KR20080000574A

KR20080000574A - Ｂｍａｌ1의 발현 유도를 촉진시키는 ＲＯＲα

Info

Publication number: KR20080000574A
Application number: KR1020077022166A
Authority: KR
Inventors: 다꾸로 야마모또; 다까요시 마미네; 도루 다꾸미; 마꼬또 아까시
Original assignee: 소니 가부시끼 가이샤
Priority date: 2005-03-29
Filing date: 2006-03-27
Publication date: 2008-01-02
Also published as: CN101151274A; EP2251350A3; WO2006104099A1; EP1864997A1; US20090292111A1; US20120093807A1; JP2006273760A; EP1864997A4; EP2251350A2

Abstract

본 발명은 일주기성 리듬의 조절 메카니즘 중 미해명 부분을 밝혀내고자 하는 것이다. 본 발명자들은 RORα(레티노산 결합 수용체α, 이하 동일)가 Bmal1의 발현 유도를 촉진시키는 것, 및 저산소 상태에 있어서 Bmal1의 발현 유도가 촉진되는 것을 새롭게 발견하였다. 이것은, 저산소 상태 등에서 RORα의 발현이 촉진되면, Bmal1의 발현 유도가 촉진되고, Bmal1의 발현 유도가 촉진되면, BMAL1과 CLOCK과의 결합이 촉진되어, Per 유전자 또는 Cry 유전자의 발현 유도가 촉진된다고 하는 일주기성 리듬의 조절 메카니즘의 존재를 강하게 시사한다. 따라서, 본 발명은 비행시차 증후군 조정제, 항암제로서 적용할 수 있는 가능성이 있다.

Bmal1, RORα, 일주기성 리듬의 조절 메카니즘, 비행시차 증후군 조정제, 항암제

Description

Ｂｍａｌ1의 발현 유도를 촉진시키는 ＲＯＲα {RORα PROMOTING THE INDUCTION OF Bmal1 EXPRESSION}

본 발명은 Clock 유전자의 작용 메카니즘 및 그의 주변 기술에 관한 것이다. 보다 상세하게는 Bmal1(뇌 근육 ARNT-유사 단백질 1)의 발현 유도를 촉진시키는 RORα(레티노산 수용체 관련 오판(orphan) 수용체), 및 항암제, 비행시차 증후군 조정제, 이들 약제의 스크리닝 방법 등에 관한 것이다.

일주기성 리듬은 약 24 시간을 주기로 하는 생물 리듬이고, 단세포 생물로부터 인간에 이르기까지 많은 생물에게 보편적으로 보이는 생체내 현상이다. 각 생물은 일주기성 리듬의 제어에 관한 유전자를 가지고, 일주기성 리듬 제어 유전자가 일주기성 리듬의 조정을 행하고 있다.

포유류에서는, 일주기성 리듬 제어 유전자의 발현량이 뇌 시상 하부의 시교차 상핵(SCN)에서 특히 높고, 개체 수준에서의 일주기성 리듬 조정의 중추를 담당하고 있다. 한편, 생체내의 그 밖의 조직(일주기성 리듬 말초 조직)에 있어서도, 일주기성 리듬 제어 유전자는 발현되고 있어, 일주기성 리듬 중추와 동일하게 일주기성 리듬 제어 유전자에 의한 세포ㆍ조직마다 일주기성 리듬 조정이 행해지고 있다.

포유류에서의 일주기성 리듬 제어 유전자로서는, Per 유전자(Per1, Per2, Per3), Clock 유전자, Bmal 유전자(Bmal1, Bmal2, Bmal3), Cry 유전자, Rev-erb 유전자(Rev-erbα, Rev-erbβ) 등이 알려져 있다.

그 중, BMAL1(Bmal1 유전자의 전사 산물, 이하 동일)은 CLOCK(Clock 유전자의 전사 산물, 이하 동일)과 이량체를 형성하고, E-box(Per1 유전자의 프로모터 영역)을 통해 Per 유전자, Cry 유전자 등의 발현을 활성화하는 것이 시사되었다(Gekakis, N. et al. ["Role of the CLOCK protein in the mammalian circadian mechanism." Science 280, 1564-9(1998)] 등 참조).

또한, Bmal1 유전자는 REV-ERB(Rev-erb 유전자의 전사 산물, 이하 동일) 등에 의해서 발현이 조절되는 것이 시사되었다(Preitner, N. et al. ["The orphan nuclear receptor REV-ERBalpha controls circadian transcription within the positive limb of the mammalian circadian clock" Cell 110, 251-60 (2002)] 등 참조).

여기서, 본 발명에 따른 임의의 단백질, RORα(레티노산 결합 수용체α, 이하 동일)에 대하여 설명한다. RORα는 RORA(Rar-관련 오판 수용체 A) 등이라고도 불리는 단백질로, RORα1, RORα4 등의 스플라이싱 베리언트가 밝혀졌다. 또한, 「스플라이싱 베리언트」는 동일 유전자에서 유래하는, 아미노산 서열의 일부가 다른 단백질로, 스플라이싱시의 연결 방법이 다르기 때문에 발생한다.

또한, RORα는 저산소 상태에 있어서 발현이 촉진되는 것이 보고되었다(Chauvet, C. et al. ["Retinoic acid receptor-related orphan receptor(ROR) alpha4 is the predominant isoform of the nuclear receptor RORalpha in the liver and is up-regulated by hypoxia in HepG2 human hepatoma cells." Biochem J364, 449-56 (2002)] 참조).

포유류에서의 일주기성 리듬의 조절 메카니즘은 특히 미해명 부분이 많다. 한편, 일주기성 리듬은 수면, 각성뿐 아니라 체온 조절, 호르몬 분비 등, 생물의 항상성이나 체내 조절 기구에도 깊이 관련되어 있는 것이 시사되었다. 또한, 암을 비롯한 많은 질환의 발증 기구에도 관여할 가능성이 있다.

따라서, 본 발명은 일주기성 리듬의 조절 메카니즘 중 미해명 부분을 밝혀내는 것을 주된 목적으로 한다.

<발명의 개시>

본 발명자들은 RORα(레티노산 결합 수용체α, 이하 동일)가 Bmal1의 발현 유도를 촉진시키는 것, 및 저산소 상태에 있어서 Bmal1의 발현 유도가 촉진되는 것을 새롭게 발견하였다.

따라서, 본 발명에서는 Bmal1의 발현 유도를 촉진시키는 RORα, 및 저산소 상태에서 Bmal1의 발현 유도를 촉진시키는 RORα를 제공한다.

본 발명은 다음과 같은 일주기성 리듬의 조절 메카니즘의 존재를 강하게 시사한다.

저산소 상태 등에서 RORα의 발현이 촉진되면, Bmal1의 발현 유도가 촉진된다. Bmal1의 발현 유도가 촉진되면, BMAL1과 CLOCK과의 결합이 촉진되어, Per 유전자 및/또는 Cry 유전자의 발현 유도가 촉진된다.

또한, 본 발명에서는 RORα가 REV-ERBα 또는 REV-ERBβ와 경합적으로 Bmal1의 발현 유도를 촉진시키는 것을 새롭게 발견하였다. 따라서, 본 발명은 RORα와 REV-ERB 모두가 Bmal1의 발현 유도를 조절하는 것에 의해, 일주기성 리듬을 조정하는 메카니즘의 존재도 강하게 시사한다.

본 발명에 의해 RORα와 Bmal1의 프로모터 영역(RORE)과의 상호 작용이 밝혀졌다. 따라서, Bmal1의 발현 리듬의 변조 등에 의해 일주기성 리듬의 변조가 일어난 경우, 본 발명에 의해 일주기성 리듬을 조정할 수 있는 가능성이 있다.

예를 들면, RORα를 억제하는 물질은 비행시차 증후군 조정제로서의 적용 가능성이 있다. 그 밖에, 일주기성 리듬이 변조된 경우로서, 예를 들면 수면 장해, 각성 장해, 불면증, 자율 신경 실조증, 우울병, 노인성 치매, 야간 근무ㆍ교대 근무 등 생활 리듬의 불규칙화에 의한 몸 상태의 악화, 자폐증 등에 있어서의 생활 리듬의 불규칙화에 의한 소모 등을 들 수 있다. 이들 질환에 대해서도 본 발명은 적용 가능성이 있다.

덧붙여, 본 발명은 항암제로서 적용할 수 있는 가능성이 있다.

일반적으로, 암 조직에서는 저산소 상태에 빠지는 경우가 많다. 또한, 예를 들면 야간 근무로 인한 간호원 등의 유방암 발생률 상승 등은 일주기성 리듬의 변조가 유인이라고 지적되었다.

그에 대하여, 본 발명에서는 저산소 상태에 있어서 Bmal1의 발현 유도가 촉진되는 것을 밝혀내었다. 따라서, RORα를 억제하는 물질은 항암제로서 적용할 수 있는 가능성이 있다.

그 밖에, 본 발명은 DNA 칩, 프로테인 칩, 일주기성 리듬의 변조를 검출하기 위한 마커로서의 사용, 항암제 또는 비행시차 증후군 조정제의 스크리닝 방법 등에 적용할 수 있는 가능성이 있다.

본 발명에 의해 RORα가 Bmal1의 발현 유도를 촉진시키는 것이 밝혀졌기 때문에, 본 발견에 기초하여 일주기성 리듬을 조정할 수 있다.

도 1은 일주기성 리듬의 조절 메카니즘을 나타내는 도면.

도 2는 각 조직에 있어서의 Rev-erbα, Rorα, Bmal1의 발현 패턴을 나타내는 도면.

도 3은 배양 세포 NIH3T3에 있어서의 Rev-erbα, Rorα, Bmal1의 발현 패턴을 나타내는 도면.

도 4는 RORα가 Bmal의 발현을 유도한 것을 나타내는 도면.

도 5는 RORα4의 발현량 증대에 따라서 Bmal의 발현 유도도 촉진되는 것을 나타내는 도면.

도 6은 RORα와 REV-ERB 단백질이 Bmal의 프로모터 영역에 경합적으로 작용하는 것을 나타내는 도면.

도 7은 RORα의 도미넌트 네가티브(dominant negative) 변이체의 존재하에서 세포를 배양한 경우의, Bmal 발현량의 일주기성 변화를 나타내는 도면.

도 8은 제조한 재조합 벡터의 서열을 나타내는 도면.

도 9는 Bmal1의 상류 영역의 길이를 변화시킨 경우에 있어서의, RORα에 의한 Bmal의 발현 유도 수준을 나타내는 도면.

도 10은 Bmal1의 상류 영역의 길이를 변화시킨 경우에 있어서의, Bmal 발현량의 일주기성 변화를 나타내는 도면.

도 11은 풀 다운법에 의한 웨스턴 블롯 사진(도면 대용 사진).

도 12는 15 일간, 12 시간마다 밝은 조건과 어두운 조건을 반복한 후, 어두운 조건에서 프리러닝(자유 계속)시킨 경우의 액토그램(actogram).

도 13은 15 일간, 12 시간마다 밝은 조건과 어두운 조건을 반복한 후, 사육 환경을 24 시간 어두운 조건으로 한 경우의, 마우스의 일주기성 주기를 취득한 도면.

도 14는 15 일간, 12 시간마다 밝은 조건과 어두운 조건을 반복한 후, 어두운 조건의 개시 시각을 4 시간 빠르게 하여, 시차가 있는 상태로 만든 경우의 액토그램.

도 15는 15 일간, 12 시간마다 밝은 조건과 어두운 조건을 반복한 후, 환경 조건을 6 시간마다 밝은 조건과 어두운 조건을 반복하는 환경으로 변화시킨 경우의 액토그램.

도 16은 RNA 간섭에 의해 RORα의 발현을 억제한 경우의, Bmal의 발현 유도를 나타내는 도면.

도 17은 마우스 배아 섬유아세포의 RORα 유전자 결손 변이체를 이용한 경우의, Bmal 발현 유도의 일주기성 변화를 나타내는 도면.

도 18은 마우스 배아 섬유아세포의 RORα 유전자 결손 변이체를 이용한 경우에 있어서의, 정량적 실시간 RT-PCR에 의한 Bmal 발현량의 일주기성 변화를 나타내는 도면.

도 19는 안티센스를 이용하여 RORα의 발현을 억제한 경우에 있어서의, Bmal의 발현 유도를 나타내는 도면.

도 20은 저산소 상태에 있어서 Bmal의 발현 유도가 촉진된 것을 나타내는 도면.

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

<본 발명에 따른 RORα에 대하여>

먼저, 본 발명에 따른 RORα에 대하여 이하에 설명한다.

본 발명에 따른 RORα는 RORα1, RORα4 등의 스플라이싱 베리언트를 갖는다. 인간에 있어서의 RORα1의 아미노산 서열을 서열 1에, RORα4의 아미노산 서열을 서열 2에 기재한다. 또한, 마우스에 있어서의 RORα1의 아미노산 서열을 서열 3에, RORα4의 아미노산 서열을 서열 4에 기재한다.

또한, 본 발명에 따른 RORα는 RORα1, RORα4, 또는 상기 어느 단백질의 아미노산 서열과 상동성을 가지고, Bmal1의 프로모터 영역(RORE)과 상호 작용하는 영역을 유지하는 단백질이다. 즉, 예를 들면 상기 어느 단백질의 다른 스플라이싱 베리언트나, 상기 어느 하나의 단백질의 아미노산 서열 중의 일부에 치환, 결손, 삽입, 부가 부분이 포함되는 경우도, 본 발명에 따른 RORα에 포함된다.

<본 발명에 따른 일주기성 리듬의 조절 메카니즘에 대하여>

계속해서, RORα에 관한 일주기성 리듬의 조절 메카니즘에 대하여 도 1을 참조하면서 이하에 설명한다.

본 발명에 의해, RORα는 Bmal1의 프로모터 영역(ROREs)에 결합하여 Bmal1의 발현 유도를 촉진시키는 것이 밝혀졌다. 따라서, 다음과 같은 일주기성 리듬의 조절 메카니즘이 존재한다고 추측된다.

저산소 상태 등에 의해 RORα의 발현이 촉진되면, RORα는 Bmal1의 프로모터 영역(ROREs)에 작용하여 Bmal1의 발현 유도를 촉진시킨다. 발현된 BMAL1은 CLOCK과 이량체를 형성하여, E-box(Per 유전자, Cry 유전자 등의 프로모터 영역)를 통해 Per 유전자, Cry 유전자의 발현 유도를 촉진시킨다. 발현된 PER(Per 유전자의 전사 산물) 및 CRY(Cry 유전자의 전사 산물)은 일주기성 리듬의 형성에 직접적으로 관여한다.

또한, 도면 중 「REα/β」는 REV-ERB를 나타낸다. REV-ERB는 Bmal1의 프로모터 영역(ROREs)에 RORα와 경합적으로 결합하여, Bmal1의 발현을 억제한다고 생각되었다.

또한, 도면 중 「리간드」는 RORα의 발현을 촉진 또는 억제하는 물질이다. 상기한 바와 같이, RORα의 발현은 일주기성 리듬의 조정에 깊이 관여한다. 따라서, 그 물질(리간드)을 스크리닝함으로써 신규 비행시차 증후군 조정제, 항암제 등을 탐색할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 일주기성 리듬의 조절 메카니즘에 기초하여 스크리닝계를 구축할 수 있다.

<본 발명에 따른 RORα를 억제하는 물질에 대하여>

계속해서, 본 발명에 따른 RORα를 억제하는 물질(RORα를 억제하는 물질을 적어도 함유하는 항암제ㆍ비행시차 증후군 조정제 등)에 대하여 이하에 설명한다.

후술하는 실시예에 있어서, 일주기성 리듬이 시프트된 경우(밝은 조건의 개시 시간이 변경된 경우 등), RORα의 발현을 억제함으로써 통상보다 빠르고, 새로운 일주기성 리듬에 동조할 수 있다는 결과가 얻어졌다. 따라서, 본 발명에 따른 RORα를 억제하는 물질은 비행시차 증후군 조정제로서의 적용 가능성이 있다.

또한, 본 발명에서는 저산소 상태에 있어서 Bmal1의 발현 유도가 촉진되는 것을 밝혀내었다. 한편, 상술한 바와 같이, 암 조직에서는 저산소 상태에 빠지는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 따른 RORα를 억제하는 물질은 항암제로서 적용할 수 있을 가능성이 있다.

RORα를 억제하는 물질로서, 예를 들면 항 RORα항체, RORα의 코드 서열의 일부를 갖는 siRNA, 안티센스 핵산 등을 들 수 있다.

항 RORα 항체는 RORα와 특이적으로 결합함으로써 RORα의 기능을 억제한다.

siRNA(작은 간섭 RNA)는 RNA 간섭에 의해서 유전자 발현을 억제하는 짧은 이중 가닥 RNA이다. RORα의 코드 서열의 일부를 갖는 siRNA는 RORα의 발현을 억제하기 때문에 RORα의 기능을 억제할 수 있다.

안티센스 핵산은 RORα의 코드 서열의 일부를 갖는 핵산으로, 인공적으로 합성된 것, 안정화하기 위해서 수식ㆍ가공 등을 실시한 것을 폭넓게 포함한다. 안티센스 핵산은 RORα의 전사 산물(mRNA)과 상보적으로 결합함으로써 RORα의 발현을 억제하기 때문에 RORα의 기능을 억제할 수 있다.

항 RORα항체, siRNA, 안티센스 핵산은 모두 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다.

<본 발명에 따른 DNA 칩, 프로테인 칩에 대하여>

계속해서, 본 발명에 따른 DNA 칩 및 프로테인 칩에 대하여 이하에 설명한다.

RORα를 코딩하는 유전자의 염기 서열을 갖는 핵산, 또는 상기 유전자의 일부분의 염기 서열을 갖는 핵산은 DNA 칩에 적용 가능하다. DNA 칩에 이들의 핵산을 고정시킴으로써, 예를 들면 혈액 중이나 소정의 조직 중 RORα 발현량을 검출할 수 있기 때문에, 일주기성 리듬의 변조 등의 검출에 유용한 가능성이 있다. DNA 칩에의 핵산의 고정은 공지된 방법에 의해 행할 수 있다.

동일하게, RORα와 특이적으로 결합하는 항체는 프로테인 칩에 적용 가능하다. 프로테인 칩에 이러한 항체를 고정시킴으로써, 예를 들면 혈액 중이나 소정의 조직 중의 RORα 발현량을 검출할 수 있기 때문에, 일주기성 리듬의 변조 등의 검출에 유용한 가능성이 있다. 프로테인 칩에 대한 항체의 고정도 공지된 방법에 의해 행할 수 있다.

<본 발명에 따른 일주기성 리듬의 변조를 검출하기 위한 마커로서의 사용에 대하여>

계속해서, 본 발명에 따른 일주기성 리듬의 변조를 검출하기 위한 마커로서의 사용에 대하여 이하에 설명한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 RORα는 일주기성 리듬을 조정하는 메카니즘에 있어서 중요한 역할을 하기 때문에, 일주기성 리듬의 변조를 검출하기 위한 마커로서 사용할 수 있는 가능성이 있다. 구체적으로는, 예를 들면 혈액 중이나 소정의 조직 중의 RORα량을 ELISA법(공지된 방법) 등으로 검출하여 RORα 발현량의 변조를 검출함으로써, 일주기성 리듬의 변조를 검출할 수 있는 가능성이 있다.

<본 발명에 따른 스크리닝 방법에 대하여>

계속해서, 본 발명에 따른 스크리닝 방법의 일례에 대하여 이하에 설명한다.

RORα를 억제하는 물질을 탐색함으로써 스크리닝을 행하는 경우, 예를 들면 반응계에 표적 물질을 공급한 후, RORα와 Bmal1의 프로모터 영역(RORE)과의 상호 작용을 검출함으로써 목적하는 물질을 탐색할 수 있다. 즉, 반응계에 표적 물질을 공급함으로써 상호 작용이 억제된 경우, 그 표적 물질은 항암제 또는 비행시차 증후군 조정제로서 유효한 가능성이 있다.

스크리닝 방법의 구체적인 예로서, 예를 들면 미리 Bmal1의 프로모터 영역(RORE)의 올리고뉴클레오티드를 칼럼, 비드 등에 고정시켜 두고, RORα와 표적 물질을 공급한 후, RORα와 Bmal1의 프로모터 영역(RORE)과의 상호 작용을 검출하는 방법을 생각할 수 있다. 그 경우, 상호 작용을 검출하는 방법으로서, 예를 들면 공면역 침강법, 칼럼 또는 비드를 이용한 풀 다운법 등을 적용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 스크리닝 방법은 키트화가 가능하다. 그 경우, 예를 들면 RORα, Bmal1의 프로모터 영역(RORE)의 올리고뉴클레오티드, 항 RORα항체, 상호 작용 검출 시약(공면역 침강법, 칼럼 또는 비드를 이용한 풀 다운법, 웨스턴 블롯 등에 이용하는 시약) 등을, 상호 작용 검출 방법 등에 따라서 적절하게 조합하여 키트화한다. 그 경우, 상기 단백질 및 올리고뉴클레오티드는 변이체를 이용할 수도 있다.

<실시예 1>

실시예 1 및 실시예 2에서는 예비적 실험으로서 Rev-erbα, Rorα, Bmal1의 발현 패턴을 조사하였다.

실시예 1에서는 마우스로부터 복수개의 조직을 채취하여 이들 조직에 있어서의 Rev-erbα, Rorα, Bmal1의 발현 패턴을 조사하였다.

실험 절차의 개요는 다음과 같다.

(1) 우선, 실험에 이용한 마우스의 일주기성 리듬을 동조시켰다. 마우스를 2 주간, 8시부터 20시까지 밝은 조건, 20시부터 다음 8시까지를 어두운 조건으로 한 방에서 사육하여, 마우스의 일주기성 리듬을 동조시켰다.

(2) 다음에, 마우스로부터 일주기성 리듬 말초 조직으로서, 간장, 심장, 신장, 폐, 위를 소정의 시각에 채취하였다. 또한, 각 장기의 채취 시각은 일주기성 리듬의 동조를 행한 직후의 8시부터 4 시간마다로 설정하였다(8시, 12시, 16시, 20시, 24시, 익일 4시).

(3) 다음에, 채취한 각 장기를 동질화한 후, 프로메가(Promega) 전체 SV RNA 단리 키트(프로메가사(Promega) 제조)를 이용하여 각 장기로부터 전체 RNA를 추출하였다.

(4) 다음에, 정량적 실시간 RT-PCR(정량적 실시간 역전사 폴리머라제 반응)을 행하여 Rev-erbα, Rorα, Bmal1의 각 유전자의 발현량을 측정하였다.

결과를 도 2에 나타낸다.

각 그래프 중, 횡축 「ZT(차이트게버 시간)」는 일주기성 시간을 나타낸다. 또한, 종축 「상대 mRNA 발현량」은 상대적인 발현량(발현 수준)을 나타낸다. 또한, 종축 발현량의 값은 하우스 키핑 유전자 GAPDH(글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제)의 발현량을 1로 한 경우의 상대적인 값이다.

<실시예 2>

실시예 2에서는 배양 세포 NIH3T3에 있어서의 Rev-erbα, Rorα, Bmal1의 발현 패턴을 실시예 1과 동일한 절차로 조사하였다.

결과를 도 3에 나타낸다.

도면 중 횡축은 일주기성 시간을 나타낸다. 또한, 종축 「상대 mRNA 발현량」은 상대적인 발현량(발현 수준)을 나타낸다. 또한, 종축 발현량의 값은 실시예 1과 동일하게 하우스 키핑 유전자 GAPDH(글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제)의 발현량을 1로 한 경우의 상대적인 값이다.

이상, 실시예 1 및 실시예 2로부터 각 조직에 있어서의 Rev-erbα, Rorα, Bmal1의 3개 유전자의 발현 패턴을 확인할 수 있었다.

<실시예 3>

계속해서, 실시예 3 및 실시예 4는, RORα가 Bmal1의 발현을 유도하는지의 여부를 루시페라제 검정에 의해 조사한 실험이다.

「루시페라제 검정」의 개요에 대하여 이하에 설명한다.

루시페라제는 생물 발광을 촉매하는 효소 단백질이다.

예를 들면, 소정 유전자의 프로모터 영역과 루시페라제를 코딩하는 유전자를 연결시킨 재조합 유전자를 제조하고, 그 재조합 유전자를 배양 세포에 조립한 경우, 그 유전자의 발현이 유도되면 루시페라제가 발현된다.

따라서, 루시페라제에 의한 생물 발광을 측정하여 루시페라제의 발현 수준을 취득함으로써, 그 유전자의 발현 유도 수준을 추정할 수 있다.

실시예 3에서는 ROR 패밀리 단백질(RORα1, RORα4, RORβ, RORγ)이 Bmal1의 발현을 유도하는지의 여부를 루시페라제 검정에 의해 조사하였다.

실험 절차의 개요를 이하에 나타낸다.

(1) 우선, 루시페라제 발광 벡터 pGL3 basic(프로메가사 제조)에 Bmal1의 프로모터 영역을 조합하여 재조합 벡터를 제조하였다. 이 재조합 벡터는 Bmal1의 프로모터 영역과 루시페라제 유전자를 코딩하는 영역을 갖는다.

(2) 또한, 발현 벡터 pcDNA3(인비트로겐사(Invitrogen) 제조)에 ROR 패밀리 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 조합하여 재조합 벡터를 제조하였다.

(3) 다음에, (1) 및 (2)에서 제조한 재조합 벡터를 함께 배양 세포 NIH3T3에 트랜스펙팅하였다. 다음에, 트랜스펙팅한 배양 세포를 단리ㆍ계대 배양하여 두 단백질을 공발현시켰다. 그리고, 트랜스펙팅 36 시간 후에, 계대 배양한 세포를 모아 용해시켰다.

(4) 다음에, 이중 루시페라제 검정 시스템(프로메가사 제조)을 이용하여 용 해시킨 세포 용액을 제조한 후, 발광 강도를 측정하여 Bmal1의 발현 유도 수준을 취득하였다.

결과를 도 4에 나타낸다.

도면 중 「BM-Luc」는 Bmal1의 프로모터 영역과 루시페라제 유전자를 코딩하는 영역을 갖는 재조합 벡터를, 「RORα1」은 RORα1을 코딩하는 DNA 서열을 조합한 재조합 벡터를, 「RORα4」는 RORα4를 코딩하는 DNA 서열을 조합한 재조합 벡터를, 「RORβ」는 RORβ를 코딩하는 DNA 서열을 조합한 재조합 벡터를, 「RORγ」는 RORγ를 코딩하는 DNA 서열을 조합한 재조합 벡터를 각각 나타내고, 「+」는 이들 재조합 벡터를 배양 세포에 조립한 것을 나타낸다.

종축 「상대적인 luc 활성」은 발광 강도를 나타낸다. 이 값은 「BM-Luc」만을 배양 세포에 조립한 경우의 발광 강도를 「1」로 한 경우의 상대값이다.

도 4에 나타내는 결과는 ROR 패밀리 단백질, 특히 RORα1 및 RORα4가 Bmal1의 발현을 유도하는 것을 강하게 시사한다.

<실시예 4>

실시예 4에서는 RORα4의 발현 수준을 변동시킨 경우, Bmal1의 발현 유도 수준도 변동하는지 여부에 대하여 조사하였다.

실험은 실시예 3과 동일한 방법에 의해 행하였다.

또한, 재조합 벡터를 배양 세포에 트랜스펙팅할 때, RORα4를 코딩하는 DNA 서열을 조합한 재조합 벡터의 첨가량을 각각 0(대조구), 1, 5, 10, 25, 50, 100 ng으로 하였다.

결과를 도 5에 나타낸다.

도면 중 「BM-Luc」는 Bmal1의 프로모터 영역과 루시페라제 유전자를 코딩하는 영역을 갖는 재조합 벡터를 나타내고, 「+」는 재조합 벡터를 배양 세포에 조립한 것을 나타낸다.

「RORα4」는 RORα4를 코딩하는 DNA 서열을 조합한 재조합 벡터를 나타내고, 숫자는 트랜스펙팅시의 재조합 벡터의 첨가량(단위는 ng)을 나타낸다.

종축 「상대적인 luc 활성」은 발광 강도를 나타낸다. 이 값은 도 4와 동일하게, 「BM-Luc」만을 배양 세포에 조립한 경우의 발광 강도를 「1」로 한 경우의 상대값이다.

도 5의 결과는 RORα4의 발현량 증대에 따라서 Bmal1의 발현 유도도 촉진되는 것을 강하게 시사한다. 따라서, 이 결과는 RORα4의 촉진이 Bmal1의 발현을 유도하는 것을 강하게 시사한다.

<실시예 5>

Rev-erb 유전자는 일주기성 리듬 제어 유전자로서 알려져 있고, REV-ERB 단백질은 Bmal1의 프로모터 영역(RORE)에 결합하여 Bmal1의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 실시예 5에서는 RORα 단백질과 REV-ERB 단백질을 공발현시킨 경우, Bmal1의 발현이 유도되는지의 여부에 대하여 조사하였다.

실험 절차의 개요는 이하와 같다.

(1) 우선, 실시예 3 등과 동일한 절차에 의해 Bmal1의 프로모터 영역을 조합 한 재조합 벡터, RORα1을 코딩하는 DNA 서열을 조합한 재조합 벡터, Rev-erb 유전자를 조합한 재조합 벡터를 각각 제조하였다.

(2) 다음에, 그 3개의 재조합 벡터를 함께 배양 세포 NIH3T3에 트랜스펙팅하여 각 단백질을 공발현시켰다.

(3) 그리고, 그 배양 세포를 용해시킨 후, 이중 루시페라제 검정 시스템(프로메가사 제조)을 이용하여 용해시킨 세포 용액을 제조하고, 발광 강도를 측정하였다.

결과를 도 6에 나타낸다.

「RORα1」은 RORα1을 코딩하는 DNA 서열을 조합한 재조합 벡터를 나타내고, 괄호 안의 숫자는 트랜스펙팅시의 재조합 벡터의 첨가량(단위는 ng)을 나타낸다.

「β-Gal」은 상기와 동일한 절차로 β-갈락토시다제를 공발현시킨 경우를 나타내고, 대조구이다. 숫자는 트랜스펙팅시의 재조합 벡터의 첨가량(단위는 ng)을 나타낸다.

「REα」, 「REβ」는 각각 Rev-erbα 유전자, Rev-erbβ 유전자를 조합한 재조합 벡터를 나타내고, 숫자는 트랜스펙팅시의 재조합 벡터의 첨가량(단위는 ng)을 나타낸다.

도 6의 결과는, RORα와 REV-ERB 단백질은 Bmal1의 프로모터 영역에 경합적으로 작용하는 것을 강하게 시사한다.

<실시예 6>

실시예 6에서는 RORα의 도미넌트 네가티브 변이체의 존재하에서 세포를 배양한 경우의, Bmal1 발현량의 일주기성 변화에 대하여 조사하였다.

실험 절차의 개요는 다음과 같다.

우선, 실시예 3 등과 동일하게, 루시페라제 발광 벡터 pGL3 basic(프로메가사 제조)에 Bmal1의 프로모터 영역을 조합하여 재조합 벡터를 제조하였다.

다음에, 배양 세포 NIH3T에 그 재조합 벡터를 트랜스펙팅하여, 그 배양 세포를 단리ㆍ계대 배양하였다.

다음에, 그 배양 세포에 혈청 자극을 가함으로써 일주기성 리듬을 발생시켰다.

다음에, 배양액에 RORα1의 도미넌트 네가티브 변이체를 첨가한 후, 15 분에 걸쳐 루시페린(루시페라제의 기질)을 첨가하여 루시페라제 활성(발광 강도)을 측정하였다. 또한, 그 발광 강도의 일주기성 변화로부터 Bmal1의 전사 일주기성 리듬을 취득하였다.

결과를 도 7에 나타낸다.

도면 중 횡축은 시간(단위는 분)을, 종축은 발광 강도(단위는 M cpm; 10⁶ 카운트/분)를 각각 나타낸다.

「벡터」는 도미넌트 네가티브 변이체 대신에 공벡터(pcDNA3)를 첨가한 경우(대조구)의 실험 결과인 것을 나타낸다.

「β-Gal」은 도미넌트 네가티브 변이체 대신에 β-갈락토시다제를 첨가한 경우(대조구)의 실험 결과인 것을 나타낸다.

「hRORα1ΔLBD」는 인간 RORα1의 도미넌트 네가티브 변이체를 첨가한 경우의 실험 결과인 것을 나타낸다.

도 7에 나타내는 바와 같이, RORα1의 도미넌트 네가티브 변이체를 첨가한 경우, Bmal1의 전사 일주기성 리듬이 억제되었다. 즉, 이 결과는, RORα가 Bmal1의 발현을 유도하는 것뿐 아니라 Bmal1의 전사 일주기성 리듬의 발현에 중요한 역할을 하는 것을 강하게 시사한다.

<실시예 7>

실시예 7 및 실시예 8에서는 RORα에 의한 Bmal1의 발현 유도에 대하여 RORα의 Bmal1의 서열에 있어서의 작용 부위를 조사하였다.

실시예 7에서는 Bmal1 유전자의 상류 영역의 DNA 서열에 대하여 각각 길이가 다른 것을 제조하고, 실시예 3 등과 동일한 절차에 의해 RORα에 의한 Bmal1의 발현 유도 수준을 취득하였다.

실험 절차의 개요에 대하여 이하에 설명한다.

(1) 우선, 도 8에 나타내는 DNA 서열을 갖는 재조합 벡터를, 루시페라제 발광 벡터 pGL3 basic(프로메가사 제조)를 이용하여 각각 제조하였다.

도면 중 「루시페라제」는 그 영역이 루시페라제를 코딩하는 DNA 서열인 것 을 나타내고, 「Exon1」은 그 영역이 Bmal1 유전자의 1번째 EXON 부분의 서열을 갖는 것을 나타낸다. 또한, 「hBmal1」은 인간의 Bmal1 유전자를 나타낸다.

「RORE1」 및 「RORE2」는 그 영역이 각각 Bmal1 유전자의 프로모터 영역인 것을 나타낸다.

「-3465」는 그 DNA 서열이 Bmal1 유전자 서열의 3465 염기분 상류까지의 서열을 갖는 것을 나타낸다. 다른 숫자도 마찬가지다.

「mt」는 변이체(mutant)를 나타내고, RORE1, RORE2 또는 두 서열의 일부분이 변이된 것임을 나타낸다.

(2) 그리고, 실시예 3 등과 동일한 절차에 의해, RORα1과 루시페라제를 공발현시킨 후, 발광 강도를 측정하여 Bmal1의 발현 유도 수준을 취득하였다.

결과를 도 9에 나타낸다.

도면 중, 「RORα1」은 RORα1을 코딩하는 DNA 서열을 조합한 재조합 벡터를 나타내고, 「+」는 그 재조합 벡터를 배양 세포에 조립한 것을, 「-」는 조립되지 않은 것을 각각 나타낸다.

「BM-Luc」는 Bmal1의 프로모터 영역과 루시페라제 유전자를 코딩하는 영역을 갖는 재조합 벡터를 나타낸다.

「-3465」는 그 재조합 벡터가 Bmal1 유전자 서열의 3465 염기분 상류까지의 서열을 포함하는 것을 나타내고, 「-829」는 그 재조합 벡터가 Bmal1 유전자 서열의 829 염기분 상류까지의 서열을 포함하는 것을 나타내고, 「-230」은 그 재조합 벡터가 Bmal1 유전자 서열의 230 염기분 상류까지의 서열을 포함하는 것을 나타낸 다.

또한, 「RORE1mut/RORE2」는 RORE1을 결손시킨 경우, 「RORE1/RORE2mut」는 RORE2를 결손시킨 경우, 「RORE1mut/RORE2mut」는 RORE1과 RORE2를 둘다 결손시킨 경우를 나타낸다. 또한, 「mut」는 변이체(mutant)를 나타낸다.

<실시예 8>

다음에, 실시예 8에서는 실시예 7에서 제조한 재조합 벡터(도 8 참조)를 이용하여, 실시예 6 등과 동일한 절차에 의해 Bmal1 발현량의 일주기성 변화에 대하여 조사하였다.

결과를 도 10에 나타낸다.

도면 중의 표시는 도 7과 동일하다.

이상, 실시예 7(도 9) 및 실시예 8(도 10)의 결과는, RORα에 의한 Bmal1의 발현 유도가 Bmal1 유전자의 두 프로모터 영역(RORE1, RORE2)를 필요로 하는 것을 나타낸다. 따라서, RORα는 Bmal1 유전자의 두 프로모터 영역에 작용하여, Bmal1의 발현을 유도하는 것을 강하게 시사한다.

<실시예 9>

실시예 9에서는 풀 다운법에 의해 Bmal1의 프로모터 영역(RORE)과 RORα와의 결합을 조사하였다.

실험 절차의 개요는 다음과 같다.

(1) 우선, 소정 시각에 마우스의 간장을 채취 후, 균질화하여 마우스 간장의 추출물을 얻었다.

(2) 또한, Bmal1의 프로모터 영역(RORE)의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 비오틴화하였다. 비오틴화한 올리고뉴클레오티드는 스트렙토아비딘 세파로스 비드(아머샴사(Amersham) 제조)에 고정시켰다.

(3) 다음에, (1)에서 취득한 마우스 간장 추출물에 (2)의 비드를 첨가하여 배양하였다.

(4) 다음에, 비드를 회수(풀 다운)한 후, 항 RORα 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅하여 RORα를 검출하였다.

이상의 절차에 의해, Bmal1의 프로모터 영역(RORE)의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 RORα(간장 추출물 중에 존재)가 결합하는지의 여부를 조사할 수 있다.

결과를 도 11에 나타낸다.

도면 중 「무-ODN(무-올리고뉴클레오티드)」는 비오틴에 올리고뉴클레오티드를 결합시키지 않은 경우(대조구)를 나타낸다.

「BM-ROREs」는 Bmal1의 프로모터 영역(RORE)의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 비오틴화한 경우의 결과를 나타낸다.

「BM-mROREs」는 Bmal1의 프로모터 영역(RORE)의 서열을 일부 변화시킨 올리고뉴클레오티드(변이체)를 비오틴화한 경우의 결과를 나타낸다. 또한, 「m」은 변이체(mutant)를 나타낸다.

CT는 일주기성 시간을 나타낸다. 즉, 마우스로부터 간장을 채취한 시각을 나타내고, 일주기성 시간(밝은 조건의 개시 시간을 0시로 한 시각)으로 나타낸다.

「RORα1」, 「RORα4」는 웨스턴 블롯에 이용한 항체를 나타내고, 밴드가 나타나는 위치를 나타낸다.

도 11에 나타내는 바와 같이, Bmal1의 프로모터 영역(RORE)의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 이용한 경우, 「RORα1」, 「RORα4」의 모두에 있어서 밴드를 확인할 수 있었다. 그에 대하여, 변이체의 올리고뉴클레오티드를 이용한 경우, 밴드가 소실되었다.

따라서, 이상의 결과는, RORα가 Bmal1의 프로모터 영역(RORE)에 결합함으로써 Bmal1의 발현을 유도하는 것을 강하게 시사한다.

<실시예 10>

실시예 10에서는 RORα 유전자를 결손시킨 변이체 마우스를 이용하여 액토그램을 행하고, RORα 유전자 결손이 마우스의 일주기성 리듬에 미치는 영향에 대하여 조사하였다.

「액토그램」은 마우스의 음식 행동을 검출함으로써 마우스의 활동 시간을 연속적으로 기록하는 방법이다.

도 12는 15 일간, 12 시간마다 밝은 조건과 어두운 조건을 반복한 후, 어두운 조건에서 프리러닝(자유 계속)시킨 경우의 액토그램이다.

도면 중 「+/+」는 야생형을, 「+/sg」는 헤테로의 RORα 유전자 결손형을, 「sg/sg」는 호모의 RORα 유전자 결손형을 각각 나타낸다.

「LD」는 밝은 조건(light)과 어두운 조건(dark)을 반복하는 환경을 나타내고, 「DD」는 어두운 조건(dark)을 계속하는 환경, 즉 프리러닝(자유 계속)시킨 경 우를 나타낸다.

도 12에 나타내는 바와 같이, 사육 환경을 24 시간 어두운 조건으로 변경한 경우, 야생형과 비교하여, 변이체 마우스에서는 행동 시간의 개시 시각이 빨라졌다. 즉, 일주기성 주기가 짧아졌다. 이 결과는, RORα가 Bmal1의 발현 유도를 촉진시킴으로써 개체의 일주기성 리듬에도 영향을 주는 것을 시사한다.

도 13은, 도 12에 나타낸 실험 결과에 기초하여, 사육 환경을 24 시간 어두운 조건으로 변경한 후의 마우스의 일주기성 주기의 평균값을 취득한 도면이다. 도 13에서 나타내는 바와 같이, 야생형 마우스에서는, 일주기성 주기가 약 23.8 시간이었던 것에 대하여, 호모의 RORα 유전자 결손형 마우스에서는 일주기성 주기가 약 23.4 시간으로 감소되었다.

다음에, 도 14는 15 일간, 12 시간마다 밝은 조건과 어두운 조건을 반복한 후, 어두운 조건의 개시 시각을 4 시간 빠르게 하여, 시차가 있는 상태로 한 경우의 액토그램이다.

도면 중의 표시는 도 12와 동일하다.

도 14에 나타내는 바와 같이, 어두운 조건의 개시 시각을 4 시간 빠르게 한 경우, RORα 유전자 결손형 마우스는 야생형 마우스보다 빠르게 새로운 환경 조건에 순응하였다.

도 15는 15 일간, 12 시간마다 밝은 조건과 어두운 조건을 반복한 후, 환경 조건을, 6 시간마다 밝은 조건과 어두운 조건을 반복하는 환경으로 변화시킨 경우의 액토그램이다.

도면 중의 표시는 도 12와 동일하다.

도 15에 나타내는 바와 같이, 야생형 마우스에서는 환경의 변화에 관계없이 일주기성 리듬을 유지한 것에 대하여, RORα 유전자 결손형 마우스는 일주기성 리듬을 유지한 것과 일주기성 리듬이 완전히 흐트러진 것 두 가지가 존재하였다.

<실시예 11>

실시예 11에서는, RNA 간섭에 의해 RORα의 발현을 억제한 경우, Bmal1의 발현 유도도 억제되는지의 여부를 조사하였다.

실험 절차의 개요는 다음과 같다.

(1) 우선, 재조합 siRNA 발현 벡터를 제조하였다. RORα4를 코딩하는 유전자 서열의 제849 내지 1391 염기 중에서, 19 염기로 이루어지는 서열(서열 5)을 선택하였다. 또한, 그 서열을 siRNA 발현 벡터에 조립하여 재조합 발현 벡터를 제조하였다.

(2) 또한, 실시예 3 등과 동일하게, 루시페라제 발광 벡터 pGL3 basic(프로메가사 제조)에 Bmal1의 프로모터 영역을 조합하여 재조합 벡터를 제조하였다.

(3) 다음에, 배양 세포 NIH3T에 재조합 siRNA 발현 벡터와 Bmal1의 프로모터 영역을 조합한 재조합 벡터를 모두 트랜스펙팅한 후, 그 배양 세포를 단리ㆍ계대 배양하였다.

(4) 다음에, 그 배양 세포에 혈청 자극을 가함으로써 일주기성 리듬을 발생시켰다.

(5) 다음에, 배양액에 15 분에 걸쳐 루시페린(루시페라제의 기질)을 첨가하 여 루시페라제 활성(발광 강도)을 측정하였다. 또한, 그 발광 강도의 일주기성 변화로부터 Bmal1의 전사 일주기성 리듬을 취득하였다.

결과를 도 16에 나타낸다.

도면 중 횡축은 시간(단위는 분)을, 종축(상대 cpm)은 발광 강도를 나타낸다. 또한, 발광 강도는 최초의 발광 강도의 피크를 「1」로 하였을 때의 상대값이다.

「RNAi(대조)」는 RORα의 서열과는 관계가 없는 siRNA를 이용한 경우이고, 대조구이다.

「RNAi(RORα)」는 RORα를 코딩하는 염기 서열의 일부를 갖는 siRNA를 이용한 경우이다.

도 16에 나타내는 바와 같이, RORα를 코딩하는 염기 서열의 일부를 갖는 siRNA를 이용한 경우(도면 중, 가장 아래의 그래프), 공벡터를 이용한 경우(그 그래프의 상측 곡선)과 비교하여, Bmal1의 발현 유도의 진폭이 감소하였다(그 그래프 중의 하측 곡선). 따라서, 본 실험 결과는, RNA 간섭을 이용하여 ROR의 발현을 억제한 경우, Bmal1의 발현 유도도 억제되는 것을 나타낸다.

<실시예 12>

실시예 12 및 실시예 13에서는, 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 이용하여 RORα에 Bmal1의 발현 유도를 촉진시키는 작용이 있는지의 여부를 조사하였다.

실시예 12에서는 마우스 배아 섬유아세포의 RORα 유전자 결손 변이체를 이용하여 Bmal1 발현 유도의 일주기성 변화를 조사하였다.

실험 절차의 개요는 다음과 같다.

(1) 우선, 상기와 동일하게, 루시페라제 발광 벡터 pGL3 basic(프로메가사 제조)에 Bmal1의 프로모터 영역을 조합하여 재조합 벡터를 제조하였다.

(2) 다음에, 그 재조합 벡터를 마우스 배아 섬유아세포의 RORα 유전자 결손 변이체에 트랜스펙팅한 후, 그 배양 세포를 단리ㆍ계대 배양하였다.

(3) 다음에, 그 배양 세포에 혈청 자극을 가함으로써 일주기성 리듬을 발생시켰다.

(4) 다음에, 배양액에 15 분에 걸쳐 루시페린(루시페라제의 기질)을 첨가하여 루시페라제 활성(발광 강도)을 측정하였다. 또한, 그 발광 강도의 일주기성 변화로부터 Bmal1의 전사 일주기성 리듬을 취득하였다.

결과를 도 17에 나타낸다.

「+/+」는 야생형을, 「sg/sg」는 호모의 RORα 유전자 결손형을 각각 나타낸다.

도 17에 나타내는 바와 같이, 마우스 배아 섬유아세포의 RORα 유전자 결손 변이체에서는 Bmal1 발현 유도의 진폭이 감소하였다.

<실시예 13>

다음에, 실시예 13에서는, 정량적 실시간 RT-PCR에 의해 마우스 배아 섬유아세포의 RORα 유전자 결손 변이체에 있어서의 Bmal1 발현량의 일주기성 변화를 조사하였다.

마우스 배아 섬유아세포를 균질화한 후, 프로메가 전체 SV RNA 단리 키트(프로메가사 제조)를 이용하여 각 장기로부터 전체 RNA를 추출하고, 정량적 실시간 RT-PCR에 의해 Bmal1 유전자의 발현량을 측정하였다.

결과를 도 18에 나타낸다.

도면 중 횡축은 시간(단위는 분)을 나타낸다. 종축 「상대 mRNA 발현량」은 상대적인 발현량(발현 수준)을 나타낸다. 또한, 종축 발현량의 값은 실시예 1과 동일하게 하우스 키핑 유전자 GAPDH(글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제)의 발현량을 1로 한 경우의 상대적인 값이다.

도 18에 나타내는 바와 같이, 마우스 배아 섬유아세포의 RORα 유전자 결손 변이체에서는, Bmal1 발현량의 진폭이 감소하였다. 또한, 이 결과는 도 17의 결과 모두 거의 일치하였다.

이상, 도 17 및 도 18의 결과는 세포 수준에서도, RORα가 Bmal1의 발현 유도를 촉진시키는 것을 강하게 시사한다.

<실시예 14>

실시예 14에서는, 안티센스 핵산을 이용하여 RORα의 발현을 억제한 경우, Bmal1의 발현 유도도 억제되는지의 여부를 조사하였다.

실험 절차의 개요는 다음과 같다.

(1) 우선, 안티센스 핵산 발현 벡터를 제조하였다. RORα를 코딩하는 유전자 중, 소정의 영역과 동일한 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 pcDNA3에 조립하여 안티센스 핵산 발현 벡터를 제조하였다.

또한, DNA 단편으로서, RORα를 코딩하는 유전자의 제65 내지 574 염기까지의 서열을 갖는 단편, 제599 내지 1122 염기까지의 서열을 갖는 단편, 제849 내지 1391 염기까지의 서열을 갖는 단편의 3 종류를 이용하였다.

(3) 다음에, 배양 세포 NIH3T에 안티센스 발현 벡터와 Bmal1의 프로모터 영역을 조합한 재조합 벡터를 트랜스팩팅하여 그 배양 세포를 단리ㆍ계대 배양하였다.

(5) 다음에, 배양액에 15 분에 걸쳐 루시페린(루시페라제의 기질)을 첨가하여 루시페라제 활성(발광 강도)을 측정하였다. 또한, 그 발광 강도의 일주기성 변화로부터 Bmal1의 전사 일주기성 리듬을 취득하였다.

결과를 도 19에 나타낸다.

「AS(RORα1)」은 안티센스 핵산으로서, RORα를 코딩하는 유전자의 제65 내지 574 염기까지의 서열을 갖는 단편을 이용한 경우, 「AS(RORα 2)」는 안티센스로서, 제599 내지 1122 염기까지의 서열을 갖는 단편을 이용한 경우, 「AS(RORα 3)」은 안티센스로서, 제849 내지 1391 염기까지의 서열을 갖는 단편을 이용한 경우를 나타낸다.

도 19에 나타내는 바와 같이, 모든 경우에, 안티센스 핵산을 이용하여 RORα의 발현을 억제함으로써 Bmal1의 발현 유도의 진폭도 억제되었다.

<실시예 15>

상술한 바와 같이, RORα는 저산소 상태에 있어서 발현이 유도되는 것이 밝혀졌다. 따라서, 실시예 15에서는, 저산소 상태에 있어서 Bmal1의 발현 유도도 촉진되는지의 여부에 대하여 조사하였다.

실험 절차의 개요는 다음과 같다.

(2) 다음에, 그 재조합 벡터를 마우스 배아 섬유아세포의 RORα 유전자 결손 변이체에 트랜스펙팅하여 그 배양 세포를 단리ㆍ계대 배양하였다.

(3) 다음에, 그 배양 세포에 혈청 자극을 가함으로써 일주기성 리듬을 발생 시켰다.

(4) 다음에, 배양액에 0.01 mM CoCl₂를 첨가한 후, 15 분에 걸쳐 루시페린(루시페라제의 기질)을 첨가하여 루시페라제 활성(발광 강도)을 측정하였다. 또한, 그 발광 강도의 일주기성 변화로부터 Bmal1의 전사 일주기성 리듬을 취득하였다.

또한, 염화코발트(CoCl₂)를 첨가한 조건하에서 세포를 배양함으로써 저산소 상태를 만들어낼 수 있다.

결과를 도 20에 나타낸다.

「+0.01 mM CoCl₂」는 배양액에 0.01 mM CoCl₂를 첨가한 경우를, 「+0.1 mM NaCl」은 배양액에 0.01 mM CoCl₂ 대신에 0.1 mM NaCl을 첨가한 경우(대조구)를 각각 나타낸다.

도 20의 결과는, 저산소 상태에서는 Bmal1의 발현 유도도 촉진되는 것을 나타낸다.

본 발명은 일주기성 리듬의 조절 메카니즘 중 미해명 부분을 밝혔다는 점에서 유용하다. 따라서, 본 발명은 일주기성 리듬의 조절 메카니즘에 관여하는 질 환, 예를 들면 암, 수면 장해, 비행시차 증후군, 각성 장해, 불면증, 자율 신경 실조증, 우울 병, 노인성 치매 등의 질환의 예방제, 치료제로서 적용 가능성이 있다. 또한, DNA 칩, 프로테인 칩, 일주기성 리듬의 변조를 검출하기 위한 마커, 항암제ㆍ비행시차 증후군 조정제 등의 스크리닝 방법이나 스크리닝 키트 등에 적용 가능하다.

SEQUENCE LISTING <110> SONY Corp. <120> The orphan nuclear receptor RORalpha which regulates circadian transcription of Bmal1 <130> 0590194301 <160> 5 <210> 1 <211> 523 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> RORalpha 1 <400> 1 Met Glu Ser Ala Pro Ala Ala Pro Asp Pro Ala Ala Ser Glu Pro 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Ala Asp Ala Ala Ala Gly Ser Arg Glu Thr Pro 20 25 30 Leu Asn Gln Glu Ser Ala Arg Lys Ser Glu Pro Pro Ala Pro Val 35 40 45 Arg Arg Gln Ser Tyr Ser Ser Thr Ser Arg Gly Ile Ser Val Thr 50 55 60 Lys Lys Thr His Thr Ser Gln Ile Glu Ile Ile Pro Cys Lys Ile 65 70 75 Cys Gly Asp Lys Ser Ser Gly Ile His Tyr Gly Val Ile Thr Cys 80 85 90 Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Gln Gln Ser Asn Ala 95 100 105 Thr Tyr Ser Cys Pro Arg Gln Lys Asn Cys Leu Ile Asp Arg Thr 110 115 120 Ser Arg Asn Arg Cys Gln His Cys Arg Leu Gln Lys Cys Leu Ala 125 130 135 Val Gly Met Ser Arg Asp Ala Val Lys Phe Gly Arg Met Ser Lys 140 145 150 Lys Gln Arg Asp Ser Leu Tyr Ala Glu Val Gln Lys His Arg Met 155 160 165 Gln Gln Gln Gln Arg Asp His Gln Gln Gln Pro Gly Glu Ala Glu 170 175 180 Pro Leu Thr Pro Thr Tyr Asn Ile Ser Ala Asn Gly Leu Thr Glu 185 190 195 Leu His Asp Asp Leu Ser Asn Tyr Ile Asp Gly His Thr Pro Glu 200 205 210 Gly Ser Lys Ala Asp Ser Ala Val Ser Ser Phe Tyr Leu Asp Ile 215 220 225 Gln Pro Ser Pro Asp Gln Ser Gly Leu Asp Ile Asn Gly Ile Lys 230 235 240 Pro Glu Pro Ile Cys Asp Tyr Thr Pro Ala Ser Gly Phe Phe Pro 245 250 255 Tyr Cys Ser Phe Thr Asn Gly Glu Thr Ser Pro Thr Val Ser Met 260 265 270 Ala Glu Leu Glu His Leu Ala Gln Asn Ile Ser Lys Ser His Leu 275 280 285 Glu Thr Cys Gln Tyr Leu Arg Glu Glu Leu Gln Gln Ile Thr Trp 290 295 300 Gln Thr Phe Leu Gln Glu Glu Ile Glu Asn Tyr Gln Asn Lys Gln 305 310 315 Arg Glu Val Met Trp Gln Leu Cys Ala Ile Lys Ile Thr Glu Ala 320 325 330 Ile Gln Tyr Val Val Glu Phe Ala Lys Arg Ile Asp Gly Phe Met 335 340 345 Glu Leu Cys Gln Asn Asp Gln Ile Val Leu Leu Lys Ala Gly Ser 350 355 360 Leu Glu Val Val Phe Ile Arg Met Cys Arg Ala Phe Asp Ser Gln 365 370 375 Asn Asn Thr Val Tyr Phe Asp Gly Lys Tyr Ala Ser Pro Asp Val 380 385 390 Phe Lys Ser Leu Gly Cys Glu Asp Phe Ile Ser Phe Val Phe Glu 395 400 405 Phe Gly Lys Ser Leu Cys Ser Met His Leu Thr Glu Asp Glu Ile 410 415 420 Ala Leu Phe Ser Ala Phe Val Leu Met Ser Ala Asp Arg Ser Trp 425 430 435 Leu Gln Glu Lys Val Lys Ile Glu Lys Leu Gln Gln Lys Ile Gln 440 445 450 Leu Ala Leu Gln His Val Leu Gln Lys Asn His Arg Glu Asp Gly 455 460 465 Ile Leu Thr Lys Leu Ile Cys Lys Val Ser Thr Leu Arg Ala Leu 470 475 480 Cys Gly Arg His Thr Glu Lys Leu Met Ala Phe Lys Ala Ile Tyr 485 490 495 Pro Asp Ile Val Arg Leu His Phe Pro Pro Leu Tyr Lys Glu Leu 500 505 510 Phe Thr Ser Glu Phe Glu Pro Ala Met Gln Ile Asp Gly 515 520 523 <210> 2 <211> 468 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> RORalpha 4 <400> 2 Met Met Tyr Phe Val Ile Ala Glu Met Lys Ala Gln Ile Glu Ile 1 5 10 15 Ile Pro Cys Lys Ile Cys Gly Asp Lys Ser Ser Gly Ile His Tyr 20 25 30 Gly Val Ile Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser 35 40 45 Gln Gln Ser Asn Ala Thr Tyr Ser Cys Pro Arg Gln Lys Asn Cys 50 55 60 Leu Ile Asp Arg Thr Ser Arg Asn Arg Cys Gln His Cys Arg Leu 65 70 75 Gln Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Ser Arg Asp Ala Val Lys Phe 80 85 90 Gly Arg Met Ser Lys Lys Gln Arg Asp Ser Leu Tyr Ala Glu Val 95 100 105 Gln Lys His Arg Met Gln Gln Gln Gln Arg Asp His Gln Gln Gln 110 115 120 Pro Gly Glu Ala Glu Pro Leu Thr Pro Thr Tyr Asn Ile Ser Ala 125 130 135 Asn Gly Leu Thr Glu Leu His Asp Asp Leu Ser Asn Tyr Ile Asp 140 145 150 Gly His Thr Pro Glu Gly Ser Lys Ala Asp Ser Ala Val Ser Ser 155 160 165 Phe Tyr Leu Asp Ile Gln Pro Ser Pro Asp Gln Ser Gly Leu Asp 170 175 180 Ile Asn Gly Ile Lys Pro Glu Pro Ile Cys Asp Tyr Thr Pro Ala 185 190 195 Ser Gly Phe Phe Pro Tyr Cys Ser Phe Thr Asn Gly Glu Thr Ser 200 205 210 Pro Thr Val Ser Met Ala Glu Leu Glu His Leu Ala Gln Asn Ile 215 220 225 Ser Lys Ser His Leu Glu Thr Cys Gln Tyr Leu Arg Glu Glu Leu 230 235 240 Gln Gln Ile Thr Trp Gln Thr Phe Leu Gln Glu Glu Ile Glu Asn 245 250 255 Tyr Gln Asn Lys Gln Arg Glu Val Met Trp Gln Leu Cys Ala Ile 260 265 270 Lys Ile Thr Glu Ala Ile Gln Tyr Val Val Glu Phe Ala Lys Arg 275 280 285 Ile Asp Gly Phe Met Glu Leu Cys Gln Asn Asp Gln Ile Val Leu 290 295 300 Leu Lys Ala Gly Ser Leu Glu Val Val Phe Ile Arg Met Cys Arg 305 310 315 Ala Phe Asp Ser Gln Asn Asn Thr Val Tyr Phe Asp Gly Lys Tyr 320 325 330 Ala Ser Pro Asp Val Phe Lys Ser Leu Gly Cys Glu Asp Phe Ile 335 340 345 Ser Phe Val Phe Glu Phe Gly Lys Ser Leu Cys Ser Met His Leu 350 355 360 Thr Glu Asp Glu Ile Ala Leu Phe Ser Ala Phe Val Leu Met Ser 365 370 375 Ala Asp Arg Ser Trp Leu Gln Glu Lys Val Lys Ile Glu Lys Leu 380 385 390 Gln Gln Lys Ile Gln Leu Ala Leu Gln His Val Leu Gln Lys Asn 395 400 405 His Arg Glu Asp Gly Ile Leu Thr Lys Leu Ile Cys Lys Val Ser 410 415 420 Thr Leu Arg Ala Leu Cys Gly Arg His Thr Glu Lys Leu Met Ala 425 430 435 Phe Lys Ala Ile Tyr Pro Asp Ile Val Arg Leu His Phe Pro Pro 440 445 450 Leu Tyr Lys Glu Leu Phe Thr Ser Glu Phe Glu Pro Ala Met Gln 455 460 465 Ile Asp Gly 468 <210> 3 <211> 523 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> RORalpha 1 <400> 3 Met Glu Ser Ala Pro Ala Ala Pro Asp Pro Ala Ala Ser Glu Pro 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ser Arg Glu Thr Pro 20 25 30 Leu Thr Gln Asp Thr Gly Arg Lys Ser Glu Ala Pro Gly Ala Gly 35 40 45 Arg Arg Gln Ser Tyr Ala Ser Ser Ser Arg Gly Ile Ser Val Thr 50 55 60 Lys Lys Thr His Thr Ser Gln Ile Glu Ile Ile Pro Cys Lys Ile 65 70 75 Cys Gly Asp Lys Ser Ser Gly Ile His Tyr Gly Val Ile Thr Cys 80 85 90 Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Gln Gln Ser Asn Ala 95 100 105 Thr Tyr Ser Cys Pro Arg Gln Lys Asn Cys Leu Ile Asp Arg Thr 110 115 120 Ser Arg Asn Arg Cys Gln His Cys Arg Leu Gln Lys Cys Leu Ala 125 130 135 Val Gly Met Ser Arg Asp Ala Val Lys Phe Gly Arg Met Ser Lys 140 145 150 Lys Gln Arg Asp Ser Leu Tyr Ala Glu Val Gln Lys His Arg Met 155 160 165 Gln Gln Gln Gln Arg Asp His Gln Gln Gln Pro Gly Glu Ala Glu 170 175 180 Pro Leu Thr Pro Thr Tyr Asn Ile Ser Ala Asn Gly Leu Thr Glu 185 190 195 Leu His Asp Asp Leu Ser Thr Tyr Met Asp Gly His Thr Pro Glu 200 205 210 Gly Ser Lys Ala Asp Ser Ala Val Ser Ser Phe Tyr Leu Asp Ile 215 220 225 Gln Pro Ser Pro Asp Gln Ser Gly Leu Asp Ile Asn Gly Ile Lys 230 235 240 Pro Glu Pro Ile Cys Asp Tyr Thr Pro Ala Ser Gly Phe Phe Pro 245 250 255 Tyr Cys Ser Phe Thr Asn Gly Glu Thr Ser Pro Thr Val Ser Met 260 265 270 Ala Glu Leu Glu His Leu Ala Gln Asn Ile Ser Lys Ser His Leu 275 280 285 Glu Thr Cys Gln Tyr Leu Arg Glu Glu Leu Gln Gln Ile Thr Trp 290 295 300 Gln Thr Phe Leu Gln Glu Glu Ile Glu Asn Tyr Gln Asn Lys Gln 305 310 315 Arg Glu Val Met Trp Gln Leu Cys Ala Ile Lys Ile Thr Glu Ala 320 325 330 Ile Gln Tyr Val Val Glu Phe Ala Lys Arg Ile Asp Gly Phe Met 335 340 345 Glu Leu Cys Gln Asn Asp Gln Ile Val Leu Leu Lys Ala Gly Ser 350 355 360 Leu Glu Val Val Phe Ile Arg Met Cys Arg Ala Phe Asp Ser Gln 365 370 375 Asn Asn Thr Val Tyr Phe Asp Gly Lys Tyr Ala Ser Pro Asp Val 380 385 390 Phe Lys Ser Leu Gly Cys Glu Asp Phe Ile Ser Phe Val Phe Glu 395 400 405 Phe Gly Lys Ser Leu Cys Ser Met His Leu Thr Glu Asp Glu Ile 410 415 420 Ala Leu Phe Ser Ala Phe Val Leu Met Ser Ala Asp Arg Ser Trp 425 430 435 Leu Gln Glu Lys Val Lys Ile Glu Lys Leu Gln Gln Lys Ile Gln 440 445 450 Leu Ala Leu Gln His Val Leu Gln Lys Asn His Arg Glu Asp Gly 455 460 465 Ile Leu Thr Lys Leu Ile Cys Lys Val Ser Thr Leu Arg Ala Leu 470 475 480 Cys Gly Arg His Thr Glu Lys Leu Met Ala Phe Lys Ala Ile Tyr 485 490 495 Pro Asp Ile Val Arg Leu His Phe Pro Pro Leu Tyr Lys Glu Leu 500 505 510 Phe Thr Ser Glu Phe Glu Pro Ala Met Gln Ile Asp Gly 515 520 523 <210> 4 <211> 467 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> RORalpha 4 <400> 4 Met Tyr Phe Val Ile Ala Ala Met Lys Ala Gln Ile Glu Ile Ile 1 5 10 15 Pro Cys Lys Ile Cys Gly Asp Lys Ser Ser Gly Ile His Tyr Gly 20 25 30 Val Ile Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Gln 35 40 45 Gln Ser Asn Ala Thr Tyr Ser Cys Pro Arg Gln Lys Asn Cys Leu 50 55 60 Ile Asp Arg Thr Ser Arg Asn Arg Cys Gln His Cys Arg Leu Gln 65 70 75 Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Ser Arg Asp Ala Val Lys Phe Gly 80 85 90 Arg Met Ser Lys Lys Gln Arg Asp Ser Leu Tyr Ala Glu Val Gln 95 100 105 Lys His Arg Met Gln Gln Gln Gln Arg Asp His Gln Gln Gln Pro 110 115 120 Gly Glu Ala Glu Pro Leu Thr Pro Thr Tyr Asn Ile Ser Ala Asn 125 130 135 Gly Leu Thr Glu Leu His Asp Asp Leu Ser Thr Tyr Met Asp Gly 140 145 150 His Thr Pro Glu Gly Ser Lys Ala Asp Ser Ala Val Ser Ser Phe 155 160 165 Tyr Leu Asp Ile Gln Pro Ser Pro Asp Gln Ser Gly Leu Asp Ile 170 175 180 Asn Gly Ile Lys Pro Glu Pro Ile Cys Asp Tyr Thr Pro Ala Ser 185 190 195 Gly Phe Phe Pro Tyr Cys Ser Phe Thr Asn Gly Glu Thr Ser Pro 200 205 210 Thr Val Ser Met Ala Glu Leu Glu His Leu Ala Gln Asn Ile Ser 215 220 225 Lys Ser His Leu Glu Thr Cys Gln Tyr Leu Arg Glu Glu Leu Gln 230 235 240 Gln Ile Thr Trp Gln Thr Phe Leu Gln Glu Glu Ile Glu Asn Tyr 245 250 255 Gln Asn Lys Gln Arg Glu Val Met Trp Gln Leu Cys Ala Ile Lys 260 265 270 Ile Thr Glu Ala Ile Gln Tyr Val Val Glu Phe Ala Lys Arg Ile 275 280 285 Asp Gly Phe Met Glu Leu Cys Gln Asn Asp Gln Ile Val Leu Leu 290 295 300 Lys Ala Gly Ser Leu Glu Val Val Phe Ile Arg Met Cys Arg Ala 305 310 315 Phe Asp Ser Gln Asn Asn Thr Val Tyr Phe Asp Gly Lys Tyr Ala 320 325 330 Ser Pro Asp Val Phe Lys Ser Leu Gly Cys Glu Asp Phe Ile Ser 335 340 345 Phe Val Phe Glu Phe Gly Lys Ser Leu Cys Ser Met His Leu Thr 350 355 360 Glu Asp Glu Ile Ala Leu Phe Ser Ala Phe Val Leu Met Ser Ala 365 370 375 Asp Arg Ser Trp Leu Gln Glu Lys Val Lys Ile Glu Lys Leu Gln 380 385 390 Gln Lys Ile Gln Leu Ala Leu Gln His Val Leu Gln Lys Asn His 395 400 405 Arg Glu Asp Gly Ile Leu Thr Lys Leu Ile Cys Lys Val Ser Thr 410 415 420 Leu Arg Ala Leu Cys Gly Arg His Thr Glu Lys Leu Met Ala Phe 425 430 435 Lys Ala Ile Tyr Pro Asp Ile Val Arg Leu His Phe Pro Pro Leu 440 445 450 Tyr Lys Glu Leu Phe Thr Ser Glu Phe Glu Pro Ala Met Gln Ile 455 460 465 Asp Gly 467 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 5 gcagagagac agcttgtac 19

Claims

Bmal1의 발현 유도를 촉진시키는 RORα.
제1항에 있어서, 저산소 상태에서 발현이 촉진되는 것을 특징으로 하는 RORα.
제1항에 있어서, REV-ERBα 또는 REV-ERBβ와 경합적으로 작용하는 것을 특징으로 하는 RORα.
제1항에 있어서, BMAL1과 CLOCK과의 결합을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 RORα.
제4항에 있어서, Per 유전자 및/또는 Cry 유전자의 발현 유도를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 RORα.
제1항에 기재된 RORα를 억제하는 물질을 적어도 함유하는 항암제.
제6항에 있어서, 상기 물질이 항 RORα 항체인 것을 특징으로 하는 항암제.
제6항에 있어서, 상기 물질이 RORα의 발현을 억제하는 siRNA인 것을 특징으로 하는 항암제.
제6항에 있어서, 상기 물질이 안티센스 핵산인 것을 특징으로 하는 항암제.
제1항에 기재된 RORα를 억제하는 물질을 적어도 함유하는 비행시차 증후군 조정제.
제10항에 있어서, 상기 물질이 항 RORα 항체인 것을 특징으로 하는 비행시차 증후군 조정제.
제10항에 있어서, 상기 물질이 RORα의 발현을 억제하는 siRNA인 것을 특징으로 하는 비행시차 증후군 조정제.
제10항에 있어서, 상기 물질이 안티센스 핵산인 것을 특징으로 하는 비행시차 증후군 조정제.
제1항에 기재된 RORα를 코딩하는 유전자의 염기 서열을 갖는 핵산, 또는 상기 유전자의 일부분의 염기 서열을 갖는 핵산이 적어도 고정된 DNA 칩.
제1항에 기재된 RORα와 특이적으로 결합하는 항체가 적어도 고정된 프로테인 칩.
제1항에 기재된 RORα의, 일주기성 리듬의 변조를 검출하기 위한 마커로서의 용도.
제1항에 기재된 RORα를 억제하는 물질을 탐색하는 것에 의한 항암제의 스크리닝 방법.
제1항에 기재된 RORα를 억제하는 물질을 탐색하는 것에 의한 비행시차 증후군 조정제의 스크리닝 방법.