WO2006109795A1 - 糸状菌胞子の製造方法及び植物病害防除方法 - Google Patents

糸状菌胞子の製造方法及び植物病害防除方法 Download PDF

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spore
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Takayoshi Eizuka
Taiji Miyake
Hideaki Tateishi
Yoneko Sakuma
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Kureha Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N3/00—Spore forming or isolating processes
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G18/00—Cultivation of mushrooms
    • A01G18/10—Mycorrhiza; Mycorrhizal associations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/36—Penicillium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a technique related to control of plant diseases. More specifically, the present invention relates to a technology that enables the formation of a sufficient amount of spores sufficient for practical use as a microbial pesticide or a material of the genus Pecilli.
  • Chemical pesticides are indispensable means for controlling pests in plants and greatly contribute to stable food production.
  • the emergence of resistant pests caused by multiple administrations of chemical pesticides and the problem of environmental burden have been taken up.
  • filamentous fungi such as Penicillium are known as microorganisms expected to be used as the biopesticide.
  • Talaromyces spp. The complete generation of the genus Pecilium, has already been used as an agricultural fungicide for strawberry anthracnose and powdery mildew (Talaromyces flavus (Talaromyces flavus)). flavus) wettable powder, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries No. 20659).
  • Patent Document 1 discloses a Talaromyces flavus having an antagonistic action against strawberry anthrax!
  • Patent Document 2 discloses Penicillium expansum as a microorganism having an antagonistic action against mango anthracnose, and Patent Document 3 controls gray mold fungi. Pecillium-powered manmberti, which shows effects, is disclosed.
  • a medium containing an antifoaming agent or a hardener such as agar at 0.0009 to 0.005 g / 1 has been reported. Furthermore, it is known that the addition of calcium salt is effective for sporulation of P. pyrium (see Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 10-229872.
  • Patent Document 2 JP 2001-39810 A.
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-231626.
  • Patent Document 4 JP-A-9 322759.
  • Patent Document 5 JP-A-11 276158.
  • Patent Document 6 JP 2000-201669 A.
  • Patent Document 7 United State Patent 6593127.
  • Non-patent literature l Trans.Br.Mycol.Soc., 80 (2), pp319-325, 1983.
  • an object of the present invention is to provide a safe technique capable of forming a sufficient amount of filamentous fungal spores sufficient for practical use as a microbial pesticide or a material.
  • the present invention provides a method for producing filamentous fungal spores. Since this manufacturing method can use many versatile culture devices, it is easy to sterilize, and has advantages such as easy control of the environment such as temperature during culture, oxygen supply, and pH. Select a liquid culture
  • the liquid medium contains corn steep liquor or soybean-derived peptone as a carbon source and a nitrogen source, and the amount of inorganic components derived from the carbon source and the nitrogen source is a liquid of the target filamentous fungus. Judging from the number of spores formed during culture, if the amount is less than the required amount, first, calcium chloride, further magnesium sulfate if necessary, and dipotassium hydrogen phosphate if necessary. And cultivate filamentous fungi using this liquid medium to form spores.
  • the corn steep liquor or the soybean-derived peptone as a carbon source and a nitrogen source is contained in a liquid medium in an amount of 0.1 to 10%, and further, the salt calcium as an inorganic component is 0.2 to 0.2%. It is contained at 5.0%, preferably 0.4 to 3.5%.
  • magnesium sulfate and dipotassium hydrogen phosphate may be added as inorganic components so as not to be excessive. This is to compensate for the lack of the necessary amount of magnesium and potassium salts in the medium. In this case, it is desirable to add magnesium sulfate in an amount of 0.001 to 10%, preferably 0.005 to 5.0%. Further, it is desirable that dipotassium hydrogen phosphate is added so as to be contained in an amount of 0.001 to 0.3%, preferably 0.05 to 0.2%.
  • the filamentous fungus is a fungus belonging to the genus Penicillium, and as a preferred example, Talaromyces sp. B-422 (FERM BP-08516) Talaromyces flavus can be employed.
  • the number of spores formed during liquid culture should be about 10 8 or more. Effective in spore production. Therefore, if the number of spores formed in liquid culture is less than about 10 8 , the liquid medium must first contain calcium chloride as an inorganic component, magnesium sulfate if necessary, and hydrogen phosphate if necessary. It is desirable to capture potassium.
  • the present invention cultivates filamentous fungi using a liquid medium containing corn steep liquor or peptone derived from soybean as a carbon source and nitrogen source, and containing at least calcium chloride calcium as an inorganic component.
  • the present invention provides a method for controlling plant diseases, wherein the spores formed by the method are collected and the spores are brought into contact with a plant body.
  • the term “contact” widely includes methods such as spraying, dipping, mixing, and application to plants, and after mixing and irrigating the spores with the soil, seeding the plant seeds to “contact” them. It is possible, and it should not be interpreted narrowly.
  • dipotassium hydrogen phosphate and magnesium sulfate may be added to the liquid medium as inorganic components so as not to be excessive. This is to make up for the necessary amount of magnesium and potassium salts in the medium.
  • magnesium sulfate so as to contain 0.001 to 10%, preferably 0.005 to 5.0%.
  • dipotassium hydrogen phosphate in an amount of 0.001 to 0.3%, preferably 0.05 to 0.2%.
  • Core Steep Liquor (abbreviated as CS L) is an organic by-product generated in the process of producing sugar (corn starch).
  • Soy-derived peptone is obtained by partially hydrolyzing soy protein with a proteolytic enzyme or acid, and is mainly composed of oligopeptides and amino acids. These are all fungi Functions as an organic component for supplying a carbon source and a nitrogen source.
  • filamentous fungal spores generally difficult to form by liquid culture can be industrially produced in large quantities and at low cost.
  • the spores obtained by this method are useful as microbial pesticides and biological materials.
  • it since it is cultured without using any animal organic components, it is safe to avoid BSE problems.
  • corn steep liquor or soybean-derived peptone is used as the carbon source and nitrogen source used for liquid culture of filamentous fungal spores. In some cases, both of these may be used. Soy flour and kina flour can be used, but separation from spores becomes difficult after cultivation. In addition, sufficient amounts of spore formation cannot be obtained with animal peptone.
  • "Corn steep liquor” is not particularly limited, but, for example, Showa Sangyo Co., Ltd., Hokkai Sugar Co., Ltd., Nippon Shokuhin Kako Co., Ltd., Oriental Yeast Co., Ltd. ) And the like can be used as appropriate.
  • the “soybean-derived peptone” is not particularly limited, and for example, polypeptone-S manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd. can be used.
  • a suitable addition amount of corn steep liquor or soybean-derived peptone is 0.1% to 10%, preferably 0.5 to 10%, more preferably 1 to 5%. If an excessive amount is added, precipitation of insoluble matter increases and separation from spores becomes difficult.
  • a sufficient amount of spores can be produced simply by adding corn steep liquor or soybean-derived peptone, but it is also possible to add a commonly used carbon source.
  • a commonly used carbon source For example, glucose, sucrose, flatatose, galactose, glycerol, starch, sugarcane, and molasses derived from beet may be further added. Among them, it is desirable to use molasses mainly because it is inexpensive. For example, when beet molasses is used, the medium with 0.5% to 10% added can be shown in column f.
  • carbonic acid in addition to the above carbon source and nitrogen source, as inorganic components, carbonic acid, phosphoric acid and the like Metal salts such as salts, potassium, sodium, iron and magnesium can be prepared.
  • Metal salts such as salts, potassium, sodium, iron and magnesium can be prepared.
  • dipotassium hydrogen phosphate and magnesium sulfate are preferred because they are necessary elements for the growth of P. pyrium.
  • a calcium salt is added as a component for promoting sporulation.
  • salty calcium is preferred mainly in terms of solubility.
  • the calcium chloride concentration is 0.2 to 5.0%, preferably 0.4 to 3.5%. Addition of excess calcium chloride increases precipitation of insoluble matter and makes separation from spores difficult.
  • various surfactants can be freely added to the medium as an antifoaming agent.
  • the culture is performed at a culture temperature of about 20 ° C to 40 ° C, preferably 25 ° C force 35 ° C, and the initial pH of the medium is 4.0 force 8.0, preferably 5.0 to 7.0. It is carried out under aerobic conditions such as by aeration and agitation culture with a mentor.
  • the culture is filtered with sashi, gauze, glass wool or the like to remove the mycelium.
  • the obtained filtrate is centrifuged to separate spores. Add water to separate the centrifuge and wash. These steps are repeated several times to recover the washed spores.
  • washing water ion-exchanged water, distilled water, pure water prepared using various filtration membranes, water, etc. can be used.
  • the spore exhibits the same preservation and control effect as a spore obtained from a solid medium such as potato dextrose agar medium (PDA), and can be used as a biopesticide or a biological material.
  • a solid medium such as potato dextrose agar medium (PDA)
  • PDA potato dextrose agar medium
  • the filamentous fungus that can be cultured in the present invention is, for example, the genus Persium.
  • the Penicillium fungus is not particularly limited.For example, Eupenicillium sp. B-408 (FERM BP-08517), Talaromyces sp. B-422 (FERM BP-08516), Penicilli um sp. B-453 (FERM BP—08515), Talaromyces flavus, Penicillium expansum, Penicillium camemberti and the like.
  • Eupenicillium sp.B-408 (FERM BP-08517), Talaro myces sp.B-422 (FERM BP-08516), Penicillium sp.B-453 (FERM BP-08515), Talaro myces flavus are preferred, but Talaromyces sp.B — 422 (FERM BP—08516) and Talaromyces flavus are more preferred.
  • Eupenicillium sp. B-408 (FERM BP-08517), Talaromyces sp. B-422 (FERM BP- 0851) 6), Penicillium sp.B-453 (FERM BP-08515) is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (Postal Code: 305-8566, 1-chome Tsukuba, Ibaraki, Japan 1 Chuodai 6 ).
  • Example 1 in the culture of fungal spores, the difference in the number of cultured spores when the composition of the liquid medium was changed was examined.
  • Experimental Examples 1 to 3 are methods for producing filamentous fungal spores according to the present invention.
  • Corn steep liquor (Oriental Yeast Co., Ltd.) 3%, dipotassium hydrogen phosphate 0.1%, magnesium sulfate heptahydrate 0.05%, calcium chloride dihydrate 1% ( ⁇ 7.0) medium 50 ml was dispensed into a 300 ml Erlenmeyer flask and sterilized (120 ° C, 20 minutes). Sterilized water was added to Talaromyces sp. B-422 (FERM BP-08516) or Talaromyces flavus pre-cultured in PDA medium to prepare a spore concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / ml. The above liquid medium was inoculated with 0.5 ml of Talaromyces sp.
  • Corn steep liquor Showa Sangyo 3%, Beet molasses (Hokkaido Sugar Industry) 0.5%, Dipotassium hydrogen phosphate 0.1%, Magnesium sulfate heptahydrate 0.05%, Calcium chloride dihydrate 1 50 ml of medium having a composition of% (pH 7.0) was dispensed into a 300 ml Erlenmeyer flask and sterilized (120 ° C., 20 minutes). Inoculate 0.5 ml of Talaromyces sp. B-422 (FERM BP-08516) spore solution or Talaromyces flavus spore solution prepared according to Experimental Example 1 and shake incubator (150 rpm, 25 ° C) for 7 days. Cultured. After completion of the culture, the spore count was measured with a hemocytometer.
  • Experimental Example 1 0.5 ml of the adjusted Talaromyces sp. B-422 (FERM BP-08516) spore solution or Talaromyces flavus spore solution was inoculated and cultured in a shaking incubator (150 rpm, 25 ° C) for 7 days. After completion of the culture, the spore count was measured with a hemocytometer.
  • B-422 (FERM BP-08516) spore solution or Talaromyces flavu s spore solution prepared according to Experimental Example 1 and shake incubator (150 rpm, 25 ° C) for 7 days. Cultured. After completion of the culture, the spore count was measured with a hemocytometer.
  • 300 ml medium containing 50% galactose, calcium chloride dihydrate 2.5%, sodium nitrate 0.6%, potassium dihydrogen phosphate 0.15%, magnesium sulfate heptahydrate 0.05% (pH 7.0) Dispensed into a triangular flask and sterilized (120 ° C, 20 minutes). Inoculate 0.5 ml of Talaromyces sp. B-422 (FERM BP-08516) spore solution or Talaromyces flavus spore solution prepared according to Experimental Example 1, and then in a shaking incubator (150 rpm, 25 ° C) for 7 days. Cultured. After completion of the culture, the spore count was measured with a hemocytometer.
  • Potato dextrose broth 50 ml of a medium having a composition of 2.4% (pH 7.0) was dispensed into a 300 ml Erlenmeyer flask and sterilized (120 ° C., 20 minutes). Apply 0.5 ml of Talarom yces sp. B-422 (FERM BP-08516) spore solution or Talaromyces flavus spore solution prepared according to Experimental Example 1. And seeds were cultured for 7 days in shaker (150 r P m, 25 ° C). After completion of the culture, the spore count was measured with a hemocytometer.
  • Polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 3%, dipotassium hydrogen phosphate 0.1%, magnesium sulfate 7 hydrate 0.05%, calcium chloride dihydrate 1% ( PH 7.0) Dispensing into triangular flasks and sterilizing (120 ° C, 20 minutes).
  • 0.5 ml of Talaromyces spB-422 (FERM BP-08516) spore solution or Talaromyces flavus spore solution prepared according to Experimental Example 1 was inoculated and cultured for 7 days in a shaking incubator (150 rpm, 25 ° C). After completion of the culture, the spore count was measured with a hemocytometer.
  • Comparative experiment example 1 3. 2x 10 7 ⁇ 1.0. 0X 10 4 (mycelium) Comparative experiment example 2 1. 5 X 10 6 2. 3x 10 6 Comparative experiment example 3 1. 4 10 6 ⁇ 1.0 X 10 4 Comparative experiment example 4 ⁇ 1. 0X 10 4 (hyphae form) 1. 3 ⁇ 10 4 (hyphae form) Comparative experiment example 5 ⁇ 1. ⁇ 10 4 (hyphae form) ⁇ 1- 0X 10 4 (hyphae form) [0045] As is clear from the results of "Table 1" described above, the spore production in Experimental Examples 1 to 3 is significantly higher than the spore production in Comparative Experimental Examples 1 to 5 for any fungus. There were many.
  • Example 2 the optimum concentration of calcium chloride used in the method for producing filamentous fungal spores according to the present invention was examined.
  • Example 3 the transition of the number of spores for each culture time in the method for producing filamentous fungal spores according to the present invention was examined.
  • composition of corn steep liquor (Nihon Shokuhin Kako) 3%, dipotassium hydrogen phosphate 0.1%, magnesium sulfate heptahydrate 0.05%, calcium chloride dihydrate 1% ( ⁇ 7.0)
  • the medium 2 1 was dispensed into 3 1 jar mentors and sterilized (120 ° C., 60 minutes).
  • Figure 1 is a drawing substitute graph. As can be seen from the results shown in FIG. 1, the number of spores reached approximately 1 ⁇ 10 8 cells / ml in 3 days of culture.
  • Example 4 spore viability was confirmed using the medium used in Example 3 above.
  • Example 4 50 ml of the medium having the composition used in Example 4 was dispensed into a 300 ml Erlenmeyer flask and sterilized (120 ° C, 20 minutes). 0.5 ml of a spore solution of Talaromyces sp. B-422 (FERM BP-08516) pre-cultured in PDA medium was inoculated and cultured for 7 days in a shaking incubator (150 rpm, 25 ° C). After completion of the culture, the culture broth was filtered with a brush to remove the mycelium. The obtained filtrate was centrifuged to collect spores. Distilled water was added and the mixture was centrifuged and washed. This was repeated twice, and the washed spores were collected and prepared so that the number of spores counted under a microscope in tap water was about 2 ⁇ 10 8 Zml.
  • the spores obtained by liquid culture showed the same viability as the spores obtained by the solid medium.
  • Example 5 Talaromvces sp. B-422 (FERM BP-08516) liquid culture spore solution and solid solution The control effect of the body culture spore solution on rice seedling disease was verified.
  • Talaromyces sp. B-422 (FERM BP-08516) liquid culture spore solution and solid culture spore solution obtained in the same manner as in Example 3 were stored at 5 ° C for 1 month. Used for this test.
  • Talaromyces sp. B-422 (FERM BP-08516) spore solution prepared from rice-affected seeds (produced in 2001, varieties: short silver shaved) naturally infected in a field with abundant rice seedling disease at a bath ratio of 1: 1 Soaked for 24 hours, then seeded at 15 ° C for 4 days (bath ratio 1: 1), germinated for 1 day at 30 ° C, and then commercially available granular soil for seedling (trade name: Kumiai granular soil, stock A seedling box (10 ⁇ 15 cm) packed with Kureha Co., Ltd. was seeded with 5 g of dry rice per box (3 repeats in 1 section).
  • Control value (1-1 (the ratio of the seedlings in the treated area ⁇ the ratio of the seedlings in the untreated area)) X 1 0 0 [0060] [Table 4]
  • the present invention can be used as a technique for producing filamentous fungal spores that can be used in biological pesticides and materials for controlling plant diseases, or as a plant disease technique.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of Example 3, and is a drawing-substituting graph showing the transition of the number of spores per culture time.

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Abstract

【課題】 　一般に液体培養では形成困難な糸状菌胞子を、液体培養により効率的に製造する方法、及び該方法によって得られた胞子を用いる植物病害防除技術を提供する。 【解決手段】 　炭素源や窒素源を供給する有機成分として、コーンスティープリカー又は大豆由来のペプトン、無機成分として、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムを含む液体培地を用いて糸状菌を培養することにより、実用化に充分量の胞子を形成させる。また、このようにして得られた糸状菌胞子を回収し、植物体に接触させ、植物病害を有効に防除する。

Description

明 細 書
糸状菌胞子の製造方法及び植物病害防除方法
技術分野
[0001] 本発明は、植物病害の防除に係わる技術に関する。より詳しくは、ぺ-シリウム属菌 の微生物農薬又は資材としての実用化に足りる充分な量の胞子形成を可能とする技 術に関する。
背景技術
[0002] 化学農薬は、植物の病害虫防除にとって不可欠な手段であり、安定的な食物生産 に大きく貢献している。し力しながら、近年、化学農薬の多投与による抵抗性病害虫 の発生や環境負荷の問題が取り上げられるようになつている。
[0003] これを背景として、近年、前記化学農薬よりも環境への負荷が低 、と想定される微 生物を利用した、「生物農薬 (Biological agrochemicals)」とも称される生物的防除の 研究が進展し、その一部は既に実用化に到って 、る。
[0004] 前記生物農薬としての利用が期待される微生物として、例えば、ぺニシリウム属菌 などの糸状菌が知られている。このうち、ぺ-シリウム属菌の完全世代であるタラロマ イセス属 (Talaromyces属）は、既にイチゴ炭そ病やうどんこ病用の農業用殺菌剤とし て禾 IJ用されている（タラロマイセス フラバス (Talaromyces flavus)水和剤、農林水産省 第 20659号)。特許文献 1には、イチゴ炭そ菌に対して拮抗作用を有するタラロマイセ ス ·フラバスが開示されて!、る。
[0005] また、特許文献 2には、マンゴー炭そ病に対して拮抗作用を有する微生物としてべ -シリウムエタスパンサム（Penicillium expansum)が開示され、特許文献 3には、灰色 かび病菌に防除効果を示すぺ-シリウム 力マンベルティ (Penicillium camemberti)な どが開示されている。
[0006] これらべ-シリウム属菌を微生物農薬又は資材として利用するときは、通常の液体 培養によって得られる培養菌糸体を用いることができる。しかし、菌糸体は、耐久性 の胞子に比べ生存性に欠けるので実用性に乏しい。このため、耐久性の胞子を大量 かつ安価に生産できる技術が望まれて 、る。 [0007] 従来から、糸状菌の胞子形成方法として、固体培養や液体培養が行われて ヽる。 固体培養を行う場合には、米、麦、トウモロコシなどの穀物類や、フスマなどの穀物由 来の固体成分などが使用されているが、固体培養を滅菌するには長い時間を要する と共に無菌管理も難しぐまた、培養中に温度、水分、 pH等の環境を制御することも 難しい。また、これら固体成分と胞子との分離が困難であるとともに、培養時間も長く 、培養コストも割高となる。
[0008] 一方、液体培養では、多くの汎用性培養装置の利用が可能なため、滅菌も容易で あり、また培養中温度、酸素供給量、 pH等の環境制御が容易であるという利点があ るが、胞子形成が難しいという問題があった。
[0009] この問題を解決するために、例えば、炭素源としてガラクトース及び Z又はフラタト ースを使用する方法 (特許文献 4参照）、培地中成分としてマグネシウム塩及び Z又 はカリウム塩を使用する方法 (特許文献 5参照）、フラクトースを 0.1〜5%、塩ィ匕カルシ ゥムを 0.01〜0.5%、グルタミン酸を 0.01〜0.5%添加する糸状菌の液体培養方法 (特 許文献 6参照）がある。
[0010] また、糸状菌の胞子形成に有効な培地として、モラセスを 5〜20 g/l、コーンスティー プリカ一（CSL)を 10〜25 g/l、塩化ナトリウムを 5〜15 g/l、硫酸カルシウムを 0.1〜0.5 g/l、リン酸二水素カリウムを 0.001〜0.01 g/l、硫酸マグネシウム 7水和物を 0.001〜0.0 1 g/l、硫酸銅を 0.001〜0.005 g/l、硫酸鉄を 0.0009〜0.005 g/1に消泡剤や寒天など の固ィ匕剤を含む培地 (特許文献 7参照)などが報告されている。さらには、カルシウム 塩の添加がぺ-シリウム属菌の胞子形成に有効なことが知られている（非特許文献 1 参照)。
特許文献 1：特開平 10— 229872号公報。
特許文献 2：特開 2001 - 39810号公報。
特許文献 3 :特開 2004— 231626号公報。
特許文献 4：特開平 9 322759号公報。
特許文献 5 :特開平 11 276158公報。
特許文献 6：特開 2000— 201669号公報。
特許文献 7 : United State Patent 6593127号公報。 非特許文献 l : Trans.Br.Mycol.Soc.， 80(2), pp319- 325, 1983。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] 糸状菌を微生物農薬又は資材として実用化するときに、従来の培養方法では満足 な量の胞子形成量を得ることは依然として難しいという技術的課題がある。さらに、 B SE問題などから、使用する培地成分の炭素源や窒素源については、動物由来の培 地成分から安全な植物由来の培地成分への置き換えが望まれて 、る。
[0012] そこで、本発明は、微生物農薬又は資材としての実用化に足りる充分な量の糸状 菌胞子の形成が可能であって、かつ安全な技術を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0013] 本発明者は、微生物農薬又は資材として用いる糸状菌の胞子を液体培養生産す る技術について、鋭意研究を進めた結果、培地の炭素源及び窒素源として好適な植 物由来成分を用い、かっこれに好適な無機成分を添加することで、植物病害防除の ために利用される微生物農薬又は資材としての実用化に足りる充分量の胞子を生産 でさることを突さ止めた。
[0014] まず、本発明は、糸状菌胞子の製造方法を提供する。この製造方法では、多くの汎 用性培養装置の利用が可能なため、滅菌も容易であり、また培養中温度、酸素供給 量、 pH等の環境制御が容易であるなどの利点があることから、液体培養を選択する
[0015] そして、その液体培地には、炭素源及び窒素源として、コーンスティープリカ一又は 大豆由来のペプトンを含み、かつ炭素源及び窒素源に由来する無機成分の量が、 目的糸状菌の液体培養時の胞子形成個数から判断して、必要量に満たない場合に は、まず塩ィ匕カルシウムを、さらに必要であれば、硫酸マグネシウムを、その上さらに 必要であれば、リン酸水素二カリウムを含むように工夫し、この液体培地を用いて糸 状菌を培養し、胞子を形成させる。
[0016] 炭素源及び窒素源としての前記コーンスティープリカ一又は前記大豆由来ペプトン が液体培地中に 0.1〜10%含まれるようにし、さらには、無機成分としての前記塩ィ匕カ ルシゥムが 0.2〜5.0%、好ましくは 0.4〜3.5%含まれるようにする。 [0017] このとき無機成分として、過剰にならない程度に、硫酸マグネシウム、リン酸水素二 カリウムをカ卩えてもよい。培地中のマグネシウム塩、カリウム塩の必要量が不足するこ とのないよう補うためである。この場合、硫酸マグネシウムは 0.001〜10%、好ましくは 0.005〜5.0%含まれるように加えておくことが望ましい。また、リン酸水素二カリウムは 、 0.001〜0.3%、好ましくは 0.05〜0.2%含まれるように加えておくことが望ましい。
[0018] 前記糸状菌は、ぺニシリウム（Penicillium)属の糸状菌であり、一好適例を挙げれば 、 Talaromyces sp.B- 422(FERM BP- 08516) Talaromyces flavusを採用できる。これ ら 2つの菌において、炭素源及び窒素源に由来する無機成分の量が必要量を満た していると判断するには、液体培養時の胞子形成個数が約 108個以上であることが、 胞子製造上有効である。従って、液体培養時の胞子形成個数が約 108個を下回る場 合は、液体培地に、無機成分としてまず塩ィ匕カルシウム、必要であれば硫酸マグネ シゥム、さらに必要であればリン酸水素二カリウムをカ卩えることが望ましい。
[0019] 次に、本発明は、炭素源及び窒素源として、コーンスティープリカ一又は大豆由来 のペプトンを含み、かつ無機成分として、少なくとも塩ィ匕カルシウムを含む液体培地 を用いて糸状菌を培養することにより形成された胞子を回収し、該胞子を植物体に接 触させる植物病害防除方法を提供する。なお、「接触」とは、植物体への散布、浸漬 、混合、塗布などの方法を広く含み、また、前記胞子を土壌に混和、灌注した後、植 物体種子を播種して「接触」させることも可能であり、狭く解釈されな ヽ。
[0020] このとき、前記液体培地に無機成分として、過剰にならない程度に、リン酸水素二カリ ゥム、硫酸マグネシウムをカ卩えてもよい。培地中のマグネシウム塩、カリウム塩の必要 量が不足することのないよう補うためである。この場合、硫酸マグネシウムは 0.001〜1 0%、好ましくは 0.005〜5.0%含まれるように加えておくことが望ましい。また、リン酸水 素二カリウムは、 0.001〜0.3%、好ましくは 0.05〜0.2%含まれるように加えておくこと が望ましい。
[0021] なお、上記本発明において、「コーンスティープリカ一（Corn Steep Liquor:略称 CS L)」とは、製糖 (コーンスターチ)製造過程で生じる有機性副産物である。「大豆由来 のペプトン」とは、大豆タンパク質をタンパク質分解酵素や酸で部分的に加水分解し て得られるもので、オリゴペプチド、アミノ酸を主成分とする。これはいずれも、糸状菌 の培養で炭素源及び窒素源を供給する有機成分として機能する。
発明の効果
[0022] 本発明の方法に従ってべ-シリウム属糸状菌を培養することで、一般に液体培養 では形成困難な糸状菌胞子を大量かつ安価に工業的に生産する事ができる。本方 法で得られた胞子は、微生物農薬および生物資材として有用である。また、動物性 の有機成分を一切用いないで培養するため、 BSE問題もなぐ安全である。
発明を実施するための最良の形態
[0023] 以下、本発明に係る実施形態について説明する。なお、本発明は、以下に説明す る実施形態や実施例によって狭く限定されるものではない。
[0024] まず、本発明では、糸状菌胞子の液体培養に用いる炭素源及び窒素源としてコー ンスティープリカ一、あるいは大豆由来のペプトンを用いる。場合によっては、これら の両方を用いてもよい。大豆粉やきな粉なども用いることができるが、培養後胞子との 分離が困難になってしまう。また、動物性ペプトンでは充分な胞子形成量が得られな い。
[0025] 「コーンスティープリカ一」は、特に限定されな 、が、例えば、昭和産業社製、北海 道糖業社製、 日本食品化工社製、オリエンタル酵母社製 (ソルリス AST、ソルリス 09 5MPEなど）などを適宜用いることができる。「大豆由来ペプトン」についても特に限 定されないが、例えば、日本製薬社製ポリペプトン— S、などを使用できる。
[0026] コーンスティープリカ一や大豆由来ペプトンの好適な添加量は、 0.1%〜10%、好ま しくは 0.5〜10%、より好ましくは 1〜5%である。過剰量の添加は、不溶物の沈殿が増 加し、胞子との分離が困難となる。本発明では、コーンスティープリカ一や大豆由来 のペプトンの添加だけで、充分量の胞子生産が可能であるが、通常一般に使用され る炭素源をさらに添加することも可能である。例えば、グルコース、シユークロース、フ ラタトース、ガラクトース、グリセロール、デンプン、サトウキビやビート由来の廃糖蜜な どをさらに添加してもよい。これらの中では、主に安価である理由から、廃糖蜜を採用 することが望ましい。例えば、ビート糖蜜を用いた場合、 0.5%〜10%を添加した培地 を f列示することができる。
[0027] 本発明では、上記炭素源及び窒素源に加え、無機成分として、炭酸やリン酸などの 塩類、カリウム、ナトリウム、鉄、マグネシウムなどの金属塩をカ卩えることができる。とく に、ぺ-シリウム属菌の増殖に必要な要素である理由から、リン酸水素二カリウムおよ び硫酸マグネシウムが好まし 、。
[0028] さらに、胞子形成を促進する成分として、カルシウム塩を添加する。このカルシウム 塩としては、主に溶解度の点で、塩ィ匕カルシウムが好適である。塩ィ匕カルシウム濃度 としては、 0.2〜5.0%、好ましくは 0.4〜3.5%である。過剰な塩化カルシウムの添加は 、不溶物の沈殿が増加し、胞子との分離が困難になる。その他、種々の界面活性剤 を消泡剤として培地中へ添加することは自由である。
[0029] 培養は、培養温度約 20°Cから 40°C、好ましくは 25°C力 35°C、培地の初発 pHは 4.0 力 8.0、好ましくは 5.0から 7.0とし、液体振とう培養、ジャーフアーメンターによる通気 撹拌培養等によって好気的条件で行なわれる。
[0030] 培養終了後は、まず培養物をサラシ、ガーゼあるいはガラスウールなどでろ過し、 菌糸を除去する。次に、得られたろ液を遠心分離し、胞子を分離する。水を加えて遠 心分離し、洗浄を行う。これらの工程を数回繰り返し、洗浄された胞子を回収する。な お、洗浄水には、イオン交換水、蒸留水、各種ろ過膜を用いて調製された純水、水 道水などを用いることができる。
[0031] 当該胞子は、ポテトデキストロース寒天培地（PDA)などの固体培地から得られた胞 子と同等の保存性、防除効果を示し、生物農薬、生物資材として使用することができ る。
[0032] なお、本発明において培養対象とできる糸状菌は、例えば、ぺ-シリウム属菌糸状 菌である。このぺニシリウム属菌糸状菌は、特に限定されないが、例えば、 Eupenicilli um sp.B-408(FERM BP- 08517)、 Talaromyces sp.B- 422(FERM BP- 08516)、 Penicilli um sp.B-453(FERM BP— 08515)、 Talaromyces flavus、 Penicillium expansum、 Penicilli um camembertiなどを例示できる。 Eupenicilliumsp.B- 408(FERM BP- 08517)、 Talaro myces sp.B- 422(FERM BP- 08516)、 Penicillium sp.B- 453(FERM BP- 08515)、 Talaro myces flavusが好ましいが、 Talaromyces sp.B— 422(FERM BP— 08516)や Talaromyces flavusがより好ましい。
[0033] Eupenicillium sp.B- 408(FERM BP- 08517)、 Talaromyces sp.B- 422(FERM BP- 0851 6)、 Penicillium sp.B-453(FERM BP-08515)は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（郵便番号 305-8566日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央代 6)に寄託されている。
実施例 1
[0034] 実施例 1では、菌胞子の培養において、液体培地の組成を変化させたときの培養胞 子数の違いを調べた。なお、実験例 1から 3が、本発明に係る糸状菌胞子の製造方 法である。
[0035] (実験例 1)。
コーンスティープリカ一 (オリエンタル酵母社製) 3%、リン酸水素二カリウム 0.1%、硫 酸マグネシウム 7水和物 0.05%、塩化カルシウム 2水和物 1% (ρΗ7.0)の組成の培地 50 mlを 300 ml三角フラスコに分注して滅菌（120°C、 20分間）した。 PDA培地で前培養し た Talaromyces sp.B- 422(FERM BP- 08516)、又は Talaromyces flavusに滅菌水をカロ えて、胞子濃度が 1 X 106個/ mlとなるよう調製した。上記液体培地に Talaromyces sp. B-422(FERM BP- 08516)胞子液、又は Talaromyces flavus胞子液を 0.5 ml接種し、振 とう培養機（150 rpm、 25°C)で 7日間培養した。培養終了後、胞子数を血球計算盤で 測定した。なお、 Talaromyces flavusは、市販されている農薬製剤より分離して用いた
[0036] (実験例 2)。
コーンスティープリカ一（昭和産業社製) 3%、ビート糖蜜 (北海道糖業社製) 0.5%、リ ン酸水素二カリウム 0.1%、硫酸マグネシウム 7水和物 0.05%、塩化カルシウム 2水和物 1 % (pH7.0)の組成の培地 50 mlを 300 ml三角フラスコに分注して滅菌（120°C、 20分間） した。実験例 1に準じて調整した Talaromyces sp.B-422(FERM BP-08516)胞子液、又 は Talaromyces flavus胞子液を 0.5 ml接種し、振とう培養機（150 rpm、 25°C)で 7日間 培養した。培養終了後、胞子数を血球計算盤で測定した。
[0037] (実験例 3)。
大豆由来ペプトン (ポリペプトン- S、 日本製薬社製) 3%、リン酸水素二カリウム 0.1%、 硫酸マグネシウム 7水和物 0.05%、塩化カルシウム 2水和物 1% (ρΗ7.0)の組成の培地 5 0 mlを 300 ml三角フラスコに分注して滅菌（120°C、 20分間）した。実験例 1に準じて 調整した Talaromyces sp.B- 422(FERM BP- 08516)胞子液、又は Talaromyces flavus 胞子液を 0.5 ml接種し、振とう培養機（150 rpm、 25°C)で 7日間培養した。培養終了 後、胞子数を血球計算盤で測定した。
[0038] (比較実験例 1)。
ビート糖蜜 (北海道糖業社製) 0.75%、コーンスティープリカ一（昭和産業社製) 2%、 塩化ナトリウムを 1%、硫酸カルシウムを 0.025%、リン酸二水素カリウム 0.0006%、硫酸マ グネシゥム 7水和物を 0.0005%、硫酸銅 0.0001%、硫酸鉄 0.0002% (pH7.0)の組成の培 地 50mlを 300 ml三角フラスコに分注して滅菌（120°C、 20分間）した。実験例 1に準じ て調整した Talaromyces sp.B- 422(FERM BP- 08516)胞子液、又は Talaromyces flavu s胞子液を 0.5 ml接種し、振とう培養機（150 rpm、 25°C)で 7日間培養した。培養終了 後、胞子数を血球計算盤で測定した。
[0039] (比較実験例 2)。
ガラクトース 2%、塩化カルシウム 2水和物 2.5%、硝酸ナトリウム 0.6%、リン酸二水素カリ ゥム 0.15%、硫酸マグネシウム 7水和物 0.05% (pH7.0)の組成の培地 50 mlを 300 ml三 角フラスコに分注して滅菌（120°C、 20分間）した。実験例 1に準じて調整した Talarom yces sp.B-422(FERM BP- 08516)胞子液、又は Talaromyces flavus胞子液を 0.5 ml接 種し、振とう培養機（150rpm、 25°C)で 7日間培養した。培養終了後、胞子数を血球計 算盤で測定した。
[0040] (比較実験例 3)。
フラクトース 1%、脱脂粉乳 2%、塩化カルシウム 2水和物 0.2%、グルタミン酸 0.1% (pH7 .0)の組成の培地 50 mlを 300 ml三角フラスコに分注して滅菌（120°C、 20分間）した。 実験例 1に準じて調整した Talaromyces sp.B-422(FERM BP-08516)胞子液、又は Tal aromyces flavus胞子液を 0.5 ml接種し、振とう培養機（150 rpm、 25°C)で 7日間培養 した。培養終了後、胞子数を血球計算盤で測定した。
[0041] (比較実験例 4)。
ポテトデキストロースブロス（Difco社製） 2.4% (pH7.0)の組成の培地 50 mlを 300 ml三 角フラスコに分注して滅菌（120°C、 20分間）した。実験例 1に準じて調整した Talarom yces sp.B-422(FERM BP- 08516)胞子液、又は Talaromyces flavus胞子液を 0.5 ml接 種し、振とう培養機（150 rPm、 25°C)で 7日間培養した。培養終了後、胞子数を血球 計算盤で測定した。
[0042] (比較実験例 5)。
ポリペプトン（日本製薬社製) 3%、リン酸水素二カリウム 0.1%、硫酸マグネシウム 7水 和物 0.05%、塩化カルシウム 2水和物 1%(PH7.0)の組成の培地 50 mlを 300 ml三角フラ スコに分注して滅菌（120°C、 20分間）した。実験例 1に準じて調整した Talaromyces s p.B-422(FERM BP- 08516)胞子液、又は Talaromyces flavus胞子液を 0.5 ml接種し、 振とう培養機（150rpm、 25°C)で 7日間培養した。培養終了後、胞子数を血球計算盤 で測定した。
[0043] 上記した実験例 1〜3、並びに比較実験例 1〜5で得られた培養液中の胞子濃度を
、以下の「表 1」に示す。
[0044] [表 1]
Talaromyces sp.B-422胞子数 Talaromyces flavus胞子效
(単位：個ノ ml) (単位:個 Zml) 実験例 1 1. 5x 108 8. 7X107 実験例 2 1. 6 X 108 一 実験例 3 1. 2 X 108 一
比較実験例 1 3. 2x 107 <1. 0X 104(菌糸状） 比較実験例 2 1. 5 X 106 2. 3x 106 比較実験例 3 1. 4 106 <1. 0 X 104 比較実験例 4 <1. 0X 104(菌糸状） 1. 3Χ104(菌糸状） 比較実験例 5 <1. ΟΧ 104(菌糸状） <1- 0X 104(菌糸状） [0045] 前掲した「表 1」の結果から明らかなように、いずれの菌についても、実験例 1〜3で の胞子生産量は、比較実験例 1〜5の胞子生産量に比べて顕著に多かった。なお、 Talaromyces sp.B- 422(FERM BP- 08516)を使用したときの比較実験例 4、 5、及び Tal aromyces flavusを使用したときの比較実験例 1、 4、 5では、胞子形成が困難で、菌糸 状であった (表 1参照)。
実施例 2
[0046] 実施例 2では、本発明に係る糸状菌胞子の製造方法に用いる最適な塩化カルシゥ ムの濃度を調べた。
[0047] 実施例 1の実験例 1と同様の方法で、塩ィ匕カルシウム 2水和物の濃度のみを、 0.1% , 0.5%, 3.0%と変化させて、培養された Talaromyces sp.B- 422(FERM BP- 08516)胞 子数を調べた。結果を表 2に示す。
[表 2]
Figure imgf000012_0001
実施例 3
[0048] 実施例 3では、本発明に係る糸状菌胞子の製造方法における培養時間ごとの胞子 数の推移を調べた。
[0049] コーンスティープリカ一（日本食品化工社製) 3%、リン酸水素二カリウム 0.1%、硫酸マ グネシゥム 7水和物 0.05%、塩化カルシウム 2水和物 1% (ρΗ7.0)の組成の培地 2 1を 3 1 ジャーフアーメンターに分注して滅菌（120°C、 60分間）した。同培地を用いて 5日間 三角フラスコで前培養した Talaromycesp.B-422(FERM BP-08516)の培養液を 0.1%接 種し、攪拌速度 300 rpm、温度 25°C、通気量 0.5 wmで培養を行った。経時的にサン プリングし、胞子数を血球計算盤で測定した。培養時間ごとの胞子数の推移を、図面 代用グラフである図 1に示す。この図 1に示された結果からもわ力るように、培養 3日 で胞子数は、ほぼ 1 X 108個/ mlに達した。
実施例 4
[0050] 実施例 4では、上記実施例 3で用いた培地を使用して、胞子の生存性の確認を行 つた o
[0051] 実施例 4で使用した組成の培地 50 mlを 300 ml三角フラスコに分注して滅菌（120°C 、 20分間）した。 PDA培地で前培養した Talaromyces sp.B- 422(FERM BP- 08516)胞 子液を 0.5ml接種し、振とう培養機（150 rpm、 25°C)で 7日間培養した。培養終了後、 培養液をサラシでろ過して菌糸を除去した。得られたろ液を遠心分離し、胞子を集め た。蒸留水を加えて遠心分離し、洗浄を行った。これを 2回繰り返して、洗浄された胞 子を回収し、水道水に顕微鏡下でカウントした胞子数が、約 2 X 108個 Zmlとなるよう に調製した。
[0052] 比較のための固体培地で形成された胞子は、 PDA培地で、 25°C、 10日間培養した ものを用いた。シャーレに蒸留水を加えて筆で表面を力きとった後、液体培養の場合 と同様の操作を行って同じ濃度の胞子液を調整した。 5°C、 20°Cで保持して、 3ヶ月 後の生菌数を測定した。得られた結果を次の「表 3」に示す。
[0053] [表 3] 調製直後の 5°C3ヶ月保存後の 20度 3ヶ月保存後の
B422胞子液 生菌数 生菌数 生菌数
(GFUZml) (CFU/ml) (CFUZml) 液体培地からの調製 1.4 108 1.7 X 108 1.2 X 108 固体培地からの調製 1.5 X 108 0.8 108 1.6 X 108
[0054] 前掲した「表 3」に示された結果力 わ力るように、液体培養で得られた胞子は、固 体培地で得られた胞子と同等の生存性を示した。
実施例 5
[0055] 実施例 5では、 Talaromvces sp.B- 422(FERM BP- 08516)液体培養胞子液および固 体培養胞子液の、イネばか苗病に対する防除効果を検証した。
[0056] 実施例 3と同様にして得られた Talaromyces sp.B-422(FERM BP-08516)液体培養 胞子液および固体培養胞子液を、 5°Cで 1ヶ月間保存しておいたものを本試験に用 いた。
[0057] イネばか苗病多発圃場で自然感染したイネ罹病種子 (2001年産、品種：短銀坊主） を調製した Talaromyces sp.B- 422(FERM BP- 08516)胞子液に浴比 1： 1で 24時間浸 漬し、次いで 15°Cで 4日間浸種 (浴比 1： 1)、 30°Cで 1日間催芽を行った後、市販の育 苗用粒状培土 (商品名：くみあい粒状培土、株式会社クレハ製)を詰めた育苗用箱（1 0 X 15cm)に箱当たり乾籾 5g相当を播種した（ 1区 3反復)。
[0058] その後、出芽器中で、 30°Cで 3日間出芽させ、以降はガラス温室内で育苗した。播 種 14日後に各試験区の徒長苗率を調査し、防除価を求めた。この結果を次の「表 4」 に示した。なお、防除価は、次の数式 1で算出した。
[0059] [数 1]
防除価 = ( 1一 （処理区の徒長苗率 ÷無処理区の徒長苗率） ） X 1 0 0 [0060] [表 4]
Figure imgf000014_0001
液体培地からの調製 1 X 106 1.5 99
固体培地からの調製 1 X 106 4.4 96
無処理 100
供試籾：短銀坊主（2001年産、自然感染籾）
種子処理: 24時間浸漬
浸種： 15°C4曰
催芽： 30°C1曰
出芽： 30°C3日
[0061] 前掲する「表 4」に示された結果からわ力るように、液体培養で得られた胞子は、固 体培地で得られた胞子と同等の効果 (防除価)を示した。
産業上の利用可能性 [0062] 本発明は、植物病害防除のための生物農薬や資材に使用できる糸状菌胞子を製 造する技術、あるいは植物病害技術として利用できる。
図面の簡単な説明
[0063] [図 1]実施例 3の結果を示す図であって、培養時間ごとの胞子数の推移を示す図面 代用グラフである。

Claims

請求の範囲
[1] 炭素源及び窒素源として、コーンスティープリカ一及び Z又は大豆由来のペプトン を含み、かつ無機成分として、少なくとも塩ィ匕カルシウムを含む液体培地を用いて、 糸状菌を培養して胞子を形成させる糸状菌胞子の製造方法。
[2] 前記液体培地に、無機成分として、リン酸水素二カリウム及び Z又は硫酸マグネシ ゥムを含むことを特徴とする請求の範囲第 1項記載の糸状菌胞子の製造方法。
[3] 前記液体培地中に、前記コーンスティープリカ一及び Z又は前記大豆由来ぺプト ンが 0. 1〜10%含まれることを特徴とする請求の範囲第 1項又は第 2項記載の糸状 菌胞子の製造方法。
[4] 前記液体培地中に、前記塩ィ匕カルシウムが 0. 2〜5. 0%含まれることを特徴とする 請求の範囲第 1項力 第 3項のいずれか一項に記載の糸状菌胞子の製造方法。
[5] 前記糸状菌が、ぺニシリウム（Penicillium)属の糸状菌であることを特徴とする請求 の範囲第 1項力 第 4項のいずれか一項に記載の糸状菌胞子の製造方法。
[6] 前記糸状菌が、 Talaromyces sp.B- 422(FERM BP- 08516)であることを特徴とする請 求の範囲第 1項力 第 4項のいずれか一項に記載の糸状菌胞子の製造方法。
[7] 前記糸状菌が、 Talaromyces flavusであることを特徴とする請求の範囲第 1項力 第
4項の 、ずれか一項に記載の糸状菌胞子の製造方法。
[8] 炭素源及び窒素源として、コーンスティープリカ一又は大豆由来のペプトンを含み
、かつ無機成分として、少なくとも塩ィ匕カルシウムを含む液体培地を用いて糸状菌を 培養することにより形成された胞子を回収し、該胞子を植物体に接触させることを特 徴とする植物病害防除方法。
[9] 前記液体培地に、無機成分として、リン酸水素二カリウム及び Z又は硫酸マグネシ ゥムを含むことを特徴とする請求の範囲第 8項記載の植物病防除方法。
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