WO2007026895A1 - 尿路上皮ガンの検出用キットおよび方法 - Google Patents

尿路上皮ガンの検出用キットおよび方法 Download PDF

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WO2007026895A1
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cancer
nucleic acid
antibody
gene
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Hideo Akiyama
Yoshinori Tanaka
Satoko Kozono
Hitoshi Nobumasa
Osamu Ogawa
Takeshi Takahashi
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Toray Industries, Inc.
Kyoto University
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting urothelial cancer by measuring CXCL1 protein useful for detecting or diagnosing urothelial cancer, or expression of a gene encoding the protein.
  • the present invention also relates to a diagnostic kit for cancer comprising a substance capable of binding to the protein or gene, which is used for detection of urothelial cancer.
  • Urinary epithelial cancer is a general term for bladder cancer, renal pelvic cancer, ureteral cancer, etc., and these cancers are cancers of transitional epithelial cells of the urinary tract, and their properties are common. It is believed that there is. Urinary epithelial cancer is the most common urinary tract organ cancer after prostate cancer. In 2000, the Ministry of Health, Labor and Welfare Minister's Secretariat Statistics Information Department “Demographic Statistics” shows that only bladder cancer is Tang, 9765 males, 3243 females, 3459 males, 158 7 females. Renal cancer and ureteral cancer have relatively few deaths of 797 and 713 for both men and women, respectively.
  • bladder cancer is more common in people over the age of 50, and men develop two to three times more frequently than women. Smokers are thought to be about 4 times more likely than non-smokers.
  • Superficial papillary cancer is a relatively low-grade cancer that protrudes into the lumen of the bladder (the inner surface of the bladder) but has a shallow root surface.
  • Nipple-like (cauliflower-like) with a narrow stem. Can be treated endoscopically, but more than half of patients relapse in the bladder. The depth of the cancer may extend below the mucosa, but does not reach the muscle layer of the bladder.
  • invasive cancer is a highly malignant cancer that tends to invade deep into the bladder wall where the roots spread and may metastasize. Therefore, treatment that puts a heavy burden on the body, such as cystectomy, use of anticancer drugs, and radiation therapy, is necessary.
  • bladder cancer The most common symptom of bladder cancer is painless hematuria. There are cases of bladder inflammation such as pain during urine and not refreshing after urination. Diagnosis uses urinalysis (cytology), radiography, and endoscope. However, there are no specific and sensitive tumor markers that can be used in blood and urine that are useful for early diagnosis, and they are often discovered by testing after the cancer has progressed. In addition, urothelial cancer that occurs in parts other than the bladder has the same properties. Therefore, the practical use of a simple detection method with a specific and sensitive tumor marker for urothelial cancer, particularly bladder cancer, is expected.
  • Patent Document 1 JP 2004-337120
  • Patent Document 2 JP-A-2004-248508
  • Patent Document 3 JP 2002-238599
  • Patent Document 4 JP-A-2004-61288
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 7_309895
  • Patent Document 6 JP 2000-131321 A
  • An object of the present invention is to find a novel urothelial cancer tumor marker and provide a method capable of effectively detecting urothelial cancer, particularly bladder cancer.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a method for detecting urothelial cancer comprising measuring in vitro CXCL1 protein or expression of a gene encoding the protein in a biological sample derived from a subject.
  • the nucleic acid probe is a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a variant thereof, a nucleic acid comprising a complementary sequence thereof, a nucleic acid hybridizing under stringent conditions with these nucleic acids, Or the method according to (10), comprising a fragment containing 15 or more consecutive bases thereof.
  • the protein in the sample is immunologically measured, and the amount of the protein is compared to that in the control sample.
  • a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a variant thereof, a nucleic acid comprising its complementary sequence, a nucleic acid that hybridizes with these nucleic acids under stringent conditions, or 15 or more thereof
  • a probe consisting of a fragment containing consecutive bases
  • the expression level of the gene in the sample is measured, and the urinary epithelium is used as an indicator that the expression level increases compared to that of the control sample.
  • the method according to any one of (1) to (5), (7), (8), (10) to (: 12), which comprises detecting cancer.
  • urothelial cancer is also selected from a group force consisting of bladder cancer, renal pelvis cancer, ureteral cancer, and urethral cancer.
  • the gene has the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a mutant sequence thereof (1) to (5), (7), (8), (10) to (12 ), (14) to (: 17).
  • a kit for diagnosing urothelial cancer comprising an antibody or a fragment thereof, or a chemically modified derivative thereof, which specifically binds to CXCL1 protein or a fragment thereof.
  • Fragment force S of the protein including an epitope consisting of at least 8 amino acids
  • the method further comprises a labeled secondary antibody that can bind to the antibody or fragment thereof (20) to (2 The kit according to any one of 4).
  • a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a variant sequence thereof, a nucleic acid comprising a complementary sequence thereof, a nucleic acid that hybridizes with these nucleic acids under stringent conditions, or a nucleic acid thereof
  • a kit for diagnosing urothelial cancer comprising a fragment containing 15 or more consecutive bases, or a chemically modified derivative thereof.
  • the nucleic acid has the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a mutant sequence thereof.
  • kits according to (27) or (28), wherein the urothelial cancer is selected from the group consisting of bladder cancer, renal pelvis cancer, ureteral cancer, and urethral cancer.
  • nucleic acids nucleotides, polynucleotides, amino acids, peptides, polypeptides, proteins, etc. are indicated in “Guidelines for the creation of specifications including base sequences or amino acid sequences” (edited by the Japan Patent Office). ) And customary in the art
  • CXCL1 Chemokine (C—X—C motif) ligand 1, GR ⁇ ichi, GRO-1, melanoma growth stimulating activity, alpha
  • a protein consisting of 107 amino acids belonging to the chemokine family and having a molecular weight of about 1. kDa. This protein acts as a ligand for CXCR1 and CXCR2, 7-transmembrane receptors, and neutrophils and basophils expressing these receptors Causes migration of spheres, mast cells, etc. (Richmond, A et al., 1988, EMBO journal, Section 7, p. 2025-712033).
  • nucleic acid is used to include both RNA and DNA.
  • the DNA includes any of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA.
  • the RNA includes any of total RNA, mRNA, rRNA, and synthetic RNA.
  • the nucleic acid is used interchangeably with the polynucleotide.
  • cDNA includes a full-length DNA strand of a sequence complementary to RNA generated by gene expression and a DNA fragment consisting of a partial sequence thereof.
  • cDNA can be synthesized by RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) using RNA as a cage and using poly-T primers.
  • gene refers not only to double-stranded DNA, but also to each single-stranded DNA such as a positive strand (or sense strand) or a complementary strand or an antisense strand constituting the same. Used with the intention of inclusion. The length is not particularly limited. Therefore, in this specification, unless otherwise specified, “gene” refers to double-stranded DNA including human genomic DNA, single-stranded DNA including cDNA (positive strand), and single-stranded DNA having a sequence complementary to the positive strand. DNA (complementary strand) and any of these fragments are included.
  • the “gene” is not only a “gene” represented by a specific base sequence (or SEQ ID NO), but also a protein having a biological function equivalent to a protein encoded by these, for example, a homolog (ie, homolog), Variants such as splice variants and “genes” encoding derivatives are included.
  • a “gene” encoding such a homologue, variant or derivative specifically, a base sequence that hybridizes with a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under the stringent conditions described later.
  • the “gene” possessed can be mentioned.
  • a homologue of a human-derived protein ie, a homolog
  • a gene encoding the same can be exemplified by a protein or gene of another biological species corresponding to the protein or the human gene encoding the same.
  • Protein or gene homozygous HomoloGene http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homoloGene/
  • a specific human amino acid or nucleotide sequence is represented by the BLAST program (Kariin, S. et al., Proceedings of the National Academic Sciences US A., 1993, 90th, p.
  • the "gene” may include, for example, an expression control region, a code region, an exon, or an intron, without questioning whether the functional region is different.
  • transcript refers to messenger RNA (mRNA) synthesized with a DNA sequence of a gene as a cage.
  • RNA polymerase binds to a site called a promoter located upstream of the gene, and ribonucleotides are bound to the 3 'end so that it is complementary to the DNA base sequence.
  • This mRNA includes not only the gene itself but also the entire sequence from the transcription start point to the end of the poly A sequence, including the expression control region, coding region, exon or intron.
  • translation product refers to a protein synthesized based on the information regardless of whether or not the mRNA force splicing synthesized by transcription is modified or not.
  • ribosome and messenger RNA are first bound, and then amino acids are linked according to the base sequence of mRNA to synthesize a protein.
  • probe refers to RNA produced by gene expression, or RNA Nucleic acids used to specifically detect nucleic acids derived from and / or complementary nucleic acids thereto.
  • primer includes continuous nucleic acids and Z or complementary nucleic acids that specifically recognize and amplify RNA produced by gene expression or nucleic acids derived therefrom. To do.
  • complementary nucleic acid ⁇ complementary strand, reverse strand is a full-length nucleic acid sequence consisting of a base sequence defined by SEQ ID NO: or its partial partition ⁇ 1J (here, for convenience, this is the normal strand)
  • the strong complementary strand is not limited to forming a complete complementary sequence with the base sequence of the target positive strand, but has a complementary relationship that can be hybridized with the target positive strand under stringent conditions. You may have.
  • stringent conditions refers to conditions under which a probe hybridizes to its target sequence to a detectably greater extent (eg, at least twice background) than to other sequences. Say. Stringent conditions are sequence-dependent and depend on the environment in which the hybridization is performed. By controlling the stringency of the hybridization and / or wash conditions, target sequences that are 100% complementary to the probe can be identified.
  • the term "mutant" refers to a natural variant, homologue, or degeneracy of the genetic code caused by polymorphism, mutation, alternative splicing during transcription, and the like. Or a mutation comprising one or more, preferably one or several base deletions, substitutions, additions or insertions in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof. Or about 80% or more, about 85% or more, and preferably about 90% with the base sequence or a partial sequence thereof. / o or more, more preferably about 95% or more, about 97% or more, about 98.
  • nucleic acid that hybridizes under stringent conditions as defined above with a variant showing% identity of 0 or more, or about 99% or more, or a polynucleotide or oligonucleotide containing the nucleotide sequence or a partial sequence thereof
  • a variant comprising a deletion, substitution, addition or insertion of one or more, preferably one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a partial sequence thereof, Or the amino acid About 80% or more, about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more, about 97% or more, about 98% or more, or about 99% or more% identity to the sequence or a partial sequence thereof It means the variant which shows.
  • “several” means an integer of about 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 or 2 or less.
  • % identity can be determined by introducing a gap using the above-mentioned protein or gene search system by BLAST or FASTA (Karim, S. et al. 1993, Proceedings oi the National Academic Sciences U. 3 ⁇ 4 .A., 90, p. 5873-5877; Altschul, SF et al., 1990, Journal of Molecular Biology, 215, p. 403-410 Pearson, WR et al., 1988, Proceedings of the National Academic Sciences USA, Vol. 85, p.2444-244 8).
  • the term "derivative” means, in the case of nucleic acid, a labeled derivative with a fluorophore, a radioisotope, etc., a modified nucleotide (for example, alkyl such as halogen and methyl, alkoxy such as methoxy, thio, Nucleotides containing groups such as carboxymethyl, biotinylated nucleotides, and nucleotides that have undergone base rearrangement, double bond saturation, deamination, substitution of oxygen molecules to sulfur molecules, etc.)
  • chemical modifications such as acetylation, acylation, alkylation, phosphorylation, sulfation, glycosylation, piotin / avidination, labeling (eg, labels for enzymes, fluorophores, luminescent substances, etc.) Derivative means.
  • the term "diagnosis or detection or determination kit” refers to the presence or absence of urothelial cancer, the degree of morbidity, the presence or absence of improvement, and the degree of improvement. It is used directly or indirectly to screen candidate substances useful for the prevention, amelioration or treatment of urothelial cancer.
  • the "biological sample” to be detected and diagnosed refers to a sample (or specimen) in which the expression of the protein and Z or gene of the present invention changes as urothelial cancer develops.
  • the sample includes urothelial tissue and surrounding lymph nodes, other organs suspected of metastasis, blood, serum, plasma, lymphocyte culture supernatant, urine, spinal fluid, saliva, sweat , Body fluids such as ascites, and cell or organ extracts.
  • urinary tract epithelial cancer means a cancer that develops in the transitional epithelium in the kidney cup, renal pelvis, ureter, bladder, and urethra.
  • urothelial cancer include bladder cancer, renal pelvis cancer, ureteral cancer, and urethral cancer, and the present invention is particularly preferably used for detection of bladder cancer.
  • subject refers to an animal having a urothelial cancer, preferably a mammal, more preferably a human.
  • urothelial cancer can be easily detected with high reliability. For example, it is possible to easily determine whether or not the patient has urothelial cancer simply by measuring the ratio of the CXCL1 concentration / creatine concentration in the urine of the patient. In this case, it is particularly effective for detecting invasive tumors.
  • FIG. 1 Comparison of mRNA expression levels by RT-PCR measurement of CXCL1 in bladder cancer cell lines and normal urothelial epithelial cells.
  • FIG. 2 CXCL1 tongue in culture supernatants of bladder cancer cell lines and normal urothelial cells Protein expression level.
  • FIG. 3 CXCL1 protein expression in urine of bladder cancer patients.
  • FIG. 4 Measurement of CXCL1 protein expression level in urine of bladder cancer patients.
  • the white circles indicate the numerical values of each data, and the average value and standard error are indicated by + characters.
  • * Indicates that there is a significant difference between healthy individuals (control) and early cancer patients (Ta) with a risk factor of P 001.
  • + Indicates a significant difference between patients with early cancer and those with advanced cancer (T1 and above) with a risk factor of P ⁇ 0. 01
  • FIG. 5 is an immunostaining diagram of CXCL1 protein expression in tissues of bladder cancer patients. Strong staining is seen in advanced cancer (PT2G3) and lymph node metastases. In contrast, no staining was observed in normal urothelial tissue (pTaGl).
  • the present inventors have now confirmed that the protein whose expression is enhanced in cancer cells derived from bladder cancer patients compared to normal urothelial cells, Screening was performed by proteome analysis. As a result, it was found that the full length CXCL1 protein was detected more in the culture supernatant of cancer cells than in the culture supernatant of normal urothelial cells.
  • normal urothelial cells are epithelial cells obtained from normal ureters of nephrectomized patients who do not suffer from urothelial cancer.
  • the present inventors also measured the amount of CXCL1 protein in blood and urine before and after surgery for bladder cancer patients by an immunological method. The patient's blood and urine were found to be more highly detected than after bladder cancer removal.
  • the present inventors further recovered total RNA expressed in cells derived from bladder cancer patients and normal urothelial cells, and expressed the expression level of the gene encoding CXCL1 in the total RNA by DNA array method and Measured by quantitative PCR, it was found that the amount of mRNA encoding CXCL1 was increased in cells derived from bladder cancer patients compared to normal cells.
  • the present invention in one embodiment thereof, comprises measuring in vitro the CXC L1 protein in a biological sample derived from a subject, or the expression of a gene encoding the protein, and urothelial cancer Provide a method of detecting [0072]
  • the presence or amount of the protein or the expression or expression level of the gene in a biological sample is measured.
  • the target protein or gene in the present invention also includes mutants caused by the type of subject (for example, polymorphism depending on individuals, splice mutation, etc.
  • the expression and expression level of a gene can be measured using a substance that can specifically bind to the protein or gene, such as an antibody or a nucleic acid probe described below. included.
  • the antibody that can be used in the present invention recognizes the CXCL1 protein (preferably a protein having the amino acid coordination IJ of SEQ ID NO: 2) and specifically binds to the antibody, a fragment thereof, or a chemical modification Derivative (defined above).
  • Antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, or antibody fragments such as Fab, Fab ', F (ab'), Fv, ScFv, etc.
  • the antibody of the present invention is an antibody against one or more epitopes composed of at least 5, preferably at least 8 amino acids of the protein.
  • a specific polyclonal antibody is obtained by a technique including, for example, passing an antiserum such as a rabbit immunized with a CXCL1 protein to a carrier such as agarose and collecting the IgG antibody bound to the column carrier. Can be produced.
  • the monoclonal antibody can be obtained by a technique described later.
  • a nucleic acid probe that can be used in the present invention hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a mutant sequence thereof, a nucleic acid comprising a complementary sequence thereof, or a nucleic acid thereof. Includes nucleic acids, or fragments containing 15 or more consecutive bases thereof, or chemically modified derivatives thereof (as defined above).
  • the abundance of the protein or the expression level of the gene in a biological sample from a subject is measured. If the amount of the protein or the expression level of the gene is significantly increased compared to that of the control sample, it is determined that the subject is suffering from urothelial cancer.
  • the control sample is, for example, a corresponding sample from a normal or healthy individual or an individual who does not have urothelial cancer, for example, body fluid such as blood and urine, urothelial tissue or cells, and the like.
  • body fluid such as blood and urine, urothelial tissue or cells, and the like.
  • mRNA is recovered from these samples by conventional methods, and is generated and amplified by quantitative RT-PCR.
  • the amount of cDNA (which corresponds to the expression level of the target gene) can be determined, or the cells can be cultured and the concentration of CXCL1 protein in the culture supernatant can be measured
  • the increase rate relative to the control sample is usually 2 times or more, preferably 3 times or more, more preferably 4 times or more, and most preferably 5 times or more. If the increase rate is 3 times or more, the reliability increases.
  • the degree of increase can be determined by comparing the relative values with respect to, for example, a certain amount of a correction substance (for example, creatinine) based on only a comparison of measured actual values.
  • urothelial cancer includes, for example, bladder cancer, renal pelvis cancer, ureteral cancer, urethral cancer, and the like.
  • detection of bladder cancer was significantly more reliable in detecting invasive tumors than in superficial tumors. Therefore, the present invention will be more effective in detecting invasive tumors that are prone to metastasis among urothelial cancers.
  • the method for detecting urothelial cancer of the present invention uses a primer or a probe for nucleic acid derived from a gene encoding a CXCL1 protein produced from a urothelial cancer cell in a sample. It includes measuring the expression level or immunologically measuring CXCL1 protein in a sample produced by urothelial cancer cells using an antibody.
  • the method of the present invention makes it possible to distinguish between urothelial cancer patients and non-urothelial cancer patients who can only determine whether or not the subject has urothelial cancer.
  • the expression level of a nucleic acid derived from a gene encoding a CXCL1 protein in a sample or the CXCL1 protein in the sample can be determined by quantifying the expression level of the urothelial cancer.
  • the present invention provides a method for immunologically quantifying CXCL1 protein in a sample by using an antibody or fragment thereof that specifically binds to the CXCL1 protein or fragment thereof. It provides a method for detecting urothelial cancer represented by cancer.
  • the present invention provides a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding CXCL1 protein, a nucleic acid comprising a sequence complementary thereto, a nucleic acid that hybridizes with these nucleic acids under stringent conditions, or Use fragments of 15 or more bases of those nucleic acids
  • the present invention provides a method for detecting urothelial cancer represented by bladder cancer by measuring the expression level of a gene encoding CXCL1 protein in a sample.
  • the expression level of a gene encoding CXCL1 protein produced from urothelial cancer cells in a sample is measured using a nucleic acid as a primer or probe. The method of doing is mentioned.
  • a nucleic acid that can be used for determining the presence and / or absence of urothelial cancer or for diagnosing urothelial cancer is a human-derived CXCL1 gene, its cognate Enables the qualitative and / or quantitative determination of the presence, expression level or abundance of the body, its transcript or cDNA, or its mutants or derivatives.
  • the expression level of CXCL1 gene is significantly increased in urothelial cancer tissue as compared to non-cancerous tissue. Therefore, the composition of the present invention can be used effectively for measuring the expression level of CXCL1 gene in non-cancerous tissue and urothelial cancer tissue and comparing them.
  • a nucleic acid that can be used in the present invention includes a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in a living tissue of a patient suffering from urothelial cancer, a complementary nucleic acid thereof, and a complementary nucleic acid to the base sequence.
  • a nucleic acid that hybridizes with a DNA comprising a base sequence under stringent conditions, a complementary nucleic acid thereof, and one or more nucleic acids selected from a nucleic acid group containing 15 or more consecutive bases in the base sequence of those nucleic acid groups Includes combinations.
  • the above-mentioned polynucleotide fragment is, for example, the total number of 15 to 30 consecutive bases J, 15 to 300 bases, 15 to 250 bases, 15 to 200 bases, 15 to : 150 bases, 15-: 140 bases, 15-: 130 bases, 15-: 120 bases, 15-: 110 bases, 15-: 100 bases, 15-90 bases, 15-80 bases, 15-70 bases, 15-60 bases, 15-50 bases, 15-40 bases, 15-30 bases or 15-25 bases; 25-total number of bases in the sequence, 25-300 bases, 25-250 bases, 25-200 bases, 25- : 150 bases, 25-: 140 bases, 25-: 130 bases, 25-: 120 bases, 25-: 110 bases, 25-: 100 bases, 25-90 bases, 25-80 bases, 25-70 bases 25 to 60 bases, 25 to 50 bases or 25 to 40 bases; 50 to the total number of bases in the sequence, 50 -300 bases, 50-250 bases, 50-200 bases;
  • nucleic acids or fragments thereof used in the present invention may be DNA or RNA.
  • the nucleic acid as the composition of the present invention can be prepared using a general technique such as a DNA recombination technique, a PCR method, or a method using a DNA / RNA automatic synthesizer.
  • the present invention is also for urothelial cancer diagnosis (detection) comprising one or more of a nucleic acid, a variant thereof and / or a fragment thereof which can be used as a probe (and optionally a primer) in the above method.
  • urothelial cancer diagnosis comprising one or more of a nucleic acid, a variant thereof and / or a fragment thereof which can be used as a probe (and optionally a primer) in the above method.
  • Provide kit comprising one or more of a nucleic acid, a variant thereof and / or a fragment thereof which can be used as a probe (and optionally a primer) in the above method.
  • the kit of the present invention preferably comprises one or more nucleic acids selected from the nucleic acids described above or a fragment thereof.
  • the kit of the present invention comprises a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, a nucleic acid comprising a complementary sequence thereof, a nucleic acid that hybridizes with these nucleic acids under stringent conditions, or a fragment of these nucleic acids.
  • the nucleic acid comprises a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a nucleic acid comprising a complementary sequence thereof, a nucleic acid that hybridizes with these nucleic acids under stringent conditions, or a fragment containing 15 or more consecutive bases thereof.
  • the fragment is 15 or more, preferably 30 or more, preferably 50 or more.
  • it can be a nucleic acid containing 60 or more, for example 50 to 100, consecutive bases.
  • kits of the present invention are merely examples, and all other various possible combinations are included in the present invention.
  • nucleic acids, variants or fragments thereof contained in the kit of the present invention are packaged individually or in any combination in different containers.
  • the nucleic acid as a probe contained in the kit of the present invention may be bound to a solid phase carrier.
  • the carrier include a substrate such as a DNA microarray or a DNA chip.
  • DNA microarrays and DNA chips containing the above nucleic acids are also within the scope of the present invention.
  • nucleic acids that can be immobilized are all the nucleic acids of the present invention described above.
  • nucleic acids can include one or more of the following nucleic acids or fragments thereof.
  • a nucleic acid consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, a variant thereof, or a fragment thereof containing 15 or more consecutive bases.
  • a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a nucleic acid group that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a fragment thereof containing 15 or more consecutive bases.
  • a nucleic acid comprising 60 or more consecutive bases in each of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence.
  • the solid-phased nucleic acid is genomic DNA, cDNA, RNA, synthetic DNA, synthetic RNA, misaligned, or single-stranded, double-stranded. But min.
  • a method of immobilizing a previously prepared probe on a solid surface can be used.
  • a nucleic acid into which a functional group has been introduced is synthesized, and oligonucleotides or polynucleotides are spotted on the surface of the surface-treated solid support and covalently bound (for example, JB
  • the nuclear acid is covalently bonded to the surface-treated solid support via a spacer or a crosslinker.
  • a method is also known in which polyacrylamide gel fragments are aligned on a glass surface and a synthetic nucleic acid is covalently bound thereto (G. Yershov et al., Proceedings of the National Academic Sciences USA, 1996, 94th page, p. 4913).
  • an array of microelectrodes is prepared on a silica microarray, and an agarose permeation layer containing streptavidin is provided on the electrode as a reaction site, and this site is positively charged to immobilize the piotinated polynucleotide.
  • an agarose permeation layer containing streptavidin is provided on the electrode as a reaction site, and this site is positively charged to immobilize the piotinated polynucleotide.
  • the substrate of the DNA chip is not particularly limited as long as DNA can be solid-phased, and examples thereof include a slide glass, a silicon chip, a polymer chip, and a nylon membrane.
  • these substrates are subjected to surface treatments such as the introduction of functional groups such as poly-L-lysine-coated kyamino groups and carboxyl groups.
  • the solid phase immobilization method is not particularly limited as long as it is a commonly used method.
  • a high-density dispenser for example, put a different gene solution in each well of a plate having many wells, pick up this solution with a pin (needle), and spot it on the substrate in order. By doing.
  • genes are ejected from Nozunore and arranged at high speed on the substrate.
  • a base bonded to a substrate is protected with a functional group that can be eliminated by light, and a mask is used to irradiate only the base at a specific site to desorb the functional group. Thereafter, the step of adding a base to the reaction solution and coupling with the base on the substrate is repeated.
  • hybrida I See Chillon conditions include, but are not limited to, for example, 30 ° C ⁇ 50 ° C, 3 ⁇ 4 XS SC, 0. 1 ⁇ 0 5 0/0 in SDS:.! ⁇ 24B temple ⁇ Noble hybridization, more preferably at 40 ° C to 45 ° C, in 3.4 X SSC, 0.3% SDS:! ⁇ 24 hours of hybridization, and subsequent washing Including.
  • washing conditions include conditions such as continuous washing at room temperature with a solution containing 233 and 0.1% SDS, and a 1 X SSC solution and a 0.2 X SSC solution.
  • 1 X SSC is an aqueous solution (pH 7.2) containing 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate. It is desirable that the complementary strand maintain a hybridized state with the target positive strand even if washed under strong conditions.
  • a complementary strand consisting of a base sequence that is completely complementary to the target positive strand base sequence, and a base sequence having at least 80% homology with the strand. Can be exemplified.
  • Examples of stringent hybridization conditions when PCR is carried out using the polynucleotide fragment of the kit of the present invention as a primer include, for example, 10 mM Tris-HCL (pH 8.3), 50 mM KC1, 1 to
  • a PCR buffer having a composition such as 2 mM MgCl may be used, and the melting temperature (Tm) calculated from the sequence of the primer may be 5 to 10 ° C for 15 seconds to 1 minute.
  • Tm 2 X (number of adenine residues + number of thymine residues) + 4 X (number of guanine residues + number of cytosine residues)
  • Another method for detecting urothelial cancer according to the present invention includes a method for measuring the presence or amount of CXCL1 protein produced from urothelial carcinoma cells in a sample using an antibody.
  • an antibody that can be used to determine the presence and / or absence of urothelial cancer or to diagnose urothelial cancer is a human-derived CXCL1 gene, its cognate. Enables the qualitative and / or quantitative measurement of the expression level or abundance of the translation product of the body, or a variant or derivative thereof.
  • the antibody that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it specifically binds to CXCL1 protein or a fragment thereof.
  • a monoclonal antibody that can be used as a monoclonal antibody or a polyclonal antibody is used. It is preferable to do this.
  • the globulin type of the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it has the above characteristics, and may be any of IgG, IgM, IgA, IgE, and IgD, but IgG and IgM are preferred.
  • 20326 ⁇ l abl0375, Abeam
  • polyclonal antibodies are also commercially available from Abeam.
  • An antibody that specifically binds to the CX CL1 protein can also be produced by the method described below.
  • a protein to be used as an immunogen is prepared.
  • CXCL1 protein or a fragment thereof is used.
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of CXCL1 protein that can be used as an immunogen in the present invention and the cDNA sequence (SEQ ID NO: 1) encoding the protein are listed in GenBank, respectively, with accession numbers NP_001502 and NM_001511. It has been published as Therefore, it is possible to synthesize CXCL1 protein fragments for use as immunogens by publicly known methods such as solid phase peptide synthesis using publicly available amino acid sequence information. it can.
  • a carrier protein such as KLH or BSA.
  • the CXCL1 protein uses information on the cDNA encoding the CXCL1 protein, It can be obtained by using a known DNA recombination technique.
  • CDNA encoding CXCL1 protein can be prepared by cDNA cloning method. It is obtained by treating total RNA extracted from living tissue such as monocytes, melanoma cells, airway epithelial cells, keratinocytes, and alveolar macrophages that express the CXCL1 gene, which is a target in the present invention, with an oligo dT cellulose column.
  • a cDNA library can be prepared from poly A (+) RNA by RT_PCR, and the desired cDNA clone can be obtained from this library by screening such as hybridization screening, expression screening, and antibody screening. If necessary, cDNA clones can be amplified by PCR.
  • the probe or primer may be selected from among the contiguous sequences of 15 to 100 bases based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and synthesized.
  • the cDNA cloning technique is described in, for example, Sambrook, J. & Russel, D., Molecular Cloning, A LAB ORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, January 15, 2001, pp. 1.42 to 7.45. 2nd Section 8. 9. 8-8.
  • the CXCL1 protein can be obtained by, for example, incorporating a cDNA clone obtained as described above into an expression vector, and culturing a prokaryotic or eukaryotic host cell transformed or transfected with the vector. Alternatively, it can be obtained from the culture supernatant.
  • expression vectors plasmids derived from E.
  • coli eg, pET21a, pGEX4T, pC118, pC119, pC18, pC19, etc.
  • Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, etc.
  • plasmids derived from yeast eg, YEpl 3, YEp24, YCp50 and the like
  • examples of phage DNA include ⁇ phage ( ⁇ gtl l, ⁇ , etc.).
  • animal viruses such as vaccinia virus and insect virus vectors such as baculovirus can be used.
  • CXCL1 cDNA To insert CXCL1 cDNA into a vector, first, the purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into the appropriate vector restriction enzyme site or multiple cloning site, and ligated to the vector. Method is adopted.
  • the vector contains the protein
  • regulatory elements such as promoters, enhancers, polyadullation signals, ribosome binding sites, replication origins, terminators, selectable markers, etc. can be included.
  • a fusion polypeptide in which a labeling peptide is attached to the C-terminus or N-terminus of the polypeptide may be used.
  • Representative labeling peptides include histidine repeats of 6 to 10 residues, FLAG, myc peptide, GFP protein, etc.
  • the force labeling peptide is not limited to these.
  • DNA recombination techniques are described in Sambrook, J. & Russel, D. (above). A known DNA ligase is used to link the DNA fragment and the vector fragment.
  • Host cells include prokaryotic cells such as bacteria (eg, Escherichia coli, Bacillus subtilis), yeast (eg, Saccharomyces * cerevisiae), insect cells (eg, Sf cells), mammalian cells (eg, C 0 S, CH 0, BHK) can be used.
  • the method for introducing a recombinant vector into a host cell is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into each host. For example, a method using calcium ions, a method using ribosomes, an electrovolution method, And microinjection method.
  • the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the microorganism.
  • Either natural or synthetic media can be used as long as the culture can be carried out efficiently.
  • the culture is usually carried out at 37 ° C for 6 to 24 hours under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture.
  • the pH is kept near neutral.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, alkaline solution, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as necessary.
  • the culture supernatant or the protein settled in the cell is recovered after culturing in a medium suitable for each cell.
  • the medium may or may not contain serum, but culture in a serum-free medium is more desirable.
  • CXCL1 protein is produced in cells or cells, the protein is extracted by disrupting the cells or cells.
  • CXCL1 protein is produced outside the cells or cells, use the culture solution as it is, or remove the cells or cells by centrifugation or the like.
  • examples of the purification method include methods including ultrafiltration, salting out, gel filtration, ion exchange chromatography and the like.
  • the antibody that recognizes the protein thus obtained can specifically bind to the protein via the antigen-binding site of the antibody.
  • CXCL1 protein or a fragment thereof, a mutant protein or a fusion protein thereof can be used as an immunogen for producing antibodies that are immunoreactive with each other.
  • proteins, fragments, mutants, fusion proteins and the like contain antigenic determinants or epitopes that elicit antibody formation, but these antigenic determinants or epitopes may be linear, A higher order structure (intermittent) may be used.
  • the antigenic determinant or epitope can be identified by any method known in the art.
  • Antibodies of all embodiments are induced by the protein of the present invention. Once all or part of the protein or epitope has been isolated, both polyclonal and monoclonal antibodies can be prepared using conventional techniques. Examples of the method include those described in Kennet Osamu), Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Division in Biological Analyzes, Pienum Press, New York, 1980.
  • the obtained protein is dissolved in a buffer to prepare an immunogen.
  • an adjuvant may be added for effective immunization.
  • Adjuvants include commercially available complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, aluminum hydroxide Alum, muramyl peptide, etc., and any of these may be mixed.
  • the immunogen obtained as described above is administered to mammals such as rats, mice (for example, Balb / c of inbred mice), and rabbits.
  • the single dose of the immunogen is appropriately determined according to the type of immunized animal, the route of administration, etc., and is about 50 to 20 O x g per animal.
  • Immunization is performed mainly by injecting an immunogen subcutaneously or intraperitoneally.
  • the immunization interval is not particularly limited, and after the first immunization, booster immunization is performed at intervals of several days to several weeks, preferably:! To 4 weeks, 2 to 10 times, preferably 3 to 4 times.
  • the antibody titer in the serum of the immunized animal is repeatedly measured by ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sor bent Assay) method.
  • ELISA Enzyme-Linked Immuno Sor bent Assay
  • the immunogen is intravenously or intraperitoneally
  • antibody-producing cells are collected 2 to 5 days, preferably 3 days after the last immunization day. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, etc., but spleen cells or local lymph node cells are preferred.
  • a hybridoma cell line that produces a monoclonal antibody specific for each protein is also provided.
  • Such hyperpridoma can be produced and identified by conventional techniques.
  • One method for producing such a hyperidoma cell line is to immunize an animal with the protein of the invention, collect spleen cells from the immunized animal, fuse the spleen cells to a myeloma cell line, and Generating a hyperidoma cell and identifying a hyperidoma cell line that produces a monoclonal antibody that binds to the enzyme.
  • a myeloma cell line to be fused with an antibody-producing cell a generally available cell line of an animal such as a mouse can be used.
  • the cell line used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, thymine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells. Those having properties are preferred.
  • the cell line is preferably derived from an animal of the same species as the immunized animal. Specific examples of myeloma cell lines are derived from BALB / c mice P3X63_Ag. 8 strain (ATCC TIB9) which is a hypoxanthine guanine 'phosphoribosyl' transferase (HGPRT) deficient cell line.
  • HGPRT hypoxanthine guanine 'phosphoribosyl' transferase
  • the myeloma cell line and antibody-producing cells are fused.
  • cell fusion antibody-producing cells and myeloma cell lines are mixed at a ratio of 1 ::! To 20: 1 in animal cell culture media such as serum-free DMEM, RPMI-1640 media, The fusion reaction is performed in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter polyethylene glycol having an average molecular weight of 1500 to 4000 daltons can be used at a concentration of about 10 to 80%.
  • an adjuvant such as dimethyl sulfoxide may be used in combination in order to increase the fusion efficiency.
  • the antibody-producing cells and the myeloma cell line can be fused using a commercially available cell fusion device using electrical stimulation (for example, electoral position).
  • the target hyperidoma is selected from the cells after cell fusion treatment.
  • the cell suspension is appropriately diluted with, for example, RPMI-1640 medium containing fetal bovine serum, and then plated on a microtiter plate at about 2 million cells / well, and a selective medium is added to each well. Cultivation is performed by appropriately changing the selection medium.
  • the culture temperature is 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • myeloma cells are HGPRT-deficient strain or thymidine kinase-deficient strain, cells that have antibody-producing ability and myeloma cells can be obtained by using hypoxanthine'aminopterin'thymidine-containing selective medium (HAT medium). Only strains of high-pridoma can be selectively cultured and propagated. As a result, cells that grow from about 14 days after the start of culturing in the selective medium can be obtained as a hyperidoma.
  • HAT medium hypoxanthine'
  • the culture supernatant of the proliferated hyperidoma is screened for the presence of the antibody of interest.
  • Hypridoma screening is not particularly limited as long as it follows a normal method. For example, a portion of the culture supernatant contained in wells grown as wild or hybridoma is collected, and enzyme immunoassay (EIA: Enzyme Immuno Assay and ELISA), radioimmunoassay (RIA: Radio Immuno Assay), etc. Can be done. Cloning of the fused cells is carried out by limiting dilution or the like, and finally, a hyperidoma that is a monoclonal antibody-producing cell is established.
  • EIA Enzyme Immuno Assay and ELISA
  • RIA Radio Immuno Assay
  • the hyperidoma of the present invention is stable in culture in a basic medium such as RPMI-1640 or DMEM. It produces and secretes monoclonal antibodies that specifically react with CXCL1 protein derived from urothelial cancer.
  • Monoclonal antibodies can be recovered by conventional techniques. That is, as a method for collecting a monoclonal antibody from the established hybridoma, a normal cell culture method or ascites formation method can be employed. In the cell culture method, Hypridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium, MEM medium or serum-free medium containing 10% ushi fetal serum under normal conditions (for example, 37 ° C, 5% CO 2). Concentration) 2 ⁇ : 10 days
  • the monoclonal antibodies of the present invention include chimeric antibodies, for example, humanized forms of murine monoclonal antibodies.
  • the present invention also provides an antigen-binding fragment of the above antibody. Examples of antigen-binding fragments that can be produced by conventional techniques include Fab and F (ab ') fragments
  • Antibody fragments and derivatives that can be produced by genetic engineering techniques are also provided.
  • the antibody of the present invention can be used in an assay for detecting the presence of the polypeptide of the present invention or a (poly) peptide fragment thereof both in vitro and in vivo.
  • the antibodies of the present invention can also be used to purify proteins or protein fragments by immunoaffinity chromatography.
  • the method of the present invention is preferably any of a measurement method using the above-described antibody of the present invention, that is, an immunological measurement method, or a method of measuring the expression level of a gene encoding CXCL1 protein.
  • immunological methods include enzyme immunoassay (ELISA, EIA), fluorescence immunoassay, radioimmunoassay (RIA), luminescence immunoassay, immunoturbidimetric method, latex agglutination, latex Examples include turbidimetry, hemagglutination, particle agglutination, or Western plotting.
  • Quantitative RT-PCR method DNA array method, Northern blot method, Northern hybridization method, Southern blot method, Southern hybridization method can be used to measure the expression level of gene-derived nucleic acid. Law.
  • a sample to be tested may be a biological sample that may contain CXCL1 protein derived from urothelial ganglia or a nucleic acid derived from a gene encoding the protein. If it is not particularly limited.
  • the measured value of CXCL1 protein obtained from a body fluid sample such as urine, blood, plasma, and serum is useful as an index of urothelial cancer.
  • the urothelial cancer detection method of the present invention is very useful as a simple detection method because it can be detected not only in cancer tissues but also in blood and urine.
  • the protein detection method of the present invention is carried out by an immunoassay using a label such as an enzyme immunoassay, a fluorescence immunoassay, a radioimmunoassay, or a luminescence immunoassay
  • a label such as an enzyme immunoassay, a fluorescence immunoassay, a radioimmunoassay, or a luminescence immunoassay
  • the antibody of the present invention It is preferable to immobilize the components in the sample or to immobilize the components in the sample and perform their immunological reaction.
  • solid phase carrier polystyrene, polycarbonate, polytoluene toluene, polypropylene, polyethylene, poly salt bulbu, nylon, polymetatalylate, latex, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, glass, metal, ceramics or Beads, microplates, test tubes, sticks or test pieces made of magnetic materials (test strips)
  • An insoluble carrier having a shape such as (a) can be used.
  • the solid phase can be formed by binding the solid phase carrier and the antibody or sample component of the present invention according to a known method such as a physical adsorption method, a chemical binding method, or a combination thereof.
  • the antibody of the present invention is labeled in order to easily detect the reaction between the antibody of the present invention and the CX CL1 protein derived from urothelial cancer cells in a sample.
  • the reaction is detected directly or indirectly by using a labeled secondary antibody.
  • it is preferable to use the latter indirect detection (for example, a sand switch method) in terms of sensitivity.
  • labeling substance in the case of enzyme immunoassay, peroxidase (POD), alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, urease, catalase, gnorecosidase, lactate dehydrogenase, amylase or piotin avidin complex, etc.
  • POD peroxidase
  • fluorescence immunoassay fluorescein isothiocyanate, tetramethylrhodamine sothiocyanate, substituted rhodamine isothiocyanate, dichlorotriazine isothiocyanate, Alexa or AlexaFluoro, etc.
  • tritium iodine 125, iodine 131 or the like can be used.
  • NADH—, FMNH 2 —, luciferase system, luminol hydrogen peroxide POD system, acrylidine ester system, dioxetane compound system, etc. can be used for the luminescence immunoassay.
  • the labeling substance and the antibody are bound by a known method such as the dartal aldehyde method, the maleimide method, the pyridinoresisulfide method or the periodic acid method.
  • a known method such as the dartal aldehyde method, the maleimide method, the pyridinoresisulfide method or the periodic acid method.
  • known methods such as the chloramine T method and the Bolton Hunter method can be used.
  • the measurement can be performed by a known method (Current protocols in Protein Sciences, 1995, John Wiley & Sons Inc., Current protocols in Immunology, 2001, John Wiley & Sons Inc.).
  • the components in the sample are immobilized and brought into contact with the labeled antibody of the present invention to form a CXCL1 protein-antibody of the present invention complex.
  • Unbound labeled antibody can be washed and separated, and the amount of CXCL1 protein in the sample can be measured from the amount of bound labeled antibody or the amount of unbound labeled antibody.
  • a labeled secondary antibody is used, the antibody of the present invention is reacted with a sample (primary reaction), and further, a labeled secondary antibody is reacted (secondary reaction).
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at different times.
  • the primary reaction and secondary reaction form a complex of immobilized CXCL1 protein-antibody of the present invention with a single labeled secondary antibody, or a solid phase of immobilized antibody of the present invention with one CXCL1 protein and a labeled secondary antibody.
  • the unbound labeled secondary antibody can be washed and separated, and the amount of CXCL1 protein in the sample can be measured from the amount of bound labeled secondary antibody or the amount of unbound labeled secondary antibody.
  • a substrate is reacted with a labeled enzyme under the optimum conditions, and the amount of the reaction product is measured by an optical method or the like.
  • fluorescence immunoassay the fluorescence intensity by the fluorescent substance label is measured.
  • radioimmunoassay the amount of radioactivity by the radioactive substance label is measured.
  • luminescence immunoassay measure the amount of luminescence by the luminescence reaction system.
  • immune complex aggregates such as immunoturbidimetry, latex agglutination, latex turbidimetry, erythrocyte agglutination or particle agglutination are generated, and the transmitted light and scattered light are optically transmitted.
  • a phosphate buffer solution, a glycine buffer solution, a Tris buffer solution or a Good buffer solution can be used as the solvent, and polyethylene glycol or the like can be used.
  • reaction accelerators and non-specific reaction inhibitors may be included in the reaction system.
  • the antibody of the present invention is immobilized on an insoluble carrier as a primary antibody.
  • the solid phase surface on which the antigen is not adsorbed is blocked with a protein unrelated to the antigen (eg, baby serum, rabbit serum albumin, gelatin).
  • a protein unrelated to the antigen eg, baby serum, rabbit serum albumin, gelatin.
  • the immobilized primary antibody is brought into contact with the test sample.
  • a labeled secondary antibody that reacts with the CXCL1 protein at a site different from the primary antibody is contacted, and a signal from the label is detected.
  • second antibody that reacts with the CXCL1 protein at a site different from the primary antibody refers to the type of immunogen that is not particularly limited as long as it recognizes sites other than the binding site between the primary antibody and CXCL1 protein.
  • polyclonal antibody, antiserum, monoclonal anti can be used in any form of the body (Fab, F (ab '), Fab, Fv, ScF
  • V etc. can also be used.
  • multiple types of monoclonal antibodies may be used as secondary antibodies.
  • the antibody of the present invention is labeled to give a secondary antibody, and an antibody that reacts with the CXCL1 protein at a site different from the antibody of the present invention is immobilized on an insoluble carrier as a primary antibody.
  • the immobilized primary antibody may be brought into contact with a test sample, and then the antibody of the present invention labeled as a secondary antibody may be contacted to detect a signal from the label.
  • the antibody of the present invention specifically reacts with CXCL1 protein derived from urothelial cancer cells, and thus can be used as a diagnostic agent for cancer.
  • the diagnostic agent of the present invention contains the antibody of the present invention, and therefore, using the diagnostic agent of the present invention, the urinary tract contained in a sample collected from an individual force suspected of suffering from urothelial cancer. By detecting CXCL1 protein derived from skin cancer cells, it is possible to diagnose morbidity of urothelial cancer in the individual.
  • the diagnostic agent of the present invention can be used in any means as long as it is a means for performing an immunological measurement.
  • the immunochromatographic test strip known in the art can be used. By using in combination with simple means, cancer can be diagnosed more easily and quickly.
  • the immunochromatographic test strip includes, for example, a sample receiving portion made of a material that easily absorbs a sample, a reagent portion containing the diagnostic agent of the present invention, a developing portion where a reaction product of the sample and the diagnostic agent moves, and a developing strip.
  • the labeling part for coloring the reaction product, the presentation part for developing the colored reaction product, etc. can be configured in the same manner as the pregnancy diagnostic drug.
  • the sample receiving portion absorbs the sample and causes the sample to reach the reagent portion.
  • a reaction between the CXCL1 protein derived from urothelial cancer cells in the sample and the antibody of the present invention occurs, and the reacted complex moves through the development part and reaches the labeling part.
  • the labeling part when the reaction between the reaction complex and the labeled secondary antibody occurs, and the reaction product with the labeled secondary antibody expands to the presentation part, a coloring power S is recognized.
  • the immunochromatographic test strips can be used for monitoring at home because they do not give the user any pain or danger due to reagent use.
  • Treatment surgical It can be used to prevent metastasis and recurrence.
  • this test strip can be mass-produced at low cost by a manufacturing method as described in, for example, JP-A-10-54830.
  • the diagnostic agent of the present invention in combination with a diagnostic agent for a known tumor marker of urothelial cancer, a more reliable diagnosis can be made.
  • the present invention also relates to a diagnostic kit for urothelial cancer comprising an antibody or a fragment thereof that specifically reacts with CXCL1 protein or a fragment thereof.
  • the antibody may be bound to the solid phase carrier as described above.
  • the kit of the present invention may contain a labeled secondary antibody, a carrier, a washing buffer, a sample diluent, an enzyme substrate, a reaction stop solution, a purified CXCL1 protein as a standard substance, and the like.
  • Normal urothelial cells were obtained from normal ureters from patients with nephrectomy. Urinary epithelial cells extracted from normal ureters were cultured in a 10 cm culture dish using Defined KSFM medium (Scriven, S. D. et al., 1997, Journal of Urology, 158, p. 1147-1152). 90 urothelial cells cultured in 4 culture dishes with a diameter of 10 cm. When it became / o confluent, it was washed 3 times with PBS (-), and then the medium was changed to RPMI1640 medium without serum and cultured for 24 hours, and the culture supernatant was collected.
  • This culture supernatant was treated by ultracentrifugation (150,000 g, 30 minutes, 4 ° C) to remove the precipitate, and then the supernatant was concentrated by centrifugation using Amicon Ultra-15 (Millipore). (4,000 g, 20 minutes, 4 ° C). As a result, 1 mg of protein was extracted from 40 mL of the cultured cell supernatant.
  • Bladder cancer cell lines (RT112, 5637, T24, and EJ) were cultured with RPMI1640 containing 10% urine fetal serum, and normal urothelial epithelial cells were cultured with defined-KSFM.
  • Total RNA was prepared from these cells using Trizol reagent (Invitrogen) and RNeasy Mini kit (Qiagen) according to the recommended protocol.
  • CDNA was synthesized from TotalRN A 3 microg using First-Strand cDNA sysnthesis kit (Amersham Biosciences). Using these cDNAs as templates, primers for CXCL1, one of the growth factors found from proteome analysis, and its receptor, CXCR2, were designed, and gene expression was determined by RT-PCR.
  • agarose gel electrophoresis with molecular weight as an index (Fig. 1).
  • Hi-Lo DNA Marker (BIONEXUS) was used as a molecular weight marker.
  • CXCL1 mRNA expression was highly expressed in 5637 and T24, which are cell lines derived from invasive bladder cancer. Although expression was detected in normal tissues, it was found to be less severe than cell lines derived from invasive cancer.
  • Bladder cancer cell lines (5637, T24) were each RPMI1 640 containing 10% urine fetal serum, and normal urothelial cells were defined--cultured with KSFM. Each cell was cultured in a 96-well plate for 24 hours, and the culture medium was exchanged when the cells were almost confluent. Furthermore, the culture supernatant was collected after 24 hours. The CXCL1 protein concentration in each culture supernatant was measured using Human GRO alpha / CXCLl Quantikine ELISA kit (R & D Systems).
  • CXCL1 was not detected in the culture supernatant of normal urothelial cells, but it was a high concentration of about 5 to 2 Ong / mL or more in the culture supernatant of 5637, T24 derived from invasive cancer. CXCL1 was detected ( Figure 2).
  • a urine sample was obtained from 3 patients with invasive bladder cancer and 1 healthy control, and the urinary CXC L1 protein concentration was measured using Human GR0 alpha / CXCLl Quantikine ELISA kit (R & D Systems). In each sample, urine Creathun concentration When the CXCL1 protein concentration was corrected using the degree of urine, a higher urinary CXCL1 protein concentration was detected in bladder cancer patients than in healthy controls (FIG. 3).
  • Urine samples were obtained from 32 early-stage (Ta) bladder cancer patients, 35 advanced (T1 or higher) bladder cancer patients and 40 healthy controls, and the urinary CXCL1 protein concentration was determined using Human GR ⁇ alpha / CXCLl. Measurement was performed using Quantikine ELISA kit (R & D Systems). Higher urinary CXCL1 protein levels were detected in patients with early and advanced bladder cancer than in healthy controls ( Figure 4).
  • the expression or expression level of the CXCL1 gene in the urothelial tissue or cells using the above-described antibody or nucleic acid probe is measured and compared with a control. It is possible to effectively detect early or advanced urothelial cancers such as bladder cancer, using as an index the detection or increase in the expression level.
  • the present invention it is possible to effectively detect urothelial cancer by a simple and inexpensive method. Therefore, early detection, diagnosis and treatment of urothelial cancer are possible.
  • the method of the present invention enables non-invasive detection of urothelial cancer using patient urine, so that urothelial cancer can be detected easily and quickly.

Abstract

　本発明は、被験者由来の生体試料中のＣＸＣＬ１タンパク質、または該タンパク質をコードする遺伝子の発現、をインビトロで測定することを含む、尿路上皮ガンを検出する方法、ならびに、該タンパク質または遺伝子に特異的に結合可能な抗体または核酸プローブを含む尿路上皮ガン診断用キットに関する。

Description

明 細 書
尿路上皮ガンの検出用キットおよび方法
技術分野
[0001] 本発明は、尿路上皮ガンの検出または診断に有用な CXCL1タンパク質、あるいは 該タンパク質をコードする遺伝子の発現、を測定することによる尿路上皮ガンの検出 方法に関する。
[0002] 本発明はまた、尿路上皮ガンの検出のために使用される、該タンパク質あるいは遺 伝子と結合可能な物質を含む該ガンの診断用キットに関する。
背景技術
[0003] 尿路上皮ガンとは、膀胱ガンと腎盂ガン、尿管ガンなどの総称であり、これらのガン はいずれも尿路の移行上皮細胞がガン化したものであり、その性質は共通であると 考えられる。尿路上皮ガンは尿路性器ガンでは前立腺ガンに次いで罹患者が多ぐ 2 001年の日本国厚生労働省大臣官房統計情報部「人口動態統計」では、膀胱ガンだ けでも日本国の年間'濯唐、数は男 9765人、女 3243人、死亡数は男 3459人、女 158 7人に上る。腎盂ガン、尿管ガンは比較的少なぐ死亡数はそれぞれ男女合わせて 7 97人、 713人とされてレヽる。
[0004] 膀胱ガンまたはその他の尿路上皮ガンの予防に関する研究はないが、膀胱ガンは 50歳以上に好発し、男性が女性の 2〜3倍の頻度で発症する。また喫煙者は非喫煙 者に比べて 4倍程度発生率が高いと考えられてレ、る。膀胱ガンには大きく分けて 2つ のタイプがあり、表在性乳頭状ガンは比較的悪性度の低いガンで、膀胱の内腔 (膀 胱の内面）に突出するが根は浅ぐ表面は乳頭状 (カリフラワーの様）で狭い茎を持 つ。内視鏡的に治療できるが、半数以上の患者で膀胱内に再発する。ガンの深さは 粘膜下に及ぶ場合もあるが、膀胱の筋肉層には達しない。これに対して浸潤性ガン は悪性度の高いガンで、根が広ぐ膀胱の壁深部まで浸潤する傾向があり、転移する こともある。したがって膀胱摘出、抗ガン剤の使用、放射線療法など、体に負担のか 力る治療が必要となる。
[0005] 膀胱ガンの症状で一番多いものは痛みのない血尿である力 尿の回数が多い、排 尿時の痛み、排尿後もスッキリしない、などの膀胱炎症状の場合もある。診断には尿 検查 (細胞診）、 X線撮影、内視鏡などが利用される。し力 ながら、早期診断に有用 な血液や尿で利用可能な特異的で感度が高い腫瘍マーカーが存在せず、ガンが進 行してしまつてから検査によって発見となる場合が多い。また膀胱以外の部位で発生 する尿路上皮ガンも同じ性質を持っている。したがって、尿路上皮ガン、特に膀胱ガ ンのための特異的で感度が高い腫瘍マーカーによる、簡便な検查方法の実用化が 期待されている。
[0006] 膀胱ガンの検査 '判定のための種々のマーカー及び方法が提案されている。例え ばヌクレオホスミン/ B23(特許文献 1)、 HURP (特許文献 2)、 CYP4B1又は CYP4B 2(特許文献 3)などの遺伝子の発現レベルの変化によって膀胱ガンを判定する方法、 尿検体中の特定のタンパク質の存在又は量によって判定する方法 (特許文献 4、特 許文献 5)、血液中の可溶性 Fas濃度を指標として判定する方法 (特許文献 6)などを 挙げることができる。
特許文献 1 :特開 2004— 337120
特許文献 2：特開 2004— 248508
特許文献 3：特開 2002— 238599
特許文献 4：特開 2004— 61288
特許文献 5：特開平 7 _ 309895号公報
特許文献 6 :特開 2000— 131321
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明の課題は、新規な尿路上皮ガン腫瘍マーカーを見出し、尿路上皮ガン、特 に膀胱ガンを効果的に検出できる方法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、 CXCL1タンパク質を腫瘍 マーカーとして、これに特異的に結合する抗体、あるいは該タンパク質をコードする 遺伝子、その転写産物またはその cDNAに結合可能な核酸、を用いることにより、尿 路上皮ガンを有意に検出できることを見いだし、本発明を完成するに至った。 [0009] <発明の概要 >
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
[0010] (1)被験者由来の生体試料中の CXCL1タンパク質、または該タンパク質をコードす る遺伝子の発現、をインビトロで測定することを含む、尿路上皮ガンを検出する方法。
[0011] (2)前記タンパク質量または前記遺伝子の発現量を測定する、 （1)に記載の方法。
[0012] (3)前記タンパク質量または前記遺伝子の発現量が、対照試料のものと比べて有意 に増大していることを指標にする、 （1)または（2)に記載の方法。
[0013] (4)前記増大が 2倍以上である、 （3)に記載の方法。
[0014] (5)前記増大が 3倍以上である、 （3)に記載の方法。
[0015] (6)前記測定が免疫学的方法によるものである、（1)〜（5)のいずれかに記載の方 法。
[0016] (7)前記測定がハイブリダィゼーシヨンによるものである、（1)〜（5)のいずれかに記 載の方法。
[0017] (8)前記測定が、前記タンパク質または前記遺伝子と結合可能な物質を用いて行わ れる、（1)〜（7)のいずれかに記載の方法。
[0018] (9)前記タンパク質と結合可能な物質が抗体またはその断片である、（8)に記載の方 法。
[0019] (10)前記遺伝子と結合可能な物質が核酸プローブである、 （8)に記載の方法。
[0020] (11)前記核酸プローブが、配列番号 1で表される塩基配列もしくはその変異体から なる核酸、その相補的配列からなる核酸、それらの核酸とストリンジェントな条件でハ イブリダィズする核酸、またはそれらの 15以上の連続した塩基を含む断片からなる、 (10)に記載の方法。
[0021] (12)前記抗体または核酸プローブが標識されている、（9)〜（： 11)のいずれかに記 載の方法。
[0022] (13)前記タンパク質またはその断片と特異的に結合する抗体またはその断片を用 いて、試料中の該タンパク質を免疫学的に測定し、該タンパク質の量が対照試料の ものと比べて増大していることを指標にして尿路上皮ガンを検出することを含む、（1) 〜（6)、（8)、 （9)及び（12)のいずれかに記載の方法。 [0023] (14)配列番号 1で表される塩基配列もしくはその変異体からなる核酸、その相補的 配列からなる核酸、それらの核酸とストリンジェントな条件でハイブリダィズする核酸、 またはそれらの 15以上の連続した塩基を含む断片からなるプローブを用いて、試料 中の前記遺伝子の発現量を測定し、該発現量が対照試料のものと比べて増大して レ、ることを指標にして尿路上皮ガンを検出することを含む、（1)〜（5)、（7)、（8)、 (1 0)〜（： 12)のレ、ずれかに記載の方法。
[0024] (15)前記尿路上皮ガンが膀胱ガン、腎盂ガン、尿管ガンおよび尿道ガンからなる群 力も選択される、 (1)〜（14)のいずれかに記載の方法。
[0025] (16)前記試料が血液、血漿、血清または尿である、（1)〜（15)のいずれかに記載 の方法。
[0026] (17)前記試料が尿路上皮組織または細胞である、 （1)〜（15)のレ、ずれかに記載の 方法。
[0027] (18)前記タンパク質が、配列番号 2に示されるアミノ酸配列またはその変異体配列を 有する、（1)〜（6)、（8)、 (9)、 (12)、（13)、（15)〜（： 17)のいずれかに記載の方法
[0028] (19)前記遺伝子が、配列番号 1に示される塩基配列またはその変異体配列を有す る、（1)〜（5)、 (7)、 (8)、（10)〜（12)、（14)〜（： 17)のいずれかに記載の方法。
[0029] (20) CXCL1タンパク質またはその断片と特異的に結合する、抗体もしくはその断片 またはそれらの化学修飾誘導体を含む、尿路上皮ガン診断用キット。
[0030] (21)前記タンパク質が、配列番号 2に示されるアミノ酸配列またはその変異体配列を 有する、 (20)に記載のキット。
[0031] (22)前記タンパク質の断片力 S、少なくとも 8個のアミノ酸からなるェピトープを含む、 (
20)または（21)に記載のキット。
[0032] (23)前記尿路上皮ガンが膀胱ガン、腎盂ガン、尿管ガン及び尿道ガンからなる群か ら選択される、（20)〜（22)のいずれかに記載のキット。
[0033] (24)前記抗体またはその断片が固相担体に結合されている、（20)〜（23)のいず れかに記載のキット。
[0034] (25)前記抗体またはその断片と結合可能な標識二次抗体をさらに含む、（20)〜（2 4)のいずれかに記載のキット。
[0035] (26)前記二次抗体の標識が酵素、蛍光または放射性標識である、 (25)に記載のキ ッ卜。
[0036] (27)配列番号 1で表される塩基配列もしくはその変異体配列からなる核酸、その相 補的配列からなる核酸、それらの核酸とストリンジェントな条件でハイブリダィズする核 酸、もしくはそれらの 15以上の連続した塩基を含む断片、またはそれらの化学修飾 誘導体を含む、尿路上皮ガン診断用キット。
[0037] (28)前記核酸が、配列番号 1に示される塩基配列またはその変異体配列を有する、
(27)に記載のキット。
[0038] (29)前記尿路上皮ガンが膀胱ガン、腎盂ガン、尿管ガン及び尿道ガンからなる群か ら選択される、（27)または（28)に記載のキット。
[0039] (30)前記核酸が固相担体に結合されている、 （27)〜（29)のいずれかに記載のキ ッ卜。
[0040] (31)前記固相担体が DNAチップまたはマイクロアレイの基板である、 (30)に記載 のキット。
[0041] (32)上記 (20)〜（31)のいずれかに記載のキットの、被験者における尿路上皮ガン のインビトロ検出のための使用方法。
[0042] <用語の定義 >
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。
[0043] 核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質 などの略号による表示は、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のた めのガイドライン」（日本国特許庁編)及び当技術分野における慣用に従うものとする
[0044] 本明細書において「CXCL1」（Chemokine (C—X—C motif) ligand 1、 G R〇一ひ 、 GRO— 1、 melanoma growth stimulating activity, alpha)タンノ ク質とは、 C—X—Cケモカインファミリーに属するアミノ酸 107残基からなる分子量約 1. lkDaのタンパク質である。このタンパク質は、 7回膜貫通型受容体である CXCR1 および CXCR2のリガンドとして作用し、これらの受容体を発現する好中球、好塩基 球、マスト細胞などの遊走を引き起こす（Richmond, Aら、 1988、 EMBO journal 、第 7卷、 p. 2025— 712033など）。またヒト悪性黒色腫での細胞分裂誘導因子とし ての活性が報告されている（Anisowicz, Aら、 1987、 Proceedings of the nati onal Academy of Sciences, USA、第 84卷、 p. 7188— 7192)。
[0045] 本明細書において「核酸」とは、 RNA及び DNAのいずれも包含するものとして用 レヽられる。なお、上記 DNAには、 cDNA、ゲノム DNA、及び合成 DNAのいずれも が含まれる。また上記 RNAには、 totalRNA, mRNA、 rRNA、及び合成 RNAのい ずれもが含まれる。また、本明細書では、核酸はポリヌクレオチドと互換的に使用され る。
[0046] 本明細書において「cDNA」とは、遺伝子の発現によって生じた RNAに相補的な 配列の DNA鎖全長、及びその部分配列からなる DNA断片、を包含する。 cDNAは 、 RNAを铸型にして、ポリ Tプライマーを用いる RT— PCR (逆転写酵素一ポリメラー ゼ連鎖反応)によって合成されうる。
[0047] 本明細書において「遺伝子」とは、 2本鎖 DNAのみならず、それを構成する正鎖（ またはセンス鎖）または相補鎖ほたはアンチセンス鎖）などの各 1本鎖 DNAを包含 することを意図して用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。 従って、本明細書において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノム DNAを含む 2本鎖 DNA、 cDNAを含む 1本鎖 DNA (正鎖）、該正鎖と相補的な配列を有する 1 本鎖 DNA (相補鎖）、及びこれらの断片のいずれも含む。また該「遺伝子」は特定の 塩基配列 (または配列番号)で示される「遺伝子」だけではなぐこれらによってコード されるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質、例えば同族体 (すなわち 、ホモログ）、スプライスバリアントなどの変異体、及び誘導体をコードする「遺伝子」が 包含される。かかる同族体、変異体または誘導体をコードする「遺伝子」としては、具 体的には、後に記載したストリンジェントな条件下で、配列番号 1で示される塩基配列 の相補配列とハイブリダィズする塩基配列を有する「遺伝子」を挙げることができる。
[0048] 例えばヒト由来のタンパク質の同族体（すなわち、ホモログ）またはそれをコードする 遺伝子としては、当該タンパク質またはそれをコードするヒト遺伝子に対応する他生 物種のタンパク質または遺伝子が例示でき、これらのタンパク質または遺伝子ホモ口 グは、 HomoloGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homoloGene/)により同 定することができる。具体的には特定のヒトアミノ酸または塩基配列を BLASTプログ フム (Kariin, S.ら、 Proceedings of the National Academic Sciences U.S. A .、 1993年、第 90卷、 p.5873— 5877、 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAS T/)にかけて一致する（Scoreが最も高ぐ E_valueが 0でかつ Identifyが 100%を 示す）配列の登録番号（accession number)を取得することができる。 BLASTプロ グラムとしては、 BLASTN (遺伝子）、 BLASTX (タンパク質)などが知られている。例 えば、遺伝子検索の場合、上記 BLAST検索からの登録番号を UniGene (http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/UmGene/)に入力して得られに UniGeneClusterlD (H s.で示す番号）を HomoloGeneに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子と ヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示される ヒト遺伝子に対応する遺伝子ホモログとして、他生物種の遺伝子を選抜することがで きる。またこの方法において、 BLASTプログラムの代わりに FASTAプログラム（http ://www.ddbj . nig. ac. jp/ search/ fasta—— e. html)を用レヽ" O よレヽ。
[0049] なお、「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなぐ例えば発現制御領域、コー ド領域、ェキソンまたはイントロンを含むことができる。
[0050] 本明細書において「転写産物」とは、遺伝子の DNA配列を铸型にして合成された メッセンジャー RNA (mRNA)のことをいう。 RNAポリメラーゼが遺伝子の上流にある プロモーターと呼ばれる部位に結合し、 DNAの塩基配列に相補的になるように 3'末 端にリボヌクレオチドを結合させてレ、く形で mRNAが合成される。この mRNAには遺 伝子そのもののみならず、発現制御領域、コード領域、ェキソンまたはイントロンをは じめとする転写開始点からポリ A配列の末端にいたるまでの全配列が含まれる。
[0051] 本明細書において「翻訳産物」とは、転写によって合成された mRNA力 スプライ シングなどの修飾を受ける/受けないにかかわらず、その情報を元に合成されたタン パク質を示す。 mRNAの翻訳過程においては、まずリボソームとメッセンジャー RNA が結合し、次に mRNAの塩基配列に従ってアミノ酸がつながつていき、タンパク質が 合成される。
[0052] 本明細書において「プローブ」とは、遺伝子の発現によって生じた RNAまたはそれ に由来する核酸を特異的に検出するために使用される核酸及び/またはそれに相 補的な核酸を包含する。
[0053] 本明細書において「プライマー」とは、遺伝子の発現によって生じた RNAまたはそ れに由来する核酸を特異的に認識し、増幅する、連続する核酸及び Zまたはそれに 相補的な核酸を包含する。
[0054] ここで相補的な核酸湘補鎖、逆鎖）とは、配列番号によって定義される塩基配列 からなる核酸の全長配列、またはその部分配歹 1J、 （ここでは便宜上、これを正鎖と呼 ぶ）に対して A:T (U)、 G : Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関 係にある核酸を意味する。ただし、力かる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完 全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件で ノ、イブリダィズできる程度の相補関係を有するものであってもよい。
[0055] 本明細書において「ストリンジヱントな条件」とは、プローブが他の配列に対するより も、検出可能により大きな程度（例えばバックグラウンドよりも少なくとも 2倍）で、その 標的配列に対してハイブリダィズする条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存 性であり、ハイブリダィゼーシヨンが行われる環境によって異なる。ハイブリダィゼーシ ヨン及び/または洗浄条件のストリンジエンシーを制御することにより、プローブに対 して 100%相補的である標的配列が同定され得る。
[0056] 本明細書において「変異体」とは、核酸の場合、多型性、突然変異、転写時の選択 的スプライシングなどに起因した天然の変異体、同族体、あるいは遺伝暗号の縮重 に基づく変異体、あるいは配列番号 1で表される塩基配歹 1ほたはその部分配列にお いて 1以上、好ましくは 1もしくは数個、の塩基の欠失、置換、付加または揷入を含む 変異体、あるいは該塩基配列またはその部分配列と約 80%以上、約 85%以上、好 ましくは約 90。/o以上、より好ましくは約 95%以上、約 97%以上、約 98。/0以上、もしく は約 99%以上の％同一性を示す変異体、あるいは該塩基配列またはその部分配列 を含むポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと上記定義のストリンジヱントな条件 でハイブリダィズする核酸を意味し、一方、タンパク質またはペプチドの場合、配列番 号 2で表されるアミノ酸配列またはその部分配列おいて 1以上、好ましくは 1もしくは 数個、のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を含む変異体、あるいは該アミノ酸 配列またはその部分配列と約 80%以上、約 85%以上、好ましくは約 90%以上、より 好ましくは約 95%以上、約 97%以上、約 98%以上、もしくは約 99%以上の％同一 性を示す変異体を意味する。
[0057] 本明細書において「数個」とは、約 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3または 2個以下の整数 を意味する。
[0058] 本明細書において「％同一性」は、上記の BLASTや FASTAによるタンパク質ま たは遺伝子の検索システムを用いて、ギャップを導入して、決定することができる（Ka rim, S.ら、 1993年、 Proceedings oi the National Academic Sciences U. ¾ . A.、第 90卷、 p.5873-5877 ;Altschul, S. F.ら、 1990年、 Journal of Mole cular Biology,第 215卷、 p. 403— 410 ; Pearson, W. R.ら、 1988年、 Procee dings of the National Academic Sciences U. S. A.、第 85卷、 p.2444-244 8)。
[0059] 本明細書において「誘導体」とは、核酸の場合、蛍光団、放射性同位元素などによ るラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド (例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキ シなどのアルコキシ、チォ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド、ビォチン 化ヌクレオチド、および塩基の再構成、二重結合の飽和、脱ァミノ化、酸素分子の硫 黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど)を含む誘導体など、一方、タンパク質 の場合、ァセチル化、ァシル化、アルキル化、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、ピオ チン/アビジン化、ラベル化（例えば酵素、蛍光団、発光物質などのラベル)などの化 学修飾誘導体を意味する。
[0060] 本明細書において「診断ほたは検出もしくは判定)用キット」とは、尿路上皮ガンの 罹患の有無、罹患の程度もしくは改善の有無や改善の程度を診断するために、また 尿路上皮ガンの予防、改善または治療に有用な候補物質をスクリーニングするため に、直接または間接的に利用されるものをいう。これには尿路上皮道ガンの罹患に関 連して生体内、特に尿路上皮組織において発現が変動する遺伝子を特異的に認識 し、また結合することのできるヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、こ れらのヌクレオチドが包含される。これらのオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド は、上記性質に基づいて生体内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子を検出 するためのプローブとして、また生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのブラ イマ一として有効に利用することができる。またこれには該遺伝子の翻訳産物である タンパク質を検出することができる抗体も包含される。
[0061] 本明細書において検出 ·診断対象となる「生体試料」とは、尿路上皮ガンの発生に ともない本発明のタンパク質および Zまたは遺伝子が発現変化する試料 (または検体
)であり、被験者から採取された試料を指す。具体的には、該試料には、尿路上皮組 織及びその周辺のリンパ節、また転移が疑われる他臓器、血液、血清、血漿、リンパ 球培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹水などの体液、さらに細胞または臓器の抽出液 などが含まれる。
[0062] 本明細書において「尿路上皮ガン」とは、腎杯、腎盂、尿管、膀胱、尿道にある移行 上皮部に発生するガンを意味する。尿路上皮ガンの例としては、例えば、膀胱ガン、 腎盂ガン、尿管ガン、尿道ガンが挙げられ、本発明は特に、膀胱ガンの検出におい て好ましく使用される。
[0063] 本明細書において「被験者」とは、尿路上皮ガンをもつ動物、好ましくは哺乳動物、 より好ましくはヒトを指す。
[0064] 本明細書において「特異的」とは、特定のタンパク質または核酸のみを認識するか
、あるいはそれらとのみ結合または反応することを意味する。
発明の効果
[0065] 本発明により、尿路上皮ガンを容易にかつ高い信頼度で検出することが可能にな つた。例えば、患者の尿中の CXCL1濃度/クレアチュン濃度の割合を測定するだけ で、容易に尿路上皮ガンであるか否力を判定することができる。この場合、特に浸潤 性腫瘍の検出に有効である。
[0066] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-255370号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0067] [図 1]膀胱ガン株化細胞および正常尿皮上皮細胞における CXCL1の RT— PCR測 定による mRN A発現量比較。
[図 2]膀胱ガン株化細胞および正常尿皮上皮細胞の培養上清における CXCL1タン パク質発現量。
[図 3]膀胱ガン患者の尿中における CXCL1タンパク質発現。
[図 4]膀胱ガン患者の尿中における CXCL1タンパク質発現量の測定。 白丸は各々 のデータの数値を示し、平均値と標準誤差を +字で示した。 *は危険率 Pく 0. 001で 健常人 (対照）と早期ガン患者 (Ta)の間に有意な差があることを示す。 +は危険率 P < 0. 01で早期ガン患者と進行ガン患者 (T1以上）の間に有意な差があることを示す
[図 5]膀胱ガン患者の組織中における CXCL1タンパク質発現の免疫染色図。進行 ガン (PT2G3)およびリンパ節転移巣では強く染色が見られる。これに対して、正常 尿路上皮組織 (pTaGl)では染色が見られなかった。
発明を実施するための最良の形態
[0068] 本発明者らは、今回、正常尿路上皮細胞と比較して膀胱ガン患者由来のガン細胞 におレ、て発現が増強するタンパク質につレ、て、それぞれの細胞培養上清のプロテオ ーム解析によりスクリーニングを行った。その結果、全長 CXCL1タンパク質について 、正常尿路上皮細胞の培養上清よりもガン細胞の培養上清において多く検出される ことを見出した。ここで、正常尿路上皮細胞とは、尿路上皮ガンに罹患していない腎 摘出症例患者の正常尿管から得られた上皮細胞である。
[0069] 本発明者らはまた、膀胱ガン患者のガン摘出手術前と手術後の血液および尿中の CXCL1タンパク質の量を免疫学的方法によって測定したところ、 CXCL1タンパク質 は、膀胱ガン摘出前の患者の血液および尿において、膀胱ガン摘出後に比べて高 度に検出されることを見出した。
[0070] 本発明者らはさらに、膀胱ガン患者由来の細胞と正常尿路上皮細胞に発現してい る totalRNAを回収し、該 totalRNA中の CXCL1をコードする遺伝子の発現量を D NAアレイ法および定量 PCR法によって測定し、膀胱ガン患者由来の細胞において CXCL1をコードする mRNA量が正常細胞に比べて増加していることを見出した。
[0071] したがって、本発明は、その一の態様において、被験者由来の生体試料中の CXC L1タンパク質、または該タンパク質をコードする遺伝子の発現、をインビトロで測定す ることを含む、尿路上皮ガンを検出する方法を提供する。 [0072] 本発明の方法では、一般に、生体試料中の上記タンパク質の存在または存在量、 あるいは、上記遺伝子の発現または発現量が測定される。ここで、本発明における標 的タンパク質または遺伝子は、被験者の種類 (例えば人衝ゃ個体に依存した多型性 、スプライス変異などに起因した変異体も包含する。このようなタンパク質の存在や量 、あるいは遺伝子の発現や発現量は、該タンパク質または遺伝子と特異的に結合可 能な物質を用いて測定することができる。そのような物質には、以下で説明するような 抗体、核酸プローブなどが含まれる。
[0073] 本発明で使用可能な抗体は、 CXCL1タンパク質 (好ましくは、配列番号 2のァミノ 酸配歹 IJを有するタンパク質)を認識し、それに特異的に結合する、抗体またはその断 片あるいは化学修飾誘導体 (上に定義)である。抗体にはポリクローナル抗体、モノク ローナル抗体、または抗体断片、例えば Fab、 Fab'、 F (ab' ) 、 Fv、 ScFvなどが含
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まれる。本発明の抗体は、前記タンパク質の少なくとも 5個、好ましくは少なくとも 8個 のアミノ酸からなる 1もしくは複数のェピトープに対する抗体である。特異的なポリクロ ーナル抗体は、例えばァガロースなどの担体に CXCL1タンパク質を結合したカラム に、該タンパク質を免疫したゥサギなどの抗血清を通し、カラム担体に結合した IgG 抗体を回収することを含む手法によって作製することができる。モノクローナル抗体は 、後述する手法によって得ることができる。
[0074] 本発明で使用可能な核酸プローブは、配列番号 1で表される塩基配列もしくはその 変異体配列からなる核酸、その相補的配列からなる核酸、それらの核酸とストリンジェ ントな条件でハイブリダィズする核酸、もしくはそれらの 15以上の連続した塩基を含 む断片、またはそれらの化学修飾誘導体 (上に定義)を含む。
[0075] 本発明の方法では、その実施形態により、被験者からの生体試料中の上記タンパ ク質の存在量または上記遺伝子の発現量を測定する。該タンパク質の量または遺伝 子の発現量が、対照試料のものと比べて有意に増大している場合、被験者が尿路上 皮ガンに罹患していると判定される。ここで対照試料は、例えば正常もしくは健常な 個体、あるいは尿路上皮ガンをもたない個体、からの対応する試料、例えば血液、尿 などの体液、尿路上皮組織もしくは細胞などである。特に組織や細胞については、こ れらの試料から常法により mRNAを回収し、定量 RT— PCR法により生成 '増幅され た cDNA量 (これは、標的遺伝子の発現量に対応する。）を決定するか、あるいは、該 細胞を培養し、その培養上清中の CXCL1タンパク質の濃度を測定することができる
[0076] 対照試料に対する増大率は、通常 2倍以上、好ましくは 3倍以上、より好ましくは 4 倍以上、最も好ましくは 5倍以上である。増大率が 3倍以上であれば信頼度が増す。 増大の程度は、測定された実測値の対比だけでなぐ例えばある種の補正用物質（ 例えばクレアチニンなど)の量を基準にし、これに対する相対値の比較から決定する こと力 Sできる。
[0077] 尿路上皮ガンとしては、上記定義のとおり、例えば膀胱ガン、腎盂ガン、尿管ガン、 尿道ガンなどが含まれる。特に膀胱ガンの検出では、表在性腫瘍と比べて浸潤性腫 瘍においてガンの検出信頼性が有意に高かった。それゆえ、本発明は、尿路上皮ガ ンのなかでも、転移を起こしやすい浸潤性腫瘍の検出により有効であるだろう。
[0078] このように、本発明の尿路上皮ガンの検出方法は、プライマーまたはプローブを用 いて試料中の尿路上皮ガン細胞から産生された、 CXCL1タンパク質をコードする遺 伝子由来の核酸の発現量を測定すること、または尿路上皮ガン細胞によって産生さ れた、試料中の CXCL1タンパク質を、抗体を用いて免疫学的に測定することを含む 。本発明の方法によって、被験者が尿路上皮ガンに罹患しているか否かを判定する ことができるだけでなぐ尿路上皮ガン患者と非尿路上皮ガン患者の識別を可能に する。またさらに、本発明の方法によって試料中の CXCL1タンパク質をコードする遺 伝子由来の核酸の発現量または CXCL1タンパク質を定量することにより、尿路上皮 ガンの進行度を判定することも可能にする。
[0079] 本発明の実施形態により、本発明は、上記 CXCL1タンパク質またはその断片と特 異的に結合する抗体またはその断片を用いて、試料中の CXCL1タンパク質を免疫 学的に定量することにより膀胱ガンに代表される尿路上皮ガンを検出する方法を提 供する。
[0080] あるいは、別の実施形態により、本発明は、 CXCL1タンパク質をコードする塩基配 歹からなる核酸、それと相補的な配列からなる核酸、これらの核酸とストリンジェントな 条件でハイブリダィズする核酸、あるいはそれらの核酸の 15塩基以上の断片を用い て、試料中の CXCL1タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定することにより 膀胱ガンに代表される尿路上皮ガンを検出する方法を提供する。
[0081] < CXCL1遺伝子の検出 >
本発明において、尿路上皮ガンの検出方法のひとつとして、核酸をプライマーまた はプローブとして用いて試料中の尿路上皮ガン細胞から産生された、 CXCL1タンパ ク質をコードする遺伝子の発現量を測定する方法が挙げられる。
[0082] 本発明において、尿路上皮ガンの存在及び/または不存在を判定するための、ある いは尿路上皮ガンを診断するために使用可能な核酸は、ヒト由来の CXCL1遺伝子 、その同族体、その転写産物または cDNA、あるいはその変異体または誘導体の存 在、発現レベルまたは存在量を定性的及び/または定量的に測定することを可能に する。
[0083] CXCL1遺伝子は、非ガン組織に比べて尿路上皮ガン組織においてその発現レべ ルが有意に増大する。それゆえ、本発明の組成物は、非ガン組織と尿路上皮ガン組 織について CXCL1遺伝子の発現レベルを測定し、それらを比較するために有効に 使用すること力 Sできる。
[0084] 本発明で使用可能な核酸は、尿路上皮ガンに罹患した患者の生体組織において 配列番号 1で表される塩基配列を含む核酸及びその相補的核酸、該塩基配列に相 補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でそれぞれハイブリダィズする 核酸及びその相補的核酸、ならびにそれらの核酸群の塩基配列において 15以上の 連続した塩基を含む核酸群から選ばれた 1または複数の核酸の組み合わせを含む。
[0085] 上記のポリヌクレオチドの断片は、各核酸の塩基配列において、例えば、連続する 15〜配歹' Jの全塩基数、 15〜300塩基、 15〜250塩基、 15〜200塩基、 15〜： 150 塩基、 15〜： 140塩基、 15〜： 130塩基、 15〜： 120塩基、 15〜： 110塩基、 15〜： 100塩 基、 15〜90塩基、 15〜80塩基、 15〜70塩基、 15〜60塩基、 15〜50塩基、 15〜 40塩基、 15〜30塩基または 15〜25塩基； 25〜配列の全塩基数、 25〜300塩基、 25〜250塩基、 25〜200塩基、 25〜： 150塩基、 25〜： 140塩基、 25〜： 130塩基、 2 5〜： 120塩基、 25〜： 110塩基、 25〜： 100塩基、 25〜90塩基、 25〜80塩基、 25〜7 0塩基、 25〜60塩基、 25〜50塩基または 25〜40塩基； 50〜配列の全塩基数、 50 〜300塩基、 50〜250塩基、 50〜200塩基、 50〜： 150塩基、 50〜： 140塩基、 50〜 130塩基、 50〜： 120塩基、 50〜： 110塩基、 50〜： 100塩基、 50〜90塩基、 50〜80 塩基、 50〜70塩基または 50〜60塩基； 60〜酉己歹 IJの全塩基数、 60〜300塩基、 60 〜250塩基、 60〜200塩基、 60〜： 150塩基、 60〜： 140塩基、 60〜： 130塩基、 60〜 120塩基、 60〜： 110塩基、 60〜： 100塩基、 60〜90塩基、 60〜80塩基または 60〜 70塩基などの範囲の塩基数を含むことができる力 これらに限定されないものとする
[0086] 本発明で使用される上記核酸類またはその断片類はいずれも DNAでもよいし RN Aでもよい。
[0087] 本発明の組成物としての核酸は、 DNA組換え技術、 PCR法、 DNA/RNA自動 合成機による方法などの一般的な技術を用いて作製することができる。
[0088] DNA組換え技術及び PCR法は、例えば Ausubelら， Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, US (199d)； Sambrookら , Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, US (1989)などに記載される技術を使用することができる
[0089] 本発明はまた、上記方法においてプローブ (及び、場合によりプライマー)として使用 可能な核酸、その変異体及び/またはその断片の 1つまたは複数を含む尿路上皮ガ ン診断 (検出)用キットを提供する。
[0090] 本発明のキットは、好ましくは、上記に記載した核酸類から選択される 1または複数 の核酸またはその断片を含む。
[0091] 本発明のキットは、配列番号 1で表される塩基配列を含む核酸、その相補的配列を 含む核酸、それらの核酸とストリンジヱントな条件でハイブリダィズする核酸、またはそ れらの核酸の断片を少なくとも 1つ含むことができる。
[0092] 好ましい実施形態では、前記核酸が、配列番号 1で表される塩基配列からなる核酸
、その相補的配列からなる核酸、それらの核酸とストリンジェントな条件でハイブリダィ ズする核酸、またはそれらの 15以上の連続した塩基を含む断片である。
[0093] 好ましい実施形態では、前記断片は、 15以上、好ましくは 30以上、好ましくは 50以 上、好ましくは 60以上、例えば 50〜： 100、の連続した塩基を含む核酸であることがで きる。
[0094] 本発明のキットを構成する上記の組み合わせは、あくまでも例示であり、他の種々 の可能な組み合わせのすべてが本発明に包含されるものとする。
[0095] 本発明のキットに含まれる核酸、その変異体またはその断片は、個別にまたは任意 に組み合わせて異なる容器に包装される。
[0096] 本発明のキットに含まれるプローブとしての核酸は、固相担体に結合されていても よレ、。担体には、例えば DNAマイクロアレイ、 DNAチップなどの基板が含まれる。す なわち、上記核酸を含む DNAマイクロアレイや DNAチップも本発明の範囲内である
[0097] 固相化されうる核酸は、上記で説明した本発明の全ての核酸である。例えば、その ような核酸は、以下の 1または複数の核酸またはその断片を含むことができる。
[0098] ·配列番号 1で表される塩基配列からなる核酸、それらの変異体、または 15以上の 連続した塩基を含むそれらの断片。
[0099] ·配列番号 1で表される塩基配列を含む核酸。
[0100] ·配列番号 1で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェン トな条件でハイブリダィズする核酸群、または 15以上の連続した塩基を含むそれらの 断片。
[0101] ·配列番号 1で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダ ィズする核酸群、または 15以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
[0102] ·配列番号 1で表される塩基配列またはその相補的配列の各々において、 60以上 の連続した塩基を含む核酸。
[0103] 本発明において、固相化される核酸は、ゲノム DNA、 cDNA、 RNA、合成 DNA、 合成 RNAのレ、ずれでもよレ、し、あるいは 1本鎖でもよレ、しまたは 2本鎖でもよレ、。
[0104] 標的遺伝子、 RNAまたは cDNAの発現レベルを検出、測定することができる DNA チップの例としては、 Affymetrix社の Gene Chip Human Genome U133 Plus 2. 0 Array ^ Agilent社の Whole human genome oligo microarray、タカフバィ ォ社の IntelliGene(R) HS Human Expression CHIPなどを挙げることができる。 [0105] DNAマイクロアレイの作製について、例えば予め調製したプローブを固相表面に 固定化する方法を使用することができる。予め調製した核酸プローブを固相表面に 固定化する方法では、官能基を導入した核酸を合成し、表面処理した固相担体表面 にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、 J. B.
Lamtureら、 Nucleic. Acids. Research, 1994年、第 22卷、 p. 2121— 2125、 Z . Guoら、 Nucleic. Acids. Research, 1994年、第 22卷、 p. 5456— 5465)。核 酸は、一般的には、表面処理した固相担体にスぺーサーゃクロスリンカ一を介して共 有結合される。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成 核酸を共有結合させる方法も知られている（G. Yershovら、 Proceedings of the N ational Academic Sciences U. S. A.、 1996年、第 94卷、 p. 4913)。また、シ リカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを 含むァガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させること でピオチン化ポリクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密な ハイブリダィゼーシヨンを可能にする方法も知られている（R. G. Sosnowskiら、 Pro ceedmgs of the National Academic sciences U. S. A.、 1997年、第 94卷、 p. 1119—1123)。
[0106] DNAチップの基板としては、 DNAを固相化できるものであれば特に制限はなく、 スライドガラス、シリコン製チップ、ポリマー製チップ及びナイロンメンブレンなどを例 示することができる。またこれらの基板にはポリ Lリジンコートゃァミノ基、カルボキシル 基などの官能基導入などの表面処理がされてレ、てもよレ、。
[0107] また固相化法については一般に用いられる方法であれば特に制限はなぐスポッタ 一またはアレイヤーと呼ばれる高密度分注機を用いて DNAをスポットする方法や、ノ ズルより微少な液滴を圧電素子などにより噴射する装置 (インクジェット）を用いて DN Aを基板に吹き付ける方法、または基板上で順次ヌクレオチド合成を行う方法を例示 すること力 Sできる。高密度分注機を用いる場合には、例えば多数のゥエルを持つプレ ートのおのおののゥエルに異なった遺伝子溶液を入れておき、この溶液をピン (針） で取り上げて基板上に順番にスポットすることによる。インクジェット法では、ノズノレより 遺伝子を噴射し、基板上に高速度で遺伝子を整列配置することによる。基板上での DNA合成は、基板上に結合した塩基を光によって脱離する官能基で保護し、マスク を用いることにより特定部位の塩基だけに光を当て、官能基を脱離させる。その後、 塩基を反応液に加えて、基板上の塩基とカップリングさせる工程を繰り返すことによつ て行われる。
[0108] ハイブリダィゼーシヨン条件は、限定されないが、例えば 30°C〜50°Cで、 3〜4 X S SC、 0. 1 ~0. 50/0SDS中で：!〜 24B寺 ΓΡ のノヽイブリダィゼーシヨン、より好ましくま 40 °C〜45°Cで、 3. 4 X SSC, 0. 3%SDS中で:!〜 24時間のハイブリダィゼーシヨン、 そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、 2 33じと0. 1%SDSを含 む溶液、および 1 X SSC溶液、 0. 2 X SSC溶液による室温での連続した洗浄などの 条件を挙げることができる。ここで、 1 X SSCは、 150mM塩化ナトリウムおよび 15m Mクェン酸ナトリウムを含む水溶液 (pH7. 2)である。相補鎖は力かる条件で洗浄し ても対象とする正鎖とハイブリダィズ状態を維持するものであることが望ましレ、。具体 的にはこのような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にあ る塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも 80%の相同性を有する塩基配列か らなる鎖を例示することができる。
[0109] 本発明のキットのポリヌクレオチド断片をプライマーとして PCRを実施する際のストリ ンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件の例としては、例えば 10mMTris— HCL (p H8. 3)、 50mM KC1、 l〜2mM MgClなどの組成の PCRバッファーを用レヽ、当 該プライマーの配列から計算された融解温度 (Tm) _ 5〜： 10°Cにおいて 15秒から 1 分程度処理することなどが挙げられる。力かる Tmの計算方法として Tm= 2 X (アデ ニン残基数 +チミン残基数) + 4 X (グァニン残基数 +シトシン残基数)などが挙げられる
[0110] これらのハイブリダィゼーシヨンにおける「ストリンジヱントな条件」の他の例について は、例えば Sambrook, J. & Russel, D. 著、 Molecular Cloning, A LABOR ATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press、 2001年 1月 15 日発行、の第 1卷 7. 42〜7. 45、第 2卷 8. 9〜8. 17などに記載されており、本発明 において利用できる。
[0111] < CXCL1タンパク質の検出 > 本発明に係る尿路上皮ガンの別の検出方法として、抗体を用いて試料中の尿路上 皮ガン細胞から産生された、 CXCL1タンパク質の存在または量を測定する方法が 挙げられる。
[0112] 本発明において、尿路上皮ガンの存在及び/または不存在を判定するための、ある いは尿路上皮ガンを診断するために使用可能な抗体は、ヒト由来の CXCL1遺伝子 、その同族体、あるいはその変異体または誘導体の翻訳産物の発現レベルまたは存 在量を定性的及び/または定量的に測定することを可能にする。
[0113] 本発明において使用できる抗体としては、 CXCL1タンパク質またはその断片と特 異的に結合するものであれば特に限定されず、モノクローナル抗体でもポリクローナ ル抗体でも使用することができる力 モノクローナル抗体を使用するのが好ましい。本 発明の抗体のグロブリンタイプは、上記特徴を有するものである限り特に限定される ものではなぐ IgG、 IgM、 IgA、 IgE、 IgDのいずれでもよいが、 IgG及び IgMが好ま しレ、。例えばモノクローナル抗体として 20326· l (abl0375、 Abeam社）などを使 用することができ、ポリクローナル抗体も Abeam社などより市販されている。また、 CX CL1タンパク質と特異的に結合する抗体は、以下に記載するような方法によって作 製することもできる。
[0114] 免疫原の調製
本発明において抗体を作製するにあたり、免疫原（抗原）となるためのタンパク質を 調製する。免疫原タンパク質としては、 CXCL1タンパク質またはその断片を用いる。 本発明において免疫原として使用可能な CXCL1タンパク質のアミノ酸配列（配列番 号 2)及び該タンパク質をコードする cDNA配列（配列番号 1)は、それぞれ GenBan kにおレ、てァクセッション番号 NP_001502、 NM_001511として公開されてレ、る。 また従って、公開されているアミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法 、例えば固相ペプチド合成法などにより、免疫原として使用するための CXCL1タン ノ^質断片を合成することができる。免疫原として CXCL1タンパク質断片を使用する 場合は、 KLH、 BSAなどのキャリアータンパク質に連結させて使用するのが好ましい
[0115] また CXCL1タンパク質は、 CXCL1タンパク質をコードする cDNAの情報を用レ、、 公知の DNA組換え技術を利用して得ることができる。 CXCL1タンパク質をコードす る cDNAは cDNAクローニング法によって作製することができる。本発明において標 的である CXCL1遺伝子が発現される単球、メラノーマ細胞、気道上皮細胞、ケラチ ノサイト、肺胞マクロファージなどの生体組織力 抽出した total RNAを、オリゴ dT セルロースカラムで処理して得られるポリ A ( + ) RNAから RT_ PCR法によって cDN Aライブラリーを作製し、このライブラリーからハイブリダィゼーシヨンスクリーニング、 発現スクリーニング、抗体スクリーニングなどのスクリーニングによって目的の cDNA クローンを得ることができる。必要に応じて、 cDNAクローンを PCR法によって増幅す ることもできる。プローブまたはプライマーは、配列番号 1に示される塩基配列に基づ いて 15〜 100塩基の連続する配列の中力ら選択し、合成しうる。 cDNAクローニング 技術は、例えば Sambrook, J. & Russel, D. 著、 Molecular Cloning, A LAB ORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001年 1月 15日発行、の第 1卷 7. 42〜7. 45、第 2卷 8. 9〜8. 17に記載されてレヽる。
[0116] CXCL1タンパク質は、例えば上記のようにして得られた cDNAクローンを発現べク ターに組み込み、該ベクターによって形質転換またはトランスフエクシヨンされた原核 または真核宿主細胞を培養することによって該細胞または培養上清から得ることがで きる。発現ベクターとしては大腸菌由来のプラスミド（例えば pET21a、 pGEX4T、 p C118、 pC119、 pC18、 pC19など）、枯草菌由来のプラスミド（例えば pUB110、 p TP5など）、酵母由来のプラスミド（例えば YEpl 3、 YEp24、 YCp50など）などが挙 げられ、ファージ DNAとしては λファージ（λ gtl l、 λ ΖΑΡ等） が挙げられる。さら に、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルス、バキュロウィルスなどの昆虫ウィルスべク ターを用いることもできる。ベクター及び発現系は Novagen社、宝酒造、第一化学薬 品、 Qiagen社、 Stratagene千土、 Promega社、 Roche Diagnositics社、 Invitroge n社、 Genetics Institute社、 Amersham Bioscience社など力ら入手可肯である
[0117] ベクターに CXCL1の cDNAを揷入するには、まず、精製された DNAを適当な制 限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに 挿入してベクターに連結する方法などが採用される。ベクターには、該タンパク質を コードする DNAの他に、調節エレメント、例えばプロモーター、ェンハンサー、ポリア デュル化シグナル、リボソーム結合部位、複製開始点、ターミネータ一、選択マーカ 一などを含むことができる。またポリペプチドの精製を容易にするために標識べプチ ドをポリペプチドの C末端または N末端につけた融合ポリペプチドとしてもよい。代表 的な標識ペプチドには、 6〜10残基のヒスチジンリピート、 FLAG, mycペプチド、 G FPタンパク質などが挙げられる力 標識ペプチドはこれらに限られるものではない。 また DNA組換え技術については、 Sambrook, J. & Russel, D. (上記）に記載さ れている。 DNA断片とベクター断片とを連結させるには、公知の DNAリガーゼを用 いる。
[0118] 宿主細胞としては、細菌などの原核細胞 (例えば大腸菌、枯草菌）、酵母 (例えばサ ッカロマイセス*セレビシァェ）、昆虫細胞（例えば Sf細胞）、哺乳動物細胞（例えば C 〇S、 CH〇、 BHK)などを用いることができる。宿主細胞への組換えベクターの導入 方法は、それぞれの宿主へ DNAを導入する方法であれば特に限定されるものでは ないが、例えばカルシウムイオンを用いる方法、リボソームを用いる方法、エレクトロボ レーシヨン法、マイクロインジェクション法、等が挙げられる。
[0119] 大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地とし ては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培 養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用い てもよレ、。培養は、通常、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下、 37°C で 6〜24時間行う。培養期間中、 pHは中性付近に保持する。 pHの調整は、無機ま たは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンゃテト ラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。哺乳類細胞などの形質転換体を 培養する場合においても、それぞれの細胞に適した培地中で培養後、培養上清また は細胞内に精算されたタンパク質を回収する。このとき培地には血清を含んでもよぐ 含まなくてもよいが、無血清培地での培養がより望ましい。 CXCL1タンパク質が菌体 内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することによりタンパ ク質を抽出する。また、 CXCL1タンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合 には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体または細胞を除去する。 [0120] 標識ペプチドを付けずに本発明に係るタンパク質を生産した場合には、その精製 法として例えば限外ろ過、塩析、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーなどを含む 方法を挙げることができる。またこれに加えて、ァフィ二ティークロマトグラフィー、 HP LC、疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法で もよレ、。一方、当該タンパクにヒスチジンリピート、 FLAG, myc、 GFPといった標識ぺ プチドを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれの標識ペプチドに適した ァフィ二ティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。単離'精製が容易 となるような発現ベクターを構築するとよレ、。特にポリペプチドと標識ペプチドとの融 合タンパク質の形態で発現するように発現ベクターを構築し、遺伝子工学的に当該 タンパク質を調製すれば、単離 ·精製も容易である。 CXCL1タンパク質が得られたか 否かは、 SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。
[0121] このようにして得られたタンパク質を認識する抗体は、抗体の抗原結合部位を介し て、該タンパク質に特異的に結合し得る。具体的には、 CXCL1タンパク質またはそ の断片、その変異体タンパク質または融合タンパク質などを、それぞれに免疫反応 性である抗体を産生するための免疫原として使用することが可能である。
[0122] より具体的には、タンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などは、抗体形成を引 き出す抗原決定基またはェピトープを含むが、これら抗原決定基またはェピトープは 、直鎖でもよいし、より高次構造（断続的）でもよい。なお、該抗原決定基またはェピト ープは、当該技術分野に知られるあらゆる方法によって同定できる。
[0123] 本発明のタンパク質によってあらゆる態様の抗体が誘導される。該タンパク質の全 部若しくは一部またはェピトープが単離されてレ、れば、慣用的技術を用いてポリクロ ーナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも調製可能である。方法には例えば 、 Kennet 修)， Monoclonal Antibodies, Hybridomas : A New Dim ension in Biological Analyses, Pie num Press, New York, 1980に挙げ られた方法がある。
[0124] 次に、得られたタンパク質を緩衝液に溶解して免疫原を調製する。なお、必要であ れば、免疫を効果的に行うためにアジュバントを添カ卩してもよい。アジュバントとしては 、市販の完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミユウ ム（alum)、ムラミルペプチド、等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。
[0125] モノクローナル抗体の作製
( 1 )免疫及び抗体産生細胞の採取
上記のようにして得られた免疫原を、哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交 系マウスの Balb/c)、ゥサギなどに投与する。免疫原の 1回の投与量は、免疫動物 の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物 1匹当たり約 50〜20 O x gとされる。免疫は主として皮下、腹腔内に免疫原を注入することにより行われる。 また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましく は:!〜 4週間間隔で、 2〜： 10回、好ましくは 3〜4回追加免疫を行う。初回免疫の後、 免疫動物の血清中の抗体価の測定を ELISA (Enzyme— Linked Immuno Sor bent Assay)法などにより繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したときは、免疫原 を静脈内または腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から 2〜5 日後、好ましくは 3日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓 細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞または局所リンパ節 細胞が好ましい。
[0126] (2)細胞融合
また本発明によれば、各タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイ プリドーマ細胞株も提供される。こうしたハイプリドーマは、慣用的技術によって産生 し、そして同定することが可能である。こうしたハイプリドーマ細胞株を産生するため の 1つの方法は、動物を本発明のタンパク質で免疫し、免疫された動物から脾臓細 胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイプリドーマ細胞 を生成し、そして該酵素に結合するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細 胞株を同定することを含む。抗体産生細胞と融合させる骨髄腫細胞株としては、マウ スなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞 株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態では HAT選択培地（ヒポキサンチン、 アミノプテリン、チミンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生 存できる性質を有するものが好ましい。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物 に由来するものが好ましい。骨髄腫細胞株の具体例としては、 BALB/cマウス由来 のヒポキサンチン ·グァニン'ホスホリボシル 'トランスフェラーゼ（HGPRT)欠損細胞 株である P3X63 _Ag. 8株（ATCC TIB9)などが挙げられる。
[0127] 次に、上記骨髄腫細胞株と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清 を含まない DMEM、 RPMI— 1640培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産 生細胞と骨髄腫細胞株とを約 1：：!〜 20 : 1の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在 下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量 1500〜4000ダルトン のポリエチレングリコール等を約 10〜80%の濃度で使用することができる。また場合 によっては、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用し てもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクト口ポレーシヨン）を利用した市販の細胞融 合装置を用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを融合させることもできる。
[0128] (3)ハイプリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリドーマを選別する。その方法として 、細胞懸濁液を、例えばゥシ胎児血清含有 RPMI— 1640培地などで適当に希釈後 、マイクロタイタープレート上に 200万個/ゥエル程度まき、各ゥエルに選択培地を加 え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は、 20〜40°C、好ましく は約 37°Cである。ミエローマ細胞が HGPRT欠損株またはチミジンキナーゼ欠損株 のものである場合には、ヒポキサンチン'アミノプテリン'チミジンを含む選択培地 (HA T培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞と骨髄腫細胞株のハイプリドー マのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始 後、約 14日前後から生育してくる細胞をハイプリドーマとして得ることができる。
[0129] 次に、増殖してきたハイプリドーマの培養上清中に、 目的とする抗体が存在するか 否かをスクリーニングする。ハイプリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えば よ 特に限定されない。例えば、ノ、イブリドーマとして生育したゥエルに含まれる培 養上清の一部を採取し、酵素免疫測定法（EIA: Enzyme Immuno Assay、及び ELISA)、放射免疫測定法（RIA: Radio Immuno Assay)等によって行うことが できる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行レ、、最終的にモノクロ一 ナル抗体産生細胞であるハイプリドーマを樹立する。本発明のハイプリドーマは、後 述するように、 RPMI— 1640、 DMEM等の基本培地中での培養において安定であ り、尿路上皮ガンに由来する CXCL1タンパク質と特異的に反応するモノクローナル 抗体を産生、分泌するものである。
[0130] (4)抗体の回収
モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。すなわち樹立したハ イブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法また は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイプリドーマを 10%ゥシ胎児血清含有 RPMI— 1640培地、 MEM培地または無血清培地等の動 物細胞培養培地中で、通常の培養条件 (例えば 37°C、 5% CO濃度）で 2〜： 10日間
2
培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞 由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイプリドーマを約 1000万個投与し、ハ イブリドーマを大量に増殖させる。そして、：!〜 2週間後に腹水または血清を採取する
[0131] 上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、 イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィ 一などの公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより、精 製された本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。
[0132] 本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体 のヒト化型が含まれる。また本発明によれば、上記抗体の抗原結合断片も提供される 。慣用的技術によって産生可能な抗原結合断片の例には、 Fabおよび F (ab' ) 断片
2 が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子工学技術によって産生可能な抗体断 片および誘導体もまた提供される。本発明の抗体は、 in vitro及び in vivoのいず れにおいても、本発明のポリペプチドまたはその（ポリ）ペプチド断片の存在を検出す るためのアツセィに使用可能である。また本発明の抗体は、免疫ァフィ二ティークロマ トグラフィ一によつてタンパク質またはタンパク質断片を精製することにも使用すること ができる。
[0133] ポリクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗体を作製する場合は、前記と同様に動物を免疫し、最終の免疫日 力も 6〜60日後に、酵素免疫測定法 (EIA及び ELISA)、放射免疫測定法 (RIA)等 で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗 血清中のポリクローナル抗体の反応性を ELISA法などで測定する。
[0134] <検出法>
本発明の方法は、本発明の上記抗体を用いる測定法すなわち免疫学的測定法、 または CXCL1タンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定する方法のいずれの 方法も好ましい。
[0135] 免疫学的測定法として例えば、酵素免疫測定法 (ELISA、 EIA)、蛍光免疫測定 法、放射免疫測定法 (RIA)、発光免疫測定法、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラ テックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応またはウェスタンプロット法が挙げ られる。
[0136] 遺伝子由来の核酸の発現量を測定する方法としては定量 RT— PCR法、 DNAァ レイ法、ノーザンブロット法、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法、サザンブロット法、サ ザンハイブリダィゼーシヨン法などが挙げられる。
[0137] 本発明のタンパク質検出方法において被検対象となる試料としては、尿路上皮ガ ンに由来する CXCL1タンパク質または該タンパク質をコードする遺伝子由来の核酸 が含まれる可能性のある生体試料であれば特に限定されるものではなレ、。特に、尿、 血液、血漿、血清のような体液試料にぉレ、て得られた CXCL1タンパク質の測定値は 、尿路上皮ガンの指標として有用である。このように、本発明の尿路上皮ガンの検出 方法は、ガン組織だけでなく血液や尿において検出可能であることから、簡便な検出 法として非常に有用である。
[0138] 本発明のタンパク質検出方法を、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測 定法または発光免疫測定法等の標識を用いた免疫測定法により実施する場合には 、本発明の抗体を固相化するか、または試料中の成分を固相化して、それらの免疫 学的反応を行うことが好ましレ、。
[0139] 固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビュルトルエン、ポリプロピ レン、ポリエチレン、ポリ塩ィ匕ビュル、ナイロン、ポリメタタリレート、ラテックス、ゼラチン 、ァガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックスまたは磁性体等の 材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティックまたは試験片（テストストリツ プ)等の形状の不溶性担体を用いることができる。
[0140] 固相化は、固相担体と本発明の抗体または試料成分とを物理的吸着法、化学的結 合法またはこれらの併用等の公知の方法に従って結合させることにより行うことができ る。
[0141] 本発明においては、本発明の抗体と、試料中の尿路上皮ガン細胞に由来する CX CL1タンパク質との反応を容易に検出するために、本発明の抗体を標識することによ り該反応を直接検出するか、または標識二次抗体を用いることにより間接的に検出 する。本発明の検出方法においては、感度の点で、後者の間接的検出（例えばサン ドイッチ法など） を利用することが好ましい。
[0142] 標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、ペルォキシダーゼ（POD)、アル カリホスファターゼ、 β ガラクトシダーゼ、ゥレアーゼ、カタラーゼ、グノレコースォキ シダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼまたはピオチン アビジン複合体等を、蛍光 免疫測定法の場合には、フルォレセインイソチオシァネート、テトラメチルローダミンィ ソチオシァネート、置換ローダミンイソチオシァネート、ジクロロトリアジンイソチオシァ ネート、 Alexaまたは AlexaFluoro等を、そして放射免疫測定法の場合にはトリチウ ム、ヨウ素 125またはヨウ素 131等を用いることができる。また、発光免疫測定法は、 NADH—、 FMNH2—、ルシフェラーゼ系、ルミノール 過酸化水素 POD系、ァ クリジニゥムエステル系またはジォキセタン化合物系等を用いることができる。
[0143] 標識物質と抗体との結合法は、酵素免疫測定法の場合にはダルタルアルデヒド法 、マレイミド法、ピリジノレジスルフイド法または過ヨウ素酸法等の公知の方法を、放射 免疫測定法の場合にはクロラミン T法、ボルトンハンター法等の公知の方法を用いる ことができる。測定の操作法は、公知の方法（Current protocols in Protein S ciences、 1995年、 John Wiley & Sons Inc. 、 Current protocols in Im munology、 2001年、 John Wiley & Sons Inc. )により行うことができる。例え ば、本発明の抗体を直接標識する場合には、試料中の成分を固相化し、標識した本 発明の抗体と接触させて、 CXCL1タンパク質—本発明の抗体の複合体を形成させ る。そして未結合の標識抗体を洗浄分離して、結合標識抗体量または未結合標識抗 体量より試料中の CXCL1タンパク質量を測定することができる。 [0144] また例えば、標識二次抗体を用いる場合には、本発明の抗体と試料とを反応させ（ 一次反応）、さらに標識二次抗体を反応させる（二次反応)。一次反応と二次反応は 逆の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいし、または時間をずらして行ってもよ レ、。一次反応及び二次反応により、固相化した CXCL1タンパク質—本発明の抗体 一標識二次抗体の複合体、または固相化した本発明の抗体一 CXCL1タンパク質一 標識二次抗体の複合体が形成する。そして未結合の標識二次抗体を洗浄分離して 、結合標識二次抗体量または未結合標識二次抗体量より試料中の CXCL1タンパク 質量を測定することができる。
[0145] 具体的には、酵素免疫測定法の場合は標識酵素にその至適条件下で基質を反応 させ、その反応生成物の量を光学的方法等により測定する。蛍光免疫測定法の場合 には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫定法の場合には放射性物質標識に よる放射能量を測定する。発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測 定する。
[0146] 本発明の方法では、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球 凝集反応または粒子凝集反応等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散 乱光を光学的方法により測るか、 目視的に測る測定法により実施する場合には、溶 媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液またはグッド緩衝液等を用いるこ とができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を反 応系に含ませてもよい。
[0147] 以下に、本発明の検出法の好ましい実施形態の一例を示す。
[0148] 最初に、本発明の抗体を一次抗体として不溶性担体に固定する。そして好ましくは 、抗原が吸着していない固相表面を、抗原とは無関係のタンパク質 (仔ゥシ血清、ゥ シ血清アルブミン、ゼラチンなど）によりブロッキングする。続いて、固定化された一次 抗体と被検試料とを接触させる。次いで、上記一次抗体と異なる部位で CXCL1タン パク質と反応する標識二次抗体とを接触させ、該標識からの信号を検出する。ここで 用いる「一次抗体と異なる部位で CXCL1タンパク質と反応する二次抗体」は、一次 抗体と CXCL1タンパク質との結合部位以外の部位を認識する抗体であれば特に制 限はなぐ免疫原の種類を問わず、ポリクローナル抗体、抗血清、モノクローナル抗 体のいずれでもよぐまたこれらの抗体のフラグメント（Fab、 F (ab' ) 、 Fab、 Fv、 ScF
2
Vなど）を用いることもできる。更に、二次抗体として複数種のモノクローナル抗体を用 いてもよい。
[0149] またこれとは逆に、本発明の抗体に標識を付して二次抗体とし、本発明の抗体と異 なる部位で、 CXCL1タンパク質と反応する抗体を一次抗体として不溶性担体に固定 し、この固定化された一次抗体と被検試料とを接触させ、次いで、二次抗体として標 識を付した本発明の抗体とを接触させ、前記標識からの信号を検出してもよい。
[0150] また本発明の抗体は、上述したように、尿路上皮ガン細胞に由来する CXCL1タン パク質と特異的に反応するため、ガンの診断薬として用いることができる。本発明の 診断薬は、本発明の抗体を含むものであり、従って、本発明の診断薬を用いて、尿 路上皮ガンへの罹患が疑われる個体力ら採取した試料中に含まれる尿路上皮ガン 細胞に由来する CXCL1タンパク質を検出することによって、該個体の尿路上皮ガン の罹患を診断することができる。
[0151] また本発明の診断薬は、免疫学的測定を行うための手段であればいずれの手段に おいても利用することができるが、当技術分野で公知の免疫クロマト用テストストリップ などの簡便な手段と組み合わせて用いることによって、さらに簡便かつ迅速にガンを 診断することができる。免疫クロマト用テストストリップとは、例えば、試料を吸収しや すい材料からなる試料受容部、本発明の診断薬を含有する試薬部、試料と診断薬と の反応物が移動する展開部、展開してきた反応物を呈色する標識部、呈色された反 応物が展開してくる提示部など力 構成されるものであり、妊娠診断薬と同様の形態 とすること力できる。まず、試料受容部に試料を与えると、試料受容部は試料を吸収 して試料を試薬部にまで到達させる。続いて、試薬部において、試料中の尿路上皮 ガン細胞由来の CXCL1タンパク質と本発明の抗体との反応が起こり、反応した複合 体が展開部を移動して標識部に到達する。標識部においては、上記反応複合体と 標識二次抗体との反応が起こって、その標識二次抗体との反応物が提示部にまで展 開すると呈色力 S認められることになる。上記免疫クロマト用テストストリップは、使用者 に対し苦痛や試薬使用による危険性を一切与えなレ、ものであるため、家庭における モニターに使用することができ、その結果を各医療機関レベルで精査'治療（外科的 切除等）し、転移 ·再発予防に結びつけることが可能となる。また現在、このテストスト リップは、例えば特開平 10— 54830号公報に記載されるような製造方法により安価 に大量生産できるものである。また、本発明の診断薬と既知の尿路上皮ガンの腫瘍 マーカーに対する診断薬とを組み合わせて使用することにより、さらに信頼性の高い 診断が可能になる。
[0152] したがって、本発明はまた、 CXCL1タンパク質またはその断片と特異的に反応す る抗体またはその断片を含む尿路上皮ガン診断用キットに関する。本発明のキットに おいて抗体は、上記のような固相担体に結合されていてもよい。さらに本発明のキッ トは、標識二次抗体、担体、洗浄バッファー、試料希釈液、酵素基質、反応停止液、 精製された標準物質としての CXCL1タンパク質等を含みうる。
[0153] 以下、実施例により、本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに よって限定されるものではない。
実施例
[0154] (1)正常尿路上皮細胞培養上製中のプロテオーム解析
正常尿路上皮細胞は、腎摘症例患者由来の正常尿管から得た。正常尿管から抽 出した尿路上皮細胞を 10cmの培養皿内で Defined KSFM培地によって培養を 行った（Scriven, S. D.ら、 1997年、 Journal of Urology,第 158卷， p. 1147 一 1152)。直径 10cmの培養皿 4枚に培養した尿路上皮細胞が 90。/oコンフルェント になった時点で PBS (―)で 3回洗浄後、血清を含まない RPMI1640培地に培地交 換を行って 24時間培養し、培養上清を回収した。この培養上清を超遠心（150, 000 g、 30分、 4°C)処理して沈査を除いた後、遠心上清を Amicon Ultra- 15 (Millip ore社）を用いた遠心処理によって濃縮した（4, 000g、 20分、 4°C)。この結果、培養 細胞上清 40mLより lmgのタンパク質を抽出した。
[0155] 抽出したタンパク質の 200 /i gを ProteomeLab™ PF2D System (Beckman Coulter社)逆相クロマトグラフィーで 26分画に分離し、トリプシン消化した後、 Q— T OF Ultima (Micromass社）にて網羅的にタンパク質同定を行った。その結果約 6 00種類のタンパク質が同定され、うち約 20種類が増殖因子活性を持つことが推察さ れ /こ [0156] (2)発現遺伝子解析
膀胱ガン株化細胞（RT112、 5637、 T24、 EJ)はそれぞれ 10%ゥシ胎児血清を含 んだ RPMI1640、正常尿皮上皮細胞は defined— KSFMによって培養した。これら の細胞からそれぞれ、 Trizol reagent (Invitrogen社）および RNeasy Mini kit ( Qiagen)を用いて、同社推奨のプロトコールにより totalRNAを調製した。 TotalRN A 3 micro gより、 First— Strand cDNA sysnthesis kit (Amersham Bios ciences)を使用し、 cDNAを合成した。これらの cDNAをテンプレートとし、プロテオ ーム解析から見出された増殖因子のひとつである CXCL1、およびその受容体であ る CXCR2に対するプライマーをそれぞれ設計して、遺伝子発現を RT—PCR法によ つて検討し、ァガロースゲル電気泳動によって分子量を指標として発現の有無を確 認した（図 1)。分子量マーカーとしては Hi— Lo DNA Marker (BIONEXUS) を用いた。
[0157] CXCL1の mRNA発現は浸潤性膀胱ガン由来の細胞株である 5637、 T24では高 度の発現が見られた。正常組織では発現が検出されるものの、その程度は浸潤性ガ ン由来の細胞株よりも低いことが見出された。
[0158] (3)培養上清中の CXCL1濃度測定
膀胱ガン株化細胞（5637、 T24)はそれぞれ 10%ゥシ胎児血清を含んだ RPMI1 640、正常尿路上皮細胞は defined— KSFMによって培養した。各細胞を 96穴プレ ート内で 24時間培養し、ほぼコンフルェントになった状態で培養液を交換した。さら に 24時間後に培養上清を回収した。各培養上清中の CXCL1タンパク質濃度を、 H uman GR〇 alpha/CXCLl Quantikine ELISA kit (R&D Systems社） を用いて測定した。その結果、正常尿路上皮細胞の培養上清では CXCL1は検出さ れなかったが、浸潤性ガン由来の細胞株である 5637、 T24の培養上清では約 5〜2 Ong/mL以上の高濃度の CXCL1が検出された（図 2)。
[0159] (4)膀胱ガン患者尿中の CXCL1濃度測定
浸潤性の膀胱ガン患者 3名および健常対照 1名より尿サンプノレを得て、尿中の CXC L1タンパク質濃度を、 Human GR〇 alpha/CXCLl Quantikine ELISA ki t (R&D Systems社）を用いて測定した。各サンプルにおいて尿中クレアチュン濃 度を用いて、 CXCL1タンパク質濃度の補正を行ったところ、膀胱ガン患者において 、健常対照者に比べて高値の尿中 CXCL1タンパク質濃度が検出された（図 3)。
[0160] (5)進行度別の膀胱ガン患者尿中の CXCL1濃度測定
早期 (Ta)の膀胱ガン患者 32名、進行性 (T1以上）の膀胱ガン患者 35名および健 常対照 40名より尿サンプルを得て、尿中の CXCL1タンパク質濃度を、 Human GR 〇 alpha/CXCLl Quantikine ELISA kit (R&D Systems社）を用いて測 定した。早期および進行性膀胱ガン患者において、健常対照者に比べて高値の尿 中 CXCL1タンパク質濃度が検出された（図 4)。
[0161] (6)正常尿路上皮組織および膀胱ガンにおける CXCL1発現の測定
正常な尿路上皮組織および膀胱ガン組織を 10%中性ホルマリンによって固定し、パ ラフィン包埋した。このパラフィンブロックを 5 μ ΐηの厚さの切片とし、脱パラフィン化と 湿潤化し、スライドガラス上に固定した。内因性のペルォキシダーゼ活性を過酸化水 素によって抑制した。スライドガラスを PBSで洗浄した後、 1%ゥサギ血清を含む PBS によって 30分間処理した。 1次抗体として、抗 CXCL1抗体（Gro a (C— 15)： SC13 74、 Santa Cruz Biotechnology社)を 1： 150に希釈して用レ、、 4°Cでー晚静置し た。さらにヒストファインシンプルスティン MAX— PO (株式会社ニチレイバイオサイエ ンス、 日本国）を用いて、ジァミノベンチジンによる発色を行った。さらに切片をへマト キシリンによって軽く染色した。腫瘍細胞の細胞質の 10%以上が染色された場合を CXCL1陽性と判断した。
[0162] 正常な尿路上皮組織は染色されず、 CXCL1の発現は認められなかったが、進行性
(PT2G3)膀胱ガン組織およびリンパ節転移巣においては強度の染色が認められ、 CXCL1が強く発現してレ、ることが示された（図 5)。
[0163] したがって、本発明により、上記抗体または核酸プローブを用いて尿路上皮組織ま たは細胞等における CXCL1遺伝子の発現または発現量を測定し対照と比較するこ とによっても、該遺伝子の発現の検出または発現量の増大を指標にして、早期また は進行性の膀胱ガン等の尿路上皮ガンを効果的に検出できる。
産業上の利用可能性
[0164] 本発明により、簡易かつ安価な方法で、尿路上皮ガンを効果的に検出することがで きるため、尿路上皮ガンの早期発見、診断及び治療が可能になる。また、本発明の 方法により、患者尿を用いて尿路上皮ガンを非侵襲的に検出できるため、尿路上皮 ガンを簡便かつ迅速に検出することが可能になる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[I] 被験者由来の生体試料中の CXCL1タンパク質、または該タンパク質をコードする 遺伝子の発現、をインビトロで測定することを含む、尿路上皮ガンを検出する方法。
[2] 前記タンパク質の量または前記遺伝子の発現量を測定する、請求項 1に記載の方 法。
[3] 前記タンパク質の量または前記遺伝子の発現量が、対照試料のものと比べて有意 に増大していることを指標にする、請求項 2に記載の方法。
[4] 前記増大が 2倍以上である、請求項 3に記載の方法。
[5] 前記増大が 3倍以上である、請求項 3に記載の方法。
[6] 前記測定が免疫学的方法によるものである、請求項 1に記載の方法。
[7] 前記測定がハイブリダィゼーシヨンによるものである、請求項 1に記載の方法。
[8] 前記測定が、前記タンパク質または前記遺伝子と結合可能な物質を用いて行われ る、請求項 1に記載の方法。
[9] 前記タンパク質と結合可能な物質が抗体またはその断片である、請求項 8に記載の 方法。
[10] 前記遺伝子と結合可能な物質が核酸プローブである、請求項 8に記載の方法。
[I I] 前記核酸プローブが、配列番号 1で表される塩基配列もしくはその変異体からなる 核酸、その相補的配列からなる核酸、それらの核酸とストリンジェントな条件でハイブ リダィズする核酸、またはそれらの 15以上の連続した塩基を含む断片からなる、請求 項 10に記載の方法。
[12] 前記抗体または核酸プローブが標識されている、請求項 9または 10に記載の方法
[13] 前記タンパク質またはその断片と特異的に結合する抗体またはその断片を用いて 、試料中の該タンパク質を免疫学的に測定し、該タンパク質の量が対照試料のものと 比べて増大していることを指標にして尿路上皮ガンを検出することを含む、請求項 1 に記載の方法。
[14] 配列番号 1で表される塩基配列もしくはその変異体からなる核酸、その相補的配列 力 なる核酸、それらの核酸とストリンジェントな条件でハイブリダィズする核酸、また はそれらの 15以上の連続した塩基を含む断片からなるプローブを用いて、試料中の 前記遺伝子の発現量を測定し、該発現量が対照試料のものと比べて増大しているこ とを指標にして尿路上皮ガンを検出することを含む、請求項 1に記載の方法。
[15] 前記尿路上皮ガンが膀胱ガン、腎盂ガン、尿管ガンおよび尿道ガンからなる群から 選択される、請求項 1に記載の方法。
[16] 前記試料が血液、血漿、血清または尿である、請求項 1に記載の方法。
[17] 前記試料が尿路上皮組織または細胞である、請求項 1に記載の方法。
[18] 前記タンパク質が、配列番号 2に示されるアミノ酸配列またはその変異体配列を有 する、請求項 1に記載の方法。
[19] 前記遺伝子が、配列番号 1に示される塩基配列またはその変異体配列を有する、 請求項 1に記載の方法。
[20] CXCL1タンパク質またはその断片と特異的に結合する、抗体もしくはその断片ま たはそれらの化学修飾誘導体を含む、尿路上皮ガン診断用キット。
[21] 前記タンパク質が、配列番号 2に示されるアミノ酸配列またはその変異体配列を有 する、請求項 20に記載のキット。
[22] 前記タンパク質の断片力 少なくとも 8個のアミノ酸からなるェピトープを含む、請求 項 20に記載のキット。
[23] 前記尿路上皮ガンが膀胱ガン、腎盂ガン、尿管ガン及び尿道ガンからなる群から 選択される、請求項 20に記載のキット。
[24] 前記抗体またはその断片が固相担体に結合されている、請求項 20に記載のキット
[25] 前記抗体またはその断片と結合可能な標識二次抗体をさらに含む、請求項 20に 記載のキット。
[26] 前記二次抗体の標識が酵素、蛍光または放射性標識である、請求項 25に記載の キット。
[27] 配列番号 1で表される塩基配列もしくはその変異体配列からなる核酸、その相補的 配列からなる核酸、それらの核酸とストリンジェントな条件でハイブリダィズする核酸、 もしくはそれらの 15以上の連続した塩基を含む断片、またはそれらの化学修飾誘導 体を含む、尿路上皮ガン診断用キット。
[28] 前記核酸が、配列番号 1に示される塩基配列またはその変異体配列を有する、請 求項 27に記載のキット。
[29] 前記尿路上皮ガンが膀胱ガン、腎盂ガン、尿管ガン及び尿道ガンからなる群から 選択される、請求項 27に記載のキット。
[30] 前記核酸が固相担体に結合されている請求項 27〜29のいずれ力 1項に記載のキ ッ卜。
[31] 前記固相担体が DNAチップまたはマイクロアレイの基板である、請求項 30に記載 のキット。
[32] 請求項 20または 27に記載のキットの、被験者における尿路上皮ガンのインビトロ検 出のための使用方法。
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