WO2007028380A1 - Funktioneller in vitro immunassay - Google Patents

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WO2007028380A1
WO2007028380A1 PCT/DE2006/001604 DE2006001604W WO2007028380A1 WO 2007028380 A1 WO2007028380 A1 WO 2007028380A1 DE 2006001604 W DE2006001604 W DE 2006001604W WO 2007028380 A1 WO2007028380 A1 WO 2007028380A1
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incubation
compounds
target cells
immune system
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Manuel Schmidt
Burghardt Wittig
Astrid Sander
Yiyou Chen
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Mologen Ag
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/56966—Animal cells
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the invention relates to a method for the in vitro investigation of the action of substances in in vivo processes as well as an in vitro detection method for the identification of immunomodulating compounds and / or the detection of the effect of immunomodulating compounds and the identification of apoptosis and / or necrosis inducing compounds by means of Immune system in in vivo processes.
  • Chemotherapy which has been the only treatment option for advanced and widespread cancer since the 1950s, has one goal in mind: to develop therapies that have fewer side effects for the patient but are highly effective in achieving the therapeutic goal.
  • immunotherapy which aims to enhance the natural immune response against the tumor disease by genetic engineering modifications, ie the "attention" of the immune system to cancer cells and thus to influence the defense reaction so that the tumor is controlled by the body itself.
  • immunomodulatory substances are under development, which should cause the immune system to fight tumor cells.
  • These immunomodulatory agents aim to induce or "program" the immune system to specifically attack and ultimately destroy tumor cells, thus immunomodulatory agents acting indirectly through the immune system on the tumor or underlying tumor cell type.
  • a method that allows in vitro to investigate the effect of new substances on in vivo processes, such as the destruction of tumor cells, would avoid on the one hand with great ethical reservations in vivo experiments and on the other hand allow, in a short time a variety of substances in a variety of different tumor cells to test.
  • it would be possible by such a method to represent the progress of a therapy regarding the induced in vivo effects in a so-called "therapy monitoring".
  • Effector cells of the mixture of immune cells e.g. PBMC [Peripheral monoclonal immune system of blood (human or higher mammalian) cells, spleen cells (animal models), etc.] or sub-populations sorted by FACS or MACS, e.g. B, T and NK cells, monocytes, dendritic cells, etc.
  • PBMC Peripheral monoclonal immune system of blood (human or higher mammalian) cells, spleen cells (animal models), etc.
  • FACS or MACS e.g. B, T and NK cells, monocytes, dendritic cells, etc.
  • immunomodulatory compounds are to be understood as meaning substances which are capable of influencing the reaction of the immune system or even of only individual cells thereof, in particular of the effector cells. These include not only chemical compounds but also DNA Constructs, proteins, antibodies, sugar molecules or other substances that have properties that cause the immune system or cells of the immune system to react. This relates in particular to the cells of the immune system designated as effector cells in the present invention, which are capable of effecting or transmitting reactions of the immune system. This transfer takes place by means of the distribution of specific messengers.
  • an in vitro detection method for the identification of immunomodulating compounds and / or the detection of the effect of immunomodulating compounds as well as the identification of apoptosis and / or necrosis inducing compounds by the immune system in in vivo processes comprising the following sequence of Process steps comprise a) primary incubation of effector cells of the immune system with an immunomodulatory effect or apoptosis or necrosis inducing substance, followed by b) recovery of the supernatant or mixture of cells and supernatant of the primary incubation followed by c) secondary incubation of target cells with the supernatant or mixture of cells and supernatant of the primary incubation, and finally d) the immunomodulating and / or apoptosis and / or necrosis-inducing effect is analyzed by means of suitable detection methods.
  • the effect of already performed / performed therapy can be tracked (by analyzing relevant parameters).
  • this use of the method according to the invention is also referred to as "therapy monitoring.” This merely refers to the in vitro tracking of the in vivo therapy effects
  • the methods according to the invention are not associated with the therapy itself, except that the therapeutic success is controlled or can be tracked.
  • the isolated cells are in a preferred embodiment of the method according to the invention to effector cells of the immune system according to the definition given above.
  • the methods of the invention are particularly useful to study effects of substances on cells mediated by the immune system.
  • target cells human cells or cells of higher mammals are preferably provided.
  • isolated cells are used for the primary incubation, in particular cells of the immune system, and as target cells for the secondary incubation.
  • target cells for the secondary incubation.
  • tumor cells of different origin can be considered tumor cells.
  • the aim of a "functional in vitro immunoassay" is to identify or investigate substances which are suitable for inducing apoptosis or necrosis by means of the immune system in tumor cells.
  • a further aim of the method according to the invention is also the detection of tumor cells by the immune system, caused by the increased expression of MHC-I (eg HLA-ABC) and adhesion (eg ICAM-1) molecules on the surface of the tumor cells, to investigate.
  • MHC-I eg HLA-ABC
  • adhesion eg ICAM-1
  • kits according to the invention For the application of the method according to the invention for the investigation of changes of the expression of surface molecules due to an immune reaction induced by the immunomodulating substance a kit according to the invention is provided.
  • the kit contains storage-ready aliquots of cells, preferably immune system effector cells, for primary incubation with the substances to be tested, means for performing primary and secondary incubation, and suitable means for analyzing the expression pattern of the surface molecules of the cells of the secondary incubation.
  • the kit according to the invention contains means for carrying out an RT-PCR for analyzing the expression pattern of surface antigens of the target cells of the secondary incubation, for which the kit contains suitable primers for amplification of the mRNA of surface molecules, enzymes for the duplication and the required buffers and / or means for a FACS Analysis for which the kit contains suitable fluorescently labeled antibodies directed against surface antigens and apoptosis / necrosis markers, and also means for processing the target cells, such as buffers and chemicals.
  • the methods according to the invention are also suitable for monitoring therapy, in which, in the primary incubation, whole blood, blood cells, blood serum or the blood plasma of a patient before, during and / or after a treatment (eg immunotherapy or therapy containing the Immune system changed or influenced) is used.
  • a treatment eg immunotherapy or therapy containing the Immune system changed or influenced
  • the treatments in which the methods according to the invention are intended as therapy monitoring for the effectiveness of the therapeutics used in each case are preferably diseases such as cancer, infections, allergies and autoimmune diseases.
  • CpG motif-containing oligodeoxynucleotides and dSLIM double stem-loop immunomodulating oligodeoxyribonucleotides, see EP 1 196 178 BI
  • dSLIM double stem-loop immunomodulating oligodeoxyribonucleotides
  • biomolecules such as natural or genetically engineered antibodies, DNA or RNA-based substances (antisense oligodeoxynucleotides, si-RNA, etc.), amino acid compounds, messengers or other immune modulators (such as aluminum salts, Imidazoquinolines, lipopolysaccharides, saponin derivatives, phospholipids, squalene, etc.).
  • compounds which induce apoptosis and / or necrosis are, in particular, those compounds which are suitable for sustainably disrupting the processes necessary for obtaining the cell.
  • DNA- or RNA-based substances antisense oligodeoxynucleotides, si-RNA, etc.
  • antibodies or chemotherapeutic agents come into consideration.
  • the methods of the invention may be further used to identify messengers that are secreted by the cells as a result of incubation of the isolated cells in the primary incubation with immunomodulatory or apoptosis and / or necrosis inducing substances.
  • the supernatant of the primary incubation is preincubated with antibodies which specifically recognize potential messengers prior to addition to the target cells of the secondary incubation. Due to the interaction between the antibody and the epitope of the messenger, it is no longer able to mediate signals to the target cells and is thus blocked in its function.
  • This embodiment of the method according to the invention is important for detecting which specific messengers are responsible for an induced effect, e.g. Apoptosis, are responsible.
  • perforated plates having 24-96 holes are preferably used, the area of each hole of a plate being coated with an antibody which is resistant to an epitope of a messenger (eg IFN).
  • a messenger eg IFN
  • kits for applying the methods of the invention for identifying messenger substances which are released as a reaction of incubation of the cells of the primary incubation with a substance to be examined also subject of the present invention.
  • a kit contains storable prepared aliquots of cells, preferably effector cells of the immune system, for the primary incubation with the substances to be examined, means for performing primary and Sekund sourcetububation, and further multi-well plates with a number of holes between 24 - 96 holes in which the surfaces of the Holes are coated with an antibody, wherein the surfaces of different holes are coated with different antibodies, but preferably at least two holes are each provided with an identical antibody.
  • the incubation steps necessary in the method according to the invention preferably take place in an incubator with 5% CO 2 content.
  • other incubation conditions are also conceivable, each of which depends on the requirements of the cells to be incubated.
  • the recovery of the supernatants or the mixture of supernatant and cells from the primary incubation is carried out according to the invention by centrifugation.
  • all other methods are also conceivable which are suitable for separating the cells from the supernatants, for example filtration of the cells at a mesh width which allows passage only to the supernatant, but not to the cells or existing cell debris.
  • cell separations or sortings by means of specific antibodies and subsequent magnetic (MACS) or fluorescence-based (FACS) selection are provided.
  • FACS measurements Fluorescent Activated Cell Sorting
  • Western blots gel filtrations or cytospins are possible.
  • RNAse protection assays for example, RNAse protection assays and Northern and Southern blots.
  • apoptosis assays are provided, such as the staining of the cells with annexin V or the so-called tunel assay or cell cycle analyzes, for example by Propidiumjodid-dyeings.
  • peripheral blood mononuclear cells were obtained from whole blood or so-called "buffy coat.” This is a by-product which is produced from whole blood during the production of erythrocyte concentrates.
  • Ficoll is an uncharged sucrose polymer whose density is adjusted so that when layered with whole blood or buffy coat followed by centrifugation, the lower density portions pass through the ficoll layer and collect at the bottom, while lymphocytes and monocytes intercalate in the interphase Collect plasma (top) and ficoll (bottom).
  • the interphase containing the cells after centrifugation was isolated and washed several times with PBS. Subsequently, the isolated cells in cell culture absorbed and adjusted to a concentration of 1 - 4 x 10 6 cells per milliliter.
  • Double-stranded immunomodulatory oligodeoxynucleotides dSLIM
  • Double-stranded immunomodulatory oligodeoxynucleotides are molecules with CpG sequences.
  • linear oligodeoxynucleotides ODN
  • ODN linear oligodeoxynucleotides
  • dumbbell-shaped molecules dumbbell-shaped molecules, called the dSLIM, "double stem-loop immunomodulator.”
  • the immunomodulatory effect is based on non-specific activation of the immune system by the unmethylated CpG sequences that bind to Toll-like receptors, and especially the special Structure of the dSLIM molecules
  • Each loop of the dSLIM contains three unmethylated CpG motifs.
  • Double stranded immunomodulators dSLIM of the ISS30 type (e.g., dSLIM-30L1) were prepared after SOP and final quality control in the class B laboratory.
  • dSLIM-30L1 Double stranded immunomodulators dSLIM of the ISS30 type (e.g., dSLIM-30L1) were prepared after SOP and final quality control in the class B laboratory.
  • ODN Oligode- soxyribonukleotide
  • T4 DNA ligase T4 DNA ligase.
  • the resulting dSLIM molecules were concentrated by ethanol and sodium magnesium acetate precipitation and dissolved in PBS. The exact method is shown in WO 01/07055.
  • the isolated cells were seeded in multi-well-plates.
  • the size of the batches and, accordingly, the size of the wells was chosen so that the culture supernatant harvested later had exactly the volume needed for the secondary incubation with the target cells.
  • Target cells e.g., HT-29
  • the optimum concentration and the volume had to be determined beforehand in which they were sown.
  • the aim was that after the secondary incubation at least 5 x 10 5 target cells per well are present for the analysis. Care was taken to ensure that the cells had optimal growth conditions for 3 days, were as dense as necessary and seeded as thinly as possible, so that after 3 days they are almost confluent. Non-optimal growth conditions also lead to necrosis or apoptosis, which would lead to a falsification of the test result.
  • HT-29 co-ion carcinoma cells were used as target cells.
  • the cells were seeded in the previously determined optimal density in correspondingly large batches and incubated overnight at 37 degrees Celsius in a CO 2 incubator (eg 2.4 ⁇ 10 5 cells in 700 ⁇ l per well in 24 well-plate).
  • the approaches - direct stimulation and indirect stimulation - were again incubated for 48 hours at 37 degrees Celsius in the CO 2 incubator. Subsequently, the respective desired analysis could be carried out with the cells.
  • the supernatants were removed from the cells and the cells were washed with PBS. The cells were removed from the wells by means of trypsin / EDTA and, after a further washing step, transferred to a centrifugation tube, in order subsequently to determine the cell number. Staining of surface antigens
  • the cells from the stimulation batches were centrifuged off and washed with a special staining buffer. Subsequently, the cell suspension was adjusted to a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells per milliliter. 500 ⁇ i (0.5 ⁇ 10 6 cells) of this cell suspension was centrifuged off in a FACS tube and, after uptake in 50 ⁇ l of staining buffer, the antibodies (eg ICAM-1 (CD54) conjugated with FITC and HLA-ABC conjugated with PE) were added. For each antibody, an appropriate isotype control was included as well as a single stained positive sample for device adjustment and compensation. After an incubation step, the cells were washed twice with PBS and resuspended for measurement in 500-1000 ⁇ l of PBS. For the discrimination of dead cells, 7-AAD was added and incubated for a further 10 minutes. Subsequently, the FACS measurement was carried out.
  • the antibodies eg ICAM-1 (CD54) conjugated with FITC and HLA
  • Apoptotic cells were stained with annexin V-PE, which detects apoptotic processes in the cell. To distinguish from necrotic cells, a counterstaining with 7-AAD was performed.
  • the cells from the stimulation batches were centrifuged off and washed twice with PBS. Subsequently, the cells were diluted in a special annexin binding buffer and a cell concentration of 1 ⁇ 10 6 cells per milliliter was set. Per 100 .mu.l (1 ⁇ 10 5 cells) of this cell suspension were mixed with 5 .mu.l of annexin V-PE and 7-AAD and incubated after good mixing for 15 min at room temperature. Subsequently, 400 .mu.l binding buffer were added and the measurement was carried out immediately in the FACS.
  • Fluorescence 2 (annexin V-PE) and fluorescence 3 (7-AAD) were measured.
  • the device setting was done with unstimulated cells (direct approaches) or untreated cells (indirect approaches).
  • the cell population was set to be in the middle. Subsequently, the PMT settings and compensation for fluorescence 2 and 3 were performed. Thereafter, all samples were measured (5000 cells).
  • the device setting was carried out with lin-30L1 stimulated cells with appropriate isotype controls (in double staining) for the adjustment of non-specific binding and with the fluorescence-labeled antibodies (in single stains).
  • the cell population was set to be in the middle. Subsequently, PMT settings were performed for fluorescence 1, 2 and 3 with the isotype controls, as well as the compensation with single staining. Thereafter, all samples were measured (10000 cells). The dead cells (7 AAD-positive cells) were excluded (fluorescence 3 versus FSC in the dot blot).
  • a dot blot 7-AAD versus annexin V is formed. Then quadrants are set based on untreated cells. Depending on their position in the respective quadrant, the cells belong to the apoptotic or necrotic fraction.
  • Living cells are annexin negative and 7AAD negative
  • Apoptotic cells are annexin-positive and 7AAD-negative
  • Necrotic cells are annexin-positive and 7AAD-positive
  • FIG. 1 Schematic representation of the method according to the invention
  • Fig. 6 Analysis of the mechanism of action of dSLIM by detecting apoptosis and necrosis in HT-29 tumor cells using the method of the invention.
  • Fig. 7 Analysis of the mechanism of action of dSLIM by detecting the expression of HLA-ABC surface markers in HT-29 tumor cells using the method of the invention.
  • Fig. 12 In vitro tracking of viable tumor cells during therapy of a cancer patient
  • FIG. 13 In vitro tracking of apoptotic / necrotic tumor cells during the therapy of a cancer patient
  • Figure 14 In vitro follow-up of surface markers of tumor cells during therapy of a cancer patient
  • FIG. 1 shows a schematic representation of the sequence of the method steps in the method according to the invention.
  • FIG. 2 shows the results of an analysis of the in vitro action of dSLIM immunomodulator using the method according to the invention.
  • Use of the supernatant from dSLIM-incubated PBMCs induces apoptosis and necrosis in HT-29 tumor cells (colon carcinoma), as in the right part of the figure You can see.
  • HT-29 tumor cells colon carcinoma
  • FIG. 4 shows that dSLIM induces apoptosis (annexin V) and necrosis (7-AAD).
  • apoptosis annexin V
  • necrosis 7-AAD
  • FIG. 5 shows the enhanced induction of the HLA-ABC surface markers by the incubation of the target cells (HT-29) with the dSLIM supernatant of the PBMC.
  • Figure 6 shows the results of an analysis of the mechanism of action of dSLIM in HT-29 cells using the method of the invention and the detection of apoptosis and necrosis.
  • an antibody anti-IFN- ⁇ , green frame
  • experiments were performed with antibodies (anti-IFN- ⁇ , anti-TNF ⁇ ) to prove the specificity. It is easy to see (green frame) that the number of apoptotic as well as necrotic cells is minimized by the anti-IFN- ⁇ antibody.
  • FIG. 7 the application of the method according to the invention corresponds to that of FIG. 6, but the expression of the surface marker ICAM-1 (CD54) was analyzed in the target cells (HT-29). In the lower part of the figure is shown comparatively the shift of the cell population.
  • Figures 8 and 9 show results of experiments using the method of the invention in Renca tumor cells, comparing the effect of dSLIM with linear ODNs.
  • the linear CpG-containing oligodeoxynucleotides also have a different sequence than the dSLIM and are protected against degradation by means of phosphorothioate.
  • Figure 8 shows that treatment of the target cells with dSLIM results in enhanced expression of the surface marker HLA-ABC (upper part), whereas a linear CpG ODN has no effect.
  • the table in the right part of the figure compares the numerical differences.
  • dSLIM is significantly more potent than linear CpG ODN.
  • the lower part shows the difference in induction of apoptosis in percent.
  • Figures 10 and 11 respectively compare dSLIM with linear CpG ODN using the method of the invention in HT-29 cells as target cells.
  • the results of this experiment correspond to the results obtained with the Renca tumor cells and are shown in FIGS. 8 and 9.
  • the structure of the figures is also according to the figures 8 and 9.
  • Figures 12, 13 and 14 illustrate the use of the inventive method for in vitro tracking of the number of viable tumor cells ( Figure 12) and apoptotic / necrotic cells (Figure 13) as well as the change in expression of the surface markers ICAM-1 / HLA-ABC ( Figure 14) in the course of therapy of a cancer patient.
  • the plasma was isolated and incubated with cells of the tumor cell line HT-29. Subsequently, the number of viable (FIG. 12) and apoptotic / necrotic cells was determined and the expression of the surface markers ICAM-1 / HLA-ABC was investigated.
  • Figure 12 shows the results of incubation of HT-29 cells with plasma from eight blood samples. There is a clear decrease in viable HT-29 cells as early as the second day of administration of dSLIM. The number of viable cells decreases on the second day to less than half of the cells of the first day, which is comparable to the number of viable cells of the controls.
  • FIG. 13 shows the tracking of apoptotic / necrotic tumor cells during the treatment of the cancer patient on days 1, 2, 5 and 20. It can be seen in this evaluation of the tracking of the in vivo effects that the number of apoptotic / necrotic cells increases significantly already one day after the administration of dSLIM.
  • Figure 14 illustrates results of the studies on changing the expression of the surface markers ICAM-1 / HLA-ABC during the therapy of the cancer patient with reference to the plasma of the blood of samples 1, 2, 3 and 8.
  • sample 1 is used as a reference value to show changes the expression of the two surface markers used.
  • ICAM-1 is significantly more expressed on the second day of therapy, as shown in the lower part of the figure by the shift in the position of the fluorescence intensity, which shows that ICAM-1 is more strongly expressed.
  • target tissue e.g. tumor
  • test substance e.g. dSLIM
  • immune cells e.g. PBMC
  • test substance e.g. dSLIM
  • target cells e.g. tumor cells

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Untersuchung der Wirkung von Substanzen in in vivo Prozessen sowie ein in vitro Nachweisverfahren, für die Identifikation immunmodulierender Verbindungen und/oder den Nachweis der Wirkung von immunmodulierenden Verbindungen sowie die Identifikation Apoptose und/oder Nekrose induzierender Verbindungen mittels des Immunsystems in in vivo Prozessen. Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich insbesondere dazu, Wirkungen von Substanzen auf Zellen zu untersuchen, die durch das Immunsystem vermittelt werden. Nachdem Zellen des Immunsystems mit den Substanzen in der primären Inkubation auf diese ihre Wirkung entfalten konnten, werden dann in der sekundären Inkubation die in vivo Effekte der Substanz dadurch nachgewiesen, dass die Überstände oder das Gemisch aus Zellen und Überstand der primären Inkubation, welche unter anderem die ausgeschiedenen Produkte der Zellen des Immunsystems enthalten, mit Zielzellen inkubiert werden. Weiterhin ist das erfindungsgemäße Verfahren zur in vitro Nachverfolgung der in vivo Effekte vor, während und/oder nach der Gabe von immunmodulierenden Verbindungen sowie Apoptose und/oder Nekrose induzierender Verbindungen, geeignet.

Description

Funktioneller in vitro Immunassay
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Untersuchung der Wirkung von Substanzen in in vivo Prozessen sowie ein in vitro Nachweisverfahren, für die Identifikation immunmodulierender Verbindungen und/oder den Nachweis der Wirkung von immunmodulierenden Verbindungen sowie die Identifikation Apoptose und/oder Nekrose induzierender Verbindungen mittels des Immunsystems in in vivo Prozessen.
In der pharmazeutischen Industrie wurden in den letzten Jahren vollkommen neuartige Substanzklassen entwickelt, die zur Therapie verschiedenster Erkrankungen vorgesehen sind. Darunter sind unter anderem auch Mittel aus der Gentherapie oder gentherapeutisch modifizierte körpereigene Stoffe wie beispielsweise Proteine oder DNA-Konstrukte.
Da mit diesen vollkommen neuartigen Substanzklassen zum Teil noch keine Erfahrungen in der pharmazeutischen Therapierung von Erkrankungen vorliegen, besteht ein Bedarf an Verfahren zum Testen der Wirksamkeit dieser Mittel, ohne gleich auf Tierexperimente und/oder klinische Studien mit Patienten zurückgreifen zu müssen. Schon aus ethischen Gründen verbieten sich derartige Versuche mit neuen, unbekannten Substanzen. Vielmehr ist es angezeigt vorbereitend auf diesen Schritt durch in vitro Untersuchungen Ergebnisse zu erhalten, die Aussagen hinsichtlich der in vivo Wirksamkeit der Substanzen erlauben. Dabei ist es essentiell, bei den in vitro Versuchen der in vivo Situation möglicht nahe zu kommen. Zusätzlich ist es wichtig, einfache Methoden zur Verlaufsuntersuchung („Monitoring") von Patienten vor, während und/oder nach einer Behandlungsmethode (z.B. Immuntherapie oder Therapie, die das Immunsystem beeinflusst) zu entwickeln, wobei die Reaktion des Organismus bzw. des Immunsystems auf die entsprechende Behandlungsmethode untersucht wird.
Neben den konventionellen Behandlungsmethoden von Krebserkrankungen, wie der Strahlen - u. Chemotherapie, die seit den 1950er Jahren die einzige Behandlungsoption für fortgeschrittene und weitgestreute Tumorerkrankungen darstellt, ist es in zwischen ein Ziel, Therapien zu entwickeln, welche für den Patienten mit weniger Nebenwirkungen verbunden sind, dabei aber hoch effektiv hinsichtlich der Erzielung des Therapiezieles sind.
Ein Ansatz dazu ist die Immuntherapie, welche darauf abzielt, die natürliche Immunantwort gegen die Tumorerkrankung durch gentechnologische Modifikationen zu verstärken, also die „Aufmerksamkeit" des Immunsystems gegenüber Krebszellen und damit die Abwehrreaktion so zu beeinflussen, dass der Tumor vom Körper selbst bekämpft wird.
Die meisten klinischen Studien setzen derzeit auf die Entfernung des Tumors, einer anschließenden ex-vivo Transfektion der Tumorzellen mit einem therapeutischen Gen, Bestrahlung der Tumorzell-Population und nachfolgender Reimplantation der nunmehr modifizierten Tumorzellen. Durch diese Tumorzellvakzinierung läßt sich die Antitumorantwort in Abhängigkeit vom transfizierten therapeutischen Gen in unterschiedlichem Ausmaße steigern.
Neben der Transfektion von Tumorzellen sind aber auch immunmodulierende Stoffe in der Entwicklung, die das Immunsystem zur Bekämpfung von Tumorzellen veranlassen sollen. Durch diese immunmodulierenden Stoffe soll das Immunsystem dazu veranlasst werden bzw. „programmiert" werden, dass Tumorzellen spezifisch angegriffen und letztlich vernichtet werden. Immunmodulierende Stoffe wirken demnach bei der Krebstherapie indirekt über das Immunsystem auf den jeweiligen Tumor oder die zugrunde liegende Tumorzellart. Eine Methode, die es erlaubt, in vitro die Wirkung von neuen Substanzen auf in vivo Prozesse, beispielsweise die Zerstörung von Tumorzellen zu untersuchen, würde einerseits unter großen ethischen Vorbehalten stehende in vivo Versuche vermeiden und es andererseits ermöglichen, in kurzer Zeit eine Vielzahl von Substanzen bei einer Vielzahl von verschiedenen Tumorzellen auszutesten. Weiterhin wäre es durch eine derartige Methode möglich, den Fortgang einer Therapie hinsichtlich der induzierten in vivo Effekte in einem so genannten „Therapie-Monitoring" darzustellen.
Ausgehend von diesem Stand der Technik, ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches es erlaubt in vitro die Wirksamkeit von Substanzen auf in vivo Prozesse bei Menschen oder höheren Säugetieren zu untersuchen.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Merkmale der selbstständigen Ansprüche.
Im Sinne der Erfindung bedeuten:
Effektorzellen des Gemisch von Immunzellen, wie z.B. PBMC [peripherer mono- Immunsystems nuklearer Zellen aus Blut (von Mensch oder höheren Säugetieren), Milzzellen (Tiermodelle), etc.] oder über FACS oder MACS sortierte Subpopulationen, wie z.B. B-, T- und NK-Zellen, Monozyten, Dendritische Zellen, etc.
CpG-Motiv Unmethyliertes Cytosin-Guanin-Motiv dSLIM double Stem-Loop |mmunomodulating Oligodeoxyribonucleo- tides, wobei jeder Loop CpG-Motive aufweist, vorzugsweise drei
ODN Oligodesoxyribonukleotid
PBMC Primäre mononukleare Blutzellen
Nachfolgend sollen eine Reihe allgemeiner Begriffe wie folgt verstanden werden:
Unter immunmodulierenden Verbindungen sollen im Sinne der vorliegenden Erfindung Substanzen verstanden werden, die in der Lage sind die Reaktion des Immunsystems oder auch nur einzelner Zellen davon, insbesondere der Efffektorzel- len, zu beeinflussen. Darunter fallen neben chemischen Verbindungen auch DNA- Konstrukte, Proteine, Antikörper, Zuckermoleküle oder sonstige Stoffe, die Eigenschaften aufweisen, welche dazu führen, dass das Immunsystem oder Zellen des Immunsystems zu einer Reaktion veranlasst werden. Dies betrifft insbesondere die in der vorliegenden Erfindung als Effektorzellen bezeichneten Zellen des Immunsystems, welche in der Lage sind Reaktionen des Immunsystems zu bewirken oder zu übertragen. Diese Übertragung findet mittels der Ausschüttung spezifischer Botenstoffe statt.
Erfindungsgemäß ist demnach ein Verfahren vorgesehen, welches die folgenden Verfahrensschritte umfasst:
a) Isolation von Zellen b) Primäre Inkubation der Zellen mit der zu untersuchenden Substanz c) Gewinnung des Überstandes oder des Gemischs aus Zellen und Überstand der primären Inkubation d) Sekundäre Inkubation von Zielzellen mit dem Überstand oder dem Gemisch aus Zellen und Überstand e) Analyse der Zielzellen
In einer alternativen Ausführungsform ist ein In vitro Nachweisverfahren, welches für die Identifikation immunmodulierender Verbindungen und/oder den Nachweis der Wirkung von immunmodulierenden Verbindungen sowie die Identifikation Apoptose und/oder Nekrose induzierender Verbindungen mittels des Immunsystems in in vivo Prozessen vorgesehen, welches die folgende Abfolge von Verfahrensschritte umfasst a) Primäre Inkubation von Effektorzellen des Immunsystems mit einer auf immunmodulierende Wirkung zu untersuchenden oder Apoptose oder Nekrose induzierenden Substanz, gefolgt von der b) Gewinnung des Überstandes oder des Gemischs aus Zellen und Ü- berstand der primären Inkubation und anschließender c) Sekundärer Inkubation von Zielzellen mit dem Überstand oder dem Gemisch aus Zellen und Überstand der primären Inkubation, und abschließend d) die immunmodulierende und/oder Apoptose und/oder Nekrose induzierende Wirkung mittels geeigneter Nachweisverfahren analysiert wird.
Mittels der Verfahrensschritte der angegebenen Verfahren wird es ermöglicht in vitro die Wirkung von Substanzen in in vivo Prozessen zu untersuchen. Dadurch können unter Bedingungen, die der in vivo Situation sehr nahe kommen, neuartige Verbindungen ausgetestet werden, ohne dass es zu einer Gefährdung von Tieren und/oder Patienten in klinischen Studien kommt.
Außerdem kann die Auswirkung einer bereits vorgenommenen/durchgeführten Therapie verfolgt werden (durch die Analyse relevanter Parameter). Diese Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren wird im Sinne dieser Erfindung auch als „Therapie-Monitoring" bezeichnet. Damit wird lediglich die in vitro Nachverfolgung der in vivo Therapieeffekte bezeichnet. Die erfindungsgemäßen Verfahren stehen nicht mit der Therapie selber in Zusammenhang, außer das der Therapieerfolg kontrolliert oder nachverfolgt werden kann.
Bei den isolierten Zellen handelt es sich in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens um Effektorzellen des Immunsystems gemäß der oben angegebenen Definition. Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich insbesondere dazu, Wirkungen von Substanzen auf Zellen zu untersuchen, die durch das Immunsystem vermittelt werden.
Nachdem Zellen des Immunsystems mit den Substanzen in der primären Inkubation auf diese ihre Wirkung entfalten konnten, werden dann in der sekundären Inkubation die in vivo Effekte der Substanz dadurch nachgewiesen, dass die Überstände oder das Gemisch aus Zellen und Überstand der primären Inkubation, welche unter anderem die ausgeschiedenen Produkte der Zellen des Immunsystems enthalten, mit Zielzellen inkubiert werden.
Als Zielzellen sind bevorzugt menschliche Zellen oder Zellen von höheren Säugetieren vorgesehen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren werden isolierte Zellen für die primäre Inkubation verwendet, insbesondere Zellen des Immunsystems, und als Zielzellen für die sekundäre Inku- bation Tumorzellen oder Zelllinien, die von Tumorzellen abstammen. Bei dieser Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verfahren werden diese dann als „Funktioneller in vitro Immunassay" bezeichnet.
Als Tumorzellen kommen grundsätzlich jegliche Arten von Tumorzellen unterschiedlichen Ursprungs in Betracht. Ziel eines „funktionellen in vitro Immunassays" ist es Substanzen zu identifizieren oder zu untersuchen, welche geeignet sind mittels des Immunsystems bei Tumorzellen Apoptose oder Nekrose einzuleiten.
Ein weiteres Ziel der erfindungsgemäßen Verfahren ist es aber auch, die Erkennung von Tumorzellen durch das Immunsystem, hervorgerufen durch die verstärkte Expression von MHC-I (z.B. HLA-ABC) und Adhäsions- (z.B. ICAM-1) Molekülen auf der Oberfläche der Tumorzellen, zu untersuchen. Ein entscheidender Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahren liegt darin, dass der in vivo Effekt nachgewiesen werden kann, ohne dass es notwendig ist, Versuche in Tieren und/oder Patienten in klinischen Studien mit all den damit verbundenen Nachteilen durchführen zu müssen.
Zur Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren für die Untersuchung von Änderungen der Expression von Oberflächenmolekülen aufgrund einer durch die immunmodulierenden Substanz induzierten Immunreaktion ist erfindungsgemäß ein Kit vorgesehen. Der Kit enthält lagerungsfähig aufbereitet Aliquots von Zellen, bevorzugt Effektorzellen des Immunsystems, für die Primärinkubation mit den zu untersuchenden Substanzen, Mittel zur Durchführung von Primär- und Sekundärinkubation sowie geeignete Mittel zur Analyse des Expressionsmusters der Oberflächenmoleküle der Zellen der Sekundärinkubation. Der erfindungsgemäße Kit enthält zur Analyse des Expressionsmuster von Oberflächenantigenen der Zielzellen der Sekundärinkubation Mittel zur Durchführung einer RT-PCR, wozu der Kit geeignete Primer zur Vervielfältigung der mRNA von Oberflächenmolekülen, Enzyme für die Vervielfältigung und die benötigten Puffer enthält und/oder Mittel für eine FACS- Analyse, wozu der Kit geeignete fluoreszenzmarkierte Antikörper, die gegen Ober- flächenantigene und Apoptose/Nekrose-Marker gerichtet sind enthält sowie weiterhin Mittel zur Aufarbeitung der Zielzellen, wie Puffer und Chemikalien. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind in einer Weiterbildung auch zum Therapie-Monitoring geeignet, wobei als zu untersuchende Substanz in der primären Inkubation Vollblut, Blutzellen, Blutserum oder das Blutplasma eines Patienten vor, während und/oder nach einer Behandlung (z.B. Immuntherapie oder Therapie, die das Immunsystem verändert bzw. beeinflusst) verwendet wird.
Mittels dieser Weiterbildung der erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich zu überprüfen, ob Therapeutika, die dem Patienten verabreicht wurden und vorzugsweise stimulierend auf das Immunsystem wirken, bereits eine in vivo Wirkung erzielt haben. Obwohl in dem Verfahren das Blut des Patienten mit den darin enthaltenen Zellen und/oder Botenstoffen oder Teilen davon (z.B. Serum bzw. Plasma oder ZeII- subpopulationen) untersucht wird, dient ein erfindungsgemäßes Verfahren in dieser Ausgestaltung letztlich einem indirekten Nachweis der in vivo Wirkung der Substanz, die dem Patienten in der Therapie, vorzugsweise einer Immuntherapie, verabreicht wurde.
Sofern keine spezifischen Antikörper bekannt sind, die in den erfindungsgemäßen Verfahren zum „Therapie-Monitorimg" verwendet werden können, ist es möglich eine in vivo Wirkung infolge verabreichter Therapeutika über Änderungen des Zyto- kinspiegels im Blut (Plasma/Serum) zu verfolgen, oder Änderungen in der Produktion spezifischer Antikörper infolge einer Reaktion des Immunsystems zu verfolgen.
Bei den Behandlungen, bei denen die erfindungsgemäße Verfahren als Therapie- Monitoring für die Wirksamkeit der jeweils verwendeten Therapeutika vorgesehen sind, handelt es sich vorzugsweise um Erkrankungen wie Krebs, Infektionen, Allergien und Autoimmunerkrankungen.
Aufgrund der genannten Vorteile sind daher für die erfindungsgemäßen Verfahren auch bevorzugt Verbindungen vorgesehen, welche eine immunmodulierende Wirkung haben oder in der Lage sind Apoptose oder Nekrose zu erzeugen.
Als immunmodulierende Verbindungen sind erfindungsgemäß bevorzugt CpG-Motiv enthaltende Oligodesoxynukleotide und dSLIM (double Stem-Loop immunomodula- ting Oligodeoxyribonucleotides, siehe EP 1 196 178 BI) vorgesehen. Es liegt aber auch im Bereich der Erfindung andere Biomoleküle zu verwenden, wie beispielsweise natürliche oder gentechnisch veränderte Antikörper, DNA- bzw. RNA-basierte Substanzen (Antisense-Oligdesoxynukleotide, si-RNA, etc.), Aminosäureverbindungen, Botenstoffe oder andere Immunmodulatoren (wie z.B. Aluminiumsalze, Imida- zaquinoline, Lipopolysaccharide, Saponin-Derivate, Phospholipide, Squalene, etc.).
Als Apoptose und/oder Nekrose induzierende Verbindungen kommen erfindungsgemäß insbesondere solche Verbindungen in Betracht, welche geeignet sind die zum Erhalt der Zelle notwendigen Prozesse nachhaltig zu stören. Dabei kommen insbesondere DNA- bzw. RNA-basierte Substanzen (Antisense- Oligdesoxynukleotide, si-RNA, etc.), Antikörper oder Chemotherapeutika in Betracht.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können weiterhin dazu verwendet werden, um Botenstoffe zu identifizieren, die in Folge der Inkubation der isolierten Zellen in der Primärinkubation mit immunmodulierenden oder Apoptose und/oder Nekrose induzierenden Substanzen von den Zellen ausgeschüttet werden. Dazu wird der Überstand der Primärinkubation vor der Zugabe zu den Zielzellen der Sekundärinkubation mit Antikörpern vorinkubiert, welche spezifisch potentielle Botenstoffe erkennen. Durch die Interaktion zwischen dem Antikörper und Epitop des Botenstoffes ist dieser nicht mehr in der Lage Signale an die Zielzellen zu vermitteln und wird so in seiner Funktion blockiert Diese Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahren ist wichtig, um nachzuweisen, welche konkreten Botenstoffe für eine induzierte Wirkung, z.B. Apoptose, verantwortlich sind.
Im Rahmen eines Kits zur Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren zur Identifizierung der induzierten Ausschüttung von Botenstoffen werden vorzugsweise Lochplatten mit 24 - 96 Löchern verwendet, wobei die Fläche eines jeden Lochs einer Platte mit einem Antikörper beschichtet ist, der gegen ein Epitop eines Botenstoffes (z.B. IFN-y) gerichtet ist und nach Inkubation von Fraktionen des Überstandes der Primärinkubation mit einer derart vorbehandelten Platte und der nachfolgenden Inkubation der Fraktionen mit Zielzellen, besteht die Möglichkeit eine Vielzahl von potentiellen Botenstoffen in kurzer Zeit dahingehend zu überprüfen, ob diese tatsächlich an der Vermittlung einer Immunantwort oder der Induktion von Apoptose beteiligt sind. Somit ist ein Kit zur Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren zur Identifikation von Botenstoffen, die als Reaktion der Inkubation der Zellen der Primärinkubation mit einer zu untersuchenden Substanz ausgeschüttet werden, ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ein derartiger Kit enthält lagerungsfähig aufbereitet Aliquots von Zellen, bevorzugt Effektorzellen des Immunsystems, für die Primärinkubation mit den zu untersuchenden Substanzen, Mittel zur Durchführung von Primär- und Sekundärinkubation, sowie weiterhin Mehrlochplatten mit einer Lochanzahl zwischen 24 - 96 Löchern, bei denen die Flächen der Löcher mit einem Antikörper beschichtet sind, wobei die Flächen verschiedene Löcher mit unterschiedlichen Antikörpern beschichtet sind, vorzugsweise aber wenigstens 2 Löcher mit jeweils einem identischen Antikörper versehen sind.
Die bei den erfindungsgemäßen Verfahren notwendigen Inkubationsschritte finden vorzugsweise in einem Brutschrank mit 5% CO2-Gehalt statt. Es sind aber auch andere Inkubationsbedingungen denkbar, die sich jeweils nach den Erfordernissen der zu inkubierenden Zellen richten.
Die Gewinnung der Überstände oder des Gemisches aus Überstand und Zellen aus der primären Inkubation erfolgt erfindungsgemäß durch Zentrifugation. Es sind erfindungsgemäß aber auch alle anderen Verfahren denkbar, welche zu einer Trennung der Zellen von den Überständen geeignet sind, wie beispielsweise die Filtration der Zellen bei einer Maschenweite, die nur dem Überstand die Passage erlaubt, aber nicht den Zellen oder vorhandenem Zelldebris. Außerdem sind Zellauftrennungen bzw. -Sortierungen mittels spezifischer Antikörper und anschließender magnetischer (MACS) oder fluoreszenz-basierter (FACS) Selektion vorgesehen.
Zur Analyse der Zellen sind erfindungsgemäß Methoden vorgesehen, welche Veränderungen der Proteinexpression in den Zielzellen darstellen können. Dabei kommen insbesondere FACS-Messungen (Fluorescent Activated Cell Sorting), Western- Blots Gelfiltrationen oder Zytospins in Betracht.
Weiterhin sind Methoden zur Analyse von Änderungen bei der Expression bestimmter Gene vorgesehen, wie beispielsweise RT-PCR, real-time PCR, RNAse Protecti- on Assays sowie Northern und Southern Blots. Letztlich sind bei der Analyse der in vivo Effekte auch Apoptose-Assays vorgesehen, wie beispielsweise das Anfärben der Zellen mit Annexin V oder der so genannte Tunel-Assay oder Zellzyklus-Analysen, z.B. durch Propidiumjodid-Färbungen.
Die weiter unten aufgeführten Beispiele und Ergebnisse von Versuchen belegen, dass die Anwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens nicht nur in der Lage ist mit in vitro Untersuchungen die Wirkung von Substanzen in vitro Prozessen darzustellen, sondern auch vielmehr dazu geeignet ist, die Spezifität der gefundenen Effekte durch den Ausbau eines erfindungsgemäßen Verfahrens zu einem Kompetiti- onsassay zu überprüfen und belegen.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungsformen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen und der Beschreibung. Die Erfindung einschließlich der Durchführbarkeit des erfindungsmäßen Verfahrens wird anhand der Ausführungsbeispielen und Abbildungen nachfolgend näher beschrieben, ohne dass aber die Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken ist.
Gewinnung mononuklearer Zellen
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden periphere mono- nukleäre Blutzellen (PBMC) aus Vollblut oder so genanntem „Buffy Coat" gewonnen. Dabei handelt es sich um ein Nebenprodukt, dass bei der Herstellung von E- rythrozytenkonzentraten aus Vollblut entsteht.
Die Isolation der PBMC erfolgte über einen Ficoll-Gradienten durch Zentrifugation zur Trennung von Erythrozyten, Granulozyten und toten Zellen. Ficoll ist ein ungeladenes Sucrose-Polymer, dessen Dichte so eingestellt ist, dass beim Überschichten mit Vollblut oder Buffy Coat und anschließender Zentrifugation die Anteile mit kleinerer Dichte die Ficollschicht passieren und sich am Boden sammeln, während Lymphozyten und Monozyten sich in der in der Interphase zwischen Plasma (oben) und Ficoll (unten) ansammeln.
Die Interphase, welche die Zellen nach der Zentrifugation enthielt, wurde isoliert und mehrfach mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die isolierten Zellen in Zellkul- turmedium aufgenommen und auf eine Konzentration von 1 - 4 x 106 Zellen pro Millilitereingestellt.
Doppelsträngige immunmodulatorische Oligodesoxynukleotide (dSLIM)
Doppelsträngige immunmodulatorische Oligodesoxynukleotide sind Moleküle mit CpG-Sequenzen. Hierzu werden lineare Oligodesoxynukleotide (ODN) mittels Nukleotid-Loop kovalent geschlossen, so dass sie vor Degradation durch Exo- nukleasen geschützt sind. Dabei ergeben sich hanteiförmige Moleküle, die dSLIM, „double stem-loop immunomodulator" heißen. Die immunmodulierende Wirkung beruht auf einer unspezifischen Aktivierung des Immunsystems durch die nicht- methylierten CpG-Sequenzen, die an Toll-like Rezeptoren binden, und vor allem die spezielle Struktur der dSLIM Moleküle. Jeder Loop der dSLIM enthält drei nicht- methylierte CpG-Motive.
Doppelsträngige Immunmodulatoren dSLIM des ISS30 Typs (z.B. dSLIM-30L1) wurden nach SOP und abschließender Qualitätskontrolle im Labor Klasse B hergestellt. Hierzu werden einzelsträngige, haarnadelförmige, 5'-phosphorylierte Oligode- soxyribonukleotide (ODN) mit T4-DNA-Ligase ligiert. Nach Verdau der restlichen Edukte mit T7-Polymerase und chromatographischer Aufreinigung, wurden die resultierenden dSLIM Moleküle durch Ethanol und Sodium-Magnesium Acetat Fällung konzentriert und in PBS gelöst. Das genaue Verfahren ist in der WO 01/07055 dargestellt.
Primäre Inkubation der Immunzellen (PBMC) mit dSLIM
Die isolierten Zellen (PBMC) wurden in Multi-well-plates ausgesät. Die Größe der Ansätze und dementsprechend die Größe der Wells wurde so gewählt, dass der später geerntete Kulturüberstand genau das Volumen hatte, dass für die sekundäre Inkubation mit den Zielzellen benötigt wurde.
In einem ersten Ansatz befanden sich unstimulierte Zellen (Negativ-Kontrolle). In einem zweiten Ansatz wurde mit 0,1 - 10 μM dSLIM-30L1 stimuliert. In zwei weiteren Ansätzen erfolgte eine Stimulation mit 0,1 - 10 μM eines Oligodesoxynukleotids (ODN), dass ein möglichst stark positives Ergebnis ergibt, um Geräteeinstellungen und Kompensation am FACS vornehmen zu können. Im weiteren Ansätzen wurde mit 0,1 - 10 μM anderer ODNs zum Vergleich stimuliert. Der Ansatz wurde für 48 Stunden bei 37 Grad Celsius in einem CO2-Brutschrank inkubiert. Die Überstände dieser Ansätze wurden durch Zentrifugation gewonnen und für weitere Arbeiten bei -80 Grad Celsius eingefroren.
Sekundäre Inkubation mit Zielzellen (z.B. HT-29)
Für die sekundäre Inkubation mit den Zielzellen musste zuvor die optimale Konzentration und das Volumen ermittelt werden, in denen diese ausgesät werden. Ziel war es, dass nach der sekundären Inkubation wenigstens 5 x 105 Zielzellen pro Well für die Analyse vorhanden sind. Dabei war darauf zu achten, dass die Zellen für 3 Tage optimale Wachstumsbedingungen haben, so dicht wie nötig und so dünn wie möglich ausgesät wurden, so dass sie nach 3 Tagen fast konfluent sind. Nicht optimale Wachstumsbedingungen führen ebenfalls zu Nekrose oder Apoptose, was eine Verfälschung des Versuchsergebnisses zu Folge hätte. Als Zielzellen wurden hier HT- 29 Koionkarzinomzellen verwendet.
Die Zellen wurden in der vorher ermittelten optimalen Dichte in entsprechend großen Ansätzen ausgesät und über Nacht bei 37 Grad Celsius im CO2-Brutschrank inkubiert (z.B. 2,4 x 105 Zellen in 700 μl pro well in 24 well-plate).
Am nächsten Tag erfolgte die Stimulation durch Abnehmen des Mediums von den inzwischen adhärenten Zellen und Zugabe der Überstände aus der primären Inkubation („indirekte Stimulation") bzw. Zugabe der angegebenen Substanzen (dSLIM- 30L1 , lin30L1) direkt ins Medium („direkte Stimulation"). Als Negativ-Kontrolle wurde zu einem indirekten Ansatz nur Medium zugegeben. Diese Zellen wurden zur Unterscheidung von den unstimulierten Zellen (Zugabe von unstimuliertem Überstand aus primärer Inkubation) als unbehandelte Zellen bezeichnet.
Die Ansätze - direkte Stimulation und indirekte Stimulation - wurden für 48 Stunden wiederum bei 37 Grad Celsius im CO2-Brutschrank inkubiert. Anschließend konnte mit den Zellen die jeweils gewünschte Analyse durchgeführt werden. Dazu wurden zuerst die Überstände von den Zellen abgenommen und die Zellen mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mittels Trypsin / EDTA aus den Wells abgelöst und nach einem weiteren Waschschritt in ein Zentrifugationsröhrchen überführt, um anschließend die Zellzahl zu bestimmen. Färbung von Oberflächenantigenen
Die Zellen aus den Stimulationsansätzen wurden abzentrifugiert und mit einem speziellen Färbepuffer gewaschen. Anschließend wurde die Zelisuspension auf eine Konzentration von 1 x 106 Zellen pro Milliliter eingestellt. 500 μi (0,5 x 106 Zellen) dieser Zellsuspension wurde in einem FACS-Röhrchen abzentrifugiert und nach Aufnahme in 50μl Färbepuffer wurden die Antikörper (z.B. ICAM-1 (CD54) mit FITC konjugiert und HLA-ABC mit PE konjugiert) zugegeben. Für jeden Antikörper wurde eine entsprechende Isotyp-Kontrolle mitgeführt, sowie eine einzeln gefärbte positive Probe für die Geräteeinstellung und Kompensation. Nach einem Inkubationsschritt wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und für die Messung in 500 - 1000 μl PBS resuspendiert. Für die Diskriminierung der toten Zellen wurde 7-AAD dazugegeben und weitere 10 Minuten inkubiert. Anschließend erfolgte die FACS- Messung.
Anfärbung von apoptotischen / nekrotischen Zellen
Apoptotische Zellen wurden mit Annexin V-PE angefärbt, welches apoptotische Vorgänge in der Zelle nachweist. Zur Unterscheidung von nekrotischen Zellen wurde eine Gegenfärbung mit 7-AAD durchgeführt.
Die Zellen aus den Stimulationsansätzen wurden abzentrifugiert und zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in einem speziellen Annexin- Bindungspuffer verdünnt und eine Zellkonzentration von 1 x 106 Zellen pro Milliliter eingestellt. Je 100 μl (1 x 10 5 Zellen) dieser Zellsuspension wurden mit je 5 μl Annexin V-PE und 7-AAD versetzt und nach gutem Mischen für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 400 μl Bindungspuffer zugegeben und es erfolgte unverzüglich die Messung im FACS.
Durchflusszvtometrische Messung am FACS A. Apoptose/ Nekrose
Gemessen wurde die Fluoreszenz 2 (Annexin V-PE) und Fluoreszenz 3 (7-AAD). Die Geräteeinstellung erfolgte mit unstimulierten Zellen (direkte Ansätze) bzw. unbehandelten Zellen (indirekte Ansätze). Im Dot Plot FSC (Vorwärtsscatter = Zellgröße) gegen SSC (Seitwärtsscatter = Gra- nularität der Zellen) wurde die Zellpopulation so eingestellt, dass sie sich in der Mitte befindet. Anschließend erfolgten die PMT-Einstellungen und Kompensation für Fluoreszenz 2 und 3. Danach wurden alle Proben gemessen (5000 Zellen).
B. Oberflächenantiqene
Gemessen wurden Fluoreszenz 1 (ICAM 1 -FITC), Fluoreszenz 2 (HLA-ABC-PE) und Fluoreszenz 3 (7-AAD).
Die Geräteeinstellung erfolgte mit lin-30L1 stimulierten Zellen mit entsprechenden Isotypkontrollen (in Doppelfärbung) zum Abgleich von unspezifischen Bindungen und mit den Fluoreszenz-markierten Antikörpern (in Einzelfärbungen).
Im Dot Plot FSC gegen SSC wurde die Zellpopulation so eingestellt, dass sie sich in der Mitte befindet. Anschließend erfolgten PMT-Einstellungen für Fluoreszenz 1 , 2 und 3 mit den Isotypkontrollen, sowie die Kompensation mit Einzelfärbung. Danach wurden alle Proben gemessen (10000 Zellen). Hierbei wurden die toten Zellen (7- AAD-positive Zellen) ausgeschlossen (Fluoreszenz 3 versus FSC im Dot Blot).
Ergebnisinterpretation A. Apoptose/ Nekrose
Es wird ein Dot Blot 7-AAD versus Annexin V gebildet. Dann werden Quadranten anhand von unbehandelten Zellen gesetzt. Je nach Ihrer Position in den jeweiligen Quadranten gehören die Zellen zur apoptotischen bzw. nekrotischen Fraktion.
Lebende Zellen sind Annexin- negativ und 7AAD-negativ
(LL-Quadrant)
Apoptotische Zellen sind Annexin- positiv und 7AAD-negativ
(LR-Quadrant)
Nekrotische Zellen sind Annexin- positiv und 7AAD-positiv
(UR-Quadrant) oder
Annexin-negativ und 7-AAD positiv
(UL-Quadrant)
B. Oberflächenmarker Es werden zwei Dot Blots (Fluoreszenz 1 versus FSC bzw. Fluoreszenz 2 versus FSC) mit den lebenden Zellen gebildet. Je nach Ihrer Position in den jeweiligen Dot Blots wird die Fluoreszenz-Intensität (Fluoreszenz 1 / ICAM-1 bzw. 2 / HLA-ABC) der Zellen abgelesen. Es findet anschließend ein Vergleich mit den jeweiligen Kontrollen statt.
• Vergleich des Testansatzes mit den Kontrollen bezüglich o Anzahl von Oberffächenmarker-positiven Zellen (= Anzahl von Zellen mit entsprechendem Oberflächenmarker) o Fluoreszenzintensität der Oberflächenmarker (= Anzahl der Oberflächenmarker-Moleküle auf der Zelloberfläche)
Die Ergebnisse der Durchführung der beschriebenen Beispiele unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Figuren dargestellt.
Es zeigt:
Fig. 1 Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens
Fig. 2 Analyse der in vitro Wirkung von dSLIM Immunomodulator durch
Nachweis von Apoptose und Nekrose in HT-29 Tumorzellen .
Fig. 3 Analyse der in vitro Wirkung von dSLIM Immunomodulator durch
Nachweis der Expression von HLA-ABC Oberflächenmarkern in HT- 29 Tumorzellen
Fig. 4 Analyse der in vitro Wirkung von dSLIM Immunomodulator durch
Nachweis von Apoptose und Nekrose in HEK-293 Tumorzellen
Fig. 5 Analyse der in vitro Wirkung von dSLIM Immunomoduiator durch
Nachweis der Expression von HLA-ABC Oberflächenmarkern in HEK- 293 Tumorzellen
Fig. 6 Analyse des Wirkmechnismus von dSLIM durch Nachweis von Apoptose und Nekrose in HT-29 Tumorzellen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Fig. 7 Analyse des Wirkmechnismus von dSLIM durch Nachweis der Expression von HLA-ABC Oberflächenmarkern in HT-29 Tumorzellen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Fig. 8 Vergleich der Wirksamkeit von dSLIM mit linearen CpG-ODN durch
Nachweis der Expression von HLA-ABC Oberflächenmarkern in Renca Tumorzellen.
Fig. 9 Vergleich der Wirksamkeit von dSLIM mit linearen CpG-ODN durch
Nachweis von Apoptose und Nekrose in Renca Tumorzellen.
Fig. 10 Vergleich der Wirksamkeit von dSLIM mit linearen CpG-ODN durch
Nachweis der Expression von HLA-ABC Oberflächenmarkern in HT- 29 Tumorzellen.
Fig. 11 Vergleich der Wirksamkeit von dSLIM mit linearen CpG-ODN durch
Nachweis von Apoptose und Nekrose in HT-29 Tumorzellen.
Fig. 12 In vitro Nachverfolgung lebensfähiger Tumorzellen während der Therapie eines Krebspatienten
Fig. 13 In vitro Nachverfolgung apoptotischer / nekrotischer Tumorzellen während der Therapie eines Krebspatienten
Fig. 14 In vitro Nachverfolgung der Oberflächenmarker von Tumorzellen während der Therapie eines Krebspatienten
Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung der Abfolge der Verfahrensschritte bei dem erfindungsgemäßen Verfahren. Links, im Teil A, befindet sich die Darstellung einer beispielhaften Anwendung in vivo, rechts, im Teil B, ist das zugehörige erfindungsgemäße Verfahren in der Ausgestaltung als „Funktioneller in vitro Immunas- say" dargestellt.
Figur 2 zeigt die Ergebnisse einer Analyse der in vitro Wirkung von dSLIM Immunomodulator unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Verwendung des Überstandes von dSLIM-inkubierten PBMCs induziert Apoptose und Nekrose in HT-29 Tumorzellen (Colonkarzinom), wie im rechten Teil der Abbildung ZU sehen ist. Hier ist ein Steigerung bei der Apoptose von direkt mit dSLIM behandelten Zellen zu den mit dem Überstand behandelten Zellen von 17% auf 46,7% zu sehen.
In Figur 3 wurde die in vitro Wirkung von dSLIM Immunomodulator in HT-29 Zellen analysiert. Die Verwendung des Überstandes von dSLIM-inkubierten PBMCs induziert eine verstärkte Expression von HLA-ABC Oberflächenmarkern. Der Shift der Zellpopulation ist im ganz rechten Teil der Abbildung gut zu erkennen.
Zur Sicherung der in HT-29 erhaltenen Versuchsergebnisse unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden analoge Versuche in HEK-293 Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Figuren 4 und 5 dargestellt.
Figur 4 zeigt, dass durch dSLIM Apoptose (Annexin V) und Nekrose (7-AAD) induziert wird. So steigt die Zahl apoptotischer Zellen durch den Überstand der mit dSLIM behandelten Zellen im Vergleich der mit einem Überstand ohne ODN behandelten Zellen von 12,1 % auf 21 ,7 % an. Die Zahl nekrotischer Zellen steigt von 9,2 % auf 16 %.
In Figur 5 ist die verstärkte Induktion der HLA-ABC Oberflächenmarker durch die Inkubation der Zielzellen (HT-29) mit dem dSLIM Überstand der PBMC dargestellt. Der obere Teil der Figur zeigt dabei den Shift (=Steigerung der Expression) der Zellpopulation von Zellen, die mit Überstand behandelt wurden, der von PBMCs stammte, die nicht mit ODN behandelt wurden, zu Zellen, die mit dem Überstand der dSLIM behandelten PBMCs inkubiert wurden.
Figur 6 zeigt die Ergebnisse einer Analyse des Wirkmechanismus von dSLIM in HT- 29 Zellen unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und dem Nachweis von Apoptose und Nekrose. Dabei wurde bei dem Schritt der primären Inkubation der PBMCs ein Antikörper zugegeben (anti-IFN-γ, grüner Rahmen), der in der Lage ist, die Wirkung von dSLIM zu neutralisieren. Zum Vergleich wurden Versuche mit Antikörpern (anti-IFN-α, anti-TNFα) durchgeführt, um die Spezifität zu belegen. Es ist gut zu erkennen (grüner Rahmen), dass durch den anti-IFN-γ Antikörper sowohl die Zahl der apoptotischen, als auch nekrotischen Zellen minimiert wird. In Figur 7 entspricht die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens dem von Figur 6, jedoch wurde bei den Zielzellen (HT-29) die Expression des Oberflächen- markers ICAM-1 (CD54) analysiert. Im unteren Teil der Figur ist vergleichend der Shift der Zellpopulation dargestellt.
Figur 8 und 9 zeigen Ergebnisse von Experimenten unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Renca Tumorzellen, wobei vergleichend die Wirkung von dSLIM mit linearen ODNs untersucht wurde. Die linearen CpG-enthaltenden Oligodesoxynukleotide haben aber auch eine andere Sequenz als die dSLIM und sind mittels Phosphorothioat gegen Abbau geschützt.
Figur 8 zeigt, dass die Behandlung der Zielzellen mit dSLIM zu einer verstärkten Expression des Oberflächenmarkers HLA-ABC führt (oberer Teil), wohingegen ein lineares CpG-ODN keinen Effekt hat. Die Tabelle im rechten Teil der Abbildung stellt die zahlenmäßigen Unterschiede gegenüber. Bei der Induktion von Apoptose und Nekrose, Figur 9, ist dSLIM deutlich potenter als lineare CpG-ODN. Im unteren Teil ist der Unterschied der Induktion von Apoptose in Prozent angegeben.
Die Figuren 10 und 11 vergleichen jeweils dSLIM mit linearen CpG-ODN unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in HT-29 Zellen als Zielzellen. Die Ergebnisse dieser Experiment entsprechen den Ergebnissen, welche mit den Renca Tumorzellen erzielt wurden und in den Figuren 8 und 9 dargestellt sind. Der Aufbau der Figuren ist ebenfalls entsprechend den Figuren 8 und 9.
Die Figuren 12, 13 und 14 zeigen die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur in vitro Nachverfolgung der Zahl lebensfähiger Tumorzellen (Fig. 12) und apoptotischer / nekrotischer Zellen (Fig. 13) sowie der Veränderung der Expression der Oberflächenmarker ICAM-1/HLA-ABC (Fig. 14) im Verlauf der Therapie eines Krebspatienten.
Dem Patienten mit rektalen Karzinom und Metastasierung der Leber wurden an den ersten fünf Tagen der ersten Woche der Therapie jeweils 2,5 mg dSLIM verabreicht. Am sechsten Tag der ersten Woche erfolgte eine Bestrahlung, gefolgt von einer Chemotherapie. Zur in vitro Analyse der in vivo Effekte wurde dem Patienten jeweils an den ersten sechs Tagen der ersten Woche Blut abgenommen. Während der Chemotherapie wurde gegen Ende jeder Woche ebenfalls Blut abgenommen.
Aus den Blutproben wurde das Plasma isoliert und mit Zellen der Tumorzelllinie HT- 29 inkubiert. Anschließend wurde die Zahl lebensfähiger (Fig. 12) und apoptotischer / nekrotischer Zellen bestimmt sowie die Expression der Oberflächenmarker ICAM-1 / HLA-ABC untersucht.
Figur 12 zeigt die Ergebnisse der Inkubation von HT-29-Zellen mit Plasma von acht Blutproben. Es ist eine deutliche Abnahme lebensfähiger HT-29-Zellen bereits am zweiten Tag der Gabe von dSLIM zu erkennen. Die Zahl lebensfähiger Zellen sinkt am zweiten Tag auf weniger als die Hälfte der Zellen des ersten Tages, die mit der Zahl lebensfähiger Zellen der Kontrollen vergleichbar ist.
In Figur 13 ist die \n vitro Nachverfolgung apoptotischer / nekrotischer Tumorzellen während der Therapie des Krebspatienten an den Tagen 1 , 2, 5 und 20 dargestellt. Es zeigt sich bei dieser Auswertung der Nachverfolgung der in vivo Effekte, dass bereits einen Tag nach Gabe von dSLIM die Zahl der apoptotischen / nekrotischen Zellen deutlich zunimmt.
Figur 14 stellt Ergebnisse der Untersuchungen zur Veränderung der Expression der Oberflächenmarker ICAM-1 / HLA-ABC während der Therapie des Krebspatienten anhand des Plasmas des Blutes der Proben 1 , 2, 3 und 8 dar. Dabei wird Probe 1 als Refernzwert zur Darstellung von Änderungen der Expression der beiden Oberflächenmarker herangezogen.
ICAM-1 wird bereits am zweiten Tag der Therapie deutlich stärker exprimiert, was im unteren Teil der Abbildung an der Verlagerung der Position der Fluoreszenz- Intensität ersichtlich ist, welche zeigt, dass ICAM-1 stärker exprimiert wird.
Bei HLA-ABC hat am zweiten Tag noch keine Verlagerung der Fluoreszenz- Intensität stattgefunden. Diese findet erst am dritten Tag der Therapie statt und zeigt ebenfalls eine stärkere Expression von HLA-ABC. Bezugszeichenliste
A = in vivo Situation
B = in vitro Immunassay
1 = Patient
2 = Zielgewebe, z.B. Tumor
3 = Immunzellen
4 = Testsubstanz, z.B. dSLIM
5 = aktivierte Immunzellen
6 = Spender
7 = Immunzellen, z.B. PBMC
8 = Testsubstanz, z.B. dSLIM
9 = aktivierte Immunzellen, z.B. PBMC
10 = Überstand
11 = Zielzellen, z.B. Tumorzellen
12 = Analyse

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur in vitro Untersuchung der Wirkung von Substanzen in in vi- vo Prozessen, die folgende Abfolge von Verfahrensschritte umfassend a) Isolation von Zellen b) Primäre Inkubation der Zellen mit der zu untersuchenden Substanz c) Gewinnung des Überstandes oder des Gemischs aus Zellen und Überstand der primären Inkubation d) Sekundärer Inkubation von Zielzellen mit dem Überstand oder dem Gemisch aus Zellen und Überstand e) Analyse der Zielzellen
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei es sich bei den isolierten Zellen für die primäre Inkubation um Effektorzellen des Immunsystems handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei den Zielzellen der sekundären Inkubation um menschliche Zellen oder Zellen höherer Säugetiere handelt.
4. Verfahren nach wenigstens einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Verfahrensschritte 1.d) und 1.e) mit Patientenblut, -serum, oder -plasma durchgeführt werden.
5. Verfahren nach wenigstens einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei den zu untersuchenden Substanzen um immunmodulierende sowie Apoptose oder Nekrose induzierende Verbindungen handelt.
6. In vitro Nachweisverfahren, welches für die Identifikation immunmodulierender Verbindungen und/oder den Nachweis der Wirkung von immunmodulierenden Verbindungen sowie die Identifikation Apoptose und/oder Nekrose induzierender Verbindungen mittels des Immunsystems in in vivo Prozessen geeignet ist, die folgende Abfolge von Verfahrensschritte umfassend a) Primäre Inkubation von Effektorzellen des Immunsystems mit ei- ner auf immunmodulierende Wirkung zu untersuchenden oder A- poptose oder Nekrose induzierenden Substanz, gefolgt von der b) Gewinnung des Überstandes oder des Gemischs aus Zellen und Überstand der primären Inkubation und anschließender c) Sekundärer Inkubation von Zielzellen mit dem Überstand oder dem Gemisch aus Zellen und Überstand der primären Inkubation, und abschließend d) die immunmodulierende und/oder Apoptose und/oder Nekrose induzierende Wirkung mittels geeigneter Nachweisverfahren analysiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Zellen für die Primärinkubation in
Verfahrensschritt La. zuvor isoliert werden.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei es sich bei den Effektorzellen des Immunsystems für die primäre Inkubation vorzugsweise um periphere mononukleäre Zellen aus Blut, Milzzellen oder über FACS oder MACS sortierte Subpopulationen von Zellgemischen, wie beispielsweise B-, T- und NK-Zellen, Monozyten oder Dendritische Zellen, handelt.
9. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei es sich bei den Zellen für die primäre Inkubation und die Zielzellen der sekundären um menschliche Zellen oder Zellen höherer Säugetiere handelt.
10. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei die Verfahrensschritte 6.c) und 6.d) mit Patientenblut, -serum, oder -plasma durchgeführt werden.
11. Verfahren nach wenigstens einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei den Zielzellen der sekundären Inkubation um Tumorzellen oder Zelllinien tumorgenetischen Ursprungs handelt.
12. Verfahren nach wenigstens einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei den immunmodulierenden Verbindungen, deren Wirkung untersucht wird, um CpG-enthaltende Oligodesoxynukleotide oder partiell dop- pelsträngige DNA-Konstrukte mit wenigstens einem CpG-Motiv in einem einzelsträngigen Bereich handelt.
13. Verfahren nach wenigstens einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei den Apoptose und/oder Nekrose induzierenden Verbindungen, deren Wirkung untersucht wird, vorzugsweise um Antisense- Oligodesoxynukleotide, siRNA, Antikörper oder Chemotherapeutika handelt.
14. Verfahren nach wenigstens einem der vorherigen Ansprüche, wobei als zu untersuchende Substanz in der primären Inkubation Vollblut, Blutzellen, Blutzellsubpopulationen, Blutserum oder Blutplasma vor, während und/oder nach einer Behandlung verwendet wird.
15. Verfahren nach wenigstens einem der vorherigen Ansprüche, wobei Inkubationen im Brutschrank stattfinden.
16. Verfahren nach wenigstens einem der vorherigen Ansprüche, wobei LJ- berstände durch Zentrifugation gewonnen werden.
17. Verfahren nach wenigstens einem der vorherigen Ansprüche, wobei zur Analyse der Zielzellen die Expression spezifischer Proteine untersucht wird.
18. Verfahren nach wenigstens einem der vorherigen Ansprüche, wobei zur
Analyse der Zielzellen die Expression definierter Gene untersucht wird
19. Verfahren nach wenigstens einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zielzellen zur Analyse angefärbt werden, insbesondere mit Annexin V oder Propidiumjodid-Färbungen durchgeführt werden.
20. Verfahren nach wenigstens einem der vorherigen Ansprüche, wobei zur Analyse der Zielzellen Apoptose und/oder Nekrose-Nachweisverfahren durchgeführt werden.
21. Verfahren nach wenigstens einem der vorherigen Ansprüche, wobei ZeII- zyklus-Analysen durchgeführt werden.
22. Verfahren nach wenigstens einem der vorherigen Ansprüche, wobei bei der primären Inkubation mit der zu untersuchenden Substanz Antikörper oder andere kompetierende Substanzen zugegeben werden.
23. Kit zur Durchführung eines in vitro Nachweisverfahrens, welches für die Identifikation immunmodulierender Verbindungen und/oder den Nachweis der Wirkung von immunmodulierenden Verbindungen sowie die Identifika- tion Apoptose und/oder Nekrose induzierender Verbindungen mittels des
Immunsystems in in vivo Prozessen geeignet ist
■ lagerungsfähig aufbereitete Aliquots von Effektorzellen des Immunsystems sowie
■ Mittel zur Durchführung von Primär und Sekundärinkubation sowie
■ für den Nachweis von Botenstoffen, die als Reaktion der Inkubation der Zellen der Primärinkubation mit einer zu untersuchenden Verbindung ausgeschüttet werden Mehrlochplatten mit einer Lochanzahl zwischen 24 - 96 Löchern, bei denen die Flächen der Löcher mit einem Antikörper beschichtet sind und/oder
■ für die Untersuchung von Änderungen der Expression von Oberflächenmolekülen aufgrund einer durch die zu untersuchenden Verbindung induzierten Immunreaktion Mittel zur Durchführung ei- ner RT-PCR, wozu der Kit geeignete Primer zur Vervielfältigung der mRNA von Oberflächenmolekülen, Enzyme für die Vervielfältigung und die benötigten Puffer enthält und/oder Mittel für eine FACS-Analyse, wozu der Kit geeignete fluoreszenzmarkierte Anti- körper, die gegen Oberflächenantigene gerichtet sind enthält sowie weiterhin Mittel zur Aufarbeitung der Zielzellen, wie Puffer und Chemikalien.
24. Kit zur in vitro Darstellung der Wirkung von immunmodulierenden Verbindungen sowie der Identifikation Apoptose und/oder Nekrose induzie- render Verbindungen mittels des Immunsystems in in vivo Prozessen vor, während und/oder nach der Gabe derartiger Verbindungen, wenigstens folgende Komponenten aufweisend
■ lagerungsfähig aufbereitete Aliquots von Zielzellen für die Inkubation mit Patientenblut, -serum, oder -plasma
■ Mittel zur Durchführung einer Sekundärinkubation sowie
■ für den Nachweis von Botenstoffen, die als Reaktion der Inkubation der Zellen der Primärinkubation mit einer zu untersuchenden Verbindung ausgeschüttet werden Mehrlochplatten mit einer Lochanzahl zwischen 24 - 96 Löchern, bei denen die Flächen der Löcher mit einem Antikörper beschichtet sind und/oder
■ für die Untersuchung von Änderungen der Expression von Oberflächenmolekülen aufgrund einer durch die zu untersuchenden Verbindung induzierten Immunreaktion Mittel zur Durchführung einer RT-PCR, wozu der Kit geeignete Primer zur Vervielfältigung der mRNA von Oberflächenmolekülen, Enzyme für die Vervielfältigung und die benötigten Puffer enthält und/oder Mittel für eine FACS-Analyse, wozu der Kit geeignete fluoreszenzmarkierte Antikörper, die gegen Oberflächenantigene gerichtet sind enthält sowie weiterhin Mittel zur Aufarbeitung der Zielzellen, wie Puffer und Chemikalien. ■ Kit nach Anspruch 24, wobei es sich bei den enthaltenen Zielzellen um Tumorzellen oder Zelllinien tumorgenetischen Ursprungs handelt.
25. Kit nach Anspruch 24, wobei es sich bei den enthaltenen Zielzellen um Tumorzellen oder Zelllinien tumorgenetischen Ursprungs handelt.
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