JP6486683B2 - Her2阻害薬を用いた治療に対する応答を予測する方法 - Google Patents
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Description
i)前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子(少なくとも1つのコピー)、特に、両方の対立遺伝子(両方のコピー)に対して、rs3746083多型部位のヌクレオチドを同定するステップ、及び/又は、
ii)前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質のレベルを決定するステップ、
を含む。
−本発明の予測方法は、シンプル且つ高速である。特に、ステップi)は、患者からの腫瘍試料の採取を必要としない、従って、生検を行うことに関連する種々のリスク及び問題を回避するという利点を有する。実際、本発明の予測方法は、シンプルな分子生物学技術による患者からの通常の5から10mlの血液試料から実行することができる。本発明の予測方法は、単に、多くの医療センターにおいてすでに存在する標準的な分子生物学基盤を必要とする。さらに、ステップi)は、特に解析するのが容易な結果を提供するという利点を有する。ステップii)は、たった1つのタンパク質のレベルの解析のみを必要とするという利点を有する。
−本発明の予測方法は、信頼でき、再現でき、且つ安価である。
−HER2細胞外ドメインに対して作られた抗体、特にトラスツズマブ(Herceptin(登録商標))、
−HER2に対して作られ、且つ、HER3等とのHER2のホモ二量体形成及び/又はヘテロ二量体形成を抑制する抗体、特に、モノクローナル抗体ペルツズマブ(2C4、Omnitarg(登録商標)とも呼ばれる)、
−抗HER2ワクチン、
−HER2チロシンキナーゼ活性の抑制剤、特にエモジン(3−メチル−1,6,8−トリヒドロキシアントラキノン)、クルクミン、OSI−774(Tarceva(登録商標))、ZD−1839(Iressa(登録商標))、CI−1033及びラパチニブ(Tykerb(登録商標)、GSK572016、GW572016、GlaxoSmithKline、Research Triangle Park、NC、USA)、
−HER2に対して作られた、特にHER2細胞外ドメインに対して作られた細胞内単鎖抗体であって、HER2の小胞体中の通過を回避するタイプの抗体、
−HER2をコードする遺伝子、特にアデノウイルスE1A遺伝子の転写の抑制剤、及び、
−アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイム等のHER2をコードするmRNAの翻訳の抑制剤、
から成る群から選択することができ、これらの種々のタイプのHER2阻害薬は、特に、Chen等による記事(2003)において例示されている。
−テストされることになる薬剤を、HER2を発現する細胞と接触させて置くステップ、
−HER2発現条件下で前記細胞を増殖させるステップ、
−HER2機能及び/又はHER2発現レベルを決定するステップ、
−前記テストされることになる薬剤の存在下と非存在下でのHER2機能、特にHER2チロシンキナーゼ活性及び/又はHER2発現レベルを比較するステップ、
で構成される方法によって同定することができ、前記テストされることになる薬剤の存在下でのHER2機能、特にチロシンキナーゼ活性及び/又はHER2発現レベルの有意の減少は、HER2阻害薬の存在を示している。
−rs3746083多型部位のヌクレオチドが、トリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子(少なくとも1つのコピー)、特に、両方の対立遺伝子(両方のコピー)に対してCヌクレオチドでない場合に、特に、rs3746083多型部位のヌクレオチドが、前記患者におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子(少なくとも1つのコピー)、特に、両方の対立遺伝子(両方のコピー)に対してTヌクレオチドである場合に、前記患者を非応答群に割り当てるステップ、又は、
−rs3746083多型部位のヌクレオチドが、前記患者におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の両方の対立遺伝子(両方のコピー)に対してCヌクレオチドである場合に、前記患者を応答群に割り当てるステップ、
をさらに含み得る。
iii)ステップii)において決定した前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質のレベルを、少なくとも1つの参照値と比較するステップをさらに含み得る。
−参照閾値、
−ステップii)においてトリステトラプロリンタンパク質のレベルを決定した腫瘍組織に隣接する健康な組織において決定されたトリステトラプロリンタンパク質のレベルの平均値、
−少なくとも1つのHER2阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に応答性の患者の群に対する、等価の生物学的試料において決定されたトリステトラプロリンタンパク質のレベルの平均値、又は
−少なくとも1つのHER2阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に応答性ではない患者の群に対する、等価の生物学的試料において決定されたトリステトラプロリンタンパク質のレベルの平均値、
であり得る。
−GPR22(Gタンパク質共役受容体22、特に、GenBank reference:NM_005295)、PEX19(ペルオキシソーム生合成因子19、特に、GenBank reference:NM_002857)、GRHL2(グレイニーヘッド(grainyhead)様2、特に、GenBank reference:NM_024915)、及び、DERL1(デルリン(Derlin)1、特に、GenBank reference:NM_024295)、HER2をコードする遺伝子(特に、GenBank reference:NM_004448)から成る群から選ばれた少なくとも1つの遺伝子の発現レベルであり得る。
iv)ステップi)及び/又はステップii)において得た結果を評価することによって、少なくとも1つのHER2阻害薬、特にトラスツズマブを用いた治療に対する前記患者の応答を予測するステップ、
をさらに含み得る。
−a)本発明の予測方法を実行することによって、少なくとも1つのHER2阻害薬を用いた治療に対する患者の応答を予測するステップ、及び、
−b)ステップa)において少なくとも1つのHER2阻害薬を用いた治療に対して応答性であると予測した前記患者に治療量のHER2阻害薬を投与するステップ、
を含む。
−少なくとも1つのHER2阻害薬、及び
−HER2関連病態及び/又は疾患、特に、HER2陽性病態、さらに特には、HER2陽性癌、なお特にはHER2陽性乳癌を治療するための少なくとも1つの他の薬剤、
を、患者におけるHER2関連病態及び/又は疾患、特に、HER2陽性病態、さらに特には、HER2陽性癌、なお特にはHER2陽性乳癌を治療するための同時、別々、若しくは連続使用のための配合剤として含む製品にも関し、前記患者は、本発明の予測方法によって当該HER2阻害薬を用いた治療に応答性であると予測される。
−少なくとも1つのHER2阻害薬、及び
−HER2関連病態及び/又は疾患、特に、HER2陽性病態、さらに特には、HER2陽性癌、なお特にはHER2陽性乳癌を治療するための少なくとも1つの他の薬剤
の使用にも関し、前記患者は、本発明の予測方法によって当該HER2阻害薬を用いた治療に応答性であると予測される。
−特に乳癌の場合にはタキサン(特にドセタキセル又はTaxotere(登録商標))、ドキソルビシン、5−フルオロウラシル、エピルビシン、又はシクロホスファミド等の化学療法の薬剤
−特に乳癌の場合にはタモキシフェン等のホルモン療法の薬剤、又は、
−放射線療法の薬剤
であり得る。
−rs3746083多型部位のヌクレオチドを同定する手段、及び/又は、
−トリステトラプロリンタンパク質のレベルを決定する手段、さらに任意で、
−少なくとも1つのHER2阻害薬を用いた治療に対する患者の応答を予測するための前記手段を使用するための指示、
を含む。
−rs3746083多型部位にヌクレオチドを有する患者のゲノムDNA、cDNA、又はRNAを配列決定するための特異的なプライマー及び試薬、
−rs3746083多型部位にヌクレオチドを有する患者のゲノムDNA、cDNA、又はRNAを増幅するための特異的なプライマー及び試薬であって、特に、rs3746083多型部位のヌクレオチドに隣接する患者のゲノムDNA、cDNA、又はRNAの一部と特異的にハイブリッド形成する能力を持つ核酸プライマー、
−ヒトゲノム上の位置rs3746083に位置している多型のC対立遺伝子、T対立遺伝子、A対立遺伝子、及びG対立遺伝子に対する特異的な核酸プローブ、並びに、多型を検出するために使用される相補的な核酸配列間の特異的ハイブリッドの形成を検出するための試薬、
で構成される群から選択することができる。
α)前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子(少なくとも1つのコピー)、特に、両方の対立遺伝子(両方のコピー)に対する、rs3746083多型部位のヌクレオチドを同定するステップを含む。
−本発明の予後又は診断の方法は、シンプル且つ高速である。ステップα)は、患者からの腫瘍試料の採取を必要としない、従って、生検を行うことに関連する種々のリスク及び問題を回避するという利点を有する。例えば、本発明の予後又は診断の方法は、シンプルな分子生物学技術による患者からの通常の5から10mlの血液試料から実行することができる。本発明の予後又は診断の方法は、多くの病院においてすでに存在する標準的な分子生物学基盤を必要とする。さらに、ステップα)は、特に解析するのが容易な結果を提供するという利点を有する。
−本発明の予後又は診断の方法は、信頼でき、再現でき、且つ安価である。
−HER2陽性癌の場合にHER2をコードする遺伝子等、前記癌を被る患者において発現が調節される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル
であり得る。
1)本発明の予後又は診断の方法を実行することによる、前記患者における癌の予後又は診断ステップ、
2)ステップ1)において特に予後不良を有した癌を被るとして診断した前記患者に対する治療量の抗癌剤の投与ステップ、
を含む。
−特に乳癌の場合にはタキサン(特にドセタキセル又はTaxotere(登録商標))、ドキソルビシン、5−フルオロウラシル、エピルビシン、又はシクロホスファミド等の化学療法の薬剤
−特に乳癌の場合にはタモキシフェン等のホルモン療法の薬剤、又は、
−放射線療法の薬剤
であり得る。
−rs3746083多型部位のヌクレオチドを同定する手段、及び任意で、
−患者における癌、特に予後不良を有した癌の予後又は診断を確立するための前記手段を使用するための指示、
を含む。
−rs3746083多型部位にヌクレオチドを有する患者のゲノムDNA、cDNA、又はRNAを配列決定するための特異的なプライマー及び試薬、
−rs3746083多型部位にヌクレオチドを有する患者のゲノムDNA、cDNA、又はRNAを増幅するための特異的なプライマー及び試薬であって、特に、rs3746083多型部位のヌクレオチドに隣接する患者のゲノムDNA、cDNA、又はRNAの一部と特異的にハイブリッド形成する能力を持つ核酸プライマー、
−ヒトゲノム上の位置rs3746083に位置している多型のC対立遺伝子、T対立遺伝子、A対立遺伝子、及びG対立遺伝子に対する特異的な核酸プローブ、並びに、多型を検出するために使用される相補的な核酸配列間の特異的ハイブリッドの形成を検出するための試薬、
で構成される群から選択することができる。
I.1 プラスミドの構築
MDA231細胞におけるTET−Offアプローチ(TET:テトラサイクリン)に対して、pREV−TTPコンストラクトを、pREVプラスミド(Clontech)のHindIII制限部位においてTTP cDNAの領域のコード化に対応する1kbのDNA断片を挿入することによって得た(Essafi−Benkhadir等、2007)。野生型配列(rs3746083多型部位でのCヌクレオチドの存在)及びヒトTTPの配列変異体(rs3746083多型部位でのTヌクレオチドの存在)を含有するpcDNA4/TO/myc−HysA(Trex−TTP)コンストラクトを、センスプライマー(5’CCACTCTCGGCCGACACCCC−3’)及びアンチセンスプライマー(5’−GTCACTCAGAAACAGAGATGCG−3’)を用いてHs578T細胞のcDNAから直接1kbの領域を増幅することによって、並びに、その断片をpCR2.1−TOPOベクター(Invitrogen社)内に挿入することによって作製した。TTP cDNA断片を、次に、pcDNA4/TO/myc−HysAベクター(Invitrogen社)内にEcoRI制限部位にて挿入した。2つの独立したプラスミド調製を、各コンストラクトに対して得た。
TRIzol試薬(Invitrogen社)を用いて全RNAを抽出した。Superscript First−Strand Synthesis System kit(QIAGEN社、Hilden、Germany)を使用し、第1のDNA鎖の合成を刺激するためにOligo(dt)プライマーを用いて、2マイクログラムの全RNAを逆転写に使用した。リアルタイムPCRに対して、TaqMan Gene Expression Assay kit(Applied Biosystems社)及びqPCRCore kit(Eurogentec社)を使用した。細胞株におけるTTP、VEGF、及びIL8のmRNAの相対発現を計算するために、2[ddC(T)]方法を使用し(Schmittgen、2008)、さらに、RPLP0遺伝子(Essafi−Benkhadir等、2007)を、標準化のために使用した。mRNAの安定性を計算するために、25μg/mlの5,6−ジクロロ−1−D−リボフラノシルベンズイミダゾール(DRB)を、培養した乳癌細胞に添加し、続いて、種々の時間に該細胞からRNAを抽出した。培養液へのDRBの添加前の0時間での各mRNAの相対量を、100%に設定した。
乳癌細胞株MDA231、Hs578T、MCF7、T47D、及びMCF10、並びに、ヒト胚性腎臓細胞株HEK293を、以前に記載されたように培養した(Essafi−Benkhadir等、2007、Eckert等、2004)。RAW264.7細胞を、37℃の5%CO2の加湿した大気において、ウシ胎仔血清を追加したDulbecco’s Modified Eagle’s Mediumにおいて増殖し、10ng/mlの濃度のリポ多糖(LPS)(Sigma Aldrich社)で刺激した。TTP抗体を、ヒト型TTPを遺伝子導入されたLPSで刺激されたRAW264.7細胞及びHEK293細胞のタンパク質抽出物に対する免疫ブロット解析によって検証した(Lay等、1999)。安定なクローンを、pREV−TTPプラスミドにLipofectamine(商標)2000(Invitrogen社)を遺伝子導入することによって取得し、さらに、ハイグロマイシン耐性クローンを、培養液からのテトラサイクリンの除去後に免疫ブロットによってスクリーニングした。MCF7細胞におけるTTPの不活性化を、細胞にLipofectamine及びMISSION(商標)shRNAレンチウイルスプラスミド(SIGMA社)を遺伝子導入することによって得た。耐性クローンの選択を、培養液にピューロマイシンを添加することによって実行し、さらに、選択したクローンのスクリーニングを、qPCRによって実行した。
CIAP(New England Biolabs社、Ipswich、MA)を用いた実験に対して、解析前の24時間、MDA231細胞からテトラサイクリンを取り除いた。細胞を、続いて、溶解緩衝液(1%Triton X−100、50mM Tris、pH8.5、100mM NaCl、及び0.5mM EDTA)において溶解した。CIAP(35U)を、1時間37℃の可溶化液に添加した。レムリ溶解緩衝液を添加することによって反応を中止させた。
細胞上清におけるVEGF及びIL−8の存在を、ヒトVEGF及びIL−8に対する酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)キット(Pierce Biotechnology社、Rockford、IL)を使用して測定した。
乳癌を有した92人の女性、及び、対照として89人の女性を、rs3746083多型部位でのTヌクレオチドの存在に対して解析した。癌を被る患者全てが、HER2遺伝子(HER2陽性)の増幅と共に非常に高悪性度の腫瘍を有し、全員を、HER2に対して作られたモノクローナル抗体であるHerceptin(登録商標)(トラスツズマブ)を用いて治療した。ゲノムDNAを、標準的な技術を使用して末梢血白血球から抽出した。SNP NM_003407.2:367C>T(rs3746083多型部位でのTヌクレオチドの存在)に対して、1つの400bpの増幅産物を、プライマー103F(5’−CGACCATGGAGGGACTGAG−3’)及び103R(5’−GCCCTGGAGGTAGAACTTGT)を使用して、及び、以下のPCR条件、すなわち、50μlのPCR反応量における200ngのゲノムDNA、50pMの各プライマー、200μMの各dNTP、1X緩衝液、0.9ユニットのTaqポリメラーゼ(AmpliTaq Gold−Applied Biosystems社、Foster City、CA、USA)、及び1.5mM MgCl2に従うことによって生じた。95℃での10分間の最初の変性の後、95℃で45秒間、62℃で45秒間、72℃で45秒間、次に、72℃で10分間最後の伸長という35の増幅サイクルが続いた。rs3746083遺伝子座での変異体のT対立遺伝子の有無(rs3746083多型部位でのTヌクレオチドの存在;NM_003407.2:367C>T)は、(製造者、すなわちNew England BioLabs社の指示に従い)制限酵素HhaIを用いた消化によって評価される。酵素消化の後、試料は、3%アガロースゲル上に堆積される。
対立遺伝子頻度は、遺伝子型データから推定される。患者群及び対照群は、統計学的有意性の基準としてp=0.05を規定することによってFisher直接確率法と比較される。Hardy−Weinberg平衡が、対照群においても患者群においてもカイ二乗検定を用いてテストされる。臨床研究のために、腫瘍パラメータをANOVAによって比較した。生存推定を、Kaplan−Meier法を使用して計算した。生存期間の差を、ログランク検定を使用して評価した。カイ二乗検定を使用して、患者の遺伝子型と、(血液学的、消化性)毒性と、トラスツズマブに基づく治療に対する応答との関連性を決定した。
II.1 乳癌細胞株におけるTTP、VEGF、及びIL8の発現
TTPタンパク質のレベルを、いくつかの乳癌細胞株:MDA231、Hs578T、MCF7、及びT47Dにおいて免疫ブロットによって解析した。MDA231及びHs578Tは、非常に高悪性度の細胞株であり、間葉系の表現型、(「トリプルネガティブ」表現型とも呼ばれる)エストロゲン並びにプロゲステロン受容体及びHER2受容体の発現の欠如によって特徴づけられる一方で、MCF7及びT47Dは、より悪性度の低い上皮系の表現型、HER2タンパク質の増幅がないエストロゲン及びプロゲステロン受容体の発現を有する(Eckert等、2004)。TTPタンパク質の期待されるサイズは、35kDaであるが、市販の抗体(Suswam等、2008、Al−Souhibani等2010)も「ハウス(house)」抗体(Essafi−Benkhadir等、2007)も使用した従来のSDS−PAGE免疫ブロット解析の間に45kDaから47kDaのバンドの形状で移動することが頻繁にある。2つの癌細胞株、MDA231及びHs578Tは、期待されたサイズのタンパク質を発現しなかったが、MCF7及びT47D細胞は、非腫瘍形成性の不死化した乳房の細胞株であるMCF10のものに匹敵するレベルで発現したということを観察した(図1A)。トリプルネガティブ細胞(MDA231及びHs578T)におけるVEGF及びIL8等の血管新生因子の、より悪性度の低い細胞株(MCF7及びT47D)よりも高い産生と、TTPタンパク質の発現の欠如が関連があるかどうかを調べた。そのためにも、4つの細胞株において、これらの因子のmRNAのレベルを定量的リアルタイムPCRによって決定し、さらに、分泌されたタンパク質のレベルをELISAによって決定した。MDA231及びHs578T細胞は、TTPタンパク質を発現しないが、mRNA及びタンパク質両方に関して大量のVEGF及びIL8を産生する(図1B及び1C)。これらのデータは、TTPレベルと乳腺腫瘍細胞の病原力との相互関係の基礎をなす。
乳癌におけるTTPタンパク質と血管新生因子との相互関係を研究するために、Myc−エピトープのタグをつけたテトラサイクリン誘導TTP遺伝子を安定的に遺伝子導入したMDA231/TET−OFF細胞のクローンを作製した。HeLa/TTP細胞に対して以前に観察されたように、TET−OFFモデルは、細胞増殖に関与する遺伝子の研究に対してより適しており、さらに、偽陽性クローンの選択を回避する(Suswam等、2008)。テトラサイクリンの存在下では、TTPタンパク質は発現されない。培地からテトラサイクリンを除去することによって、TTP誘導が可能になる。TTPタンパク質の弱誘導性の発現を有した1つのクローン(PA15)、及び、高誘導性の発現を有した2つのクローン(PA1及びPA48)を得た(図2A)。VEGF及びIL8のmRNAの産生に対するTTPタンパク質の効果を示すために、定量的リアルタイムRT−PCRを実行し、VEGF及びIL8のmRNAの発現に対するTTPタンパク質の用量依存的な効果を観察した(図2B)。この実験によって、血管新生因子のmRNAのレベルの減少はTTPタンパク質のレベル次第であるということが確かめられている。
TTPタンパク質の発現によって調節することができる別の腫瘍形成表現型は、癌細胞の増殖速度である(Brennan等、2009)。それぞれ高レベル及び低レベルでTTPタンパク質を発現する2つのMDA231クローン(PA1及びPA15)において、増殖速度における減少は、TTPタンパク質の発現次第である(図4A)。MDA231クローンの増殖の間(4日間まで)に、神経膠腫又はHeLa細胞に対して観察されたように(Suswam等、2008、Brennan等、2009)、形態学的変化も細胞死又はアポトーシスにおける増加も注目することはなかった。さらに、安定なMCF7−TTPノックダウンクローン(sh62−TTP1及びsh65−TTP2)を使用して、増殖に対するTTPタンパク質発現の効果を確かめた。形態学的観点から、これらのクローンは、コロニーの形状で増殖する能力、上皮間葉転換におけるTTPタンパク質の損失の関与を実証し得る効果を有する(Gebeshuber等、2009)(図4B)。2つのクローン(sh62−TTP1及びsh65−TTP2)は、用量依存的TTPタンパク質の消失と相関した増殖速度における有意な増加を示した(図4C)。VEGF及びIL8のmRNAの発現に対して先に記載したように、増殖に対する用量依存的効果を観察した。
全てを考慮した上で、本データは、2つの血管新生因子、VEGF及びIL8の産生、並びに、乳癌細胞増殖の調節におけるTTPタンパク質レベルの重大な役割を明白に指摘している。これらの結果は、乳癌におけるTTPタンパク質発現の頻繁な抑制を示す発表されたデータを明白に実証している。その結果、TTPタンパク質は、腫瘍の悪性度に対する予後因子として提案された(Brennan等、2009)。乳癌に対する予後因子としてTTPタンパク質発現速度を使用する可能性は非常に将来有望であるため、上記の乳癌細胞株におけるTTP mRNA及びTTPタンパク質レベルの相対量をテストし、mRNAのレベルとTTPタンパク質のレベルとの相互関係を示した。MCF7、MDA231、T47D、及びHs578T細胞をテストし、さらに、ヒト胚性腎臓細胞(HEK293)を、これらの細胞がTTPタンパク質の発現に対して負であるとして記載されてきた(Lay等、1999)ことを考慮に入れ、負の対照として使用した。図5Aにおいて示されているように、TTPタンパク質は、MCF7及びT47D細胞において明白に検出することができる一方で、HEK293、MDA231、及びHs578T細胞においては欠如しているか又は弱く発現されている。TTP mRNAを、ΔΔCT法を使用して解析した。MCF7細胞におけるmRNAレベルは、参照値(100%)としてみなした。最も低いTTP mRNAレベルを、MDA231細胞において発見し、有意なTTP mRNAレベルを、MCF7及びT47D細胞において検出した。意外にも、前記タンパク質を発現しないHs578T細胞が、検出可能なレベルのTTP mRNAを明白に有している(図5B)。これらのデータは、mRNAの発現レベルとTTPタンパク質の発現レベルとの相互関係の明らかな欠如を示している。この相互関係の欠如は、TTP mRNAのより短い半減期によるもの、又は、そのmRNAの翻訳レベルの相違によるものであり得る。
Hs578T細胞におけるTTPタンパク質のレベルとmRNAのレベルとの相互関係の欠如を研究するために、ゲノムDNA上のTTPタンパク質をコードする領域を配列決定し、さらに、MCF7細胞のゲノムDNAを対照として使用した。アルギニンに対応するコドンを修飾してCGCをCGT(R103R)に形質転換する一塩基多型(SNP)を、Hs578T細胞において検出した(rs3746083=NM_003407.2:367C>T、rs3746083多型部位でのTヌクレオチドの存在)。乳癌を被る女性の群(92人:患者群)、及び、対照としての女性の群(89人:対照群)を研究することによって、症例対照研究を実行して、乳房発癌における367C>T変異体(rs3746083多型部位でのTヌクレオチドの存在)が果たす役割を評価した。患者全てが、HER2遺伝子の増幅と共に非常に高悪性度の腫瘍を有し(HER2陽性)、症例全てを、HER2に対して作られたモノクローナル抗体であるHerceptin(登録商標)(トラスツズマブ)を用いて治療した(Hall等、2009)。患者群において13のrs3746083多型部位でのC/Tヘテロ接合体を同定し(T対立遺伝子の頻度=14.1%)、且つ、対照群において5つのrs3746083多型部位でのC/Tヘテロ接合体を同定した(T対立遺伝子の頻度=5.6%)。表1におけるrs3746083多型のC及びT対立遺伝子の対立遺伝子頻度は、患者群におけるT対立遺伝子の頻度の増加を明らかにしたが、統計学的有意性の閾値には達していない(カイ二乗検定p=0.095、Fisher検定を使用して確証p=0.080、OR=2.7、CI95%[0.9−10.3])。さらに、367C>T変異体(rs3746083多型部位でのTヌクレオチドの存在)が、生存率等の他の臨床パラメータと付随し得るかどうかを調べた。生存率との相互関係は同定されなかった。しかし、rs3746083多型のT対立遺伝子の異なる分布を、Herceptin(登録商標)(トラスツズマブ)を用いた治療に対する患者の応答に関して観察した。表2において示されているように、rs3746083多型のT対立遺伝子は、Herceptin(登録商標)(トラスツズマブ)に耐性の患者の群において、統計学的に有意な値(カイ二乗検定p=0.010、Fisher検定を使用して確証p=0.0093、OR=8.0、CI95%[1.9−33.4])を有して、対照群よりも明瞭に高頻度であった。これらのデータは、TTPタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子に対するrs3746083多型部位でのTヌクレオチドの存在がTTPタンパク質発現に対して機能的効果を有し、さらに、トラスツズマブ(Herceptin(登録商標))治療に対する患者の差次的な反応に関連があるということを示している。
遺伝子解析の間に得た結果を考慮して、367C>T変異体(NM_003407.2)(rs3746083多型部位でのTヌクレオチドの存在)が、Hs578T細胞において観察したmRNAのレベルとTTPタンパク質のレベルの間の相違の原因であり得るかどうかを調べた。第一に、367C>Tの変化(NM_003407.2)が、mRNAの安定性又はタンパク質の翻訳に干渉することによって遺伝子の発現に影響を与え得るかどうかを調べた(Sauna、2007)。Hs578T細胞から得たTTP cDNAのPCR解析は、これらの細胞における、MDA231細胞と比較して異常な別の転写物の存在を明らかにしなかった(図6A)。野生型(C対立遺伝子)(wt)も変異体対立遺伝子(T対立遺伝子)(var)も転写されたことを検証するために、rs3746083多型部位のヌクレオチドの同定を、一方で、酵素HhaIを用いた消化を解析することによって、もう一方で、Hs578T細胞から得たゲノムDNA及びcDNAから生じるPCR産物を配列決定することによって実行した。2つの技術によって、Hs578T細胞において、(rs3746083多型の)T対立遺伝子が、野生型(rs3746083多型の)C対立遺伝子よりも発現されたことが示された(図6A及び6B)。さらに、MFoldプログラム(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi−bin/RNAfold.cgi)を使用したTTP mRNA構造の予測解析によって、(rs3746083多型の)C対立遺伝子に対応するmRNA分子に対して、(rs3746083多型の)T対立遺伝子に対応するmRNA分子のより安定な二次構造が示された(図6C)。TTP mRNAの半減期は、MCF7及びMDA231の細胞において18分であり、さらに、Hs578T細胞においては21分である(図6D)。非常に安定なRNA構造は、対応するmRNAの翻訳レベルに影響を与え得るため、非常に安定及び豊富なmRNA分子は、より低いタンパク質レベルに付随し得ることを仮定した(Nackley等、2006)。この仮説を機能的にテストするために、in vitroでの転写/翻訳実験を、野生型対立遺伝子(rs3746083多型のC対立遺伝子)に対しても、変異体対立遺伝子(rs3746083多型のT対立遺伝子)に対してもタグをつけたTTPコンストラクトを使用して実行した。従って、野生型TTP遺伝子(wt)(rs3746083多型部位でのCヌクレオチドの存在)の翻訳レベルは、変異体TTP遺伝子(var)(rs3746083多型部位でのTヌクレオチドの存在)よりも高い(図7A)。これらのデータを確かめるために、両方の全長コード領域(rs3746083多型の野生型C対立遺伝子及び変異体T対立遺伝子)を真核生物発現ベクターpcDNA4/TO/myc−Hisにおいてクローン化することによって実験モデルを開発し、TTP陰性HEK293細胞株における一過性導入まで進めた。ルシフェラーゼレポーター遺伝子を、遺伝子導入効率の制御として同時導入した。種々の量のTTPプラスミド(100、200、及び500ngのDNA/105細胞)を用いた実験を実行して、ルシフェラーゼ転写及び/又は安定性に影響を与えないか、又は、大量の細胞死を誘導しない最適なTTP濃度を決定した。細胞死に対する効果は観察されなかったが、500ngの遺伝子導入は、ルシフェラーゼ活性に有意に影響を与えたため、野生型コンストラクト(rs3746083多型のC対立遺伝子)に対しても、TTP変異体(rs3746083多型のT対立遺伝子)に対しても除外した。匹敵する遺伝子導入効率によって特徴づけられた試料のみを比較することによって、100又は200ngの発現プラスミドが遺伝子導入された場合に、野生型TTPプラスミド(rs3746083多型のC対立遺伝子)が変異体TTPプラスミド(rs3746083多型のT対立遺伝子)よりも多くの量のタンパク質を産生したということを示す(図7B)。
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Claims (2)
- トラスツズマブ又はペルツズマブを用いた治療に対する患者の応答を予測するin vitro又はex vivoでの方法であって、
i)前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子、特に、両方の対立遺伝子に対して、rs3746083多型部位のヌクレオチドを同定するステップであり、前記rs3746083部位にてC/Cのホモ接合性を有する前記患者は、前記トラスツズマブ又はペルツズマブを用いた治療に対して応答性であると予測される、ステップ、及び/又は、
ii)前記患者からの生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質のレベルを決定し、さらに、前記トリステトラプロリンタンパク質のレベルを少なくとも1つの参照値と比較するステップであり、前記生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質のレベルが、ステップii)においてトリステトラプロリンタンパク質のレベルが決定された腫瘍組織に隣接する健康な組織において決定されたトリステトラプロリンタンパク質のレベルの平均値、又は、トラスツズマブ又はペルツズマブを用いた治療に応答性の患者の群に対する、等価の生物学的試料において決定されたトリステトラプロリンタンパク質のレベルの平均値である前記参照値以上である場合、前記患者は、前記トラスツズマブ又はペルツズマブを用いた治療に対して応答性であると予測されるか、又は、前記生物学的試料におけるトリステトラプロリンタンパク質のレベルが、トラスツズマブ又はペルツズマブを用いた治療に応答性ではない患者の群に対する、等価の生物学的試料において決定されたトリステトラプロリンタンパク質のレベルの平均値である前記参照値よりも有意に高い場合、前記患者は、前記トラスツズマブ又はペルツズマブを用いた治療に対して応答性であると予測される、ステップ、
を含み、前記患者は、HER2陽性癌を被っている、方法。 - 前記患者は、HER2陽性乳癌を被っている、請求項1に記載の方法。
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