WO2006104099A1 - Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進するＲＯＲα - Google Patents

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WO2006104099A1
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ror
rora
bmall
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Takuro Yamamoto
Takayoshi Mamine
Toru Takumi
Makoto Akashi
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Sony Corporation
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Definitions

  • ROR a promotes Bmall expression induction
  • the present invention relates to a mechanism of action of a clock gene and peripheral techniques thereof. More specifically, RORa (retinoic acid receptor-related orphan receptor) that promotes the induction of expression of Bmall (brain— muscle ARNT— like protein 1), as well as anti-cancer agents, jet lag modifiers, and their agents Related to screening methods.
  • RORa retinoic acid receptor-related orphan receptor
  • Circadian rhythm (bicycle rhythm) is a biological rhythm with a cycle of about 24 hours, and is an in vivo phenomenon that is universally seen in many organisms, from single-celled organisms to humans. . Each organism has a gene involved in the circadian rhythm control, and the circadian rhythm control gene regulates the circadian rhythm.
  • circadian rhythm control genes plays a central role in the circadian rhythm adjustment at the individual level, which is particularly high in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus.
  • circadian rhythm control genes are expressed in other tissues in the living body (circadian rhythm peripheral tissues). ⁇ Circadian rhythm adjustments are made for each organization.
  • Circadian rhythm control genes in mammals include Per gene (Perl, Per2, Per3), Clock gene, Bmal gene (Bmall, Bmal2, Bmal3), Cry gene, Rev-erb gene (Rev-erb a, Rev —Erb j8) is known.
  • BMAL1 (Bmall gene transcript, same below) forms a dimer with CLOCK (Clock gene transcript, same below), E-box (Perl gene promoter region) It is suggested to activate the expression of Per gene, Cry gene, etc. (ekakis, N. et al. Role of the LOCK protein in the mammalian circadian mechanism. "Science 280, 1564-9 ( 1998)).
  • Bmall gene is regulated by REV-ERB (Rev-erb gene transcript, the same applies hereinafter) (Preitner, N. et al. "The orphan nuclear receptor REV—ERBalpha controls circadian transcription within the positive limb of the mammalian circadian clock "Cell 110, 251-60 (2002)).
  • ROR a retinoic acid binding-receptor alpha, hereinafter the same
  • ROR a is a protein called RORA (Rar— relate d orphan receptor A), and splicing variants such as ROR a 1, ROR o;
  • a “splicing variant” refers to a protein derived from the same gene and having a partly different amino acid sequence, and is generated due to a difference in splicing.
  • ROR a is hypoxic and its expression is promoted! (C hauvet, C. et al. 'Retinoic acid receptor-related orphan receptor (ROR ) alpha4 is the predominant isoform of the nuclear receptor RORalpha in the liver and is up—see regul atea by hypoxia in HepG2 human hepatoma cells. ”Biochem J364, 449-56 (2002)).
  • circadian rhythm regulation mechanism in mammals is particularly unclear.
  • circadian rhythm is deeply related to the homeostasis of living organisms and internal regulation mechanisms, such as body temperature regulation and hormone secretion just by sleep and awakening. It may also be involved in the pathogenesis of many diseases, including cancer.
  • the main object of the present invention is to clarify an unclear part of the circadian rhythm regulation mechanism.
  • ROR a retinoic acid binding-receptor alpha
  • ROR a that promotes the induction of Bmall expression, and hypoxia
  • the present invention strongly suggests the existence of the following circadian rhythm regulation mechanism.
  • a substance that suppresses ROR a may be applied as a jet lag adjusting agent.
  • rhythm modulated include, for example, sleep disorders, wakefulness disorders, insomnia, autonomic dysfunction, depression, senile dementia, night work, shift work, etc. Deterioration, exhaustion due to irregular rhythm of life in autism, etc.
  • the present invention is also applicable to these diseases.
  • the present invention may be applicable as an anticancer agent.
  • the present invention may be applicable to DNA chips, protein chips, use as markers for detecting circadian rhythm modulation, screening methods for anticancer agents or jet lag modifiers, and the like. .
  • FIG. 1 is a diagram showing a circadian rhythm regulation mechanism.
  • FIG. 2 shows expression patterns of Rev-erb ⁇ , Ror ⁇ , and Bmall in each tissue.
  • FIG. 3 shows the expression patterns of Rev-erb ⁇ , Ror ⁇ , and Bmall in cultured cells NIH3T3.
  • FIG. 4 is a view showing that the expression of RORa force MAL was induced.
  • FIG. 5 is a diagram showing that the induction of Bmal expression is promoted as the expression level of ROR a 4 increases.
  • FIG. 6 shows that ROR a and REV-ERB protein act competitively on the promoter region of Bmal.
  • FIG. 7 is a graph showing circadian changes in the expression level of Bmal when cells are cultured in the presence of a dominant negative mutant of RORa.
  • FIG. 8 is a diagram showing the sequence of the prepared recombinant vector.
  • FIG. 9 is a diagram showing the level of Bmal expression induction by ROR a when the length of the upstream region of Bmall is changed.
  • FIG. 10 is a graph showing the circadian change in the expression level of Bmal when the length of the upstream region of Bmall is changed.
  • FIG. 11 is a Western plot photograph (drawing substitute photograph) by the pull-down method.
  • Fig. 12 shows an actogram when the light and dark conditions are repeated every 12 hours for 15 days and then free-run (freely continued) under dark conditions.
  • Figure 13 shows the rearing environment after repeating light and dark conditions every 12 hours for 15 days.
  • Fig.14 shows an actogram in which the light condition and dark condition are repeated every 12 hours for 15 days, and then the start time of the dark condition is advanced by 4 hours, resulting in a time difference.
  • Figure 15 shows the environmental conditions after repeating the light and dark conditions every 12 hours for 15 days.
  • FIG. 16 is a diagram showing the induction of Bmal expression when RORa expression is suppressed by RNA interference.
  • FIG. 17 is a view showing circadian changes in Bmal expression induction when a mouse embryo fibroblast RORa gene deletion mutant is used.
  • FIG. 18 is a graph showing circadian changes in Bmal expression level by quantitative real-time RT-PCR in the case of using a mouse embryo fibroblast RORa gene deletion mutant.
  • FIG. 19 is a diagram showing the induction of Bma 1 expression when the expression of ROR a is suppressed using antisense.
  • FIG. 20 is a diagram showing that the induction of Bmal expression was promoted in a hypoxic state.
  • ROR a according to the present invention has splicing variants such as ROR a 1 and ROR a 4.
  • the amino acid sequence of ROR a 1 in human is described in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of ROR a 4 is described in SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence of ROR o; 1 in mouse is described in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of ROR a 4 is described in SEQ ID NO: 4.
  • RORa according to the present invention has homology with the amino acid sequence of RORa1, RORa4, or any one of the above proteins, and interacts with the promoter region (RORE) of Bmall.
  • RORE promoter region
  • a protein that retains a region That is, for example, when the other splicing variants of any one of the above proteins or a part of the amino acid sequence of any one of the above proteins includes a substitution, deletion, insertion, or addition, the ROR according to the present invention Included in a.
  • RORa binds to the promoter region (ROREs) of Bmall and promotes the induction of Bmall expression. Therefore, it is assumed that the following circadian rhythm regulation mechanism exists.
  • RORa When RORa expression is promoted due to hypoxia or the like, RORa acts on the promoter region (ROREs) of Bmall and promotes the expression induction of Bmall.
  • the expressed BMAL 1 forms a dimer with CLOCK and promotes the induction of expression of the Per gene and the Cry gene via the E-box (promoter region such as the Per gene and the Cry gene).
  • E-box promoter region such as the Per gene and the Cry gene.
  • Expressed PER (Per gene transcript) and CRY (Cry gene transcript) are directly involved in the formation of circadian rhythms.
  • REV a Z j8 indicates REV-ERB.
  • REV—ERB is thought to bind to the promoter region (ROREs) of Bmall competitively with ROR o; and suppress the expression of Bmall.
  • Ligand is a substance that promotes or suppresses the expression of RORa.
  • the expression of ROR o is deeply involved in the regulation of circadian rhythm. Therefore, by screening the substance (ligand), it is possible to search for new jet lag adjusting agents, anticancer agents and the like. That is, a screening system can be constructed based on the circadian rhythm regulation mechanism according to the present invention.
  • substances that suppress RORa according to the present invention antioxidant agents containing at least substances that suppress RORa, such as jet lag adjusting agents.
  • the substance that suppresses ROR o according to the present invention may be applied as a jet lag adjusting agent.
  • the substance that suppresses ROR a according to the present invention can be applied as an anticancer agent.
  • Examples of substances that suppress RORa include anti-RORa antibodies, siRNA having a part of the coding sequence of RORa, and antisense nucleic acids.
  • the anti-RORa antibody inhibits the function of RORa by specifically binding to RORa.
  • siRNA short interfering RNA
  • RNA interference Since siRNA having a part of the coding sequence of RORa suppresses the expression of RORa, it can suppress the function of RORa.
  • Antisense nucleic acids broadly include nucleic acids having a part of the coding sequence of ROR a, artificially synthesized, and those that have been modified or modified for stability. . An antisense nucleic acid suppresses the expression of ROR a by binding complementarily to the transcription product (mRNA) of ROR a, so that the function of ROR a can be suppressed.
  • Anti-RORa antibodies, siRNA, and antisense nucleic acids can be prepared by any known method.
  • a nucleic acid having a base sequence of a gene encoding RORa, or a nucleic acid having a partial base sequence of the gene can be applied to a DNA chip.
  • a DNA chip for example, the RORo; expression level in blood or a specific tissue can be detected, which may be useful in detecting circadian rhythm modulation and the like.
  • Nucleic acid can be immobilized on the DNA chip by a known method.
  • an antibody that specifically binds to RORa is applicable to a protein chip.
  • the expression level of RORa in blood or a predetermined tissue can be detected, which may be useful for detecting circadian rhythm modulation.
  • the antibody can be immobilized on the protein chip by a known method.
  • ROR ⁇ plays an important role in the mechanism for adjusting the circadian rhythm, and thus can be used as a marker for detecting the modulation of the circadian rhythm.
  • a marker for detecting the modulation of the circadian rhythm There is sex. Specifically, for example, by detecting the amount of ROR a in blood or a predetermined tissue by ELISA (known method) and the like, and detecting the modulation of ROR a expression level, the modulation of circadian rhythm can be detected. there is a possibility.
  • the screening method When screening is performed by searching for a substance that suppresses ROR a, for example, after supplying a target substance to the reaction system, the interaction between ROR a and the promoter region (RORE) of Bmall is detected. By this, the target substance can be searched. That is, when an interaction is suppressed by supplying a target substance to the reaction system, the target substance may be effective as an anticancer agent or a jet lag adjusting agent.
  • oligonucleotides of Bmall promoter region are immobilized in advance on columns, beads, etc., and after supplying RORa and target substance, ROR o And a method for detecting the interaction between B and the promoter region (RORE) of Bmall.
  • a method for detecting the interaction for example, a co-immunoprecipitation method, a pull-down method using a column or beads, and the like can be applied.
  • the screening method according to the present invention can be a kit.
  • ROR a Bmall promoter region (RORE) oligonucleotide, anti-ROR a antibody, interaction detection reagent (co-immunoprecipitation method, pull-down method using column or beads, reagent used for Western plot, etc. ), Etc. are combined as appropriate according to the interaction detection method, etc.
  • mutants may be used for the protein and oligonucleotide.
  • Example 1 the expression patterns of Rev-erb ⁇ , Ror ⁇ , and Bmall were examined as preliminary experiments.
  • Example 1 a plurality of tissues with mouse force were also collected, and the expression patterns of Rev-erb ⁇ , Ror ⁇ , and Bmall in those tissues were examined.
  • mice used in the experiment were synchronized.
  • the mice were kept in a room under light conditions from 8 o'clock to 20 o'clock and dark conditions from 20 o'clock to 8 o'clock the next 2 weeks to synchronize the circadian rhythm of the mice.
  • liver indicates the liver
  • heart indicates the kidney
  • kidney indicates the kidney
  • lung indicates the lung
  • stomach indicates the stomach.
  • the horizontal axis “ZT (Zeitgeber Times)” indicates circadian time.
  • the vertical axis “relative mRNA abundance” indicates a relative expression level (expression level).
  • the value of the expression level on the vertical axis is a relative value when the expression level of the housekeeping gene GAPDH (GlycerAldehyde-3-Phosphate DeHydrogenase) is 1.
  • Example 2 the expression patterns of Rev-erb ⁇ , Ror ⁇ , and Bmall in cultured cells NIH3T3 were examined in the same procedure as in Example 1.
  • the horizontal axis represents circadian time.
  • the vertical axis “relative mRNA abundance” indicates the relative expression level (expression level).
  • the value of the expression level on the vertical axis is a relative value when the expression level of the housekeeping gene GAPDH (GlycerAldehyde-3-Phosphate DeHydrogenase) is 1, as in Example 1.
  • Example 1 As described above, from Example 1 and Example 2, the expression patterns of the three genes Rev-erb ⁇ , Ror ⁇ , and Bmall in each tissue were confirmed.
  • Example 3 and Example 4 are experiments in which whether or not RORa induces the expression of Bmall was examined by luciferase assay.
  • Luciferase is an enzyme protein that catalyzes bioluminescence.
  • a recombinant gene in which a promoter region of a predetermined gene and a gene encoding luciferase are linked is prepared, and the recombinant gene is incorporated into a cultured cell.
  • luciferase is expressed when expression of the gene is induced.
  • Example 3 whether to induce the expression of ROR family proteins (RORa1, RORa4, RORjS, RORy) 1S Bmall was examined by luciferase assay.
  • a Bmall promoter region was incorporated into a luciferase luminescence vector pGL3 basic (Promega) to prepare a recombinant vector.
  • This recombinant vector has a Bmall promoter region and a region encoding a luciferase gene.
  • a recombinant vector was prepared by incorporating a DNA sequence encoding an ROR family protein into the expression vector pcDNA3 (manufactured by Invitrogen).
  • both the recombinant vectors prepared in (1) and (2) were transfected into cultured cells NIH3T3.
  • the transfected cultured cells were isolated and passaged to co-express both proteins. Then, 36 hours after transfection, the passaged cells were collected and lysed.
  • BM-Luc incorporated a recombinant vector having a Bmall promoter region and a region encoding luciferase gene
  • ROR ⁇ 1 incorporated a DNA sequence encoding ROR a 1 Recombinant vector
  • ⁇ ROR a 4 '' is a recombinant vector incorporating a DNA sequence encoding ROR a 4
  • ⁇ ROR ⁇ '' is a recombinant vector incorporating a DNA sequence encoding ROR ⁇
  • ROR y indicates a recombinant vector in which a DNA sequence encoding ROR y is incorporated
  • “+” indicates that these recombinant vectors are incorporated into cultured cells.
  • the vertical axis “relative luc activity represents luminescence intensity. This value is a relative value when the luminescence intensity when only“: BM-Luc ”is incorporated into cultured cells is“ 1 ”. [0077] The results shown in FIG. 4 strongly suggest that it induces the expression of ROR family proteins, particularly ROR a 1 and ROR a 4 force B mall.
  • Example 4 it was examined whether or not the expression induction level of Bmall varies when the expression level of RORa4 is varied.
  • the amount of addition of the recombinant vector incorporating the DNA sequence encoding ROR a 4 is 0 (control), 1, 5 respectively. 10, 25, 50, lOOng.
  • BM-Luc indicates a recombinant vector having a Bmall promoter region and a region encoding luciferase gene
  • + indicates that the recombinant vector has been incorporated into cultured cells.
  • ROR a 4 indicates a recombinant vector incorporating a DNA sequence encoding ROR a 4, and the number indicates the amount of recombinant vector added (in ng) at the time of transfection.
  • the vertical axis “relative luc activity represents luminescence intensity. This value is similar to FIG.
  • the Rev-erb gene is known as a circadian rhythm control gene, and the REV-ERB protein is known to bind to the promoter region (RORE) of Bmall and suppress the expression of Bmall.
  • RORE promoter region
  • Example 5 it was examined whether or not the expression of Bmall was induced when the RORa protein and the REV-ERB protein were co-expressed. [0088] The outline of the experimental procedure is as follows.
  • BM-Luc indicates a recombinant vector having a Bmall promoter region and a region encoding a luciferase gene
  • + indicates that the recombinant vector has been incorporated into a cultured cell.
  • ROR a 1 indicates a recombinant vector in which a DNA sequence encoding ROR a 1 is incorporated, and the number written in katsuko indicates the amount of recombinant vector added (in units of transfection). ng).
  • ⁇ -Galj is a control when ⁇ -galactosidase is co-expressed in the same procedure as described above.
  • the number indicates the amount of added caroten (units of recombinant vector at the time of transfection). Represents ng).
  • RE a and “RE j8” indicate recombination vectors in which Rev-erb a gene and Rev-erb ⁇ gene are inserted, respectively, and the numbers indicate the combinations at the time of transfection. Indicates the amount of replacement vector added (unit: ng).
  • Example 6 circadian changes in the expression level of Bmall when cells were cultured in the presence of a dominant negative mutant of RORa were examined.
  • the luciferase luminescence vector pGL3 basic (Promeg A recombinant vector was prepared by incorporating the promoter region of Bmall into (manufactured by a).
  • the recombinant vector was transfected into cultured cells NIH3T, and the cultured cells were isolated and subcultured.
  • luciferin luciferase substrate
  • luciferase activity luminescence intensity
  • the horizontal axis represents time (unit: minutes), and the vertical axis represents emission intensity (unit: M cpm; Million of
  • vector indicates an experimental result when an empty vector (pcDNA3) was squeezed instead of the dominant negative mutant (control).
  • Example 7 regarding the induction of Bmall expression by ROR a,
  • Example 7 DNA sequences with different lengths were prepared for the upstream region of the Bmall gene, and the expression induction level of Bmall by ROR o; was obtained by the same procedure as in Example 3. .
  • “Luciferase” indicates that the region is a DNA sequence encoding luciferase
  • “Exonl” indicates that the region has the sequence of the first etason part of the Bmall gene.
  • “HBmall” represents the human Bmall gene.
  • ROREl and “RORE2” indicate that the region is a promoter region of the Bmall gene, respectively.
  • One 3465 indicates that the DNA has a sequence up to 3465 bases upstream of the Bmall gene sequence. The same applies to other numbers.
  • mt represents a mutant and indicates that a part of the sequence of ROREl, RORE2, or both is mutated.
  • ROR a 1 represents a recombinant vector incorporating a DNA sequence encoding ROR a 1
  • “+” represents that the recombinant vector was incorporated into a cultured cell.
  • “—” Indicates that it is not included.
  • BM-Luc indicates a recombinant vector having a Bmall promoter region and a region encoding a noreluciferase gene.
  • One 3465 indicates that the sequence includes up to 3465 bases upstream of the recombinant vector force Bmall gene sequence
  • “One 829” indicates 829 bases upstream of the recombinant vector force Bmall gene sequence
  • “One 230” indicates that the recombinant vector contains a sequence up to 230 bases upstream of the Bmall gene sequence.
  • RORElmutZRORE2 indicates that RORE1 is deleted
  • RORElZROR E2mutJ indicates that RORE2 is deleted
  • RORElmut / RORE2mut indicates that both RORE1 and RORE2 are deleted.
  • Mot represents a mutant.
  • Example 8 using the recombinant vector prepared in Example 7 (see Fig. 8), The circadian change in the expression level of Bmall was examined by the same procedure as in Example 6.
  • Example 7 shows that the induction of Bmall expression by RORa requires both promoter regions (ROREl and RORE2) of the Bmall gene. It shows that. Therefore, it is strongly suggested that RORa acts on both promoter regions of the Bmall gene to induce Bmall expression.
  • Example 9 the binding between the promoter region (RORE) of Bmall and RORa was examined by a pull-down method.
  • oligonucleotide containing the sequence of the promoter region (RORE) of Bmall was biotinylated. Piotinylated oligonucleotide was immobilized on Streptavidin-Sepharose beads (Amersham).
  • nucleic acid indicates a case (control) when an oligonucleotide is bound to piotin.
  • BM—ROREs shows the results when the oligonucleotide containing the Bmall promoter region (RORE) sequence was piotinated.
  • BM-mROREs shows the result of piotiny oligonucleotide (mutant) in which Bmall promoter region (RORE) sequence is partially changed.
  • M represents a mutant.
  • CT circadian time
  • the mouse force also represents the time when the liver was collected, and is indicated by the circadian time (the time when the light condition start time is 0 o'clock).
  • Example 10 an actogram was performed using mutant mice lacking the RORa gene, and the effect on the circadian rhythm of RORo; gene-deficient mice was examined.
  • a "gramgram” is a method of continuously recording the activity time of a mouse by detecting the eating and drinking behavior of the mouse.
  • Fig. 12 is an actogram when the light condition and dark condition are repeated every 12 hours for 15 days and then free run (free continuation) is performed under the dark condition.
  • LD indicates an environment in which light conditions (light) and dark conditions (dark) are repeated
  • DD indicates an environment in which dark conditions (dark) are continued, that is, when free-run (free continuation) is performed. Indicates.
  • Figure 13 shows that the breeding environment was changed to a dark condition for 24 hours based on the experimental results shown in Figure 12. It is the figure which acquired the average value of the circadian cycle of a mouse
  • Fig. 14 is an actogram when the light condition and the dark condition are repeated every 12 hours for 15 days, and then the start time of the dark condition is advanced by 4 hours, resulting in a time difference state.
  • Figure 15 shows an external graph in which the light condition and dark condition are repeated every 12 hours for 15 days, and then the environmental condition is changed to an environment where the light condition and dark condition are repeated every 6 hours. It is.
  • Example 11 when RORa expression was suppressed by RNA interference, it was examined whether the induction of Bmall expression was also suppressed.
  • a recombinant siRNA expression vector was prepared. From the 849th to 1391th bases of the gene sequence encoding RORa4, a sequence having a base strength of 19 (SEQ ID NO: 5) was selected. Then, the sequence was incorporated into an siRNA expression vector to prepare a recombinant expression vector.
  • luciferin (a luciferase substrate) was added to the culture solution every 15 minutes, and luciferase activity (luminescence intensity) was measured. Then, the transcriptional circadian rhythm of B mall was obtained from the circadian change of the emission intensity.
  • the horizontal axis represents time (unit: minutes), and the vertical axis (relative cpm) represents emission intensity.
  • the emission intensity is a relative value when the peak of the first emission intensity is “1”.
  • vector indicates an experimental result obtained when an empty vector (pcDNA3) was prepared instead of the dominant negative mutant (control).
  • RNAi control
  • siRNA control
  • RNAi (ROR ⁇ ) is a case where siRNA having a part of the base sequence encoding RORa is used.
  • Example 12 mouse embryo fibroblasts (MEF; Mouse Embryonic)
  • Fibroblast was used to examine whether ROR ⁇ had an effect of promoting Bmall expression induction.
  • Example 12 using a mouse embryo fibroblast RORa gene deletion mutant,
  • a recombinant vector was prepared by incorporating the Bmall promoter region into the luciferase luminescence vector pGL3 basic (Promega).
  • the recombinant vector was transformed into a mouse embryo fibroblast RORa gene deletion mutation. After transfection into the body, the cultured cells were isolated and passaged.
  • luciferin (a luciferase substrate) was added to the culture solution every 15 minutes, and luciferase activity (luminescence intensity) was measured. Then, the transcriptional circadian rhythm of B mall was obtained from the circadian change of the emission intensity.
  • the horizontal axis represents time (unit: minutes), and the vertical axis (relative cpm) represents emission intensity.
  • the vertical axis represents emission intensity.
  • the emission intensity is a relative value when the peak of the first emission intensity is “1”.
  • Example 13 circadian changes in the expression level of Bmall in RORa gene-deficient mutants of mouse embryo fibroblasts were examined by quantitative real-time RT-PCR.
  • the horizontal axis represents time (unit: minutes).
  • the vertical axis “relative mRNA abundance” shows the relative expression level (expression level).
  • the value of the vertical axis represents the housekeeping gene GAPDH (GlycerAldehyde—3—Phosphate DeHy as in Example 1. It is a relative value when the expression level of drogenase is 1.
  • Example 14 when the expression of ROR a was suppressed using an antisense nucleic acid, Bmal
  • an antisense nucleic acid expression vector was prepared.
  • a DNA fragment having the same base sequence as the predetermined region was incorporated into pcDNA3 to prepare an antisense nucleic acid expression vector.
  • a DNA fragment a fragment having a sequence from 65 to 574 bases of a gene encoding RORa, a fragment having a sequence from 599 to 1122 bases, and a sequence from 849 to 1391 bases Three types of fragments were used.
  • luciferin luciferase substrate
  • luciferase activity luminance intensity
  • the horizontal axis represents time (unit: minutes), and the vertical axis (relative cpm) represents emission intensity.
  • the emission intensity is a relative value when the peak of the first emission intensity is “1”.
  • AS (ROR a 1) is an antisense nucleic acid, and when using a fragment having a sequence of bases 65 to 574 of a gene encoding ROR a, "AS (ROR a 2)" When using a fragment having a sequence of 599 to 1122 bases as an antisense, “AS (ROR a 3)” has a sequence of 849 to 1391 bases as an antisense. When a fragment is used,
  • Example 15 examined the force that can promote the induction of Bmall expression in a hypoxic state.
  • a recombinant vector was prepared by incorporating the Bmall promoter region into the luciferase luminescence vector pGL3 basic (Promega).
  • Luciferase activity (luminescence intensity) was measured. Then, Bmall's transcriptional circadian rhythm was obtained from the circadian change of the emission intensity.
  • Hypoxia can be achieved by culturing cells under the condition of addition of salt and sodium chloride (CoCl 2).
  • the horizontal axis represents time (unit: minutes), and the vertical axis (relative cpm) represents emission intensity.
  • the vertical axis represents emission intensity.
  • the emission intensity is a relative value when the peak of the first emission intensity is “1”.
  • MNaCl is obtained when 0. ImMNaCI is added to the culture medium instead of 0. OlmMCoCl (
  • the present invention is useful in that it reveals an unclear part of the circadian rhythm regulation mechanism. Therefore, the present invention relates to a disease involved in the circadian rhythm regulation mechanism, for example, for example, it can be applied as a preventive or therapeutic agent for diseases such as cancer, sleep disorders, jet lag, arousal disorder, insomnia, autonomic dysfunction, depression, and senile dementia. It can also be applied to screening methods and screening kits such as DNA chips, protein chips, markers for detecting circadian rhythm modulation, and anti-cancer agents.

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Abstract

　概日リズムの調節メカニズムのうち、未解明な部分を明らかにすること。本発明者らは、ＲＯＲα（ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｌｐｈａ、以下同じ）が、Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進すること、及び、低酸素状態において、Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進されること、を新規に見出した。このことは、低酸素状態などで、ＲＯＲαの発現が促進されると、Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進され、Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進されると、ＢＭＡＬ１とＣＬＯＣＫとの結合が促進され、Ｐｅｒ遺伝子又はＣｒｙ遺伝子の発現誘導が促進される、という概日リズムの調節メカニズムの存在を強く示唆する。従って、本発明に係る本発明は、時差ぼけ調整剤、抗がん剤として、適用できる可能性がある。

Description

明 細 書
Bmallの発現誘導を促進する ROR a
技術分野
[0001] 本発明は、時計遺伝子の作用メカニズム及びその周辺技術に関する。より詳細に は、 Bmall (brain— muscle ARNT— like protein 1)の発現誘導を促進する R OR a (retinoic acid receptor― related orphan receptor)、並びに抗カ Sん 剤、時差ぼけ調整剤、それらの薬剤のスクリーニング方法などに関する。
背景技術
[0002] 概日リズム（サ一力ディアンリズム）は、約 24時間を周期とする生物リズムであり、単 細胞生物からヒトに至るまで、多くの生物に普遍的に見られる生体内現象である。各 生物は、概日リズムの制御に関わる遺伝子を有し、概日リズム制御遺伝子が、概日リ ズムの調整を行って 、る。
[0003] 哺乳類では、概日リズム制御遺伝子の発現量が脳視床下部の視交叉上核 (SCN) で特に高ぐ個体レベルでの概日リズム調整の中枢を担っている。一方、生体内のそ の他の組織 (概日リズム末梢組織）にお 、ても、概日リズム制御遺伝子は発現してお り、概日リズム中枢と同様に、概日リズム制御遺伝子による細胞 ·組織ごとの概日リズ ム調整が行われている。
[0004] 哺乳類における概日リズム制御遺伝子としては、 Per遺伝子（Perl、 Per2、 Per3) 、 Clock遺伝子、 Bmal遺伝子（Bmall、 Bmal2、 Bmal3)、 Cry遺伝子、 Rev—erb 遺伝子（Rev— erb a、 Rev—erb j8 )などが知られている。
[0005] そのうち、 BMAL1 (Bmall遺伝子の転写産物、以下同じ）は、 CLOCK (Clock遺 伝子の転写産物、以下同じ）と二量体を形成し、 E— box (Perl遺伝子のプロモータ 一領域)を介して、 Per遺伝子、 Cry遺伝子などの発現を活性化することが示唆され 飞いる ( ekakis, N. et al. Role of theし LOCK protein in the mammalian circadian mechanism." Science 280, 1564-9 (1998)など参照）。
[0006] また、 Bmall遺伝子は、 REV— ERB (Rev— erb遺伝子の転写産物、以下同じ）な どによって、発現が調節されることが示唆されている（Preitner, N. et al. "The orphan nuclear receptor REV— ERBalpha controls circadian transcription within the positive limb of the mammalian circadian clock" Cell 110, 251—60 (2002)など参照）。
[0007] ここで、本発明にかかわりのあるタンパク質、 ROR a (retinoic acid binding -r eceptor alpha,以下同じ）について、説明する。 ROR aは、 RORA (Rar— relate d orphan receptor A)などとも呼ばれるタンパク質で、 ROR a 1、 ROR o; 4など のスプライシングバリアントが明らかになつている。なお、「スプライシングバリアント」は 、同一遺伝子に由来する、アミノ酸配列の一部が異なったタンパク質のことであり、ス プライシングの際のつながり方が異なるために生じる。
[0008] また、 ROR aは、低酸素状態にお!、て、発現が促進されることが報告されて!、る (C hauvet, C. et al. 'Retinoic acid receptor-related orphan receptor (ROR)alpha4 is th e predominant isoform of the nuclear receptor RORalpha in the liver and is up— regul atea by hypoxia in HepG2 human hepatoma cells." Biochem J364, 449-56 (2002)参 照)。
[0009] 哺乳類における概日リズムの調節メカニズムは、特に、未解明な部分が多 、。一方 、概日リズムは、睡眠、覚醒だけでなぐ体温調節、ホルモン分泌など、生物の恒常 性や体内調節機構にも深くかかわつていることが示唆されている。また、がんをはじ めとする多くの疾患の発症機構にも関与している可能性がある。
[0010] そこで、本発明は、概日リズムの調節メカニズムのうち、未解明な部分を明らかにす ることを主な目的とする。
発明の開示
[0011] 本発明者らは、 ROR a (retinoic acid binding -receptor alpha、以下同じ） 力 Bmallの発現誘導を促進すること、及び、低酸素状態において、 Bmallの発現 誘導が促進されること、を新規に見出した。
[0012] そこで、本発明では、 Bmallの発現誘導を促進する ROR a、及び、低酸素状態で
、 Bmallの発現誘導を促進する ROR o;、を提供する。
[0013] 本発明は、次のような概日リズムの調節メカニズムの存在を強く示唆する。
[0014] 低酸素状態などで、 ROR aの発現が促進されると、 Bmallの発現誘導が促進され る。 Bmallの発現誘導が促進されると、 BMAL1と CLOCKとの結合が促進され、 Pe r遺伝子及び Z又は Cry遺伝子の発現誘導が促進される。
[0015] また、本発明では、 ROR a力 REV— ERB a又は REV— ERB βと競合的に、 Β mallの発現誘導を促進することを、新規に見出した。従って、本発明は、 ROR aと R EV— ERBの両者が Bmallの発現誘導を調節することにより、概日リズムを調整する メカニズムの存在をも強く示唆する。
[0016] 本発明により、 ROR aと Bmallのプロモーター領域 (RORE)との相互作用が明ら 力になった。従って、 Bmallの発現リズムの変調などにより、概日リズムの変調が引き 起こされた場合、本発明により、概日リズムを調整できる可能性がある。
[0017] 例えば、 ROR aを抑制する物質は、時差ぼけ調整剤としての適用可能性がある。
その他、概日リズムが変調した場合として、例えば、睡眠障害、覚醒障害、不眠症、 自律神経失調症、うつ病、老人性痴呆、夜間勤務，交代勤務など生活リズムの不規 則化による体調の悪化、自閉症などにおける生活リズムの不規則化による消耗、など が挙げられる。これらの疾患に対しても、本発明は適用可能性がある。
[0018] カロえて、本発明は、抗がん剤として、適用できる可能性がある。
[0019] 一般に、がん組織では、低酸素状態に陥ることが多い。また、例えば、夜間勤務に よる看護婦などの乳がん発生率上昇などは、概日リズムの変調が誘因であると指摘さ れている。
[0020] それに対し、本発明では、低酸素状態において、 Bmallの発現誘導が促進される ことを明らかにした。従って、 ROR o;を抑制する物質は、抗がん剤として、適用できる 可能性がある。
[0021] その他、本発明は、 DNAチップ、プロテインチップ、概日リズムの変調を検出する ためのマーカーとしての使用、抗がん剤又は時差ぼけ調整剤のスクリーニング方法 などに適用できる可能性がある。
[0022] 本発明により、 ROR o;が Bmallの発現誘導を促進することが明らかになつたため、 本知見に基づき、概日リズムを調整できる。
図面の簡単な説明
[0023] [図 1]図 1は、概日リズムの調節メカニズムを示す図。
[図 2]図 2は、各組織における、 Rev— erb α、 Ror α、 Bmallの発現パターンを示す 図。
[図 3]図 3は、培養細胞 NIH3T3における、 Rev— erb α、 Ror α、 Bmallの発現パタ ーンを示す図。
[図 4]図 4は、 ROR a力 ¾malの発現を誘導したことを示す図。
[図 5]図 5は、 ROR a 4の発現量の増大に伴い、 Bmalの発現誘導も促進されることを 示す図。
[図 6]図 6は、 ROR aと REV—ERBタンパク質が、 Bmalのプロモーター領域に競合 的に作用することを示す図。
[図 7]図 7は、 ROR aのドミナントネガティブ変異体の存在下で細胞を培養した場合 の、 Bmal発現量の概日変化を示す図。
[図 8]図 8は、作製した組換えベクターの配列を示す図。
[図 9]図 9は、 Bmallの上流領域の長さをかえた場合における、 ROR aによる Bmal の発現誘導レベルを示す図。
[図 10]図 10は、 Bmallの上流領域の長さをかえた場合における、 Bmal発現量の概 日変化を示す図。
[図 11]図 11は、プルダウン法による、ウェスタンプロット写真（図面代用写真)。
[図 12]図 12は、 15日間、 12時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、暗条件でフ リーラン（自由継続)させた場合のァクトグラム。
[図 13]図 13は、 15日間、 12時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、飼育環境を
24時間暗条件にした場合の、マウスの概日周期を取得した図。
[図 14]図 14は、 15日間、 12時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、暗条件の開 始時刻を 4時間早め、時差のある状態にした場合のァクトグラム。
[図 15]図 15は、 15日間、 12時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、環境条件を
、6時間ごとに明条件と暗条件を繰り返す環境に変化させた場合のァ外グラム。
[図 16]図 16は、 RNA干渉により、 ROR aの発現を抑制した場合の、 Bmalの発現誘 導を示す図。
[図 17]図 17は、マウス胚繊維芽細胞の ROR a遺伝子欠損変異体を用いた場合の、 Bmal発現誘導の概日変化を示す図。 [図 18]図 18は、マウス胚繊維芽細胞の ROR a遺伝子欠損変異体を用いた場合に おける、定量的リアルタイム RT— PCRによる、 Bmal発現量の概日変化を示す図。
[図 19]図 19は、アンチセンスを用いて ROR aの発現を抑制した場合における、 Bma 1の発現誘導を示す図。
[図 20]図 20は、低酸素状態において、 Bmalの発現誘導が促進されたことを示す図。 発明を実施するための最良の形態
[0024] <本発明に係る ROR aにつ 、て >
はじめに、本発明に係る ROR o;について、以下説明する。
[0025] 本発明に係る ROR aは、 ROR a 1、 ROR a 4などのスプライシングバリアントを有 する。ヒトにおける ROR a 1のアミノ酸配列を配列番号 1に、 ROR a 4のアミノ酸配列 を配列番号 2に記載する。また、マウスにおける ROR o; 1のアミノ酸配列を配列番号 3に、 ROR a 4のアミノ酸配列を配列番号 4に記載する。
[0026] なお、本発明に係る ROR aは、 ROR a 1、 ROR a 4、若しくは前記いずれかのタン パク質のアミノ酸配列と相同性を有し、 Bmallのプロモーター領域 (RORE)と相互 作用する領域を保持するタンパク質である。即ち、例えば、前記いずれかのタンパク 質の他のスプライシングバリアントや、前記いずれかのタンパク質のアミノ酸配列中の 一部に、置換、欠損、挿入、付加部分が含まれる場合も、本発明に係る ROR aに包 含される。
[0027] <本発明に係る概日リズムの調節メカニズムについて >
続いて、 ROR aに関わる概日リズムの調節メカニズムについて、図 1を参照にしな がら、以下説明する。
[0028] 本発明により、 ROR aは、 Bmallのプロモーター領域 (ROREs)に結合し、 Bmall の発現誘導を促進することが明らかになった。従って、次のような概日リズムの調節メ 力-ズムが存在すると推測される。
[0029] 低酸素状態などにより、 ROR aの発現が促進されると、 ROR aは、 Bmallのプロ モーター領域 (ROREs)に作用し、 Bmallの発現誘導を促進する。発現した BMAL 1は、 CLOCKと二量体を形成し、 E—box (Per遺伝子、 Cry遺伝子などのプロモー ター領域)を介して、 Per遺伝子、 Cry遺伝子の発現誘導を促進する。発現した PER (Per遺伝子の転写産物)及び CRY (Cry遺伝子の転写産物）は、概日リズムの形成 に直接的に関与する。
[0030] なお、図中、「RE a Z j8」は、 REV— ERBを示す。 REV— ERBは、 Bmallのプロ モーター領域 (ROREs)に、 ROR o;と競合的に結合し、 Bmallの発現を抑制すると 考えられている。
[0031] また、図中、「Ligand」は、 ROR aの発現を促進又は抑制する物質である。上記の 通り、 ROR o;の発現は、概日リズムの調整に深く関わる。従って、その物質 (ligand) をスクリーニングすることにより、新規時差ぼけ調整剤、抗がん剤などを探索できる。 即ち、本発明に係る概日リズムの調節メカニズムに基づいて、スクリーニング系を構 築できる。
[0032] <本発明に係る ROR aを抑制する物質にっ 、て >
続ヽて、本発明に係る ROR aを抑制する物質 (ROR aを抑制する物質を少なくと も含有する抗がん剤'時差ぼけ調整剤など）について、以下説明する。
[0033] 後述する実施例において、概日リズムがシフトした場合 (明条件の開始時間が変更 された場合など）、 ROR aの発現を抑制することにより、通常よりも早ぐ新しい概日リ ズムに同調できる、という結果が得られた。従って、本発明に係る ROR o;を抑制する 物質は、時差ぼけ調整剤としての適用可能性がある。
[0034] また、本発明では、低酸素状態において、 Bmallの発現誘導が促進されることを明 らかにした。一方、上述の通り、がん組織では、低酸素状態に陥ることが知られている
。従って、本発明に係る ROR aを抑制する物質は、抗がん剤として、適用できる可能
'性がある。
[0035] ROR aを抑制する物質として、例えば、抗 ROR a抗体、 ROR aのコード配列の一 部を有する siRNA、アンチセンス核酸などが挙げられる。
[0036] 抗 ROR a抗体は、 ROR aと特異的に結合することにより、 ROR aの機能を抑制す る。
[0037] siRNA (short interfering RNA)は、 RNA干渉によって遺伝子発現を抑制す る、短い二本鎖 RNAである。 ROR aのコード配列の一部を有する siRNAは、 ROR aの発現を抑制するため、 ROR aの機能を抑制できる。 [0038] アンチセンス核酸は、 ROR aのコード配列の一部を有する核酸で、人工的に合成 されたもの、安定ィ匕するために修飾'カ卩ェなどを施したもの、を広く包含する。アンチ センス核酸は、 ROR aの転写産物（mRNA)と相補的に結合することにより、 ROR a の発現を抑制するため、 ROR aの機能を抑制できる。
[0039] 抗 ROR a抗体、 siRNA、アンチセンス核酸は、 、ずれも、公知方法により、作製で きる。
[0040] <本発明に係る DNAチップ、プロテインチップについて >
続いて、本発明に係る DNAチップ及びプロテインチップについて、以下説明する。
[0041] ROR aをコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸、又は、前記遺伝子の一部分 の塩基配列を有する核酸は、 DNAチップに適用可能である。 DNAチップにそれら の核酸を固定することにより、例えば、血液中や所定の組織中の ROR o;発現量を検 出できるため、概日リズムの変調などの検出に、有用な可能性がある。 DNAチップ への核酸の固定は、公知方法により行うことができる。
[0042] 同様に、 ROR aと特異的に結合する抗体は、プロテインチップに適用可能である。
プロテインチップに、この抗体を固定することにより、例えば、血液中や所定の組織中 の ROR a発現量を検出できるため、概日リズムの変調などの検出に、有用な可能性 がある。プロテインチップへの抗体の固定も、公知方法により行うことができる。
[0043] <本発明に係る概日リズムの変調を検出するためのマーカーとしての使用につ!/ヽ て >
続いて、本発明に係る概日リズムの変調を検出するためのマーカーとしての使用に ついて、以下説明する。
[0044] 上述の通り、本発明に係る ROR αは、概日リズムを調整するメカニズムにお 、て、 重要な役割を果たしているため、概日リズムの変調を検出するためのマーカーとして 使用できる可能性がある。具体的には、例えば、血液中や所定の組織中の ROR a 量を ELISA法 (公知方法)などで検出し、 ROR a発現量の変調を検出することにより 、概日リズムの変調を検出できる可能性がある。
[0045] <本発明に係るスクリーニング方法にっ ヽて >
続いて、本発明に係るスクリーニング方法の一例について、以下説明する。 [0046] ROR aを抑制する物質を探索することにより、スクリーニングを行う場合、例えば、 反応系に標的物質を供給した後、 ROR aと Bmallのプロモーター領域 (RORE)と の相互作用を検出することにより、 目的の物質を探索できる。即ち、反応系に標的物 質を供給することにより相互作用が抑制された場合、その標的物質は、抗がん剤又 は時差ぼけ調整剤として有効な可能性がある。
[0047] スクリーニング方法の具体例として、例えば、予め、 Bmallのプロモーター領域 (R ORE)のオリゴヌクレオチドを、カラム、ビーズなどに固定しておき、 ROR aと標的物 質を供給した後、 ROR o;と Bmallのプロモーター領域 (RORE)との相互作用を検 出する方法、が考えられる。その場合、相互作用を検出する方法として、例えば、共 免疫沈降法、カラム又はビーズを用いたプルダウン法、などを適用できる。
[0048] なお、本発明に係るスクリーニング方法は、キットィ匕が可能である。その場合、例え ば、 ROR a、 Bmallのプロモーター領域（RORE)のオリゴヌクレオチド、抗 ROR a 抗体、相互作用検出試薬 (共免疫沈降法、カラム又はビーズを用いたプルダウン法、 ウェスタンプロットなどに用いる試薬）、などを、相互作用検出方法などに応じて適宜 組み合わせ、キットィ匕する。その場合、前記タンパク質及びオリゴヌクレオチドは、変 異体を用いてもよい。
実施例 1
[0049] 実施例 1及び実施例 2では、予備的実験として、 Rev—erb α、 Ror α、 Bmallの発 現パターンを調べた。
[0050] 実施例 1では、マウス力も複数の組織を採取し、それらの組織における、 Rev—erb α、 Ror α、 Bmallの発現パターンを調べた。
[0051] 実験手順の概要は次の通りである。
[0052] (1)まず、実験に用いたマウスの概日リズムを同調させた。マウスを、 2週間、 8時か ら 20時まで明条件、 20時から翌 8時までを暗条件にした部屋で飼育し、マウスの概 日リズムを同調させた。
[0053] (2)次に、マウスカも概日リズム末梢組織として、肝臓、心臓、腎臓、肺、胃を所定 の時刻に採取した。なお、各臓器の採取時刻は、概日リズムの同調を行った直後の 8 時から、 4時間ごとに設定した（8時、 12時、 16時、 20時、 24時、翌 4時)。 [0054] (3)次に、採取した各臓器をホモジナイズ後、 Promega total SV RNA Isola tion Kit (Promega社製）を用いて、各臓器から total RNAを抽出した。
[0055] (4)次に、定量的リアルタイム RT— PCR (定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ反 応）を行 、、 Rev-erb α、 Ror α、 Bmallの各遺伝子の発現量を測定した。
[0056] 結果を図 2に示す。
[0057] 図中、「liver」は肝臓を、「heart^¾心臓を、「kidney」は腎臓を、「lung」は肺を、「 stomach」は胃を、それぞれ示す。
[0058] 各グラフ中、横軸「ZT (Zeitgeber Times)」は、概日時間を示す。また、縦軸「rel ative mRNA abundance」は、相対的な発現量（発現レベル）を示す。なお、縦軸 の発現量の値は、ハウスキーピング遺伝子 GAPDH (GlycerAldehyde— 3— Phos phate DeHydrogenase)の発現量を 1とした場合の相対的な値である。
実施例 2
[0059] 実施例 2では、培養細胞 NIH3T3における、 Rev— erb α、 Ror α、 Bmallの発現 パターンを、実施例 1と同様の手順で調べた。
[0060] 結果を図 3に示す。
[0061] 図中、横軸は、概日時間を示す。また、縦軸「relative mRNA abundance」は、 相対的な発現量 (発現レベル)を示す。なお、縦軸の発現量の値は、実施例 1と同様 、ハウスキーピング遺伝子 GAPDH (GlycerAldehyde— 3— Phosphate DeHydr ogenase)の発現量を 1とした場合の相対的な値である。
[0062] 以上、実施例 1及び実施例 2より、各組織における、 Rev-erb α、 Ror α、 Bmall の 3つの遺伝子の発現パターンを確認できた。
実施例 3
[0063] 続いて、実施例 3及び実施例 4は、 ROR aが Bmallの発現を誘導するかどうかを、 ルシフェラーゼアツセィにより調べた実験である。
[0064] 「ルシフェラーゼアツセィ」の概要について、以下説明する。
[0065] ルシフェラーゼは、生物発光を触媒する酵素タンパク質である。
[0066] 例えば、所定の遺伝子のプロモーター領域とルシフェラーゼをコードする遺伝子と を連結させた組換え遺伝子を作製し、その組換え遺伝子を培養細胞に組み込んだ 場合、その遺伝子の発現が誘導されると、ルシフェラーゼが発現する。
[0067] そこで、ルシフェラーゼによる生物発光を測定し、ルシフェラーゼの発現レベルを取 得することにより、その遺伝子の発現誘導レベルを推定することができる。
[0068] 実施例 3では、 RORファミリータンパク質 (ROR a 1、 ROR a 4、 ROR jS、 ROR y ) 1S Bmallの発現を誘導するかどうかを、ルシフェラーゼアツセィにより調べた。
[0069] 実験手順の概要を以下に示す。
[0070] (1)まず、ルシフェラーゼ発光ベクター pGL3 basic (Promega社製）に、 Bmall のプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した。この組換えベクター は、 Bmallのプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子をコードする領域を有する。
[0071] (2)また、発現ベクター pcDNA3 (Invitrogen社製）に、 RORファミリータンパク質 をコードする DNA配列を組み込んで、組換えベクターを作製した。
[0072] (3)次に、（1)及び（2)で作製した組換えベクターを、共に、培養細胞 NIH3T3にト ランスフエクシヨンした。次に、トランスフエクシヨンした培養細胞を、単離'継代し、両 たんぱく質を共発現させた。そして、トランスフエクシヨンの 36時間後に、継代した細 胞を集め、溶解させた。
[0073] (4)次に、 Dual Luciferase Assay System (Promega社製）を用いて、溶解さ せた細胞溶液を調製した後、発光強度を測定し、 Bmallの発現誘導レベルを取得し た。
[0074] 結果を図 4に示す。
[0075] 図中、「BM— Luc」は、 Bmallのプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子をコー ドする領域を有する組換えベクターを、「ROR α 1」は、 ROR a 1をコードする DNA 配列を組み込んだ組換えベクターを、「ROR a 4」は、 ROR a 4をコードする DNA配 列を組み込んだ組換えベクターを、「ROR β」は、 ROR βをコードする DNA配列を 組み込んだ組換えベクターを、「ROR y」は、 ROR yをコードする DNA配列を組み 込んだ組換えベクターを、それぞれ示し、「 +」は、それらの組換えベクターを、培養 細胞に組み込んだことを表す。
[0076] 縦軸「relative luc activity は、発光強度を表す。この値は、「： BM— Luc」のみ を培養細胞に組み込んだ場合の発光強度を「 1」とした場合の相対値である。 [0077] 図 4に示す結果は、 RORファミリータンパク質、特に、 ROR a 1及び ROR a 4力 B mallの発現を誘導することを強く示唆する。
実施例 4
[0078] 実施例 4では、 ROR a 4の発現レベルを変動させた場合、 Bmallの発現誘導レべ ルも変動するかどうかについて調べた。
[0079] 実験は、実施例 3と同様の方法により行った。
[0080] なお、糸且換えベクターを培養細胞にトランスフエクシヨンする際、 ROR a 4をコード する DNA配列を組み込んだ組換えベクターの添カ卩量を、それぞれ、 0 (コントロール )、 1、 5、 10、 25、 50、 lOOngとした。
[0081] 結果を図 5に示す。
[0082] 図中、「BM—Luc」は、 Bmallのプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子をコー ドする領域を有する組換えベクターを示し、「 +」は、組換えベクターを、培養細胞に 組み込んだことを表す。
[0083] 「ROR a 4」は、 ROR a 4をコードする DNA配列を組み込んだ組換えベクターを示 し、数字は、トランスフエクシヨンの際の、組換えベクターの添加量 (単位は ng)を表す
[0084] 縦軸「relative luc activityは、発光強度を表す。この値は、図 4と同様、「BM
-Lucjのみを培養細胞に組み込んだ場合の発光強度を「1」とした場合の相対値で ある。
[0085] 図 5の結果は、 ROR a 4の発現量の増大に伴!、、 Bmallの発現誘導も促進される ことを強く示唆する。従って、この結果は、 ROR o; 4の促進が Bmallの発現を誘導す ることを強く示唆する。
実施例 5
[0086] Rev—erb遺伝子は、概日リズム制御遺伝子として知られ、 REV— ERBタンパク質 は、 Bmallのプロモーター領域 (RORE)に結合して、 Bmallの発現を抑制すること が知られている。
[0087] そこで、実施例 5では、 ROR aタンパク質と REV— ERBタンパク質を共発現させた 場合、 Bmallの発現が誘導されるかどうかについて、調べた。 [0088] 実験手順の概要は、以下の通りである。
[0089] (1)まず、実施例 3などと同様の手順により、 Bmallのプロモーター領域を組み込 んだ組換えベクター、 RORひ 1をコードする DNA配列を組み込んだ組換えベクター 、 Rev— erb遺伝子を組み込んだ組換えベクター、をそれぞれ作製した。
[0090] (2)次に、その 3つの組み換えベクターを、共に、培養細胞 NIH3T3にトランスフエ クシヨンし、各タンパク質を共発現させた。
[0091] (3)そして、その培養細胞を溶解させた後、 Dual Luciferase Assay System ( Promega社製)を用いて、溶解させた細胞溶液を調製し、発光強度を測定した。
[0092] 結果を図 6に示す。
[0093] 図中、「BM—Luc」は、 Bmallのプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子をコー ドする領域を有する組換えベクターを示し、「 +」は、組換えベクターを、培養細胞に 組み込んだことを表す。
[0094] 「ROR a 1」は、 ROR a 1をコードする DNA配列を組み込んだ組換えベクターを示 し、カツコ書きの数字は、トランスフエクシヨンの際の、組換えベクターの添加量（単位 は ng)を表す。
[0095] 「 β -Galjは、前記と同様の手順で β ガラクトシダーゼを共発現させた場合を示 し、コントロールである。数字は、トランスフエクシヨンの際の、組換えベクターの添カロ 量 (単位は ng)を表す。
[0096] 「RE a」、「RE j8」は、それぞれ、 Rev -erb a遺伝子、 Rev— erb β遺伝子を糸且み 込んだ組換えベクターを示し、数字は、トランスフエクシヨンの際の、組換えベクター の添加量（単位は ng)を表す。
[0097] 図 6の結果は、 ROR aと REV— ERBタンパク質は、 Bmallのプロモーター領域に 競合的に作用することを強く示唆する。
実施例 6
[0098] 実施例 6では、 ROR aのドミナントネガティブ変異体の存在下で細胞を培養した場 合の、 Bmall発現量の概日変化について調べた。
[0099] 実験手順の概要は次の通りである。
[0100] まず、実施例 3などと同様に、ルシフェラーゼ発光ベクター pGL3 basic (Promeg a社製）に、 Bmallのプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した。
[0101] 次に、培養細胞 NIH3Tに、その組み換えベクターをトランスフエクシヨンし、その培 養細胞を単離 '継代した。
[0102] 次に、その培養細胞に血清刺激を加えることにより、概日リズムを発生させた。
[0103] 次に、培養液に、 ROR a 1のドミナントネガティブ変異体をカ卩えた後、 15分おきに、 ルシフェリン (ルシフェラーゼの基質)を加え、ルシフェラーゼ活性 (発光強度）を測定 した。そして、その発光強度の概日変化より、 Bmallの転写概日リズムを取得した。
[0104] 結果を図 7に示す。
[0105] 図中、横軸は時間（単位は分）を、縦軸は発光強度（単位は M cpm ; Million of
Counts Per Minutes)を、それぞれ示す。
[0106] 「vector」は、ドミナントネガティブ変異体の代わりに空ベクター (pcDNA3)をカロえ た場合 (コントロール)の実験結果であることを示す。
[0107] 「 /3 -Galjは、ドミナントネガティブ変異体の代わりに /3 ガラクトシダーゼをカ卩えた 場合 (コントロール)の実験結果であることを示す。
[0108] 「hROR α Ι Δ LBD」は、ヒト ROR a 1のドミナントネガティブ変異体をカ卩えた場合の 実験結果であることを示す。
[0109] 図 7に示す通り、 ROR a 1のドミナントネガティブ変異体をカ卩えた場合、 Bmallの転 写概日リズムが抑制された。即ち、この結果は、 ROR o;力 bmallの発現を誘導する だけでなぐ Bmallの転写概日リズムの発現に、重要な役割を果たしていることを強 く示唆する。
実施例 7
[0110] 実施例 7及び実施例 8では、 ROR aによる Bmallの発現誘導に関して、 ROR aの
、 Bmallの配列における作用部位を調べた。
[0111] 実施例 7では、 Bmall遺伝子の上流領域の DNA配列について、それぞれ長さの 異なるものを作製し、実施例 3などと同様の手順により、 ROR o;による Bmallの発現 誘導レベルを取得した。
[0112] 実験手順の概要について、以下説明する。
[0113] (1)まず、図 8に示す DNA配列を有する組換えベクターを、ルシフェラーゼ発光べ クタ一 pGL3 basic (Promega社製)を用いて、それぞれ作製した。
[0114] 図中、「Luciferase」は、その領域が、ルシフェラーゼをコードする DNA配列である ことを示し、「Exonl」は、その領域が、 Bmall遺伝子の一番目のエタソン部分の配 列を有することを示す。なお、「hBmall」は、ヒトの Bmall遺伝子を表す。
[0115] 「ROREl」及び「RORE2」は、その領域が、それぞれ、 Bmall遺伝子のプロモー ター領域であることを示す。
[0116] 「一 3465」は、その DNA配列力 Bmall遺伝子配列の 3465塩基分上流までの配 列を有することを示す。他の数字も同様である。
[0117] 「mt」は、変異体（mutant)を表し、 ROREl、 RORE2、又は両者の配列の一部分 が変異したものであることを示す。
[0118] (2)そして、実施例 3などと同様の手順により、 RORひ 1とルシフェラーゼを共発現 させた後、発光強度を測定し、 Bmallの発現誘導レベルを取得した。
[0119] 結果を図 9に示す。
[0120] 図中、「ROR a 1」は、 ROR a 1をコードする DNA配列を組み込んだ組換えべクタ 一を示し、「 +」は、その組換えベクターを培養細胞に組み込んだことを、「―」は、組 み込んでいないことを、それぞれ表す。
[0121] 「： BM—Luc」は、 Bmallのプロモーター領域とノレシフェラーゼ遺伝子をコードする 領域を有する組換えベクターを示す。
[0122] 「一 3465」は、その組換えベクター力 Bmall遺伝子配列の 3465塩基分上流まで の配列を含むことを示し、「一 829」は、その組換えベクター力 Bmall遺伝子配列の 829塩基分上流までの配列を含むことを示し、「一 230」は、その組換えベクターが、 Bmall遺伝子配列の 230塩基分上流までの配列を含むことを示す。
[0123] また、「RORElmutZRORE2」は RORE1を欠損させた場合、「RORElZROR E2mutJは RORE2を欠損させた場合、「RORElmut/RORE2mut」は RORE1と RORE2の両方を欠損させた場合、を表す。なお、「mut」は、変異体 (mutant)を表 す。
実施例 8
[0124] 次に、実施例 8では、実施例 7で作製した組換えベクター（図 8参照）を用いて、実 施例 6などと同様の手順により、 Bmall発現量の概日変化について調べた。
[0125] 結果を図 10に示す。
[0126] 図中の表示は、図 7と同様である。
[0127] 以上、実施例 7 (図 9)及び実施例 8 (図 10)の結果は、 ROR aによる Bmallの発現 誘導が、 Bmall遺伝子の両方のプロモーター領域 (ROREl、 RORE2)を必要とす ることを示す。従って、 ROR aは、 Bmall遺伝子の両方のプロモーター領域に作用 して、 Bmallの発現を誘導していることを強く示唆する。
実施例 9
[0128] 実施例 9では、プルダウン法により、 Bmallのプロモーター領域 (RORE)と ROR a との結合を調べた。
[0129] 実験手順の概要は次の通りである。
[0130] (1)まず、所定時刻に、マウスの肝臓を採取後、ホモジナイズし、マウス肝臓の抽出 物を得た。
[0131] (2)また、 Bmallのプロモーター領域 (RORE)の配列を含むオリゴヌクレオチドを ピオチンィ匕した。ピオチンィ匕したオリゴヌクレオチドは、ストレプトァヴイジンーセファロ ースビーズ (Amersham社製）に固定した。
[0132] (3)次に、（1)で取得したマウス肝臓抽出物に、（2)のビーズをカロえ、インキュベート した。
[0133] (4)次に、ビーズを回収（プルダウン）した後、抗 ROR a抗体を用いてウェスタンブ ロットし、 ROR aを検出した。
[0134] 以上の手順により、 Bmallのプロモーター領域 (RORE)の配列を含むオリゴヌタレ ォチドと ROR a (肝臓抽出物中に存在）が結合しているかどうかを調べることができる
[0135] 結果を図 11に示す。
[0136] 図中、「no ODN (no oligonucleotide)」は、ピオチンにオリゴヌクレオチドを結 合させて 、な 、場合 (コントロール)を示す。
[0137] 「： BM— ROREs」は、 Bmallのプロモーター領域（RORE)の配列を含むオリゴヌク レオチドをピオチン化した場合の結果を示す。 [0138] 「： BM— mROREs」は、 Bmallのプロモーター領域（RORE)の配列を一部変化さ せたオリゴヌクレオチド (変異体)をピオチンィ匕した場合の結果を示す。なお、「m」は 変異体（mutant)を表す。
[0139] 「CT(circadian time)」は、概日時間を表す。即ち、マウス力も肝臓を採取した時 刻を表し、概日時間（明条件の開始時間を 0時とした時刻)で示している。
[0140] 「ROR a 1」、「ROR a 4」は、ウェスタンブロットに用いた抗体を示し、バンドの現れ る位置を表している。
[0141] 図 11に示す通り、 Bmallのプロモーター領域 (RORE)の配列を含むオリゴヌタレ ォチドを用いた場合、「ROR a l」、「ROR a 4」の両方において、バンドが確認でき た。それに対し、変異体のオリゴヌクレオチドを用いた場合、バンドが消失した。
[0142] 従って、以上の結果は、 ROR a力 Bmallのプロモーター領域 (RORE)に結合す ることにより、 Bmallの発現を誘導することを強く示唆する。
実施例 10
[0143] 実施例 10では、 ROR a遺伝子を欠損した変異体マウスを用いて、ァクトグラムを行 い、 ROR o;遺伝子欠損力 マウスの概日リズムに与える影響について、調べた。
[0144] 「ァタトグラム」は、マウスの飲食行動を検出することにより、マウスの活動時間を連 続的に記録する方法である。
[0145] 図 12は、 15日間、 12時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、暗条件でフリーラ ン（自由継続)させた場合のァクトグラムである。
[0146] 図中、「 + Z +」は野生型を、「 + Zsg」はヘテロの ROR a遺伝子欠損型を、「sgZ sgjはホモの ROR a遺伝子欠損型を、それぞれ示す。
[0147] 「LD」は明条件 (light)と暗条件 (dark)を繰り返す環境を示し、「DD」は暗条件 (d ark)を続ける環境、即ち、フリーラン（自由継続)させた場合、を示す。
[0148] 図 12に示す通り、飼育環境を 24時間暗条件に変更した場合、野生型と比較して、 変異体マウスでは、行動時間の開始時刻が早くなつた。即ち、概日周期が短くなつた
。この結果は、 ROR a 1S Bmallの発現誘導を促進することにより、個体の概日リズ ムにも影響を与えて ヽることを示唆する。
[0149] 図 13は、図 12に示した実験結果に基づいて、飼育環境を 24時間暗条件に変更し た後の、マウスの概日周期の平均値を取得した図である。図 13が示す通り、野生型 マウスでは、概日周期力 約 23. 8時間であつたのに対し、ホモの ROR a遺伝子欠 損型マウスでは、概日周期が約 23. 4時間に減少していた。
[0150] 次に、図 14は、 15日間、 12時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、暗条件の 開始時刻を 4時間早め、時差のある状態にした場合のァクトグラムである。
[0151] 図中の表示は、図 12と同様である。
[0152] 図 14に示す通り、暗条件の開始時刻を 4時間早めた場合、 ROR a遺伝子欠損型 マウスは、野生型マウスよりも早ぐ新しい環境条件に順応した。
[0153] 図 15は、 15日間、 12時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、環境条件を、 6時 間ごとに明条件と暗条件を繰り返す環境に変化させた場合のァ外グラムである。
[0154] 図中の表示は、図 12と同様である。
[0155] 図 15に示す通り、野生型マウスでは、環境の変化にかかわらず、概日リズムを維持 したのに対し、 ROR a遺伝子欠損型マウスは、概日リズムを維持したものと、概日リ ズムが完全に乱れたものの両者が存在した。
実施例 11
[0156] 実施例 11では、 RNA干渉により、 ROR aの発現を抑制した場合、 Bmallの発現 誘導も抑制されるかどうか、調べた。
[0157] 実験手順の概要は、次に通りである。
[0158] (1)まず、組換え siRNA発現ベクターを作製した。 ROR a 4をコードする遺伝子配 列の第 849〜 1391塩基の中から、 19塩基力もなる配列（配列番号 5)を選択した。 そして、その配列を、 siRNA発現ベクターに組み込み、組換え発現ベクターを作製 した。
[0159] (2)また、実施例 3などと同様に、ルシフェラーゼ発光ベクター pGL3 basic (Prom ega社製）に、 Bmallのプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した
[0160] (3)次に、培養細胞 NIH3Tに、組換え siRNA発現ベクターと Bmallのプロモータ 一領域を組み込んだ組換えベクターとを、共に、トランスフエクシヨンした後、その培 養細胞を単離 '継代した。 [0161] (4)次に、その培養細胞に血清刺激を加えることにより、概日リズムを発生させた。
[0162] (5)次に、培養液に、 15分おきに、ルシフェリン (ルシフェラーゼの基質）をカ卩え、ル シフェラーゼ活性 (発光強度)を測定した。そして、その発光強度の概日変化より、 B mallの転写概日リズムを取得した。
[0163] 結果を図 16に示す。
[0164] 図中、横軸は時間（単位は分)を、縦軸 (relative cpm)は発光強度を示す。なお 、発光強度は、最初の発光強度のピークを「1」とした時の相対値である。
[0165] 「vector」は、ドミナントネガティブ変異体の代わりに空ベクター (pcDNA3)をカロえ た場合 (コントロール)の実験結果であることを示す。
[0166] 「RNAi (control)」は、 ROR aの配列とは関係のな 、siRNAを用いた場合であり 、コントロールである。
[0167] 「RNAi (ROR α )」は、 ROR aをコードする塩基配列の一部を有する siRNAを用 いた場合である。
[0168] 図 16に示す通り、 ROR aをコードする塩基配列の一部を有する siRNAを用いた 場合（図中、一番下のグラフ）、空ベクターを用いた場合 (そのグラフの上側の曲線） と比較して、 Bmallの発現誘導の振幅が減少した (そのグラフ中の下側の曲線)。従 つて、本実験結果は、 RNA干渉を用いて RORの発現を抑制した場合、 Bmallの発 現誘導も抑制されることを示す。
実施例 12
[0169] 実施例 12及び実施例 13では、マウス胚繊維芽細胞（MEF； Mouse Embryonic
Fibroblast)を用いて、 ROR αに Bmallの発現誘導を促進する作用があるかどう 力 調べた。
[0170] 実施例 12では、マウス胚繊維芽細胞の ROR a遺伝子欠損変異体を用いて、 Bma
11発現誘導の概日変化を調べた。
[0171] 実験手順の概要は次の通りである。
[0172] (1)まず、前記と同様、ルシフェラーゼ発光ベクター pGL3 basic (Promega社製） に、 Bmallのプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した。
[0173] (2)次に、その組換えベクターを、マウス胚繊維芽細胞の ROR a遺伝子欠損変異 体にトランスフエクシヨンした後、その培養細胞を単離'継代した。
[0174] (3)次に、その培養細胞に血清刺激を加えることにより、概日リズムを発生させた。
[0175] (4)次に、培養液に、 15分おきに、ルシフェリン (ルシフェラーゼの基質）をカ卩え、ル シフェラーゼ活性 (発光強度)を測定した。そして、その発光強度の概日変化より、 B mallの転写概日リズムを取得した。
[0176] 結果を図 17に示す。
[0177] 図中、横軸は時間（単位は分)を、縦軸 (relative cpm)は発光強度を示す。なお
、発光強度は、最初の発光強度のピークを「1」とした時の相対値である。
[0178] 「 + Z +」は野生型を、「sgZsg」はホモの ROR o;遺伝子欠損型を、それぞれ示す
[0179] 図 17に示す通り、マウス胚繊維芽細胞の ROR a遺伝子欠損変異体では、 Bmall 発現誘導の振幅が減少した。
実施例 13
[0180] 次に、実施例 13では、定量的リアルタイム RT— PCRにより、マウス胚繊維芽細胞 の ROR a遺伝子欠損変異体における、 Bmall発現量の概日変化を調べた。
[0181] マウス胚繊維芽細胞をホモジナイズ後、 Promega total SV RNA Isolation Kit (Promega社製）を用いて、各臓器から total RNAを抽出し、定量的リアルタイ ム RT— PCRにより、 Bmal 1遺伝子の発現量を測定した。
[0182] 結果を図 18に示す。
[0183] 図中、横軸は、時間（単位は分）を示す。縦軸「relative mRNA abundance]は 、相対的な発現量 (発現レベル)を示す。なお、縦軸の発現量の値は、実施例 1と同 様、ハウスキーピング遺伝子 GAPDH (GlycerAldehyde— 3— Phosphate DeHy drogenase)の発現量を 1とした場合の相対的な値である。
[0184] 「 + Z +」は野生型を、「sgZsg」はホモの ROR o;遺伝子欠損型を、それぞれ示す
[0185] 図 18に示す通り、マウス胚繊維芽細胞の ROR a遺伝子欠損変異体では、 Bmall 発現量の振幅が減少した。なお、この結果は、図 17の結果ともほぼ一致した。
[0186] 以上、図 17及び図 18の結果は、細胞レベルでも、 ROR aが Bmallの発現誘導を 促進することを、強く示唆する。
実施例 14
[0187] 実施例 14では、アンチセンス核酸を用いて ROR aの発現を抑制した場合、 Bmal
1の発現誘導も抑制されるかどうか、調べた。
[0188] 実験手順の概要は次の通りである。
[0189] (1)まず、アンチセンス核酸発現ベクターを作製した。 ROR aをコードする遺伝子 のうち、所定の領域と同じ塩基配列を有する DNAフラグメントを、 pcDNA3に組み込 んで、アンチセンス核酸発現ベクターを作製した。
[0190] なお、 DNAフラグメントとして、 ROR aをコードする遺伝子の第 65〜574塩基まで の配列を有するフラグメント、第 599〜 1122塩基までの配列を有するフラグメント、第 849〜 1391塩基までの配列を有するフラグメント、の 3種類を用 、た。
[0191] (2)また、実施例 3などと同様に、ルシフェラーゼ発光ベクター pGL3 basic (Prom ega社製）に、 Bmallのプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した
[0192] (3)次に、培養細胞 NIH3Tに、アンチセンス発現ベクターと Bmallのプロモーター 領域を組み込んだ組換えベクターとを、コトランスフエクシヨンし、その培養細胞を単 離 ·継代した。
[0193] (4)次に、その培養細胞に血清刺激を加えることにより、概日リズムを発生させた。
[0194] (5)次に、培養液に、 15分おきに、ルシフェリン (ルシフェラーゼの基質）をカ卩え、ル シフェラーゼ活性 (発光強度)を測定した。そして、その発光強度の概日変化より、 B mallの転写概日リズムを取得した。
[0195] 結果を図 19に示す。
[0196] 図中、横軸は時間（単位は分)を、縦軸 (relative cpm)は発光強度を示す。なお 、発光強度は、最初の発光強度のピークを「1」とした時の相対値である。
[0197] 「AS (ROR a 1)」は、アンチセンス核酸として、 ROR aをコードする遺伝子の第 65 〜574塩基までの配列を有するフラグメントを用いた場合、「AS (ROR a 2)」は、ァ ンチセンスとして、第 599〜1122塩基までの配列を有するフラグメントを用いた場合 、「AS (ROR a 3)」は、アンチセンスとして、第 849〜 1391塩基までの配列を有する フラグメントを用いた場合、を示す。
[0198] 図 19に示す通り、いずれの場合も、アンチセンス核酸を用いて ROR aの発現を抑 制することにより、 Bmallの発現誘導の振幅も抑制された。
実施例 15
[0199] 上述の通り、 ROR o;は低酸素状態において発現が誘導されることが明らかになつ ている。そこで、実施例 15では、低酸素状態において、 Bmallの発現誘導も促進さ れる力どう力につ 、て調べた。
[0200] 実験手順の概要は次の通りである。
[0201] (1)まず、前記と同様、ルシフェラーゼ発光ベクター pGL3 basic (Promega社製） に、 Bmallのプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した。
[0202] (2)次に、その組換えベクターを、マウス胚繊維芽細胞の ROR a遺伝子欠損変異 体にトランスフエクシヨンし、その培養細胞を単離'継代した。
[0203] (3)次に、その培養細胞に血清刺激を加えることにより、概日リズムを発生させた。
[0204] (4)次に、培養液に、 0. OlmMCoClを加えた後、 15分おきに、ルシフェリン (ル
2
シフェラーゼの基質)を加え、ルシフェラーゼ活性 (発光強度)を測定した。そして、そ の発光強度の概日変化より、 Bmallの転写概日リズムを取得した。
[0205] なお、塩ィ匕コノ レト（CoCl )を加えた条件下で、細胞を培養することにより、低酸素
2
状態を作り出すことができる。
[0206] 結果を図 20に示す。
[0207] 図中、横軸は時間（単位は分)を、縦軸 (relative cpm)は発光強度を示す。なお
、発光強度は、最初の発光強度のピークを「1」とした時の相対値である。
[0208] 「 + 0. OlmMCoCl」は、培養液に 0. OlmMCoClをカ卩えた場合を、「 + 0. lm
2 2
MNaCl」は、培養液に、 0. OlmMCoClの代わりに、 0. ImMNaCIをカ卩えた場合（
2
コントロール）を、それぞれ示す。
[0209] 図 20の結果は、低酸素状態では、 Bmallの発現誘導も促進されることを示す。
産業上の利用可能性
[0210] 本発明は、概日リズムの調節メカニズムのうち、未解明な部分を明らかにして点で、 有用である。従って、本発明は、概日リズムの調節メカニズムに関与する疾患、例え ば、がん、睡眠障害、時差ぼけ、覚醒障害、不眠症、自律神経失調症、うつ病、老人 性痴呆などの疾患の予防剤、治療剤として、適用可能性がある。また、 DNAチップ、 プロテインチップ、概日リズムの変調を検出するためのマーカー、抗がん剤'時差ぼ け調整剤などのスクリーニング方法やスクリーニングキットなどに適用可能である。

Claims

請求の範囲
[I] Bmallの発現誘導を促進する ROR a。
[2] 低酸素状態で発現が促進されることを特徴とする請求項 1記載の ROR a。
[3] REV-ERB a又は REV— ERB βと競合的に作用することを特徴とする請求項 1 記載の ROR 。
[4] BMALlと CLOCKとの結合を促進することを特徴とする請求項 1記載の ROR a。
[5] Per遺伝子及び Z又は Cry遺伝子の発現誘導を促進することを特徴とする請求項
4記載の： ROR a。
[6] 請求項 1記載の ROR aを抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤。
[7] 前記物質は、抗 ROR a抗体であることを特徴とする請求項 6記載の抗がん剤。
[8] 前記物質は、 ROR aの発現を抑制する siRNAであることを特徴とする請求項 6記 載の杭がん剤。
[9] 前記物質は、アンチセンス核酸であることを特徴とする請求項 6記載の抗がん剤。
[10] 請求項 1記載の ROR aを抑制する物質を少なくとも含有する時差ぼけ調整剤。
[I I] 前記物質は、抗 ROR a抗体であることを特徴とする請求項 10記載の時差ぼけ調 整剤。
[12] 前記物質は、 ROR aの発現を抑制する siRNAであることを特徴とする請求項 10 記載の時差ぼけ調整剤。
[13] 前記物質は、アンチセンス核酸であることを特徴とする請求項 10記載の時差ぼけ 調整剤。
[14] 請求項 1記載の ROR aをコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸、又は、前記 遺伝子の一部分の塩基配列を有する核酸が少なくとも固定された DNAチップ。
[15] 請求項 1記載の ROR aと特異的に結合する抗体が少なくとも固定されたプロテイン チップ。
[16] 請求項 1記載の ROR αの、概日リズムの変調を検出するためのマーカーとしての 使用。
[17] 請求項 1記載の ROR aを抑制する物質を探索することによる、抗がん剤のスクリー ユング方法。 請求項 1記載の ROR aを抑制する物質を探索することによる、時差ぼけ調整剤の スクリーニング方法。
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