WO2007033514A1

WO2007033514A1 - Combinaison de protéines caractérisée dans le transfert d'énergie entre molécules fluorescentes et utilisation de cette combinaison de protéines

Info

Publication number: WO2007033514A1
Application number: PCT/CN2005/001488
Authority: WO
Inventors: Jun Zhang; Baoquan Guan; Wenxin Luo; Shengxiang Ge; Ningshao Xia
Original assignee: Xiamen University; Yang Sheng Tang Company Limited
Priority date: 2005-09-19
Filing date: 2005-09-19
Publication date: 2007-03-29

Description

具有荧光共振能量转移特点的

蛋白组合及其用途发明领域

本发明涉及一种具有荧光共振能量转移特点的蛋白组合，其由来自同一抗体的重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白，和任选的，由该抗体识别的特异性抗原组成，其中，重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白中的任一个，或者任选的该抗体识别的特异性抗原，分别带有作为能量供体的荧光物质（或化学发光物质），或者带有作为能量受体的荧光淬灭物质。本发明还涉及利用该蛋白组合检测样本中目标抗原的方法，以及含有该蛋白组合的检测样本中目标抗原的试剂盒。背景技术

免疫检测技术是一种超微量的生物分析技术，它利用了抗原 -抗体间免疫反应的高度亲和性以及作为探针的标记物的高度可测性，能够对生物体内微量、超微量的物质进行准确的定量测量，具有操作简单、特异性好、灵敏度高等优点，是疾病诊断和医学研究的重要方法。按照标记物的不同，免疫分析主要可以分为放射性免疫分析（ RIA )、酶免疫分析（ EIA )、发光免疫分析 ( LIA ) 和荧光免疫分析（ FIA )。免疫检测的自动化和简便化是免疫检测发展的最主要方向，需要更好的提高检测的自动化程度和快速准确性。目前基因工程、细胞工程和酶工程技术开发的重组抗原、单克隆抗体及酶技术已逐步取代原有免疫诊断试剂，为各种疾病的诊断增加了新型的有效试剂盒。

免疫分析可在不同的相态下进行反应分析，根据反应系统的物理状态的不同，可以分为均相免疫分析和非均相免疫分析。在现有的免疫检测中，非均相相免疫法以 RIA和 EIA应用最为广泛，但非均相免疫分析需要一个将结合与未结合游离标记物的分离步骤，即在定性或定量分析之前必须尽可能的去除过量的未结合的标记试剂，从而提高信噪比和分析的灵敏度，因而操作相对复杂。分析游离相与结合相是关键，也最容易产生误差。而且由于包括了包被（抗原或抗体）、封闭、多次孵育和洗涤以及检测等过程，最快的也需 2小时以上。

均相免疫测定因其具有不需要分离结合与未结合分子即可直接测定以及均相反应较固相、半固相反应更为迅速的特点，成为目前免疫检测技术研究中的重要方向。其中均相荧光免疫分析 ( homogeneous fluorescence immunoassay ₇ hFIA ) 在抗原抗体反应完成后，无需将已结合的和游离的标记物加以分离，可以直接进行测定，操作简单快捷，易于实现自动化，得到了广泛的应用。

荧光共振能量转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer,

FRET )是指两个不同的荧光基团中，如果一个供体基团的发射光谱与另一个受体基团的激发光谱有一定的重叠，当两个荧光基团的距离足够近时就会发生的荧光能量从供体向受体转移的现象。

1948年 Fdrster首次提出 FRET的发生过程，认为一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体（Donor ) 和能量受体（ Acceptor ) 对，它们之间由于偶极-偶极的相互作用，激发供体分子的光子能量可能被传递至受体分子，之后受体分子通过发射出能量降低的光子而松弛，其直观的表现就是供体和受体之间达到合适的距离内（l-10nm ) 以供体的激发光激发，供体产生的荧光强度比它单独存在时要低得多而受体发射的荧光却大大增强，同时伴随着供受体荧光寿命的相应缩短或延长。

1976 年 Ullman 等人首先提出了基于荧光共振能量传递的 hFIA , 即均相荧光共振免疫测定（Homogeneous Fluorescence resonance immunoassay, hFRIA ), 实现了抗原 -抗体反应的均相测定 (Ullman E F,Schwarzberg M， Rubenstein K E. J Biol chem, 1976， 251(14): 4172-4178)。

目前均相荧光共振免疫测定已应用于检测抗原。 Ueda 等 [Ueda H, Kubota K, Wang Y, et al. Biotechniques, 27( 4 ): 738-742 ( 1999 ) 1用琥珀酰亚胺脂和荧光黄 -X 分别标记抗体的重链和轻链，两者在比色杯中混合后再加入抗原，抗原抗体的特异结合，使琥珀酰亚胺脂与荧光黄 -X靠近，用 490nm波长激发琥珀酰亚胺脂，检测到 520nm发射光减弱， 605nm的发射光增强，随着抗原量的增加， 605nm的荧光亦增强。在检测中需要同时监测两个不同波长的发射光强度。

在专利文献 CN1136450C 中提出了通过一对荧光标记的蛋白检测标本中抗体存在的方法，但由于其需要进行全波长扫描才能看出 FRET信号的变化，因此必须具备荧光全旙仪等相对较为昂贵、要求较高的全波长扫描仪器，使其应用受到了一定的限制。

抗体 Fv由重链可变区 VH和轻链可变区 VL通过非共价键结合在一起，是抗体中具有完整抗原结合位点的最小功能片段。可变区之间的相互作用可以应用于荧光共振免疫检测。 Arai等 [Arai R,Ueda H,Tsumoto K,et al. Protein Engineering, 2000， 13(5):369-376.]改进了均相免疫测定技术，提出开放三明治荧光免疫测定 ( open sandwich fluoroimmunoassay )。通过对基因工程萩得的重链可变区和轻链可变区分别标记绿色荧光蛋白的光谱异构体，形成一个检测体系，加入特异抗原，组合出免疫复合物， VH 和 VL被重组在一起，标记的供受体对也聚到一起，检测到 FRET 的发生。通过这种方法检测到鸡蛋溶菌酶（HEL ) 及其抗体 HyHEL-10的可变区之间的特异性结合。之后又对此进行了改进，能量供体选用了生物发光物质 Renilla 荧光素酶，提高了检测的灵敏度 [Arai R,Nakagawa H,Tsumoto K,et al. Analytical Biochemistry, 2001,289:77-81】。但是，他们在研究中需要考虑能量供体和能量受体两个方面的因素，如前者要以 EBFP 360nm激发，分别测量 444nm的 EBFP荧光强度和 506nm的 EGFP荧光强度，后者要同时检测 475nm和 525nm的荧光强度，并且必须根据两个不同波长发射光强度建立检测抗原的指标，因而能够同时检测双波长的昂贵仪器成为必要。另外，上述两者又都局限在非竟争模式的检测方法。

因此，为了能够克服上述不足之处，使免疫检测方便、快捷，检测成本降低，本发明致力于利用符合 FRET特征的能量供 /受体荧光基团，建立一类新型的均相荧光共振免疫检测试剂及检测方法，以快速、准确的检测标本中的抗原。发明内容

本发明的一个方面涉及一种具有荧光共振能量转移特点的蛋白组合，其由来自同一抗体的重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白组成，其中，重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白中的一个带有作为能量供体的荧光物质或者化学发光物质，另一个则带有作为能量受体的荧光淬灭物质，其中，所述作为能量供 /受体的荧光物质和荧光淬灭物质为符合荧光共振能量转移（FRET ) 特征的试剂。

已知符合 FRET特征的能量供 /受体荧光基团之间发生有效的能量转移的条件是相当苛刻的，必须满足以下几个条件：（1 ) 供体的发射光谱与受体的激发光谱必须重叠；（2 )供体与受体的荧光生色团必须以适当的方式排列；（3 )供 /受体的激发光谱、发射光谱都要分得足够开；（4 )供 /受体之间必须距离足够近，达到 FRET发生的距离范围。因此特定能量供 /受体的选择对于 FRET的发生至关重要，也是基于 FRET的方法和应用需要重点解决的难点之一。

荧光淬灭物质是一类特殊的物质，其只有激发光而没有发射光，由于光激发而产生的能量以热能等方式而非以光能的形式散发出去。本发明以荧光淬灭物质作为整个 FRET体系的能量受体，则当发生 FRET时，以能量供体的激发波长激发后，供体的能量转移给受体而能量降低，荧光强度降低，而能量受体为荧光淬灭物质，没有新的发射光产生，因而只需检测能量供体在其发射波长处的荧光强度变化就可以知道整个体系 FRET变化情况，成为监测体系 FRET变化的最为有效、最为方便的指标，同时由于最大限度的排除了能量受体发射光的干扰，使检测背景更为清晰，实现起来更为容易。

荧光蛋白和发光蛋白尤其是绿色荧光蛋白（GFP ) 是近年来出现的革命性的标记分子。 GFP是一类存在于水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。在对其关键残基进行一系列修饰和突变后，获得了多种性能更加优良的光谱异构体。目前报道的主要有绿色荧光蛋白（GFP )、蓝色荧光蛋白（BIT )、黄色荧光蛋白（ΥΓΤ )、青色荧光蛋白（CFP ) 和红色荧光蛋白（RFP ) 等。 GFP的各种突变型很适合作为 FRET的特异荧光团。其优点在于 GFP能够与目的蛋白融合表达，因而标记比恒定，避免了化学标记的过标记或标记不足的缺点，而且其光谱异构体包括了从紫外到红色等较长的波长范围，提供了应用上的多种选择。对于化学合成荧光物质和稀土元素，由于研究历史较久，因而其荧光特性已有相当的了解，经双功能交联剂修饰后可以对多种蛋白的氨基、羧基或者巯基等基团进行标记，具有荧光量子产率高、反应后荧光光谱变化显著、易于检测的优点，可以作为 FRET的能量供受体。

在本发明中，适于所述作为能量供体的荧光物质优选的，选自荧光蛋白、荧光素、稀土元素等荧光物质，更优选的，选自绿色荧光蛋白（GFP ),蓝色荧光蛋白（BFP )，黄色荧光蛋白（YFP ), 青色荧光蛋白（CFP ) 和红色荧光蛋白（RFP ) 的荧光蛋白，最优选的，作为能量供体的荧光物质为绿色荧光蛋白。在本发明，适于作为能量供体的化学发光物质选自发光蛋白和鲁米诺、过氧草酸盐。在本发明中适于作为能量受体的荧光淬灭物质为 QSY-35 (分子标记公司）。

具体的，选择一对来自同一抗体的重链可变区和轻链可变区蛋白，分别标记荧光特性能够满足发生 FRET的能量供受体对（其中能量受体限定为荧光淬灭物质）而得到荧光重链可变区（VH ) 和荧光轻链可变区（VL )。根据免疫球蛋白的分子结构和抗原抗体特异性反应的原理，特定的荧光 VH与 VL互相结合形成 IV 结构，将两种荧光物质的距离拉近，达到 FRET的有效发生范围 l ~ 10nm而发生 FRET现象。一旦加入相应抗原后，由于抗原与 Fv的特异结合，抗原结合到 VH与 VL之间的抗原结合位点，相应的拉长了两种荧光物质的距离，使 FRET现象减弱，荧光淬灭減弱，从而能量受体的发射光增强。

通过相应的荧光检测仪器测定能量供体发射光荧光强度的变化，可以判断待测样品中是否有针对所选抗体的特异性抗原的存在。本发明所述组合蛋白通过利用具有 FRET特征的能量供 /受体试剂，有效的避免了双波长检测的繁杂和能量受体发射光的干扰，满足方便、快捷、准确的应用要求。

在本发明的一个具体实施方案中，涉及一种具有荧光共振能量转移特点蛋白组合，其中所述带有作为能量供体的荧光物质的融合蛋白为由来自抗 HBV pre-Sl单克隆抗体 MA18 / 7的重链可变区与增强型绿色荧光蛋白 EGFP组成的 GaH，所述带有作为能量受体的荧光淬灭物质的融合蛋白为由来自抗 HBV pre-Sl单克隆抗体 MA18 / 7的轻链链可变区与荧光淬灭剂 QSY一 35组成的 QL。

本发明人经研究发现具有 FRET特征的蛋白组合，可以应用于检测标本中抗原的存在，且该检测具有方便、快捷、迅速，易于实现和高特异性的特点，可以用于疾病检测中。

本发明另一方面涉及一种具有荧光共振能量转移特点的蛋白组合，其由来自同一抗体的重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白以及由所述抗体识别的特异性抗原组成，其中当选自所述重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白中的一个带有作为能量供体的荧光物质或者化学发光物质时，所述抗体识别的特异性抗原带有作为能量受体的荧光淬灭物质；而当选自所述重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白中的一个带有作为能量受体的荧光淬灭物质时，所述抗体识别的特异性抗原带有作为能量供体的荧光物质或者化学发光物质，且所述作为能量供 /受体的荧光物质和荧光淬灭物质为符合荧光共振能量转移（FRET )特征的试剂对。

具体的，选择一种与待测抗原具有相同表位的抗原蛋白，和特异识别此抗原的抗体的重链可变区或轻链可变区蛋白，分别标记荧光特性能够满足发生 FRET的能量供受体对（其中能量受体限定为荧光淬灭剂），再加上无荧光标记的相应的抗体轻链可变区或重链可变区蛋白，根据抗原抗体特异反应的原理，抗原与抗体重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白构成的 Fv 片段特异结合，则两种荧光物质距离拉近，达到发生 FRET的距离要求以内，即 1 ~ 10nm, 而发生 FRET现象。加入待测抗原后，待测抗原与荧光标记的抗原蛋白竟争而减弱了 FRET现象，荧光淬灭作用减弱，相应的能量供体的发射光增强。测定能量供体发射光荧光强度的变化，可以判断待测样品中是否有特异抗原的存在。

本发明的这一组蛋白中涉及荧光淬灭物质，有效的避免了双波长检测的繁杂和能量受体发射光的干扰，满足方便、快捷、准确的应用要求。

本发明又一方面涉及一种用于检测样本中目标抗原存在的方法，其包括 1 )在适于所述待测抗原与权利要求 1所述的蛋白组合中所述抗体结合的条件下，将待测样本与所述蛋白组合相接触；和 2 )检测待测样本与所述蛋白组合相互接触前后能量供体的相对荧光强度的变化，判断待测样本中与所述抗体之重链可变区蛋白和 /或轻链可变区蛋白特异结合的抗原的存在。

根据本发明的一个具体实施方案，为检测标本中 HBV pre-Sl 抗原的存在与否，本发明人选择抗 HBV pre-Sl 单克隆抗体 MA18/7 的重链可变区和轻链可变区蛋白，将重链可变区通过一段 3个 Ala的柔性 linker与增强型绿色荧光蛋白（EGFP )相连接构成作为能量供体的融合蛋白 GaH，将轻链可变区蛋白与荧光淬灭剂 QSY35 ( Molecular Probes公司产品，属乙酸琥珀酰亚胺酯类）化学偶联构成作为能量受体的蛋白 QL, 二者共同构成检测试剂。以 485nm激发，检测能量供体 EGFP最大发射光 510nm 的荧光强度。当加入存在 HBV pre-Sl抗原的样品时，荧光强度较加入样品前升高，而加入不含 HBV pre-Sl抗原的样品时荧光强度略有降低。因此由上述 GaH和 QL组成的蛋白组合可以应用于 HBV检测。

根据本发明的又一具体实施方案，为检测标本中 HBV pre-Sl 抗原的存在与否，本发明人选择了抗 HBV pre-Sl 单克隆抗体 MA18/7的重链可变区和轻链可变区蛋白，以及 HBV pre-Sl抗原 C06, 将重链可变区通过一段 3个 Ala的柔性 linker与增强型绿色荧光蛋白（EGFP )相连接构成作为能量供体的融合蛋白 GaH，将 HBV pre-Sl抗原 C06与荧光淬灭剂 QSY35化学偶联构成作为能量受体的蛋白 QC, 将 GaH、 QC和轻链可变区蛋白 ML共同构建一套新的蛋白组合作为检测试剂。以 485nm激发，检测能量供体 EGFP 最大发射光 510nm 的荧光强度。当加入存在 HBV pre-Sl抗原的样品时，荧光强度较加入样品前升高，而加入不含 HBV pre-Sl抗原的样品时荧光强度略有降低。因此由上述 GaH、 QC和 ML组成的蛋白组合可以应用于 HBV检测。

本发明还涉及用于疾病检测的试剂盒，其特征在于包括本发明所提供的任一蛋白组合及相应的緩冲液。由于本发明采用的同一抗体的重链可变区和轻链可变区蛋白之间为非共价结合，不同 pH值的緩沖液会在一定程度上影响到二者之间或二者与抗原之间的结合，因此本发明釆用中性或 pH值为弱碱性的 PBS作为緩沖液，以使这个检测体系更趋于稳定。

根据本发明，本发明的蛋白组合中所选择的抗原来自病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、肿瘤相关抗原或其他具有抗原决定簇的物质。蛋白组合中的荧光标记抗原与待测抗原要求具有相同的抗原表位，这样当待测抗原加入蛋白组合时会因为二者之间对同一抗体结合位点的结合而发生竟争，使蛋白组合原来产生的

FRET现象因为荧光物质距离的拉大而减弱，检测到的作为能量供体的荧光物质的发射光较加入前增强，因此可以将此抗原竟争的模式用于检测标本中的抗原，如乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、戊型肝炎病毒抗原等。

通过基因工程的方法可以获得单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区蛋白。可变区蛋白作为单域抗体，单个分子大小仅相当于完整 IgG抗体的 1/12，通过基因工程的方法与荧光蛋白或发光蛋白基因嵌合并表达保持原有可变区抗体活性的融合蛋白难度较大。 Arai ( Arai R,Ueda H,Tsumoto K,et al. Protein Engineering, 2000,13(5):369 ) -376; Arai R,Nakaga a H,Tsumoto ,et al. Analytical Biochemistry, 2001,289:77-81. )在上迷两项研究中均采用了首先将可变区与 Trx (硫氧还蛋白）基因融合表达后再与 GFP 基因融合的方法来保持活性。本发明人对荧光蛋白与可变区蛋白融合表达进行了多种探索性研究，如可变区基因 N末端或 C末端融合荧光蛋白，直接融合或者通过柔性 linker融合以及多种柔性 linker 的选择等，最终确定了具体实施方式中所述的融合蛋白 GaH, 其既保持了重链可变区的抗原结合活性，又保持了荧光蛋白的荧光特性，而且通过 His柱很容易进行纯化，非常适宜作为检测试剂。

而且，本发明所涉及的可变区蛋白和可变区与荧光蛋白基因融合表达的融合蛋白，均可以利用已经十分成熟的大肠杆菌表达系统进行高效表达，以包含体的形式表达目的蛋白减少了细胞质内蛋白水解酶对外源蛋白的降解，表达产量高远远高于可溶性表达或周质腔分泌表达，且有利于进一步的纯化操作，优化的复性方法能够比较容易的得到保持亲本抗体和荧光蛋白活性的高产量的純化蛋白，保证了检测试剂生产的简单、高效、快速。以下结合附图和实施例详细说明本发明。附图说明

图 1显示 MA18/7可变区抗体及 GFP融合蛋白 GaH的竟争抑制 ELISA结果， 8C11为抗 HEV单克隆抗体， 4D11为抗 HBV pre-Sl单克隆抗体， EGFPa-Fv为 GaH与 ML等量混合的混合物。

图 2显示 MA18/7可变区抗体片段间接 ELISA结果。

图 3显示融合蛋白 GaH的间接 ELISA结果，其中 ML2为 MA18/7的轻链可变区抗体片段，不带有 6 x ffis。

图 4显示加入不同体积的 QL时 GaH、 QL体系的淬灭率。图 5显示以 GaH、 QL体系检测 HBV pre-Sl抗原 21 ~ 47的结果，其中 2147为 HBV pre-Sl 21 ~ 47合成肽。

图 6显示以 GaH、QL体系检测 HBV pre-Sl抗原 C06的结果，其中 C06为 HBV pre-Sl重组抗原。

图 7显示加入不同体积的 QC时 GaH、 QC, ML体系的淬灭率。

图 8显示以 GaH、 QC ML体系检测 HBV pre-Sl抗原 21 ~ 47的结果。

图 9显示以 GaH、 QC, ML体系检测 HBV pre-Sl抗原 C06 的结果。实施例

下面结合具体实施例与附图，对本发明进一步加以描述。所述实施例旨在以举例方式具体阐明本发明。载体和宿主的选择以及试剂的浓度、温度和其他变量的值只是举例说明本发明的应用，而不构成对本发明的限制。实施例 1 MA18/7可变区抗体片段重组蛋白的制备与性质分析

根据单克隆抗体 MA18/7的重链可变区 VH序列（GenBank 登录号： AJ002098 )和轻链可变区 VL序列（GenBank登录号： AJ002099 ), 分别合成两段可变区全基因。针对 VH设计一对特异引物， VHF： 5,-GAA TTC GAT GTG CAG CTT CAG GAG-3'(SEQ ID NO:2), VHR: 5，- AAG CTT TGC AGA GAC AGT GAC CAG-3'(SEQ ID NO:3), 针对 VL设计一对特异引物， VLF: 5，- GAA TTC GAC ATT GAG ATG ACC CAG-3'(SEQ ID NO:4), VLR: 5，- AAG CTT TTT CAG CTC CAG CTT G-3'(SEQ ID NO:5), 其中划线部分分别为 EcoR I和 Hind III酶切位点。以人工合成基因片段为模板分别通过 PCR扩增重链 VH和轻链 VL基因，扩增条件是 94°C预变性 5 min, 然后按照 94 °C 35s, 55 °C 35s, 72 °C 40s进行 28个循环，最后 72°C延伸 10min。胶回收试剂盒回收 PCR产物，连接 pMD-18T载体得到克隆质粒 pT-MA18/7-VH和质粒 pT-MA18/7-VL。用 EcoR I/Hind III分别双酶切质粒 pT-MA18/7-VH和质粒 pT-MA18/7-VL, 胶回收试剂盒回收 VH片段和 VL片段。

表达质粒选择本实验室构建的可用于目的基因的融合或非融合表达的原核表达质粒 pTO-T7, 将质粒 ρΤΟ-Τ7用 EcoR I和 Hind III双酶切，乙醇沉淀法回收线性载体， T4 DNA连接酶连接载体和目的片段，得到重组表达载体 pTO-T7-MA18/7-VH 和 pTO-T7-MA18/7-VL。对其分别进行基因测序可知其序列与 GenBank所载一致。

表达质粒 pTO-T7-MA18/7-VH和 pTO-T7-MA18/7-VL分别转化 E.coli ER2566菌株，挑取单菌落于 3 ml LB (含 Kan 100 μ g/ml )培养基中， 37°C振荡培养过夜，转接菌液于 500 ml LB (含 Kan 100 /ml )培养基中， 37°C振荡培养过夜，菌液 OD600值达 0.8左右时加入 0.2 mmol/L的 IPTG诱导，诱导条件为 37°C， 4H。离心收集菌体，用 20mmol/L Tris-Cl ( pH7.6 ) 悬浮，冰水浴条件下超声破碎，超声条件为：输出控制 -7, 占空因数 -70 % , 工作时间 _35sec，重复 10次，每次间隔 5min。12000rpm离心 15min 以分离包含体沉淀和上清，沉淀用与上清等体积的的 20mmol/L Tris-Cl ( pH7.6 ) 悬浮，取等量上清和沉淀溶液进行 SDS-PAGE 电泳。

SDS - PAGE电泳条件具体为：堆积胶浓度为 5 %，分离胶浓度为 15 %，结果显示转化了质粒 pTO-T7-MA18/7-VH的工程菌的全菌裂解物含有一条特异的诱导表达带，表达蛋白约占菌体总蛋白的 60 %以上，其实际分子量约 14 kD，与理论预期值近似。

而转化了质粒 pTO-T7-MA18/7-VH 的工程菌的全菌裂解物也含有一条特异的诱导表达带，表达蛋白约占 60 %以上，实际分子量 13 kD也与理论预期值相近。两种重组蛋白均主要以不溶性的包涵体的形式存在。

超声沉淀先后用 Buffer I ( 20 mM Tris-Cl, pH8.5，100 mM NaCl, 5 mM EDTA ) 和 2%Triton洗涤两次后分别用 2M、 4M 和 8M尿素溶解，各溶解液用 15 % SDS"PAGE 电泳分析。结果 MH主要溶于 8M尿素中， ML主要溶于 4M尿素中。将溶解在尿素中的抗体可变区片段用同浓度的尿素稀释至蛋白浓度约 100 ug/ml, 10°C条件下用浓度相对较低的尿素透析并不断減少尿素含量直至将蛋白透析到 PBS中，以 PEG20 000在 4°C下浓缩透析后样品，得抗体片段初步纯化产物。

轻摇 His纯化 Talon试剂瓶，使 Talon树脂混匀，吸取 2ml 上柱，用 20ml 4°C预冷的 PBS平衡两次，堵住出样口，加入抗体片段初步纯化样品，混匀， 4°C放置 2H，期间每隔 lOmin轻摇柱子，打开出样口，收集穿透峰，用 PBS洗柱 3次，每次静置 3min 后将 PBS放干。堵住出样口，加入洗涤 buffer ( PBS, 5mM咪唑， pH7.0 ) 2ml, 混匀，室温静置 lOmin, 收集洗涤液，重复三次后加入洗脱 buffer ( PBS， 150mM咪唑， pH7.0 ) 2ml，混匀，室温静置 10min，收集洗脱液，重复三次。洗脱液即为纯化后的抗体 MA18/7可变区重组蛋白，其纯度在 90 %以上。

分别采用竟争抑制 ELISA法和间接 ELISA检测重组抗体可变区片段的活性。竟争抑制 ELISA法的方法如下： HBV pre-Sl 21 ~ 47合成肽溶解于 0.05 mol/L CB buffer ( 20.02g Na2C03, 2.52g NaHC03加去离子水至 1 L， pH9.5 )，浓度为 1 μ g/mL, 37 条件下在 96孔聚乙烯板的各孔表面吸附 2H，再置 4°C过夜。用 PBST 洗涤液（ 8.0g NaCl , 0.2g KH2P04 ， 2.9g Na2HP04 12H20, 0.2g C1, 0.5ml吐温 20，加去离子水至 1升， pH为 7.4 ) 洗涤滴定板以除去未结合的抗原蛋白。然后用 200 μ 1/孔的封闭液（ 1 X PBS溶液中加入 2%明胶、 0.2%酪蛋白和 2% 蔗糖） 37°C封闭 2小时。甩净、拍干后真空封闭。最终得到的 21 ~ 47板放于 4°C保存。

检测时每孔中加入 50 μ L不同待测样本，样本包括纯化后的 MH、 ML以及 MH和 ML混合物，以 PBS为对照，再加入 50 μ L按 1/1000稀释 HRP标记的 HBV pre-Sl单抗 4D11 , 混匀后 37°C温育 lh, 用 PBST洗涤 5次，拍干后先后加入底物液、 B 各 50 L (底物液 A的成分为： 13.42g Na2HP04 12H20, 4.2g 柠檬酸 ·Η20和 0.3g H2O2，加去离子水至 700ml; 底物液 B的成分为： 0.2g 四甲基联苯胺， 20ml 二甲基甲酰胺，加去离子水至 700ml ), 37°C显色 15min, 加入 50 μ L终止液（ 2M H2S04 ) 终止反应，用酶标仪检测各孔的 OD450/620。

一般以竟争抑制达到 50 %以上者视为阳性。结果显示， MA18/7 的重链和轻链可变区两个抗体片段都不能单独参与对

HBV pre-Sl抗原的竟争结合，即单独的重链可变区和轻链可变区片段都不具有明显的抗原结合活性。而二者等量混合后形成的 Fv 段，竟争抑制率达 70 %以上（图 1 )，显示了良好的抗原结合活性。

间接 ELISA法如下：将 MH和 ML等量混合后的混合物进行倍比稀释后，分别加 lOOul到上述包被好的 21 ~ 47板中， 37 °C孵育 1小时， PBST洗涤 5次后扣干，然后每孔加入 lOOul 1:2500 稀释的 HRP标记 anti-6His抗体， 37°C孵育 30min, 加入显色底物、 B显色 15min后终止，用酶标仪测定每孔的 OD450/620。结果显示单独的重链可变区或轻链可变区片段 OD值仅 0.1左右，而二者等量混合后形成的 Fv段原液 OD值为 3.685, 稀释 8倍后为 0.627 (图 2 ) ，显示 Fv有较好的特异性结合抗原的活性。实施例 2 MA18/7重链可变区与 EGFP融合蛋白 GaH的制备与性质分析

根据 EGFP基因（GenBank登录号： U76561 ) 的序列合成两条引物，分别为上游引物 SHGF: GGA TCC ATG GTG AGC AAG GGC GAG(SEQ ID NO:6);下游引物 EGR: GAA TTC TGC AGC GGC CTT GTA CAG CTC GTC CAT G(SEQ ID NO:7)，划线部分分别为 8&11111 1和£(：01^ 1酶切位点。另外在 EGR引入的酶切位点之后加入一段短的 DNA序列，使其能够表达成 3个丙氨酸作为 GFP与 VH之间的柔性连接，同时为了进一步克隆需要而去除了 EGFP的 TAA终止子。

以 SHGF和 EGR为引物，以质粒 pEGFP为（购自 Clontech 公司）模板通过 PCR方法扩增 EGFPa基因（增加了 3 x Ala )，扩增奈件为： 94 °C预变性 5 min, 然后按照 94 °C 40s, 55 °C 35s, 72 °C 50s进行 28个循环，最后 72 °C延伸 10 min, 胶回收试剂盒回收 PCR产物，并克隆至 pMD-18T载体，用 BamH I/EcoR I双酶切后回收目的片段。用 BamH I/EcoR I 双酶切表达质粒 ρΤΟ-Τ7 , 回收载体后与 EGFPa 片段连接，得到质粒 pTO-T7-EGFPa 。用 EcoR Ι/HindIII 酶切质粒 pTO-T7-MA18/7-VH, 回收片段，用 EcoR Ι/HindIII 酶切质粒 pTO-T7-EGFPa, 回收载体，连接上述载体与片段后得到重组融合表达载体 pTO-T7-EGFPa-MA18/7-VH。

将质粒 pTO-T7-EGFPa-MA18/7-VH转化大肠杆菌 ER2566 菌林，挑取单菌落于 3 ml LB (含 Kan 100 g/ml )培养基中， 37°C振荡培养过夜，转接菌液于 500 ml LB (含 Kan 100 μ g /ml ) 培养基中， 37。C振荡培养至菌液 OD600值达 0.7左右时加入 0.1 mmol/L的 IPTG诱导，诱导条件为 20°C , 20H。离心收集菌体，可见菌体呈肉眼可见的明显的绿色。

用 20mmol/L Tris-Cl ( pH7，6 )悬浮菌体，冰水浴奈件下超声破碎，超声破碎后离心分离沉淀和超声上清，用 12 % SDS-PAGE 电泳分析可见工程菌裂解产物有一条明显的表达蛋白带，其分子量约 40 kD, 与理论预期值相当，其表达量占菌体总蛋白量的 20 %左右，且主要以不溶性的包涵体的形式存在。超声沉淀先后用 Buffer I ( 20 mM Tris-Cl, pH8.5,100 mM NaCl, 5 mM EDTA ) 和 2%Triton洗涤两次后分别用 2M、 4M和 8M尿素溶解，以同浓度尿素稀释尿素样品至蛋白浓度约为 100 u_g/ml，用浓度稍低的尿素透析并不断减少尿素含量直至将蛋白透析到 PBS 中，以 PEG20 000浓缩透析后样品，得融合蛋白 GaH ( SEQ ID NO: 1 )。

用 His 柱对初纯物进行金属离子亲和纯化。各溶液用 12 % SDS-PAGE电泳分析。结果表明融合蛋白主要溶解在 8M尿素中， 4°C下逐步对 PBS透析复性，对其进行复性及柱纯化后能获得纯度达 90 %以上的純化蛋白。 GaH纯化产物直接用肉眼观察呈明显的绿色，用荧光仪测定其相对荧光强度可达 200 RFU，显示融合蛋白较好的保持了绿色荧光蛋白的荧光特性，但与浓度相当的 E GFP蛋白相比荧光强度略有降低。

分别以竟争抑制 ELISA法和间接 ELISA法测定单独的融合蛋白纯化产物以及纯化产物与 VL 片段的混合物的抗原结合活性。

竟争抑制 ELISA法待测样本为融合蛋白 GaH、 ML纯化产物及二者的混合物，结果显示单独的纯化产物对 HBV pre-Sl单抗无竟争能力，没有抗原结合活性，而混合物则能与抗 pre-Sl单抗竟争，竟争抑制率达到 50 %以上（图 1 )，具有较强的抗原结合活性。

间接 ELISA法操作步骤同实施例 1 , 待测样本为融合蛋白纯化产物 GaH、 MA18/7轻链可变区 VL纯化产物 ML2 (不带有 6 X His ) 及二者的混合物，结果显示单独的融合蛋白纯化产物 GaH、 ML2纯化产物测定的 OD值仅 0.1左右，而二者混合物原液的 OD值达 3.284，且倍比梯度稀释后呈现良好的梯度（图 3 ), 表明其能够较好的结合 HB V pre-Sl抗原。实施例 3 抗体轻链可变区片段偶联荧光淬灭剂

抗体 MA18/7轻链可变区 VL纯化后的重组蛋白 ML在 4°C 下用 PEG20 000浓缩后继续在 4°C下透析到 0.1M碳酸氢钠緩冲液（pH8.3 ) 中，测定其浓度为 5.25 mg/ml, 取出 2ml室温下电磁緩慢搅拌，尽量不能产生气泡。荧光淬灭剂为 Molecular Probes 公司生产的 QSY-35, 为琥珀酰亚胺酯类，分子量为 411.33。避光条件下小心称取淬灭剂 5.95mg, 加入 DMF 0.525ml, 轻柔颠倒混匀，使其终浓度为 10 mg/ml。在室温避光的条件下用微量加样器将淬灭剂逐滴慢慢加到电磁搅拌下的蛋白溶液中，直至将 0.525ml全部加完，使最终反应体系中蛋白与淬灭剂的物质的量比为 1: 15。加完后室温避光继续緩慢搅拌 lh，然后将反应溶液移到 4°C下继续反应 5h，再转移到排阻分子量为 3.5kD的透析袋中， 4°C下对 PBS透析，每隔 2h换液一次，连续换液 6次以上，收集透析袋中的溶液避光保存。称 Sephadex-G25 4g, PBS平衡两天后装柱（10 x 300mm )，加入透析后的溶液，收取最先流出的带有蓝紫色的溶液，即为结合好淬灭剂的抗体轻链可变区蛋白 QL, 避光保存于 -20°C。实施例 4 GaH和 QL作为一组蛋白检测样品中抗原的存在与浓度

以如实施例 2中所述制备的 GaH为能量供体（EGFPa-VH )，以如实施例 3所述制备的 QL为受体（QSY35-VL )。为防止孔间荧光干扰，采用黑色 96孔空板作为检测板，所用仪器为荧光和化学发光仪。

测定如上述纯化后的融合蛋白 GaH浓度为 0.5 mg/mL，每个样品孔加入 GaH 80 L, 再加入荧光淬灭剂标记蛋白 QL溶液，体积分别为 0.5， 1， 1.5， 2, 2.5, 3, 3.5, 4， 4.5, 5 L, 混匀并当体系稳定后测定各孔的相对荧光强度，以计算相应的淬灭率。

结果显示偶联了 QSY35的 QL溶液浓度约为 4 mg/mL,随着其加入体系量的增加对 EGIT荧光的淬灭率也逐渐增加，在加入 4 后淬灭率基本稳定（图 4 ),显示在此时溶液中结合与解离大致到达平衡。

因为荧光与化学发光仪 96 孔板最适检测样品孔的体积为 100 L, 为进一步检测方便，确定在 86 GaH溶液中加入 4 QL为最适加入量，以此建立本发明的优选检测体系。

96孔检测板每孔加入 86 GaH溶液，然后每孔再加入 4 QL, 测定各孔荧光值，待稳定后加入 10 μ∑待测样品。样品中含有浓度不同的 HBV pre-Sl抗原，以溶于 PBS的 21 ~ 47合成肽和 HBV pre-Sl抗原 C06为检测对象，以 PBS为对照，测量加入待测样品后检测孔的荧光强度，比较加入抗原前后单孔本身相对荧光强度的变化。当 GaH与 QL混合后， VH与 VL相互作用而结合形成可变区片段 Fv，则两种荧光基团 EGFP和 QSY35距离拉近，达到 FRET发生的范围而产生了 FRET现象，在 485 nm的激发下，能量供体 EGFP发射 510 nm的绿色荧光，但大部分能量转移给近距离的能量受体 QSY35而发生荧光淬灭。而加入 HBV preSl抗原后，抗原会与 Fv发生特异结合，其结合位点恰好位于 Fv的抗原结合位点，也就是 VH与 VL之间，因此拉大了 EGFP 与 QSY35的距离，能量转移减弱甚至不再发生，因此 EGFP发射的荧光值相应增加。

检测结果也验证了这一过程。我们把加入待测样品前的荧光值定为 C，加入后的荧光值定为 D，单孔本身荧光增长比 M - D/C, 以检测孔的体系荧光增长比 FIR ( Fluorescence Increasing Ratio ) 为检测指标， FIR - M/MPBS。结果显示含有目的抗原的样品能够使各孔的荧光强度升高，荧光强度的升高程度与抗原浓度在大约 3 g/ml以上时呈正相关，而不含有 HBV pre-Sl抗原的等体积緩冲液则使体系中的荧光强度略有下降（图 5, 图 6 )。

表明抗原浓度在 3 g/ml以上时反应体系能够较好的检测出标本中存在的 HBV preSl抗原，检测时间在 30min以内。实施例 5 HBV pre-Sl抗原偶联荧光淬灭剂

HBV pre-Sl重组抗原 C06纯化蛋白（杨海杰. 治疗性基因工程乙肝疫苗的探索性研究 [D】. 厦门大学博士论文， 2002,8. ) 用 PEG20, 000浓缩后在 4。C下透析到 0.1M碳酸氢钠緩沖液（ pH8.3 ) 中，测定其浓度为 7.08 mg/ml，取出 2ml室温下电磁緩慢搅拌，尽量不能产生气泡。

荧光淬灭剂为 Molecular Probes公司生产的 QSY-35, 为琥珀酰亚胺酯类，分子量为 411.33。避光条件下小心称取淬灭剂 8.00mg, 加入 DMF 0.8ml, 轻柔颠倒混匀，使其终浓度为 10 mg/ml₀ 在室温避光的条件下用微量加样器将淬灭剂逐滴慢慢加到电磁搅拌下的蛋白溶液中，直至将 0.8ml全部加完，使最终反应体系中蛋白与淬灭剂的物质的量比为 1: 15。加完后室温避光继续緩慢搅拌 1H，然后将反应溶液移到 4°C下继续反应 5H，再转移到排阻分子量为 3.5kD的透析袋中， 4°C下对 PBS透析，每隔 2H换液一次，连续换液 6次以上，收集透析袋中的溶液避光保存。称 SepHadex-G25 4g, PBS平衡两天后装柱（ 10 x 300mm )，加入透析后的溶液，收取最先流出的带有蓝紫色的溶液，即为结合好淬灭剂的 HBV pre-Sl抗原蛋白 QC, 避光保存于 -20 °C备用。

取标记前和标记后的抗原 C06，进行 12 %的 SDS-PAGE分析，并以 1: 2000稀释的 HRP标记的 HBV pre-Sl单抗 4D11为酶标抗体进行 Western Blot分析。标记 QSY35后的蛋白 QC比 C06分子量略大，标记前后抗原 C06的活性相当，表明 C06标记 QS Y35后并没有影响其与相应抗体反应的活性。实施例 6 GaH、 ML和 QC作为一组蛋白检测样品中抗原的存在与浓度

选择如实施例 2所制备的融合蛋白 GaH与 ML等摩尔浓度混合后，和如实施例 5所制备的 QSY35标记的抗原 QC—起构成本发明的竟争检测试剂，其中能量供体为 EGFP，能量受体为荧光淬灭剂 QSY35。

为防止孔间荧光干扰，采用黑色 96孔板作为检测板，所用仪器为荧光和化学发光仪 ( Labsystem Fluoroskan Ascent FL )。测定纯化后的融合蛋白 GaH浓度为 0.5 mg/mL, ML 的浓度为 1 mg/mL,每个样品孔加入 GaH与 MH1等摩尔浓度混合后的溶液体积为 80 L, 再加入荧光淬灭剂标记抗原 QC溶液，体积分别为 l ~ 10 L, 混勾并当体系稳定后测定各孔的相对荧光强度，以计算相应的淬灭率。

结果显示偶联了 QSY35的 QC溶液浓度约为 6 mg/mL, 随着其加入体系量的增加对 EGFP荧光的淬灭率也逐渐增加，在加入 8 L后淬灭率基本稳定（图 7 )，显示在此时溶液中结合与解离大致到达平衡。因为仪器最适检测样品孔的体积为 lOO L, 为进一步检测方便 ,确定在 82 μΐ, GaH与 ML1混合溶液中加入 8 QC 为最适加入量，以此建立本发明的竟争检测体系。

取 GaH和轻链可变区蛋白 ML加到 96孔检测板孔中，然后再加入抗原偶联溶液 QC，测定各孔荧光值，待稳定后加入 10 待测样品。样品中含有浓度不同的 HBV preSl抗原，以溶于 PBS 的 21 ~ 47合成肽和 HBV pre-Sl抗原 C06为检测对象，以 PBS 为对照，测量加入待测样品后检测孔的荧光强度，比较加入抗原前后单孔本身相对荧光强度的变化。我们把加入待测样品前检测体系的荧光值定为 C，加入后的荧光值定为 D, 则单孔本身荧光增长比 M - D/C, 以各检测孔相对于整个检测体系的荧光增长比 FIR ( Fluorescence Increasing Ratio ) 为检测指标 , FIR = M/MPBSo

因为 GaH、 ML与 QC在抗原结合位点相互结合， VH上的 EGFP与标记抗原上的 QSY35距离拉近，达到 FRET发生的范围，因此 485 nm激发产生的 EGI 的发射荧光被淬灭。若待测样品中含有 HBV pre-Sl抗原，则会与检验试剂中的标记抗原发生竟争，游离的 QC与 EGFP的距离拉大，淬灭作用降低或消失，因而能测到增强的绿色荧光。

检测结果显示（图 8、 9 )，含有目的抗原的样本能够使整个反应体系的荧光强度升高，荧光强度的升高程度与抗原浓度呈正相关，而加入等体积的緩冲液对照后体系中的荧光强度略有下降。表明该体系可用于检测标本中 HBV pre-Sl抗原的存在，检测时间在 30min以内。

Claims

权利要求

1. 一种具有荧光共振能量转移特点的蛋白組合，其由来自同一抗体的重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白组成，其中，重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白中的一个带有作为能量供体的荧光物质或者化学发光物质，另一个则带有作为能量受体的荧光淬灭物质，且所述作为能量供 /受体的荧光物质和荧光淬灭物质为符合荧光共振能量转移（FRET )特征的试剂对。

2. 权利要求 1 的蛋白组合，其中所述作为能量供体的荧光物质优选的，选自荧光蛋白、荧光素、稀土元素等荧光物质，更优选的，选自绿色荧光蛋白（GFP ), 蓝色荧光蛋白（BFP ), 黄色荧光蛋白（YFP ), 青色荧光蛋白（CFP )和红色荧光蛋白（RFP ) 的荧光蛋白，最优选的，作为能量供体的荧光物质为绿色荧光蛋白；作为能量供体的化学发光物质选自发光蛋白和鲁米诺、过氧草酸盐；而作为能量受体的荧光淬灭物质为 QSY-35。

3. 权利要求 1 的蛋白组合，其中所述带有作为能量供体的荧光物质的融合蛋白为由来自抗 HBV pre-Sl单克隆抗体 MA18 / 7 的重链可变区与增强型绿色荧光蛋白 EGIT組成的 GaH,所述带有作为能量受体的荧光淬灭物质的融合蛋白为由来自抗 HBV pre-Sl单克隆抗体 MA18 / 7的轻链链可变区与荧光淬灭剂 QSY - 35组成的 QL。

4. 一种具有荧光共振能量转移特点的蛋白组合，其由来自同一抗体的重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白以及由所述抗体识别的特异性抗原组成，其中当选自所述重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白中的一个带有作为能量供体的荧光物质或者化学发光物质时，所述抗体识别的特异性抗原带有作为能量受体的荧光淬灭物质；而当选自所述重链可变区蛋白和轻链可变区蛋白中的一个带有作为能量受体的荧光淬灭物质时，所述抗体识别的特异性抗原带有作为能量供体的荧光物质或者化学发光物质，且所述作为能量供 /受体的荧光物质和荧光淬灭物质为符合荧光共振能量转移

( FRET )特征的试剂对。

5. 权利要求 4的蛋白组合，其中所述作为能量供体的荧光物质优选的，选自荧光蛋白、荧光素、稀土元素等荧光物质，更优选的，选自绿色荧光蛋白（GFP )，蓝色荧光蛋白（BIT ), 黄色荧光蛋白（YFP )，青色荧光蛋白（CFP )和红色荧光蛋白（RFP ) 的荧光蛋白，最优选的，作为能量供体的荧光物质为绿色荧光蛋白；作为能量供体的化学发光物质选自发光蛋白和鲁米诺、过氧草酸盐；而作为能量受体的荧光淬灭物质为 QSY-35。

6. 权利要求 5的蛋白组合，其中所述带有作为能量供体的荧光物质的融合蛋白为由来自抗 HBV pre-Sl单克隆抗体 MA18 / 7 的重链可变区与增强型绿色荧光蛋白 EGFP组成的 GaH,所述带有作为能量受体的荧光淬灭物质的融合蛋白为由来自 HBV pre-Sl重組抗原 C。6与荧光淬灭剂 QSY一 35组成的 QC。

7. 权利要求 1或 4的蛋白组合，其中所述特异性抗原来自病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、肿瘤相关抗原或其他具有抗原决定簇的物质。

8. 一种用于检测样本中目标抗原存在的方法，其包括 1 )在适于所述待测抗原与权利要求 1所述的蛋白组合中所述抗体结合的条件下，将待测样本与所述蛋白组合相接触；和 2 )检测待测样本与所述蛋白组合相互接触前后能量供体的相对荧光强度的变化，判断待测样本中与所迷抗体之重链可变区蛋白和 /或轻链可变区蛋白特异结合的抗原的存在。

9. 一种用于检测样本中与经标记的抗原竟争性结合抗体的目标抗原存在的方法，其包括

1 )在适于所述待测抗原与权利要求 4所述的蛋白组合中所述抗体结合的条件下，将待测样本与所述蛋白组合相接触；和 2 )检测待测样本与所述蛋白组合相互接触前后能量供体的相对荧光强度的变化，判断待测样本中与经标记的抗原竟争性结合抗体的目标抗原的存在。

10. 根据权利要求 8或 9的方法，其中目标抗原为乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、戊型肝炎病毒抗原。

11. 一种用于检测待测样本中目标抗原的试剂盒，其特征在于包含权利要求 1或 4所述的蛋白组合，及相应的緩冲液。

12. 权利要求 11 的试剂盒，其中目标抗原为乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、戊型肝炎病毒抗原。