WO2007032482A1 - 抗うつ薬に対する反応性予測に有用な遺伝子多型 - Google Patents

抗うつ薬に対する反応性予測に有用な遺伝子多型 Download PDF

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WO2007032482A1
WO2007032482A1 PCT/JP2006/318386 JP2006318386W WO2007032482A1 WO 2007032482 A1 WO2007032482 A1 WO 2007032482A1 JP 2006318386 W JP2006318386 W JP 2006318386W WO 2007032482 A1 WO2007032482 A1 WO 2007032482A1
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gene
polymorphism
antidepressant
reactivity
subject
Prior art date
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PCT/JP2006/318386
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French (fr)
Inventor
Junichi Azuma
Tsuyoshi Fukuda
Megumi Yamashita
Yuka Hosoi
Masaki Kato
Masataka Wakeno
Yoshiteru Takekita
Gaku Okugawa
Toshihiko Kinoshita
Original Assignee
The New Industry Research Organization
Osaka University
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting reactivity to an antidepressant based on a genetic polymorphism of a subject.
  • the present invention provides a technique useful for testing and diagnosis in pharmacotherapy for the purpose of improving depression.
  • depression is a familiar disease, as “depression is a cold of the heart”.
  • the major biological hypotheses for the development of depression include monoamine (serotonin, noradrenaline) nervous system dysfunction, hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) dysfunction (stress adaptive dysfunction), ecological rhythm abnormality, Although neuroplasticity abnormalities have been envisaged, they have not yet been confirmed. Since the prevalence of depression relatives is higher than in general subjects, there is no doubt that some genetic predisposition exists in the pathogenesis. Depression can be regarded as some kind of stress vulnerability, and its foundation includes monoamine nervous system, HPA system and neuroplasticity abnormalities, which are excessively affected by stress and the stress adaptation mechanism in the brain has collapsed. It is assumed that the disease will occur.
  • SSRI is used as a first-line drug for treating depression, and it is known that there are great individual differences in the clinical effect.
  • SSRI is an abbreviation for Selective Serotonin Reuptake InWbitors, a new generation of a group of drugs that selectively inhibit serotonin reuptake via serotonin transporters at nerve terminals. It is a name that refers to a depressant.
  • SNRI can be cited as a new generation of antidepressants.
  • SNRI is an abbreviation for serotonin & noradrenaline reuptake inhibitors (Selective) Serotonin & Noradorenaline Reuptake InWbitors, and is a name that refers to a group of substances that selectively inhibit serotonin and noradrenaline reuptake.
  • Non-Patent Document 2 was published by the present inventors, and the clinical effects and genetic polymorphisms of patients with two typical antidepressant drugs paroxetine (paroxetine) and fluvoxamine (fluvoxamine) belonging to SSRI. We reported that the clinical effect of paroxetine was higher than that of fluvoxamine when the genotype of the LPR polymorphism was s / s.
  • TPH2 Noriant tributofan hydroxylase-2
  • TPH3 tributophane hydroxylase
  • Non-patent Document 4 A polymorphism that is present in an exon of the TPH2 gene and that reduces serototone production by 80% in vitro has been reported (Non-patent Document 4 below). Many mutations were detected in patients with depression, suggesting that this mutation is an important region for TPH2 enzyme activity and may be involved in the development of depression.
  • Non-Patent Document 8 ⁇ 9 below There has been a report that there is a correlation between polymorphisms related to the TPH2 gene and attention deficit hyperactivity disorder (ADHD)! / Talk.
  • Non-patent document 1 Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2005,29: 1062-1073
  • Non-patent document 2 Int Clin Psychopharmacol. 2005,20: 151-156
  • Non-Patent Document 3 Science. 2003,299: 76
  • Non-Patent Document 4 Neuron. 2005, 45: 11-16
  • Non-Patent Document 5 Mol Psychiatry. 2004,9: 980-983
  • Non-Patent Document 6 Mol Psychiatry. 2004,9: 1030-1036
  • Non-Patent Document 7 Psychiatry Res. 2005,134: 195-198
  • Non-Patent Document 8 Mol Psychiatry. 2005 Oct; 10 (10): 944-9.
  • Non-Patent Document 9 Mol Psychiatry. 2005 Dec; 10 (12): 1126- 32.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems, that is, the importance of predicting antidepressant drug reactivity before administration, and the object thereof is the polymorphism of a subject. It is to provide a method for predicting reactivity to antidepressants based on the above.
  • the present inventors have conducted intensive research assuming the involvement of genetic factors in the cause of large individual differences in the clinical effects of antidepressants, and so far, serotonin, which is the site of action of the antidepressant SSRI.
  • serotonin which is the site of action of the antidepressant SSRI.
  • the LPR polymorphism of the transporter is one of the causes.
  • TPH2 tributophan hydroxylase-2
  • gene polymorphisms present in the promoter region of the TPH2 gene are useful for predicting individual differences in the clinical effects of antidepressants, and the gene polymorphisms are used to accurately predict responsiveness to antidepressants. It was also found that, by combining with other genetic polymorphism test results such as the above-mentioned LPR polymorphism, it becomes possible to predict the response more finely and contribute to the formulation of treatment plans suitable for individual patients.
  • D2 receptor D2 receptor
  • the inventors have found that the TaqlA polymorphism of the gene and the TCAT recombinant polymorphism of the tyrosine hydroxylase (TH) gene are useful for predicting the reactivity to antidepressants, and have completed the present invention. .
  • the present invention includes the following inventions A) to A) as industrially useful inventions.
  • TPH2 tryptophan hydroxylase-2
  • D2 dominine D2 receptor
  • TH tyrosine hydroxylase
  • tryptophan hydroxylase-2 (tryptophan hydroxylase-2) is also called tryptophan hydroxyloxygen type 2 and is considered to be an enzyme responsible for the rate-limiting step of serotonin biosynthesis in the brain.
  • this enzyme is abbreviated as “TPH2” and its gene is referred to as “TPH2 gene”.
  • Dopamine D2 receptor is one of the subtypes of dopamine receptor.
  • this receptor is abbreviated as “DRD2”, and the gene is referred to as “DR D2 gene”.
  • DR D2 the gene is referred to as “DR D2 gene”.
  • TH the gene is referred to as “TH”. It is called “gene”.
  • the present invention examines TPH2 gene, DRD2 gene, TH gene, or polymorphisms in the vicinity of them in the genome. In other words, this is at least one polymorphism associated with these genes. Means to inspect. It is not limited to the examination of polymorphisms present in the exon region or intron region of these genomic genes, but is intended to examine polymorphisms present in transcription regulatory regions such as promoter regions, control regions or untranslated regions. May be.
  • “gene polymorphism” includes a polymorphism existing in such a promoter region and the like, and has a broad meaning of a polymorphism related to the gene.
  • the present invention it is preferable to use a method in which a plurality of polymorphisms related to any of the above three genes are examined and the reactivity of a subject to an antidepressant is predicted based on the results.
  • paroxetine praroxetine
  • fluvoxamine fluvoxamine
  • fluoxetine fluoxetine
  • sertraline sertraline
  • dexfenfluramine dexfenfluramine
  • examples of the above-mentioned antidepressant SNRI include milnacipran and the like, in addition to venlafaxine and duloxetine.
  • the present invention is suitable for predicting the reactivity against the above-mentioned antidepressant drug S SRI or SNRI, but other antidepressants having a serotonin reuptake inhibitory effect (tricyclic antidepressants, tetracyclic antidepressants). It can also be used for predicting the reactivity to depression and the like.
  • C) By detecting at least one of the polymorphism present in the promoter region of the TPH2 gene, the TaqlA polymorphism of the DRD2 gene, and the TCAT repeat polymorphism of the TH gene, The method according to A) or B) above, wherein the reactivity to an antidepressant is predicted.
  • the present inventors have made a polymorphism present in the promoter region of the TPH2 gene (r si 1178997 gene polymorphism), a TaqlA polymorphism in the DRD2 gene (rsl800497 gene polymorphism), or a TCAT repeat polymorphism in the TH gene.
  • r si 1178997 gene polymorphism a polymorphism present in the promoter region of the TPH2 gene
  • rsl800497 gene polymorphism a TaqlA polymorphism in the DRD2 gene
  • TCAT repeat polymorphism a polymorphism present in the promoter region of the TPH2 gene
  • TCAT tetranucleotide
  • a serotonin transporter gene, a serotonin receptor gene, or a polymorphism existing in the vicinity thereof in the genome is examined, and the results are taken into consideration to determine whether the subject has an anti-depressant drug.
  • the above-mentioned “polymorphism existing in the vicinity thereof” means, in other words, a polymorphism related to the serotonin transporter gene (or serotonin receptor gene), that is, A polymorphism present in a transcriptional regulatory region such as a promoter region, a regulatory region, or a non-translated region may be examined.
  • the genetic polymorphism test comprises the steps of amplifying the gene region sandwiching the polymorphic site by converting the genomic DNA prepared from the subject into a saddle type. And genotyping based on the amplified fragment.
  • TPH2 tryptophan hydroxylase-2
  • D2 dopamine D2 receptor
  • TH tyrosine hydroxylase
  • reactivity to an antidepressant can be easily and quickly predicted objectively based on TPH2, DRD2, and TH gene polymorphisms.
  • disease treatment it can be suitably used for predicting patient responsiveness to antidepressants.
  • antidepressants especially SSRI
  • the clinical effects of antidepressants, especially SSRI vary greatly from person to person, and the severity of depression is likely to lead to suicide attempts. It was strongly desired to predict the drug objectively at the early stage of treatment and to carry out appropriate drug treatment suitable for individual patients.
  • the present invention makes it possible to predict the antidepressant drug response of a patient with high accuracy before administration, realize effective and safe depression treatment, and contribute to improvement of medical quality and improvement of treatment efficiency. Is.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of examining the correlation between the TPH2 gene polymorphism (rslll78997 polymorphism) and the reactivity to the antidepressant SSRI.
  • Fig. 2 shows the results of investigating the correlation between the TPH2 gene polymorphism (rslll78997 polymorphism) and the antidepressant SSRI reactivity in the sZs group with the LPR polymorphism of the serotone transporter gene It is a graph.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of examining the correlation between the above TPH2 gene polymorphism (rsl 1178997 polymorphism) and the above LPR polymorphism and the reactivity to the antidepressant SSRI.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating polymorphisms on the DRD2 gene.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of examining the correlation between TaqlA polymorphism (rsl800497 polymorphism) of the DRD2 gene and reactivity to the antidepressant drug SSRI.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating polymorphisms on the TH gene.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of examining the correlation between the TCAT repeat polymorphism of the TH gene and the reactivity to the antidepressant SSRI (paroxetine).
  • FIG. 8 is a graph showing the results of examining the correlation between the TCAT repeat polymorphism of the TH gene and the reactivity to the antidepressant SSRI (fulvoxamine).
  • FIG. 1 is a graph showing that a significant correlation was observed between this rsl 1178997 polymorphism and reactivity to the antidepressant SSRI.
  • the analysis method is roughly as follows. In other words, 100 patients (mean age 43.7 ⁇ 14.9) who were diagnosed as major depression or dysthymic disorder and had written consent were used, and no SSRI paroxetine or fluvoxamine was administered by envelope method. Assigned to work. The drug dose started at 20 mg and 50 mg, respectively, and could be increased to 40 mg and 150 mg, respectively, depending on the degree of symptom improvement. The clinical effect was evaluated over time by the Hamilton Depression Rating Scale (HAM-D) score, which is a scale of depression. The graph in Figure 1 shows fluvoxamine. This is the result of 41 patients taking depression. The lower the “HAMD change rate (%)” on the vertical axis of the graph, the higher the improvement rate by the drug, that is, the higher the clinical effect.
  • HAM-D Hamilton Depression Rating Scale
  • the ⁇ / ⁇ possession group that has the homology of the rsl 1178997 polymorphic allele in the rsl 1178997 polymorphism is heterozygous for the ⁇ and ⁇ alleles.
  • the clinical effect of fluvoxamine was higher.
  • the early stage force of the second week of drug administration was significantly better.
  • no “ ⁇ / ⁇ ” holders with the “ ⁇ ” allele were detected.
  • “1/2”, “3/4”, and “5/6” indicate 1-2 weeks, 3-4 weeks, and 5-6 weeks, respectively, and “ ⁇ ” indicates the number of patients in each group. *, “#” And “+” indicate the ⁇ value of t test (the same applies to other graphs).
  • the rsl 1178997 polymorphism was shown to be significantly correlated with the reactivity to the SSRI drug fluvoxamine. Based on these results, the rsl 1178997 polymorphism of the depression patient was examined, and if the base of the polymorphic site is a genotype ⁇ / ⁇ that has a homology with the allele of ⁇ T '', SSRI Reactivity can be predicted to be an effective responder. On the other hand, in the case of genotype “T / A” or “A / A” where the base of the polymorphic site has an allele of “A”, a non-responsor (non-responsor) having no effect on SSRI.
  • the der can be predicted to be a force responder or a poor responder.
  • the patient's responsiveness to the antidepressant ie, whether the patient is a responder (or poor responder) is predicted before administration. This can contribute to efficient and appropriate treatment of depression.
  • the present invention is a method for predicting a subject's antidepressant responsiveness based on the test result of the above-mentioned TPH2 gene polymorphism (rsl 1178997 polymorphism). It is not limited to direct inspection methods. For example, by testing for other polymorphisms on the TPH2 gene that are linked to the rsl 1178997 polymorphism and form a haplotype, the rs 11178997 polymorphism can be indirectly tested to determine the anti-depressant drug reactivity. Can be predicted. In addition, since this analysis revealed a correlation between TPH2 gene polymorphism and antidepressant responsiveness, it was based on other gene polymorphisms present on the TPH2 gene! It is also possible to predict responsiveness.
  • the rsl 1178997 polymorphism is completely linked to the 11178998 polymorphism (-52 / on the TPH2 gene, and when the rsl 1178998 polymorphism is the “A” allele, the rsl 1178997 polymorphism is the “T” allele.
  • the rsl 1178997 polymorphism test may be tested with other linked mutations.
  • the gene polymorphism is not limited to a single nucleotide polymorphism, for example, a polymorphism due to the presence or absence of a defective portion, that is, consisting of two or more bases Difference between insertion type with specific base sequence and deletion type lacking this base sequence It may be a genotype having The present invention is not limited to single nucleotide polymorphisms, and may predict antidepressant drug reactivity based on gene polymorphisms based on the presence or absence of such a defective portion, or may be antitumor based on other gene polymorphisms such as rearrangement. Depressant drug reactivity may be predicted.
  • the TPH2 cDNA sequence is Since it is registered and published under the session number “NM_173353” etc., it may be designed with reference to the nucleotide sequences disclosed in these databases (especially the gene polymorphism of the exon region or intron region of the TPH2 gene). If you want to inspect).
  • PCR-SSCP single strand conformation polymorphism
  • the PCR reaction solution (201) was prepared by adding 60 ng of genomic DNA extracted from the patient's peripheral blood force to the optimal buffer, enzyme, dNTP (0.2 mM each), forward primer (0.5 ⁇ ) and reverse primer ( The composition contained 0.5 ⁇ ).
  • the sequences of the designed forward primer ( ⁇ 2-473F) and reverse primer ( ⁇ 2 -473R) are as shown in (a) and (b) below.
  • As PCR reaction conditions 94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds were used as one cycle, and DNA was amplified by performing this step for 35 cycles.
  • the obtained PCR products were separated by a method called SSCP (single strand conformation polymorphism), and the gene difference was determined by the electrophoresis pattern.
  • the PCR product was first diluted 4-fold with Tris buffer, and 3 U of this sample was added to the denaturing solution 6 / zL.
  • the denaturing solution is 94% formamide, 0.05% xylene cyanol blue.
  • Solution a solution of 0.04% bromophenol blue.
  • the PCR product was heat denatured by treatment at 95 ° C for 5 minutes. After electrophoresis using GeneGel Excel 12.5 / 24 kit (Amersham), silver staining was performed.
  • FIG. 4 shows the power of representative polymorphisms of DRD2.
  • -141C Ins / Del polymorphism in the promoter region, 3, TaqlA polymorphism in the UTR region (rsl800497 polymorphism), and exon 7 Ser311Cys polymorphism has been studied in many diseases.
  • FIG. 5 is a graph showing that as a result of the analysis by the present inventors, a significant correlation was observed between the Taq 1 A polymorphism and the reactivity to the antidepressant drug S SRI. .
  • the analysis method is the same as in the case of TPH2, and the graph in FIG. 5 shows the results of 41 patients with depression who took fluvoxamine. The lower the “: HAMD change rate (%)” on the vertical axis of the graph, the lower the improvement rate by the drug, that is, the clinical effect Is rated high.
  • the A2 allele possession group that is, the “A1 / A2” and “A2” alleles having the “A1” and “A2” alleles in heterogeneity are shown.
  • “A2 / A 2” with homo is more effective in the clinical phase of fluvoxamine than the “A1 / A1” group with homo A1 allele. Obtained.
  • “ ⁇ ” indicates that there was a significant difference between the A2 allele possession group and the A1 allele homology group in repeated measure ANOVA (the same applies to FIGS. 7 and 8). It shows that there was a significant difference in the analysis).
  • TaqlA polymorphism was shown to significantly correlate with the responsiveness to the SSRI drug fluvoxamine. Based on these results, TaqlA polymorphisms in depressed patients are examined, and if the polymorphism is in the A2 allele possession group (“A1 / A2” or “A2 / A2”), it shows an effect on SSRI Reactivity can be predicted to be a responder. On the other hand, if the polymorphism is the A1 allele homozygote group “A1 / A1”, it is predicted to be a non-responder that has no effect on SSRI or a poor responder (poor responder). be able to.
  • testing TaqlA polymorphism alone also shows the patient's responsiveness to antidepressants (therapeutic responsiveness), ie whether the patient is a responder (or poor responder). Predicting before administration can contribute to efficient and appropriate treatment of depression.
  • PCR-RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
  • the PCR reaction solution (201) was prepared by adding 30 ng of genomic DNA extracted from the patient's peripheral blood to the optimal buffer, enzyme, dNTP (each 0.2 mM), forward primer (0.5 ⁇ 0.5) and reverse primer ( The yarn was 0.5 ⁇ ⁇ ).
  • the sequences of the designed forward primer (D2-TaqlA F) and reverse primer (D2-TaqlA R) are as shown in (a) and (b) below.
  • PCR reaction conditions were 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds, and DNA was amplified in steps of 35 cycles.
  • the Taql A polymorphism inspection method is not limited to the above method.
  • TaqlA polymorphisms are indirectly tested by examining other gene polymorphisms on the DRD2 gene that are linked to TaqlA polymorphisms to form haplotypes. The reactivity of an antidepressant may be predicted.
  • this analysis found a correlation between D RD2 gene polymorphism and antidepressant drug reactivity, it was determined that there was an antidepressant responsiveness based on other gene polymorphisms present on the DRD2 gene. Can also be predicted.
  • the base sequence of 201 nucleotides in length including the TaqlA polymorphic site is shown below.
  • the TaqlA polymorphism site is located at the 101st position, the A1 allele is “TJ (thymine)”, and the A2 allele is “C” (cytosine).
  • probes and primers can be designed based on this sequence information, and the polymorphism can be examined.
  • TCAT TH tetranucleotide repeat polymorphism
  • TH tyrosine hydroxylase
  • FIG. 6 shows a representative gene polymorphism of TH.
  • the above TCAT repeat polymorphism in intron 1 is most frequently studied in relation to various diseases.
  • the other is the Val81Met polymorphism of amino acid substitution, which has been correlated with schizophrenia (Neuropsychiatric Genetics. 2003, 116B: 23-26, Molecular Psychiatry. 2001, 6:31 5-319).
  • TCAT repeat polymorphism activation of the noradrenergic nervous system (Hypertension. 1999, 32: 676-682, Life Science. 1997, 61: 1341-1347) and reduced extroversion in healthy individuals (Neuroscience Research. 2006, 54 : 180-185).
  • TCA T repeat polymorphism has not been reported to be associated with antidepressant responsiveness.
  • the TCAT repeat polymorphism has 6 to 10 repeats (T6 to T10) alleles, 9 repeats for Japanese and 10 repeats for Caucasian.
  • FIG. 7 and FIG. 8 are graphs showing that a significant correlation was observed between the TCAT repeat polymorphism and reactivity to the antidepressant drug SSRI.
  • the analysis method is the same as for TPH2 and DRD 2, but the graph in Fig. 7 shows the results for 39 patients with depression who took paroxetine, while the graph in Fig. 8 shows the patients with depression who took fluvoxamine. The result of the name.
  • the TCAT repeat polymorphism is significantly correlated with reactivity to the antidepressant SSRI. Based on these results, TCAT repeat polymorphisms in depressed patients were examined, and if the polymorphism was in the ⁇ 9 + / 9 + '' group with 9 repeat alleles homozygous, it was more fully than paroxetine. It can be predicted that taking voxamine (or antidepressants with similar trends) will be more responsive to the patient. On the other hand, when the polymorphism has an allele other than 9 repeat alleles (“9 + / 9-” or “9- / 9-”), paroxetine (or a similar trend is shown) rather than fluvoxamine.
  • the TCAT repeat polymorphism was examined and determined using PCR as follows. First, for the PCR method, the PCR reaction solution (20 ⁇ 1) was prepared by adding 60 ng of genomic DNA extracted from the patient's peripheral blood, optimal buffer, enzyme, dNTP (each 0.2 mM), forward primer ( ⁇ ⁇ ), and reverse. A yarn containing a primer (1 mm) was formed. The sequences of the designed forward primer (TH 1F) and reverse primer (TH 1R) are as shown in (a) and (b) below. As PCR reaction conditions, 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds were used as a cycle, and DNA was amplified by performing 40 cycles of this cycle.
  • the obtained PCR product was electrophoresed using a capillary and the difference of 4 bp was observed and judged.
  • TCAT repeat polymorphisms are indirectly detected by examining other gene polymorphisms on the TH gene that are linked to TCAT repeat polymorphisms to form haplotypes.
  • the mold may be examined to predict antidepressant responsiveness.
  • TH gene polymorphism and antidepressant responsiveness was found in this analysis, so antidepressant responsiveness was determined based on other gene polymorphisms present on the TH gene. It is also possible to predict this.
  • This sequence is a 9-repeat allele sequence, and the site in Katsuko corresponds to the polymorphic site.
  • a probe or primer can be designed based on this sequence information, and the polymorphism can be inspected.
  • the present invention examines at least one polymorphism related to the TPH2 gene, DRD2 gene or TH gene and predicts the reactivity to an antidepressant.
  • a plurality of gene polymorphisms related to these genes are used.
  • the method of predicting responsiveness and predicting reactivity to antidepressants based on the test results is a preferred method, and similarly, combining gene polymorphisms related to these genes with polymorphisms of other genes Thus, a method for predicting reactivity to an antidepressant is also preferred and a method.
  • Fig. 3 shows the result of examining the correlation between the TPH2 gene polymorphism (rslll78997 polymorphism) and the LPR polymorphism test results and the patient's response to the antidepressant fluvoxamine It is a graph.
  • wild and hetero indicate that the genotype of the rslll78997 polymorphism is “T / T” and “ ⁇ / ⁇ ”, respectively, and ⁇ / sj “1/1” and “s / s” are LPR. Indicates the polymorphic genotype.
  • the combination of “1/1” and “wild” has the highest therapeutic response, whereas the combination of “s” and “heter 0 ” has the lowest therapeutic response. I helped.
  • Each combination of “s / s” and “wild”, ⁇ / sj and “hetero”, “l / s” and “wild” shows intermediate therapeutic response between them, and has a certain effect on SSRI.
  • the reactivity can be predicted to be the same as the bonder shown. In this way, by combining the test results of a plurality of gene polymorphisms, it becomes possible to predict the reactivity more finely.
  • HTR serotonin receptor
  • the sequence described under each gene polymorphism of (1) to (6) above is a base sequence in the vicinity of the front and back including the polymorphic site, and the site in Katsuko corresponds to the polymorphic site. To do. These base sequences are also described in SEQ ID NOs: 11 to 16 in the sequence listing, respectively, but in the sequence listing, the base at the polymorphic site is represented by one letter by the universal code.
  • the gene polymorphism in (6) above is a polymorphism due to the presence or absence of a defective portion, and SEQ ID NO: 16 describes the nucleotide sequence of the insertion type (ins).
  • the gene polymorphism (HTR2A-1438A / G) in (3) above is a number when converted into a reverse-complemented strand, and thus is T / C in the above sequence (the same applies to SEQ ID NO: 13).
  • Serotonin receptor (HTR) gene polymorphisms (1) to (6) above and anti-depressant SSRI The specific correlation with the treatment responsiveness will be described as follows.
  • the polymorphism in (4) (HT R2A 102T / C: rs6313) was completely linked to the polymorphism in (3) above (linkage disequilibrium), so the C / C group tended to have a high improvement rate. Admitted.
  • the improvement rate tends to be high in the C / C group.
  • the polymorphism (HTR3B-100_-102AAG ins / del), the ins / A tendency toward a high improvement rate was observed in the ins group.
  • paroxetine clinical effects and two gene polymorphisms were analyzed by combining the two polymorphisms, and the odds ratio was 15.5. The prediction rate improved.
  • a method of predicting the reactivity to an antidepressant by combining a plurality of gene polymorphisms is a preferable method.
  • the predictive method based on discriminant analysis and the predictive method based on decision trees as disclosed in the specification of International Application No. PCTZJP2006Z312519 are preferable when predicting reactivity by combining test results of multiple gene polymorphisms. It is.
  • each prediction method described above is performed using a program.
  • the present invention includes such an antidepressant drug reactivity prediction support program. That is, the prediction support program of the present invention is (1) 1 or 2 related to any one of TPH2, DRD2 and TH.
  • the program of the present invention can be provided as a computer-readable recording medium on which the program is recorded.
  • Examples of such recording media include magnetic storage media such as flexible disks, hard disks, and magnetic tapes, and optical storage media such as CD-ROM, CD-R, CD-RW, DVD-ROM, DVD-RAM, and DVD-RW.
  • Powers that can exemplify electrical storage media such as RAM and ROM, and magnetic Z optical storage media such as MO are not limited to these.
  • methods for investigating TPH2, DRD2, and TH gene polymorphisms and other gene polymorphisms are not particularly limited, and can be used to directly or indirectly examine polymorphisms on genes.
  • Known methods can be applied, and methods developed in the future may be used.
  • the method used for this analysis to examine gene polymorphisms by PCR is a simple method with good accuracy, so this method is briefly described below.
  • the DNA sample to be used for the examination is any organ 'tissue' cell of the subject (including blood, cells in amniotic fluid, cells cultured from the collected tissue, etc.) 'Extract. As long as gene amplification by PCR is possible, the DNA purification and extraction step may be omitted or simplified.
  • PCR is performed using the genomic DNA in the DNA sample prepared by the above method as a saddle, and the polymorphic site is sandwiched. Amplify the gene region. Then, based on the obtained amplified fragment, the length of the amplified fragment can be examined by Primer extension method (primer extension method), PCR-RFLP method, or electrophoresis. Determine genotype by methods.
  • each condition and reagents used in the PCR method are not particularly limited.
  • genetic polymorphism testing may use methods other than PCR. If the polymorphism on the gene can be tested directly or indirectly, a method for testing the base in a single nucleotide polymorphism (SNP) (SNP typing), or a polymorphism based on the presence or absence of a defective part
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • SNP typing single nucleotide polymorphism
  • Various conventionally known methods such as the method can be applied (for example, refer to the document “Post-Sequence Genomic Science (1) SNP gene polymorphism strategy” (Nakayama Shoten)).
  • a testing method using a genetic polymorphism testing instrument such as a DNA chip can be mentioned.
  • This method uses a DNA chip (or similar instrument) with a probe for testing TPH2, DRD2 and TH gene polymorphisms, or a probe for testing other gene polymorphisms on the substrate.
  • This is a method of performing gene typing using this DNA chip or the like based on the presence or absence of a hybridization signal between a gene sample from a subject and a probe.
  • an adjacent nucleotide sequence including the base of the polymorphic site for example, about 8 to 30 nucleotides in length
  • its complementary sequence is used.
  • DNA chip mainly refers to a synthetic DNA chip that uses synthesized oligonucleotides as probes. It also uses an affixed DNA microarray that uses cDNA such as PCR products as probes. Good.
  • a DNA chip containing such probes for TPH2, DRD2 and TH gene polymorphism assays can be used as a reactivity prediction chip for the antidepressant SSRI.
  • a point mutation detection method such as PCR-SSCP method or Allele specific PCR method may be used, or an amplification method other than PCR method (for example, RCA method). Etc.) may be used.
  • the base sequence of the amplified fragment can be directly determined using a nucleotide sequence determination device (Sequencer), and then the gene can be typed.
  • genetic polymorphism testing may be performed based on polymorphisms present in intron sequences, control sequences, etc., in addition to coding sequences encoding proteins.
  • the polymorphism (mutation) is a mutation on the coding sequence
  • the polymorphism (mutation) can be detected based on cDNA prepared from RNA or mRNA.
  • the polymorphism (mutation) may be detected from the amino acid sequence of the protein.
  • the gene polymorphism testing kit of the present invention is a primer designed based on these gene sequences or their neighboring sequences in order to directly or indirectly test TPH2, DRD2 and TH gene polymorphisms.
  • it contains probes, (1) Enzymes and reagents used for sample preparation, (2) Enzymes and reagents used for reverse transcription reaction, (3) Enzymes and reagents used for PCR method, ( 4) It may contain 1 or 2 or more of enzymes and reagents used to determine the base sequence! /.
  • TPH2, DRD2 and TH gene polymorphisms and antidepressant responsiveness shows the expression of TPH2, DR D2 and TH based on these gene polymorphisms. It can be said that individual differences in the amount (or activity, etc.) affect the antidepressant responsiveness. Therefore, by developing TPH2, DRD2 or TH as a target (drug discovery target) and searching for substances that affect the expression level, activity, binding to other substances, etc., development of efficient antidepressants, In particular, it can be expected to develop drugs that can be used in combination with antidepressants such as SSRI to improve their efficacy.
  • the present invention includes such an antidepressant screening method targeting TPH2, DRD 2 and TH.
  • screening method of the present invention various conventionally known methods for examining the expression level of gene 'protein, changes in protein activity, binding between molecules, etc. can be applied, and are not particularly limited. . Further, a screening method newly developed after the present invention may be used. Either in vitro or in vivo screening systems may be used, and screening may be performed with a cell-free system. In addition to the human-derived gene'protein used for screening, a mouse-derived or other animal-derived protein may be used. Of course, you may screen using the information regarding the three-dimensional structure of protein.
  • the present invention relates to a method for predicting the reactivity of a subject to an antidepressant based on genetic polymorphisms of TPH2, DRD2, and TH. It can be used for testing, diagnosis, etc. in the treatment of depression using drugs, especially SSRI.

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Abstract

　本発明者らは、トリプトファンヒドロキシラーゼ-２（ＴＰＨ２）の遺伝子多型と抗うつ薬に対する反応性との関連性の有無について解析を行った。その結果、抗うつ薬に対する反応性予測に有用な遺伝子多型をＴＰＨ２遺伝子のプロモーター領域に見出すと共に、当該遺伝子多型を用いて抗うつ薬反応性を高精度に予測できることを明らかにした。さらに、ドパミンＤ２受容体（ＤＲＤ２）およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の遺伝子多型が、抗うつ薬に対する反応性予測に有用であることを見出した。本発明は、抗うつ薬とりわけ選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）を用いたうつ病治療における検査、診断に有用である。

Description

明 細 書
抗うつ薬に対する反応性予測に有用な遺伝子多型
技術分野
[0001] 本発明は、被検者の遺伝子多型に基づいて抗うつ薬に対する反応性を予測する 方法に関するものである。本発明は、特に、うつ病の改善を目的とした薬物治療にお ける検査、診断に有用な技術を提供するものである。
背景技術
[0002] 近年、「うつはこころの風邪」といわれるように、うつ病は身近な病気であるとの認識 が一般的となっている。これまで、主なうつ病発症の生物学的仮説として、モノアミン（ セロトニン、ノルアドレナリン)神経系機能異常、視床下部—下垂体-副腎 (HPA)系 機能異常 (ストレス適応機能不全)、生態リズム異常、神経可塑性異常などが想定さ れてきたが、未だ確定されてはいない。うつ病の親族の有病率は一般対象よりも高い ことから、発症機序に何らかの遺伝的素因が存在することは間違いない。うつ病は、 何らかのストレス脆弱性ともとらえることができ、その基盤にモノアミン神経系、 HPA 系や神経可塑性の異常が存在し、ストレス影響を過剰に受け、脳内ストレス適応機構 が破綻を来して発病に至ることが想定される。
[0003] 現在、うつ病治療の第一選択薬として、抗うつ薬 SSRIが用いられているが、その臨 床効果には大きな個人差が存在することが知られている。 SSRIとは、選択的セロト- ン再取り込み阻害薬（Selective Serotonin Reuptake InWbitors)の略称であり、神経終 末においてセロトニントランスポーターを介したセロトニンの再取り込みを選択的に阻 害する新世代の一群の抗うつ薬を指す名称である。この SSRIのほかに、新世代の 抗うつ薬として SNRIを挙げることができる。 SNRIとは、セロト-ン&ノルアドレナリン 再取り込み阻害薬（(Selective) Serotonin & Noradorenaline Reuptake InWbitors)の略 称であり、セロトニンおよびノルアドレナリンの再取り込みを選択的に阻害する一群の 物質を指す名称である。
[0004] 上記したように、抗うつ薬 SSRIの臨床効果には大きな個人差が存在するが、この 個人差の背景には遺伝的因子の関与が想定され、 SSRIの作用部位であるセロト- ントランスポーターの LPR多型は、最も有力な因子としてこれまでにも研究が行われ ている（下記の非特許文献 1 · 2参照)。このうち、非特許文献 2は、本発明者らの発表 によるものであり、 SSRIに属する代表的な 2つの抗うつ薬パロキセチン（paroxetine) とフルボキサミン (fluvoxamine)による臨床効果と患者の遺伝子多型との相関を検討 し、上記 LPR多型における遺伝子型が s/sの場合には、フルボキサミンに比べてパ ロキセチンの臨床効果が高力つたことなどを報告した。
[0005] このほかにも、種々のセロトニン関連因子の遺伝子多型力 SSRIの反応性を予測 しょうとする研究が行われている力 多くは一定の結論に至っていない。ところで近年 、セロトニン生合成の律速段階を担うトリブトファンヒドロキシラーゼ (TPH)に、新規脳 特異的ノリアントであるトリブトファンヒドロキシラーゼ -2 (TPH2)が発見された（下記 非特許文献 3)。その後、この TPH2について様々な研究が行われ、これまでに次の ような報告がなされている。
(1) TPH2遺伝子のェキソンに存在し、 in vitroでセロト-ン産生量を 80%低下させ る多型が報告されている（下記非特許文献 4)。うつ病患者で変異が多く検出されたこ とから、この変異は TPH2の酵素活性に重要な領域であり、うつ病の発症に関わる可 能性が示唆された。
(2) そのほかにも、 TPH2遺伝子のェキソン上、およびイントロン上の SNP (1塩基 多型）が報告されている（下記非特許文献 5 · 6)。これらの報告では、当該 SNPとうつ 病の罹患率との相関につ 、て検討されて 、る一方、抗ぅつ薬の反応性との相関につ いては検討されていない。
(3) 最近、 TPH2遺伝子のプロモーター領域の多型と統合失調症及び自殺との相 関を検討し、両者の相関は認められな力つた旨の報告がなされている（下記非特許 文献 7)。
(4) ごく最近では、 TPH2遺伝子に関連する多型と注意欠陥多動障害 (ADHD)と の間に相関がある旨の報告がなされて！/ヽる（下記非特許文献 8 · 9)。
[0006] 非特許文献 1： Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2005,29:1062-1073 非特許文献 2 : Int Clin Psychopharmacol. 2005,20:151-156
非特許文献 3 : Science. 2003,299:76 非特許文献 4: Neuron. 2005,45:11-16
非特許文献 5 :Mol Psychiatry. 2004,9:980-983
非特許文献 6 :Mol Psychiatry. 2004,9:1030-1036
非特許文献 7 : Psychiatry Res. 2005,134:195-198
非特許文献 8 :Mol Psychiatry. 2005 Oct;10(10):944- 9.
非特許文献 9 :Mol Psychiatry. 2005 Dec; 10(12): 1126- 32.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] うつ病の改善を目的とした薬物治療にぉ 、て、安全で有効な治療を行うには適応と なる患者を正しく選定することが重要である。特に、前述のように抗うつ薬 SSRIの臨 床効果には大きな個人差が存在するため、患者の SSRI反応性を治療初期の段階 で客観的に予測し、個々の患者に適した薬物治療を行うことの重要性が指摘されて いる。
[0008] 本発明は、上記の問題点、即ち抗うつ薬反応性を投与前に予測することの重要性 に鑑みなされたものであり、その目的は、被検者の遺伝子多型 (polymorphism)に基 づいて抗うつ薬に対する反応性を予測する方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、抗うつ薬による臨床効果に大きな個人差が存在する原因に遺伝的 因子の関与を想定し鋭意研究を進め、これまでに抗うつ薬 SSRIの作用部位である セロトニントランスポーターの LPR多型がその一因であることを報告した。今回さらに 脳内セロトニン量に着目し、前記トリブトファンヒドロキシラーゼ -2 (TPH2)を含む複 数のセロトニン関連因子の遺伝子多型を取り上げ、抗うつ薬の臨床効果に及ぼす影 響を検討した。その結果、 TPH2遺伝子のプロモーター領域に存在する遺伝子多型 が抗うつ薬の臨床効果の個人差の予測に有用であり、当該遺伝子多型を用いて抗ぅ つ薬に対する反応性を高精度に予測できること、また上記 LPR多型など他の遺伝子 多型の検査結果と組み合わせることによって更にきめ細かい反応性予測が可能にな り、個々の患者に適した治療計画の立案に資すること、を見出した。
[0010] さらに、ドパミン神経系における検討因子の中から、ドパミン D2受容体 (DRD2)遺 伝子の TaqlA多型、および、チロシンヒドロキシラーゼ (TH)遺伝子の TCATリビー ト多型が、抗うつ薬に対する反応性予測に有用であること、等を見出し、本発明を完 成させるに至った。
即ち、本発明は、産業上有用な発明として、下記 A)〜ひの発明を包含するもので ある。
A) トリプトファンヒドロキシラーゼ- 2 (TPH2)遺伝子、ドノ ミン D2受容体（DRD2) 遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ (TH)遺伝子、またはゲノム上それらの近傍に存在 する 1又は 2以上の多型を検査し、その結果に基づき、被検者の抗うつ薬に対する反 応性を予測する方法。
上記トリプトファンヒドロキシラーゼ- 2 (tryptophan hydroxylase- 2)は、トリプトファン 水酸化酸素タイプ 2などとも称され、脳内セロトニン生合成の律速段階を担う酵素と考 えられる。本明細書では、この酵素を「TPH2」と略称し、またその遺伝子を「TPH2 遺伝子」と称する。
上記ドパミン D2受容体（Dopamine D2 receptor)は、ドパミン受容体のサブタイプの 1つであり、本明細書では、この受容体を「DRD2」と略称し、またその遺伝子を「DR D2遺伝子」と称する。また、上記チロシンヒドロキシラーゼ（Tyrosine hydroxylase)は 、チロシンを L-DOPAへ変換するドパミン生合成関連酵素であり、本明細書では、こ の酵素を「TH」と略称し、またその遺伝子を「TH遺伝子」と称する。
本発明は、 TPH2遺伝子、 DRD2遺伝子、 TH遺伝子、またはゲノム上それらの近 傍に存在する多型を検査するものであるが、これは換言すれば、これらの遺伝子に 関連する少なくとも 1つの多型を検査することを意味する。これらゲノム遺伝子のェキ ソン領域あるいはイントロン領域に存在する多型の検査に制限されず、そのプロモー ター領域など転写調節領域、制御領域あるいは非翻訳領域などに存在する多型を 検査するものであってもよい。本明細書において、「遺伝子多型」とは、このようなプロ モーター領域などに存在する多型を含み、当該遺伝子に関連する多型という広義の 意味である。
また、本発明において、上記 3つの遺伝子のいずれかに関連する多型を複数検査 し、その結果に基づき、被検者の抗うつ薬に対する反応性を予測する方法は好まし い方法であるが、単独で抗うつ薬に対する反応性との相関が認められた 1つの多型 を検査し、その結果に基づき、反応性予測するものであってもよい。
[0012] B) 抗うつ薬として使用される、選択的セロトニン再取り込み阻害薬 (SSRI)または セロト-ン&ノルアドレナリン再取り込み阻害薬 (SNRI)に対する反応性を予測する、 上記 A)記載の方法。
上記抗うつ薬 SSRIとしては、パロキセチン（paroxetine)、フルボキサミン（fluvoxami ne)、フルォキセチン (fluoxetine)、セルトラリン（sertraline)などが代表的である力 そ のほ力に、ネファゾドン（nefazodone)、シタロプラム（citalopram)、デタスフェンフルラミ ン（dexfenfluramine)などを挙げることができる。他方、上記抗うつ薬 SNRIとしては、ミ ルナシプラン (milnacipran)などが代表的である力 そのほかに、ベンラフアキシン (ve nlafaxine)、デュロキセチン（duloxetine)などを挙げることができる。
本発明は、上記抗ぅつ薬 S SRIある 、は SNRIに対する反応性予測に好適に使用 できるが、セロトニン再取り込み阻害作用を有するその他の抗うつ薬 (三環系抗うつ 薬、四環系抗うつ薬など）に対する反応性予測に使用することも可能と考えられる。
[0013] C) 上記 TPH2遺伝子のプロモーター領域に存在する多型、上記 DRD2遺伝子 の TaqlA多型、および、上記 TH遺伝子の TCATリピート多型の少なくとも 1っを検 查することによって、被検者の抗うつ薬に対する反応性を予測する、上記 A)又は B) 記載の方法。
後述のように、本発明者らは、 TPH2遺伝子のプロモーター領域に存在する多型 (r si 1178997遺伝子多型）、 DRD2遺伝子の TaqlA多型（rsl800497遺伝子多型）また は TH遺伝子の TCATリピート多型（TH tetranucleotide (TCAT) repeat多型）を検査 、判定することによって、いずれも各多型単独で抗うつ薬 SSRIに対する治療反応性 を高精度に予測できることを明らかにした。したがって、これらの遺伝子多型の少なく とも 1つを直接、または間接的に検査、判定することによって、抗うつ薬 SSRIに対す る治療反応性を高精度に予測することが可能である。
[0014] D) さらに、セロトニントランスポーター遺伝子、またはセロトニン受容体遺伝子、あ るいはゲノム上それらの近傍に存在する多型を検査し、その結果を加味して、被検者 の抗うつ薬に対する反応性を予測する、上記 A)記載の方法。 前述と同様に、上記の「それらの近傍に存在する多型」とは、換言すれば、セロト- ントランスポーター遺伝子 (またはセロトニン受容体遺伝子）に関連する多型を意味し 、即ちこれら遺伝子のプロモーター領域など転写調節領域、制御領域あるいは非翻 訳領域などに存在する多型を検査するものであってもよい。
[0015] E) セロトニントランスポーター遺伝子に関連する LPR多型を検査し、その結果を 加味して、被検者の抗うつ薬に対する反応性を予測する、上記 D)記載の方法。 後述のように、本発明者らは、 TPH2遺伝子に関連する上記 rsl 1178997多型の検 查結果と、セロトニントランスポーター遺伝子のプロモーター領域に存在する LPR多 型（Int Clin Psychopharmacol. 2005,20:151-156参照）の検査結果とを組み合わせる ことによって更にきめ細かい反応性予測が可能になることを明らかにした。このように 、複数の遺伝子多型に基づいて薬効予測することは好ましぐゲノム情報に基づく個 々の患者に適した適正な薬物治療の実現に資するものである。
[0016] F) うつ病の改善を目的とした薬物治療において、抗うつ薬に対する患者の反応 性予測に使用する、上記 A)〜E)のいずれかに記載の方法。
G) 上記 A)〜E)のいずれか〖こ記載の検査結果をもとに、被検者の抗うつ薬反応 性予測をコンピュータに実行させる、抗うつ薬反応性予測支援プログラム。
H) 上記 A)記載の方法にお!、て、遺伝子多型の検査は、被検者から調製したゲ ノム DNAを铸型にして、多型部位を挟む遺伝子領域を増幅する工程と、得られた増 幅断片をもとに遺伝子型を決定する工程とを含む方法。
I) 上記 A)記載の方法にお!、て、 DNAチップ等の遺伝子多型検査器具を用いて 遺伝子多型を検査する方法。
J) 上記 I)記載の方法に使用される、遺伝子多型検査用オリゴヌクレオチド。
K) 上記 A)記載の方法に使用される、遺伝子多型検査用キット。
L) トリプトファンヒドロキシラーゼ -2 (TPH2)、ドパミン D2受容体（DRD2)遺伝子 またはチロシンヒドロキシラーゼ (TH)遺伝子を標的 (創薬ターゲット）とした抗うつ薬 のスクリーニング方法。
今回の解析により、 TPH2、 DRD2および THの各遺伝子多型と抗うつ薬反応性と の間に相関が認められた力 この結果は、これらの遺伝子多型に基づく TPH2、 DR D2および THの発現量 (または活性等)の個体差が、抗うつ薬の反応性に影響を及 ぼすことを示すものといえる。したがって、 TPH2、 DRD2または THを標的 (創薬タ ーゲット)とし、その発現量または活性等を変化させる物質を探索することは、 SSRI 等の抗うつ薬と併用し、その薬効を向上させる薬剤の開発に有用である。 発明の効果
[0017] 本発明によれば、 TPH2や DRD2、 THの遺伝子多型に基づいて抗うつ薬に対す る反応性を簡易迅速かつ客観的に予測することができるので、抗うつ薬を用いたうつ 病治療において、抗うつ薬に対する患者の反応性予測に好適に使用することができ る。前述のように、抗うつ薬とりわけ SSRIの臨床効果は個人差が非常にあり、しかもう つ病は重症化すると自殺企図につながる恐れが高いことから、使用予定の抗うつ薬 に対する患者の反応性を治療初期の段階で客観的に予測し、個々の患者に適した 適正な薬物治療を行うことが強く望まれていた。本発明は、投与前に患者の抗うつ薬 反応性を高精度に予測することを可能とし、有効で安全なうつ病治療を実現し、医療 の質の向上、並びに治療効率の向上に寄与するものである。
図面の簡単な説明
[0018] [図 1]TPH2の遺伝子多型 (rslll78997多型）と抗うつ薬 SSRIに対する反応性との相 関を調べた結果を示すグラフである。
[図 2]セロト-ントランスポーター遺伝子の LPR多型が sZsのグループ内における、 T PH2の遺伝子多型 (rslll78997多型）と抗うつ薬 SSRIに対する反応性との相関を調 ベた結果を示すグラフである。
[図 3]上記 TPH2の遺伝子多型 (rsl 1178997多型）と上記 LPR多型とを組み合わせ、 これと抗うつ薬 SSRIに対する反応性との相関を調べた結果を示すグラフである。
[図 4]DRD2遺伝子上の多型を説明する図である。
[図 5]上記 DRD2遺伝子の TaqlA多型（rsl800497多型）と抗うつ薬 SSRIに対する 反応性との相関を調べた結果を示すグラフである。
[図 6]TH遺伝子上の多型を説明する図である。
[図 7]上記 TH遺伝子の TCATリピート多型と抗うつ薬 SSRI (パロキセチン）に対する 反応性との相関を調べた結果を示すグラフである。 [図 8]上記 TH遺伝子の TCATリピート多型と抗うつ薬 SSRI (フルボキサミン）に対す る反応性との相関を調べた結果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0019] 以下、本発明の好ましい態様について説明する。なお、本明細書および図面にお いて、塩基 ·アミノ酸等を略号で表記する場合、その表記は IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基 づくものであり、たとえば DNAの塩基の表記については以下のとおりである。
Aまたは a :アデニン、 Gまたは g :グァニン、 Cまたは c :シトシン、 Tまたは t :チミン、 R または r :アデニンまたはグァニン、 Mまたは m :アデニンまたはシトシン、 Wまたは w: アデニンまたはチミン、 Sまたは s :グァニンまたはシトシン、 Kまたは k :グァニンまたは チミン、 Yまたは y:シトシンまたはチミン、である。
[0020] また、遺伝子多型、遺伝子配列等に関する番号、数値その他の情報は、米国国立 ノィォテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information : NC BI)のウェブページなどで利用可能な主要な遺伝子データベースにお!/、て使用され ている番号、数値等を参酌して解釈されるものとする。
[0021] [ 1 ]杭うつ薬の反応性予測に有用な遺伝子多型とそれを利用した予測法
[1-1] TPH2遺伝子多型を利用した反応性予測
本発明者らは、前述のように、上記 TPH2の遺伝子多型と抗うつ薬に対する反応性 との関連性の有無につ 、て解析を行った結果、抗ぅつ薬 SSRIに対する反応性予測 に有用な遺伝子多型 (rs 11178997多型）を TPH2遺伝子のプロモーター領域に見出 した。図 1は、この rsl 1178997多型と抗うつ薬 SSRIに対する反応性との間に有意な 相関が認められたことを示すグラフである。
[0022] 解析方法は概略以下のとおりである。即ち、大うつ病または気分変調障害と診断さ れ、書面にて同意の得られた患者 100名（平均年齢 43.7± 14.9)を対象とし、投与薬 剤として SSRIのパロキセチンまたはフルボキサミンを封筒法により無作為に割り当て た。薬剤用量はそれぞれ 20mg、 50mgで開始し、症状改善程度によりそれぞれ 40mg、 150mgまで増量可能とした。臨床効果はうつ病の尺度である Hamilton Depression Rat ing Scale (HAM- D) scoreにより経時的に評価した。図 1のグラフは、フルボキサミンを 服用したうつ病患者 41名の結果であり、グラフ縦軸の「HAMD変化率（％)」が低く なるほど薬剤による改善率即ち臨床効果は高いと評価される。
[0023] 患者の遺伝子多型 (rsl 1178997多型）の検査、判定は、各患者の末梢血からゲノム DNAを抽出後、 PCR法によって行った (検査方法については後述する）。ここで、上 記 rsl l l78997多型について説明すると、ヒト第 12染色体の TPH2遺伝子のプロモー ター領域内、より詳しくは TPH2遺伝子の翻訳開始点を「 + 1」とするとその上流「- 6 14」番目に位置し、転写開始点を「 + 1」とするとその上流「—473」番目に位置する、 当該位置の塩基が T (チミン)または A (アデニン）の 1塩基多型（SNP)である（Psychi atry Res. 2005,134:195-198参照）。以下に、当該多型部位を含む長さ 51ヌクレオチ ドの塩基配列を示す。この塩基配列中、 rsl 1178997多型は第 26番目に位置する。 gattaccttatttgatcattacaca[l / A]tgtacgcttgtgtcaaaatatcaca
[0024] 配列表の配列番号 1にも同一の配列が示される力 多型部位の塩基をュ-バーサ ルコード「w」により表記した点で異なる。配列番号 2は、 SNPのデータベースに「rsl l 178997」の番号を付されて登録 *掲載されているデータ中の配列であり、当該配列中 、 rsl 1178997多型は第 400番目に位置する。
[0025] 図 1に示すように、上記 rsl 1178997多型における塩基力^ T」のアレルをホモで有す る「Τ/Τ」保有群は、「Τ」アレルと「Α」アレルをへテロで有する「Τ/Α」保有群に比べて フルボキサミンの臨床効果が高ぐ薬剤投与 2週目の早期段階力 有意に良好な治 療効果が得られた。なお、今回の解析では「Α」アレルをホモで有する「Α/Α」保有者 は検出されなかった。図中、「1/2」「3/4」「5/6」はそれぞれ 1〜2週、 3〜4週、 5〜6 週を示し、「η」は各群の患者数を示し、「*」「#」「+」は t検定の ρ値を示す (他のグラフ も同様である)。
[0026] さらに、各患者のセロトニントランスポーター遺伝子の LPR多型についても検査を 行った。この LPR多型の遺伝子型力 SsZsの場合には、「1」（エル)アレルを保有する 群に比べてフルボキサミンの臨床効果は有意に低くなると 、う結果が得られて 、る (I nt Clin Psychopharmacol. 2005,20: 151-156参照）。そこで、 LPR多型の影響を除外 するため、低改善率群である sZs群内において、上記 rsl 1178997多型とフルボキサ ミンに対する反応性との相関を検討した。図 2は、その結果を示すグラフである。同図 に示すように、上記 rsl 1178997多型の遺伝子型が「T/T」の患者のフルボキサミンに 対する良好な反応性傾向は、 s,s群内にお!ヽても保持されて!ヽた。
[0027] このように、上記 rsl 1178997多型は、 SSRI薬フルボキサミンに対する反応性と有意 に相関することが示された。これらの結果に基づき、うつ病患者の rsl 1178997多型を 検査し、当該多型部位の塩基が「T」のアレルをホモで有する遺伝子型「Τ/Τ」の場合 には、 SSRIに対して効果を示すレスポンダー (responder)であると反応性予測するこ とができる。他方、当該多型部位の塩基が「A」のアレルを有する遺伝子型「T/A」ま たは「A/A」の場合には、 SSRIに対して効果を示さないノンレスポンダー（non respon der)である力 または効果の低いレスポンダー（poor responder)であると反応性予測 することができる。このように、 rsl 1178997多型を検査、判定することによって、抗うつ 薬に対する患者の応答性 (反応性）、即ち患者がレスポンダーであるカゾンレスボン ダー（又は poor responder)であるかを投与前に予測することができ、これにより効率 的かつ適正なうつ病治療に貢献することができる。
[0028] 本発明は、上記 TPH2の遺伝子多型 (rsl 1178997多型）の検査結果に基づいて被 検者の抗うつ薬反応性を予測する方法であるが、検査方法は当該遺伝子多型を直 接検査する方法に制限されるものではない。たとえば、上記 rsl 1178997多型と連鎖し 、ハプロタイプを形成するような TPH2遺伝子上の他の遺伝子多型を検査することに よって間接的に rs 11178997多型を検査し、抗ぅつ薬の反応性を予測することができる 。また、今回の解析により TPH2の遺伝子多型と抗うつ薬反応性との間に相関が認 められたので、 TPH2遺伝子上に存在する他の遺伝子多型に基づ!/ヽて抗うつ薬反 応性を予測することも可能である。
[0029] たとえば、 rsl 1178997多型は、 TPH2遺伝子上の 11178998多型(-52 / と完全 にリンクし、 rsl 1178998多型が「A」アレルのときは、 rsl 1178997多型は「T」アレルと判 断できる。このように、 rsl 1178997多型の検査は他のリンクする変異で検査してもよい
[0030] TPH2遺伝子上の他の遺伝子多型を検査する場合、当該遺伝子多型は 1塩基多 型に制限されるものではなぐたとえば欠損部分の有無による多型、即ち、 2以上の 塩基からなる特定の塩基配列を有する挿入型とこの塩基配列を欠く欠失型との違い を有する遺伝子型、であってもよい。本発明は、 1塩基多型に限らず、このような欠損 部分の有無による遺伝子多型に基づいて抗うつ薬反応性を予測してもよいし、転位 など他の遺伝子多型に基づいて抗うつ薬反応性を予測してもよい。
[0031] 遺伝子多型の検査、判定は、たとえば患者の血液力 調製した DNA試料中のゲノ ム DNAを铸型にして、多型部位を挟む遺伝子領域を PCR法などで増幅し、得られ た増幅断片をもとにプライマー伸長法などで遺伝子型を決定することにより行うことが できる。 PCR法に使用するプライマー配列、プライマー伸長法に使用するプローブ 配列は、たとえば配列番号 1 · 2に示される配列などを参考に設計することができる。 また、 TPH2遺伝子のゲノム配列は、 GenBank等の遺伝子配列データベースにァク セッション番号「NC_000012 REGION: 70618893..70712488 J (GenelD : 121278)で登 録 ·掲載されており、 TPH2の cDNA配列はァクセッション番号「NM_173353」などで 登録'掲載されているので、これらのデータベースに開示されている塩基配列などを 参考に設計してもよい（特に、 TPH2遺伝子のェキソン領域またはイントロン領域の 遺伝子多型を検査する場合)。
[0032] 上記 rsl 1178997多型の検査、判定は、 PCR- SSCP (single strand conformation poly morphism)法を用いて次のように行った。まず PCR法について、 PCR反応液（20 1) は、患者末梢血力 抽出したゲノム DNA 60ngに、至適バッファー、酵素、 dNTP (各 0. 2mM)、フォワードプライマー（0.5 μ Μ)及びリバースプライマー（0.5 μ Μ)を含む組成 とした。設計したフォワードプライマー（ΤΡΗ2 - 473F)及びリバースプライマー（ΤΡΗ2 -473R)の配列はそれぞれ下記 (a),(b)に示すとおりである。 PCRの反応条件は、 94°C 30秒、 50°C 30秒、 72°C 30秒を 1サイクルとして、これを 35サイクル行うステップに よって DNAを増幅した。
(a) 5 ' -GGCAATGGATATCTTGATTA-3 ' (配列番号 3)
(b) 5 ' -AACCTCAGTCTTTAAGCAAT-3 ' (配列番号 4)
[0033] 次に、得られた PCR産物を SSCP (single strand conformation polymorphism)と呼ば れる方法で分離し、その電気泳動パターンで遺伝子の差異を判定した。この方法で は、まずトリスバッファーで PCR産物を 4倍希釈し、このサンプル 3 Uこ対し、変性溶 液 6 /z Lを加えた。変性溶液は 94%ホルムアミド、 0.05%キシレンシァノールブルー溶 液、 0.04%ブロモフエノールブルーの溶液である。次に 95°C、 5分間処理し、 PCR産 物を熱変性させた。そして、 GeneGel Excel 12.5/24 kit (アマシャム社）を用いて電気 泳動後、銀染色を行った。この銀染色によって得られた電気泳動パターンから遺伝 子の差異を判定し、上記 rsl 1178997多型における遺伝子型を決定した。さらに、遺 伝子の差異を確認するため、上記 SSCP法により得られた差異をダイレクトシークェン ス法及び TaqMan法でも確認した。
[0034] [ 1-2] DRD2遺伝子多型を利用した反応性予測
近年、セロトニンやノルアドレナリン神経系だけではなぐドパミン神経系も抗うつ薬 の臨床効果に影響を及ぼして 、るとの報告が多々見られるようになってきた (Journal of Affective Disorders.2005,86:37-45)。そこで、本発明者らは、抗うつ薬の反応性予 測に有用な遺伝子多型として、ドパミン神経系の因子の探索を行ったところ、ドパミン D2受容体（DRD2)およびチロシンヒドロキシラーゼ (TH)の遺伝子多型につ!、て、 抗ぅつ薬の臨床効果との相関が認められた。
[0035] DRD2の遺伝子多型と精神病との相関については、以前より注目され、研究が進 められていた。例えば、 DRD2のプロモーター領域や 3' UTR領域の多型と統合失 調症（Human Molecular Genetics. 1997,6:577- 582)ゃ躁うつ病（Psychiatry Research . 1999,86:193-201)との相関を検討した報告がある。また、抗うつ薬 SSRIに対するレ スポンダーにおいて、線条体での DRD2に対するリガンドの結合量が増加していたと の報告がある（Psychiatry Research. 1999,90:91-101)。しかし、抗うつ薬の反応性と DRD2の遺伝子多型との関係を検討した報告はない。もちろん、大うつ病の罹患率 と同遺伝子多型との相関の報告もない。
[0036] 図 4には、 DRD2の代表的な遺伝子多型が示される力 この中でも、プロモーター 領域の- 141C Ins/Del多型、 3，UTR領域の TaqlA多型（rsl800497多型）、および ェキソン 7の Ser311Cys多型力 多くの疾患で研究されている。図 5は、本発明者らに よる解析の結果、この中の Taq 1 A多型と抗ぅつ薬 S SRIに対する反応性との間に有 意な相関が認められたことを示すグラフである。解析方法は前記 TPH2の場合と同 様であり、図 5のグラフは、フルボキサミンを服用したうつ病患者 41名の結果である。 グラフ縦軸の「： HAMD変化率 (％)」が低くなるほど薬剤による改善率即ち臨床効果 は高いと評価される。
[0037] 同図に示すように、上記 TaqlA多型において、 A2アレル保有群（即ち、「A1」ァレ ルと「A2」アレルをへテロで有する「A1/A2」および「A2」アレルをホモで有する「A2/A 2」）は、 A1アレルをホモで有する「A1/A1」群に比べてフルボキサミンの臨床効果が 高ぐ薬剤投与 2週目の早期段階力 有意に良好な治療効果が得られた。なお、図 中の「★」は、反復測定分散分析 (repeated measure ANOVA)で A2アレル保有群と A1アレルホモ群との間に有意差があったことを示す（図 7、図 8も同様に同分析で有 意差があったことを示す)。
[0038] このように、上記 TaqlA多型は、 SSRI薬フルボキサミンに対する反応性と有意に 相関することが示された。これらの結果に基づき、うつ病患者の TaqlA多型を検査し 、当該多型が A2アレル保有群（「A1/A2」または「A2/A2」）の場合には、 SSRIに対し て効果を示すレスポンダーであると反応性予測することができる。他方、当該多型が A1アレルホモ群「A1/A1」の場合には、 SSRIに対して効果を示さないノンレスボンダ 一であるか、または効果の低いレスポンダー（poor responder)であると反応性予測す ることができる。このように、 TaqlA多型単独を検査することによつても、抗うつ薬に対 する患者の応答性 (治療反応性）、即ち患者がレスポンダーであるカゾンレスボンダ 一（又は poor responder)であるかを投与前に予測することができ、これにより効率的 かつ適正なうつ病治療に貢献することができる。
[0039] 上記 TaqlA多型の検査、判定は、 PCR- RFLP(Restriction Fragment Length Polym orphism)法を用いて次のように行った。まず PCR法について、 PCR反応液（20 1)は、 患者末梢血から抽出したゲノム DNA 30ngに、至適バッファー、酵素、 dNTP (各 0.2m M)、フォワードプライマー（0.5 μ Μ)及びリバースプライマー（0.5 μ Μ)を含む糸且成とし た。設計したフォワードプライマー（D2- TaqlA F)及びリバースプライマー（D2- TaqlA R)の配列はそれぞれ下記 (a),(b)に示すとおりである。 PCRの反応条件は、 94°C 30 秒、 58°C 30秒、 72°C 30秒を 1サイクルとして、これを 35サイクル行うステップによつ て DNAを増幅した。
(a) 5，- CCGTCGACCCTTCCTGAGTGTCATCA- 3，（配列番号 5)
(b) 5 ' -CCGTCGACGGCTGGCCAAGTTGTCTA-3 ' (配列番号 6) 次に、得られた PCR産物 5 μ 1に対して 5Uの制限酵素 Taq Iを用い、 65°Cで 3時間以 上反応させ切断した。そして、 3%ァガロースゲルで電気泳動（100 V、 20分）を行い、 EtBr染色により判定を行った。
[0040] もちろん、 Taql A多型の検査方法は上記の方法に制限されるものではない。また、 TaqlA多型を直接検査する方法以外に、 TaqlA多型と連鎖し、ハプロタイプを形 成するような DRD2遺伝子上の他の遺伝子多型を検査することによって間接的に Ta qlA多型を検査し、抗うつ薬の反応性を予測してもよい。さらに、今回の解析により D RD2の遺伝子多型と抗ぅつ薬反応性との間に相関が認められたので、 DRD2遺伝 子上に存在する他の遺伝子多型に基づいて抗うつ薬反応性を予測することも可能で ある。
[0041] 以下に、 TaqlA多型部位を含む長さ 201ヌクレオチドの塩基配列を示す。この塩 基配列中、 TaqlA多型部位は第 101番目に位置し、前記 A1アレルは当該部位が「 TJ (チミン）であり、 A2アレルは当該部位が「C」（シトシン）である。 TaqlA多型の検 查においては、この配列情報に基づきプローブやプライマーを設計し、当該多型を 検査することができる。
Figure imgf000016_0001
配列表の配列番号 7にも同一の配列が示されるが、多型部位の塩基をュ-バーサ ルコード「γ」により表記した点で異なる。
[0042] [ 1-3] ΤΗ遺伝子多型を利用した反応性予測
本発明者らは、上記 TaqlA(rsl800497)多型に加え、ドパミン生合成の律速段階 を担うチロシンヒドロキシラーゼ（TH)の TCATリピート多型（TH tetranucleotide (TC AT) repeat多型)も、抗うつ薬に対する反応性予測に有用であることを明らかにした。
[0043] 図 6には、 THの代表的な遺伝子多型が示される。 TH遺伝子では、イントロン 1にあ る上記 TCATリピート多型が様々な疾患との関連においてもっとも多く検討されてい る力 他にはアミノ酸置換の Val81Met多型があり、統合失調症との相関をみたものが ある（Neuropsychiatric Genetics. 2003, 116B:23— 26、 Molecular Psychiatry. 2001,6:31 5-319)。 TCATリピート多型では、ノルアドレナリン性神経系の活性化（Hypertension . 1999,32:676-682、 Life Science. 1997,61:1341-1347)や、健常人において外向性 低下（Neuroscience Research. 2006,54: 180-185)に影響するとの報告がある。その他 、躁うつ病および大うつ病の罹患率との関連検討もある力 相関は認められな力つた (American Journal of Medical Genetics. 1997,74:176—178、同 1999,88:88—94)。 TCA Tリピート多型も、 DRD2多型と同様に、抗うつ薬に対する反応性との関連を検討し た報告はなされていない。なお、 TCATリピート多型には、 6〜10リピート (T6〜T10 )のアレルが存在し、 日本人は 9リピート、 Caucasianは 10リピートがメジャーアレルとさ れている。
[0044] 図 7および図 8は、上記 TCATリピート多型と抗うつ薬 SSRIに対する反応性との間 に有意な相関が認められたことを示すグラフである。解析方法は前記 TPH2、 DRD 2の場合と同様であるが、図 7のグラフは、パロキセチンを服用したうつ病患者 39名の 結果、一方、図 8のグラフは、フルボキサミンを服用したうつ病患者 41名の結果であ る。
[0045] 図 7に示すように、上記 TCATリピート多型において、 9リピートアレル以外のアレル を有する群（即ち、 9リピートアレル「9+」とそれ以外のアレル「9-」をへテロで有する「9 +/9-」および 9リピートアレル以外のアレルをホモで有する「9-/9-」）は、 9リピートァレ ルをホモで有する「9+/9+」群に比べてパロキセチンの臨床効果が高ぐ薬剤投与 2 週目の早期段階力 有意に良好な治療効果が得られた。
[0046] これに対して、フルボキサミンの臨床効果については、上記 2群における改善率が 逆の傾向を示した。即ち、図 8に示すように、 9リピートアレルをホモで有する「9+/9+」 群のほうが、 9リピートアレル以外のアレルを有する群（「9+/9-」または「9-/9-」）に比 ベてフルボキサミンの臨床効果が有意に高力つた。
[0047] このように、上記 TCATリピート多型は、抗うつ薬 SSRIに対する反応性と有意に相 関する。これらの結果に基づき、うつ病患者の TCATリピート多型を検査し、当該多 型が 9リピートアレルをホモで有する「9+/9+」群の場合には、パロキセチンよりも、フル ボキサミン (または同様の傾向を示す抗うつ薬)を服用したほうが、当該患者にとって 治療反応性がより高いと予測することができる。他方、当該多型が 9リピートアレル以 外のアレルを有する群（「9+/9-」または「9-/9-」 )の場合には、フルボキサミンよりも、 パロキセチン (または同様の傾向を示す抗うつ薬)を服用したほうが、当該患者にとつ て治療反応性がより高いと予測することができる。このように、 TCATリピート多型を検 查することによって、使用する抗うつ薬に対する患者の応答性 (治療反応性)、即ち その薬が当該患者にとってより治療効果を期待できるものかどうかを投与前に予測す ることができ、これにより効率的かつ適正なうつ病治療に貢献することができる。
[0048] 上記 TCATリピート多型の検査、判定は、 PCR法を用いて次のように行った。まず P CR法について、 PCR反応液（20 μ 1)は、患者末梢血から抽出したゲノム DNA 60ngに 、至適バッファー、酵素、 dNTP (各 0.2mM)、フォワードプライマー（Ι Μ)及びリバ一 スプライマー（1 Μ)を含む糸且成とした。設計したフォワードプライマー (TH 1F)及び リバースプライマー (TH 1R)の配列はそれぞれ下記 (a),(b)に示すとおりである。 PCR の反応条件は、 94°C 30秒、 58°C 30秒、 72°C 30秒を 1サイクルとして、これを 40サ イタル行うステップによって DNAを増幅した。
(a) 5 ' -CAGCTGCCCTAGTCAGCAC-3 ' (配列番号 8)
(b) 5 ' -GCTTCCGAGTGCAGGTCACA-3 ' (配列番号 9)
次に、得られた PCR産物をキヤピラリーを用いて電気泳動し、 4bpの差を観察 '判定 した。
[0049] もちろん、 TCATリピート多型の検査方法は上記の方法に制限されるものではない 。また、 TCATリピート多型を直接検査する方法以外に、 TCATリピート多型と連鎖し 、ハプロタイプを形成するような TH遺伝子上の他の遺伝子多型を検査することによ つて間接的に TCATリピート多型を検査し、抗うつ薬の反応性を予測してもよい。さら に、今回の解析により THの遺伝子多型と抗うつ薬反応性との間に相関が認められた ので、 TH遺伝子上に存在する他の遺伝子多型に基づ ヽて抗うつ薬反応性を予測 することも可會である。
[0050] 以下に、 TCATリピート多型部位を含む長さ 234ヌクレオチドの塩基配列を示す。
この配列は、 9リピートアレルの配列であり、カツコ内の部位が多型部位に相当する。 TCATリピート多型の検査にぉ 、ては、この配列情報に基づきプローブやプライマ 一を設計し、当該多型を検査することができる。
Figure imgf000019_0001
配列表の配列番号 10にも同一の配列（9リピートアレル）が示される。
[0051] [1-4]複数の遺伝子多型を利用した反応性予測
本発明は、 TPH2遺伝子、 DRD2遺伝子または TH遺伝子に関連する少なくとも 1 つの多型を検査し、抗うつ薬に対する反応性予測を行うものであるが、これらの遺伝 子に関連する複数の遺伝子多型を検査し、その検査結果をもとに抗うつ薬に対する 反応性予測を行う方法は好ましい方法であるし、同様に、これらの遺伝子に関連する 遺伝子多型と他の遺伝子の多型とを組み合わせて、抗うつ薬に対する反応性予測を 行う方法もまた好まし 、方法である。
[0052] たとえば、図 3は、 TPH2の遺伝子多型 (rslll78997多型）と前記 LPR多型の検査 結果を組み合わせ、これと患者の抗うつ薬フルボキサミンに対する反応性との相関を 調べた結果を示すグラフである。図中、「wild」「hetero」はそれぞれ、 rslll78997多型 の遺伝子型が「T/T」「Τ/Α」であることを示し、 Γΐ/sj「1/1」「s/s」は LPR多型の遺伝子 型を示す。同図に示すように、「1/1」及び「wild」の組み合わせの場合に最も治療反応 性が高ぐ反対に、「s 」及び「heter0」の組み合わせの場合に最も治療反応性が低 力つた。「s/s」及び「wild」、 Γΐ/sj及び「hetero」、「l/s」及び「wild」の各組み合わせは 両者の中間程度の治療反応性を示し、 SSRIに対して一定の効果を示すレスボンダ 一であると反応性予測することができる。このように、複数の遺伝子多型の検査結果 を組み合わせることによって、更にきめ細かい反応性予測が可能になる。
[0053] このほ力に、セロトニン受容体（HTR)のサブタイプ（1A,2A,3A,3B)に関連する下記
(1)〜（6)の複数の遺伝子多型と、抗うつ薬 SSRIに対する反応性との間にお ヽても 相関が認められたので、 TPH2、 DRD2または THの遺伝子多型とセロトニン受容体 の遺伝子多型とを組み合わせて、抗うつ薬に対する反応性を予測することも好まし ヽ 方法である。
(1) HTRlA 272Gly/Asp:rsl800042
CTGGGCGTGG AGAGCAAGGC TGGGG
(G/A)
TGCTCTGTGC GCCAATGGCG CGGTG
(2) HTR1A -1019C/G:rs6295
Figure imgf000020_0001
(3)HTR2A -1438A/G:rs6311
Figure imgf000020_0002
(4)HTR2A 102T/C:rs6313 (T/C)
Figure imgf000021_0001
(5) HTR3A 178C/T :rsl062613
CAGGCTGGCTC GTGGGCCTCG
(C/T)
CCTG
TGGGTCCAGC
(6) HTR3B - 100— - 102AAG ins/del
GTGTTT
(AAG/-)
GAGGAC CCATCT
[0054] 上記（1)〜（6)の各遺伝子多型の下に記載される配列は、多型部位を含むその前 後近傍の塩基配列であり、カツコ内の部位が多型部位に相当する。これらの塩基配 列はそれぞれ配列表の配列番号 11〜16にも記載されて 、るが、配列表では多型部 位の塩基はユニバーサルコードにより 1文字表記されている。なお、上記（6)の遺伝 子多型は欠損部分の有無による多型であり、配列番号 16には挿入型 (ins)の塩基配 列を記載した。また、上記（3)の遺伝子多型（HTR2A -1438A/G)は Reverse comple mented strandにしたときの番号なので、上記の配列では T/Cとなっている（配列番号 13も同様)。
[0055] セロトニン受容体 (HTR)の上記（1)〜（6)の各遺伝子多型と、抗うつ薬 SSRIに対 する治療反応性との具体的な相関について説明すれば、以下のとおりである。まず、
(1)の多型（HTR1A 272Gly/Asp :rsl800042)については、 Aspアレル保有者で早期 に改善率が高い傾向が認められた。また、（2)の多型（HTRlA -1019C/G :rs6295) については、 C/C群で改善率が高い傾向が、（3)の多型（HTR2A - 1438A/G:rs6311 )については、 G/G群で改善率が高い傾向力 それぞれ認められた。（4)の多型 (HT R2A 102T/C :rs6313)については、上記（3)の多型と完全にリンク (連鎖不平衡)して いたため、 C/C群で改善率が高い傾向が認められた。（5)の多型（HTR3A 178C/T: rsl062613)については、 C/C群で改善率が高い傾向が、（6)の多型（HTR3B - 100_ - 102AAG ins/del)については、 ins/ins群で改善率が高い傾向力 それぞれ認められ た。
[0056] また、抗うつ薬 SSRIのフルボキサミンおよびパロキセチンについて、薬剤別にロジ スティック解析を行った。まず、フルボキサミンの臨床効果と 3つの遺伝子多型 (前記 r si 1178997多型、 TaqlA多型および LPR多型）についてロジスティック解析をそれぞ れの因子で行ったところ、ォッズ比が 3.50 (rsl 1178997)、 4.58 (TaqlA)、 7.50 (LPR )であったのに対して、 3つの遺伝子多型を組み合わせて解析したところ、ォッズ比が 32.86とフルボキサミンに対する反応性の予測率がより一層向上した。同様に、パロキ セチンの臨床効果と 2つの遺伝子多型（前記 rslll78997多型および TCATリピート 多型）について、 2つの多型を組み合わせて解析したところ、ォッズ比が 15.5となり、こ の場合も反応性の予測率が向上した。このように、複数の遺伝子多型を組み合わせ て、抗うつ薬に対する反応性を予測する方法は好まし 、方法である。
[0057] 複数の遺伝子多型の検査結果を組み合わせて抗うつ薬の反応性予測を行う場合 は、予測方法があまり複雑にならないよう留意することが好ましい。たとえば国際出願 番号 PCTZJP2006Z312519の明細書に開示されるような判別分析による予測方 法、および決定木による予測方法は、複数の遺伝子多型の検査結果を組み合わせ て反応性予測を行う場合に好ま ヽ方法である。
[0058] 以上説明した各予測方法をプログラムを利用して行うことは好ましぐ本発明はこの ような抗うつ薬反応性予測支援プログラムを包含するものである。即ち、本発明の予 測支援プログラムは、（1)TPH2、 DRD2および THのいずれかに関連する 1又は 2 以上の遺伝子多型に基づいて、使用する抗うつ薬に対する患者の治療反応性を予 測する方法、（2)TPH2、 DRD2および THのいずれかに関連する 1又は 2以上の遺 伝子多型と、セロトニントランスポーター遺伝子の LPR多型とを組み合わせて、抗うつ 薬に対する反応性を予測する方法、（3)TPH2、 DRD2および THのいずれかに関 連する 1又は 2以上の遺伝子多型と、セロトニン受容体の遺伝子多型とを組み合わせ て、抗うつ薬に対する反応性を予測する方法、などをコンピュータに実行させ、これ により遺伝子多型の検査結果から被検者の抗うつ薬反応性予測をコンピュータに実 行させるものである。本発明のプログラムは、これを記録した、コンピュータで読み取り 可能な記録媒体として提供することができる。このような記録媒体としては、フレキシ ブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気記憶媒体、 CD-ROM, CD-R 、 CD-RW, DVD-ROM, DVD-RAM, DVD— RW等の光学記憶媒体、 RA Mや ROM等の電気記憶媒体、および MO等の磁気 Z光学記憶媒体を例示すること ができる力 これらに限定されるものではない。
[0059] [2]遺伝子多型の検査方法
本発明において、 TPH2、 DRD2、 THの遺伝子多型および他の遺伝子多型を調 ベる方法は特に制限されるものではなぐ遺伝子上の多型を直接的または間接的に 調べることが可能な従来公知の方法を適用することができ、今後開発される方法を使 用してもよい。今回の解析に用いた、 PCR法により遺伝子多型を検査する方法は簡 易な方法であり、精度も良好であるので、以下ではこの方法について簡単に説明す る。
[0060] 検査に供する DNA試料は、被検者の任意の器官'組織'細胞 (血液、羊水中の細 胞、採取した組織等を培養した細胞を含む)力ゝら常法に従って DNAを精製'抽出す ればよい。なお、 PCR法による遺伝子増幅が可能な限りにおいて、 DNAの精製 '抽 出工程は省略又は簡略ィ匕してもよい。
[0061] 次に、多型部位に基づく遺伝子型の同定 (遺伝子タイピング)のため、上記の方法 で調製した DNA試料中のゲノム DNAを铸型にして PCR法を行 、、多型部位を挟む 遺伝子領域を増幅する。その後、得られた増幅断片をもとに、 Primer extension法 (プ ライマー伸長法）、 PCR-RFLP法、または電気泳動により増幅断片の長さを調べる方 法などによって遺伝子型を決定する。
[0062] 上記 PCR法における各条件、使用する試薬 *プライマーなどは特に制限されるもの ではない。また、遺伝子多型の検査は、 PCR法以外の方法を使用してもよい。遺伝 子上の多型を直接的または間接的に検定可能な方法であれば、一塩基多型 (SNP )における塩基を検定する方法 (SNPタイピング)、欠損部分の有無による多型を検 定する方法、など従来公知の種々の方法を適用することができる（例えば、文献「ポ ストシークェンスのゲノム科学（1) SNP遺伝子多型の戦略」（中山書店)参照)。
[0063] 一例として、 DNAチップ等の遺伝子多型検査器具を用いた検査方法を挙げること ができる。この方法は、 TPH2、 DRD2および THの遺伝子多型を検定するためのプ ローブ、あるいは更に他の遺伝子多型を検定するためのプローブを基板上に配置し た DNAチップ (または同種の器具)を作製し、この DNAチップ等を用いて被検者か らの遺伝子試料とプローブとのハイブリダィゼーシヨンシグナルの有無により、遺伝子 のタイピングを行う方法である。プローブには、多型部位の塩基を含む近傍の塩基配 列（たとえば長さ 8〜30ヌクレオチド程度)またはその相補配列等力もなるオリゴヌタレ ォチドを用いることができる。尚、ここで、「DNAチップ」とは、主として、合成したオリ ゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型 DNAチップを意味する力 PCR産物など の cDNAをプローブに用いる貼り付け型 DNAマイクロアレイを使用してもよい。この ような TPH2、 DRD2および THの遺伝子多型検定用のプローブを含む DNAチップ は、抗うつ薬 SSRIの反応性予測チップとして利用することができる。
[0064] その他にも、遺伝子多型の検査方法として、 PCR-SSCP法、 Allele specific PCR法な どの点変異検出法を用いてもよいし、 PCR法以外の他の増幅方法 (例えば、 RCA法 など)を用いてもよい。また、 DNA増幅後に塩基配列決定装置 (シークェンサ一)な どで直接増幅断片の塩基配列を決定し、遺伝子のタイピングを行ってもょ 、。
[0065] 勿論、遺伝子多型の検査は、タンパク質をコードするコード配列以外に、イントロン 配列や制御配列などに存在する多型に基づいて行ってもよい。また、多型 (変異）が コード配列上の変異であれば、 RNA、または mRNAから調製した cDNAをもとに、 当該多型 (変異)を検出することも可能である。さらに、アミノ酸置換を伴う多型 (変異) であれば、タンパク質のアミノ酸配列などから当該多型 (変異）を検出してもよい。 [0066] 本発明の遺伝子多型検査用キットは、 TPH2、 DRD2および THの遺伝子多型を 直接的または間接的に検査するため、これらの遺伝子配列またはその近傍配列に基 づいて設計されたプライマーあるいはプローブなどを含むものであればよぐさらに、 (1)試料の調製に用いる酵素や試薬、（2)逆転写反応に用いる酵素や試薬、 (3) P CR法に用いる酵素や試薬、（4)塩基配列の決定に用いる酵素や試薬、などのうち 1 又は 2以上を含むものであってもよ!/、。
[0067] [3]本発明のスクリーニング方法
今回の解析により、 TPH2、 DRD2および THの各遺伝子多型と抗うつ薬反応性と の間に相関が認められた力 この結果は、これらの遺伝子多型に基づく TPH2、 DR D2および THの発現量 (または活性等)の個体差が、抗うつ薬の反応性に影響を及 ぼすことを示すものといえる。したがって、 TPH2、 DRD2または THを標的 (創薬タ ーゲット)とし、その発現量、活性、他の物質との結合などに影響を与える物質を探索 することによって、効率の良い抗うつ薬の開発、とりわけ SSRI等の抗うつ薬と併用し、 その薬効を向上させる薬剤の開発が期待できる。本発明は、このような TPH2、 DRD 2および THを標的とした抗うつ薬のスクリーニング方法を包含するものである。
[0068] 本発明のスクリーニング方法としては、遺伝子'タンパク質の発現量、タンパク質の 活性変化、分子間の結合等を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、 特に限定されるものではない。また、本発明以降に新たに開発されたスクリーニング 方法を使用するものであってもよい。 in vitro及び in vivoスクリーニング系のいずれで あってもよいし、 cell- free systemでスクリーニングを行ってもよい。また、スクリーニング に使用する遺伝子'タンパク質は、ヒト由来のもののほか、マウスその他の動物由来 のものを使用してもよい。勿論、タンパク質の立体構造に関する情報を利用してスクリ 一-ングを行ってもよい。
産業上の利用可能性
[0069] 本発明は、以上のように、 TPH2や DRD2、 THの遺伝子多型に基づいて被検者 の抗うつ薬に対する反応性を予測する方法に関するものであり、前述したとおり、抗ぅ つ薬とりわけ SSRIを用いたうつ病治療における検査、診断などに利用することができ る。

Claims

請求の範囲
[I] トリブトファンヒドロキシラーゼ -2 (TPH2)遺伝子、ドパミン D2受容体 (DRD2)遺伝 子、チロシンヒドロキシラーゼ (TH)遺伝子、またはゲノム上それらの近傍に存在する 1又は 2以上の多型を検査し、その結果に基づき、被検者の抗うつ薬に対する反応 性を予測する方法。
[2] トリブトファンヒドロキシラーゼ -2 (TPH2)遺伝子またはゲノム上その近傍に存在す る多型を検査し、その結果に基づき、被検者の抗うつ薬に対する反応性を予測する 方法。
[3] ドパミン D2受容体 (DRD2)遺伝子またはゲノム上その近傍に存在する多型を検査 し、その結果に基づき、被検者の抗うつ薬に対する反応性を予測する方法。
[4] チロシンヒドロキシラーゼ (TH)遺伝子またはゲノム上その近傍に存在する多型を 検査し、その結果に基づき、被検者の抗うつ薬に対する反応性を予測する方法。
[5] 抗うつ薬として使用される、選択的セロトニン再取り込み阻害薬 (SSRI)またはセロ トニン&ノルアドレナリン再取り込み阻害薬 (SNRI)に対する反応性を予測する、請 求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。
[6] 上記 TPH2遺伝子のプロモーター領域に存在する多型を検査することによって、被 検者の抗うつ薬に対する反応性を予測する、請求項 1又は 2記載の方法。
[7] 上記 DRD2遺伝子の TaqlA多型を検査することによって、被検者の抗うつ薬に対 する反応性を予測する、請求項 1又は 3記載の方法。
[8] 上記 TH遺伝子の TCATリピート多型を検査することによって、被検者の抗うつ薬 に対する反応性を予測する、請求項 1又は 4記載の方法。
[9] さらに、セロトニントランスポーター遺伝子、またはセロトニン受容体遺伝子、あるい はゲノム上それらの近傍に存在する多型を検査し、その結果を加味して、被検者の 抗うつ薬に対する反応性を予測する、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。
[10] セロトニントランスポーター遺伝子に関連する LPR多型を検査し、その結果を加味 して、被検者の抗うつ薬に対する反応性を予測する、請求項 9記載の方法。
[II] うつ病の改善を目的とした薬物治療において、抗うつ薬に対する患者の反応性予 測に使用する、請求項 1〜： LOのいずれか 1項に記載の方法。
[12] 請求項 1〜： LOのいずれか 1項に記載の検査結果をもとに、被検者の抗うつ薬反応 性予測をコンピュータに実行させる、抗うつ薬反応性予測支援プログラム。
[13] 請求項 1記載の方法にぉ 、て、遺伝子多型の検査は、被検者力 調製したゲノム
DNAを铸型にして、多型部位を挟む遺伝子領域を増幅する工程と、得られた増幅 断片をもとに遺伝子型を決定する工程とを含む方法。
[14] 請求項 1記載の方法において、 DNAチップ等の遺伝子多型検査器具を用いて遺 伝子多型を検査する方法。
[15] 請求項 14記載の方法に使用される、遺伝子多型検査用オリゴヌクレオチド。
[16] 請求項 1記載の方法に使用される、遺伝子多型検査用キット。
[17] トリブトファンヒドロキシラーゼ -2 (TPH2)、ドパミン D2受容体 (DRD2)遺伝子また はチロシンヒドロキシラーゼ (TH)遺伝子を標的とした抗うつ薬のスクリーニング方法
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