで相互作用するポリペプチドを含むものとする。直接的な相互作用とは、タンパク質が、互いに結合する能力によって(例えば、共免疫沈降または他の手段によって)単離されることを意味する。間接的な相互作用とは、互いに結合するために他の分子を必要とするタンパク質を意味する。あるいは、間接的な相互作用とは、互いが直接結合することは決してないが、仲介物を介して相互作用するタンパク質を意味する。例えば、Rasは、GRF2と直接相互作用し、タンパク質4.1は、pIClnと直接相互作用する(タンパク質4.1はpIClnベイトと共免疫沈降する)。しかしながら、タンパク質4.1は、pICln仲介物によりGRF2と間接的に相互作用する(タンパク質4.1は、GRF2ベイトと共免疫沈降しないことがわかった)。
【0071】
本明細書で用いられる「単離された」という用語は、本発明に係るタンパク質およびタンパク質複合体に関しては、例えば、当該タンパク質または複合体が内在的に見出される細胞環境において、当該タンパク質または複合体と結合して通常存在しうるタンパク質の混入が本質的にないタンパク質またはタンパク質複合体の調製物を意味する。従って、単離されたタンパク質複合体は、例えばそれらの調節因子をスクリーニングする際のような単離中に通常「混入する」または上記複合体の研究を妨害する細胞成分から単離される。しかしながら、このような「単離された」複合体は他のタンパク質を組み込んでいてもよく、当該他のタンパク質は、調査される本発明に係るタンパク質またはタンパク質複合体によって調節される、ということが理解される。この場合において、このような追加のタンパク質としては、例えば、Ras、GEF、および、GRF2複合体で仲介されるシグナル伝達カスケードに関与する他のタンパク質がある。
【0072】
本明細書で用いられる「単離された」という用語は、DNAまたはRNAなどの核酸に関して、他のDNA、またはRNA(それぞれ高分子化合物(macromolecule)の天然資源に存在する)から分離された分子を意味する。好ましくは、例えば、単離されたポリペプチドをコードする核酸は、ゲノムDNAの特定の遺伝子の天然で直接隣接する核酸配列の10キロ塩基(kb)以下を含み、より好ましくはこのような天然に存在する隣接配列の5kb以下を含み、および最も好ましくはこのような天然に存在する隣接配列の1.5kb未満を含む。また、本明細書で用いられる「単離された」という用語は、細胞成分、ウイルス成分、または培地(組換えDNA技術で生産された場合)、または化学的な前駆物質もしくは他の化学物質(化学的に合成された場合)を実質的に含まない核酸またはペプチドを意味する。さらに、「単離された核酸」は、断片として天然に存在せず、自然状態で見出されない核酸断片を含むものとする。
【0073】
「哺乳動物GRF2」とは、Rasの活性化に関与するGタンパク質交換因子と相互作用する哺乳動物タンパク質、および、ヒトGRF2の配列またはそれと実質的に同一な配列を有する配列のいずれかの配列を有する哺乳動物タンパク質のファミリーを意味し、例えば、GRF2の非微生物性、望ましくは哺乳動物(例えば、マウス)の相同体がある。ヒトGRF2の配列(配列番号1)を以下に示す。
【0074】
【化1】
【0075】
「哺乳動物Ndr」とは、以下に示す配列(配列番号3)を有するヒトNdrを含む哺乳動物タンパク質、および、実質的にそれと同一な配列を有するタンパク質(その哺乳動物相同体を含む)のファミリーを意味する。
【0076】
【化2】
【0077】
「哺乳動物Skb1」とは、以下に示す配列(配列番号2)を有するヒトSkb1を含む哺乳動物タンパク質、および、実質的にそれと同一な配列を有するタンパク質(その哺乳動物相同体を含む)のファミリーを意味する。
【0078】
【化3】
【0079】
「哺乳動物4.1SVWL2」とは、以下に示す配列(配列番号4)を有するヒト4.1SVWL2を含む哺乳動物タンパク質ファミリー、および、実質的にそれと同一な配列を有する哺乳動物タンパク質(その哺乳動物相同体を含む)のファミリーを意味する。また、上記4.1ファミリータンパク質の他の新規のメンバーの一つである4.1SVWL1を、以下に示す(配列番号5)。
【0080】
【化4】
【0081】
ホモサピエンスの赤血球膜タンパク質4.1svwl1(配列番号5)のmRNAの10個のコンティグの翻訳および組み合わせは、cdsを用いて完成させた。
【0082】
【化5】
【0083】
本明細書でタンパク質の「哺乳動物相同体」と称されるポリペプチドは、他の哺乳動物のパラログまたは他の哺乳動物のオーソログを意味する。
【0084】
本明細書で用いられる「モチーフ」という用語は、特定の構造または機能を有するタンパク質で共通して見出されるアミノ酸配列を意味する。一般的に、コンセンサス配列は、特定のモチーフを表すために定義される。当該コンセンサス配列は、厳密に定義される必要はなく、位置の変異、退縮、長さの変異を含んでよい。当該コンセンサス配列をデータベース検索に用いて、アミノ酸配列中のモチーフの存在によって類似の構造または機能を有する他のタンパク質を同定することができる。特定のモチーフを有する他のタンパク質を同定するために、例えばGenBankまたはSwissProtのようなオンラインデータベースを、コンセンサス配列を用いて検索することができる。様々な検索アルゴリズムおよび/またはプログラムを用いることができ、例えばFASTA、BLASTまたはENTREZがある。FASTAおよびBLASTは、GCG配列分析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部として利用可能である。ENTREZは、National Center for Biotechniques Information, National Library of Medicine, National Institute of Health, Bethesda, Mdを介して利用可能である。
【0085】
本発明の「非ヒト動物」としては、例えばげっ歯類、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、雌牛、ニワトリ、両生類、爬虫類などのような脊椎動物がある。好ましい非ヒト動物は、げっ歯類ファミリーから選択され、例えばラットおよびマウスであり、最も好ましくはマウスであるが、トランスジェニック両生類、例えばアフリカツメガエル属のメンバーや、トランスジェニックニワトリも、例えば、胚形成および組織のパターニングを理解するための重要なツールを提供することができる。本明細書において「キメラ動物」という用語は、組換え遺伝子が見出される動物、または、動物細胞のいくつか(しかし全てではない)で組換え体が発現される動物を意味するように用いられる。「組織特異的キメラ動物」という用語は、組換え遺伝子が、いくつかの組織で存在する、および/または発現される(ただし他の組織では存在する、および/または発現されない)ことを示す。
【0086】
本明細書で用いられる「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、および、場合によってはリボ核酸(RNA)のようなポリヌクレオチドを意味する。また、この用語は、ヌクレオチド類似体から生産されたRNAまたはDNAいずれかの等価物、類似体として、および、説明される実施形態に適用可能なものとして、一本鎖ポリヌクレオチド(センスまたはアンチセンスなど)および二本鎖ポリヌクレオチドを含むものと理解されるべきである。
【0087】
本明細書では、「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は交換可能に用いられる。
【0088】
「PEST配列」または「PESTモチーフ」という用語は、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンおよびスレオニン残基が豊富なタンパク質の領域を意味する。PEST配列は、ユビキチン経路を介した様々なタンパク質の分解シグナルとして作用するようである。PEST領域は、タンパク質およびその特異的ユビキチン化機構の間の認識要素として作用すると考えられている。
【0089】
「PH」とは、プレクストリンホモロジーを意味する。
「PHドメイン」または「PHモチーフ」という用語は、プレックストリンの約100個のアミノ酸領域と相同性を有するポリペプチドを意味する。構造的な研究が示すところによれば、PHドメインは、2つの逆平行β−シートおよび長いC末端αヘリックスを含む類似のコンフォメーションに折りたたまれる(Gibson et al., 1994, Trends Biochem. Sci. 19:349−353)。PHドメインを有することがわかったタンパク質のなかでも、シグナル伝達または細胞骨格の構築において重要な役割を有するタンパク質のメンバーは、例えば、スペクトリン、ダイナミン、ホスホリパーゼC−γ、Btk、RasGAP、mSOS−1、Rac、Aktである。様々なPHドメインの例は、Musacchio, A., et al., TIBS, 18:343−348, 1993およびGibson, T. J., et al., TIBS, 19:349−353, 1994に示される。他のPHドメインは、これらの出版物で説明されている配列アライメント技術および3次構造比較を用いて同定することができる。
【0090】
本明細書で用いられる「表現型」とは、例えば、いずれか一つの特性を有する細胞の、または特性のいずれかのグループを有する細胞の、全体の物理学的、生化学的、および生理学的な性質を意味する。
【0091】
「精製タンパク質」という用語は、タンパク質の調製物を意味し、好ましくは、単離形態のタンパク質、またあるいは、細胞または細胞溶解産物中で通常タンパク質と結合する他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質を意味する。「他の細胞のタンパク質を実質的に含まない」(または本明細書では「他の混入タンパク質を実質的に含まない」ともいう)という用語は、20%未満(乾燥重量で)の混入タンパク質、および好ましくは5%未満の混入タンパク質しか含まない各構成タンパク質の個々の調製物と定義される。各構成タンパク質の機能的形態は、以下の実施例で説明されるような、クローン化遺伝子を用いて調製される精製調製物であり得る。再構成タンパク質混合物を生成するのに用いられる構成タンパク質を調製することに言及する場合、「精製された」とは、指定の分子が他の生体高分子の非存在下で存在することを意味し、ここで他の生体高分子とは、例えば他のタンパク質(特に、精製調製物として、または、本発明に係る再構成混合物中のその機能において、構成タンパク質の特徴を実質的にマスクする、減少させる、混同させる、または改変するような他のタンパク質)である。本明細書で用いられる「精製された」という用語は、好ましくは少なくとも80%(乾燥重量で)、より好ましくは95〜99重量%の範囲、および最も好ましくは少なくとも99.8重量%の同じ型の生体高分子が存在することを意味する(しかしながら、水、緩衝液、および他の低分子、特に5000未満の分子量を有する分子は存在してよい)。本明細書で用いられる「純粋な」という用語は、好ましくは、直前で述べた「精製された」と同じ数的限定を有する。「単離された」および「精製された」とは、天然状態(例えば、細胞の一部として)のタンパク質、または、細胞溶解産物の一部としてのタンパク質のいずれも含まれず、または、成分に分離されているが(例えば、アクリルアミドゲルで)純粋な(例えば、混入タンパク質を含まない)物質または溶液のいずれの状態でもないタンパク質も含まれない。また、本明細書で用いられる「単離された」という用語は、組換えDNA技術で生産された場合は細胞成分または培地、または、化学合成された場合は化学的な前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない構成タンパク質を意味する。
【0092】
「組換えタンパク質」という用語は、組換えDNA技術により生産される本発明のタンパク質を意味し、この際、通常、発現タンパク質をコードするDNAは適切な発現ベクターに挿入され、次にそれを用いて宿主細胞に形質転換し、異種タンパク質を生産する。その上、組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子に関して「から誘導された」という成句は、「組換えタンパク質」の意味の範囲内で、野生型タンパク質のアミノ酸配列、または、それに類似したアミノ酸配列(天然に存在するタンパク質を置換および欠失などで変異させることにより生成した)を有するタンパク質を含むものとする。
【0093】
本明細書で用いられる「レポーター遺伝子構造」とは、転写調節配列に実施可能に連結した「レポーター遺伝子」を含む核酸である。レポーター遺伝子の転写は、これらの配列によって制御される。少なくとも1以上のこれら制御配列の活性は、GRF2またはGRF2相互作用タンパク質を含むシグナル伝達経路によって直接的または間接的的に調節される。転写調節配列は、プロモーターおよび他の調節領域を含み、例えば、基質タンパク質のレベルへの応答してレポーター遺伝子の発現レベルを調節するエンハンサー配列などがある。
【0094】
「半精製された(semi−purified)」とは、タンパク質調製に関して、他の細胞性タンパク質またはウイルスタンパク質から予め分離されたタンパク質を意味する。例えば、全部の細胞溶解物に比べて、基質タンパク質を共に含む再構成された複合系のタンパク質は、混合物中の全ての他のタンパク質に対して少なくとも50%の純度で混合物中に存在し、より好ましくは少なくとも75%の純度、さらにより好ましくは90〜95%の純度で存在する。
【0095】
本明細書で用いられる「半精製された細胞抽出物」という用語、あるいは、「分画された溶解物」という用語は、全部の細胞溶解物の少なくとも1つの成分を実質的に分離するように処理された細胞溶解物、または、全部の細胞溶解物の少なくとも1つの成分を実質的に高濃度にするように処理された細胞溶解物を意味する。本明細書で用いられる「実質的に分離する」とは、全部の細胞溶解物の成分の、少なくとも10%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも80%を分離することを意味する。本明細書で用いられる「実質的に高濃度にする」とは、全細胞溶解物の少なくとも1つの成分を、全細胞溶解物の他の成分と比較して、少なくとも10%、より好ましくは少なくとも30%、さらにより好ましくは少なくとも約50%まで高濃度にすることを意味する。分離または高濃度にされた成分は、GRF2シグナル伝達経路の成分、例えば、GRF2、GRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質等であり得る。また、「半精製された細胞抽出物」という用語は、所定の成分がコントロールされた細胞より実質的に多くなる、または実質的に少なくなるように細胞を処理した場合、細胞からの溶解物も含むものとする。例えば、GRF2シグナル伝達経路の成分を全く(または非常に少量しか)生産しないように改変された細胞(例えば、組換えDNA技術により)は、細胞溶解により、半精製された細胞抽出物を生産する。
【0096】
本明細書において「シグナル伝達」、「シグナル伝達」、「シグナル伝達経路」、「シグナル伝達経路」などの用語は交換可能に用いられ、細胞環境からの物理学的または化学的シグナルの細胞膜を介したプロセシングを意味し、これは、数種のメカニズムの1以上を介して生じ、当該メカニズムとしては、例えば、酵素(プロテアーゼ、または、リン酸化パターンまたは他の翻訳後修飾を改変し得る他の酵素)の活性化/不活性化、イオンチャンネルまたは細胞内のイオン貯蔵の活性化、グアニンヌクレオチド結合タンパク質中間体を介したエフェクター酵素の活性化、イノシトールリン酸の形成、アデニリルシクラーゼの活性化または不活性化、転写因子および/または活性化の直接的な活性化(または阻害)などがある。
【0097】
本明細書で用いられる「低分子」とは、約5kD未満、最も好ましくは約2.5kD未満の分子量を有する組成物を意味するものとする。低分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティック、炭化水素、脂質または他の有機分子(炭素含有)または無機分子であり得る。多くの製薬会社は、化学的および/または生物学的な混合物の広範なライブラリーを所持しており、当該ライブラリーは一連の低分子、しばしば真菌、細菌、または藻類抽出物を含み、本発明のいずれかの分析でスクリーニング可能である。
【0098】
本明細書で用いられる「特異的にハイブリダイズする」という用語は、ターゲット遺伝子配列、または、それらに相補的な配列、またはそれらの天然に存在する変異体の少なくとも15、25、50または100個の連続したヌクレオチドにハイブリダイズし、ターゲット遺伝子に比べて細胞性の核酸(例えば、mRNAまたはゲノムDNA)に対するバックグラウンドハイブリダイゼーションが、15%未満、好ましくは10%未満、およびより好ましくは5%未満であるような、本発明の核酸プローブ/プライマーの能力を意味する。
【0099】
ポリペプチドに対して用いられる場合の「実質的な配列同一性」とは、2種の哺乳動物ペプチド配列が、デフォルトGAPを用いるGAPまたはBESTFITプログラムによって並べられた場合、少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは少なくとも99%の配列同一性またはそれ以上の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的なアミノ酸置換と区別される。例えば、電荷または極性などの化学的特性が類似するアミノ酸の置換によって、タンパク質の特性が影響を受けることはあまりない。例えば、アスパラギンに対してグルタミン、または、アスパラギン酸に対してグルタミン酸が挙げられる。
【0100】
本明細書で用いられる「組織特異的プロモーター」という用語は、プロモーターとして作用するDNA配列、すなわち、プロモーターに操作可能に連結した選択DNA配列の発現を調節するDNA配列を意味し、これらは、組織の特定の細胞、例えば泌尿器系由来の細胞(例えば、腎臓細胞)、または神経系由来の細胞(例えば、ニューロン性細胞)において、選択DNA配列の発現に作用する。またこの用語は、最初はある組織での選択DNAの発現を調節するが、他の組織での発現を起こすような、いわゆる「leaky」プロモーターも同様に含む。
【0101】
本明細書で用いられる「トランスフェクション」という用語は、核酸が仲介する遺伝子の移動によって、核酸、例えば発現ベクターを、レシピエント細胞に導入することを意味する。本明細書で用いられる「形質転換」とは、細胞が外来性のDNAまたはRNAを取り込んだ結果として細胞が変化し、例えば、形質転換した細胞が本発明のポリペプチドの組換え型を発現するようなプロセス、または、形質転換された遺伝子からアンチセンス発現が起こり、その結果天然に存在する型の遺伝子の発現が行われなくなるようなプロセス、を意味する。
【0102】
本明細書で用いられる「形質転換遺伝子」という用語は、それが導入されるトランスジェニック動物または細胞にとって部分的または完全に異種な、すなわち外来の核酸配列、または、それが導入されるトランスジェニック動物または細胞の内在性遺伝子と相同な核酸配列を意味するが、これらは、それが挿入される細胞のゲノムを変化させるような方法で(例えば、天然の遺伝子の位置とは異なる位置に挿入されるか、または、それが挿入されることによりノックアウトが起こる)、動物のゲノムに挿入できるように設計されるか、または、動物のゲノムに挿入される。形質転換遺伝子は、選択核酸の最適な発現に必要な1以上の転写調節配列やその他いかなる核酸(例えばイントロンなど)を含んでもよい。
【0103】
本明細書で用いられる「トランスジェニック動物」とは、いかなる動物、好ましくはヒト以外の哺乳動物、鳥類または両生類であり、この場合、当業界周知のトランスジェニック技術のような人間が介入する方法で導入された異種核酸を上記動物の1以上の細胞に含む。マイクロインジェクションや組換えウイルスでの感染などの方法によって計画的に遺伝子操作して、核酸を細胞の前駆体に導入することによって、直接または間接的に核酸を細胞に導入する。遺伝子操作という用語は、典型的な異種交配、またはインビトロの受精というよりむしろ、組換えDNA分子の導入を指す。このような分子は、染色体に統合されてもよいし、または、染色体外で複製されるDNAであってもよい。本発明で望ましい一般的なトランスジェニック動物において、形質転換遺伝子は、例えば、アゴニスト型またはアンタゴニスト型のいずれかの形態で、細胞にタンパク質の組換え型を発現させる。しかしながら、例えば、以下で説明するFLPまたはCREリコンビナーゼ依存性の構造として、組換え遺伝子がサイレントであるトランスジェニック動物も含まれる。
【0104】
「転写調節配列」とは、本明細書で用いられる総称的な用語であり、それと操作可能に連結されるタンパク質のコーディング配列の転写を誘導または制御するDNA配列(例えば開始シグナル、エンハンサー、およびプロモーターなど)を意味する。好ましい実施形態において、組換えタンパク質遺伝子の転写は、発現が意図された細胞型における組換え遺伝子発現を制御するプロモーター配列(または他の転写調節配列)の制御下で行われる。また、組換え遺伝子も、タンパク質の天然に存在する形態の転写を制御する配列と同じかまたは異なる転写調節配列の制御下にあり得ることも理解されよう。
【0105】
本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、それに連結した他の核酸を移送することができる核酸分子を意味する。好ましいベクターの一つの型としてエピゾームがあり、すなわちエピゾームとは、染色体外での複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、それに連結した核酸の自律的な複製/発現が可能なベクターである。操作可能に連結した遺伝子の発現の指示が可能なベクターとは、本明細書では「発現ベクター」と称する。一般的に、組換えDNA技術で有用な発現ベクターは、多くの場合「プラスミド」の形態であり、プラスミドとは、環状の二本鎖DNAのループであり、それがベクター形態の場合には染色体に結合しない。プラスミドは最も広く用いられる形態のベクターであるため、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられる。しかしながら、本発明では、同等の機能を有し、今後当業界で知られるようになる他の形態の発現ベクターも含むものとする。
【0106】
また「WD−40モチーフ」は、当業界では「β−トランスデューシンリピート」または「WD−40リピート」と呼ばれ、これは、配列の2つの末端(アミノ末端およびカルボキシル末端)において比較的よく保存された一連のアミノ酸を有する約25〜50個の連続したアミノ酸配列と概略的に定義できる(Simon et al., Science 252:802−808 (1991) and Neer et al., Nature 371:297 (1994)で述べられる)。WD−40リピート含有タンパク質の少なくとも1つのWD−40リピートの保存されたセットは、一般的に、特定の位置に保存されたアミノ酸を含む。アミノ末端のセットは、2個の連続したアミノ酸から構成され、多くの場合、Gly、その後にHisを含む。カルボキシル末端のセットは、6〜8個の連続したアミノ酸から構成され、一般的に、その第一の位置にAsp、およびTrp、続いてその最後の2つの位置にAspを含む。WD40リピートを特徴付ける一般式は、{X6〜94−[GH−X23〜41−WD]}Nであり、式中、X6〜94は、6〜94個の連続したアミノ酸残基を示し、X23〜41は、23〜41個の連続したアミノ酸残基を示し、およびNは、4〜8の整数を示す(Neer et al., Nature 371:297 (1994))。しかしながら、他のWD40リピートも当業者により認識できる。特定のタンパク質中のWD−40リピートの数は、2から8以上の範囲であり得る。
【0107】
「全部の溶解物」という用語は、単に細胞を溶解させて溶解物状にする工程の後に、例えば、分画したり、除去したり、付け加えたりする操作を行っていない細胞溶解物を意味する。
【0108】
「亜鉛(zinc)フィンガードメイン」および「亜鉛フィンガーモチーフ」という用語は、以下の一般式で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを単離したペプチド、またはその部分的なペプチドを意味する:一般式C−X2,4−C−X3−[LIVMFYWC]−X8−H−X3,5−H、および/または、一般式C−X2,4−C−X3−F−X5−L−X2−H−X3,4−Hであり、式中、Xは任意のアミノ酸を示す(Prosite PDOC00028)。亜鉛フィンガーのフォールディングは、保存されたシステイン(C)およびヒスチジン(H)残基が結合して四面体状に配置された亜鉛イオンの周りで組織化される(Miller et al. (1985) EMBO J. 4:1609, ’Klug and Rhodes (1987) Trends Biochem. Sci. 12:464)。タンパク質は、その配列中に、ドメインの不完全または減縮されたコピーを含む亜鉛フィンガーモチーフを1つまたは複数含んでもよい。多数の亜鉛フィンガータンパク質が、亜鉛フィンガーを介してDNAと相互作用するDNA結合タンパク質であることがわかっている。
【0109】
3.代表的な核酸および発現ベクター
以下に説明するように、本発明の一つの観点は、GRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、またはsmD3−IPタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸に関し、ここで上記タンパク質としては、例えば、表1〜9に示されたタンパク質、および/またはこのような核酸の等価物である。本明細書で用いられる「核酸」という用語は、断片および等価物を含むように意図される。等価物という用語は、GRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、またはsmD3−IPタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、例えば、他のタンパク質(GRF2シグナル伝達経路の他の成分など)と結合する能力を保持するもの、または、タンパク質が内因性の酵素活性を有する場合は基質に作用するもの、と理解される。同等のヌクレオチド配列とは、1以上のヌクレオチド置換、付加または欠失により異なる配列(例えば対立遺伝子変異体)を含み、従って、例えば遺伝子コードの減縮により、表1〜9で示されたコーディング配列のヌクレオチド配列とは異なるコーディング配列を含む。また等価物は、ストリンジェントな条件下(すなわち、約1Mの塩濃度で形成された二本鎖DNA分子の融解温度(Tm)より約20〜27℃低い条件に等しい)で、表1〜9で示されたコーディング配列のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。DNAハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェント条件としては、例えば、約45℃での6.0×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)、続いて50℃での2.0×SSCによる洗浄が、当業者周知であるか、または、Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1−6.3.6)に記載されている。例えば、洗浄工程における塩濃度は、低いストリンジェンシー(50℃で約2.0×SSC)から、高いストリンジェンシー(50℃で約0.2×SSC)までの範囲から選択できる。加えて、洗浄工程における温度は、低いストリンジェント条件(室温、すなわち約22℃)から、高いストリンジェント条件(約65℃)にかけて増加しうる。一つの実施形態において、等価物は、表1〜9で示されるコーディング配列のヌクレオチド配列から誘導された核酸配列、および、進化的に関連する核酸配列をさらに含む。
【0110】
その上、通常認識されるように、特定の環境下では、本発明に係るGRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質の相同体を提供することが有利な場合があり、当該相同体は、天然に存在する型のタンパク質の生物活性の部分集合だけを促進または阻害するために、アゴニスト(ミメティック)またはアンタゴニストのいずれか一方として限定された能力で機能する。従って、全ての特定のタンパク質の生物活性に向けられたアゴニストまたはアンタゴニストを用いた治療に比べて、限定された機能を有し、より少ない副作用の相同体を用いた治療によって、特定の生物学的な効果を引き出すことができる。例えば、アンタゴニスト型の相同体を生産することができ、当該相同体は、GRF2シグナル伝達経路において他のタンパク質と結合する野生型(「元の(authentic)」)タンパク質の能力を妨害するが、内因性の酵素活性またはその他の複合体を形成する能力(例えば、細胞の他の調節メカニズムに関与し得るような)を実質的に妨害しない。
【0111】
本明細書ではGRF2経路成分ポリペプチドと称されるポリペプチド、例えば、GRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質は、好ましくは、表1〜9に記載のGenBank寄託物で示されるアミノ酸配列の全部または部分に相当するアミノ酸配列を有するか、または、これらタンパク質の一つと相同であり、例えば他のヒトパラログ、または哺乳動物オーソログなどがある。
【0112】
一般的に、GRF2経路成分ポリペプチドの生物活性は、以下に示す1以上の性質によって特徴付けられる:真核細胞、特に哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)の細胞周期を調節する能力;真核細胞の増殖/細胞成長を調節する能力;または、細胞/組織の分化を調節する能力、である。また、本発明に係るポリペプチドは、他の細胞のタンパク質の動作に影響を与えることによって、細胞成長または増殖を調節することができる。GRF2経路成分ポリペプチドは、タンパク質の野生型の機能の特異的なアゴニストでもよく、または、触媒的に不活性な変異体のような特異的なアンタゴニストでもよい。本発明に係るGRF2経路成分の他の生物活性とは、本明細書で説明されるほか、本発明の開示の観点において当業者に十分明白であるものも含まれる。
【0113】
一つの実施形態において、本発明の核酸は、天然に存在する脊椎動物のGRF2経路成分の遺伝子産物のアゴニストまたはアンタゴニストであるポリペプチド(例えば、表1〜9で示されたタンパク質)をコードする。好ましいGRF2経路成分は、表1〜9で示されたアミノ酸配列と同一または相同の成分である。好ましい核酸は、表1〜9で示されたアミノ酸配列と、少なくとも60%相同、より好ましくは70%相同、最も好ましくは80%相同のポリペプチドをコードする。また、GRF2経路成分の活性を有するポリペプチドをコードし、表1〜9で示された配列と少なくとも約90%、より好ましくは少なくとも約95%、および最も好ましくは少なくとも約98〜99%相同な核酸も、本発明の範囲内に含まれる。好ましくは、当該核酸は、表1〜9で示されたヒトGRF2シグナル伝達経路の成分をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むcDNA分子である。
【0114】
また、遺伝子コードが減縮したことによって表1〜9で示されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と異なる単離された核酸も、本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸の数は、1以上のトリプレットで設計される。同じアミノ酸を明示するコドンまたは同義コドン(例えば、CAUおよびCACはヒスチジンの同義コドンである)により、アミノ酸配列またはタンパク質に影響を与えない「サイレント」変異が生じる。しかしながら、本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列に変化を与えないDNA配列多型が、哺乳動物細胞中に存在することが予測される。特定のタンパク質をコードする核酸の1以上のヌクレオチド(ヌクレオチドの約35%まで)のこのような変異が、自然の対立遺伝子変異により、所定の種の個体間で存在することが、当業者には明白である。このようなヌクレオチド変異のいずれかまたは全部、およびその結果生じるアミノ酸多型は、本発明の範囲内である。
【0115】
本発明は、真核細胞から誘導されたGRF2経路成分をコードする核酸に関し、当該核酸は、表1〜9に記載の配列で示されるGRF2経路成分と進化的に関連したアミノ酸配列を有し、ここで「進化的に関連した」とは、自然に生じる(例えば、対立遺伝子変異またはディファレンシャルスプライシングによって)アミノ酸配列を有するGRF2経路成分を意味し、同様に、例えば、コンビナトリアル変異誘発により生じるGRF2経路成分の突然変異体を意味する。
【0116】
また、本発明に係るタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする核酸の断片も本発明の範囲内である。本明細書で用いられる、GRF2経路成分の活性な部分をコードする核酸の断片とは、例えば、表1〜9で示されたタンパク質の完全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より少ないヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、および、完全長タンパク質の生物活性の少なくとも一部を保持するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またあるいは、完全長タンパク質の生物活性のアンタゴニストとして機能的なヌクレオチド配列、を意味する。このような断片は、例えば、当該断片が誘導される完全長タンパク質に適切なものとして、GRF2経路成分と他のタンパク質との相互作用を仲介するドメインを含むポリペプチドを含む。
【0117】
また、本発明の範囲内の核酸は、リンカー配列、改変された制限エンドヌクレアーゼ部位、および、このような組換えポリペプチドの分子クローニング、発現または精製に有用な他の配列を含んでもよい。
【0118】
以下に示される実施例で指示したとおり、GRF2経路成分ポリペプチドをコードする核酸は、本明細書で説明されるプロトコール、同様に一般的に当業者既知のプロトコールに従って、いずれの脊椎生物からのmRNAまたはゲノムDNAから得ることができる。GRF2経路成分ポリペプチドをコードするcDNAは、例えば、細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞からのトータルmRNAを単離することによって得ることができる。続いて、多数の既知の技術のいずれかを用いて、二本鎖cDNAsを上記トータルmRNAから調製し、その後、適切なプラスミドまたはバクテリオファージベクターに挿入することができる。また、GRF2経路成分をコードする遺伝子を、確立されたポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて、本発明で提供されるヌクレオチド配列情報に従いクローニングすることができる。
【0119】
本発明の他の観点は、「アンチセンス」療法における単離された核酸の使用に関する。本明細書で用いられるアンチセンス療法とは、本発明に係るGRF2経路成分の一つをコードする細胞性のmRNAおよび/またはゲノムDNAを含む細胞環境下で特異的にハイブリダイズする(例えば、結合する)オリゴヌクレオチドプローブまたはそれらの誘導体を投与し、または、インサイチュで生成することによって、そのタンパク質の発現を阻害すること(例えば、転写および/または翻訳を阻害することによって)を意味する。結合は、決まった塩基対の相補性によってなされ、または、例えば二本鎖DNAに結合する場合は、ダブルヘリックスの主溝における特異的な相互作用を介して結合が起こる。一般的に、アンチセンス療法とは、当業界で通常用いられる技術範囲を意味し、オリゴヌクレオチド配列への特異的な結合によるいかなる治療も含まれる。
【0120】
本発明のアンチセンス構造(構造)は、例えば、細胞中で転写される場合、GRF2経路成分をコードする細胞のmRNAの少なくとも特有な部分に相補的なRNAを生産する発現プラスミドとして提供される。あるいは、アンチセンス構造は、エクスビボで生成するオリゴヌクレオチドプローブであり、これは、細胞に導入された場合、GRF2経路成分をコードするmRNAおよび/またはゲノム配列とハイブリダイズすることによって発現を阻害する。このようなオリゴヌクレオチドプローブとして好ましくは、内在性ヌクレアーゼ(例えば、エキソヌクレアーゼおよび/またはエンドヌクレアーゼ)に耐性であり、従ってインビボで安定な、改変オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いられる代表的な核酸分子は、DNAのホスホラミデート、ホスホチオエートおよびメチルホスホネート類似体である(米国特許第5,176,996号;第5,264,564号;および第5,256,775号も参照)。加えて、アンチセンス療法に有用なオリゴマーを構築する一般的な方法は、例えば、van der Krol et al., (1988) Biotechniques 6:958−976;およびStein et al., (1988) Cancer Res 48:2659−2668に記載される。
【0121】
従って、本発明の改変オリゴマーは、治療、診断、および研究の環境において有用である。治療用途において、当該オリゴマーは、一般的にアンチセンス療法に適切な方法で利用できる。このような療法のために、全身および局所的または部分的な投与を含む様々な投与様式にあわせて本発明のオリゴマーを配合することができる。通常、技術や配合については、Remmington’s Pharmaceutical Sciences(Meade Publishing Co., Easton、PA)で見出すことができる。全身投与に関しては、注射が好ましく、例えば筋肉注射、静脈注射、腹膜内注射、結節内(intranodal)注射、および皮下注射があり、本発明のオリゴマーは、液体、好ましくは生理学的に適合可能な緩衝液(例えばハンクス液またはリンガー液)に配合することができる。加えて、当該オリゴマーは、固形状で配合され、使用直前に再溶解または懸濁することができる。また、凍結乾燥形態も含まれる。
【0122】
また、経粘膜または経皮の方法で全身投与することができ、また上記化合物を経口的に投与することもできる。経粘膜または経皮投与に関して、関門(barrier)を透過させるのに適した浸透剤が製剤に用いられる。このような浸透剤としては、一般的に当業界で知られており、例えば、経粘膜投与のための胆汁酸塩やフシジン酸誘導体がある。加えて、透過を促進するのに界面活性剤を用いることができる。経粘膜投与は、鼻内噴霧を介して、または、坐剤を用いてなされ得る。経口投与に関して、上記オリゴマーは、従来の経口投与形態、例えばカプセル、錠剤、およびトニックに配合される。局所投与に関して、本発明のオリゴマーは、一般的に当業界で既知の軟膏、軟膏剤(salve)、ゲル、またはクリーム剤に配合される。
【0123】
治療での使用に加えて、本発明のオリゴマーは、診断試薬として用いることができ、当該診断試薬は、上記オリゴマーが特異的に結合するターゲットDNAまたはRNA配列の存在または非存在を検出し、例えば、本発明の遺伝子の発現レベルを決定したり、本発明の遺伝子が遺伝学的な異常を含むかどうかを決定したりできる。
【0124】
本発明の他の観点において、本発明に係る核酸は発現ベクター中に供給され、当該発現ベクターは、目的のGRF2経路成分ポリペプチドをコードし、少なくとも1つの調節配列が操作可能に連結したヌクレオチド配列を含む。「操作可能に連結された」とは、ヌクレオチド配列を発現させるような方法でヌクレオチド配列が調節配列に連結されていることを意味するものとする。調節配列は、技術的に認識されており、GRF2経路成分の活性を有するポリペプチドが発現するように選択される。従って、「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御因子を含む。代表的な調節配列は、Goeddel;Gene Expression Technology:Methods in Enzymology(Academic Press, San Diego, CA (1990))に記載される。例えば、DNA配列が発現制御配列に操作可能に連結された場合、DNA配列の発現を制御するような多様な発現制御配列のいずれもこれらベクター中で用いることができ、それによって本発明のGRF2経路成分をコードするDNA配列を発現する。このような有用な発現制御配列としては、例えば、SV40の初期および後期プロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス前初期プロモーター、lac系、trp系、TACまたはTRC系、T7プロモーター(その発現はT7RNAポリメラーゼにより指示される)、λファージの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質に関する制御領域、3−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素に関するプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター(例えば、Pho5)、酵母のα−交配因子プロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、および、原核細胞もしくは真核細胞またはそのウイルスの遺伝子発現を制御することが知られている他の配列、およびそれらの様々な組み合わせ、が挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞および/または発現が望まれるタンパク質のタイプなどの要素に依存すると理解されるべきである。その上、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、ベクターによりコードされた他のタンパク質(例えば抗生物質マーカー)のいずれかの発現も考慮されるべきである。
【0125】
本発明に係る遺伝子構造を用いて、本発明に係るGRF2経路成分ポリペプチドを培地で増殖させた細胞中で発現させ、例えば、タンパク質またはポリペプチド(精製のための融合タンパク質またはポリペプチドを含む)を生産することができることは、明白である。
【0126】
また、本発明は、1以上の本発明に係るGRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質のコーディング配列を含む組換え遺伝子でトランスフェクトした宿主細胞に関する。当該宿主細胞は、どのような原核または真核細胞でもよい。例えば、本発明のポリペプチドは、微生物細胞(例えばE. coli)、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス発現系を利用)、酵母、または哺乳動物細胞で発現させることができる。他の適切な宿主細胞が当業者既知である。
【0127】
従って、本発明はさらに、本発明に係るGRF2経路成分ポリペプチドを生産する方法に関する。例えば、GRF2経路成分ポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞を、上記ポリペプチド発現を起こすのに適した条件下で培養することができる。上記ポリペプチドは、細胞の混合物やポリペプチドを含む培地から分離・単離することができる。あるいは、上記ポリペプチドが細胞質中に保持される場合、その細胞を回収し、溶解し、そのタンパク質を単離する。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養物に適切な培地は、当業界周知である。上記ポリペプチドは、当業界で知られたタンパク質精製の技術を用いて、細胞培地、宿主細胞、またはその両方から単離することができ、上記精製技術としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動、および、GRF2経路成分の特定のエピトープに特異的な抗体を用いたイムノアフィニティー精製がある。好ましい実施形態において、GRF2経路成分は、その精製を促進するドメインを含む融合タンパク質であり、例えばGRF2経路成分−GST融合タンパク質である。
【0128】
従って、本発明に記載のGRF2経路成分のクローニングで得られたヌクレオチド配列は、上記タンパク質の全部または選択された部分をコードしており、これらは、微生物細胞または真核細胞のプロセスにより上記タンパク質の組換え形態を生産するのに用いることができる。標準的な方法として、ポリヌクレオチド配列を遺伝子構造(例えば発現ベクター)にライゲーションし、および、真核細胞(酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物の細胞)または原核細胞(細菌細胞)のいずれかの宿主へ形質転換またはトランスフェクションする。本発明に従って、類似の方法またはその改変方法を用いて、微生物による方法または組織培養技術で組換えGRF2経路成分、またはその部分を調製することができる。
【0129】
クローニングされた遺伝子またはその部分を、原核細胞、真核細胞のいずれか、またはその両方で発現させるのに適切なベクターにライゲーションすることによって、組換えGRF2経路成分を生産することができる。組換えGRF2経路成分を生産するための発現媒体としては、プラスミドおよび他のベクターがある。例えば、GRF2経路成分の発現に適切なベクターとしては、原核細胞(例えばE. coli)での発現用として、以下の型のプラスミド:pBR322由来プラスミド、pEMBL由来プラスミド、pEX由来プラスミド、pBTac由来プラスミドおよびpUC由来プラスミドがある。
【0130】
酵母中で組換えタンパク質を発現させるための多数のベクターがある。例えば、YEP24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2、およびYRP17は、遺伝子構造をS. cerevisiaeに導入するのに有用なクローニングおよび発現媒体である(例えば、Broach et al., (1983) in Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye Academic Press, p. 83を参照;参照によって本明細書に含まれる)。これらのベクターは、pBR322のoriの存在によりE. coli中で複製でき、および、酵母2μプラスミドの複製の決定基(決定基)によりS. cerevisiae中で複製できる。加えて、薬剤耐性マーカー(例えばアンピシリン)も用いることができる。
【0131】
好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌でベクターの増殖を促進するような原核性の配列と、真核細胞で発現される1以上の真核性の転写単位とを両方含む。真核細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例としては、pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2−dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko−neoおよびpHyg由来のベクターがある。これらのベクターのいくつかを、細菌性のプラスミド(例えばpBR322)からの配列を用いて改変することによって、原核および真核細胞の両方で複製および薬剤耐性セレクションを容易にすることができる。あるいは、ウイルス誘導体、例えば、ウシ乳頭腫ウイルス(BPV−1)、またはエプスタイン−バーウイルス(pHEBo、pREP由来およびp205)も、真核細胞でのタンパク質の一過性発現に用いることができる。他のウイルス性発現系(レトロウイルス性を含む)の例は、以下の遺伝子治療運搬システムの説明で示される。プラスミドの調製や宿主生物の形質転換に用いられる様々な方法は、当業界周知である。原核および真核細胞の両方のための他の適切な発現系、同様に、一般的な組換え方法に関しては、Molecular Cloning A Laboratory Manual(2nd Ed, ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989))の第16章および第17章を参照すること。いくつかの例においては、バキュロウイルス発現系を用いることによって組換えGRF2経路成分を発現させることが説明される。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、pVL由来ベクター(例えば、pVL1392、pVL1393およびpVL941)、pAcUW由来ベクター(例えばpAcUW1)、およびpBlueBac由来ベクター(例えば、β−gal含有pBlueBacIII)がある。
【0132】
完全長GRF2経路成分のカルボキシル末端断片、すなわち短縮された変異体(truncation mutant)の発現が所望の場合、所望の配列を含むオリゴヌクレオチド断片に開始コドン(ATG)を付加し、発現させることが必要である。メチオニンアミノペプチダーゼ(MAP)酵素を用いてN末端のメチオニンの位置を酵素的に開裂することができることは当業界周知である。MAPは、E. coli(Ben−Bassat et al., (1987) J. Bacteriol. 169:751−757)およびSalmonella typhimuriumからクローニングされており、これらは組換えタンパク質でインビトロ活性を有する(Miller et al., (1987) PNAS USA 84:2718−1722)。従って、必要であれば、インビボで、すなわちこのような組換えポリペプチドをMAPを生産する宿主(例えば、E. coliまたはCM89またはS. cerevisiae)中で発現させることによって、または、インビトロで、すなわち精製MAPを用いて(例えば、Miller等の方法で)、のいずれにおいても、N末端メチオニンの除去は達成できる。
【0133】
あるいは、異なるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む融合遺伝子の一部として、上記ポリペプチドに関するコーディング配列を含ませることができる。このタイプの発現系は、例えば、GRF2経路成分の免疫原性の断片を生産したい場合の条件下で有用である。例えば、ロタウイルスのVP6キャプシドタンパク質は、単量体形態またはウイルス粒子形態のいずれかで、ポリペプチドの部分に対する免疫学的な担体タンパク質として用いることができる。GRF2経路成分の部分(それに対する抗体が生産される予定の)に対応する核酸配列は、後期のワクシニアウイルス構造タンパク質に関するコーディング配列を含む融合遺伝子構造に組み入れられ、ビリオン部分としてのタンパク質部分を含む融合タンパク質を発現する組換えウイルスのセットが生産される。また、B型肝炎表面抗原もその役割において同様に用いることができる。同様に、免疫原性を強化するために、GRF2経路成分の部分およびポリオウイルスキャプシドタンパク質を含む融合タンパク質をコードするキメラ構造を製造することができる(例えば、欧州特許公報第0259149号;and Evans et al.,(1989) Nature 339:385;Huang et al., (1988) J. Virol. 62:3855;and Schlienger et al., (1992) J. Virol. 66:2を参照)。
【0134】
ペプチドに基づく免疫化のための複数の抗原ペプチド系が利用でき、この際、所望のGRF2経路成分の部分は、有機化学によりオリゴマー状に分岐したリシンコア上に直接合成されたペプチドから得ることができる(例えば、Posnett et al., (1988) JBC 263:1719 and Nardelli et al., (1992) J. Immunol. 148:914を参照)。また、GRT2経路成分の抗原決定基も、細菌性の細胞により発現および提示され得る。
【0135】
免疫原性を強化するために融合タンパク質を利用することに加えて、融合タンパク質もタンパク質発現を促進するすることが広く認識されている。例えば、本発明のGRF2経路成分を、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質として生成することができる。このようなGST融合タンパク質を用いてGRF2経路成分の精製を簡単にすることができ、例えば、グルタチオンで誘導されたマトリックスの使用を介してなされる(例えば、Current Protocoles in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., (N.Y.:John Wiley & Sons, 1991)を参照)。
【0136】
他の実施形態において、精製リーダー配列(例えば、組換えタンパク質の所望の部分のN末端におけるポリ(His)/エンテロキナーゼ開裂部位配列)をコードする融合遺伝子により、発現された融合タンパク質をNi2+金属樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。その後、エンテロキナーゼで処理して精製リーダー配列を除去し、精製GRF2経路成分を得る(例えば、Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177;and Janknecht et al., PNAS USA 88:8972を参照)。
【0137】
さらに他の実施形態において、相互作用する2種のタンパク質を含むように本発明に係る融合タンパク質を生成することができ、それにより、例えば、タンパク質複合体の共有結合型の変異体(covalent version)が形成される。例えば、本明細書においては、GRF2およびGRF2−IP、NdrおよびNdr−IP、Skb1およびSkb1−IP、pIClnおよびpICln−IP、PP2CおよびPP2C−IP、4.1SVWL2および4.1SVWL2−IP、smD1およびsmD1−IP、またはsmD3およびsmD3−IPポリペプチド部分を含む融合タンパク質が考慮される。特定の例においては、2種の異なるタンパク質間で相互作用が可能なフレキシブルなポリペプチドリンカー配列を含むことが望ましい。
【0138】
融合遺伝子を製造する技術が周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする様々なDNA断片の連結は、従来技術に従ってなされ、すなわち、ライゲーションのために平滑末端とずれた末端(stagger−ended)とを用い、制限酵素消化して適切な末端にし、適切な相補末端で充填し、アルカリホスファターゼ処理して望ましくない連結を防ぎ、および酵素的にライゲーションすることによってなされる。他の実施形態において、融合遺伝子は、DNA自動合成装置などの従来技術によって合成できる。あるいは、遺伝子断片のPCR増幅は、2つの連続した遺伝子断片間の相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いてなされ、その後、アニールすることによってキメラ遺伝子配列が得られる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons:1992を参照)。
【0139】
4.代表的なポリペプチド
また本発明は、単離および/または精製された形態の本発明に係るGRF2経路成分を利用可能にし、当該成分は単離形態であるか、またあるいは、通常タンパク質と結合し得る他の細胞内のタンパク質または当該タンパク質を含む特定の複合体を実質的に含まない。「他の細胞のタンパク質を実質的に含まない」(また「他の細胞のタンパク質」とは、本明細書では「混入タンパク質」ともいう)という用語は、例えば、GRF2経路成分の調製物が、20%未満(乾燥重量で)の混入タンパク質、好ましくは5%未満の混入タンパク質しか含まないことと定義される。本明細書で説明されるクローン化遺伝子を用いて精製された調整物のような、GRF2経路成分ポリペプチドの機能的な形態が初めて調製される。「精製された」とは、ポリペプチドに言及される場合、指定の分子が実質的に他の生体高分子、例えば他のタンパク質(混入タンパク質)の非存在下で存在することを意味する。本明細書で用いられる「精製された」という用語は、好ましくは少なくとも80%(乾燥重量で)、より好ましくは95〜99重量%の範囲、最も好ましくは少なくとも99.8重量%の同じ型の生体高分子が存在することを意味する(しかしながら、水、緩衝液、および他の低分子、特に5000未満の分子量を有する分子は存在してよい)。本明細書で用いられる「純粋な」という用語は、好ましくは、直前で述べた「精製された」と同じ数的限定を有する。「単離された」および「精製された」とは、天然状態の天然物質、または、成分に分離されているが(例えば、アクリルアミドゲルで)純粋な(例えば、混入タンパク質、または、変性剤などのクロマトグラフィー試薬、および、例えば、アクリルアミドまたはアガロースなどのポリマーを含まない)物質または溶液のいずれの状態でもない天然物質はいずれも含まれない。
【0140】
本発明の他の観点は、完全長GRF2経路成分から誘導されたポリペプチドに関する。本発明に係るタンパク質の単離されたペプチジル部分は、このようなポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換えにより製造されたポリペプチドをスクリーニングすることによって得られる。加えて、断片は、従来のMerrifieldの固相によるf−Mocまたはt−Boc化学のような当業界で知られた技術を用いて化学的に合成できる。例えば、本発明に係るタンパク質のいずれか一つは、所望の長さの断片(断片のオーバーラップを含まない)に任意に分割でき、また好ましくは、所望の長さのオーバーラップする断片に分割してもよい。上記断片を製造し(組換えまたは化学合成により)、試験することによって、特異的タンパク質複合体形成の、またはより一般的にはGRF2シグナル伝達経路のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして機能する上記ペプチジル断片を、例えばマイクロインジェクション分析によって同定することができる。
【0141】
治療または予防の有効性、または安定性(例えば、エクスビボでの貯蔵寿命や、インビボでのタンパク分解に対する耐性)を強化する等の目的で、本発明に係るGRF2経路成分の構造を改変することも可能である。このような改変ポリペプチドは、そのタンパク質の天然に存在する形態の少なくとも1つの活性を保持するように設計された場合、本明細書においてより詳細に説明されるGRF2経路成分と同等の機能を有するものと解釈される。このような改変ポリペプチドは、例えば、アミノ酸置換、欠失、または付加によって生産できる。
【0142】
例えば、イソロイシンまたはバリンでのロイシンの単独置換、グルタミン酸でのアスパラギン酸の単独置換、セリンでのスレオニンの単独置換、または、構造的に関連するアミノ酸での同類アミノ酸置換(すなわち、保存的な変異)は、結果生じる分子の生物活性に目立った影響を与えないことが合理的に予想できる。保存的な置換は、側鎖が関連したアミノ酸ファミリー間で起こる。遺伝的にコードされたアミノ酸は、以下の4つのファミリーに分けることができる:(1)酸性=アスパラギン酸、グルタミン酸;(2)塩基性=リシン、アルギニン、ヒスチジン;(3)非極性=アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;および(4)非電荷、極性 =グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンであり、場合によって、これらはまとめて芳香族アミノ酸と分類される。同様の方法で、アミノ酸群を以下のように分類できる:(1)酸性=アスパラギン酸、グルタミン酸;(2)塩基性=リシン、アルギニン、ヒスチジン、(3)脂肪族=グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニンであり、ここでセリンおよびスレオニンは、場合により、脂肪族−ヒドロキシルとして別に分類される;(4)芳香族=フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン;(5)アミド=アスパラギン、グルタミン;および(6)硫黄含有=システインおよびメチオニンである(例えば、Biochemistry, 2nd Ed, ed. by L. Stryer, W.H. Freeman and Co., 1981を参照)。ポリペプチドのアミノ酸配列における変化により機能的な相同体が生じたかどうかは、変異ポリペプチドが野生型タンパク質と同じように細胞中で応答を発生させる能力を評価することによって、容易に調べられる。例えば、このようなGRF2経路成分の変異型を、他のポリペプチド、例えば他のGRF2経路成分と結合する能力に関して評価できる。2以上置換されたポリペプチドは、同じ方法で簡単に試験することができる。
【0143】
さらに本発明は、本発明に係るGRF2経路成分のコンビナトリアル変異体のセット、同様に、短縮された(truncation)変異体を生産する方法を考慮しており、当該方法は特に、GRF2経路成分への結合において機能する可能性のある変異配列(例えば、相同体)を同定するのに有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用し得るGRF2経路成分の相同体、またあるいは、新規の活性を全て共に有するGRF2経路成分の相同体を生産することである。コンビナトリアルで誘導された相同体として、天然に存在するGRF2経路成分に関連する選択的な効力を有する相同体が生産できる。このようなタンパク質を、組換えDNA構造で発現させることによって、遺伝子治療プロトコールに用いることができる。
【0144】
同様に、変異誘発により、対応する野生型タンパク質とは劇的に異なる細胞内の半減期を有する相同体を得ることができる。例えば、変化したタンパク質において、タンパク分解または他の細胞性プロセスに対する安定性を高くさせるか、または、低くさせることが可能であり、それによりGRF2経路成分の破壊あるいは不活性化をもたらす。このような相同体、およびそれらをコードする遺伝子は、そのタンパク質の半減期を調節することによって、GRF2経路成分の発現を変えるのに利用できる。例えば、短い半減期により、より多くの一時的な生物学的効果を生じさせることができ、さらに、誘導性の発現系の場合には、組換えGRF2経路成分の細胞内レベルをより強く制御することができる。上述したように、このようなタンパク質、および、特にその組換え核酸構造は、遺伝子治療プロトコールに用いることができる。
【0145】
同様の方法において、GRF2経路成分相同体は、現在のコンビナトリアル方法により、アンタゴニストとして作用するように生産でき、この場合、上記相同体は、対応する野生型タンパク質がGRF2仲介シグナル伝達を調節する能力を妨害することができる。
【0146】
本発明の方法の代表的な実施形態において、GRF2経路成分相同体の集団に関するアミノ酸配列は並べられ、それにより、好ましくは、可能な最も高い相同性を得ることができる。このような変異体の集団は、例えば、1以上の種から得られた相同体、または、同じ種だが変異のために異なる相同体を含む。並べられた配列の各位置にみられるアミノ酸は、コンビナトリアル配列のディジェネレートセットが得られるように選択される。好ましい実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、それぞれ可能性のあるGRF2経路成分配列の部分を少なくとも含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子のディジェネレートライブラリーを用いて生産される。例えば、可能性のあるGRF2経路成分のヌクレオチド配列のディジェネレートセットが個々のポリペプチドとして、またあるいは、より大きい融合タンパク質のセットとして(例えば、ファージディスプレイのために)発現可能な遺伝子配列に、合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的にライゲーションできる。
【0147】
多くの方法によって、可能性のある相同体のライブラリーが、ディジェネレートオリゴヌクレオチド配列から生産できる。ディジェネレート遺伝子配列の化学合成は、DNA自動合成装置を用いて行うことができ、次に、その合成遺伝子は、発現用の適切な遺伝子にライゲーションできる。遺伝子のディジェネレートセットの目的は、1つの混合物に、可能性のあるGRF2経路成分配列の所望のセットをコードする配列全てを含ませることである。ディジェネレートオリゴヌクレオチドの合成は当業界周知である(例えば、Narang, SA(1983) Tetrahedron 39:3;Itakura et al.,(1981) Recombinant DNA, Proc, 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam:Elsevier pp273−289;Itakura et al.,(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323;Itakura et al.,(1984) Science 198:1056;Ike et al.,(1983) Nucleic Acid Res. 11:477を参照)。このような技術は、他のタンパク質の方向付けられた進化に用いられている(例えば、Scott et al.,(1990) Science 249:386−390;Roberts et al.,(1992) PNAS USA 89:2429−2433;Devlin et al.,(1990) Science 249:404−406;Cwirla et al.,(1990) PNAS USA 87:6378−6382;同様に、米国特許第5,223,409号、第5,198,346号、および第5,096,815号を参照)。
【0148】
あるいは、変異誘発の他の形態をコンビナトリアルライブラリーを生産するのに利用することができる。例えば、GRF2経路成分相同体(アゴニストおよびアンタゴニスト形態の両方)を生産し、スクリーニングによってライブラリーから単離され、ここで当該スクリーニングとしては、例えば、アラニンスキャニングによる変異誘発等を用いたスクリーニング(Ruf et al.,(1994) Biochemistry 33:1565−1572;Wang et al.,(1994) J. Biol. Chem. 269:3095−3099;Balint et al.,(1993) Gene 137:109−118;Grodberg et al.,(1993) Eur. J. Biochem. 218:597−601;Nagashima et al.,(1993) J. Biol. Chem. 268:2888−2892;Lowman et al.,(1991) Biochemistry 30:10832−10838;and Cunningham et al.,(1989) Science 244:1081−1085)、リンカースキャニング変異誘発によるスクリーニング(Gustin et al.,(1993) Virology 193:653 −660;Brown et al.,(1992) Mol. Cell Biol. 12:2644−2652;McKnight et al.,(1982) Science 232:316)、飽和変異誘発によるスクリーニング(Meyers et al.,(1986) Science 232:613)、PCR変異誘発によるスクリーニング(Leung et al.,(1989) Method Cell Mol Biol 1:11−19)、または、化学的な変異誘発などを含むランダム変異誘発によるスクリーニングがある。(Miller et al.,(1992) A Short Course in Bacterial Genetics、CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY;and Greener et al.,(1994) Strategies in Mol Biol 7:32−34)。リンカースキャニング変異誘発は、特にコンビナトリアルのセッティングにおいて、GRF2経路成分の短縮された(truncated)(生物活性)形態を同定するのに魅力的な方法である。
【0149】
点変異および短縮(truncation)により製造されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための方法、その方法に関して、特定の特性を有する遺伝子産物に関してcDNAライブラリーをスクリーニングする方法について、広範な技術が当業界で知られている。このような技術は、通常、GRF2経路成分相同体のコンビナトリアル変異誘発によって生成した遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用できる。大規模な遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く用いられる技術は、一般的に、複製可能な発現ベクターに遺伝子ライブラリーをクローニングし、適切な細胞に形質転換することによりベクターのライブラリーを得て、所望の活性の検出により、生産物がすでに検出されている遺伝子をコードするベクターを比較的簡単に単離させるような条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。以下に説明される各分析例は、コンビナトリアル変異誘発技術により製造された大量のディジェネレート配列をスクリーニングするのに必要なハイスループット分析で処理することができる。
【0150】
スクリーニング分析の実施形態の例を説明すると、本発明に係るタンパク質のいずれか一つの候補のコンビナトリアル遺伝子産物が細胞またはウイルスの表面に表示され、特定の細胞またはウイルス粒子の、他のGRF2経路成分(例えばGRF2または表1〜9で示されたタンパク質)を結合させる能力が「パニング分析(panning assay)」で検出される。例えば、GRF2−IP 変異体のライブラリーを、細菌性の細胞表面膜タンパク質に関する遺伝子にクローニングすることができ(Ladner et al., WO88/06630;Fuchs et al.,(1991) Bio/Technology 9:1370−1371;and Goward et al.,(1992) TIBS 18:136−140)、結果生じた融合タンパク質を、例えばGRF2−IPに結合する蛍光標識された分子(例えばFITCで標識されたGRF2)を用いたパニングによって検出し、可能性のある機能的な相同体に関するスコアを取る。蛍光顕微鏡により細胞を視覚的に観察、分離することができ、また、細胞の形態学が可能であれば、蛍光活性化セルソーターで細胞を分離することができる。前述の説明は、GRF2−IPとGRF2とが関与する相互作用を利用する実施形態に対して向けられているが、例えば、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2、smD1、およびsmD3タンパク質およびその同種の結合パートナーを用いても同様の実施形態が可能であることが理解できる。
【0151】
同様の方法において、上記遺伝子ライブラリーは、ウイルス粒子の表面で融合タンパク質として発現させることができる。例えば、糸状ファージ系において、外来ペプチド配列を感染性のファージの表面上で発現させることができ、それにより2つの顕著な利点が得られる。第一に、これらのファージは非常に高濃度でアフィニティーマトリックスに適用できるため、多数のファージを同時にスクリーニングすることができる。第二に、各感染性ファージがその表面にコンビナトリアル遺伝子産物を表示するため、特定のファージが低い収率でしかアフィニティーマトリックスから回収されなかったとしても、そのファージを感染をさらに行うことによって増幅することができる。殆ど同一のE. coli糸状ファージM13、fd、およびf1のグループがファージディスプレイライブラリーに最も頻繁に用いられるが、これは、ファージgIIIまたはgVIIIコートタンパク質のいずれかも、ウイルス粒子の根本的なパッケージングを破壊することなく融合タンパク質を生成するのに用いることができるためである(Ladner等のPCT出願WO90/02909;Garrard等のPCT出願WO92/09690;Marks et al.,(1992) J. Biol. Chem. 267:16007−16010;Griffiths et al.,(1993) EMBO J 12:725−734;Clackson et al.,(1991) Nature 352:624−628;and Barbas et al.,(1992) PNAS USA 89:4457−4461)。
【0152】
また本発明は、本発明に係るGRF2経路成分の減少を提供することによって、ミメティック、例えば、ペプチドまたは非ペプチド薬剤を生産することができ、当該ミメティックは、元のタンパク質が他の細胞内のパートナーに結合することを模擬できる。また、このような上述の変異誘発技術は、チオレドキシン系も同様に、特に、例えば、本発明に係るタンパク質の相互の結合を含むタンパク質−タンパク質相互作用に関与するGRF2経路成分の決定基のマッピングに有用である。説明すると、基質タンパク質の分子認識に関与するGRF2経路成分に決定的な残基を決定し、それを用いることによって、GRF2経路成分から誘導されたペプチドミメティックを生産することができ、ここで上記ペプチドミメティックは、基質タンパク質に結合し、さらに、GRF2経路成分の結合を抑制することによって、その生物活性を抑制するように作用する。他のポリペプチドとの結合に関与するGRF2経路成分のアミノ酸残基をマッピングするために、例えば、スキャニング変異誘発を用いることによって、ペプチドミメティック化合物を、結合に関与するそれら残基を模擬するように生産できる。例えば、このような残基の非加水分解性のペプチド類似体は、ベンゾジアゼピン(例えば、Freidinger et al., in Peptides:Chemistry and Biology, G.R. Marshall Ed, ESCOM Publisher:Leiden, Netherlands, 1988を参照)、アゼピン(例えば、Huffman et al., in Peptides:Chemistry and Biology, G. R. Marshall Ed, ESCOM Publisher:Leiden, Netherlands, 1988を参照)、置換されたγラクタム環(Garvey et al., in Peptides:Chemistry and Biology, G.R. Marshall Ed, ESCOM Publisher:Leiden, Netherlands, 1988)、ケト−メチレンプソイドペプチド(Ewenson et al.,(1986) J. Med. Chem. 29:295;and Ewenson et al., in Peptides:Structure and Function (9th American Peptides Symposiumの議事録) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985)、β−ターンジペプチドコア(Nagai et al., (1985) Tetrahedron Lett 26:647;and Sato et al.,(1986) J. Chem Soc Perkin Trans 1:1231)、およびβ−アミノアルコール(Gordon et al.,(1985) Biochem Biophys Res Commun 126:419;and Dann et al.,(1986) Biochem Biophys Res Commun 134:71)を用いて生産可能である。
【0153】
5.ヌクレオチドおよびポリペプチド配列の相同性検索
本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、データベース(GenBank、SwissProt、BLOCKS、およびPimaIIなど)に対する問い合わせ配列として用いることができる。これらのデータベースは、すでに同定された注釈付きの配列を含み、BLAST(Basic Local Aligninent Search Toolを表す)を用いて相同性(類似性)領域に関して検索可能である(Altschul S F (1993) J. Mol Evol 36:290−300;Altschul、S F et al (1990) J. Mol Biol 215:403−10)。
【0154】
BLASTにより、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の両方のアライメントを得て、配列類似性を決定することができる。アライメントの位置的な性質により、BLASTは、正確な適合を決定すること、または、原核性(細菌の)または真核性(動物、真菌または植物)の起源由来であり得る相同体を同定することにおいて特に有用である。一次配列パターンおよび二次構造のギャップペナルティーを処理する場合、他のアルゴリズム(例えばSmith、R. F. and T. F. Smith(1992;Protein Engineering 5:35−51)で説明されたアルゴリズム;参照により本明細書に含める)を用いてもよい。本出願で開示したように、配列は、少なくとも49ヌクレオチドの長さであり、不必要な塩基は12%以下である(ここで、A、C、G、またはTではなくNを記録する)。
【0155】
BLAST法は、KarlinおよびAltschulに記載されるように(1993;Proc Nat Acad Sci 90:5873−7;参考により本明細書に含める)、問い合わせ配列とデータベース配列との間の適合を検索することにより、見出された全ての適合の統計学的な有意差を評価し、使用者が選択した有意な閾値を満たすような適合のみが報告される。好ましくは、この閾値は、ヌクレオチドに対しては10〜25、ペプチドに対しては3〜15に設定される。
【0156】
6.代表的な抗体
本発明の他の観点は、GRF2経路成分(例えば表1〜9に列挙されたもの)と特異的に反応する抗体に関する。例えば、本発明に係るタンパク質の配列に基づいたペプチドを用いて、特異的な抗血清またはモノクローナル抗体を標準的な方法により製造できる。哺乳動物(例えばマウス、ハムスターまたはウサギ)を、ペプチド(例えば、抗体応答を惹起できる抗原性断片)の免疫原性形態により免疫化することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を与える技術は、担体への結合、または、当業界周知の他の技術を含む。例えば、本発明に係るタンパク質のいずれか一つのペプチジル部分は、アジュバントの存在下で投与できる。免疫化の進行は、血漿または血清中の抗体のタイターを検出することによってモニターできる。抗原として免疫原を用いて標準的なELISAまたは他のイムノアッセイを行うことによって、抗体レベルを評価することができる。
【0157】
免疫化した後、抗血清を得て、所望であれば、ターゲットタンパク質に対するポリクローナル抗体をさらに血清から単離してもよい。モノクローナル抗体を生産するために、抗体生産細胞(リンパ球)を免疫化動物から回収し、不死化細胞(例えば、ハイブリドーマ細胞を得るためのミエローマ細胞)を用いた標準的な体細胞融合法によって融合させることができる。このような技術は当業界周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術(もとはといえばKohler およびMilsteinにより開発された;(1975) Nature、256:495−497)、同様に、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4:72)、および、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのEBV−ハイブリドーマ技術(Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77−96)がある。ハイブリドーマ細胞は、GRF2経路成分および単離されたモノクローナル抗体と特異的に反応する抗体の生産に関して、免疫化学的にスクリーニングすることができる。
【0158】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、その断片を含むものとし、当該断片はまた、本発明に係るタンパク質または当該タンパク質を含む複合体のいずれか一つと特異的に反応する。抗体は従来技術で断片化でき、さらに、抗体全体について上述したのと同じ方法を利用してスクリーニングできる。例えば、抗体をペプシン処理することによりF(ab’)2断片を得ることができる。得られたF(ab’)2断片を処理して、ジスルフィド架橋を還元し、Fab’断片を得ることができる。本発明の抗体はさらに、二重特異性分子およびキメラ分子、同様に一本鎖(scFv)抗体を含むものとする。
【0159】
本発明に係る抗体は、三量体の抗体およびヒト化抗体を含み、これらは例えば米国特許第5,585,089号で説明されたように調製することができる。また一本鎖抗体も本発明の範囲内である。これら抗体および抗体断片の改変形態の全てを「抗体」という用語に含むものとし、より広い用語「GRF2経路成分結合タンパク質」に含まれる。
【0160】
本発明に係るGRF2経路成分に対して向けられたモノクローナルおよびポリクローナル抗体(Ab)の両方、および抗体断片(例えばFab’およびF(ab’)2)は、個々のGRF2経路成分を選択的にブロックし、それにより細胞周期、細胞増殖、分化および/または生存を調節するのに用いることができる。
【0161】
一つの実施形態において、本発明に係る抗体は、発現ベクター(例えばλgt11、λgtl8〜23、λZAP、およびλORF8)に構築されたcDNAライブラリーを免疫学的にスクリーニングすることに用いることができる。このタイプのメッセンジャーライブラリーは、正しいリーディングフレームと方向で挿入されたコーディング配列を含み、融合タンパク質を生産することができる。例えば、λgt11は、アミノ末端がβ−ガラクトシダーゼアミノ酸配列からなり、そのカルボキシル末端が外来ポリペプチドからなる融合タンパク質を生産する。次に、GRF2経路成分の抗原性エピトープ、例えば表1〜9に列挙されたGRF2経路成分に抗原として関連するタンパク質を、抗体で検出することができ、例えば、感染プレートから持ち上げたニトロセルロースフィルターと、抗GRF2経路成分抗体とを反応させることによって検出される。次に、この分析でスコアを付けたファージを感染プレートから単離できる。このようにして、GRF2経路成分相同体を検出し、他の源からクローニングできる。
【0162】
7.トランスジェニック動物
本発明のさらに他の観点は、GRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質に関する異種遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト動物、または、動物の組織または細胞型の少なくとも一つで、GRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2−IP、smD1−IP、およびsmD3−IPタンパク質をコードする1以上のゲノム遺伝子を破壊したトランスジェニック非ヒト動物を提供する。例えば、1以上の遺伝子座で破壊を受けたトランスジェニックマウスを、例えば相同組換えにより製造することができる。
【0163】
他の観点において、本発明は、誤って発現したGRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2、smD1、およびsmD3タンパク質に関する遺伝子の対立遺伝子を有する発育異常の動物モデルを提供する。例えば、特定の対立遺伝子が欠失したマウス、または、1以上の遺伝子のエキソンの全部または一部が欠失したマウスを飼育できる。このような対立遺伝子変異体がGRF2−IP、Ndr−IP、Skb1−IP、pICln−IP、PP2C−IP、4.1SVWL2、smD1、およびsmD3遺伝子に対して生産される場合、このようなマウスモデルは、GRF2経路の異常調節により発症する病気の研究に用いることができる。
【0164】
従って、本発明は、本発明の形質転換遺伝子を含む細胞(その動物)からなるトランスジェニック動物に関し、好ましくは(ただし場合により)、動物の1以上の細胞で外来性のGRF2経路成分を発現するトランスジェニック動物に関する。GRF2経路成分の形質転換遺伝子は、タンパク質の野生型をコードしてもよいし、または、その相同体(アゴニストおよびアンタゴニストの両方、同様にアンチセンス構造を含む)をコードしてもよい。好ましい実施形態において、形質転換遺伝子の発現は、例えば、所望のパターンに発現を制御するシス作用性配列 を利用して、細胞、組織または発生段階の特定の部分集合に制限される。本発明において、このような本発明に係るタンパク質のモザイク発現は、多くの形態の系列分析に必須であり、加えて、例えば、細胞周期の進行の効果(それにより、異なる正常な胚の組織の小さいパッチにおける発生を大きく改変し得る)を評価する手段を提供する。その結果に対して、組織特異的な調節配列および条件的な調節配列を用いて、特定の空間的なパターンで形質転換遺伝子の発現を制御することができる。その上、例えば、条件的な組換え系または原核性の転写調節配列によって、一時的な発現パターンを提供できる。
【0165】
形質転換遺伝子を発現させるための遺伝子技術は、インビボで部位特異的な遺伝子操作により調節でき、当業者既知である。例えば、遺伝学的システムを、リコンビナーゼ発現(ターゲット配列の遺伝子組換えを触媒する)を調節するのに利用できる。本明細書で用いられる「ターゲット配列」という成句は、リコンビナーゼにより遺伝子組換えされたヌクレオチド配列を意味する。ターゲット配列は、リコンビナーゼ認識配列を端に有しており、通常、リコンビナーゼ活性を発現する細胞中で切除または逆転される。リコンビナーゼで触媒された組換え現象は、ターゲット配列の組換えにより本発明に係るGRF2経路成分ポリペプチドの発現が活性化または抑制されるように設計することができる。例えば、組換えGRF2経路成分の遺伝子の発現を妨害するターゲット配列の切除を設計して、その遺伝子発現を活性化させることができる。このタンパク質発現の妨害は、様々なメカニズムによって生じ、例えば、GRF2経路成分遺伝子をプロモーター要素または内部の停止コドンから空間的に分離することによって生じる。さらに、形質転換遺伝子が形成され、その際、遺伝子のコーディング配列の端にリコンビナーゼ認識配列が置かれ、はじめにプロモーター要素に関して3’から5’への方向で細胞にトランスフェクトされる。このような場合において、ターゲット配列の逆位により、プロモーター要素(転写の活性化を起こすプロモーターを含む)に関する方向にコーディング配列の5’末端を配置させて、本発明に係る遺伝子を再び方向付ける。
【0166】
例示された実施形態において、バクテリオファージP1のCre/loxPリコンビナーゼ系(Lakso et al.,(1992) PNAS USA 89:6232−6236;Orban et al.,(1992) PNAS USA 89:6861−6865)またはSaccharomyces cerevisiae のFLPリコンビナーゼ系(O’Gorman et al.,(1991) Science 251:1351−1355;PCT公告WO92/15694)のいずれを用いても、インビボの部位特異的遺伝子組換え系を製造することができる。Creリコンビナーゼは、loxP配列の間に位置する介在ターゲット配列の部位特異的組換えを触媒する。loxP配列は、Creリコンビナーゼが結合する34塩基対のヌクレオチド反復配列であり、Creリコンビナーゼが仲介する遺伝子組換えに必要である。loxP配列の方向により、Creリコンビナーゼが存在する場合に介在ターゲット配列が切除されるか逆転されるかが決定され(Abremski et al.,(1984) J. Biol. Chem. 259:1509−1514)、すなわち、loxP配列が直接リピートの向きである場合はターゲット配列の切除を触媒し、loxP配列が逆転したリピートの向きである場合はターゲット配列の逆転が触媒される。
【0167】
従って、ターゲット配列の遺伝子組換えはCreリコンビナーゼの発現に依存する。リコンビナーゼの発現を、調節的な制御(例えば、組織特異的、発生段階特異的、外部から添加された薬剤での誘導または抑制)を受けやすいプロモーター要素で調節することができる。このような調節された制御により、リコンビナーゼ発現がプロモーター要素で仲介される細胞においてのみターゲット配列の遺伝子組換えが起こり得る。従って、GRF2経路成分遺伝子の発現の活性化は、リコンビナーゼ発現の調節を介して調節できる。
【0168】
Cre/loxPリコンビナーゼ系を用いて組換えGRF2経路構成タンパク質の発現を調節するために、Creリコンビナーゼと本発明に係るタンパク質との両方をコードする形質転換遺伝子を含むトランスジェニック動物の構築が必要である。Creリコンビナーゼと組換えGRF2経路成分遺伝子の両方を含む動物は、「ダブル」トランスジェニック動物の構築により得られる。このような動物を得る便利な方法は、2種のトランスジェニック動物(それぞれ形質転換遺伝子、例えば、GRF2経路成分遺伝子とリコンビナーゼ遺伝子とを含む)を交配することである。
【0169】
リコンビナーゼの仲介で発現可能な形式でGRF2経路成分の形質転換遺伝子を含むトランスジェニック動物を最初に構築することから得られる利点は、本発明に係るタンパク質がトランスジェニック動物における発現に有害である可能性に由来する。このような場合において、初代集団(全ての組織において本発明に係る形質転換遺伝子がサイレントである)を繁殖させ、維持する。この初代集団の個体は、例えば1以上の組織でリコンビナーゼを発現する動物と交配させることができる。このようにして、初代集団(例えば、アンタゴニスト型のGRF2経路成分の形質転換遺伝子がサイレントである)を形成し、その初代の後代(特定の組織において、または、発生段階で細胞周期調節が破壊されることにより、例えば致死表現型になる)を研究に用いることができる。
【0170】
同様の条件的な形質転換遺伝子を、原核性のプロモーター配列を用いて得ることができ、この際、当該プロモーター配列は、形質転換遺伝子の発現を促進するために、原核性のタンパク質を同時に発現させる必要がある。代表的なプロモーターおよび対応するトランス活性化された原核性のタンパク質は、米国特許第4,833,080号に記載される。その上、条件的な形質転換遺伝子の発現は、遺伝子治療的な方法で誘導され、この場合、トランス活性化タンパク質、例えばリコンビナーゼまたは原核性のタンパク質をコードする遺伝子は組織に運搬され、細胞型に特異的な方法で発現が起こる。この方法により、GRF2経路成分の形質転換遺伝子は、トランス活性化因子の導入によって「開始」されるまで、成人期にサイレントのままでいることができる。
【0171】
代表的な実施形態において、本発明の「トランスジェニック非ヒト動物」は、形質転換遺伝子を非ヒト動物の生殖細胞系に導入することによって製造される。様々な発生段階における胎児性のターゲット細胞を用いて、形質転換遺伝子を導入することができる。胎児性ターゲット細胞の発生段階に応じて、異なる方法を用いる。受精体はマイクロインジェクションのための最良のターゲットである。マウスにおいて、雌性前核は直径約20マイクロメーターの大きさに達するので、1〜2plのDNA溶液を再現性よくインジェクションすることができる。遺伝子トランスファーのターゲットとして受精体を用いることは、殆どの場合インジェクションされたDNAは初めの分割の前に宿主遺伝子に組み込まれるという大きい利点がある(Brinster et al.,(1985) PNAS USA 82:4438−4442)。結果として、トランスジェニック非ヒト動物の全ての細胞が組み込まれた形質転換遺伝子を含むようになる。またこれは、一般的に、生殖細胞の50%が形質転換遺伝子に隣接しているため、形質転換遺伝子の初代の子孫への効率的な伝達に反映される。本発明の実施において、受精体のマイクロインジェクションは、形質転換遺伝子の取り込みのために好ましい方法である。
【0172】
また、レトロウイルスの感染を用いて、形質転換遺伝子を非ヒト動物に導入することができる。発生中の非ヒト胚を、胚盤胞期までインビトロで培養することができる。この期間中、その分割球はレトロウイルスの感染に対するターゲットとなり得る(Jaenich, R. (1976) PNAS USA 73:1260−1264)。効率的な分割球の感染は、酵素処理により透明帯を取り除くことによってなされる(Manipulating the Mouse Enibryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986))。形質転換遺伝子を導入するのに用いられたウイルスベクター系は、一般的に、形質転換遺伝子を有する複製欠損レトロウイルスである(Jahner et al.,(1985) PNAS USA 82:6927−6931;Van der Putten et al.,(1985) PNAS USA 82:6148−6152)。トランスフェクションは、ウイルス生産細胞の単分子層上で分割球を培養することによって容易かつ効率的に達成できる(上記のVan der Putten;Stewart et al.,(1987) EMBO J 6:383 −388)。あるいは、感染は、後期で行ってもよい。ウイルスまたはウイルス生産細胞を胞胚腔に注入してもよい(Jahner et al.,(1982) Nature 298:623−628)。トランスジェニック非ヒト動物を形成する細胞の部分集合においてのみ取り込みが起こるため、初代の殆どは形質転換遺伝子に関してモザイクである。さらに、初代において、形質転換遺伝子の様々なレトロウイルスの挿入は、ゲノム(通常、子孫で分離する)中の異なる位置でなされる。加えて、懐胎中期の胚の子宮内のレトロウイルス感染により、形質転換遺伝子を生殖細胞系に導入することができる(上記のJahner et al.,(1982))。
【0173】
形質転換遺伝子の導入のためのターゲット細胞の第三の型は、胎性幹細胞(ES)である。インビトロで培養された移植前の胚からES細胞を得て、胚と融合させる(Evans et al.,(1981) Nature 292:154−156;Bradley et al.,(1984) Nature 309:255−258;Gossler et al.,(1986) PNAS USA 83:9065−9069;and Robertson et al.,(1986) Nature 322:445−448)。DNAトランスフェクションまたはレトロウイルスが仲介する導入により、形質転換遺伝子を効率的にES 細胞に導入できる。その後、このような形質転換されたES細胞と、非ヒト動物の胚盤胞とを合わせることができる。その後、ES細胞は胚に定着し、生じるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する。参考文献として、Jaenisch, R. (1988) Science 240:1468−1474を参照すること。
【0174】
ノックアウトまたは破壊トランスジェニック動物の作製方法もまた一般的に知られている。例えば、Manipulating the Mouse Embryoを参照すること(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)。また、リコンビナーゼ依存性ノックアウトも製造可能であり、例えば、GRF2経路成分遺伝子の不活性化の組織特異的および/または一時的な制御が上述したように行われるように、相同組換えによりターゲット配列を挿入して製造される。
【0175】
8.GRF2経路成分遺伝子および遺伝子産物の検出
また、本発明のGRF2経路成分で特異的に免疫活性な抗体は、タンパク質発現の存在度およびパターンを評価するために、組織サンプルの免疫組織化学的な染色に用いることができる。体液から単離された組織または細胞における1以上のGRF2経路成分のレベルを検出および評価するために、臨床的な試験方法の一部として、抗GRF2経路成分の抗体を免疫沈降および免疫ブロッティングにおいて診断的に用いることができる。抗GRF2経路成分抗体を用いる診断用分析において、例えば、新生物または過形成性の疾患の初期診断で補助となるように設計されたイムノアッセイ、例えば、サンプル中のガン細胞の存在、例えば、GRF2経路成分遺伝子の発現レベルが改変された細胞を、正常な細胞に対して検出すること、が含まれる。
【0176】
加えて、ヌクレオチドプローブは本発明に係るGRF2経路成分のクローン化配列から製造することができ、それにより、インタクト組織および組織サンプルを、GRF2経路成分をコードした核酸の存在に関して組織学的にスクリーニングすることができる。抗GRF2経路成分の抗体の診断における使用と同様に、GRF2経路成分をコードしたmRNAまたはゲノムGRF2経路成分の遺伝子配列に向けられたプローブの使用は、例えば、新生物または過形成性の疾患(例えば、不要な細胞成長)または不要な分化現象で明白な対立遺伝子変異の予測および治療的な評価のいずれにも用いることができる。
【0177】
抗GRF2経路成分の抗体のイムノアッセイと、ヌクレオチドプローブとを併せて用いることによって、発育障害(GRF2経路成分の発現(またはその欠失)に関連した数々の異常を含む)に対する分子機構の決定を促進することができる。例えば、GRF2経路成分合成における変化と、コーディング配列の変異とを区別できる。
【0178】
一つの実施形態において、本発明の方法は、タンパク質分解、異常細胞増殖および/または分化を特徴とする障害に対するリスクを検体が有するかどうかを決定する方法を提供する。好ましい実施形態において、当該方法は、通常、脊椎動物の検体(好ましくはヒトまたは他の哺乳動物の検体)からの細胞サンプルにおいて、遺伝的な異常の存在または非存在を検出することを含むことを特徴とし、ここで当該遺伝的な異常は、少なくとも以下の(i)または(ii)のいずれか一つを特徴とする:(i)GRF2経路成分の遺伝子の完全性(integrity)に影響を及ぼす変性;または(ii)GRF2経路成分の遺伝子の誤った発現。例証として、このような遺伝的な異常は、少なくとも以下の(i)〜(ix)のいずれか一つの存在を確認することによって検出することができる:(i)GRF2経路成分の遺伝子からの1以上のヌクレオチドの欠失、(ii)1以上のヌクレオチドのGRF2経路成分の遺伝子への付加、(iii)GRF2経路成分の遺伝子の1以上のヌクレオチドの置換、(iv)GRF2経路成分の遺伝子の著しい染色体の配列換え、(v)GRF2経路成分の遺伝子のメッセンジャーRNA転写レベルの著しい変化、(vi)ゲノムDNAのメチル化パターン等におけるGRF2経路成分の遺伝子の異常な修飾、(vii)GRF2経路成分の遺伝子のメッセンジャーRNA転写の非野生型スプライシングパターンの存在、(viii)非野生型のGRF2経路構成タンパク質のレベル、および(ix)GRF2経路構成タンパク質の不適切な翻訳後修飾。以下に示すように、本発明は、GRF2経路成分の遺伝子における異常を検出するための多数の分析技術を提供し、さらに重要なことには、GRF2仲介シグナル伝達依存性の異常な細胞成長、増殖および/または分化の基礎となる様々な分子レベルの原因を識別する能力を提供する。
【0179】
代表的な実施形態において、(精製)オリゴヌクレオチドプローブを含む核酸組成物が提供され、ここで当該オリゴヌクレオチドプローブは、GRF2経路成分の遺伝子(例えば、表1〜9に列挙されたタンパク質をコードする遺伝子)または天然に存在するそれらの変異体、または5’または3’隣接配列、または、本発明に係るGRF2経路成分の遺伝子と自然に結合するイントロン部の配列、または、天然に存在するそれらの変異体など)のセンスまたはアンチセンス配列にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列の領域を含む。細胞の核酸をハイブリダイゼーションに利用しやすいようにし、プローブをサンプルの核酸に晒し、プローブとサンプル核酸とのハイブリダイゼーションを検出する。このような技術を用いて、ゲノムレベルまたはmRNAレベルいずれかにおける異常(欠失、置換等を含む)を検出することができ、同様に、mRNA転写レベルを測定することができる。
【0180】
特定の実施形態において、異常の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(例えば、米国特許第4,683,195号および第4,683,202号を参照)(例えばアンカーPCRまたはRACE PCR)で、またあるいは、ライゲーション連鎖反応(ligation chain reaction)(LCR)(例えば、Landegran et al., (1988) Science 241:1077−1080;and Nakazawa et al.,(1994) PNAS USA 91:360−1364を参照)でプローブ/プライマーを利用することを含み、その後者は、GRF2経路成分の遺伝子における点変異を検出するのに特に有用である。
【0181】
単なる例証的な実施形態において、上記方法は、以下の(i)〜(iv)の工程を含む:(i)患者から細胞サンプルを回収すること、(ii)核酸(例えば、ゲノム、mRNAまたは両方)を前記サンプルの細胞から単離すること、(iii)前記核酸サンプルと1以上のプライマーとを接触させること、ここで当該プライマーは、GRF2経路成分の遺伝子(存在する場合)のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下で、特異的にGRF2経路成分の遺伝子にハイブリダイズする、および(iv)増幅産物の存在または非存在を検出すること、または、増幅産物のサイズを検出し、コントロールサンプルの長さと比較すること。
【0182】
さらに他の代表的な実施形態において、患者のサンプルからのゲノムDNAを、1以上の制限エンドヌクレアーゼ(メチル化に感受性を有し、その認識部位がGRF2経路成分の遺伝子(隣接配列およびイントロン部の配列に含まれる)に存在する)で消化することによって、GRF2経路成分の遺伝子の異常なメチル化パターンを検出することができる。例えば、Buiting et al.,(1994) Human Mol Genet 3:893−895を参照すること。消化されたDNAをゲル電気泳動で分離し、例えば、ゲノムまたはcDNA配列から誘導されたプローブを用いてハイブリダイズする。GRF2経路成分の遺伝子のメチル化状態は、サンプルDNAから得られた制限パターンと、既知のメチル化標準の制限パターンとを比較することによって測定できる。
【0183】
さらに他の実施形態において、診断用分析が提供され、当該分析において、GRF2経路成分の遺伝子産物(例えば生検細胞から単離された)の、他の細胞のタンパク質と結合する能力が検出される。例えば、他のGRF2経路成分または基質タンパク質より高いまたは低い結合親和性で結合するGRF2経路成分の変異体を検出することが望ましい。このような変異体は、例えば、微細な変異、例えば、診断用のDNA配列解析技術や上述したイムノアッセイでは検出不可能な点変異体から生じる。従って、本発明はさらに、診断用のスクリーニング分析を考慮しており、当該スクリーニング分析は、一般的に、1以上のGRF2経路成分の遺伝子をサンプル細胞からクローニングすること、および、組換え遺伝子産物と基質タンパク質、例えば、他のGRF2経路成分との相互作用を検出できるような条件下で、そのクローン化遺伝子を発現すること、を含む。以下に示す様々な薬剤スクリーニング分析の説明から明らかなように、広範な技術を用いて、GRF2経路構成タンパク質が他の細胞成分と結合する能力を決定することができる。
【0184】
また、本発明に係る方法を用いて、充実性腫瘍の検出および/または予後を強化することができ、当該充実性腫瘍としては、例えば組織(これらに限定されないが、卵巣、肺、腸、膵臓、前立腺、精巣、肝臓、皮膚、胃、腎臓、頚部、結腸直腸、ならびに、頭部および首)の癌腫(特に上皮由来の癌腫);黒色腫;および肉腫、例えば、カポジ肉腫および横紋筋肉腫がある。好ましい実施形態において、本発明に係る方法を用いて、悪性または前ガンの上皮ガンを評価できる。
【0185】
また、本発明の診断方法を治療の経過観察として用いることもでき、例えば、GRF2経路成分またはその活性のレベルを定量することにより、現在行われている、または以前に行われたガン治療の有効性、同様に、患者の予後におけるこれらの治療効果を示すことができる。
【0186】
従って、本発明は、血管増殖性の障害の診断および表現形解析を補助するために、細胞のGRF2経路成分のアップレギュレーションを検出するのに利用可能な診断用分析および試薬を作製し、ここで上記血管増殖性の障害は、例えば、細胞の腫瘍化、または他の過形成性または腫瘍性転化プロセス、同様に細胞分化性の疾患、例えば、組織変性(例えば、神経変性)から生じる。
【0187】
9.遺伝子治療
本発明はGRF2仲介シグナル伝達を調節する方法を提供する。従って、本発明は、細胞増殖、分化および/または生存を調節する方法を提供し、当該方法を用いて、例えば、異常な細胞増殖、分化および/または生存に関する病気または状態を治療することができる。本発明の方法によって、GRF2経路成分の治療剤は、異常な細胞増殖、分化および/または細胞の生存に関する病気に罹った被験者に投与される。
【0188】
様々な異常な細胞の血管増殖性の状態に対して、本発明のGRF2経路成分の遺伝子構造、ミメティックおよびアンタゴニストは、異常な細胞増殖を調節する一般的な方法を用いて、治療上の利益を提供することができる。例えば、本発明の遺伝子構造を遺伝子治療プロトコールの一部として用いることによって、例えば、タンパク質が誤って発現している細胞、または、GRF2経路成分上流のシグナル伝達経路が機能障害を起こしている細胞において、GRF2経路成分の機能を再生したり、または、例えば、優性阻害変異体を運搬することによって、野生型タンパク質の機能を阻害したりすることができる。
【0189】
説明すると、おそらくGRF2経路構成タンパク質の機能(または機能障害)に少なくとも部分的に依存する病的または異常な成長を示す細胞型としては、様々なガンや白血病、乾癬、骨疾患、線維増殖性疾患(例えば、結合組織、アテローム性動脈硬化症、および、他の平滑筋の血管増殖性の疾患を含む)、同様に、慢性炎症がある。血管増殖性の疾患に加えて、有糸分裂への異常な再開始による組織の脱分化、または調節タンパク質の障害による不要な分化のいずれかによって生じる細胞分化性の疾患の治療も含む。
【0190】
また、本発明に係るGRF2経路成分(例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト型)またはアンチセンス核酸の遺伝子治療用の構造を一時使用することによって、インビボでの組織の再形成を、例えば、臓器の発生および維持について達成することができることも明白である。本発明に係る遺伝子構造を用いて、異なる細胞に対して血管増殖および細胞分化の可能性を制御することによって、損傷した組織を再形成したり、または、移植および移植組織の形態を改良したりできる。例えば、GRF2シグナル伝達経路のアゴニストおよびアンタゴニストを用いて、物理学的、化学的または病的な傷害を受けた後の臓器を治療的に調節することができる。例えば、遺伝子治療を用いて、部分的な肝切除の後の肝臓を再生したり、または、肺気腫の治療における肺組織の再生を促進したりできる。
【0191】
本発明の1つの観点において、本発明に係るGRF2経路成分の発現構造、または、アンチセンス分子を生産するための発現構造を、生物学的に有効ないずれの担体、例えば、インビボで組換えGRF2経路成分の遺伝子を効果的に細胞にトランスフェクトできるいずれの製剤または組成物として投与することができる。方法は、ウイルスベクター中に本発明に係る遺伝子を挿入することを含み、当該ベクターとしては、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純疱疹ウイルス−1、または、組換え細菌性もしくは真核性プラスミドがある。ウイルスベクターを用いる場合、細胞を直接トランスフェクトすることができ、その一方で、プラスミドDNAを用いる場合、例えば、カチオン性リポソーム(リポフェクチン)、または、誘導された(例えば、抗体が結合した)、ポリリシン包接体、グラマシジンS、人工ウイルスエンベロープまたは他の細胞内の担体など、同様に、遺伝子構造の直接注入、または、インビボで行われたCaPO4沈殿の補助によって運搬することもできる。適切なターゲット細胞の導入は遺伝子治療において重要な第一工程であるため、特定の遺伝子運搬システムの選択は、目的のターゲットの表現型や投与経路(例えば、局所的または全身的)などの要素に依存することが認識できる。
【0192】
インビボで本発明に係るタンパク質のいずれか一つをコードした核酸を細胞に導入する好ましい方法は、核酸(例えば、遺伝子産物をコードしたcDNA)を含むウイルスベクターの使用による方法である。細胞のウイルスベクターの感染は、ターゲット化細胞の大規模な集団が上記核酸を受け取ることができるという利点がある。加えて、ウイルスベクター中にコードされた分子は、例えばウイルスベクターに含まれたcDNAによって、ウイルスベクター核酸を摂取した細胞中で効率的に発現させることができる。
【0193】
一般的に、レトロウイルスベクター およびアデノ随伴ウイルスベクターは、インビボで外来性の遺伝子を特にヒトへ導入するために選択される組換え遺伝子運搬システムであると理解される。これらのベクターにより、遺伝子は細胞へ効率的に運搬され、導入された核酸は宿主の染色体DNAに安定して統合される。レトロウイルスを使用する際の主な必要条件は、特に、細胞集団における野生型ウイルスの拡散の可能性に関して、それらの使用の安全性を確認することである。複製能が欠損したレトロウイルスのみを生産する特殊化した細胞系(「パッケージング細胞」とよばれる)の開発により、遺伝子治療のためのレトロウイルスの有用性が高められ、および、欠損レトロウイルスは、遺伝子治療本発明に係る遺伝子導入のための使用においてよく特徴付けられる(文献として、Miller, A.D.(1990) Blood 76:271を参照)。従って、組換えレトロウイルスを構築して、レトロウイルスのコーディング配列(gag、pol、env)の一部をGRF2経路成分ポリペプチドをコードした核酸で置換し、レトロウイルスの複製を不完全にすることができる。次に、その複製欠損レトロウイルスをビリオンにパッケージングして、標準的な技術によってヘルパーウイルスを用いることによりターゲット細胞を感染させることができる。組換えレトロウイルスを生産するプロトコール、および、インビトロまたはインビボでこのようなウイルスを細胞に感染させるプロトコールは、Current Protocoles in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al., (eds.), John Wiley & Sons, Inc., Greene Publishing Associates, (2001), Sections 9.9−9.14 および他の標準的な実験マニュアルで見出すことができる。適切なレトロウイルスの例としては、pLJ、pZIP、pWEおよびpEMがあり、これらはいずれも当業者周知である。環境栄養性および両栄養性レトロウイルス系の両方を調製するための適切なパッケージングウイルス系の例としては、ΨCrip、ΨCre、Ψ2およびΨAMがある。レトロウイルスは、インビトロおよび/またはインビボで、様々な遺伝子を多くの異なる細胞型に導入するために用いられており、当該細胞型としては、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋原細胞、肝細胞、骨髄 細胞がある(例えば、Eglitis et al.,(1985) Science 230:1395−1398;Danos and Mulligan,(1988) PNAS USA 85:6460−6464;Wilson et al.,(1988) PNAS USA 85:3014−3018;Armentano et al.,(1990) PNAS USA 87:6141−6145;Huber et al.,(1991) PNAS USA 88:8039−8043;Ferry et al.,(1991) PNAS USA 88:8377−8381;Chowdhury et al.,(1991) Science 254:1802−1805;van Beusechem et al.,(1992) PNAS USA 89:7640−7644;Kay et al.,(1992) Human Gene Therapy 3:641−647;Dai et al.,(1992) PNAS USA 89:10892−10895;Hwu et al.,(1993) J Immunol. 150:4104−4115;米国特許第4,868,116号;米国特許第4,980,286号;PCT出願WO89/07136;PCT出願WO89/02468;PCT出願WO89/05345;およびPCR出願WO92/07573を参照)。
【0194】
その上、ウイルス粒子表面上でウイルスパッケージングタンパク質を改変することによって、レトロウイルスの感染範囲、および、レトロウイルスに基づくベクターの結果を制限することができることがわかっている(例えばPCT出願WO93/25234、WO94/06920、およびWO94/11524を参照)。例えば、レトロウイルスベクターの感染範囲を改変する方法としては:細胞の表面抗原に特異的な抗体と、ウイルスenvタンパク質とをカップリングする方法(Roux et al.,(1989) PNAS USA 86:9079−9083;Julan et al.,(1992) J. Gen Virol 73:3251−3255;and Goud et al.,(1983) Virology 163:251−254);または、細胞表面リガンドと、ウイルスenvタンパク質とをカップリングする方法がある(Neda et al.,(1991) J. Biol. Chem. 266:14143−14146)。カップリングとしては、タンパク質または他の変種(variety)で化学的に架橋した形態があり(例えば、ラクトースを用いて、envタンパク質をシアロ糖タンパク質に変換する)、同様に、融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体/env融合タンパク質)を生産することによる方法がある。この技術は、感染を特定の組織型に限定したり、または、方向付けるのに有用であるが、その一方で、環境栄養性ベクターを両栄養性ベクターに変換するのにも用いられる。
【0195】
本発明で有用な他のウイルス遺伝子運搬システムは、アデノウイルス誘導ベクターを利用する。興味のある遺伝子産物をコードするが、その正常な溶菌性ウイルスの生活環において複製する能力を不活化するように、アデノウイルスのゲノムを操作することができる(例えば、Berkner et al., (1988) Bio techniques 6:616;Rosenfeld et al.,(1991) Science 252:431−434;and Rosenfeld et al.,(1992) Cell 68:143−155を参照)。アデノウイルス系のAd5型dl324または他のアデノウイルス系(例えば、Ad2、Ad3、Ad7等)から誘導された適切なアデノウイルスベクターは当業者周知である。組換えアデノウイルスは、特定の環境、すなわち、非分裂細胞には感染しないが、広範な細胞型に感染するのに用いることができる環境において有利であり、ここで当該細胞型としては、気道の上皮細胞(上記のRosenfeld et al.,(1992))、内皮細胞 (Lemarchand et al.,(1992) PNAS USA 89:6482−6486)、肝細胞(Herz and Gerard,(1993) PNAS USA 90:2812−2816)および筋細胞(Quantin et al.,(1992) PNAS USA 89:2581−2584)がある。その上、ウイルス粒子は比較的安定で、精製および濃縮可能であり、さらに、上述したように、感染力の範囲に影響を与えるように改変することができる。加えて、導入されたアデノウイルスDNA(およびそれらに含まれる外来DNA)は、宿主細胞のゲノムに統合されず、エピゾーム状態を維持し、それによって、導入されたDNAが宿主ゲノム(例えば、レトロウイルスのDNA)に統合され得るような状況での挿入突然変異誘発の結果として生じる潜在的な問題を防ぐことができる。その上、アデノウイルスゲノムの外来DNAに対する環境収容力は、他の遺伝子運搬ベクターに比べて大きい(8キロベースまで)(上記のBerkner et al.;Haj−Ahmand and Graham(1986) J. Virol. 57:267)。現在使用されており、従って本発明でも好ましい殆どの複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスのElおよびE3遺伝子の全部または一部を欠損しているが、アデノウイルス遺伝物質の80%を保持する(例えば、上記のJones et al.,(1979) Cell 16:683;Berkner et al.;and Graham et al., in Methods in Molecular Biology, E.J. Murray, Ed.(Humana, Clifton, NJ, 1991) vol. 7. pp. 109−127を参照)。挿入されたGRF2経路成分の遺伝子は、例えば、E1Aプロモーター、主要後期プロモーター(MLP)および関連リーダー配列、ウイルスE3プロモーター、または外部から付加されたプロモーター配列の制御下で発現させることができる。
【0196】
本発明に係るGRF2経路成分の遺伝子の運搬に有用なさらに他のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス(AAV)。アデノ随伴ウイルスは、天然に存在する欠損ウイルスであって、当該ウイルスは、効率的な複製および増殖性の生活環のために、ヘルパーウイルスとして他のウイルス(例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス)を必要とする(文献として、Muzyczka et al., Curr. Topics in Micro. and Immunol.(1992) 158:97−129を参照)。また、アデノ随伴ウイルスは、そのDNAを非分裂細胞に統合させ、高頻度の安定な統合を示すことのできるわずかなウイルス種のひとつである(例えば、Flotte et al.,(1992) AM. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349−356;Samulski et al.,(1989) J. Virol. 63:3822−3828;and McLaughlin et al.,(1989) J. Virol. 62:1963−1973を参照)。AAVの300塩基対しか含まないベクターをパッケージングして、統合させることができる。外来性のDNAのためのスペースは、約4.5kbに制限される。AAVベクター(例えばTratschin et al.,(1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251−3260で説明される)を用いて、DNAを細胞に導入することができる。AAVベクターを用いて、様々な核酸を異なる細胞型に導入することができる(例えば、Hermonat et al.,(1984) PNAS USA 81:6466−6470;Tratschin et al.,(1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072−2081;Wondisford et al.,(1988) Mol. Endocrinol. 2:32−39;Tratschin et al.,(1984) J. Virol. 51:611−619;and Flotte et al.,(1993) J. Biol. Chem. 268:3781−3790を参照)。
【0197】
遺伝子治療で適用されてきた他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、および数種のRNAウイルスから誘導されたものであった。特に、ヘルペスウイルスベクターにより、中枢神経系の細胞および眼の組織で組換えGRF2経路成分の遺伝子を残存させるための特殊な方法を提供できる(Pepose et al.,(1994) Invest Ophthalmol Vis Sci 35:2662−2666)。
【0198】
上述したウイルス導入方法に加えて、非ウイルス的な方法を用いて、動物の組織中でGRF2経路成分を発現させることもできる。遺伝子導入のための非ウイルス的な方法の殆どは、生体高分子の取り込みおよび細胞内の輸送に関する哺乳動物細胞で用いられる正常なメカニズムに頼っている。好ましい実施形態において、本発明の非ウイルス性の遺伝子運搬システムは、ターゲット化細胞による本発明に係るGRF2経路成分の遺伝子の取り込みのための細胞内経路に頼っている。この種の代表的な遺伝子運搬システムとしては、リポゾーム由来のシステム(liposomal derived systems)、ポリリシン包接体、および人工ウイルスエンベロープがある。
【0199】
代表的な実施形態において、GRF2経路成分ポリペプチドをコードする遺伝子は、表面に正電荷を有するリポゾーム(例えば、リポフェクチン)、および(場合によって)ターゲット組織の細胞の表面抗原に対する抗体でタグを付されたリポゾーム(Mizuno et al.,(1992) No Shinkei Geka 20:547 551;PCT出願WO91/06309;日本国特許出願第1047381号;および欧州特許公報EP−A−43075)に捕獲され得る。例えば、神経膠腫細胞のリポフェクションは、神経膠腫関連抗原に対するモノクローナル抗体でタグを付されたリポゾームを用いて行うことができる(Mizuno et al.,(1992) Neurol. Med Chir. 32:873−876)。
【0200】
さらに他の例証的な実施形態において、遺伝子運搬システムは、遺伝子の結合剤(例えばポリリシン)で架橋された抗体または細胞表面リガンドを含む(例えば、PCT出願WO93/04701、WO92/22635、WO92/20316、WO92/19749、およびWO92/06180を参照)。例えば、本発明に係るGRF2経路成分の遺伝子構造を用いて、ポリカチオン(例えば、ポリリシン)に包接された抗体を含む可溶性ポリヌクレオチド担体によりインビボで特定の細胞にトランスフェクトさせることができる(米国特許第5,166,320号を参照)。また、エンドサイトーシスが仲介する本発明に係る核酸構造の有効な運搬を、エンドソーム構造からの遺伝子の逸脱を高める薬剤を用いて促進することができる、ということは明白である。例えば、アデノウイルス全体またはインフルエンザHA遺伝子産物の融合ペプチドを運搬システムの一部として用いて、DNA含有エンドソームの効率的な破壊を誘導することができる(Mulligan et al.,(1993) Science 260−926;Wagner et al.,(1992) PNAS USA 89:7934;and Christiano et al.,(1993) PNAS USA 90:2122)。
【0201】
臨床的な環境において、遺伝子運搬システムを、数多くの方法のいずれか(いずれも当業界でよく知られている)により患者に導入することができる。例えば、遺伝子運搬システムの医薬製剤を、例えば、静脈注射により全身に導入することができ、その構造のターゲット細胞における特異的が導入されるが、このような導入は、主に、遺伝子運搬媒体によって生じるトランスフェクションの特異性、遺伝子発現を制御する転写調節配列による細胞または組織での発現、またはその組み合わせによってなされる。他の実施形態において、組換え遺伝子の最初の運搬は、動物への導入が完全に局在化されるように限定される。例えば、遺伝子運搬媒体をカテーテルによって(米国特許第号5,328,470号を参照)、または、定位注入(stereotactic injection)によって(例えば、Chen et al.,(1994) PNAS USA 91:3054−3057を参照)導入することができる。
【0202】
10.薬物スクリーニング分析
また本発明は、薬物を同定する分析方法を提供し、当該薬物は、正常または異常細胞の増殖および/または分化またはそれに関する疾患の病因論の観点において、本発明に係るGRF2経路成分または当該タンパク質の役割の正常な細胞における機能に対するアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかである。一つの実施形態において、当該分析は、本発明に係るGRF2経路成分のいずれか一つと他のGRF2経路成分との相互作用を阻害する薬剤を検出する。他の実施形態において、当該分析は、GRF2経路成分またはGRF2経路成分複合体の内因性の生物活性、例えば、酵素活性、他の細胞成分への結合、細胞の区画化等を調節する薬剤を検出する。このような調節因子を、例えば、血管増殖性疾患および/または細胞分化性の疾患の治療に用いることができ、さらに、アポトーシスを調節することができる。
【0203】
様々な分析様式を用いられるが、本発明の開示の観点において、本明細書で明確に説明されていない分析様式も当業者によって理解される。タンパク質複合体、酵素活性、さらにGRF2仲介シグナル伝達経路が形成されるような状態に近い分析様式は、無細胞系(例えば、精製タンパク質または細胞溶解産物)に基づく分析、同様に、インタクト細胞を利用した細胞に基づく分析などの多くの異なる形態において可能である。また、簡単な結合分析を用いて、GRF2経路成分の結合、またはGRF2経路成分または複合体の基質への結合を破壊することによって、GRF2仲介シグナル伝達を阻害する薬剤を検出できる。GRF2シグナル伝達阻害剤として作用する能力を試験される薬剤は、例えば、細菌、酵母または他の生物によって製造され(例えば、天然産物)、化学的に製造され(例えば、ペプチドミメティックを含む低分子)、または組換えによって製造される。好ましい実施形態において、試験薬剤としては、約2,000ダルトン未満の分子量を有するペプチドまたはオリゴヌクレオチドのほかには、例えば、低分子の有機分子がある。
【0204】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所定の時間で調査される化合物数を最大化するために、ハイスループット分析が望ましい。本発明の、無細胞系でなされる分析(例えば精製または半精製タンパク質または溶解産物を用いて行われるような分析)は、しばしば「一次」スクリーニングとして行うことができ、この場合、当該スクリーニングにより、試験化合物で仲介される分子ターゲットの変化を迅速に展開し、比較的簡単に検出することができる。その上、一般的に、試験化合物の細胞毒性の効果および/または生物学的利用能は、インビトロ系では無視され、その代わりに、当該分析は、他のタンパク質との結合親和性の変化、または、分子ターゲットの酵素特性の変化に関して明白であるため、主として分子ターゲットにおける薬物の効果に焦点が当てられる。従って、可能性のある調節剤、例えば、GRF2仲介シグナル伝達の活性化剤または阻害剤は、細胞溶解産物中で機能的なGRF2シグナル伝達経路を構成することによって得られる無細胞分析において検出することができる。その代わりの様式において、以下で説明されるように、溶解産物に基づく分析に対して多くの利益を提供する再構成タンパク質混合物として、当該分析を行うことができる。
【0205】
一つの観点において、本発明は、GRF2仲介シグナル伝達を調節する薬物をスクリーニングするのに用いることができる分析を提供する。例えば、本発明の薬物スクリーニング分析は、GRF2シグナル伝達経路の成分の結合を破壊する薬剤を検出できるように設計することができる。他の実施形態において、本発明に係る分析は、GRF2シグナル伝達経路の成分の酵素活性の阻害剤を同定する。好ましい実施形態において、上記化合物は、メカニズムに基づく阻害剤であって、当該阻害剤は、GRF2シグナル伝達経路の成分を化学的に改変し、さらに、上記成分の特異的な阻害剤であり、例えば、阻害定数が相同タンパク質に比べて10倍、100倍、またより好ましくは1000倍異なる阻害剤である。
【0206】
本発明の分析の好ましいインビトロ実施形態において、GRF2シグナル伝達経路は、少なくとも半精製タンパク質の再構成タンパク質混合物を含む。半精製された、とは、他の細胞タンパク質またはウイルスタンパク質から予め分離された再構成混合物において利用されるタンパク質を意味する。例えば、細胞溶解産物と比較して、GRF2仲介シグナル伝達に関与するタンパク質は、混合物中の全ての他のタンパク質に対して少なくとも50%の純度で、より好ましくは90〜95%の純度で混合物中に存在する。本発明に係る方法の特定の実施形態において、再構成タンパク質混合物は、高度に精製されたタンパク質を混合することによって得られ、この場合、再構成混合物が、GRF2仲介シグナル伝達を測定する能力を妨害したり改変したりする可能性のある他のタンパク質(例えば細胞のタンパク質またはウイルス由来のタンパク質)を実質的に含まないようにする。
【0207】
一つの実施形態において、再構成タンパク質混合物の使用により、GRF2シグナル伝達状態をより慎重に制御することができる。その上、GRF2シグナル伝達経路の特定の段階の阻害剤を見出すのに好都合なシステムを引き出すことができる。例えば、再構成タンパク質の分析は、候補薬剤の存在または非存在下の両方で行い、それによってGRF2仲介シグナル伝達の阻害剤を検出することができる。
【0208】
候補の阻害剤の存在および非存在下でのGRF2仲介シグナル伝達の分析は、反応物を入れるのに適切ないかなる容器を用いて行うことができる。例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管がある。
【0209】
本発明の一つの実施形態において、GRF2シグナル伝達経路の成分の結合を妨害する能力に基づいて阻害剤を検出する薬物スクリーニング分析が提供される。代表的な結合分析において、興味のある化合物と、GRF2経路成分ポリペプチドから得られた混合物とを接触させる。例えば、当該混合物は、GRF2と表1で示されるポリペプチドの1以上、pIClnおよび表2で示されるポリペプチドの1以上、Ndrおよび表3A〜Bで示されるポリペプチドの1以上、Skb1および表4A〜Bで示されるポリペプチドの1以上、または、PP2Cおよび表5で示されるポリペプチドの1以上の混合物である。GRF2 シグナル伝達複合体の検出および定量は、上記2種のポリペプチド間での複合体形成を阻害する(または強化する)ことに関する化合物の有効性 を決定するための手段を提供する。上記化合物の有効性は、試験化合物の様々な濃度を用いて得られたデータによる用量反応曲線を作製することによって評価できる。その上、コントロール分析を行い、比較用の基準線を得ることができる。コントロール分析において、複合体の形成は試験化合物の非存在下で定量される。
【0210】
GRF2経路成分ポリペプチドの間またはGRF2経路成分と基質ポリペプチドとの間の複合体形成は、様々な技術によって検出することができ、その技術の多くは事実上上述されている。例えば、複合体形成における調節は、例えば、検出可能な標識タンパク質(例えば、放射標識した、蛍光標識、または酵素的に標識された)を用いて、イムノアッセイ、またはクロマトグラフィーによる検出によって定量することができる。
【0211】
一般的に、ポリペプチドのいずれか一つを固定することが望ましく、それにより、タンパク質のいずれか一つの複合化していない形態から複合体を分離することを容易にし、同様に、分析の自動化に便宜をはかることができる。例証的な実施形態において、タンパク質を不溶性マトリックスに結合させるようなドメインを付加された融合タンパク質が提供される。例えば、GST−GRF2経路成分の融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオン誘導マイクロタイタープレートに吸着させ、次に、可能性のある相互作用タンパク質(例えば、35Sで標識したポリペプチド)および試験化合物を加え、複合体形成を助ける状態のもとでインキュベートすることができる。インキュベーション後、そのビーズを洗浄して、未結合の相互作用タンパク質の全てを除去し、マトリックスビーズに結合した放射標識を直接測定する(例えば、シンチラントに位置するビーズ)、または、例えばマイクロタイタープレートを用いた場合、複合体を解離させた後、上清を測定する。あるいは、未結合のタンパク質を洗浄で除いた後、複合体をマトリックスから解離し、SDS−PAGEゲルで分離し、およびマトリックス結合分画で見出された相互作用するポリペプチドのレベルを標準的な電気泳動技術を用いてゲルにより定量することができる。
【0212】
さらに他の実施形態において、GRF2経路成分および可能性のある相互作用ポリペプチドを用いて、相互作用トラップ分析を行い(または米国特許第5,283,317号;Zervos et al.(1993) Cell 72:223−232;Madura et al.(1993) J Biol Chem 268:12046−12054;Bartel et al.(1993) Bio techniques 14:920−924;and Iwabuchi et al.(1993) Oncogene 8:1693−1696を参照)、その後、互いのタンパク質の結合を破壊する薬剤を検出することができる。
【0213】
特に、当該方法は、ハイブリッドタンパク質を発現するキメラ遺伝子を利用することができる。説明すると、第一のハイブリッド遺伝子は、転写活性因子のDNA結合ドメインのコーディング配列を含み、「ベイト」タンパク質(例えば、可能性のある相互作用タンパク質に結合するのに十分な長さのGRF2経路成分ポリペプチド)のコーディング配列のフレーム中に融合させることができる。第二のハイブリッドタンパク質は、転写活性化ドメインをコードしており、当該転写活性化ドメインは、「魚(fish)」タンパク質(例えば、ベイト融合タンパク質のGRF2経路成分ポリペプチド部分と相互作用するのに十分な長さを有する、可能性のある相互作用タンパク質)をコードする遺伝子のフレームに融合されている。上記ベイトおよび魚タンパク質が相互作用できる場合、例えば、GRF2経路成分複合体を形成する場合、それらは近接した2つの転写活性因子ドメインを生じる。この近接により、転写活性因子に関与する転写調節部位に実施可能に連結したレポーター遺伝子の転写が起こり、レポーター遺伝子の発現を検出し、ベイトおよび魚タンパク質の相互作用を評価するのに用いることができる。
【0214】
本発明に従って、当該方法は、「ベイト」融合タンパク質を宿主細胞に提供することを含み、当該宿主細胞としては、好ましくは酵母細胞、例えば、Kluyverei lactis、Schizosaccharomyces pombe、Ustilago maydis、Saccharomyces cerevisiae、Neurospora crassa、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans、Pichia pastoris、Candida tropicalis、およびHansenula polymorphaがあり、最も好ましくはS cerevisiaeまたはS. pombeである。当該宿主細胞はレポーター遺伝子を含み、当該レポーター遺伝子は、ベイトタンパク質で用いられた転写活性因子のDNA結合ドメインのための結合部位を有し、遺伝子の転写が活性化された場合、レポーター遺伝子は検出可能な遺伝子産物を発現させることができる。第一のキメラ遺伝子は、宿主細胞の染色体に存在してもよいし、発現ベクターの一部として存在してもよい。
【0215】
また、宿主細胞は、宿主細胞で発現させることができる第一のキメラ遺伝子を含む。当該遺伝子は、キメラタンパク質をコードしており、(i)レポーター遺伝子に応答する要素を宿主細胞中で認識するDNA結合ドメイン、および(ii)ベイトタンパク質(例えばGRF2経路成分ポリペプチド配列)を含む。
【0216】
また、第二のキメラ遺伝子が提供され、これは、宿主細胞中で発現させることができ、「魚」融合タンパク質をコードする。一つの実施形態において、魚および第二のキメラ遺伝子の両方を、プラスミドの形態で宿主細胞に導入することができる。しかしながら、好ましくは、第一のキメラ遺伝子は宿主細胞の染色体中に存在し、第二のキメラ遺伝子はプラスミドの一部として宿主細胞に導入される。
【0217】
好ましくは、第一のハイブリッドタンパク質のDNA結合ドメインと、第二のハイブリッドタンパク質の転写活性化ドメインとは、分離可能なDNA結合および転写活性化ドメインを有する転写活性因子から誘導される。例えば、これらの独立したDNA結合および転写活性化ドメインは、酵母GAL4タンパク質で見出されることがわかっており、さらに、酵母GCN4およびADR1タンパク質で見出されることがわかっている。また、転写に関与する他のタンパク質の多くは分離可能な結合および転写活性化ドメインを有し、これらは本発明において有用であり、例えば、LexAおよびVP16タンパク質がある。他の(実質的に)転写不活性なDNA結合ドメインを本発明に係る構造に用いることができ、例えばACE1、λcI、lacリプレッサー、junまたはfosのドメインがあることが理解できる。他の実施形態において、DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインは、異なるタンパク質からでもよい。LexAのDNA結合ドメインを使用することによって、特定の利点が得られる。例えば、酵母において、LexA部分は、活性化機能を含まず、酵母遺伝子の転写になんの既知の影響ももたない。加えて、LexAの使用により、相互作用レベルの分析の感度を制御することができる(例えば、Brent等のPCT出願WO94/10300を参照)。
【0218】
好ましい実施形態において、ベイトまたは魚タンパク質に関するいかなる酵素活性(例えば、優性阻害)が不活性化されており、または、GRF2経路成分他の変異体を用いてもよい。
【0219】
例証的な実施例の続きとして、宿主細胞中で、ベイトおよび魚の融合タンパク質間で、GRF2経路成分が仲介する相互作用が生じ、それによりドメインが活性化され、レポーター遺伝子の転写を活性化することができる。当該方法は、第一のキメラ遺伝子および第二のキメラ遺伝子を宿主細胞に導入し、ベイトおよび魚の融合タンパク質が、レポーター遺伝子が活性化されるのに十分な量で発現される状態のもとに当該細胞をさらすことによって行われる。GRF2経路成分/相互作用タンパク質複合体の形成により、レポーター遺伝子の発現により生産された検出可能なシグナルが生じる。従って、試験化合物の存在下および試験化合物の非存在下の複合体の形成のレベルを、いずれの場合のレポーター遺伝子の発現レベルを検出することによって評価できる。様々なレポーター構造が本発明の方法に従って用いることができ、例えば、検出可能なシグナルを生産するレポーター遺伝子があり、当該検出可能なシグナルは、酵素シグナル、蛍光シグナル、リン光性シグナルおよび薬剤耐性からなる群より選択することができる。
【0220】
本発明の一つの観点は、再構成タンパク質の調製物、例えば、精製タンパク質の組み合わせを提供し、当該組み合わせとしては、GRF2および表1に記載のポリペプチドの1以上、pIClnおよび表2に記載のポリペプチドの1以上、Ndrおよび表3A〜Bに記載のポリペプチドの1以上、Skb1および表4A〜Bに記載のポリペプチドの1以上、または、PP2Cおよび表5に記載のポリペプチドの1以上がある。
【0221】
本発明の分析のさらなる実施形態において、本発明に係る分析をサポートする細胞培養技術の利点を利用して、GRF2シグナル伝達経路を細胞全体で発生させることができる。例えば、以下で説明されるように、GRF2シグナル伝達経路を、真核細胞培養系(哺乳動物や酵母細胞を含む)で構築することができる。インタクト細胞中で本発明に係る分析を行う利点は、阻害剤の治療的使用が必要となり得る環境によりいっそう近い環境で機能的な阻害剤を検出する能力を含み、例えば、薬剤の細胞への侵入を強化する能力がある。その上、例えば以下に示す実施例のような、インビボでの当該分析の実施形態のいくつかは、候補薬剤のハイスループット分析で処理することができる。
【0222】
GRF2シグナル伝達経路の成分は、上記分析をサポートするように選択された細胞に内在するものでもよい。あるいは、当該成分のいくつかまたは全部が外来性の源より誘導されてもよい。例えば、融合タンパク質は、組換え技術(例えば発現ベクターの使用によって)によって細胞に導入してもよいし、同様に、融合タンパク質自身または当該融合タンパク質をコードしたmRNAをマイクロインジェクションすることによって細胞に導入してもよい。
【0223】
いずれの場合においても、GRF2仲介シグナル伝達現象(例えば、GRF2経路成分基質の翻訳後修飾(例えばリン酸化)の調節、GRF2シグナル伝達への応答における遺伝子の転写の調節など)の検出を促進するために、細胞を候補の阻害剤でインキュベートした後に最終的に処理する。再構成タンパク質混合物または溶解産物で行われた分析に関して上述したように、候補の阻害剤の有効性は、GRF2経路成分ポリペプチドの直接的な特徴を測定することによって評価でき、当該測定としては、電気泳動法による分子量の移動、または、結合分析における検出がある。これらの実施形態に関して、一般的に、候補の薬剤でのインキュベーションの終わりに細胞を溶解させ、その溶解産物を、再構成タンパク質混合物または溶解産物(例えば上述した方法)で用いられたのと大体同じ方法で検出工程において操作することができる。
【0224】
また、GRF2シグナル伝達経路の間接的な測定は、GRF2仲介シグナル伝達現象によって調節されたGRF2経路成分に関する生物活性を検出することによって達成することができる。上述したように、GRF2経路成分ポリペプチドを含む融合タンパク質および酵素活性の使用は、本発明に係る分析の代表的な実施形態であり、当該方法において、検出手段は、関連する酵素活性を定量することによってGRF2経路成分ポリペプチドを間接的に測定することによる。
【0225】
プロテインキナーゼ活性の阻害剤の同定
タンパク質キナーゼは、アデノシン三リン酸(ATP)またはグアノシン三リン酸(GTP)からのリンのターゲット化タンパク質への移動を触媒して、リン酸化タンパク質およびアデノシン二リン酸(ADP)またはグアノシン二リン酸(GDP)とをそれぞれ生産する酵素である。ATPまたはGTPは、まず加水分解されて、ADPまたはGDP、および無機リン酸を形成する。次に、無機リン酸はターゲット化タンパク質に付着する。キナーゼによりターゲット化されたタンパク質基質は、構造タンパク質であり、膜成分(例えば細胞壁、または、機能的タンパク質である他の酵素)で見出される。
【0226】
タンパク質キナーゼは、しばしば、それらがリン酸化するアミノ酸残基に基づいて2つのグループに分割される。第一のグループは、いわゆるセリン/スレオニンキナーゼであり、例えば、サイクリックAMPおよびサイクリックGMP依存性タンパク質キナーゼ、カルシウムおよびリン脂質依存性タンパク質キナーゼ、カルシウムおよびカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ、カゼインキナーゼ、細胞分裂周期タンパク質キナーゼ等がある。通常、これらのキナーゼは、細胞質性か、または、できればタンパク質を固定することにより細胞の粒子分画に結合している。
【0227】
第二のキナーゼのグループは、いわゆるチロシンキナーゼであり、チロシン残基をリン酸化する。これらは、かなり少量でしか存在しないが、細胞調節において均一な重要な役割を果たす。これらのキナーゼは数種の受容体を含み、当該受容体は、成長因子やホルモンのような分子に対するものであり、例えば、上皮成長因子受容体、インスリン受容体、血小板由来成長因子受容体等のような分子に対する数種の受容体である。研究が示すところによれば、多くのチロシンキナーゼは、膜貫通型タンパク質であり、その受容体ドメイン(細胞の外側に位置する)およびそのキナーゼドメイン(内側に位置する)を共に有する。
【0228】
本明細書で用いられる「キナーゼ」とは、ATPまたはGTPから基質ポリペプチドへリン酸基を移動させることができる酵素的に活性なポリペプチドを意味する。キナーゼは、単独の未改変ポリペプチドで活性であるか、または、付加的な活性のための因子を必要とすることもあり、当該因子としては、例えば、他のポリペプチド(例えば、サイクリン依存性タンパク質キナーゼに対するサイクリンサブユニットのような結合パートナー)、コファクター(例えば、マグネシウム、マンガン、カルシウムなど)および/または翻訳後修飾(例えば、リン酸化、糖付加など)がある。
【0229】
試験分子がキナーゼ活性を阻害する有効性を評価するためのインビトロ分析は、精製キナーゼポリペプチドまたはポリペプチド複合体を用いて行うことができる。精製キナーゼは、完全長分子の組換え産物、または生物学的に活性なそれらの変異体または誘導体によって得ることができる。組換えポリペプチドを生産する方法は上述したとおりである。キナーゼポリペプチドの組換え産物のための宿主細胞としては、これらに限定されないが、細菌(例えばE. coli)、酵母、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス系を用いた)、哺乳動物細胞、または他の真核細胞がある。複数のサブユニットのキナーゼ複合体のポリペプチド構成要素を、同じ宿主細胞で共に生産することができ、この場合、その宿主細胞は、各ポリペプチドをコードするDNAで共にトランスフェクトされる。キナーゼポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、宿主細胞(または、それらが分泌される場合は、培地)から精製することができ、一般的に、この方法は、各ポリペプチドを、「タグ」配列(例えばヘマグルチニン(「HA」)、His(ヘキサヒスチジンのようなポリヒスチジン)、mycまたはFLAG)と共に発現させ、タグを付されたポリペプチドをアフィニティークロマトグラフィーによって精製することによってなされ、当該アフィニティークロマトグラフィーにおいては、例えば、ポリヒスチジンに対してはニッケルカラムを用い、またはmycまたはFLAGに対してはモノまたはポリクローナル抗体を用いることができる。キナーゼ活性に必要な翻訳後修飾は、生産中に宿主細胞で自然に起こり得るが、精製成分を用いてなされてもよい。例えば、バキュロウイルス発現系を用いた昆虫細胞でのCdk2/サイクリンA共発現により、細胞から活性キナーゼ複合体(すなわち、活性化したスレオニンリン酸化を含む)を単離することができる。あるいは、別々に発現されたCdk2およびサイクリンAポリペプチドを混合して、ATPの存在下でCdk活性化キナーゼまたは「Cak」とインキュベートし、活性化Cdk2/サイクリンAペアを生産することができる。
【0230】
本発明の分析において有用なキナーゼ基質としては、タンパク質、タンパク質断片またはペプチド(Kemp, Design and Use of Peptides Substrates for Protein Kinase. Methods in Enzymology. 200:121−134,(1991))がある。多くのタンパク質キナーゼの基質は、市販されており、例えばヒストンH1は、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼの一般的に用いられる基質であり、および多くの腫瘍遺伝子がチロシン残基でリン酸化されることがわかっている。あるいは、キナーゼ分析で用いることができる基質ポリペプチドを同定するために、各ペプチドが少なくとも1種のセリン、スレオニンおよび/またはチロシン残基を含むペプチドライブラリーを特異性が未知のタンパク質キナーゼの基質として用いることができる(Songyang, Z. et al., Curr. Biol. 4:973−982(1994) and Songyang & Cantley, Methods Mol. Biol. 87:87−98(1998))。簡単に言えば、ペプチドの混合ライブラリーを、ATPの存在下で、タンパク質キナーゼによるリン酸化で処理することができる。次に、リン酸化ペプチドを残りのライブラリーから分離し、配列分析で処理することができる。個々のリン酸化ペプチドは、その後のキナーゼ分析の基質として用いることができ、また、そのキナーゼに対するコンセンサス基質配列を、上記キナーゼの基質として作用し得るライブラリーからの全てのペプチドの分析に基づいて決定することができる。
【0231】
一般的に、タンパク質キナーゼ活性を測定する方法は、放射性の検出方法に基づく。このような方法において、興味のあるキナーゼを含むサンプルを、γ−32P−ATPまたはγ−32P−GTPの存在下で、活性化剤および基質とインキュベートする。しばしば、一般的で廉価な基質(例えばヒストンまたはカゼイン)が用いられる。適切なインキュベーション期間の後、反応物を保存し、ゲル電気泳動によって、または、フィルターに基質を結合させることによってリン酸化基質と遊離のリン酸とを分離し、洗浄して過剰な放射活性標識された遊離のATPを除去する。基質に取り込まれた放射標識されたリン酸の量は、シンチレーション計数またはリン光イメージ分析によって測定できる。あるいは、基質のリン酸化は、ホスホセリン、ホスホスレオニンまたはホスホチロシン残基に特異的な抗体(例えば、抗ホスホセリン、Sigma#P3430;抗ホスホスレオニン、Sigma#P3555;および抗ホスホチロシン、Sigma#P3300)を用いた免疫蛍光法によって検出できる。
【0232】
代表的な実施形態において、キナーゼ活性の阻害剤である薬剤を同定するための分析は、溶液中で行われる。活性キナーゼは、ガンマ標識されたATP(例えば32P−ATP)と、基質(例えばヒストンH1、カゼインなど)と、および試験分子と混合され、これらは、同時または連続的に溶液に加えられる。インキュベーション期間の後、基質を単離し、基質が含む標識の量を分析する。
【0233】
一つの好ましい分析は、「シンチレーション近接アッセイ」または「SPA」(Cook, Drug Discovery Today, 1:287−294(1996))とよばれ、当該分析において、ビオチン化基質(例えばヒストンH1または網膜芽腫ペプチド)をストレプトアビジンでコーティングされた非多孔質性ビーズに付着させ、シンチレーション液で充填される。マイクロタイタープレート(例えば96ウェルプレートまたは384ウェルプレート)を用いて、上記ビーズを、活性キナーゼ、ガンマ標識されたATPおよび試験分子とインキュベートすることができる。放射標識したリン酸基が活性キナーゼの活性を介して基質へ移動したら、放射性のリン酸基により放出されたフォトンをシンチレーションカウンターを用いて記録する。キナーゼ活性を阻害するのに有効な試験分子を含むウェルにおいて検出される放射性の計測数は、コントロールウェルに比べて少ない。
【0234】
また、他のインビトロ分析で処理して、試験分子を評価することができる。このような分析の一つにおいて、基質をマイクロタイタープレートのウェルに付着させ、続いて、活性ホロ酵素複合体、ガンマ標識されたATP(または他の適切な検出因子)および試験分子を連続的または同時に加えることができる。短時間のインキュベーション(秒〜分単位)の後、その溶液を各ウェルから除去してプレートを洗浄し、次に、キナーゼ活性により基質に付加された標識されたγリン酸の量を測定することができる。
【0235】
これらの分析の他のバリエーションは、当業者に明白である。例えば、基質は、ビーズ、あるいはその代わりに各ウェルの底部にに付着させることができる;次に、当該ビーズを、試験分子、標識されたATP、および活性ホロ酵素複合体と共にインキュベーションした後、溶液から除去し、次に、基質に取り込まれた標識の量を測定することができる。
【0236】
一般的に、各タイプの分析において、試験分子は濃度の範囲にわたり評価され、および、一連の適切なコントロールは結果を評価する上での正確さを求めるために用いられる。いくつかの場合において、「相乗」効果の可能性を分析するために、2以上の試験分子を一緒に評価することが有用である。
【0237】
他の実施形態において、キナーゼが基質をリン酸化する能力を阻害する試験薬剤の能力は、基質分子の活性を測定することによって達成できる。例えば、基質分子がキナーゼによってリン酸化に関して活性化される場合、基質分子の活性は、キナーゼの活性を測定するための手段として分析される。キナーゼと試験分子とをインキュベートした際に、基質の活性化のレベルが減少すれば、キナーゼ阻害剤である可能性を示す。例えば、分析は、以下に示すような分析によって行うことができ、すなわち、基質による細胞性の第2メッセンジャー(例えば、細胞内のCa2+、ジアシルグリセロール、IP3など)の誘導を検出することによって、基質の触媒性/酵素活性を検出することによって、レポーター遺伝子(検出可能なマーカー(例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)をコードする核酸に操作可能に連結された基質応答性の調節要素を含む)の誘導を検出することによって、または、ターゲットが調節する細胞応答を検出することによって、分析を行うことができる。
【0238】
ホスファターゼ活性の阻害剤の同定
タンパク質ホスファターゼ活性の決定は、リン酸化された基質から遊離した32Pを定量することによって決定することができる(例えば、Honkanen et al., J. Biol. Chem. 265:19401−04(1990);Honkanen et al., Mol. Pharmacol. 40:577−83(1991);and Critz and Honkanen, NeuroProtocoles 6:78−83(1995)を参照)。一般的に、ホスファターゼ分析は、ホスファターゼと32Pで放射標識した基質とを混合することによって行うことができる。次に、遊離した32Pを残存した放射標識した基質から分離し、上清中の放射活性レベルをシンチレーション計測によって測定する。例えば、GSTが融合した放射標識した基質を、ホスファターゼとインキュベートすることができる(Tonks et al., J. Biol. Chem. 263:6731−6737(1988))。次に、その基質をグルタチオンアガロースビーズを用いて反応物から分離する。次に、上清中に残存した放射活性の量を用いて、ホスファターゼ活性レベルを定量することができる。あるいは、放射標識した基質とホスファターゼとをインキュベートした後、その反応物をSDSゲルを用いて分離し、遊離した32Pを残存した放射標識した基質から分離することができる。未処理の基質と比較した基質における放射活性の減少は、ホスファターゼ活性レベルの決定に用いることができる。放射標識した基質の定量は、ゲル上のバンドを切り出し、シンチレーション計測するか、または、リン光イメージ分析によって測定することができる。
【0239】
本発明の分析において有用なホスファターゼ基質としては、リン酸化タンパク質、タンパク質断片、ペプチドまたは人工基質がある。ホスファターゼ分析のための代表的な基質としては、これらに限定されないが、p−ニトロフェニルホスフェート、リン酸化リゾチーム(例えば、ホスホチロシン還元カルボキシアミドメチル化およびマレイル化リゾチーム(RCML)およびホスホセリン(RCML))、リン酸化ミエリン塩基性タンパク質、チロシンリン酸化EGFRペプチド(DADEpYLIPQQG)、チロシンリン酸化v−ablペプチド(EDNDYINASL)、リン酸化p42mapkなどがある(Tonks, NK et al., J. Biol. Chem. 263:6731−6737(1988);Zhang, Z−Y et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4446−4450(1993);Charles, CH et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5292−5296(1993);Hannon, GJ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1731−1735(1994);およびZhang, Z Y, J. Biol. Chem. 270:16052−16055(1995))。
【0240】
ホスファターゼ阻害剤を決定するために、リン酸化基質の付加の後、または、それと同時に、試験分子をホスファターゼ分析に加えることができる。ホスファターゼ活性レベルを測定し、試験分子非存在下での活性のレベルと比較する。遊離した32Pの量が減少していれば、または、基質における放射活性が減少していれば、試験分子がホスファターゼ阻害活性を有することが示される。既知のホスファターゼ阻害剤(例えばオカダ酸)の付加は陽性コントロールとして用いることができる。
【0241】
メチルトランスフェラーゼ活性の阻害剤の同定
メチルトランスフェラーゼ活性は、ドナー基質とアクセプター基質との間での放射標識したメチル基の移動を測定することによって決定できる。例えば、[3H]AdoMet(NEN catalog No. Net115)を、アクセプター基質およびメチルトランスフェラーゼと共に、ドナー基質と混合することによって分析することができる。インキュベーション後、ドナー基質をろ過することによって、または、SDSゲルで分離することによって反応物から分離する。次に、取り込まれた[3H]メチルの量を、シンチレーション計数によって、または、リン光イメージ分析によって測定する。検出された放射活性の量は、メチルトランスフェラーゼ活性に比例する。本発明の分析において有用なメチルトランスフェラーゼのアクセプター基質としては、核酸、例えば、RNAまたはDNAのオリゴヌクレオチド、特に少なくとも1つのシトシン(C)ヌクレオチドを含む上記オリゴヌクレオチドがある(Smith, SS, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4744−4748(1992))。
【0242】
メチルトランスフェラーゼ阻害剤を決定するために、アクセプター基質の添加の前に、またはと同時に、試験分子をメチルトランスフェラーゼ分析に加えることができる。メチルトランスフェラーゼ活性のレベルを測定し、試験分子非存在下での活性のレベルと比較する。アクセプター基質に取り込まれた[3H]メチルの量が減少していれば、試験分子はメチルトランスフェラーゼ阻害活性を有することが示される。
【0243】
他の実施形態において、GRF2経路成分ポリペプチドの生物活性は、ターゲット化細胞の表現型の変化をモニターすることによって評価できる。例えば、検出手段は、転写調節要素を含むレポーター遺伝子構造であってもよく、ここで当該転写調節要素は、いくつかの形態で、GRF2経路成分またはGRF2経路成分の基質タンパク質のレベルに依存する。GRF2経路成分は、レポーター遺伝子構造のDNA要素に結合するドメインを有する融合タンパク質として提供され得る。付加された融合タンパク質のドメインは、そのDNA結合能力によって、レポーター遺伝子の転写を増加または減少させるドメインであり得る。いずれの場合においても、融合タンパク質中に上記ドメインが存在することによって、レポーター遺伝子をGRF2仲介シグナル伝達経路に応答させることができる。従って、レポーター遺伝子の発現レベルは、GRF2経路成分の発現レベルに応じて変化する。
【0244】
レポーター遺伝子産物は、検出可能な標識であって、例えばルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼであり、これらは無傷の細胞中で生産される。その後の細胞の溶解物において、標識を測定することができる。しかしながら、溶解工程を省略することが好ましく、一般的に、標識を測定するために細胞溶解工程を用いることは、標識の検出が細胞全体中で達成できない場合においてのみ用いられることが好ましい。
【0245】
その上、本発明に係る分析の細胞全体の実施形態において、レポーター遺伝子構造は、発現の際に選択可能なマーカーを提供することができる。レポーター遺伝子は、検出可能な遺伝子産物(RNAまたはタンパク質であり得る)を発現するいずれの遺伝子を含む。好ましいレポーター遺伝子は、容易に検出可能なものである。また、レポーター遺伝子は、融合遺伝子の形態で構造に含ませることができ、ここで当該融合遺伝子は、所望の転写調節配列を含むか、または、他の望ましい特性を示す遺伝子を有する。例えば、レポーター遺伝子の生産物は、抗生物質または他の薬物に対する耐性を付与する酵素、または、宿主細胞における欠陥を補足する酵素(すなわち、チミジンキナーゼまたはジヒドロ葉酸レダクターゼ)であり得る。説明すれば、細菌性のトランスポゾン遺伝子Tn5 neoでコードされたアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼを、細胞中に存在するGRF2経路成分ポリペプチドのレベルに応答するプロモーター要素の転写調節下に置いてもよい。このような本発明に係る分析の実施形態は、特にハイスループット分析で処理することができ、この場合、GRF2仲介シグナル伝達経路の阻害として細胞増殖を簡単に測定できる。
【0246】
レポーター遺伝子の他の例としては、これらに限定されないが、CAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)(Alton and Vapnek(1979), Nature 282:864−869)ルシフェラーゼ、および他の酵素検出系、例えばβ−ガラクトシダーゼ;ホタルのルシフェラーゼ(deWet et al.(1987), Mol. Cell. Biol. 7:725−737);細菌性のルシフェラーゼ(Engebrecht and Silverman(1984), PNAS 1:4154−4158;Baldwin et al.(1984)、Biochernistry 23:3663−3667);アルカリホスファターゼ(Toh et al.(1989) Eur. J. Biochem. 182:231−23 8, Hall et al.(1983) J. Mol. Appl. Gen. 2:101)、ヒト胎盤で分泌されるアルカリホスファターゼ(Cullen and Malim(1992) Methods in Enzymol. 216:362−368)がある。
【0247】
レポーター遺伝子からの転写量は、当業者既知の適切な方法のいずれかを用いて測定することができる。例えば、特異的なmRNA発現は、ノーザンブロットを用いて検出することができ、または、特異的なタンパク質産物は、特徴的な染色、ウェスタンブロットまたは内因性の活性により同定することができる。
【0248】
好ましい実施形態において、レポーター遺伝子産物は、その産物と結合する内因性の活性によって検出される。例えば、レポーター遺伝子は、酵素活性によって色、蛍光、または発光に基づく検出シグナルを生じる遺伝子産物をコードし得る。
【0249】
次に、レポーター遺伝子の発現量と、試験化合物非存在下の同じ細胞の発現量とを比較するか、または、レポーター遺伝子の発現量と、GRF2仲介シグナル伝達経路成分を含まない実質的に同一な細胞における転写量とを比較することができる。
【0250】
11.実施例
以上、本発明を一般的に説明したが、以下の実施例を参照することによって本発明をより容易に理解することができ、当該実施例は、本発明の特定の観点および実施形態を単に説明する目的のためであって、本発明を限定する意図はない。
【0251】
実施例1:GRF2相互作用タンパク質の同定
細胞性プロセスにおけるGRF2シグナル伝達経路およびその役割をよりよく理解するために、共免疫沈降反応実験を反復して行い、GRY2シグナル伝達に関与するタンパク質−タンパク質相互作用を綿密にまとめた。以下で説明される実験において、エピトープタグを付したマウスGRF2の誘導体(Flag−GRF2)を用いて、ヒト胚の腎臓上皮細胞(HEK293)からGRF2関連タンパク質を単離した。Flag−GRF2関連タンパク質を、SDS−PAGEで分離したトリプシン消化タンパク質をマススペクトロメトリー分析することによって同定した。この方法によって、ヒトタンパク質pICln、Ndr、Skb1およびPP2Cを含むこれらヒト細胞から回収されたGRF2と結合する様々なタンパク質が見出された。次に、同様の実験でこれらタンパク質をベイトとして用いて、これらGRF2相互作用タンパク質と結合するタンパク質を単離した。
【0252】
免疫沈降反応
Flag−エピトープタグを付したマウスRas−GRF2発現ベクターおよびヒト293細胞由来の細胞系クローン13(またはcl.13)およびクローン21(またはcl.21)(これらはマウスFlag−Ras−GRF2(GRF2)を安定して発現する)は、Fam等(12)で説明される。Flag−Ras−GRF2タンパク質(GRF2)を一時的に発現させるため、ヒト胚腎臓細胞系293を、リポフェクトアミンプラス(Gibco−BRL)を用いてトランスフェクトした。48時間(hまたはhr)後、トランスフェクトされた細胞(約1×108細胞)をトリス−塩類液(25mMのトリス−HCl(pH7.5)、140mMのNaCl、8mMのKCl、700μMのNa2HP04、5.5mMのグルコース)で洗浄し、リシスバッファー(KLB、20mMのトリス−HCl(pH7.5)、150mMのNaCl、1%のNP40、0.5%のデオキシコール酸ナトリウム、および0.2mMのAEBSF(4−(2−アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオライド))で溶解させた。続いて、遠心分離して不溶性物質を除去し、澄んだ溶解産物を、セファロース−4B(溶解産物1mlにつき10μlの充填セファロース)で、穏やかに混合しながら(転倒させることにより)40℃で20分間インキュベートした。次に、その上清を、固定化抗Flagモノクローナル抗体(M2−アガロース、Sigma−Aldrich;溶解産物1mlにつき1μlの充填M2−アガロース)を用いて、穏やかに混合しながら4℃で60分間インキュベートした。上記M2−アガロースを1mlのKLBを含まないAEBSFで2回洗浄し、1mlの50mMの重炭酸アンモニウムで1回洗浄した。M2−アガロースからのFlag−Ras−GRF2および関連タンパク質を特異的に溶出するために(競合させることにより)、M2−アガロースビーズを、50mMの重炭酸アンモニウム(400μg/mlのFlagペプチド(Sigma−Aldrich)を含む)で再懸濁した。4℃で30分経過した後、M2−アガロースビーズを遠心分離によって除去し、溶出したタンパク質を真空遠心分離により凍結乾燥させ、SDS−PAGEサンプル緩衝液に再懸濁した。
【0253】
FLAG−pICln、FLAG−Ndr、FLAG−Skb1およびFLAG−PP2C融合タンパク質を用いた共免疫沈澱反応実験を、GFR−2タンパク質に対して上述したように行った。FLAG−Ndrの免疫沈降は、オカダ酸(ホスファターゼ阻害剤)で処理した細胞を用いて、または、FLAG−Ndr(K118A)変異融合タンパク質(Ndrのキナーゼ不活性型)を用いて、行った。FLAG−Skb1の免疫沈降は、共発現GRF2または非共発現GRF2のいずれかの細胞で行われた。
【0254】
サンプル調製およびSDS−PAGE分析
再懸濁されたサンプルを最終濃度1×SDSのサンプル緩衝液(pH8.8に調節)中で沸騰させた。次に、このサンプルを1%アクリルアミド(Fisher)を含むように調整し、23℃で1時間インキュベートした。4〜15%のアクリルアミド−トリス−HClグラージェントゲルを用いたSDS−PAGE(BioRad)でサンプルを分離した。そのゲルをまず製造者説明書に従ってGELCODEブルー染色試薬(Pierce)で染色した。クローン13で誘導された細胞溶解物からのM2免疫沈降物に特有な染色されたタンパク質バンドを単離し、マススペクトロメトリーによる分析のために調製した(次の章を参照)。次に、そのゲルをShevchenko 96で説明された方法(ただし以下の点で異なる:50%エタノール、10%酢酸で固定し、50%エタノールですすぎ、0.0004%チオ硫酸ナトリウムを現像溶液に加え、および反応を1%酢酸中で止めた)に従って銀染色した。クローン13で誘導された細胞溶解物からのM2免疫沈降物に特有な銀染色されたバンドを単離し、マススペクトロメトリーによる分析のために調製した。
【0255】
マススペクトロメーター分析のためのサンプル調製
ゲル内消化およびペプチド抽出を、Shevchenko 96に従って行った(ただし以下の点で異なる:システインをアクリルアミドで改変し(上述したとおり)、そのため、DTT還元およびヨードアセトアミド工程を省略した)。簡単に言えば、そのゲルスライスを重炭酸アンモニウムで洗浄し、次に、100%アセトニトリルで脱水した。そのゲルスライスを氷上で消化用緩衝液(50mMの重炭酸アンモニウム、5mMのCaCl2、および12.5ng/μlのトリプシンを含む)(Boehringer MannheimまたはPromega)を用いて元に戻し、トリプシンを含まない消化用緩衝液で37℃で一晩インキュベートした。20mMの重炭酸アンモニウムを1回交換して、さらに、50%アセトニトリル中の5%ギ酸を2回交換して、ペプチドを抽出した。サンプルを真空遠心分離で量が10μlになるまで濃縮した。
【0256】
結果
GRF2経路成分相互作用タンパク質
FLAG−GRF2免疫沈降実験で得られたタンパク質の、代表的なクーマシーブルーおよび銀で染色されたゲルを図2に示す。これらタンパク質を上記ゲルから単離し、上述したマススペクトロメトリー分析により同定した。
図3Aおよび3Bに、FLAG−Ndr(オカダ酸存在下で)免疫沈降実験から単離されたポリペプチドの代表的なスペクトルを示す。BLAST分析を用いて、これらのポリペプチドをスピンドリンタンパク質の断片と同定した。
図4Aおよび4Bに、FLAG−Ndr(オカダ酸存在下で)免疫沈降実験から単離されたポリペプチドの代表的なスペクトルを示す。BLAST分析を用いて、これらのポリペプチドがEST705582のコーディング配列を含むことを同定した。この新規のタンパク質は、MOB様タンパク質に対する相同性を有する。
【0257】
図5に、EST6593318およびEST5339315のコーディング配列を含むタンパク質の完全長タンパク質配列を示す。当該タンパク質を同定するのに用いられたペプチドを一重下線で、または隣接ペプチドを二重下線で示す。完全長cDNAを、EST6593318の5’末端に特異的なプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いたPCR増幅でクローニングした。予想タンパク質は、分子中央に6個のWD40リピートと、特有なNおよびC末端配列とを含む。
【0258】
図6に、MOB関連タンパク質(EST705582またはEST8922671のコーディング配列を含む)およびスピンドリンのタンパク質配列を示す。タンパク質同定に用いられた5種のペプチドを下線で示した。
図7に、本発明で同定されたMOB関連タンパク質(図中、上部の7配列)と、S. cerevisiaeおよびS. pombeのMOB1タンパク質とを比較したアライメントを示す。
図8は、図7のMOB関連タンパク質の関係を示す系統樹である。
【0259】
GRF2と相互作用することが同定されたタンパク質の概要を表1に示す。GRF2は、様々なタンパク質と相互作用し、例えば、シグナル伝達経路および細胞周期調節(Skb1、NdrおよびPP2C、機能が未知のタンパク質(EST6593318のコーディング配列を有する)、構造タンパク質(ABP−280およびスペクトリン)、RNA結合(hnRNPHおよびKIAA0122)、延長因子(EF1a)、および、アダプタータンパク質と考えられるpIClnに関与するタンパク質が含まれる。
【0260】
pIClnと相互作用することが同定されたタンパク質の概要を表2に示す。PIClnは、様々なタンパク質と相互作用し、例えば、メチルトランスフェラーゼ(Skb1)、タンパク質キナーゼ(Ndr)、機能が未知のタンパク質(EST6593318のコーディング配列を含む)、および、RNA代謝に関与する様々なタンパク質(hnRNPK(ROK)、snRNPタンパク質、タンパク質4.1、KIAA0987、Gar1、gemin4およびSMN)が含まれる。
【0261】
Ndrタンパク質キナーゼと相互作用することが同定されたタンパク質の概要を表3A〜Bに示す。オカダ酸(ホスファターゼ阻害剤)の存在下で、Ndr相互作用タンパク質は、機能が未知のタンパク質(EST6593318のコーディング配列を含む)、数種のMOB関連タンパク質(EST705582のタンパク質のコーディング配列、および、機能未知のタンパク質8922671を含む)、細胞分裂に関与するタンパク質(スピンドリン)、および、シグナル伝達で誘導されたタンパク質(プロラクチン誘導タンパク質またはPIP)を含む(表3A)。不活性Ndrキナーゼを用いた(KI18A Ndrは結合するが、ATPを加水分解できない)を用いた共免疫沈降実験により、Ndrが、数種のシャペロンタンパク質(CDC37、Hsp70、Hsp71およびHsp7c)を含む様々なタンパク質と相互作用することがわかった(表3B)。
【0262】
Skb1メチルトランスフェラーゼと相互作用することが同定されたタンパク質の概要を表4A〜Bに示す。Skb1は、GRF2を共発現する細胞から共免疫沈降される場合、GRF2およびpIClnを含む様々なタンパク質と相互作用し(表4A)、一方でGRF2が共発現されない場合、RACK1および機能が未知のタンパク質(EST6593318のコーディング配列を含む)と相互作用することが示された(表4B)。
PP2Cと相互作用することが同定されたタンパク質の概要を表5に示す。
【0263】
GRF2、pICln、Skb1、NdrおよびPP2C相互作用タンパク質のいくつかの簡単な説明を以下に記す。各相互作用タンパク質を共免疫沈降させることができるベイトタンパク質が記載される。いくつかの場合において、同じ相互作用タンパク質が、複数のベイト(すなわち、2以上のGRF2、pICln、Skb1、NdrおよびPP2C)で共免疫沈降された。同様に、上記ベイトタンパク質は、場合によって、相互作用タンパク質として、他のベイトと共免疫沈降されるようである(すなわち、Skb1は、相互作用タンパク質としてGRF2ベイトと共免疫沈降された)。
【0264】
ABP−280(または、フィラミン1もしくは非筋肉性のフィラミンともいう)は、周辺の細胞質に局在する280kDaのアクチン結合タンパク質である。ABP−280は、そのC末端を介してホモ二量体化され、そのN末端を介してアクチンと結合する。ABP−280はGRF2と共免疫沈降することが示された。
【0265】
α−チューブリンは主要な微小管成分の一つであり、β−チューブリンとの二量体として機能する。α/β−チューブリン二量体は、2モルのGTPと結合するこの二量体は2分子のGTPと結合するが、その一はα−チューブリンの結合部位とは交換不可能である。α−チューブリンは、PP2Cと共免疫沈降することがわかった。
【0266】
CDC37は、約50kDaのタンパク質であり、不安定な腫瘍キナーゼをターゲットとし、それらを分子シャペロンHsp90に向ける。この相互作用は、シグナル伝達経路の確立に重要であると考えられる。CDC37のターゲットとしては、Cdk4、Raflおよびv−srcがある。またCDC37は、細胞の形質転換においてc−mycおよびサイクリンDに協力するようである(Stepanova et al., Mol. Cell Biol. 29:4462−4473(2000))。
【0267】
CDC37は、安定化に関与し、それによりNdrキナーゼの活性を高める可能性がある。CDC37は、キナーゼ不活性KI18A Ndr変異体と結合することがわかった。
EG5は、Skb1−IPとして単離される。これは、二極性の紡錐体形成に必須なキネシン関連モーターである。
EG5に関して、p34cdc2によるリン酸化は、ヒトEg5の紡錐体結合を調節する。
【0268】
延長因子1α(EF−1a)は、タンパク質合成中のアミノアシル−tRNAと80sリボゾームとのGTP依存性結合に関与する。これは、細胞質に局在するセリン/スレオニンリンタンパク質である。EF−1aがPP2Cに結合することがわかった。
【0269】
EST6028549は、機能未知のタンパク質に対応する配列を有するポリペプチドをコードし、ベイトとしてGRF2と共免疫沈降することがわかった。
【0270】
EST6593318は、約42kDaの機能が未知のタンパク質(「タンパク質EST6593318」)に対応する配列を有するポリペプチドをコードする。当該タンパク質は、6個のWD40リピートと、特有のNおよびC末端を含む。WD40リピートは、多様な機能(シグナル伝達とF−ボックス型タンパク質とに関与する機能を含む)を有するタンパク質中で見出された。タンパク質EST6593318は、Skb1と強く相互作用するようであり、これは、Skb1とGRF2との両方でも共免疫沈澱するという事実に基づく。多数の他のタンパク質(例えば、RNA代謝に関与するタンパク質)がpIClnのみと共免疫沈澱し、Skb1およびGRF2反応ではみられなかった。これは、EST6593318でコードされるタンパク質がSkb1のコレギュレーターまたはコファクターである可能性を示す。EST6593318でコードされたタンパク質は、GRF2、pICln、NdrおよびSkb1と共免疫沈澱することがわかった。
【0271】
EST705582は、同定されていないタンパク質に対応する配列を有するポリペプチドをコードし、当該ポリペプチドは、〜30kDaのタンパク質としてSDSゲル上を移動し、3つの異なるバンドとして観察され、これはすなわち翻訳後修飾されたことを示す(「タンパク質EST705582」)。BLAST検索の結果により、このタンパク質と、S. pombeおよびS. cerevisiaeからのMOBタンパク質(細胞周期調節、隔壁形成および細胞質分裂に関与すると考えられる)とは顕著な相同性を有することが示された。酵母において、Ndr関連キナーゼDBF2は、後期有糸分裂中、適切に進行するのに必要であり、MOB1タンパク質に結合し、MOB1タンパク質を介して作用する。MOB1はリンタンパク質であり、その活性は、細胞周期を制御することが示された。タンパク質EST705582は、オカダ酸の存在下で、Ndrタンパク質キナーゼで共免疫沈澱された。ある最近の結果によれば、MOBはNdrキナーゼの基質であることが初めて示された。図19に示すように、GST融合タンパク質として発現された組換えMOBは、活性Ndrにより特異的にリン酸化される。
【0272】
Gar1は、プレrRNAスプライシングに必要な、プレrRNAのシュードウリジル化に関与する核小体のタンパク質である(Bousquet−Antonelli et al., EMBO J. 16:4770−4776 (1997))。Gar1は、RNA結合において補助的な役割を有する2つのグリシン/アルギニン豊富なドメインを含む(Bagni et al., J.Biol.Chem. 273:10868−73 (1998))。これらのドメインは、hnRNPで見出されたのと類似したRGGリピートを有する。また、C末端の先端は配列FRGRGHを含み、当該配列は、メチルトランスフェラーゼによるメチル化の基質(例えばSkb1)となり得る。実際には、RNアーゼ処理酵母抽出物からのGar1は、酵母タンパク質RMT1による非対称なアルギニンジメチル化のインビトロ基質であることがわかっている。Gar1は、Cbf5pタンパク質(シュードウリジンシンターゼタンパク質)と結合することがわかっている。シュードウリジンシンターゼ相同体ジスケリン(dyskerin)の変異により、先天性角化異常症(Heiss et al., Nat. Genet.19:32−38(1998))、骨髄障害に関連する病気および他の疾患を発症することがわかっている。またGar1は、RNAドメインと結合するリボ核タンパク質であるヒトテロメラーゼと結合し、インビボでの染色体安定性および機能に必須であることがわかっている(Dragon et al., Mol. Cell. Biol. 20:3037−3048(2000))。Gar1免疫沈降は、pICln反応においてのみ起こった。
【0273】
Gemin4は、SMN(survival of motor neurons)タンパク質と免疫沈降するタンパク質と同定された。SMNは、snRNPの細胞質の構築およびプレmRNAスプライシングに関与する大型のタンパク質複合体の一部である。Gemin4は、smB、smD1〜3およびsmEと直接相互作用し、細胞質中のUsnRNAと結合する。またGemin4は、gemsおよび核小体に局在し(スプライシング因子と共に)、プレrRNAプロセシングに関与する(Charroux et al., J. Cell Biol. 148:1177−1186 (2000))。Gemin4は、DEADボックス型タンパク質gemin3、推定のATPアーゼ/ヘリカーゼタンパク質と直接相互作用することによって、SMN複合体と結合し、これは、gemin4がgemin3のコファクターである可能性を示す。Gemin4は、既知のタンパク質モチーフ/ドメインを含まないが、グリシン残基の近くの位置に多くのアルギニン残基を含んでおり、これは、メチルトランスフェラーゼに対する可能性のある基質(例えばSkb1)であることを示す。Gemin4は、pIClnと結合するが、GRF2、Ndr、Skb1またはPP2Cとは結合しないことだけがわかった。
【0274】
GRF2は、RasやRacとは異なるドメインおよび活性を有する二官能価のグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)である。GRF2は、2つのプレックトリン相同(PH)ドメインと、DHドメインとを含む。GRF2は、ベイトとしてSkb1と免疫沈降するすることがわかった。
【0275】
hnRNP H1(異種核のリボ核タンパク質H1またはROH1)は、核タンパク質であり、プレmRNAと結合するhnRNP複合体の成分である。hnRNP H1は、ポリRG(Arg/Gly)配列に結合し、3つのRNP/RRM RNA結合モチーフを含むことがわかっている。hnRNP H1は、GRF2およびSkb1と結合することがわかっている。
【0276】
異種核のリボ核タンパク質複合体K(hnRNPKまたはROK)は、〜66kDaのタンパク質であり、シチジン豊富なプレmRNAsに結合し、その成熟mRNAへのプロセシングを促進する。また、hnRNPKは、転写にも関与する可能性がある(Michelotti, et al., Mol. Cell. Biol. 16:2350−2360 (1996))。hnRNPK(および他のhnRNP)は、RNA結合に関与する可能性のあるRGGボックス型モチーフ(アミノ酸Arg−Gly−Glyのリピートで構成される)を含む。hnRNPKは、インビボでメチル化可能であり、また、インビトロでは非対称なアルギニンメチルトランスフェラーゼによりおそらくRGGボックス上でメチル化可能である(Liu, et al., Mol. Cell. Biol. 15:2800−2808(1995))。hnRNPのアルギニンのメチル化は、その核の搬出を促進する可能性がある(遺伝子 & Dev. 12:679−691)。hnRNPKはpIClnとだけ結合した。
【0277】
Hsp90、Hsp71およびHsp7cは全て、熱ショックタンパク質である。Hsp90は、CDC37により方向付けられるように、不安定な腫瘍キナーゼと特異的に結合することが知られている。これらタンパク質は、安定化に関与し、それによりNdrキナーゼの活性を高める可能性がある。Hsp90、Hsp71およびHsp7cは全て、キナーゼ不活性K118A Ndrタンパク質と免疫沈降することがわかった。
【0278】
機能未知のタンパク質8922671は、約30kDaとしてSDSゲル上を泳動し、MOBファミリーのタンパク質と顕著な相同性を有することがわかった。このタンパク質は、オカダ酸の存在下で、Ndrと結合することがわかった。ある最近の研究結果によれば、MOBがNdrキナーゼの基質であることが初めて示された。図19で示すように、GST融合タンパク質として発現した組換えMOBは、活性Ndrにより特異的にリン酸化される。
【0279】
KIAA0122は、機能が未知の亜鉛フィンガータンパク質である。その配列は、ヒトKG−1細胞系からのcDNAクローンから推測された。そのN末端およびC末端の半分はそれぞれRNA結合ドメインを含む(RRM/RNPタイプ)。KIAA0122は、GRF2と結合することがわかった。
【0280】
KIAA0987タンパク質は、ヒト脳cDNAライブラリーからの同定されていない遺伝子のコーディング配列から推測された(Nagase et al., DNA Res. 6:63 70 (1999)。KIAA0987タンパク質は、タンパク質4.1と関連し、それにより類似の機能を有するようである。KIAA0987の免疫沈降は、ベイトタンパク質としてpIClnを用いた場合にのみ達成された。
【0281】
Ndrは、Ser281およびThr444において、カルシウム調節に関する活性と、リン酸化を増加させる活性とを有するセリン/スレオニンキナーゼである。Ndrは、Dbf2(Saccharomyces cerevisiae)、Orb6(Schizosaccharomyces pombe)、Warts/Lats(ショウジョウバエ属)およびCOT−1(アカパンカビ属)キナーゼと相同である。Orb6は、p34(cdc2)有糸分裂のキナーゼを作用させることによって、分裂間期に細胞極性を維持し、有糸分裂を遅らせるのに必要である。Ndrは、HanksおよびQuinnによって定義された12個のタンパク質キナーゼのサブドメイン全て(Hanks and Quinn, Methods Enzymol. 200:38−62 (1991))、核局在シグナル(NLS)として機能し得る塩基性アミノ酸の数種の保存されたクラスター(Millward et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:5022−5026 (1995))を含む。我々の実験により、Ndrは、GRF2、pIClnおよびSkb1と結合することが見出され、Skb1との複合体において機能する可能性が示された。加えて、Ndrがオカダ酸により活性化された場合、Ndrは、MOB様タンパク質と結合することがわかった(表3A)。MOBは活性Ndrキナーゼの基質であることが初めて示された(図19)。予備的な結果によれば、GRF2の存在により、オカダ酸および/またはイオノマイシンで処理された細胞中でNDRキナーゼ活性を高めることができるということがさらに示される(図19)。これは、NdrがGFR2相互作用タンパク質であるという発見と一致する。
【0282】
pIClnはもともと、アフリカツメガエルの卵母細胞において、塩素の導入で誘導される膨潤に関連する塩素チャンネルであると考えられている。ヒトpIClnのアミノ酸配列は、ラット腎臓およびイヌ腎臓上皮の細胞系MDCKから単離された相同体と、それぞれ90.2%および92.7%の同一性を有する。哺乳動物のあいだでpIClnは保存されているが、これまで出芽酵母S. cerevisiaeでは相同体は同定されていない。しかしながら、少なくとも1種のS. pombe相同体(GI:3183396)がPSI BLASTを用いて同定可能である。我々が発見したところによれば、pIClnは、基質に特異的な部分集合を有するSkb1メチルトランスフェラーゼを共に運搬するアダプタータンパク質として作用する可能性がある。RNA代謝に関与するタンパク質は、Skb1によるメチル化に関する可能性のある基質である。pIClnは、GRF2と共発現される場合、GRF2およびSkb1と結合することがわかった。
【0283】
プロラクチン誘導タンパク質(PIP)の発現は、プロラクチンまたはアンドロゲンで誘導され、乳ガンのマーカーとして用いられる(Clark et al., Br. J. Cancer 81:1002−1008(1999))。PIPは、プロラクチンおよび受容体チロシンキナーゼとの間での混線に関与することが示唆されているシグナルペプチド配列をそのN末端に有する。これに一致して、プロラクチンは、いくつかの受容体チロシンキナーゼからのRasシグナル伝達を阻害することが示されている(D’Angelo et al., Mo. Endrocrinol. 13:692−704(1999) and Johnson et al., J. Biol. Chem. 271:21574−21578(1996))。PIPは、オカダ酸の存在下で、Ndrと共免疫沈降することが示された。
【0284】
タンパク質4.1は、少なくとも2種のアイソフォームを有し(アイソフォームAは〜130kDa、および、アイソフォームBは〜84kDa)、これらはいずれもpIClnで免疫沈降する。2種の新規の形態、4.1SVWL1および4.1SVWL2が近年クローニングされた。タンパク質4.1は、最初は、赤血球(核を有さない)における細胞骨格のタンパク質であることが示され、骨格ネットワークを安定化する役割を有すると考えられている。pIClnは、タンパク質4.1のアイソフォームBのC末端と相互作用することが以前に示されている。この相互作用は、塩素チャンネルとしてのpIClnの機能に関与すると考えられている(Tang et al., Blood 92:1442−1447(1998))。しかしながら、近年の研究によれば、タンパク質4.1は、核にも存在し、スプライシングプロセスに関与するタンパク質を強化するスペックルドメインに局在することが示されている(Lallena et al., J. Cell Sci. 111:1963−1971(1998))。タンパク質4.1は、多くのArg残基を含み、そのうちのいくつかは、メチルトランスフェラーゼによるメチル化に関する可能性のある部位(例えばSkb1)であるRGまたはGRの形態である。タンパク質4.1のアイソフォームAおよびBは、いずれもpIClnのみと結合することがわかった。4.1SVWL2を「ベイト」として用いて、4.1SVWL2と相互作用する多くのタンパク質を同定した。それらを「4.1SVWL2−IP」の「4.1SVWL2相互作用タンパク質」と指定し、表6に列挙する。
【0285】
我々は、14−3−3タンパク質の全てのファミリーがタンパク質4.1ベイト4.1SVWL2と相互作用することを初めて示す。タンパク質4.1種は、細胞周期の際に細胞中で空間的に再編成されることがわかっていることから、この研究結果により、4.1SVWL2は、細胞の何らかのシグナル伝達/細胞周期の機能に関与する可能性を示す。タンパク質4.1種は、分裂間期には核質および細胞膜に局在し、有糸分裂時には有糸分裂の紡錐体の形態、細胞質分裂時には中間体の形態である。従って、14−3−3タンパク質は、それらのタンパク質4.1種との結合を介してこれらのプロセスに関与する可能性がある。
【0286】
タンパク質ホスファターゼ2C(PP2C)は、Mn2+またはMg2+依存性のSer/Thrタンパク質ホスファターゼである(Das et al., EMBO J. 15:6798−6809 (1996))。PP2Cは、真核生物における細胞性ストレス応答を調節するのに必須であることがわかっている。またPP2Cは、cdkを脱リン酸化することによって細胞周期調節において機能する可能性がある(Cheng et al., J. Biol. Chem. 275:34744−9)。PP2Cは、GRF2と共免疫沈降することがわかった。
【0287】
RanBP8(GI:5454000)は、Skb1と免疫沈降し、RanGTPアーゼと相互作用することが知られている(Gorlich et al., J. Cell Biol. 138:65−80, 1997)。しかしながら、その機能は未知である。RanGTPアーゼは、有糸分裂の開始の調節、および、有糸分裂の紡錐体形成の誘導に関与する。他のRan結合タンパク質はRanのGTPアーゼ活性を調節するため、RanBP8は類似の機能を有する可能性が考えられる。従って、RanBP8は、有糸分裂の調節にも関与する可能性がある。これはまた、Skb1も、終期の際の有糸分裂のスピンドルポールボディ(SPB)に局在するという我々の予備的な結果と一致し(図17)、Skb1/RanBP8/Ran経路が存在し、RanBP8が有糸分裂の調節におけるSkb1に対する重要なターゲットである可能性を示す。
【0288】
活性化タンパク質キナーゼC1の受容体(RACK1)。活性化の際に、PKCは、可溶性フラクションから細胞粒子画分に転座する。アイソザイム特異的RACKは、活性化の際に、異なるPKCアイソザイムを別の細胞内部位に転座させることに関与することが示唆されている。RACK1は、WD40リピートを含み、β−アドレナリン受容体キナーゼの膜への固定化に関与するGタンパク質のβサブユニットの相同体である。RACK1は、GRF2と結合することがわかった。
【0289】
Skb1は、ミエリン塩基性タンパク質およびヒストンをメチル化するアルギニンメチルトランスフェラーゼである(J. Biol. Chem. 274:31531−31542 (1999))。Skb1は、pIClnアミノ酸配列のC末端の最後の29個のアミノ酸を介してpIClnと相互作用することがわかっている(J. Biol. Chem. 273:10811−10814 (1998);Biochim Biophys Acta 1404(3):321−8 (1998))。Skb1は、GRF2およびpIClnの両方と免疫沈降した。我々の近年の研究結果によれば、S1cb1は、終期の際に細胞の分裂溝に局在することが示される(図17)。Skb1の分裂溝への局在は、有糸分裂の際のそのS. pombe相同体の局在と一致する(Bao et al., J. Biol. Chem.、2001 manuscript C100096200)。
【0290】
またSkb1は、スピンドルポールボディにも局在する可能性がある(図17)。近年の発見の観点によれば、Skb1は、RanBP8(GI:5454000)、機能が未知のRanGTPアーゼ結合タンパク質と共免疫沈澱することが説明されている。上述したように、RanGTPアーゼは、有糸分裂の開始の調節と、有糸分裂の紡錐体形成の誘導とに関与する。他のRan結合タンパク質はRanのGTPアーゼ活性を調節することから、RanBP8が類似の機能を有する可能性が考えられる。従って、RanBP8は、有糸分裂の調節において、Skb1/RanBP8/Ran経路で機能する可能性がある。
【0291】
内在性Skb1は、核スペックルに似た構造で見出された(図18)。Skb1の核局在はpICln、Skb1相互作用タンパク質がsnRNPと免疫沈降するという発見と一致しており、スペックル様の核構造で保存される。またこれはは、pIClnが、Skb1およびその基質のいくつか(例えば、smD1およびsmD3)を共に運搬するアダプタータンパク質として作用するというモデルと一致する。
【0292】
SMN(生存運動ニューロン)タンパク質は細胞質に局在し、そこでコアのsmタンパク質と結合して、snRNP構築に関与する。核において、SMNはスプライシングが必要であり、コイルドボディに結合するgemsに存在する。またSNWは、gemin2、3および4との複合体中に存在し(しかしながら、gemin4およびSMNは直接相互作用しない)、それにより、snRNPの再生またはリサイクルに関与する可能性がある(Charroux et al., J. Cell Biol. 148:1177−1186(2000))。SMNは、棘筋の萎縮を患う患者において頻繁に欠失しているか、または変異している(Lefebvre et al., Cell 80:155−165(1995))。SMNタンパク質は、pIClnのみと結合することがわかった。
【0293】
smタンパク質(核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチド)であるsmD1〜3、smB/B’、smG、smEおよびsmFは、コアsnRNP(核内低分子リボ核タンパク質粒子)のタンパク質成分である。これらは、細胞質中で、UsnRNAと共にsnRNPに組み立てられ、その複合体は、核に戻され、そこでプレmRNAスプライシングが起こる。smタンパク質であるsmD1、smD2、smD3、smB/B’、smEおよびsmGは、pIClnと共免疫沈降することがわかった。smD3、smD1およびsmB/B’は、pIClnと相互作用することがアフィニティークロマトグラフィーを用いて以前に示されている(Mol. Cell. Biol. 19:4113−4120(1999))。smEがpIClnと免疫沈降することはこれまでに示されておらず、標識されたsmD2およびsmEを用いた実験によれば、バックグラウンドに対して弱い結合しか示されていない(Mol. Cell. Biol. 19:4113−4120(1999))。数種のsmタンパク質のC末端は、RGリピートを含む。smD1およびsmD3の上記リピート中のArg残基が、インビボで対称的にジメチル化されることが近年証明された(Brahms, et al., J. Biol. Chem. 275:17122−17129 (2000))。全身性エリテマトーデスの患者は、インビボで、対称的にジメチル化されたsmタンパク質に対する自己抗体を生産する(Brahms, et al., J. Biol. Chem. 275:17122−17129 (2000))。smタンパク質は、pIClnの存在下でのみ免疫沈降することがわかった。smタンパク質を含む複合体をさらに特徴付けるために、smD1およびsmD3を「ベイト」として用いて、「smD1−IP」および「smD3−IP」を同定した。これら2種のスクリーニングで同定されたタンパク質を表7および8にそれぞれ列挙した。
【0294】
スピンドリン(またはSpin)は、約30kDaのタンパク質であり、マウス卵母細胞において、分裂中期と終期との間における紡錐体ミメティックとの結合を増加させることがわかっている(Oh et al., Development 124:493−503 (1997))。スピンドリンは、マウスにおいて、最初の有糸分裂の細胞周期の、減数分裂周期の際と、分裂中期の際とにリン酸化される。リン酸化はSer/Thr残基上で起こり、Mos MAPキナーゼによって少なくとも部分的に調節される。スピンドリンと分裂中期Iの紡錐体との結合が減少し、これはMos−null変異体でみられることから、スピンドリンが紡錐体と結合するのにリン酸化が必要である可能性を示す(Oh et al., Mol. Reprod. Dev. 50:240−249(1998))。スピンドリンは、オカダ酸の存在下で、Ndrと共免疫沈降することがわかった。
【0295】
GI13543922は、新規のsudD様ヒトタンパク質であり、Skb1およびpIClnの両方と結合する(と共免疫沈降する)ことが可能であると同定された。アスペルギルス属のsudDはもともと、bimD6変異体の遺伝子外サプレッサーとして同定された(Anaya et al., Gene 211:323−329, 1998)。BimD6変異は有糸分裂の異常を引き起こし、それにより染色体は紡錘微細管に適切に付着できなくなり、染色体消失の増加を引き起こす。bimD6変異はsudAにより抑制することができるため、BIMDが染色体凝縮に関与する可能性が示唆されており、BIMDはSMCタンパク質をコードし、クロマチン濃縮および分離に関与する。sudAの発現中は、sudDの低温感受性変異が抑制される。またsudDは、染色体凝縮および分離に関与する可能性がある。
【0296】
sudDの相同体は、多くの種(古細菌、酵母(Rio1タンパク質)およびホモサピエンスを含む)に存在するようである。ヒトsudD相同体が以前に同定されているが、これはSkb1およびpIClnとの複合体に関して示したタンパク質とは異なる。sudD様タンパク質のヒト相同体がさらに2種存在し(AF258661およびFLJ11159)、それらと他のsudDファミリータンパク質とのアライメントを図20に示す。
【0297】
これらタンパク質は全て、RIOドメインと称する保存されたドメインを含む。このドメインの機能は報告されていない。しかしながら、psi BLAST検索により、sudDとタンパク質キナーゼとがいくらか相同性を有することが明らかになり、この相同領域は、RIOドメインとオーバーラップする。このようなsudD様タンパク質は、Skb1による有糸分裂の調節に関する重要なターゲットとなり得る。
【0298】
Mob様タンパク質FLJ10788をベイトとして用いた場合、LATS1が相互作用タンパク質として回収された(表9)。LATS1はキナーゼのNdrファミリーの他のメンバーであるため、および、LATS1は腫瘍抑制因子であるため、Mobタンパク質もLATS1および2の基質であるかどうかを観察することは興味深い。有糸分裂/細胞質分裂の際に、LATSおよびNdrがこれらタンパク質をわずかに異なる位置でターゲットとすることが可能である。
【0299】
最終的に、予備的なウェスタンブロットにより、Skb1は哺乳動物PAK種と相互作用することが示されたが、用いられた抗体は哺乳動物PAKアイソフォーム3種全てと交叉反応することが知られているため、PAKの正確な不明確である。Skb1−PAK相互作用は酵母における発見と一致する。我々の知る限りでは、哺乳動物におけるこのような相互作用はこれまでに報告されていない。
【0300】
タンパク質相互作用研究からの結論
アクチン依存性の細胞極性、および、分裂間期の際の細胞分裂に関して調節された制限(constraint)の両方を維持して、細胞分裂周期の有糸分裂期における細胞分裂の開始を導く経路において、哺乳動物NdrおよびSkb1タンパク質に対する分裂酵母の対応物は、RasおよびRac関連タンパク質Cdc42の下流で機能する。
【0301】
従って、ヒト細胞における細胞分裂のレギュレーターとして機能し得るGRF2 を含むタンパク質複合体が同定された。この複合体の破壊または機能的な不活性化は、細胞分裂周期の際の異なる正常な制限に影響を及ぼし、細胞中のアクチン構造の正常な調節を破壊し得る。正常な細胞周期の進行、または、RasまたはRacのGTP結合型を促進する腫瘍化変異の結果として、この複合体の構築、維持、および活性は、RasまたはRacの活性化により影響を受けることがある。一つの可能性として、RasのGTP結合型を促進する腫瘍性変異は、GRF2複合体を破壊し、それによって細胞分裂の際の制限を除去することができる。
【0302】
GRF2は、タンパク質キナーゼNdrおよび候補のメチルトランスフェラーゼSkb1を含むタンパク質複合体に関係する。従って、GRG2複合体は、細胞の形と細胞周期のG2/M移行とを調節する分裂酵母タンパク質と類似したタンパク質を含む(34)。GRF2のように、Ndrはカルシウムイオノフォアによりインビボで活性化され、カルシウム結合タンパク質のカルモジュリン/S100ファミリーのタンパク質と結合する。
【0303】
GRF2およびNdrを含むタンパク質複合体は、細胞周期の際の不適切な細胞分裂および複合体の破壊(正常には細胞分裂に必要な現象として起こるが、不適切な細胞分裂や増殖の原因となる)を防ぐように機能し得ることが考えられる。Rasの腫瘍性の変異により細胞の形質転換および腫瘍形成が促進されるが、これは、正常には細胞分裂を制限し、細胞の形を制御するように機能するタンパク質複合体が破壊されることによる。
【0304】
このタンパク質複合体に影響を及ぼす薬剤が、細胞分裂に影響を及ぼすことがある。例えば、GRF2および関連タンパク質GRF1(またはRas−GRFとして知られる)は、非分裂性の、脳で最終分化した神経細胞で大量に発現される。本明細書で説明されたGRF2複合体は、GRF2発現細胞の増殖を防ぐように機能し得る。従って、この複合体を阻害することによって、脳および他の神経組織における神経成長および組織再生を促進することができる。GRF2(ならびに、NdrおよびSkb1)は多くの他の細胞組織で発現されるため、GRF2複合体をターゲットとする薬剤はこれら組織の増殖を刺激することができる。GRF2複合体成分の活性化は有糸分裂を阻害するか、または、細胞の形を変え、それによって細胞増殖を制限または阻害する。
【0305】
有糸分裂の阻害剤として、および、細胞の形のレギュレーターとしてのGRF2複合体の活性は、ヒトの発ガン現象で必要な工程がこの複合体の不活性化であるという示唆と類似している。ヒトRas遺伝子のいわゆる活性化変異により、Rasタンパク質をGTPに結合させ、GRF2複合体の構築、維持および/または機能を減じ、それによって腫瘍形成を促進させる。
【0306】
ミエリン塩基性タンパク質(MBP)は、アルギニン残基で対称的にジメチル化されていることがわかっている。ほとんどの同定されたメチルトランスフェラーゼは、アルギニンに対する非対称的なジメチル化活性を有する。Skb1は、基質としてミエリン塩基性タンパク質を用いることのできる唯一のクローン化アルギニンメチルトランスフェラーゼである。Skb1の触媒ドメインは、最低限、クローン化アルギニンメチルトランスフェラーゼでよく保存されている(J. Biol. Chem. 274:31531−31542(1999))。従って、Skb1は、対称的なジメチルアルギニンを形成することができるII型のアルギニンメチルトランスフェラーゼである可能性がある。
【0307】
pIClnは、その基質の特異的な部分集合を有するSkb1メチルトランスフェラーゼを共に運搬するアダプタータンパク質としての役割を有する可能性がある。上記で列挙したRNA代謝タンパク質、または、それに強く結合するタンパク質は、Skb1によるメチル化の基質である可能性がある。smタンパク質D1およびD3はSkb1の基質であることが予測され、なぜなら、それらはインビボでそのC末端で見出されたRGリピート上で対称的にジメチル化されることがわかっているためである(J. Biol. Chem. 275:17122−17129(2000))。これらタンパク質のメチル化は、それらとsnRNPの他の成分との相互作用、または、それらと核輸送担体との相互作用に影響を及ぼす可能性がある。RNA代謝に関与する多くのタンパク質がpIClnと免疫沈降するという発見により、Skb1が、RNA代謝の調節(例えば、mRNAスプライシング、プレrRNA代謝、場合によってテロメラーゼ機能を含む)に関する全体的な経路に関与する可能性が示される。
【0308】
また、hnRNPKおよびGar1も、それらとpIClnとの結合、および、そのアミノ酸配列中にRGが豊富なドメインが存在することに基づいて、Skb1の基質であることが予測される。また、タンパク質4.1、KIAA0987、gemin4およびSMNも、それらが大規模なRGリピートを含まないにも関わらず、Skb1の基質である可能性がある。この予測の裏付けとして、ミエリン塩基性タンパク質が、これは1つのアルギニン残基しか含まないが、メチルトランスフェラーゼの基質である、ということが近年示された(Int. J. Biochem. Cell Biol. 29:743−51(1997))。
【0309】
Skb1の酵母相同体(S. cerevisiaeについてはMcMillan et al., Moll. Cell. Biol. 19:6929−6939 (1999);S. PombeについてはGilbreth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14781−14786(1998))が、細胞周期調節に関与することが示された。S. cerevisiaeは、pICln相同体を有さず、また、そのsmタンパク質のC末端にRGリピートが存在しないようである。しかしながら、pIClnは、アフリカツメガエルからヒトにかけて保存されている。これに関する一つの考えられる理由としては、S. cerevisiae において、RNAスプライシングの複雑さが他の真核生物に比べて低減されることがある。S. pombeではスプライシングはより複雑であるため、S. pombeはpICln相同体を有するはずと予測され得る。PSI BLASTプログラムを用いて、我々は、S. pombeからpIClnに相同性を有する機能未知のタンパク質を見出した。加えて、S. pombeからのsmD1は、そのC末端に多数のRGリピートを有し、一方で、smD3は、2つの可能性のあるアルギニンメチル化部位を有する。これらの観察結果により、pICln相同体は、S. pombeにおいて、ヒトの場合と類似の機能を提供し得ることが示される。
【0310】
実施例2:マススペクトロメトリー分析によるpICln相互作用タンパク質の同定
タンパク質相互作用の研究により、ヒトの生物学に対して広い洞察が提供されてきた。タンパク質−タンパク質(およびタンパク質−低分子)相互作用は、細胞の成長および発生、構造、操作、複製、および選択的除去を制御する代謝およびシグナル伝達経路を構築するため、それらは重要である。タンパク質の役割は、それと他のタンパク質との相互作用に反映される(35)。従って、複数のタンパク質の複合体の同定および逆重畳積分は、タンパク質機能および細胞調節をよりよく理解するための方法である。タンパク質−タンパク質相互作用におけるエラーによりヒトの病気を示すことができるため(例えば、(36)参照)、タンパク質−タンパク質相互作用の系統的な定義は、治療介入のための新規のターゲットを同定するための多大な発展性を秘めている。
【0311】
タンパク質複合体を捕獲するためにタンパク質−タンパク質相互作用の高親和性特徴を開発する方法と、超高感度のタンパク質同定技術の適用とを組み合わせることによって、タンパク質の機能を測定することができる。数年に渡り、マススペクトロメトリー(MS)に基づく様々な技術が、タンパク質分析分野で優位を占めていた。その理由の一つとして、マススペクトロメトリーは、タンパク質の明瞭な同定、および、ペプチドおよびタンパク質の質量の正確な測定に関して、他の技術を超える莫大な利益を提供することが挙げられる。
【0312】
我々は、親和性に基づくタンパク質複合体精製方法を示し、低いフェムトモル量のタンパク質の同定に適用できるようなマススペクトロメトリーの原理を再検討する。特に、我々は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質を同定するために、MS、DNAおよびタンパク質データベースを利用する。
【0313】
タンパク質複合体のワンステップバッチによる吸着
免疫沈降によるタンパク質単離技術、およびそのタンパク質複合体回収の利点は、よく確立されている(37)。この方法は、ワンステップバッチによる吸着である。この方法による相互作用タンパク質の回収率は、その結合定数(より特定には、結合と解離との割合)および存在度(すなわち、細胞あたりのコピー数);細胞抽出物中の溶解性および濃度;および、安定性の関数であり、ここで上記安定性とは、実験条件下での相互作用タンパク質の内因性の安定性、および、抽出物中での酵素による攻撃(それらを破壊するかまたはそれらの相互作用を破壊する)に対するそれらの耐性の両方を意味する。
【0314】
免疫複合体からの結合タンパク質の溶出は、遊離ペプチドを用いてベイトタンパク質およびベイト関連タンパク質を置換することによってなされ、ただし、抗体または固定マトリックスに非特異的に吸着したタンパク質、またあるいは、不溶性形態で回収されたタンパク質は溶出させないことにより、この方法に高度の特異性をもたらす。捕獲されたタンパク質複合体を特異的に溶出させるための代替法は、部位特異的プロテアーゼを用いて、エピトープタグに近接するように操作された部位を切断することである。この特異的な溶出工程においては、様々なタンパク質相互作用に寛容であるように設定された細胞抽出物調製条件、および、免疫沈降が補足される。この方法は、前から存在する比較的強く相互作用する(すなわち、サブマイクロモルのKd)タンパク質複合体を回収するのに好都合である。この方法は、分析の際に顕著な「ノイズ」を与えてしまう大量の非特異的相互作用タンパク質の回収には不適切である点において有利であるが、少量で存在する(すなわち、細胞あたり数千コピー未満)および/またはマイクロモル〜ミリモル範囲の結合定数を有する相互作用タンパク質を回収するその能力を明らかに制限する。
【0315】
この免疫親和性法の適用は、クロマトグラフィー工程に組み入れることができ、その際、細胞抽出物は固定化抗体充填カラムを通過する。この方法により、少量しか存在しない抗原(例えば、エピトープでタグを付した「ベイト」タンパク質)および関連タンパク質の回収を高めることができる。
【0316】
エピトープでタグを付したタンパク質複合体:FLAG−PICLnおよび関連タンパク質の細胞トランスフェクションおよび免疫沈降
この実験において、タンパク質配列DYKDDDDKを有するFLAGエピトープ(Sigma)を「ベイト」タンパク質pICLnのアミノ末端に導入した。pICLnは、広範に発現される26kDaであり、ホモサピエンスからアフリカツメガエルに至る種で保存されている。pICLnの正確な機能はまだ研究中であるが、初めは塩素チャンネルとして機能することが推測され、より最近にはスプライセオソームの調節に関与することがわかっている(38、39)。
【0317】
ヒト胎児の腎臓細胞(HEK293T)を本質的に上述したような方法を用いて細胞をトランスフェクションした2日後、その溶解物から免疫沈降によりタグを付されたpICLnを回収した(12)。HEK293細胞は効率的にトランスフェクトされる(40)。293T変異株は、SV40ウイルスのラージT抗原を発現し、トランスフェクトされたプラスミドを増幅してプラスミドがコードするcDNAの生産をさらに高めることができる。リン酸カルシウム/DNA沈殿物の形態で10μgのプラスミドDNA(pCDNA3−Flag−pICLn)を加えることによって、約2×107個の細胞がトランスフェクトされた(41)。脂質が仲介するDNAトランスフェクション法を用いても同等の結果が得られた(41)。トランスフェクトされた細胞を、溶解バッファー(1ml)[20mMのトリス−HCl(pH7.5)、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1%NP−40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、10μg/mlのアプロチニン、0.2mMのAEBSF(CalBiochem)]を加えることにより溶解し、20,000×gで30分間遠心分離することによって透明にした。細胞溶解物およびタンパク質を0〜4℃の間の温度に維持した。架橋アガロースビーズ(M2、Sigma)に共有結合した抗FLAGモノクローナル抗体(5μg)を加えることにより、その澄んだ溶解物を免疫沈降させた。その混合物を穏やかに倒置することにより60分間攪拌した。不溶性分画と結合した免疫複合体を遠心分離によって(1000×g、2分間)回収し、溶解バッファーへの再懸濁を3サイクル行うことによって洗浄し、続いて、上述したように遠心分離した。免疫複合体を、250μlの50mM重炭酸アンモニウム(使用直前に調製された)(400μMのFLAGペプチドを含む)に再懸濁することによって、ビーズから溶出した。30分間インキュベートした後、ビーズを遠心分離によって取り除き、FLAGペプチドと溶出したタンパク質とを含む上清を凍結乾燥した。
【0318】
タンパク質を標準的な一次元SDS−PAGE法により解析し、製造者の推奨法に従ってコロイド状のクーマシーブルー染色液(GelCode Blue, Pierce)で染色した。SDS−PAGEのためのサンプル調製中に、混入タンパク質(例えばヒト皮膚から誘導されたケラチン)が入らないように注意した。染色ゲルによれば、ベイトタンパク質pICLnに加えて数種のタンパク質が見出された(図9)。これらタンパク質のいくつかは他の方法ですでに同定されているが、同定されていないものもあった。例えば、タンパク質4.1、Skb1、IBP42、smB/B′、およびsmD3は、アフィニティークロマトグラフィーにより、または、酵母2ハイブリッド系により、相互作用することが示された(39、42、43)。それに比べ、smEおよびsmGについては、pIClnとの複合体に関してこれまで示されていなかった。
これらタンパク質を同定するのに用いられた解析方法、および代替法を以下に説明する。
【0319】
マススペクトロメトリー用のサンプル調製
回収された免疫沈降タンパク質のMSによる同定を促進するために、1以上のタンパク質種を含む染色バンドをポリアクリルアミドゲルから切り出し、インサイチュでのトリプシン処理によりポリペプチドに分解し、およびMS分析に適した溶液に移し、MS分析に適するように濃縮した(図10で説明される)。タンパク質をゲル内で処理する技術は、標準化したプロトコールに改良されている。いわゆる「ゲル内消化」法は、ゲル片に含まれたタンパク質を酵素的に断片化し、生じたペプチドを抽出することに関して開発されている(44)。配列解析グレードに改変されたトリプシンは、タンパク質のハイスループット同定に選択された酵素である。一般的なゲル内消化プロトコールの概要を図11に示す。この方法において、興味のあるバンドをゲルから切り出し、還元およびアルキル化してシステイン架橋を壊し、システイン架橋が再形成されるのを防いだ。対応する緩衝液で平衡化した後、そのゲル片をトリプシン溶液で膨潤させ、酵素をゲル中に入り込ませた。一般的に一晩、37℃で消化を行った。生じたペプチドを抽出物し、MS分析用に調製した。
【0320】
タンパク質同定のためのマススペクトロメーター
一般的に、マススペクトロメーターは、少なくとも3つの部品、すなわちイオン化装置、質量分離装置、および検出器で構成される。マススペクトロメトリーは非常に強力な分離技術であるが、気相で帯電する分子を分離することしかできないことを理解することが重要である。その上、マススペクトロメーターは、1度に正または負に帯電した分析物のどちらかしか分離できない。本来、ほとんどのマススペクトロメーターは分子のイオン化を行わないため、イオン化という用語は紛らわしい。それよりも、イオン化という用語は、分析物を気相へ移動させ、同時に、その電荷を維持し、および/または、サンプルの環境からの電荷を一般的にプロトンの形態で捉えることに関する。ペプチドおよびタンパク質の研究において、主として、2つのサンプルイオン化技術、すなわちマトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)(45〜47)およびエレクトロスプレーイオン化(ESI)(48)が優位を占めている。
【0321】
MALDIマススペクトロメーター、ペプチドおよびタンパク質分析
MALDIイオン化は、興味のあるサンプル、この場合ペプチドおよびタンパク質を酸性化マトリックスを用いて共結晶化する技術である(49)。上記マトリックスは低分子であり、特定の波長、一般的には紫外線(UV)の範囲で吸収し、吸収エネルギーを熱として放散する。エネルギーをマトリックスに迅速に(数nsで)運ぶために、一般的にパルスレーザー光線が用いられる。このような迅速なエネルギー運搬により、マトリックスは迅速にその表面から分離し、気相中にマトリックスのプリューム(plume)と、再結晶化された分析物とが生成する。脱離プロセス中、または、マトリックス分子と相互作用することにより分子のガスプリュームを導入した後に、分析物が変化を受けているかどうかははっきりしない。しかしながら、最終結果として、気相に存在する帯電した分析物の小さい空洞が得られる。これまで、MALDIは、主に、飛行時間型(TOF)マススペクトロメーターと並列して連結されている。飛行時間型マススペクトロメーターの機能は、分析物が固定された経路の長さ(TOFチューブまたはチャンバー)を通過して飛行するのにかかる時間を測定することである。従って、プリューム中に存在する帯電した分析物は、適切なタイムディレイ後にTOFチューブに移送される。分析物をTOFチューブに動かすために、MALDIプレートに高圧が適用して、プレートとTOFチャンバーの入り口との間に強い電場を発生させる。より小さい分析物は、チャンバー入り口により大きい分析物より迅速に到達する(すなわち、一定の運動エネルギーを適用して、分析物の異なる速度が得られる)。飛行すると、検出器に向かって移動する間に、分析物は無電界領域に存在し、チューブに沿って分離する。再び、少ない質量の分析物はチューブに沿ってより速く移動し、より大きい質量の分析物より前に検出器に到達する。検出器は、レーザーショットとタイムディレイとを順に有し、ペプチドおよびタンパク質イオンが時間中に到達する度に、それらを測定する。既知の質量および電荷を有する標準物質を用いて質量範囲を測定することによって、所定のイオンの飛行時間を質量に変換することができる。最終結果として、イオン(タンパク質またはポリペプチド)質量に対して観察された強度を比較したスペクトルが得られる。
【0322】
MALDI−TOF MSは、最新のマススペクトロメーターを用いて簡単に実行できる。一般的に、興味のあるサンプル(この場合ペプチドまたはタンパク質)とマトリックス混合物とを混合し(図12参照)、続いて、研磨されたステンレス鋼プレート(MALDIプレート)上にスポットする。市販のMALDIプレートは、1プレートあたり96サンプルを置くことができる。次に、MALDIプレートをMALDIマススペクトロメーターの減圧室に挿入する。次に、パルスレーザーを活性化し、上述したように飛行時間の獲得を始める。次に、質量を含むMSスペクトルを集め、ペプチド/タンパク質の電荷比を得る。MALDIによりイオン化された分子の電荷は、通常1である。
【0323】
近年、MALDIイオンソース技術も、ハイブリッド直交型マススペクトロメーターと連結される。この設計において、MALDIイオン化法は、本質的には上述したとおりである(ただしわずかな変更を含む)。しかしながら、TOF検出器は直交型マススペクトロメーター(例えば、PE−Sciex社製のQ−Star)で置き換えられ、直交型マススペクトロメーターは、四重極、それに続く衝突セル、およびパルス垂直型TOF MSから構成される。ハイブリッド機器(MALDI−Q−Star)は、ペプチド混合物に含まれるペプチドの質量を高解像度でマッピングでき、および、衝突誘導解離による選択されたペプチドの効率的な断片化を選択できるという利点を有する。これらの断片化パターンは、ペプチドのアミノ酸配列に関する情報を含む。
【0324】
ESIマススペクトロメーター、ペプチドおよびタンパク質分析
また、タンパク質およびペプチド混合物をマススペクトロメーターに導入するために、エレクトロスプレーイオン化も広く利用されている。エレクトロスプレーイオン化(ESI)(48)は、大気圧で分析物を液相から気相へ移すことができる。イオン化プロセスは、小さいチューブのチップとマススペクトロメーターの入り口との間に電場を印加することによって達成される。その電場によりチップの先端に帯電液が誘導され、電荷/表面の比を最小化するテイラーコーンと呼ばれるコーンが形成される。コーン先端から液滴を遊離させ、マススペクトロメーターの入り口に送る。遊離した液滴から溶媒を蒸発させ、液滴をより小さい液滴にフラグメンテーションするプロセスを繰り返し行う。このプロセスにより、多数の液滴は消失するサイズになり、溶媒がなくなって帯電した分析物が気相に存在するようになる。さらに、液滴が収縮すると同時に、pHが減少し、分析物のプロトン化が起こる。従って、トリプシン処理タンパク質を扱う場合、ESIにより多価の分析物が共通して得られる。
【0325】
一般的に、エレクトロスプレーイオン化は、酸連四重極、イオントラップ、またはハイブリッド四重極−時間飛行型マススペクトロメーター((50)で述べられる)と連結させて用いられる。エレクトロスプレーイオン化は、分離技術(例えばHPLC、LCおよびCE)との組み合わせが容易である点で、MALDIに対して相当な利点がある。またESIは、サンプルの連続注入に用いることができる。さらに、トリプシン消化物から多価ペプチドが得られる傾向により、衝突誘導解離と関連して、従来のMALDI−TOFまたはハイブリッドMALDI−Q−Star装置のいずれかで達成されたスペクトルより増強されたMS/MSスペクトルを発生させることができる。
【0326】
エレクトロスプレーイオン化およびMALDI−Q−Star装置はいずれも、衝突誘起解離によって、選択されたペプチドのアミノ酸配列に関するフラグメンテーションパターン(MS/MSスペクトル)を発生させる(図10)。一般的に、MS/MSスペクトルの発生は、2つの独立した実験を必要とする。第一の通過において、ペプチド混合物(トリプシン消化物)は、マススペクトロメーターによる質量−電荷(m/z)比にしたがって分離され、最も強いペプチドのピークのリストが立証される。第二の通過において(図13に示す)、特定のm/z種(第一の通過分析で同定された)、おそらくは特有のペプチドイオンのみをマススペクトロメーターに入らせるように、装置を調節する。これらのイオンは衝突セルに向けられ、その運動エネルギーが増加する。衝突セル中で、そのイオンと十分な運動エネルギーを有する不活性ガス分子とが衝突して、ペプチド結合が破壊される。このプロセスは衝突誘起解離、CIDと呼ばれ、同じ「親」イオンから誘導された帯電した断片および中性の断片の両方が生じる。最終的に、新しく生じた帯電した断片は、そのm/zに従ってマススペクトロメーターで分離され、MS/MSスペクトルを得る。適切な衝突エネルギーを印加することによって、主としてペプチド結合で断片化が起こり、断片のラダーが得られる。特定のピーク間の質量の差が1つのアミノ酸の損失に相当する。次に、連続する質量間での質量差を特定のイオンタイプ(すなわち、yまたはb系のイオン;図13を参照)に関して測定してラダー状に並べることによって、ペプチド配列を再構成することができる。
【0327】
一般的に、ペプチド質量はMALDI−TOFまたはMALDI−Q−Starマススペクトロメーターを用いれば低いppm(百万分率)まで正確に測定される。トリプシン消化で観察されたペプチド質量の集合は、ペプチド質量フィンガープリンテイングとよく称呼される方法でタンパク質/DNAデータベースの検索に用いられ得る(51−53)(図14)。この方法において、データベースにエントリーされたタンパク質は、それらの予測されたトリプシン消化パターンに適合するペプチド質量数に従って階級付けされることができる。市販のソフトウェアは、データベースのサイズ、ペプチドに適合する番号、および異なるペプチドに基づいたスコア付けの方法を提供するものである。観察されたペプチド数、測定の正確さ、特定の種のゲノムの大きさに従って、明瞭に同定することができる。
【0328】
MS/MSスペクトルは、タンパク質同定に用いることができる情報の第二のセットである。MS/MSスペクトルは、特定のペプチドのアミノ酸配列に関する断片化パターンを含む。一般的に、MS/MSスペクトル分析はかなり集約的である。これらのスペクトルの解釈に用いられる方法は、必要な使用者の介入のレベルに従って3つのサブグループに分類することができる。
【0329】
第一のサブグループにおいては、スペクトルの解釈は必要ではない。スペクトルに含まれる情報は、データベースに含まれるタンパク質/DNA配列情報と直接関係づけられる。この特定の作業のために、様々なアルゴリズムが開発されている。これらのアルゴリズムにより、タンパク質およびDNAデータベースに対して自動的に未解釈のMS/MSスペクトルを検索し、そのいくつかは無料で利用でき(非営利団体のもの)、ウェブ上でアクセス可能である。Matrix SciencesのMascot(www.matrixscience.com)、およびUCSFのProteinProspector(http://prospector.ucsf.edu)が最も一般的に用いられるウェブベースのMS/MS検索エンジンである。タンパク質同定は、一般的に、同じタンパク質に適合するペプチドの数により明確である。普及している他のアルゴリズムとしては、「Sequest」がある(54〜56)。提示されたいずれのMS/MSスペクトルに関して、このアルゴリズムは、上位500個の等重のペプチドをタンパク質/DNAデータベースから検索し、対応する予想スペクトルが得られる(図15)。高速フーリエ変換を用いて頻度ドメインで多重化させることによって、予想スペクトルを迅速に測定スペクトルに適合させる。次に、相関パラメーター(予測スペクトルと測定スペクトルとの間の適合のクオリティーを示す)を推測する。高い相互相関は、測定スペクトルとの高い適合を示す。このアルゴリズムを用いてわずか1種のペプチドをタンパク質同定したとしても、多くのペプチドがデータベース中で同じ登録物にマッチするため、タンパク質の由来の明瞭な同定をよく達成することができる。Sequestアルゴリズムは、集中的に計算するので、ハイスループットに対してデマンドがデュアルCPUサーバーをすぐに麻痺させることがある。本質的にSequestが遅いのは、それが最高にマッチする500個の等重のペプチドを見出そうとするためである。このリストをコンパイルするために繰り返しスキャンされるデータベースが大規模であればあるほど、この機能にかかる時間は長くなる。ソフトウェアの改良バージョン(Turbo−Sequestという)は、データベースを前処理して整えるため、検索時間が大幅に改良される。
【0330】
第二のサブグループにおける方法は全て、MS/MSスペクトルの部分的な解釈を行うため、人間の介入が必要である。有力な方法は、しばしば「配列タグ」と呼ばれるが(57〜59)(図16)、MS/MSスペクトルにおける数個の特定の断片間の質量間隔を読み取り、ペプチド配列の短い区間(タグ)を得ることからなる。このタグと残基の質量情報とを用いて、等重のペプチドに関してタンパク質データベースから得られた配列と、計算質量とを比較し、ペプチドの由来を確認することができる。それぞれのMS/MSスペクトルは、タグの作製、それに続くデータベース検索が必要である。多くのペプチドが同じタンパク質にマッチすることによって、タンパク質の明瞭な同定が確立される。数年に渡り、配列タグを用いてデータベース検索するために、このテーマに関する様々なバリエーションが開発されてきた。大規模プロテオミクスに関する努力における「配列タグ」法の主な制約は、MS/MSスペクトルの必要な部分解釈を手作業で行うために必要とされる労力と専門知識である。この問題を解決するために、配列タグを自動的に作製する試みが行われている。
【0331】
最後のサブグループは、タンパク質のデノボ配列解析(60、61)と呼ばれ、これはしばしば適合情報がデータベースで得られない場合の最後の方策として用いられ、MS/MSスペクトルのクオリティーは良好である。ペプチドのMS/MSスペクトルはラダー型の情報を含み、これは、原理的にはそのアミノ酸配列を示す。経験豊富なマススペクトロメトリー技師は、抽出物CIDスペクトルからペプチド配列を手作業で抽出することができる(デノボ配列解析)。
【0332】
研究中のデータのクオリティーおよび種の複雑さによって、ペプチドMS/MSスペクトルとタンパク質配列登録物との間で一つの確信的な適合があれば、タンパク質またはタンパク質ファミリーを同定するのに十分である。低い適合度および/または部分的な適用範囲のデータベースを扱う場合、および、SNPデータベースにアクセスするためには、同定されたペプチドがタンパク質に対して特有でない場合、明瞭な同定に必要な配列の適用範囲は、相同タンパク質に対して増加する。同じタンパク質に対するマッチする続いて得られるペプチドMS/MSはいずれも、さらに同定の信頼度を増すことは明らかである。
【0333】
これらMSに基づく方法それぞれの最終結果により、分析用に提示されたタンパク質または新規のタンパク質の部分アミノ酸配列の同一性がもたらされる。
【0334】
結果
ペプチド混合物のMS分析により、ペプチドの質量(MSスキャン)、それらのアミノ酸配列(MS/MSスキャン)、および、場合によって翻訳後修飾(例えばリン酸基)の存在に関する情報を提供することができる。
【0335】
本明細書で説明した分析方法は、タンパク質混合物に寛容であり、電気泳動におけるタンパク質の共移動はMS分析により独立して同定される。本研究で説明された実施例において、タンパク質smGは、smEに関し、smEを含む同じゲル断片で同定された(MSおよびMS/MSデータは示さず)。本明細書で報告した特定の発見は、タンパク質pIClnがスプライセオソーム機構と直接相互作用することによってRNAプロセシングの調節に関与するという示唆と一致する。興味深いことに、データによればpICLn様々なタンパク質−タンパク質相互作用に関与することが示されているが、簡単に認識できるタンパク質−タンパク質相互作用ドメインは全く含んでいない。我々は、pICLnは新規のタンパク質相互作用ドメインおよび/または結合部位を含む可能性がある、と結論付ける。
【0336】
この情報で概説されたワンステップの親和性による精製法の魅力的な活性の特徴は、細胞中に存在するタンパク質複合体を捕獲するように設計されていることである。可能性のある制限は、異常発現のレベルが「正常な」レベルを超過する、および、293細胞の細胞環境がベイトタンパク質に対する生理学的な結合パートナーを供与しない、ということである。タグの位置がタンパク質機能を妨害する可能性がある。これは、2以上の親和性タグを用いて、それを興味のあるタンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端両方に適用することによって、部分的に処理される。この方法のバリエーションとして、生理学的なレベルのベイトタンパク質を発現する安定な細胞系をつくること、または、野生型タンパク質に対して向けられた抗体を用いて内在性ベイトおよびベイト関連タンパク質を捕獲することがある。様々な関連する細胞型および細胞状態から内在性タンパク質複合体を捕獲する能力は、プロテオミクスにおける挑戦であり続ける。
【0337】
タンパク質−タンパク質相互作用を測定するための酵母2−ハイブリッド法は広範囲の二元的なタンパク質親和性に適しているが、その一方で、誤った陽性結果、すなわち、相互作用するタンパク質ペアを同定するが、必ずしもインビボで結合するとは限らない結果が発生しやすい。ワンステップの親和性による捕獲方法は、いくつもの弱い相互作用の付加的な効果により安定化された複数のタンパク質複合体を精製する可能性がある。この方法の考えられる制限は、初期データがタンパク質複合体における接点の個々のポイントを示していないことである。これは、相互作用を検証する必要性を強調する。タンパク質相互作用を検証する一つのメカニズムは、疑わしい複合体の各メンバー上にエピトープタグを順に置くことによって、複合体を通して「検証する」ことである。これは、相互作用を検証することに役立ち、数種のタンパク質で構成される複合体の二元的な相互作用を逆重畳積分するための情報を提供する。
【0338】
【表1】
【0339】
【表2】
【0340】
【表3】
【0341】
【表4】
【0342】
【表5】
【0343】
【表6】
【0344】
【表7】
【0345】
【表8】
【0346】
【表9】
【0347】
【表10】
【0348】
【表11】
【0349】
【表12】
【0350】
【表13】
【0351】
【表14】
【0352】
【表15】
【0353】
【表16】
【0354】
【表17】
【0355】
【表18】
【0356】
【表19】
【0357】
【表20】
【0358】
対等物
詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、これらは単に解説のためだけに提供されることを理解すべきであり、なぜなら、本明細書の詳細な説明から、本発明の本質および範囲内での様々な変化および改変が当業者には明白であるためである。
上述で補足説明された参考文献の全文を以下に報告するが、これらは参照することにより本明細書に含める。
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【図面の簡単な説明】
【図1A】
Ras−GRF2の機能ドメインを示す。
【図1B】
分裂酵母において既知のGRF2経路を示す。
【図1C】
NdrおよびSkb1の結合を示すと仮定されたGRF2複合体を示す。
【図2】
ヒト細胞から単離されたGRF2結合パートナーのゲル分離であり、GRF2結合パートナーのゲル上の位置を示す。
【図3A】
FLAG−Ndr(オカダ酸存在下で)免疫沈降実験から単離されるポリペプチドの代表的なスペクトルである。BLAST分析を用いて、これらのポリペプチドをスピンドリンタンパク質の断片と同定した。
【図3B】
FLAG−Ndr(オカダ酸存在下で)免疫沈降実験から単離されるポリペプチドの代表的なスペクトルである。BLAST分析を用いて、これらのポリペプチドをスピンドリンタンパク質の断片と同定した。
【図4A】
FLAG−Ndr(オカダ酸存在下で)免疫沈降実験から単離されるポリペプチドの代表的なスペクトルである。BLAST分析を用いて、これらのポリペプチドがEST705582のコーディング配列を含むことを同定した。この新規のタンパク質は、MOB様タンパク質に対する相同性を有する。
【図4B】
FLAG−Ndr(オカダ酸存在下で)免疫沈降実験から単離されるポリペプチドの代表的なスペクトルである。BLAST分析を用いて、これらのポリペプチドがEST705582のコーディング配列を含むことを同定した。この新規のタンパク質は、MOB様タンパク質に対する相同性を有する。
【図5】
EST6593318およびEST5339315のコーディング配列を含むタンパク質の完全長タンパク質配列である。当該タンパク質を同定するのに用いられたペプチドを一重下線、または隣接ペプチドを二重下線で示す。その完全長cDNAを、EST6593318の5’末端とオリゴdTプライマーとの特異的プライマーを用いたPCR増幅によりクローニングした。予想タンパク質は、分子中央に6個のWD40リピートと、特有のNおよびC末端配列とを含む。
【図6】
MOB関連タンパク質(EST705582またはEST8922671のコーディング配列を含む)およびスピンドリンのタンパク質配列である。タンパク質同定に用いられたペプチドを下線で示す。
【図7A】
本発明で同定されたMOB関連タンパク質(図中、上の7配列)と、S. cerevisiaeおよびS. pombeからのMOB1タンパク質とを比較したアライメントである。
【図7B】
図7Aのアライメントの続きである。
【図7C】
図7Aのアライメントの続きである。
【図8】
図7のMOB関連タンパク質の関係を示す系統樹である。
【図9】
Flag−pIClnおよび関連タンパク質の免疫沈降である。細胞溶解物を抗FLAGアガロースで免疫沈降させ、結合タンパク質をFLAGペプチドで溶出させた。溶出したタンパク質を4〜15%グラージェントSDSゲルで分離し、クーマシーブルーで染色した。レーン1は、HEK293T細胞溶解物である。レーン2は、FLAG−pIClnを発現するHEK293T細胞の溶解物である。タンパク質分子量マーカーの分子量を示す(M.W.)。マススペクトロメトリーで同定されたタンパク質の部分集合を標識する。本明細書で説明されたMSおよびMS/MS分析の結果として、smEおよびsmGを含むことがわかった染色されたタンパク質のバンドを矢印で示す。
【図10】
タンパク質消化物のMALDI−TOF分析の概略図である。上述したように、興味のある切り出しバンドを消化し、生成したペプチドを抽出する。そのペプチド混合物を、マトリックス溶液(本明細書中で説明された)と共にMALDIプレート上に置く。液体を乾燥させた後、そのプレートをMALDI−TOF装置の減圧室に置く。そのサンプルを気相に迅速に移送し、スポット上にレーザー光線を当てることによってTOF装置で分析する。消化物に含まれていたペプチドの質量電荷比(m/z)を示すMSスペクトルが得られる。
【図11】
タンパク質のゲル消化、および、マススペクトロメトリー分析のペプチド回収のプロトコールである。
【図12】
マススペクトロメトリーサンプルの調製プロトコールである。ZipTipを用いて脱塩し、サンプルをMALDIプレートに載せ、MALDI−TOF MS分析する。
【図13A】
タンパク質消化物のMS/MS分析の概略図である。上述したように、興味のある切り出しバンドを消化し、生成したペプチドを抽出する。ペプチド混合物を、エレクトロスプレーイオン化によりMSに注入する。MSスペクトルを得た後、所定のm/zを有するペプチドをスペクトルから抽出し、断片化用に選択する。選択されたペプチドをガス分子を用いた衝突誘起解離(CID)により断片化する。
【図13B】
タンパク質消化物のMS/MS分析の概略図である。ペプチド結合で断片化が起こり、優先的にb型またはy型のプロトン化した断片が生じ、それにより断片は電荷を維持する(図示したとおり)。次に生成した断片をそのm/z比に従って分離する。選択されたペプチドのアミノ酸配列に関する情報を含むMS/MSスペクトルが得られる。
【図13C】
タンパク質消化物のMS/MS分析の概略図である。ペプチド結合で断片化が起こり、優先的にb型またはy型のプロトン化した断片が生じ、それにより断片は電荷を維持する(図示したとおり)。次に生成した断片をそのm/z比に従って分離する。選択されたペプチドのアミノ酸配列に関する情報を含むMS/MSスペクトルが得られる。
【図14】
MALDI−TOFで得られた質量測定結果に基づくタンパク質同定のプロセス、すなわちペプチドマスフィンガープリンティングである。図1において矢印で示されたsmEバンドの分析である。測定質量は、MALDI−TOFで得られたMSスペクトルから抽出される。次にその質量を、タンパク質データベースのコンピュータ内での解析から得られた計算質量と合わせる。最大数適合したデータベース登録を、可能性のある同定として一般的に印をつける。この場合、問題のバンドは、ヒトの核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチドEと同定された。
【図15】
未解釈のMS/MSスペクトル、すなわちSequestを用いたデータベース検索に基づくタンパク質同定の例である。このソフトウェアは、質量情報を用いて、データベースから500個の関連ペプチドを同定する。次に予想スペクトルをその500個のスペクトルから得て、実測スペクトルと相関させ、相関信頼値を得る。次に、最もよく適合したペプチドを可能性のある同定として選択する。たった一つのペプチドを用いて同定を行ったとしても、同じタンパク質中の異なるペプチドに適合するMSスペクトルの冗長性(redundancy)により、明瞭なタンパク質同定を達成することができる。Sequest分析は、図1において矢印で示したバンドを処理することによってなされた。そのMS/MSスペクトルは、酸化されたメチオニン(Mox)を有するペプチドVMoxVQPINLIFRとして同定され、このバンド中のタンパク質を、核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチドEと同定した。また、他のペプチドから得られたMS/MSスペクトルもこのタンパク質と適合しており、同定が確認された。追加のペプチドは、共に移動した別のタンパク質、すなわち核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチドG(smG;データは示さず)を含むバンドを示した。
【図16】
データベース検索とMS/MSスペクトルの部分的な解釈、すなわち配列tagに基づいたタンパク質(smE)同定の例である。配列tag方法を用いて、図1において矢印で示されたバンドのトリプシン消化物から単離されたペプチドから得られたMS/MSスペクトルを分析した。そのMS/MSスペクトルを部分的に解釈すると、アミノ酸配列の小さいストレッチが得られる。次に、ペプチドの質量、その配列tag成分、およびtag前後での差し引きの質量を用いて、データベースを検索する。ペプチドが適合した場合、リストは通常スコアリングスキームを示さないで得られる。そのMS/MSスペクトルは、酸化されたメチオニン(Mox)を有するペプチドVMoxVQPINLIFRとして同定し、これは核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチドEとして同定された。また、他のペプチドから得られたMS/MSスペクトルもこのタンパク質に適合し、同定が確認された。
【図17A】
FLAG−Skb1の終期における局在である。分裂溝における局在は、有糸分裂中のS. pombe でみられる局在と一致する。
【図17B】
FLAG−Skb1の終期における局在である。分裂溝における局在は、有糸分裂中のS. pombe でみられる局在と一致する。
【図18A】
核スペックルに似た構造における内在性Skb1の局在である。Skb1の核局在は、pICln、Skb1相互作用タンパク質はsnRNPsで共に免疫沈降し、またスペックル様の核構造中に保存される、という発見と一致する。またこれは、pIClnが、Skb1とその基質のいくつか(例えば、smD1やsmD3)を共に運搬するアダプタータンパク質として機能するというモデルと一致する。
【図18B】
核スペックルに似た構造における内在性Skb1の局在である。Skb1の核局在は、pICln、Skb1相互作用タンパク質はsnRNPsで共に免疫沈降し、またスペックル様の核構造中に保存される、という発見と一致する。またこれは、pIClnが、Skb1とその基質のいくつか(例えば、smD1やsmD3)を共に運搬するアダプタータンパク質として機能するというモデルと一致する。
【図19A】
GRF2の存在により、オカダ酸および/またはイオノマイシンで標的化された細胞中のNdrキナーゼ活性が高められる可能性があることを示す。これは、GRF2がオカダ酸の存在によりNdrと共に免疫沈降するという発見と一致する。オカダ酸とイオノマイシンとを用いた二重の処理により、オカダ酸のみでの処理と比べてNdr活性がわずかに減少した。これは、イオノマイシン処理において、担体としてDMSOが存在することによる可能性がある。
【図19B】
GRF2の存在により、オカダ酸および/またはイオノマイシンで標的化された細胞中のNdrキナーゼ活性が高められる可能性があることを示す。これは、GRF2がオカダ酸の存在によりNdrと共に免疫沈降するという発見と一致する。オカダ酸とイオノマイシンとを用いた二重の処理により、オカダ酸のみでの処理と比べてNdr活性がわずかに減少した。これは、イオノマイシン処理において、担体としてDMSOが存在することによる可能性がある。
【図20A】
sudD関連タンパク質のアライメントである。Aspergillus nidulans(sudD)およびSaccharomyces cerevisiae(RIO1)からのsudDタンパク質と、すでに同定されたヒトsudDタンパク質(HssudD)と、他のヒトsudD関連タンパク質(GI13543922;AF258661;FLJ11159)とを、共に並べた。影をつけた領域は保存領域を示し、最も暗い領域は、最も高度に保存された領域を示す。
【図20B】
図20Aのアライメントの続きである。
【図20C】
図20Aのアライメントの続きである。
【図20D】
図20Aのアライメントの続きである。
Claims (22)
- GRF2、GRF2相互作用タンパク質、Ndr相互作用タンパク質、Skb1相互作用タンパク質、PP2C相互作用タンパク質、pICln相互作用タンパク質、4.1SVWL2相互作用タンパク質、smD1相互作用タンパク質、およびsmD3相互作用タンパク質からなる群より選択される少なくとも2種のタンパク質の組み合わせを含む、単離されたタンパク質複合体。
- タンパク質はそれぞれ哺乳動物起源である、請求項1に記載の単離されたタンパク質複合体。
- タンパク質の少なくとも1種は融合タンパク質である、請求項1に記載の単離されたタンパク質複合体。
- 表1、2、3、4、5、6、7または8に示されたタンパク質のアミノ酸配列またはその相同体を有する、単離されたタンパク質または組換えタンパク質。
- 請求項4に記載のタンパク質の完全長または部分的なコーディング配列のいずれかを含む、単離された核酸配列。
- タンパク質複合体のモジュレーターを同定する方法であって、
(i)GRF2、GRF2相互作用タンパク質、Ndr相互作用タンパク質、Skb1相互作用タンパク質、PP2C相互作用タンパク質、pICln相互作用タンパク質、4.1SVWL2相互作用タンパク質、smD1相互作用タンパク質、およびsmD3相互作用タンパク質からなる群より選択された少なくとも2種のタンパク質のタンパク質複合体を含む反応混合物を作製し、
(ii)前記反応混合物と試験薬剤とを接触させ、そして、
(iii)下記の群:
(a)上記タンパク質複合体の存在度の変化、
(b)上記複合体の活性の変化、
(c)上記複合体の少なくとも1種の活性の変化、
(d)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体またはその成分の細胞内局在の変化、
(e)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子の転写レベルの変化、
(f)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の存在度の変化、
(g)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の活性の変化、および、
(h)上記反応混合物が細胞全体の場合、細胞中の第2メッセンジャーレベルの変化
より選択される、1以上の活性に関する試験薬剤の効果を測定する
ことを含む上記方法。 - GRF2依存性の成長を調節できる薬剤を同定する方法であって、
(i)GRF2相互作用タンパク質、Ndr相互作用タンパク質、Skb1相互作用タンパク質、PP2C相互作用タンパク質、pICln相互作用タンパク質、4.1SVWL2相互作用タンパク質、smD1相互作用タンパク質、およびsmD3相互作用タンパク質からなる群より選択されたタンパク質を含む反応混合物を作製し、
(ii)前記反応混合物と試験薬剤とを接触させ、そして
(iii)下記の群:
(a)上記タンパク質複合体の存在度の変化、
(b)上記複合体の活性の変化、
(c)上記複合体の少なくとも1種の活性の変化、
(d)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体またはその成分の細胞内局在の変化、
(e)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子の転写レベルの変化、
(f)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の存在度の変化、
(g)上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の活性の変化、および、
(h)上記反応混合物が細胞全体の場合、細胞中の第2メッセンジャーレベルの変化
より選択される試験薬剤の1以上の活性の効果を検出する
ことを含む上記方法。 - 製薬上許容できる賦形剤と共に、分析で同定された1つ以上の薬剤を配合する工程をさらに含む、請求項6または7に記載の方法。
- 細胞と、請求項6または7に記載の分析に従って同定された薬剤とを接触させることを含む、細胞の成長状態を改変する方法。
- 細胞と、請求項6または7に記載の分析に従って同定された薬剤とを接触させることを含む、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法。
- 細胞と、請求項6または7に記載の分析に従って同定された薬剤とを接触させることを含む、細胞の分化を誘導する方法。
- 請求項6または7に記載の分析に従って同定された薬剤の治療上有効な量を、細胞のRas依存性増殖に関与する症状を有する動物に投与することを含む、該症状の重篤度を軽減する方法。
- 細胞と、Rasシグナル伝達経路の一部の活性を抑制することができる薬剤とを接触させることを含む、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法。
- 細胞と、Skb1のメチルトランスフェラーゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法。
- 細胞と、Skb1のキナーゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法。
- 細胞と、Skb1の正常な細胞下局在を抑制する薬剤とを接触させることを含む、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法。
- 細胞と、PP2Cのホスファターゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法。
- 細胞と、pIClnの活性の阻害剤とを接触させることを含む、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法。
- 請求項4に記載のタンパク質を生産するように遺伝子操作された宿主細胞。
- 細胞中の異常なGRF2依存性シグナル伝達を検出する方法であって、
(i)GRF2相互作用タンパク質、Ndr相互作用タンパク質、Skb1相互作用タンパク質、PP2C相互作用タンパク質、pICln相互作用タンパク質、4.1SVWL2相互作用タンパク質、smD1相互作用タンパク質、またはsmD3相互作用タンパク質をコードする遺伝子の発現の改変されたレベル、
(ii)GRF2相互作用タンパク質、Ndr相互作用タンパク質、Skb1相互作用タンパク質、PP2C相互作用タンパク質、pICln相互作用タンパク質、4.1SVWL2相互作用タンパク質、smD1相互作用タンパク質、またはsmD3相互作用タンパク質の安定性、翻訳後修飾、細胞下局在および/または酵素活性の改変されたレベル、および、
(iii)GRF2相互作用タンパク質、Ndr相互作用タンパク質、Skb1相互作用タンパク質、PP2C相互作用タンパク質、pICln相互作用タンパク質、4.1SVWL2相互作用タンパク質、smD1相互作用タンパク質、またはsmD3相互作用タンパク質を含む複合体の活性の改変されたレベル
の1つ以上に関して細胞をスクリーニングする工程を含む、上記方法。 - 細胞と、Ndrのキナーゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法。
- 細胞と、Ndrの正常な細胞下局在を抑制する薬剤とを接触させることを含む、細胞のRas依存性増殖を抑制する方法。
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